FI111647B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten syklisten peptidien valmistamiseksi - Google Patents

Description

111647

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten syklisten peptidien valmistamiseksi Tämä keksintö koskee patenttivaatimuksessa 1 mää-5 riteltyä menetelmää tiettyjen terapeuttisesti käyttökelpoisten syklisten peptidien valmistamiseksi. Nämä sykliset peptidit ovat vasoaktiivisen peptidin (VIP) analogeja ja ne ovat hyödyllisiä keuhkoputkia ja henkitorvea kuristavien sairauksien hoidossa.

10 Vasoaktiivinen suolistopeptidi (VIP) löydettiin, eristettiin ja puhdistettiin ensimmäiseksi sian suolesta. (US-patentti 3 879 371). Peptidissä on kaksikymmentäkahdeksan (28) aminohappoa ja siinä on laajaa homologiaa sekre-tiinin ja glukagonin kanssa. [Carlquist et ai., Horm. Me-15 tab. Res. 14 (1982) 28 - 29]. VIP:n aminohapposekvenssi on seuraavanlainen:

His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2 [ (SEQ ID NO: 1)-NH2] 20 VIP:llä tiedetään olevan laaja valikoima biologisia aktiivisuuksia koko ruoansulatuskanavassa ja verenkierto-järjestelmässä. Ottaen huomioon VIP:n samankaltaisuus ruo-ansulatuskanavahormonien kanssa sen on todettu stimuloivan 25 haima- ja sapen eritystä, maksan glykogeenin hajoamista glukoosiksi, glukagonin ja insuliinin eritystä ja aktivoivan haiman bikarbonaatin vapautusta. [Kerrins, C. ja Said, S.I., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 142 (1972) 1014 - 1017;

Domschke, S. et ai.,· Gastroenterology 73 (1977) 478 - 480]. 30 Hermosoluja, jotka sisältävät VIP:n on immunoana- ... lyysin avulla paikallistettu olevan umpieritys- ja avoeri- tysrauhasten, suolen ja sileän lihaksen solujen joukossa. [Polak, J.M. et ai., Gut 15 (1974) 720 - 724]. VIP:n on todettu olevan neuroefektori, joka aiheuttaa useiden hor-35 monien vapauttamista, mukaan lukien prolaktiini [Frawley, L.S. et ai., Neuroendocrinology 33 (1981) 79 - 83], tyrok- 111647 2 siini [Ahren, B. et ai., Nature 287 (1980) 343 - 345] ja insuliini ja glukakoni [Schebalin, M. et ai., Am. J. Physiology E. 232 (1977) 197 - 200]. VIP:n on myös todettu stimuloivan reniinin vapautusta munuaisesta in vivo ja in 5 vitro. [Porter, J.P. et ai., Neuroendocrinology 36 (1983) 404 - 408]. VIP:ä on todettu olevan läsnä erilaisten eläinlajien ja ihmisen ilmateissä olevissa hermoissa ja hermo-päätteissä. [Dey, R.D. ja Said, S.I., Fed. Proc. 39 (1980) 1062; Said, S.I. et ai., Ann. N.Y. Acad. Sei. 221 (1974) 10 103 - 114]. VIP:n sydämeen ja verisuoniin liittyvät ja keuhkoihin ja keuhkoputkiin liittyvät vaikutukset ovat kiinnostavia, koska VIP:n on todettu olevan tehokas verisuonia laajentava aine ja tehokas sileän lihaksen ren- touttaja, joka vaikuttaa periferisiin, keuhkojen ja sepel-15 valtimoverisuoniverkostoihin. [Said, S.I. et ai., Clin. Res. 20 (1972) 29]. VIP:llä on todettu olevan verisuonia laajentava vaikutus aivoverisuoniin. [Lee, T.J. ja Berszin, I., Science 224 (1984) 898 - 900]. In vitro -tutkimukset ovat osoittaneet, että vasoaktiivinen suolistopeptidi, li-20 sättynä ulkoisesti aivovaltimoille, aiheutti verisuonten laajentumista, mikä viittaa siihen, että VIP on mahdollinen välittäjäaine (transmitter) aivojen verisuonten laajentamista varten. [Lee, T. ja Saito, A., Science 224 (1984) 898 - 901]. Silmässä VIP:n on myös osoitettu olevan tehokas “ 25 verisuonten laajentaja [Nilsson, S.F.E. ja Bill, A., Acta

Physiol. Scand. 121 (1984) 385 - 392].

VIP:llä voi olla säätelyvaikutuksia immuunijärjestelmään. 0'Dorisio et ai. ovat osoittaneet, että VIP kykenee moduloimaan imusolujen lisääntymistä ja vaellusta. [J. 30 Immunol. 135 (1985) 792 - 796].

Koska VIP:n on todettu rentouttavan sileää lihasta, ja sitä on normaalisti läsnä ilmatiekudoksissa, kuten yllä on mainittu, on oletettu, että VIP voi olla keuhkoputkien sileän lihaksen rentoutuksen endogeeninen välittäjäaine. 35 [Dey, R.D. ja Said, S.I., Fed. Proc. 39 (1980) 1962]. On 111647 3 osoitettu, että astmapotilailta peräisin olevat kudokset eivät sisällä irranunoreaktiivista VIP:tä verrattuna normaaleilta potilailta peräisin olevaan kudokseen. Tämä voi viitata siihen, että VIP:n tai VIP:n vaikutukseen liittyvien 5 hermosäikeiden puute liittyy astmasairauteen. [Ollerenshaw, S. et ai., New England J. Med. 320 (1989) 1244 - 1248]. In vitro ja in vivo -testaaminen on osoittanut VIP:n rentouttavan henkitorven sileää lihasta ja suojaavan keuhkoputkea kuristavilta aineilta, kuten histamiinilta ja prostaglan-10 diini F2a:lta. [Wasserman, M.A. et ai. teoksessa Vasoactive Intestinal Peptide, S.I. Said, toim., Raven Press, N.Y., 1982, ss. 177 - 184; Said, S.I. et ai., Ann. N.Y. Acad. Sei. 221 (1974) 103 - 114]. Laskimoon annettuna VIP:n on todettu suojaavan keuhkoputkea kuristavilta aineilta, kuten 15 histamiinilta, prostaglandiini F2a:lta, leukotrieeneiltä, verihiutaleita aktivoivalta tekijältä, samoin kuin myös antigeenin aiheuttamilta keuhkoputken kaventumilta [Said, S.I. et ai., yllä, (1982)]. VIP:n on myös todettu estävän liman eritystä ihmisen ilmatiekudoksessa in vitro. [Coles, 20 S.J. et ai., Am. Rev. Respir. Dis. 124 (1981) 531 - 536].

Ihmisellä VIP:n on todettu, kun se on annettu in-fuusiona laskimoon astmapotilaille, aiheuttavan uloshengi-tyksen huippuvirtausnopeuden suurenemisen ja suojaavan histamiinin aiheuttamalta keuhkoputken laajentumalta. 25 [Morice, A.H. ja Sever, P.S., Peptides 7 (1986) 279 - 280; Morice, A. et ai., The Lancet II (1983) 1225 - 1227].

Keuhkovaikutuksiin, jotka havaittiin tällä VIP:n infuu-siolla laskimoon, liittyi kuitenkin sydämeen ja verisuoniin liittyviä sivuvaikutuksia, huomattavimmin alhaista 30 verenpainetta ja sydämen tiheälyöntisyyttä ja myös kasvojen punastumista. Kun VIP annettiin laskimoon annoksina, jotka eivät aiheuttaneet sydän-verisuonivaikutuksia, VIP ei muuttanut ilmateiden ominaisjohtavuutta. [Palmer, J. B.

D. et ai., Thorax 41 (1986) 663 - 666]. Aktiivisuuden puut-35 111647 4 teen selitettiin johtuvan annetusta alhaisesta annoksesta ja mahdollisesti yhdisteen nopeasta hajoamisesta.

Kun alkuperäistä VIP:tä on annettu aerosolin avulla ihmisille, se on ollut vain erittäin lievästi vaikuttava 5 histaaminen aiheuttamalta keuhkoputken kaventumalta suojaamisessa. [Altieri et ai., Pharmacologist 25 (1983) 123]. VIP.-llä ei todettu olevan merkittävää vaikutusta perustason ilmatieparametreihin, mutta sillä oli suojaavaa vaikutus histamiinin aiheuttamaa keuhkoputken kaventumista 10 vastaan, kun se annettiin lääkehöyryn hengittämisen avulla ihmisille. [Barnes, P.J. ja Dixon, C.M.S., Am. Rev. Res-pir. Dis. 130 (1984) 162 - 166]. On selostettu, että ae rosolin avulla annettuna VIP ei tuo esille sydämentykytystä! verenpainetta alentavia vaikutuksia keuhkoputkien laa-15 jentamisen yhteydessä. [Said, S.I. et ai. teoksessa

Vasoactive Intestinal Peptide, S.I. Said, toim., Raven Press, N.Y., 1928, ss. 185 - 191].

VIP:n kiinnostavien ja mahdollisesti kliinisesti hyödyllisten biologisten aktiivisuuksien johdosta aine on 20 ollut useiden sellaisten raportoitujen synteesiohjelmien kohde, joiden päämääränä on ollut parantaa yhtä tai useampaa tämän molekyylin ominaisuuksista. Takeyama et ai. ovat selostaneet VIP-analogin, jossa on glutamiinihapolla korvattu asparagiinihappo asemassa 8. Tämän yhdisteen todet-** 25 tiin olevan vähemmän tehokas kuin alkuperäinen VIP. [Chem.

Pharm. Bull. 28 (1980) 2265 - 2269]. Wendlberger et ai.

ovat esitelleet sellaisen VIP-analogin valmistuksen, jossa on norleusiinilla korvattu metioniini asemassa 17. [Peptide, Proc. 16th Eur. Pept. Symp. (1980) 290 - 295]. Pepti-30 din todettiin olevan yhtä tehokas kuin alkuperäinen VIP ky-vyltään syrjäyttää radiojodattu VIP maksan kalvovalmisteis-ta. Watts ja Wooton ovat selostaneet sarjan lineaarisia ja syklisiä VIP-fragmentteja, jotka sisältävät kuudesta kahteentoista jäännöstä alkuperäisestä sekvenssistä. 35 [EP-patentit 184 309 ja 325 044; US-patentit 4 737 487 ja 111647 5 4 866 039]. Turner et ai. ovat selostaneet, että fragmentti VIP (10 - 28) on VIP:n antagonisti. [Peptides 7 (1986)

849 - 854]. Substituoidun analogin [4-Cl-D-Phe6, Leu17] -VIP

on myös selostettu sitoutuvan VIP:n reseptoriin ja vastus-5 tavan VIP:n aktiivisuutta. [Pandol, S. et ai., Gastro-intest. Liver Physiol. 13 (1986) G553 - G557]. Gozes et ai. ovat selostaneet, että analogi [Lys1, Pro2, Arg3, Arg4, -Pro5,Tyr6] -VIP on kilpaileva inhibiittori VIP:n sitoutumiselle sen hermotukisolujen pinnalla olevaan reseptoriin. 10 [Endocrinology 125 (1989) 2945 - 2949]. Robberecht et ai.

ovat selostaneet useita VIP-analogeja, joissa on korvauksina D-jäännöksiä alkuperäisen VIP:n N-päätteessä. [Peptides 9 (1988) 339 - 345]. Kaikki nämä analogit sitoutuivat vä hemmän tiukasti VIP:n reseptoriin ja osoittivat pienempää 15 aktiivisuutta kuin alkuperäinen VIP c-AMP-aktivaatiossa. Tachibana ja Ito ovat selostaneet useita edeltäjämolekyylin VIP-analogeja. [Teoksessa Peptide Chem., T. Shiba ja S. Sa-kakibara, toimittajat, Prot. Res. Foundation, 1988, ss.' 481 - 486, JP-patentti 1 083 012, US-patentti 4 822 774]. 20 Näiden yhdisteiden osoitettiin olevan 1-3 kertaa tehokkaampia keuhkoputken laajentajia kuin VIP, ja niillä oli 1-2 kertaa korkeampi verenpainetta alentavan aktiivisuuden taso. Musso et ai. ovat myös selostaneet useita VIP-analogeja, joissa on substituutioita asemissa 6 - 7, 25 9 - 13, 15 - 17 ja 19 - 28. [Biochemistry 27 (1988) 8174 - 8181; EP-patentti 8 271 141; US-patentti 4 835 252] Näiden yhdisteiden todettiin olevan yhtä tai vähemmän tehokkaita kuin alkuperäinen VIP VIP:n reseptoriin sitoutumisessa ja biologisen vasteen suhteen. Bartfai et ai. ovat 30 selostaneet sarjan monisubstituoituja [Leu17]-VIP-analo-t*.. geja. [Kansainvälinen patenttihakemus WO 89/05857] .

Tämän keksinnön mukaisesti saadaan syklisiä vasoak-tiivisen peptidin analogeja. Syklinen peptidi on peptidi, jossa yhden peptidiketjussa olevan aminohapon sivuketjukar-35 boksipääte on kiinnittynyt kovalenttisesti toisen peptidi-ketjussa olevan aminohapon sivuketjuaminopäätteeseen ami- 111647 6 disidoksen muodostumisen . kautta. Tämä kahden peptidiketjus-sa olevan aminohappojäännöksen välinen kovalenttinen sidos tuottaa rengasrakenteen.

Syklisten peptidien biologinen aktiivisuus voi olla 5 oleellisesti erilainen verrattuna lähtöaineina olleiden lineaaristen analogien aktiivisuuksiin. Sykliset peptidit ' ovat konformaatioltaan jäykempiä omaten rajoitetumpia rakenteita. Nämä muutokset heijastuvat syklisten peptidien biologisissa profiileissa. Peptidianalogin saattaminen ren-10 gasmuotoon voi pidentää peptidin vaikutuksen kestoa suurentuneen jäykkyyden johdosta, mikä tekee sen vähemmän alttiiksi kemialliselle ja entsymaattiselle hajotukselle. Syklisten peptidien biologinen hyötyosuus voi olla suurentunut rakenteen jäykistymisestä tuloksina olevien peptidin fysi-15 kaalisten ominaisuuksien muutosten johdosta. Lisäksi syklisen peptidin rajoitettu muoto voi antaa suuremman spesifisyyden kohdereseptorin suhteen kuin on lineaarisilla peptideillä, vähentäen siten taipumusta toivotun biologisen aktiivisuuden myötä seuraaviin epäsuotaviin biologisiin ak-20 tiivisuuksiin.

Tämän keksinnön mukaisesti saadaan uusia syklisiä peptidejä, joilla on kaava I

(I) 25

1 I

X-His-Ser-Asp-Aia-Val-Phe-Thr-Re-Asn-Tyr-Thr-R12-30 Leu-Arg-Lys-Gln-R17-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- [X-(SEQ ID NO:2)-Y] • · • ·

Leu-Asp-Ser-R26-Leu-R28*Y

111647 7 jossa Rs on Asp, Glu tai Lys; R12 on Arg, Lys, Orn tai Asp; R17 on Met tai Nle; R26 on Ile tai Vai; R28 on Asn tai Thr; X on vety tai hydrolysoitavissa oleva aminon suojaryhmä; Y on hydroksyyli tai hydrolysoitavissa oleva karboksin suojaryh-5 mä; tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja.

Edullisia kaavan I mukaisista peptideistä ovat ne, joilla on kaava:

10 I I

X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-R8-Asn-Tyr-Thr-R12-Leu-Arg-Lys-GIn-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- [X-. (SEQ ID N0:3)-Y]

Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y

15 jossa X, Y, Rs ja R12 ovat kuten yllä kaavassa I.

Tämän keksinnön mukaisesti saadaan myös uusia syklisiä peptidejä, joilla on kaava II

20 di)

1—I

X-His-Ser-Asp-Ala-Vai-Phe-Thr-Re-Asp-Tyr-Thr-Lys- 25

Leu-Arg-Lys-GIn-R17-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- [X-(SEQ ID NO:4)— Y]

Leu-Asp-Ser-R2s-Leu-R28-Y

30 jossa Rs on Asp tai Asn; R17 on Met tai Nle; R26 on Ile tai Vai; R28 on Asn tai Thr; X on vety tai hydrolysoitavissa oleva aminon suojaryhmä; Y on hydroksyyli tai hydrolysoitavissa oleva karboksin suojaryhmä; tai niiden farmaseutti-35 sesti hyväksyttäviä suoloja.

111647 8

Edullinen kaavan II mukaisista peptideistä on peptidi, jolla on kaava:

I I

5 X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asn-Asp-Tyr-Thr-Lys-

Leu-Arg-Lys-GIn-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- [X- (SEQ ID N0:5)-Y)

Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y

10 jossa X ja Y ovat kuten yllä kaavassa II.

Tämän keksinnön mukaisesti saadaan lisäksi uusia syklisiä peptidejä, joilla on kaava III

15 (III) X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr*Thr-Lys- i-

Leu-Arg-Lys-Glu-RirAla-Val-Lys-Lys-Tyr- [X-(SEQ ID NO:6)-Y] 20

Leu-Asp-Ser-R26-Leu-R28-Y

jossa R17 on Met tai Nle; R26 on Ile tai Vai; R28 on Asn tai Thr; X on vety tai hydrolysoitavissa oleva aminon suojaryh-25 mä; Y on hydroksyyli tai hydrolysoitavissa oleva karboksin suojaryhmä; tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suo-lo j a.

Edullisia kaavan III mukaisista peptideistä ovat peptidit, joilla on kaava: 30 ::: γί X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Lys- I -

Leu-Arg-Lys-Glu-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- [x-(SEQ ID no.-7)-y] 35

Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Y

111647 9 jossa X ja Y ovat kuten yllä kaavassa III.

Kantahakemuksen mukaisesti saadaan uusia syklisiä peptidejä, joilla on kaava: 5 (IV) X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Ri2-

Leu-Arg-Lys-Gln-Ri7-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- [X-(SEQ ID NO:8)-Y)

10 I

Leu-Asp-Ser-R26-Leu-R2e-Y

jossa R12 on Arg tai Lys; R17 on Met tai Nle; R26 on Ile tai Vai; R28 on Asn tai Thr; X on vety tai hydrolysoitavissa 15 oleva aminon suojaryhmä; Y on hydroksyyli tai hydrolysoitavissa oleva karboksin suojaryhmä; tai kaava V

(v) X-R1-R2-Asp-Ala-Val-R6-Thr-Rs-Asn-R10-Thr-R12- 20 1-

Leu-Arg-Lys-R16-RirAla-R19-Lys-Lys-R22- [X-(SEQ ID NO: 10) -Y] ί6υ-Η24·Α5ρ-Ρ26^27·^28·Υ ·· 25 jossa Ri on His, N-CH3-Ala; R2 on Ser tai Ala; Rö on

Q

30 H 5 • * • * jossa Q on alempialkyylisykloheksyyli tai alempialkyy-liaryyli; R8 on Asp, Glu tai Ala; Ri0 on Tyr tai R6; R12 on 35 Arg tai Lys; Ri6 on Gin tai Ala; Ri? on Met, Nle tai Ala; R19 on Vai tai Ala; R22 on Tyr tai R6; R24 on Asn tai Ala; R26 111647 10 on Ile, Vai tai Leu; R27 on Leu tai Lys; R28 on Asn, Thr tai Lys; X on vety tai hydrolysoitavissa oleva aminon suojaryh-mä; Y on hydroksyyli, hydrolysoitavissa oleva karboksin suojaryhmä tai R29-R30-R31-Z; R29 on Gly tai Ala; R30 on Gly 5 tai Ala; R31 on Ala, Met, Cys(Acm) tai Thr; Z on hydroksyyli tai hydrolysoitavissa oleva karboksin suojaryhmä; tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja.

Keksinnön mukaisesti saatavat peptidit tuottavat henkitorveen ja keuhkoputkiin liittyvän sileän lihaksen 10 pitkäaikaisen rentoutuksen ilman sydämeen ja verisuoniin liittyviä sivuvaikutuksia ja ovat siten hyödyllisiä keuhkoputkia kuristavien sairauksien kuten astman hoidossa.

Niillä on suurentunut pitkään jatkumaan kykenevä keuhkoputkea laajentava aktiivisuus ilman havaittavia sivu-15 vaikutuksia.

Tässä käytettynä termi "alempialkyyli" käsittää suoraketjuisia ja haarautuneen ketjun omaavia tyydytettyjä alifaattisia hiilivetyryhmiä, joissa on 1 - 6 hiiliatomia. Edullinen alempialkyyliryhmä on metyyli.

20 Tässä käytettynä termi "aryyli" tarkoittaa yksiyti- misiä aromaattisia hiilivetyryhmiä, kuten fenyyliä, jotka voivat olla substituoimattomia tai substituoituja yhdessä tai useammassa asemassa alemmalla-alkyylillä, alemmalla-alkoksilla, aminolla, nitrolla, mono- tai dialempialkyy-·· 25 liaminolla, alempialkyyliamidolla tai fenyyliamidolla.

"Aryyli" tarkoittaa myös moniytimisiä aryyliryhmiä, kuten naftyyliä, jotka voivat olla substituoituja yhdellä tai • useammalla yllä mainitulla ryhmällä. Edullisia aryyliryhmiä ovat fenyyli, joka on substituoimaton tai monosubstituoitu 30 fluorilla, tai substituoimaton naftyyli.

• · Tässä käytettynä X on aminoterminaalisen aminohapon aminotypessä oleva substituentti ja Y on karboksiterminaa-lisen aminohapon karbonyyliryhmässä oleva substituentti. X voi olla vety tai hydrolysoitavissa oleva aminon suojaryh-35 mä. Y voi olla hydroksyyli tai hydrolysoitavissa oleva karboksin suojaryhmä.

111647 11

Mitä tulee termeihin "hydrolysoitavissa oleva ami-non suojaryhmä" ja "hydrolysoitavissa oleva karboksin suo-jaryhmä", mitä tahansa tavanomaisia suojaryhmiä, jotka voidaan poistaa hydrolyysin avulla, voidaan käyttää tämän kek-5 sinnön mukaan. Esimerkkejä sellaisista ryhmistä on alla. Edullisia aminon suojaryhmiä ovat Λ - -¾ jolloin X3 on alempialkyyli tai halogeenialempialkyyli. Näistä suojaryhmistä sellaiset, joissa X3 on Ci-3-alkyyli 15 tai halogeeni-Ci-3-alkyyli, ovat erityisen edullisia.

Edullisia karboksin suojaryhmiä ovat alempialkyy-liesterit, NH2 ja alempialkyyliamidit, jolloin C1-3-alkyyliesterit, NH2 ja Ci-3-alkyyliamidit ovat erityisen edullisia.

20 Keksinnön mukaiselle menetelmälle edellä mainittu jen uusien peptidien ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi on tunnusomaista, että a) suojatusta ja hartsiin sidotusta peptidistä, jolla on vastaava aminohapposekvenssi, poistetaan selektii- .··* 25 visesti suojausta vapaan sivuketjuaminoryhmän ja vapaan si- vuketjukarboksyyliryhmän aikaansaamiseksi; b) vapaa sivuketjuaminoryhmä ja vapaa sivuketjukar-boksyyliryhmä kytketään kovalenttisesti sopivan amidinmuo-dostusreagenssin avulla ja 30 c) peptidistä, jolle on suoritettu renkaanmuodos- • · » tus, poistetaan suojaus ja se lohkaistaan hartsista käsittelemällä sopivalla suojauksenpoisto- ja lohkaisureagens-silla, haluttaessa muiden sopivien lisäaineiden ollessa läsnä kationinpoistajina, ja haluttaessa muutetaan syklinen 35 peptidi farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

111647 12

Peptidien määrittelyyn käytetty nimistö on se, jota alalla tyypillisesti käytetään, jolloin N-päätteessä oleva aminoryhmä esiintyy vasemmalla ja C-päätteessä oleva kar-boksyyliryhmä esiintyy oikealla. Luonnollisilla aminoha-5 poilla tarkoitetaan jotakin luonnossa esiintyvistä aminohapoista, joita on proteiineissa, so. Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp ja His. Milloin aminohapolla on isomeerisiä muotoja, edustettuna on aminohapon L-muoto, ellei toisin 10 ole nimenomaan osoitettu.

Seuraavia lyhennyksiä tai symboleja käytetään edustamaan aminohappoja yllä kuvattujen lisäksi, suojaryhmiä, liuottimia, reagensseja ja vastaavia.

Symboli Merkitys 15 Ac asetyyli

Orn ornitiini

Nle norleusiini

Fmoc 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli

Fm 9-fluorenyylimetyyli 20 Boc t-butyylioksikarbonyyli

Born bentsyylioksimetyyli CH2CI2 metyleenikloridi CH3CN asetonitriili DMF dimetyyliformamidi ·« 25 DIPEA N, N-di-isopropyylietyyliamiini TFA trifluorietikkahappo HOBT N-hydroksibentsotriatsoli DCC N,N1-disykloheksyylikarbodi-imidi DIC N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidi 30 BOP bentsotriatsol-l-yylioksitri(dimetyy- • · « ... liamino) fosfoniumheksafluorifosfaatti 35 111647 13 ch3 N-Me-Ala CHj 0

rO

2-Nal I

Η. Λ .OH N

H O p 0 P'FPhe Η. Χ,ΟΗ N ιΓ

15 H O

FAB-MS nopea atomi -pommitusmassaspektrometria

Alkuperäisen VIP-peptidisekvenssin analogit on ilmaistu ilmoittamalla korvatut aminohapot hakasuluissa ennen 20 ilmausta "VIP". Johdannaisen tekeminen N-terminaalisesta aminoryhmästä, so. kuten X:n avulla yllä, on osoitettu hakasuluissa olevien korvausten vasemmalla puolella. Sekvenssin numerot, jotka esiintyvät suluissa ilmauksen "VIP" oikealla puolella, osoittavat aminohappojen poistot ja lisä-·· 25 ykset alkuperäisen sekvenssin numeroinnissa tehtyinä. Toi sin sanoen esimerkiksi Ac-[Lys12, Nle17, Gly29]-VIP (1-29)-NH2 ilmaisee polypeptidin, jonka aminohapposekvenssi vastaa alkuperäistä ihmisen VIP, jossa N-päätteessä on vety korvattu asetyyliryhmällä, arginiini on korvattu lysiinillä asemassa 30 12 ja metioniini on korvattu norleusiinilla asemassa 17.

• »

Lisäksi glysiini on kytketty asparagiinin 28 karboksyyli-kohtaan ja tämä on nimitetty asemaksi 29. Loppuliitteet "-OH" ja "-NH2", jotka seuraavat ilmausta "VIP" tai sulkuja, viittaavat vastaavasti polypeptidin vapaaseen happo- ja 35 amidimuotoon. Siinä tapauksessa että kumpaakaan loppulii- 111647 14 tettä ei käytetä, ilmauksen tarkoitetaan käsittävän kummatkin muodot.

Kuten yllä on mainittu, tässä määritellyn mukainen syklinen peptidi on peptidi, jossa yhden peptidissä olevan 5 aminohapon sivuketjukarboksipääte on kiinnittynyt kovalent-tisesti toisen peptidiketjussa olevan aminohapon sivuketju-aminopäätteeseen amidisidoksen muodostuksen kautta. Syklisen peptidin esittämiseen käytetään useita nimistöjä ja symboleja. Seuraavat ovat esimerkkejä: 10 i-1

Ac-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-GIn-Nle-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- a 15 Leu-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-NH2 [Ac-(SEQ ID NO:20)-NH2l

Ac- [Lys12, Nle17, Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(8 _> 12) b.

20 [Ac- (SEQ ID NO:20)-NH2]

Ac-[Lys12, Nle17, Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Asp8 _> Lys12) c. [Ac- (SEQ ID NO: 20) -NH2] .. 25 Yllä olevat kolme rakennetta (a - c) ja oheinen esitysmuoto, jossa käytetään ilmausta SEQ ID NO: ja alla olevaa sekvenssiluettelotietoa, kaikki esittävät ja määrittelevät saman polypeptidin, jonka aminohapposekvenssi vastaa alkuperäistä ihmisen VIP, jossa vety on korvattu ase-30 tyyliryhmällä N-päätteessä, arginiini on korvattu lysiinil- • · lä asemassa 12, metioniini on korvattu norleusiinilla asemassa 17, isoleusiini on korvattu valiinilla asemassa 26 ja asparagiini on korvattu treoniinilla asemassa 28. Lisäksi amidisidos on muodostettu asemassa 8 olevan asparagiiniha-35 pon sivuketjukarboksyylin ja asemassa 12 olevan lysiinin sivuketjuamiinin kesken muodostaen siten syklinen pepti- 111647 15 dianalogi. Yllä olevien peptidirakenteen esittämisten katsotaan olevan samanarvoisia ja vaihdettavia.

Tässä käytettynä termit "Rn" aminohaposta, joka on asemassa n yhdessä tässä esitetyistä rakenteista, ja "Xaa" 5 aminohaposta, joka on asemassa n vastaavassa sekvenssissä alla olevassa sekvenssiluettelossa, ovat samanarvoisia ja vaihdettavia niissä tapauksissa, joissa Xaa edustaa valintaa kahden tai useamman aminohapon joukosta.

Tämän keksinnön mukaisesti saatavissa syklisissä 10 peptideissä pätevät seuraavat konfiguraatiot, ellei toisin ole ilmoitettu.

Ketjussa oleva Aminohapon pääte, joka on sidottu aminohappo syklisen peptidin aikaansaamiseksi 15 Lys ε-amino (ε = epsilon)

Orn δ-amino (δ = delta)

Asp β-karboksyyli (β = beeta)

Glu γ-karboksyyli (γ = gamma)

Edustavia tämän keksinnön mukaisesti saatavista yh-20 disteistä ovat peptidit, joilla on seuraavat aminohapposekvenssit :

Ac-[Lys12,Nle17,Vai26,Thr28)-VIP-syklo- (Asp8-»Lys12) 25 [Ac- (SEQ ID NO:20)-NH2]

Ac- [Glu8, Lys12,Nle17, Vai26, Thr28) - VIP -syklo-(Glu8—»Lys12) [Ac-(SEQ ID NO:21)-NH2] 30 Ac-[Asn8,Asp9,Lys12,Nle17,Vai26, Thr28]-VIP-syklo- (Asp9—*Lys12) [Ac-(SEQ ID NO:22)-NH2]

Ac-[Orn12, Nle17,Vai26,Thr28) -VIP-syklo-(Asp8—»Orn12) [Ac-(SEQ ID NO:23)-NH2] 35 111647 16

Ac-[Lys8,Asp12,Nle17,Vai28,Thr28]-VIP-syklo-(Lys8—»Asp12) [Ac-(SEQ ID NO:24)~NH2]

Ac- [Glu8, Orn12, Nle17, Val2 8, Thr28 ] - VIP -syklo-(Glu8—»Orn12) [Ac-(SEQ ID NO:25)-NH2]

Ac-[Lys12,Glul6,Nle17,Vai26,Thr28]-VlP-syklo- (Lys12-»Glu16) [Ac-(SEQ ID NO:26)-NH2] Tämän keksinnön mukaisesti kaavojen I - HI mukaiset yhdisteet voidaan helposti syntetisoida käyttäen mitä tahansa tunnettua tavanomaista menetelmää peptidisidoksen 15 muodostamiseksi aminohappojen välille. Tällaisia tavanomaisia menetelmiä ovat esimerkiksi mikä tahansa liuosfaasime-netelmä, joka sallii kondensaation sellaisen aminohapon tai sen jäännöksen vapaan alfa-aminoryhmän, jonka karboksyyli-ryhmä tai muut reaktiokykyiset ryhmät on suojattu, ja toi-20 sen aminohapon tai sen jäännöksen, jonka aminoryhmä tai muut reaktiokykyiset ryhmät on suojattu, vapaan primaarisen karboksyyliryhmän kesken.

Menetelmä kaavojen I - III mukaisten yhdisteiden syntetisoimiseksi voidaan suorittaa käyttäen menettelyä, ·* 25 jossa kukin aminohappo halutussa sekvenssissä lisätään yksi kerrallaan peräkkäin toiseen aminohappoon tai sen jäännökseen, tai menettelyä, jossa peptidifragmentteja, joissa on haluttu aminohapposekvenssi, syntetisoidaan ensin tavanomaisesti ja sitten kondensoidaan halutun peptidin aikaan-30 saamiseksi.

Tällaisia tavanomaisia menetelmiä kaavojen I - III mukaisten uusien yhdisteiden syntetisoimiseksi on esimerkiksi mikä tahansa kiinteän faasin peptidisynteesimenetel-mä. Sellaisessa menetelmässä uusien yhdisteiden synteesi 35 voidaan suorittaa yhdistämällä peräkkäin halutut aminohap-pojäännökset yksi kerrallaan kasvavaan peptidiketjuun kiin- 111647 17 teän faasin menetelmien yleisten periaatteiden mukaan [Mer-rifield, R.B., J. Amer. Chem. Soc. 85 (1963) 2149 - 2154;

Barany et ai., The Peptides, Analysis,Synthesis and Biology, voi. 2, Gross, E. ja Meienhofer, J., toimittajat, Aca-5 demic Press (1980) 1 - 284).

Yhteistä peptidien kemiallisille synteeseille on eri aminohapporyhmien reaktiokykyisten sivuketjuryhmien suojaaminen sopivilla suojaryhmillä, jotka estävät kemiallista reaktiota tapahtumasta tuossa kohdassa, kunnes suoja-10 ryhmä lopulta poistetaan. Tavallisesti on yhteistä myös aminohapossa tai fragmentissa olevan alfa-aminoryhmän suojaaminen siksi ajaksi kun tuo kokonaisuus reagoi karboksyy-liryhmän kohdalla, mitä seuraa alfa-aminon suojaryhmän selektiivinen poistaminen, jotta sallittaisiin seuraavan re-15 aktion tapahtua tuossa kohdassa. Vaikka erityisiä suojaryh-miä on esitelty kiinteän faasin synteesimenetelmää varten, tulisi huomata, että kukin aminohappo voidaan suojata sellaisen suojaryhmän avulla, jota tavanomaisesti käytetään kyseistä aminohappoa varten liuosfaasisynteesissä.

20 Alfa-aminoryhmät voidaan suojata sopivalla suoja- ryhmällä, joka on valittu aromaattisista uretaanityyppiä olevista suojaryhmistä, kuten bentsyylioksikarbonyyli (Z) ja substituoitu bentsyylioksikarbonyyli, kuten p-kloori-bentsyylioksikarbonyyli, p-nitrobentsyylioksikarbonyyli, p-25 bromibentsyylioksikarbonyyli, p-bifenyyli-isopropyylioksi-karbonyyli, 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli (Fmoc) ja p-metoksibentsyylioksikarbonyyli (Moz); alifaattisista uretaanityyppiä olevista suojaryhmistä, kuten t-butyy-lioksikarbonyyli (Boc), di-isopropyylimetyylioksikarbo-30 nyyli, isopropyylioksikarbonyyli ja allyylioksikarbonyyli.

• · .. Boc on edullisin alfa-aminon suojausta varten.

Karboksyyliryhmät voidaan suojata sopivalla suoja-ryhmällä, joka on valittu aromaattisista estereistä, kuten bentsyyli (OBzl) tai bentsyyli, joka on substituoitu alem-35 maila alkyylillä, halogeenilla, nitrolla, tiolla tai sub-stituoidulla tiolla, so. alempialkyyli (1-7 hiiliatomia) 111647 18 -tiolla; alifaattisista estereistä, kuten alempialkyyli, t-butyyli (Ot-Bu), syklopentyyli, sykloheksyyli (OcHx), syk-loheptyyli ja 9-fluorenyylimetyyli (OFm). OBzl ja OFm ovat edullisimmat glutamiinihappoa (Glu) varten. OcHx, OBzl ja 5 OFm ovat edullisimmat asparagiinihappoa (Asp) varten.

Hydroksyyliryhmät voidaan suojata sopivalla suoja-ryhmällä, joka on valittu eettereistä, kuten bentsyyli (Bzl) tai bentsyyli, joka on substituoitu alemmalla alkyy-lillä, halogeenilla, kuten 2,6-diklooribentsyyli (DCB), 10 nitrolla tai nietoksilla; t-butyyli (t-Bu) , tetrahydropyra-nyyli ja trifenyylimetyyli (trityyli). Bzl on edullisin se-riiniä (Ser) ja treoniinia (Thr) varten. Bzl ja DCB ovat edullisimmat tyrosiinia (Tyr) varten.

Sivuketjuaminoryhmät voidaan suojata sopivalla suo-15 jaryhmällä, joka on valittu aromaattisista uretaanityyppiä olevista suojaryhmistä, kuten bentsyylioksikarbonyyli (Z) ja substituoitu bentsyylioksikarbonyyli, kuten p-kloo-ribentsyylioksikarbonyyli, 2-klooribentsyylioksikarbonyyli' (2-C1-Z), p-nitrobentsyylioksikarbonyyli, p-bromibentsyy-20 lioksikarbonyyli, p-difenyyli-isopropyylioksikarbonyyli, 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli (Fmoc) ja p-metoksibent-syylioksikarbonyyli (Moz); alifaattisista uretaanityyppiä olevista suojaryhmistä, kuten t-butyylioksikarbonyyli (Boc), di-isopropyylimetyylioksikarbonyyli, isopropyyliok-··· 25 sikarbonyyli ja allyylioksikarbonyyli. Z on edullisin orni- tiiniä (Orn) varten. 2-C1-Z ja Fmoc ovat edullisimmat ly-siiniä (Lys) varten.

Guanidinoryhmät voidaan suojata sopivalla suojaryh-mällä, joka on valittu ryhmistä nitro, p-tolueenisulfonyyli 30 (Tos) , Z, adamantyylioksikarbonyyli ja Boc. Tos on edullisin arginiiniä (Arg) varten.

Sivuketjuamidiryhmät voidaan suojata ksantyylin (Xan) avulla. Suojaamattomuus on edullista asparagiinin (Asn) ja glutamiinin (Gin) tapauksessa.

35 Imidatsoliryhmät voidaan suojata sopivalla suoja- ryhmällä, joka on valittu p-tolueenisulfonyylin (Tos), 9- 111647 19 fluorenyylimetyylioksikarbonyylin (Fmoc), trifenyylimetyy-lin (trityyli), 2,4-dinitrofenyylin (Dnp), ryhmän Boc ja bentsyloksimetyylin (Bom) joukosta. Tos ja Born ovat edullisimmat histidiiniä (His) varten.

5 Ellei toisin ole määritelty, prosenttimäärät, jotka on alla annettu kiinteille aineille kiinteissä seoksissa, nesteille nesteissä ja kiinteille aineille nesteissä, ovat vastaavasti paino/paino-, tilavuus/tilavuus- ja paino/tila-vuusprosentteja. Lisäksi ellei toisin ole määritelty, alla 10 mainittujen reagenssien ja instrumenttien toimittajien ei tarkoiteta olevan pakollisia. Ammatti-ihminen kykenee valitsemaan samanlaisia reagensseja tai instrumentteja muilta toimittajilta.

Kaikki liuottimet, isopropanoli (iPrOH), metyleeni-15 kloridi (CH2CI2) ja dimetyyliformamidi (DMF) hankittiin toiminimeltä Fisher tai Burdick & Jackson ja käytettiin ilman lisätislausta. Trifluorietikkahappo hankittiin toiminimeltä Halocarbon ja käytettiin ilman lisäpuhdistusta. Di-isopropyylietyyliamiini (DIPEA) hankittiin toiminimeltä 20 Pfaltz and Bauer ja tislattiin CaO:n ja ninhydriinin seasta ennen käyttöä. Disykloheksyylikarbodi-imidi (DCC) ja di-isopropyylikarbodi-imidi (DIC) hankittiin toiminimeltä Flu-ka ja käytettiin ilman lisäpuhdistusta. Hydroksibentsot-riatsoli (HOBT) ja 1,2-etaaniditioli (EDT) hankittiin toi- ·*, 25 minimeltä Sigma Chemical Co. ja käytettiin ilman lisäpuh distusta. Suojatut aminohapot olivat yleensä L-konfiguraation omaavia ja hankittiin kaupallisesti toiminimeltä Chemical Dynamics Corp. tai Bachemilta. Näiden reagenssien puhtaus varmistettiin ohutkerroskromatografiän, 30 NMR:n ja sulamispisteen avulla ennen käyttöä. Boc-O-Me-Tyr, • * ,.· Boc-2-Nal ja Boc-p-F-Phe valmistettiin kuten on selostettu.

(Bolin, D.R., US-patenttihakemus 374 503). Boc-Asp(OFm) ja Boc-Glu(OFm) valmistettiin kuten on selostettu. [Bolin, D.R. et ai., Org. Prep. Proc. Int. 21 (1989) 67 - 74].

35 Bentshydryyliamiinihartsi (BHA) oli kopolymeeri, jonka muodostivat styreeni ja 1 % divinyylibentseeniä (100 - 200 tai 111647 20 200 - 400 mesh), ja se hankittiin toiminimeltä Biomega,

Bachem, Omni tai Advanced Chemtech. Näiden hartsien kokonaistyppipitoisuus oli yleensä 0,3 - 1,2 milliekvivalent- tia/g.

5 Ohutkerroskromatografia (TLC) suoritettiin lasipoh- jaisilla esipäällystetyillä silikageeli 60 F254 -levyillä (Merck) käyttäen sopivia liuotinseoksia. Yhdisteiden osoittaminen suoritettiin UV-fluoresenssin sammuttamisen (absorptio aallonpituudella 254 nm), jodivärjäyksen tai nin-10 hydriinisuihkeen (primaaristen ja sekundaaristen amiinien tapauksessa) avulla.

Aminohappokoostumuksen analyysejä varten peptidejä hydrolysoitiin 6 N HCl:ssa, joka sisälsi 1 - 4 mg fenolia, 115 °C:ssa 22 - 24 tunnin ajan suljetuissa, tyhjennetyissä 15 hydrolyysiputkissa. Analyysit suoritettiin käyttäen joko Beckman 121M -aminohappoanalysoijaa tai Waters- HPLC:aan perustuvaa aminohappoanalyysijärjestelmää käyttäen joko Waters Cat Ex -hartsia tai Pierce AA511 -pylvästä ja ninhyd-riinillä osoittamista.

20 Korkeapainenestekromatografia (HPLC) suoritettiin LDC-laitteella, joka käsitti Constametric I ja III -pumput, Gradient Master -liuotinohjelmoijan ja -sekoittimen ja Spectromonitor III - säädettävän aallonpituuden UV-detektorin. Analyyttinen HPLC suoritettiin käänteisfaasita- ·· 25 valla käyttäen Waters pBondapak Ci8 -pylväitä (0,4 x 30 cm). Preparatiiviset HPLC-erottelut suoritettiin Whatman Magnum 20 partisil 10 ODS-3 -pylväissä (2 x 25 cm tai 2 x . 50 cm), jotka oli varustettu Waters Guard-Pak Cis -esi-pylväällä. Geelikromatografia suoritettiin käyttäen kool-30 taan 2 x 85 cm olevaa pylvästä, LKB varioper- • » « ... pex -peristalttista pumppua ja IBM-säädettävän alloonpituu- den UV-detektoria.

Peptidit valmistettiin edullisesti käyttäen kiinteän faasin synteesiä menetelmällä, jonka on yleisesti kuvan-35 nut Merrifield [J. Amer. Chem. Soc. 85 (1963) 2149], vaikka muuta vastaavaa alalla tunnettua kemiallista synteesiä voi- 111647 21 täisiin käyttää kuten aikaisemmin on mainittu. Kiinteän faasin synteesi aloitetaan peptidin C-terminaalisesta päästä kytkemällä suojattu alfa-aminohappo sopivaan hartsiin. Tällainen lähtöaine voidaan valmistaa kiinnittämällä alfa-5 aminosuojattu aminohappo esterisidoksella kloorimetyloituun hartsiin tai hydroksimetyylihartsiin tai amidisidoksella bentshydryyliamiini (BHA) tai parametyylibentshydryyliamii-ni (MBHA) -hartsiin. Hydroksimetyylihartsin valmistus on alalla tunnettua. Kloorimetyloituja hartseja on kaupalli-10 sesti saatavana ja valmistus on myös alalla tunnettua. BHA-ja MBHA-hartsikantajia on kaupallisesti saatavana ja niitä käytetään yleensä, kun halutussa syntetisoitavassa peptidissä on substituoimaton amidi C-päätteessä.

Yleensä ensimmäinen BHA-hartsiin kytkettävä amino-15 happo lisättiin Boc-aminohapon symmetrisenä anhydridinä käyttäen 2 - 10 ekvivalenttia aktivoitua aminohappoa hartsin typpiekvivalenttia kohti. Kytkemisen jälkeen hartsi pestiin ja kuivattiin tyhjössä. Hartsin kuormitus aminohapolla voidaan määrittää Boc-aminohappohartsin näytteen ami-20 nohappoanalyysin avulla. Kuormitukset olivat yleensä 0,2 -0,4 mmoolia/g hartsia. Kaikki reagoimattomat aminoryhmät voidaan suojata antamalla hartsin reagoida etikkahappoan-hydridin ja di-isopropyylietyyliamiinin kanssa metyleeni-kloridissa.

25 Boc-aminohapon lisäämisen jälkeen hartseille suori tettiin useita toistojaksoja aminohappojen lisäämiseksi peräkkäin. Alfa-aminon Boc-suojaus poistettiin happamissa olosuhteissa. Trifluorietikkahappoa (TFA) metyleeniklori-dissa, HC1 dioksaanissa tai muurahaishappo/etikkahappo-30 seoksia voidaan käyttää tähän tarkoitukseen. Edullisesti « · käytetään 50 % TFA metyleenikloridissa (tilavuus/tilavuus). Tämä voi myös sisältää 1-5 tilavuus-% EDT tai dimetyyli-sulfidia t-butyylikarboniumionien poistajana. Voidaan myös käyttää muita yleisiä alalla tunnettuja lohkaisureagensse-35 ja.

111647 22

Alfa-aminon suojaryhmän poistamisen jälkeen seuraa-vat suojatut aminohapot kytketään asteittain halutussa järjestyksessä välituotteen, suojattu peptidi -hartsin, saamiseksi. Aktivointireagenssit, joita käytetään aminohappojen 5 kytkemiseen peptidien kiinteän faasin synteesissä, ovat alalla tunnettuja. Esimerkiksi ovat sopivia reagensseja tällaisia synteesejä varten bentsotriatsol-1- yylioksitri(dimetyyliamino)fosfoniumheksafluorifosfaatti BOP) , disykloheksyylikarbodi-imidi (DCC) ja di-isopro-10 pyylikarbodi-imidi (DIC). Tässä ovat edullisia DCC ja DIC. Muita aktivointireagensseja, joita ovat kuvanneet Barany ja Merrifield (teoksessa The Peptides, voi. 2, J. Meienhofer, toim., Academic Press, 1979, ss. 1 - 284), voidaan käyttää. Erilaisia reagensseja, kuten 1-hydroksibentsotriatsolia 15 (HOBT), N-hydroksisukkinimidiä (HOSu) ja 3,4-dihydro-3-hydroksi-4-okso-l,2,3-bentsotriatsiinia (HOOBT), voidaan lisätä kytkentäseoksiin synteesijaksojen optimoimiseksi. Tässä on edullinen HOBT.

Ohje tyypillistä synteesijaksoa varten oli seuraa-20 vanlainen:

Ohje 1

Vaihe Reagenssi Aika 1 CH2C12 2 x 30 s 2 50 % TFA/CH2CI2 1 min 25 3 50 % TFA/CH2CI2 15 min 4 CH2CI2 2 x 30 s 5 iPrOH 2 x 30 s 6 CH2CI2 4 x 30 s 7 6 % DIPEA/CH2CI2 3x2 min 30 8 CH2CI2 3 x 30 s ♦ · « ... 9 kytkeminen 10 min - 18 tuntia 10 CH2CI2 2 x 30 s 11 iPrOH 1 x 30 s 12 CH2CI2 1 x 30 s 35 13 DM F 2 x 30 s 14 CH2CI2 3 x 30 s 111647 23

Liuottimia mitattiin kaikkia pesuja ja kytkemisiä varten tilavuuksiksi 10 - 40 ml/g hartsia. Kytkemiset suoritettiin käyttäen joko Boc-aminohappojen ennalta muodostettuja symmetrisiä anhydridejä tai O-asyyli-isourea-5 johdannaisina. Yleensä 2-10 ekvivalenttia aktivoitua Boc-aminohappoa lisättiin yhtä ekvivalenttia amiinihartsia kohti käyttäen metyleenikloridia liuottimena. Boc-Arg(Tos), Boc-Gln, Boc-Asn, Boc-His(Tos) ja Boc-His(Bom) kytkettiin 20 - 25 % DMF/CH2Cl2-seoksessa. Boc-Asn, Boc-Gln ja Boc- 10 His(Born) kytkettiin niiden HOBT- aktiivisina estereinä tunnettujen sivureaktioiden minimoimiseksi.

Peptidit saatettiin rengasmuotoon yleensä käyttäen alalla tunnettuja menetelmiä seuraavalla tavalla. Niissä peptidin aminohappokohdissa, joiden sivuketjut oli määrä 15 kytkeä, käytettiin erilaisia suojaryhmiä. Aminokohdan aminohapoiksi Lys ja Orn Νε- ja N5-Fmoc-johdannaiset sisällytettiin peptidiketjuun. Karboksyylikohdan aminohapoiksi Asp ja Glu liitettiin Op- ja 0Y-Fm-johdannaiset. Peptidin ollessa vielä kiinnittyneenä hartsiin sitä käsiteltiin 20 -20 40 % piperidiinillä DMF:ssa Fmoc- ja Fm-suojaryhmien pois tamiseksi selektiivisesti. Vapaat sivuketjuamino- ja -karboksyyliryhmät kytkettiin sitten kovalenttisesti molekyylissä käsittelemällä sopivalla amidinmuodostusreagens-silla, kuten difenyylifosforyyliatsidilla (DPPA), reagens-’·· 25 silla DCC, DIC tai BOP. Edullisia ovat tässä DCC ja BOP.

Tyypillisen renkaanmuodostusmenetelmän ohje oli seuraavanlainen:

Ohje 2

Vaihe Reagenssi Aika 30 1 DMF 1 x 30 s 2 20 - 40 % piperiini/DMF 1 min 3 DM F 1 x 30 s 4 20 - 40 % piperidiini/DMF 20 min 5 iPrOH 1 x 30 s 35 6 · DMF 1 x 30 s 7 iPrOH 2 x 30 s 111647 24 8 DMF 2 x 30 s 9 6 % DIPEA/CH2C12 2x2 min 10 CH2CI2 1 x 30 s 11 DMF 1 x 30 s 5 12 kytkeminen 1 x 24 tuntia 13 iPrOH 1 x 30 s 14 CH2CI2 1 x 30 s 15 DMF 2 x 30 s 16 CH2CI2 3 x 30 s 10

Koko synteesin aikana kytkentäreaktioita tarkkailtiin Kaiser-ninhydriinitestin avulla loppuunsaattamisasteen määrittämiseksi [Kaiser et ai., Anal. Biochem. 34 (1970) 15 595 - 598]. Hidas reaktiokinetiikka havaittiin aminohapoil la Boc-Arg(Tos), Boc-Asn ja Boc-Gln. Kaikkien epätäydellisten kytkemisreaktioiden tapauksessa joko uudelleenkytket-tiin käyttäen juuri valmistettua aktivoitua aminohappoa tai suojattiin käsittelemällä peptidihartsia etikkahappoanhyd-20 ridillä kuten yllä on kuvattu. Täydellisesti koottuja pep-tidihartseja kuivattiin tyhjössä useiden tuntien ajan.

Kunkin yhdisteen tapauksessa suojaryhmät poistettiin ja peptidi lohkaistiin hartsista seuraavan menetelmän avulla. Yleensä peptidi-hartseja käsiteltiin 25 -·· 25 100 pl:lla etaaniditiolia, 1 ml :11a anisolia ja 9 ml :11a nestemäistä fluorivetyä grammaa hartsia kohti 0 °C:ssa 45 -60 minuutin ajan Teflon HF -laitteessa (Peninsula). Vaihtoehtoisesti voitaisiin käyttää modifioitua kahden vaiheen lohkaisumenetelmää [Tam et ai., Tetrahedron Letters 23 30 (1982) 2939 - 2940] , jossa peptidi-hartsia käsiteltiin 3 ml :11a dimetyylisulfidia ja 1 ml :11a fluorivetyä 2 tunnin ajan 0 °C:ssa ja haihdutettiin ennen käsittelyä 90 % HF:llä. Haihtuvat reagenssit poistettiin sitten tyhjössä jäähauteen lämpötilassa. Jäännös pestiin kahdella tai kol-35 111647 25 mella 20 ml:n tilavuudella sekä Et20 että EtOAc ja suodatettiin. Peptidit uutettiin hartsista pesemällä kolmella tai neljällä 20 ml: n tilavuudella 10 % AcOH ja suodatettiin. Yhdistetyt vesisuodokset lyofilisoitiin, jolloin saa-5 tiin raaka tuote.

Raa'at peptidit puhdistettiin aluksi geelikromato-grafian avulla käyttäen Sephadex G-25 hieno -täytettä mono-meeristen aineiden erottamiseksi oligomeerisistä. Peptidit liuotettiin mahdollisimman pieneen tilavuuteen 10 % AcOH ja 10 lisättiin geelipylvääseen. Pylvästä eluoitiin 10 % AcOH:11a käyttäen virtausnopeutta 0,5·- 1,5 ml/min. Effluenttia tarkkailtiin aallonpituudella 254 nm ja halutun vyöhykkeen sisältävät fraktiot yhdistettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin puolittain puhdistettuja tuotteita.

15 Puolittain puhdistettujen peptidien puhdistaminen suoritettiin yleensä preparatiivisen HPLC:n avulla. Peptidit lisättiin pylväisiin mahdollisimman pienessä tilavuudessa joko 1 % AcOH tai 0,1 % TFA. Gradienttieluutio aloitettiin yleensä pitoisuudesta 10 % B-puskuriliuosta, 10 -20 25 % B 10 minuutissa ja 25 - 35 % B 3 tunnissa (puskuriliu os A: 0,1 % TFA/H20, puskuriliuos B: 0,1 % TFA/CH3CN) käyttäen virtausnopeutta 8,0 ml/min. UV:n avulla osoittaminen suoritettiin aallonpituudella 220 nm. Fraktioita koottiin 1,5 - 2,5 minuutin väliajoin ja tutkittiin analyyttisen ·· 25 HPLC:n avulla. Fraktiot, joiden arvioitiin olevan erittäin puhtaita, yhdistettiin ja lyofilisoitiin.

Lopullisten tuotteiden puhtaus tarkistettiin ana-• lyyttisen HPLC:n avulla käyttäen käänteisfaasipylvästä kuten yllä on mainittu. Yleensä käytettiin gradienttieluutio-30 ta, joka käsitti 20 - 40 % B (puskuriliuos A: 0, 022 % ... TFÄ/H2O, puskuriliuos B: 0,022 % TFA/CH3CN) 15 minuutissa virtausnopeuden ollessa 2,0 ml/min. Osoittaminen UV:n avulla tapahtui aallonpituudella 210 nm. Kaikkien tuotteiden puhtauden arvioitiin olevan noin 97 - 99 %. Suoritettiin 35 yksittäisten peptidien aminohappoanalyysejä, ja saadut arvot olivat hyväksyttävissä rajoissa. Yleensä kaikille lop- 111647 26 putuotteille suoritettiin myös nopea-atomipommitusmassa-spektrometria (FAB-MS). Kaikki tuotteet tuottivat odotetun hyväksyttävissä rajoissa olevan M + H-emäionin.

Tämän keksinnön mukaisesti saatavilla uusilla yh-5 disteillä on arvokkaita farmakologisia ominaisuuksia. Niillä on henkitorvea rentouttava vaikutus, ja ne ovat tehokkaita keuhkoputkea laajentavia aineita. Yhdisteillä on myös sydämeen ja verisuoniin liittyviä sivuvaikutuksia. Näiden uusien peptidien tuottama keuhkoputkien laajentuma voi jat-10 kua yli kahden tunnin ajan. Siten koska yhdisteet ovat erittäin aktiivisia keuhkoputkea laajentavia aineita, ne ovat arvokkaita farmaseuttisia vaikuttaja-aineita keuhkoputkia kuristavien sairauksien, esim. astman, hoitoa varten.

15 Kaavojen I - III mukaiset uudet yhdisteet voidaan yhdistää erilaisten tyypillisten farmaseuttisten kantaja-aineiden, edullisesti myrkyttömän, inertin, terapeuttisesti hyväksyttävän kantaja-aineen kanssa sellaisten koostumusten aikaansaamiseksi, jotka sopivat käytettäväksi keuhkoputkia 20 kuristavien sairauksien kuten astman hoidossa. Näiden yhdisteiden annostus galeenisessa antomuodossa riippuu erilaisista tekijöistä, kuten käytettävästä nimenomaisesta yhdisteestä ja nimenomaisesta koostumuksesta. Tehokkaan annostuksen voi alan ammatti-ihminen määrittää tässä esitetyn >·· 25 tehokkaan pitoisuuden (EC50) perusteella. Tyypillisiä an nostuksia ihmisillä olisivat 0,01 - 100 pg/kg. Yhdisteillä, joilla on alhainen EC50, kuten 0,1 pg, tyypillisiä annostuksia ihmisillä olisivat noin 0,02 - 20 pg/kg.

Kaavojen I - III mukaiset uudet yhdisteet muodosta-30 vat farmaseuttisesti hyväksyttäviä happoadditiosuoloja mo- 1·· nien erilaisten epäorgaanisten ja orgaanisten happojen, kuten rikki-, fosfori-, kloorivety-, bromivety-, jodivety-, typpi-, sulfamidi-, sitruuna-, maito-, palorypäle-, oksaa-li-, maleiini-, meripihka-, viini-, kaneli-, etikka-, trif-35 luorietikka-, bentsoe-, salisyyli-, glukoni-, askorbiini-ja vastaavien happojen, kanssa.

111647 27

Kysymyksessä olevat yhdisteet voidaan antaa potilaalle ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti joko laskimoon, ihon alle, lihakseen, suun kautta tai nenään. Edullinen an-tamistie ruoansulatuskanavan ulkopuolista antamista varten 5 on aerosolin avulla suun kautta tai nenään antaminen.

Tätä keksintöä valaistaan lisäksi seuraavien esimerkkien avulla.

Esimerkki 1

Boc-Thr(Bzl)-BHA-hartsin valmistus 10 Bentshydryyliamiinikopolystyreeni- 1 % divinyyli- bentseeniristikytkyhartsia (9,5 g, 3,6 milliekvivalenttia, 200 - 400 ASTM mesh, Vega Biochem) turvotettiin 100 ml:ssa metyleenikloridia, suodatettiin ja pestiin käyttäen ohjeen 1 vaiheita 7-8. Boc-Thr(Bzl):n (3,35 g, 10,8 mmol) ja di-15 sykloheksyylikarbodi-imidin (1,12 g, 5,42 mmol) annettiin reagoida 50 ml:ssa CH2CI2 1 tunnin ajan, suodatettiin ja lisättiin 50 ml:ssa CH2CI2 turvonneen hartsin joukkoon. Tätä seosta ravistettiin 18 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. DIPEA (630 ml, 3,6 mmol) lisättiin ja sitten ravistettiin 20 vielä 1 tunnin ajan, suodatettiin ja sitten suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 10 - 14. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Kaikki reagoimattomat amiiniryhmät suojattiin käsittelemällä hartsia 1 ml :11a etikkahappoanhydridiä ja 1 ml:11a DIPEA 50 ml:ssa metyleenikloridia 30 minuutin ajan, ♦· 25 suodatettiin ja pestiin ohjeen 1 vaiheiden 13 - 14 mukaan.

Hartsia kuivattiin tyhjössä yön ajan, jolloin saatiin 9,8 g Boc-Thr(Bzl)-BHA-hartsia. Osalle tästä hartsista suoritettiin aminohappoanalyysi, joka osoitti kuormituksen olevan 0,17 mmoolia Thr/g.

30 Esimerkki 2

Yhdisteen Ac-[Lys12, Nle17, Vai26, Thr28] -VIP-syklo- (Asp8 -> Lys12) [Ac- (SEQ ID No:20)-NH2] valmistus

Esimerkistä 1 saadulle Boc-Thr(Bzl)-BHA-hartsille (9,8 g, 1,7 mmol) suoritettiin kiinteän faasin synteesi 35 käytäen yllä olevaa ohjetta 1. Kaikki kytkemiset suoritettiin käyttäen ennalta muodostettuja symmetrisiä anhydride- 111647 28 jä, jotka oli valmistettu Boc-aminohaposta ja disyklohek-syylikarbodi-imidistä. Boc-asparagiini, Boc-glutamiini ja Boc-histidiini(bentsyloksimetyyli) kytkettiin vastaavina HOBT-aktiivisina estereinä. Reaktioajat olivat yleensä 1 -5 18 tuntia kytkemisvaiheen loppuun suorittamiseksi. Suori tettiin viisi kytkentäjaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kullakin aminohapoista Boc-Leu (1,5 g, 6,0 mmol), Boc-Val (1,3 g, 6,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (1,8 g, 6,0 mmol), Boc-Asn (773 mg, 3,3 mmol) ja Boc-Leu (1,5 g, 6,0 mmol). Hartsi 10 kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 12,2 g Boc- heksapeptidihartsia.

8,2 g:n (1,13 mmol) osa tästä hartsista kytkettiin kuuden jakson avulla, jotka käsittivät yhden jakson kunkin aminohapoista Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,77 g, 4,0 mmol), Boc-15 Lys(2-Cl-Z) (1,67 g, 4,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,67 g, 4,0 mmol), Boc-Val (876 mg, 4,0 mmol), Boc-Ala (762 mg, 4,0 mmol) ja Boc-Nle (932 mg, 4,0 mmol) kanssa, jolloin saatiin 10,2 g Boc-dodekapeptidihartsia.

1,26 g:n (0,139 mmol) osalle tästä hartsista suori-20 tettiin kaksi kytkentäjaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kummankin aminohapoista Boc-Gln (205 mg, 0,93 mmol) ja Boc-Lys (2-Cl-Z) (627 mg, 1,5 mmol) kanssa. Puolelle tästä hart sista (0,069 mmol) suoritettiin neljätoista kytkentäjaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kunkin aminohapoista Boc-" 25 Arg(Tos) (324 mg, 0,76 mmol), Boc-Leu (188 mg, 0,76 mmol),

Boc-Lys(Fmoc) (354 mg, 0,76 mmol), Boc-Thr(Bzl) (234 mg, 0,76 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (333 mg, 0,76 mmol), Boc-Asn (97 mg, 0,76 mmol), Boc-Asp(OFm) (311 mg, 0,76 mmol), Boc-Thr(Bzl) (234 mg, 0,76 mmol), Boc-Phe (201 mg, 0,76 mmol), 30 Boc-Val (164 mg, 0,76 mmol), Boc-Ala (143 mg, 0,76 mmol), .. Boc-Asp(OcHx) (238 mg, 0,76 mmol), Boc-Ser(Bzl) (223 mg, 0,76 mmol) ja Boc-His(Bom) (156 mg, 0,41 mmol) kanssa. Pep-tidihartsille suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 1,0 ml:11a etikkahappoanhydridiä ja 66 ml:11a 35 DIPEA (0,38 mmol) 20 ml:ssa metyleenikloridia 30 minuutin ajan. Hartsi pestiin käyttäen vaiheita 10 - 14.

111647 29

Hartsista poistettiin sitten selektiivisesti suojausta käsittelemällä ohjeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan ja sen annettiin reagoida seitsemän kertaa DCC:n (49 mg, 0,24 mmol) ja HOBT:n (32 mg, 0,24 mmol) kanssa 20 mlrssa tislat-5 tua DMF 24 tunnin ajan. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Hartsi pestiin ohjeen 2 vaiheiden 13 - 16 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 0,72 g.

Tätä hartsia käsiteltiin 6 ml :11a dimetyylisulfidia ja 2 ml: 11a nestemäistä HF 2 tunnin ajan 0 °C:ssa. Reak-10 tioseos haihdutettiin ja jäännöstä käsiteltiin 0,7 ml:11a anisolia ja 6 ml :11a nestemäistä HF 45 minuutin ajan 0 °C:ssa. Reaktioseos haihdutettiin ja jäännös pestiin 1 x 15 ml :11a Et20 ja 3 x 15 ml :11a EtOAc. Hartsia uutettiin 3 x 20 ml:11a 10 % AcOH. Yhdistetyt vesisuodokset lyofili-15 soitiin, jolloin saatiin 227 mg valkeaa kiinteää ainetta.

Tämä raaka aine puhdistettiin preparatiivisen HPLC:n avulla käyttäen Whatman Magnum-20 ODS-3 -pylvästä (2 x 25 cm) ja eluoiden lineaarisen gradientin avulla, jonka muodosti 10 - 40 % B (puskuriliuos A: 0,1 % TFA/H2O, 20 puskuriliuos B: 0,1 % TFA/CH3CN) 4 tunnissa. Päähuippu ero tettiin koottujen fraktioiden analyyttinen HPLC -analyysin avulla, yhdistettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 26,7 mg puolipuhdasta tuotetta. Tämä aine lisättiin uudelleen Magnum-20 ODS-3 -pylvääseen (2 x 50 cm) ja eluoitiin " 25 käyttäen samaa gradienttia. Päähuippu erotettiin ja lyofi- lisoitiin, jolloin saatiin 9,5 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Tämä yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja tuotti oikeanlaisen aminohappoanalyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3277,8, saatu 3276,1.

30 Esimerkki 3 * ♦ .. Yhdisteen Ac-[Glu8, Lys12, Nle17, Vai26, Thr28]-VIP- syklo-(Glu8 —» Lys12) [Ac-(SEQ ID No:21)-NH2] valmistus

Bentshydryyliamiinikopolystyreeni- 1 % divinyyli-35 bentseeniristikytkyhartsi (17,7 g, 2,6 milliekvivalenttia, 200 - 400 ASTM mesh, Vega Biochem) turvotettiin 160 ml:ssa 111647 30 metyleenikloridia, suodatettiin ja pestiin ohjeen 1 vaiheiden 7-8 mukaan. Hartsi uudelleensuspendoitiin 160 ml:aan metyleenikloridia ja tähän lisättiin Boc-Thr(Bzl) (6,25 g, 20,2 mmol) ja disykloheksyylikarbodi-imidiä (2,10 g, 10,1 5 mmol). Tätä seosta ravistettiin 8 tunnin ajan huoneenlämpö-tilassa, suodatettiin ja sitten suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 10 - 14. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Reagoimattomat amiiniryhmät suojattiin käsittelemällä hartsia 5 ml:11a etikkahappoanhydridiä ja 5 ml:11a DIPEA 150 10 ml:ssa metyleenikloridia 60 minuutin ajan, suodatettiin ja pestiin vaiheiden 13 - 14 mukaan. Hartsia kuivattiin tyhjössä yön ajan, jolloin saatiin 18,0 g Boc-Thr(Bzl)-BHA-hartsia. Osalle tästä hartsista suoritettiin aminohappoana-lyysi, joka osoitti kuormituksen olevan 0,17 mmoolia Thr/g. 15 Boc-Thr(Bzl)-BHA-hartsille (18,0 g, 3,06 mmol) suo ritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen yllä olevaa ohjetta 1. Kaikki kytkemiset suoritettiin käyttäen ennalta muodostettuja symmetrisiä anhydridejä, jotka oli valmistettu Boc-aminohaposta ja disykloheksyylikarbodi-imidistä. 20 Boc-asparagiini, Boc-glutamiini ja Boc-histidiini(bents-yloksimetyyli) kytkettiin vastaavina HOBT- aktiivisina estereinä. Suoritettiin viisi kytkentäjaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kunkin aminohapoista Boc-Leu (6,1 g, 24,5 mmol), Boc-Val (5,32 g, 24,5 mmol), Boc-Ser(Bzl) (7,23 g, ·· 25 24,5 mmol), Boc-Asn (3,13 g, 13,5 mmol) ja Boc-Leu (6,1 g, 24,5 mmol) kanssa. Hartsi kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 22,9 g Boc-heksapeptidihartsia.

7,48 g:n (1,0 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin kymmenen kytkentäjaksoa, jotka käsittivät yhden 30 jakson kunkin aminohapoista Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,76 g, 4,0 .. mmol), Boc-Lys (2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Lys (2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), Boc-Val (869 mg, 4,0 mmol), Boc-Ala (1,5 g, 8,0 mmol), Boc-Nle (925 mg, 4,0 mmol), Boc-Gln (1,08 g, 4,4 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (1,66 g, 4,0 mmol), 35 Boc-Arg(Tos) (1,71 g, 4,0 mmol) ja Boc-Leu (998 mg, 4,0 111647 31 mmol) kanssa, jolloin saatiin 9,6 g Boc-heksadekapeptidihartsia.

7,68 g:n (0,8 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin yksi kytkentäjakso aminohapon Boc-Lys(Fmoc) (1,5 g, 5 3,2 mmol) kanssa, jolloin saatiin 8,32 g Boc- heptadekapeptidihartsia.

6,24 g:n (0,6 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin kaksi kytkentäjakoa, jotka käsittivät yhden jakson kummankin aminohapoista Boc-Thr(Bzl) (742 mg, 2,4 mmol) ja 10 Boc-Tyr(2,6-DCB) (1,06 g, 2,4 mmol) kanssa, jolloin saatiin 6,28 g Boc-nonadekapeptidihartsia.

2,09 g:n (0,2 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin yhdeksän kytkentäjaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kunkin aminohapoista Boc-Asn (204 mg, 0,88 mmol), 15 Boc-Asp(OFm) (340 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp(OcHx) (258 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol) ja Boc-His(Bom) (330 mg, 0,88 mmol) kanssa. Peptidihartsille suoritettiin 20 ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,25 mlrlla etikkahappoanhydridiä ja 70 ml:11a DIPEA 20 ml:ssa mety-leenikloridia 20 minuutin ajan. Hartsi pestiin vaiheiden 10-14 mukaan.

Hartsista poistettiin selektiivisesti suojausta kä-.· _ 25 sittelemällä ohjeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan. Kolmen nel jäsosan tästä hartsista (0,15 mmol) annettiin reagoida DCC:n (77 mg, 0,37 mmol) ja HOBT:n (51 mg, 0,37 mmol) kanssa 20 ml:ssa tislattua DFM 72 tunnin ajan ja 20 mlrssa to-lueenia 24 tunnin ajan. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli ne-30 gatiivinen. Hartsi pestiin ohjeen 2 vaiheiden 13 - 16 mu- V. kaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 1,72 g.

1,14 g:n (0,099 mmol) osasta tätä hartsia poistettiin suojaus käsittelemällä, kuten esimerkissä 2, paitsi että toisessa vaiheessa käytettiin 1 ml anisolia ja 9 ml 35 HF. Reaktioseos haihdutettiin ja jäännös pestiin 1 x 15 ml:lla Et20 ja 3 x 15 ml:11a EtOAc. Hartsia uutettiin 3 x 111647 32 20 ml :11a 10 % AcOH. Yhdistetyt vesisuodokset lyofilisoi-tiin, jolloin saatiin 535 mg valkeaa kiinteää ainetta.

Tämä raaka aine puhdistettiin geelisuodatuksen avulla käyttäen Sephadex G-25 hienoa (2 x 100 cm: n pylväs) 5 ja eluoiden 10 % AcOH:11a. Monomeerihuippu erotettiin koottujen fraktioiden analyyttinen HPLC -analyysin avulla, yhdistettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 83,5 mg puolittain puhdistettua tuotetta. Tämä aine puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 2, 10 paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 20 - 40 % 3 tunnissa. Päähuippu erotettiin koottujen fraktioiden analyyttinen HPLC -analyysin avulla, yhdistettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 18,9 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Tämä yhdiste oli homogeeninen HPLC:n 15 perusteella ja tuotti oikean aminohappoanalyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3292,0, saatu 3291,8.

Esimerkki 4

Yhdisteen Ac-[Asn8, Asp9, Lys12, Nle17, Vai26, Thr28]- VIP-syklo- (Asp9 Lys12) [Ac-(SEQ ID No:22)-NH2] 20 valmistus 1,55 g:n (0,15 mmol) osalle esimerkistä 3 saatua Boc-nonadekapeptidihartsia suoritettiin yhdeksän kytkentä-jaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kunkin aminohapoista Boc-Asp(OFm) (247 mg, 0,6 mmol), Boc-Asn (153 mg, 0,66 25 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (159 mg, 0,6 mmol), Boc-Val (130 mg, 0,6 mmol), Boc-Ala (113 mg, 0,6 mmol), Boc-Asp(OcHx) (189 mg, 0,6 mmol), Boc-Ser(Bzl) (177 mg, 0,6 mmol) ja Boc-His(Born) (248 mg, 0,66 mmol) kanssa. Peptidihartsille suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja si-30 tä käsiteltiin 0,25 ml :11a etikkahappoanhydridiä ja 70 ml :11a DIPEA 20 ml:ssa metyleenikloridia 30 minuutin ajan. Hartsi pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan.

Hartsista poistettiin sitten selektiivisesti suojausta käsittelemällä ohjeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan ja sen 35 annettiin reagoida kaksi kertaa DCC:n (77 mg, 0,37 mmol) ja HOBT:n (51 mg, 0,37 mmol) kanssa 20 ml:ssa tislattua DMF 24 111647 33 ja 72 tunnin ajan ja kaksi kertaa 20 ml:ssa tolueenia 24 ja 48 tunnin ajan. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Hartsi pestiin ohjeen 2 vaiheiden 13 - 15 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 1,54 g.

5 1,26 g:n (0,122 mmol) osasta tätä hartsia poistet tiin suojaus käsittelemällä HF:llä, kuten esimerkissä 3. Reaktioseos haihdutettiin ja jäännös pestiin 1 x 15 ml:11a Et20 ja 3 x 15 ml:11a EtOAc. Hartsia uutettiin 3 x 20 ml:11a 10 % AcOH. Yhdistetyt vesisuodokset lyofilisoitiin, 10 jolloin saatiin 485 mg valkeaa kiinteää ainetta.

Tämä raaka aine puhdistettiin geelisuodatuksen avulla käyttäen Sephadex G-25 hienoa, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 83,5 mg puolittain puhdistettua tuotetta. Tämä aine puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n 15 avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 20 - 45 % 3 tunnissa. Pää-huippu erotettiin koottujen fraktioiden analyyttinen HPLC -analyysin avulla, yhdistettiin ja lyofilisoitiin, jolloin ’ saatiin 11,5 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Tämä yhdiste 20 oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja tuotti oikean amino-happoanalyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3277,8, saatu 3277,6.

Esimerkki 5

Yhdisteen Ac-[Orn12, Nle17, Vai26, Thr28]-VIP-syklo- (Asp8 —> Orn12) [Ac-(SEQ ID No:23)-NH2] valmistus *· 25 1, 92 g:n (0,2 mmol) osalle esimerkistä 3 saatua

Boc-heksadekapeptidihartsia suoritettiin kaksitoista kytkentä jaksoa, jotka käsittivät yhden jakson kunkin aminohapoista Boc-Orn(Fmoc) (364 mg, 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (495 mg, 1,6 mmol), Boc-Tyr (2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol), 30 Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Asp(OFm) (329 mg, 0,8 • · ... mmol), Boc-Thr(Bzl) (495 mg, 1,6 millimolia) , Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Boc-Ala (151 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp (OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 millimolia) ja Boc-His(Born) (330 mg, 35 0,88 mmol) kanssa. Peptidihartsille suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,25 ml :11a etikkahap- 111647 34 poanhydridiä ja 70 ml :11a DIPEA 20 ml:ssa metyleenikloridia 30 minuutin ajan. Hartsi pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan ja sitä kuivattiin yön ajan, jolloin saatiin 2,38 g.

1,38 g:n (0,11 mmol) osasta tätä hartsia poistet-5 tiin sitten selektiivisesti suojausta käsittelemällä ohjeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan ja annettiin reagoida DCC:n (55' mg, 0,27 mmol) ja HOBT:n (37 mg, 0,27 mmol) kanssa 20 ml:ssa tislattua DMF 24 tunnin ajan, 20 ml:ssa tolueenia 24 tunnin ajan ja viisi kertaa 20 ml:ssa tislattua DMF 24 10 tunnin ajan. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli heikosti positiivinen. Hartsi pestiin ohjeen 2 vaiheiden 13 - 16 mukaan ja kuivattiin tyhjössä.

0,8 g:n (0,05 mmol) osasta tätä hartsia poistettiin suojaus käsittelemäälä HF:llä, kuten esimerkissä 3. Reak-15 tioseos haihdutettiin ja jäännös pestiin 1 x 15 ml:11a Et20 ja 3 x 15 ml :11a EtOAc. Hartsia uutettiin 3 x 20 ml :11a 10 % AcOH. Yhdistetyt vesisuodokset lyofilisoitiin, jolloin saatiin 429 mg kumimaista kiinteää ainetta.

Tämä raaka aine puhdistettiin geelisuodatuksen 20 avulla käyttäen Sephadex G-25 hienoa, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 107 mg puolittain puhdistettua tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 10 - 40 % 3 tunnissa. Pää-25 huippu erotettiin koottujen fraktioiden analyyttinen HPLC -analyysin avulla, yhdistettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 17,5 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Tämä yhdiste 011 homogeeninen HPLC:n perusteella ja tuotti oikean amino-happoanalyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3263,7, saatu 3264,1.

30 Esimerkki 6

Yhdisteen Ac-[Lys8, Asp12, Nle17, Vai26, Thr28] -VIP-syklo-(Lys8 -» Asp12) [Ac-(SEQ ID No:24)-NH2] valmistus 1,0 g:n (0,1 mmol) osalle esimerkistä 3 saatua Boc-35 heksadekapeptidihartsia suoritettiin kaksitoista kytkentä-jaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista 111647 35

Boc-Asp(OFm) (165 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (176 mg, 0,4 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Lys(Fmoc) (187 mg, 0,4 mmol), Boc-Thr(Bzl) (124 mg, 0,4 mmol), Boc-Phe (106 mg, 0,4 mmol), 5 Boc-Val (87 mg, 0,4 mmol), Boc-Ala (76 mg, 0,4 mmol), Bo-Asp (OcHx) (126 mg, 0,4 mmol), Boc-Ser(Bzl) (118 mg, 0,4 mmol) ja Boc-His(Bom) (150 mg, 0,4 mmol) kanssa. Peptidi-hartsille suoritettiin ohjeen vaiheet 1 - 8 ja sitä käsiteltiin 0,5 ml:11a etikkahappoanhydridiä ja 35 ml:11a DIPEA 10 20 ml:ssa metyleenikloridia 30 minuutin ajan. Hartsia pes tiin vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin yön ajan, jolloin saatiin 1,2 g.

0,8 g:n (0,066 mmol) osasta tätä hartsia poistettiin sitten selektiivisesti suojausta käsittelemällä ohjeen 15 2 vaiheiden 1-11 mukaan ja sen annettiin reagoida BOP:n (58 mg, 0,13 mmol) kanssa 20 ml:ssa tislattua DMF 24 tunnin ajan. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Hartsi pestiin ohjeen 2 vaiheiden 13 - 16 mukaan ja kuivattiin tyhj össä.

20 Tästä hartsista poistettiin suojaus käsittelemäälä HF:llä, kuten esimerkissä 3. Reaktioseos haihdutettiin ja jäännöstä pestiin 1 x 15 ml:11a Et20 ja 3 x 15 ml:11a EtO-Ac. Hartsia uutettiin 3 x 20 ml :11a 10 % AcOH. Yhdistetyt vesisuodokset lyofilisoitiin, jolloin saatiin kumimainen ··* 25 kiinteä aine.

Tämä raaka aine puhdistettiin geelisuodatuksen avulla käyttäen Sephadex G-25 hienoa, kuten esimerkissä 3, .jolloin saatiin 43,8 mg puolittain puhdistettua tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n 30 avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaa- · < rista gradienttia, joka käsitti 10 - 40 % 3 tunnissa. Pää-huippu erotettiin koottujen fraktioiden analyyttinen HPLC -analyysin avulla, yhdistettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 7,5 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Tämä yhdiste 35 oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja tuotti oikean amino-happoanalyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3277,8, saatu 3276,4.

111647 36

Esimerkki 7

Yhdisteen Ac-[Glu8, Orn12, Nle17, Vai26, Thr28] -VIP-syklo- (Glu8 -> Orn12) [Ac-(SEQ ID No:25)-NH2] valmistus 5 Bentshydryyliamiinikopolystyreeni- 1 % divinyyli- bentseeeniristikytkyhartsia (25,0 g, 17,5 milliekvivalent-tia, 200 - 400 ASTM mesh, Bachem) turvotettiin 160 mltssa metyleenikloridia, suodatettiin ja pestiin taulukossa 1 olevan ohjeen vaiheiden 7-8 mukaan. Hartsi uudelleensus-10 pendoitiin 160 ml:aan metyleenikloridia ja tähän lisättiin Boc-Thr(Bzl) (16,2 g, 52,5 mmol) ja disykloheksyylikarbodi-imidiä (5,4 g, 26,2 mmol). Tätä seosta ravistettiin 6 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, suodatettiin ja sitten suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 10 - 14. Kaiser-ninhydriini- 15 analyysi oli negatiivinen. Reagoimattomat amiiniryhmät suojattiin käsittelemällä hartsia 5 ml :11a etikkahappoanhydri-diä ja 5 ml:11a DIPEA 150 ml:ssa metyleenikloridia 60 minuutin ajan, suodatettiin ja pestiin ohjeen vaiheiden 13 -14 mukaan. Hartsia kuivattiin tyhjössä yön ajan, jolloin 20 saatiin 29,6 g Boc-Thr(Bzl)-BHA-hartsia. Osalle tästä hartsista suoritettiin aminohappoanalyysi, joka osoitti kuormituksen olevan 0,21 mmoolia Thr/g.

14,0 g:n (2,94 mmol) osalle tästä hartsista suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen yllä olevaa oh-25 jetta kuten esimerkissä 2. Suoritettiin yksitoista kytken-täjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Leu (5,9 g, 23,5 mmol), Boc-Val (5,1 g, 23,5 mmol), Boc-Ser(Bzl) (6,9 g, 23,5 mmol), Boc-Asn (3,0 g, 13,0 mmol), Boc-Leu (5,9 g, 23,5 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) 30 (10,3 g, 23,5 mmol), Boc-Lys (2-C1-Z) (9,8 g, 23,5 mmol),

Boc-Lys (2-C1-Z) (9,8 g, 23,5 mmol), Boc-Val (5,1 g, 23,5 mmol), Boc-Ala (4,4 g, 23,5 mmol) ja Boc-Nle (5,4 g, 23,5 mmol) kanssa, jolloin saatiin 26 g Boc-dekapeptidihartsia.

5,5 g:n (0,61 mmol) osalle tästä hartsista suori-35 tettiin kytkeminen neljän jakson avulla, jotka käsittivät yhden jakson kunkin aminohapoista Boc-Gln (655 mg, 2,7 111647 37 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) (2,0 g, 4,8 mmol), Boc-Arg(Tos) (2,1 g, 4,8 mmol) ja Boc-Leu (1,2 g, 4,8 mmol) kanssa. Hartsia kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 6,12 g Boc-heksadekapeptidihartsia.

5 2,0 g:n (0,2 mmol) osalle tästä hartsista suoritet tiin kaksitoista kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Orn(Fmoc) (91 mg, 0,2 mmol), Boc-Thr(Bzl) (250 mg, 0,8 mmol), Boc-Tyr (2,6-DCB) (352 mg, 0,8 mmol), Boc-Asn (102 mg, 0,44 mmol), Boc-Glu(OFm) (340 mg, 10 0,8 mmol), Boc-Thr(Bzl) (248 mg, 0,8 mmol), Boc-Phe (212 mg, 0,8 mmol), Boc-Val (174 mg, 0,8 mmol), Bo-Ala (152 mg, 0,8 mmol), Boc-Asp (OcHx) (252 mg, 0,8 mmol), Boc-Ser(Bzl) (236 mg, 0,8 mmol) ja Boc-His(Born) (150 mg, 0,4 mmol) kanssa. Peptidihartsille suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 1 - 8 ja 15 sitä käsiteltiin 0,5 ml:11a etikkahappoanhydridiä ja 38 ml:11a DIPEA 30 ml:ssa metyleenikloridia 180 minuutin ajan. Hartsia pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä,. jolloin saatiin 2,4 g.

1,15 g:n (0,1 mmol) osasta tätä hartsia poistettiin 20 sitten selektiivisesti suojausta käsittelemällä ohjeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan ja sen annettiin reagoida kaksi kertaa BOP:n (58 mg, 0,13 mmol) ja 400 ml:n DIPEA kanssa 20 ml:ssa tislattua DM F 24 ja 6 tunnin ajan. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Tätä hartsia pestiin .· 25 ohjeen 2 vaiheiden 13 - 16 mukaan ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 1,05 g.

Tästä hartsista poistettiin suojaus käsittelemällä 9 ml:11a HF, 1 ml:11a anisolia ja 100 ml :11a etaaniditiolia 1 tunnin ajan 0 °C:ssa. Reaktioseos haihdutettiin ja jään-30 nöstä pestiin 2 x 15 ml :11a Et2<D ja 2 x 15 ml :11a EtOAc.

• « ·,. Hartsia uutettiin 4 x 20 ml :11a 10 % AcOH. Yhdistetyt ve- sisuodokset lyofilisoitiin, jolloin saatiin 385 mg vaaleaa, keltaista kiinteää ainetta.

Tämä raaka aine puhdistettiin geelisuodatuksen 35 avulla käyttäen Sephadex G-25 hienoa, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 134 mg puolittain puhdistettua tuotetta.

111647 38 Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradienttia, joka käsitti 26 - 36 % 3 tunnissa. Päa-huippu erotettiin koottujen fraktioiden analyyttinen HPLC -5 analyysin avulla, yhdistettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 23,2 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Tämä yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean amino-happoanalyysin. FAB-MS: MH laskettuna 3277,8, saatu 3276,3. Esimerkki 8 10 Yhdisteen Ac-[Lys12, Glu16, Nle17, Vai26, Thr28]-VIP- syklo-(Lys12 —» Glu16) [Ac-(SEQ ID No :26)-11¾] valmistus

Bentshydryyliamiinikopolystyreeni- 1 % divinyyli-bentseeniristikytkyhartsia (30 g, 21,4 milliekvivalenttia, 15 200 - 400 ASTM nesh, Bachem) käsiteltiin, kuten esimerkissä 22, paitsi että käytettiin 19,9 g Boc-Thr(Bzl) (64,3 mmol) ja 6,6 g disykloheksyylikarbodi-imidiä (32,1 mmol). Tätä seosta ravistettiin 18 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, suodatettiin ja sitten suoritettiin ohjeen 1 vaiheet 10 -20 14. Kaiser-ninhydriinianalyysi oli negatiivinen. Reagoimat tomat amiiniryhmät suojattiin käsittelemällä hartsia 8 ml:11a etikkahappoanhydridiä ja 8 ml :11a DIPEA 200 ml:ssa metyleenikloridia 60 minuutin ajan, suodatettiin ja pestiin ohjeen vaiheiden 13 - 14 mukaan. Hartsia kuivattiin tyhjös-··- 25 sä yön ajan, jolloin saatiin 34,2 g Boc-Thr(Bzl)-BHA- hartsia. Osalle tästä hartsista suoritettiin aminohappoana-lyysi, joka osoitti kuormauksen olevan 0,47 mmoolia Thr/g.

0,85 g:n (0,4 mmol) osalle tätä Boc-Thr (Bzl)-BHA-hartsia suoritettiin kiinteän faasin synteesi käyttäen Ap-30 plied Biosystems malli 430A-peptidisyntetisoijaa. Kaikki

« · I

kytkemiset suoritettiin käyttäen ennalta muodostettuja symmetrisiä anhydridejä, jotka oli valmistettu Boc- aminohaposta ja disykloheksyylikarbodi-imidistä. Boc- asparagiini, Boc-glutamiini ja Boc-arginiini(tosyyli) kyt-35 kettiin rutiininomaisesti vastaavina HOBT- aktiivisina estereinä. Suoritettiin yksitoista kytkentäjaksoa, joihin si- 111647 39 sältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol) , Boc-Ser(Bzl) (590 mg, 2.0 mmol), Boc-Asn (464 mg, 2,0 mmol), Boc-Leu (499 mg, 2,0 mmol), Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys(2-C1-Z) 5 (830 mg, 2,0 mmol), Boc-Lys (2-C1-Z) (830 mg, 2,0 mmol),

Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol) ja Boc-Nle (462 mg, 2,0 mmol) kanssa, jolloin saatiin Boc-dodekapeptidihartsi.

Tälle hartsille suoritettiin sitten viisi kytkentä-10 jaksoa, kuten esimerkissä 2, joihin sisältyi yksi jakso kunkin aminohapoista Boc-Glu(OFm) (340 mg, 0,8 mmol), Boc-Lys (2-C1-Z) (664 mg, 1,6 mmol), Boc-Arg(Tos) (685 mg, 1,6 mmol), Boc-Leu (398 mg, 1,6 mmol) ja Boc-Lys(Fmoc) (375 mg, 0,8 mmol) kanssa. Hartsi kuivattiin tyhjössä, jolloin saa-15 tiin 2,12 g Boc-heptadekapeptidihartsia.

1,06 g:n (0,2 mmol) osasta tätä hartsia poistettiin sitten selektiivisesti suojausta käsittelemällä ohjeen 2 vaiheiden 1-11 mukaan ja sen annettiin reagoida kaksi krtaa BOP:n (177 mg, 0,4 mmol) ja 200 ml:n DIPEA kanssa 20 20 mlrssa tislattua DMF 2 ja 8 tunnin ajan. Kaiser- ninhydriinianalyysi oli heikosti positiivinen. Reagoimattomat amiiniryhmät suojattiin käsittelemällä hartsia 0,5 ml:lla etikkahappoanhydridiä 20 mlrssa 6 % DI-PEA/metyleenikloridia 10 minuutin ajan, suodatettiin ja ·· 25 pestiin ohjeen 2 vaiheiden 13 - 16 mukaan. Tälle hartsille suoritettiin sitten yksi kytkentäjakso Boc-Thr(Bzl):n (495 mg, 1,6 mmol) kanssa ja se pantiin sitten takaisin Applied Biosystems 430A-peptidisyntetisoijaan kuten yllä. Suoritettiin kymmenen kytkentäjaksoa, joihin sisältyi yksi jakso 30 kunkin aminohapoista Boc-Tyr(2,6-DCB) (880 mg, 2,0 mmol), .. Boc-Asn (4 64 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp (OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Thr (Bzl) (618 mg, 2,0 mmol), Boc-Phe (531 mg, 2.0 mmol), Boc-Val (435 mg, 2,0 mmol), Boc-Ala (378 mg, 2,0 mmol), Boc-Asp(OcHx) (630 mg, 2,0 mmol), Boc-Ser(Bzl) (590 35 mg, 2,0 mmol) ja Boc-His(Tos) (819 mg, 2,0 mmol) kanssa. Peptidi-hartsille suoritettiin sitten ohjeen 1 vaiheet 111647 40 1 - 8 ja sen annettiin reagoida 0,5 ml:n etikkahappoanhyd-ridiä ja 100 ml:n DIPEA kanssa 20 ml:ssa metyleenikloridia 30 minuutin ajan. Hartsi pestiin vaiheiden 10 - 14 mukaan ja kuivattiin tyhjössä.

5 Peptidi-hartsista poistettiin suojaus, kuten esi

merkissä 7, jolloin saatiin 340 mg raakaa peptidiä. Peptidi puhdistettiin geelisuodatuksen avulla, kuten esimerkissä 3, jolloin saatiin 35 mg puolipuhdasta tuotetta. Tätä ainetta puhdistettiin lisäksi preparatiivisen HPLC:n avulla, kuten 10 esimerkissä 3, paitsi että käytettiin lineaarista gradient-tia, joka käsitti 25 - 35 %, jolloin saatiin 15,6 mg valkeaa, amorfista jauhetta. Yhdiste oli homogeeninen HPLC:n perusteella ja antoi oikean aminohappoanalyysin. FAB-MS: MH

laskettuna 3276,6, saatu 3278,0.

15 Koe-esimerkki 1 VIP-analogien henkitorvea rentouttava vaikutus VIP-analogien rentouttavaa aktiivisuutta tutkittiin mallissa, jossa käytettiin marsun henkitorvea. [Wasserman, M. A. et ai., teoksessa Vasoactive Intestinal Peptide, S. I. 20 Said, toim., Raven Press, N.Y. 1982, s. 177 - 184]. Kaikki kudokset otettiin urospuolisilta albiinomarsuilta, jotka painoivat 400 - 600 g ja jotka oli nukutettu uretaanin avulla (2 g/kg, ip.). Sen jälkeen kun ruumiinosa oli saatettu verettömäksi, henkitorvi poistettiin ja jaettiin nel- ·· 25 jäksi rengaslohkoksi (pituus 3 mm) . Kukin rengas ripustet tiin läpimitan 30 omaavien ruostumatonta terästä olevien lankojen avulla 10 ml: n vaipalliseen kudoshauteeseen ja kiinnitettiin 4 - 0-silkkilangan avulla Grass-voimasiir-tymäanturiin (malli FT03C, Grass Instruments Co., Quincy, 30 MA) jännityksen isometristä rekisteröintiä varten. Sileän • * t ... lihaksen haudenesteenä oli muunnettu Krebsin liuos, jolla oli seuraava koostumus: NaCl 120 mM; KC1 4,7 mM; CaCl2 2,5 mM; MgS04.7H20 1,2 mM; NaHC03 25 mM; K2HP04 yksiemäksinen 1,2 mM ja dekstroosi 10 mM. Kudoshauteita pidettiin 37 35 °C:ssa ja niihin pulputettiin jatkuvasti 95 % 02 ja 5 % C02. Vasteet rekisteröitiin 8 kanavan ja 4 kanavan Hewlett- 111647 41

Packard (vastaavasti mallit 7702B ja 7754A) rekisteröinti-laitteen avulla (Hewlett-Packard, Paramus, NJ). Henkitorvi-renkaat pantiin 1,5 g:n lepojännitykseen, jonka oli esiko-keissa määritetty olevan optimaalinen tai lähes optimaali-5 nen. Vaadittiin lukuisia jännityksen uudelleensäätöjä seuranneen 60 minuutin stabilointiajan aikana. Kudoksia huuhdottiin 15 minuutin väliajoin.

Kullekin kudokselle aikaansaatiin kumulatiivinen pitoisuusvastekäyrä hauteen VIP:n tai VIP-analogien pitoi-10 suuden peräkkäisten μ1:η lisäysten avulla VanRossumin menetelmän mukaan [Arch. Int. Pharmacodyn. 143 (1963) 299 - 330] . Ainoastaan yksi kumulatiivinen annosvastekäyrä aikaansaatiin yhdellä yksittäisellä kudoksella. Kudosten välisen vaihtelevuuden minimoimiseksi rentoutusvasteet il-15 maistiin prosenttimääränä maksimivasteesta, joka saatiin kunkin pitoisuusvastekokeen lopussa lisätylle VIP:lie (10-6 M = 100 %). Kolmelta kudokselta saadut vasteet yhdistettiin ja EC5o-arvot määritettiin lineaarisen regression avulla.

Tulokset, joista on yhteenveto taulukossa I, osoit-20 tavat kaavojen I - III mukaisten VIP-analogien henkitorvea rentouttavan vaikutuksen verrattuna alkuperäiseen VIP:iin.

Taulukko I

VIP-analogien rentouttava vaikutus marsun henkitorven sile-·· 25 ään lihakseen EC50

Yhdiste (nM) VIP[(Seq ID NO:l)-NH2] 10 30 • · ·

Ac-[Lys12,Nle17,Val26,Thr28]-VIP-syklo- (Asp8—»Lys12) [Ac-(SEQ ID NO:20)-NH2l 14 3 5

Ac-[Glu8^ Lys12,Nle17,Vai28, Thr28]-VIP-syklo- (Glu8—*Lys12) [Ac-(SEQ ID NO:21)-NH2] 34 111647 42

Ac- [Asn8, Asp9, Lys12, Nle17, Vai26, Thr28] -VIP -syklo- (Asp9->Lys12) [Ac-(SEQ ID NO:22)-NH2] 17 5 Ac-[Ornl2,Nle17,Val26,Thr28]-VlP-syklo- (Asp8—>Orn12) [AC-(SEQ ID NO:23)-NH2] 40

Ac- [Lys8, Asp^-2, Nle^7, Val26, Thr28] -VIP-syklo- (Lys8—KAsp12) [Ac-(SEQ ID NO:24)-NH2] 38 10

Ac- [Glu8,Ornl2,Nle·^·7, Val26,Thr28) -VIP-syklo- (Glu8—>Orn12) [Ac-(SEQ ID NO:25)-NH2] 16

Ac-[Lys12,Glu16, Nle17,Val2 6, Thr28)-VlP-syklo-15 (Lys12-*Glu16) [Ac-(SEQ ID NO:26)-NH2) 37

Koe-esimerkki 2 VIP-analogien keuhkoputkea laajentava vaikutus VIP:n ja VIP-analogien keuhkoputkea laajentavaa 20 vaikutusta in vivo marsuilla tutkittiin käyttäen antamista tiputtamalla henkitorveen. Tässä tekniikassa käytettiin urosmarsuja (Hartley-kanta, Charles River), jotka painoivat 400 - 600 g. Eläimet nukutettiin uretaanin avulla (2 g/kg) antamalla se vatsaontelon sisään ja polyeteenikanyyli si- *·' 25 joitettiin kaulalaskimoon lääkkeen antamiseksi laskimoon.

Eläimille tehtiin henkitorven leikkaus ja annostus-liuoksia, joissa oli tislattua vettä tai koeyhdistettä liuotettuna tislattuun veteen, annettiin henkitorveen kohtaan, joka sijaitsi suunnilleen kolme neljäsosaa henkitorven ala-30 osassa olevan harjun etäisyydestä, pipetin avulla. Annos- * · .. tusliuoksen pitoisuus säädettiin siten, että voitiin antaa 100 ml:n vakiotilavuus. Eläimet pantiin selälleen yhden minuutin ajaksi, jotta edistettäisiin lääkkeen toimittamista keuhkoihin. Yksi minuutti myöhemmin spontaani hengitys kes-35 keytettiin laskimoon annetun sukkinyylikoliinikloridin avulla (1,2 mg/kg) ja eläimiä autettiin hengittämään Har- 111647 43 vard Model 680 - pienten eläinten hengityskojeen avulla, joka oli säädetty tehokkuudelle 40 henkäystä/min ja sylinterin iskun tilavuus 4,0 cm3. Eläimille annettiin haasteeksi maksimaalinen kuristava annos histamiinia (50 mg/kg, 5 laskimoon) ja henkitorven paine (cm vettä) rekisteröitiin Statham-paineanturin (P 32 AA) avulla.

Henkitorven paineen muutoksen keskiarvo laskettiin vähintään kolmelle kontrolli- ja kolmelle lääkkeellä käsitellylle eläimelle ja laskettiin prosenttinen estäminen.

10 Tiputtamistietä annettujen yhdisteiden suhteellinen tehokkuus määritettiin antamalla erilaisia annoksia koeyhdistet-tä ja laskemalla tehokkaan annoksen keskusarvo (EDso-arvo). ED50 määritettiin annoksen logaritmi-vastekäyriltä, jotka oli aikaansaatu vähintään kolmen sellaisen annoksen avulla, 15 jotka aiheuttivat 10 %:n ja 90 %:n väliltä olevia estäviä vaikutuksia. Kunkin yhdisteen regressiosuoran korrelaa-tiokerroin oli aina suurempi kuin 0,95.

Estämisen muuttumisen ajan mukana määrittämiseksi eri yhdisteille vaihdeltiin yhdisteen antamisen ja hista- 20 miinilla ärsyttämisen välistä aikaa. Aktiivisuuden muuttuminen ajan mukana laskettiin siksi ajaksi, jona estäminen väheni 40 %:ksi.

Tulokset, joista on yhteenveto taulukossa II, osoittavat kaavan III mukaisen VIP-analogin keuhkoputkea ** 25 laajentavan vaikutuksen in vivo verrattuna alkuperäiseen VIP:iin.

Taulukko II

VIP-analogien keuhkoputkea laajentava vaikutus marsuilla 30 ED50

Yhdiste (pg) VIP[(Seq ID NO:l)-NH2J 7,3 35 Ac- [Lys12, Glu^Nle17, Val26,Thr28] -VIP-syklo- (Lys12—>Glu16) (Ac-(SEQ ID NO:26)-NH2] 39 111647 44

Patenttivaatimukset 1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten syklisten peptidien valmistamiseksi, joilla on kaava I 5 (I) I-1 X-His-Ser*Asp-Ala-Val-Phe-Thr-R8-Asn-Tyr-Thr-R12- 10

Leu-Arg-Lys-Gln-Ri7-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- [X-(SEQ ID NO: 2) -Y]

Leu-Asp-Ser-R26-Leu-R28-Y

15 jossa Rs on Asp, Glu tai Lys; R12 on Arg, Lys, Orn tai Asp; R17 on Met tai Nle; R26 on Ile tai Vai; R28 on Asn tai Thr; X on vety tai hydrolysoitavissa oleva aminon suojaryhmä; Y on hydroksyyli tai hydrolysoitavissa oleva karboksin suojaryhmä; tai kaava II

20 (II) I f X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Re-Asp-Tyr-Thr-Lys-25 Leu-Arg-Lys-Gln-R17-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr- [x-(SEQ ID NO:4)-Y]

Leu-Asp-Ser-P.26-Leu-R2s-Y

jossa Rs on Asp tai Asn; Rn on Met tai Nle; R26 on Ile tai 30 Vai; R2s on Asn tai Thr; X on vety tai hydrolysoitavissa .. oleva aminon suojaryhmä; Y on hydroksyyli tai hydrolysoita

vissa oleva karboksin suojaryhmä; tai kaava III

(III) 111647 45 ΓΠ 5 X-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Lys-

Leu-Arg-Lys-Glu-Ri7-Ala-Val'l_ys-Lys-Tyr-

Leu-Asp-Ser-R26-Leu-R28-Y [X-(SEQ ID NO :6) -Y] 10 jossa R17 on Met tai Nle; R26 on Ile tai Vai; R28 on Asn tai Thr; X on vety tai hydrolysoitavissa oleva aminon suojaryh-mä; Y on hydroksyyli tai hydrolysoitavissa oleva karboksin suojaryhmä; tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suo-15 lojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) suojatusta ja hartsiin sidotusta peptidistä, jolla on vastaava aminohapposekvenssi, poistetaan selektiivisesti suojausta vapaan sivuketjuaminoryhmän ja vapaan si-vuketjukarboksyyliryhmän aikaansaamiseksi; 20 b) vapaa sivuketjuaminoryhmä ja vapaa sivuketjukar- boksyyliryhmä kytketään kovalenttisesti sopivan amidinmuo-dostusreagenssin avulla ja c) peptidistä, jolle on suoritettu renkaanmuodos-tus, poistetaan suojaus ja se lohkaistaan hartsista käsit-25 telemällä sopivalla suojauksenpoisto- ja lohkaisureagens-silla, haluttaessa muiden sopivien lisäaineiden ollessa läsnä kationinpoistajina, ja haluttaessa muutetaan syklinen peptidi farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen • · « syklinen peptidi, jossa Rn on Nle, R26 on Vai ja R28 on Thr.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä,

tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Lys12, Nle17, Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Asp8 Lys12) [Ac-(SEQ ID

35 NO: 20) -NH2] .

111647 46 4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Glu8, Lys12, Nle17, Vai26, Thr28] -VIP-syklo- (Glu8 _> Lys12) [Ac-(SEQ ID NO: 21) -NH2] .

5 5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä,

tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Orn12, Nle17, Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Asp8 Orn12) [Ac-(SEQ ID

NO: 23) -NH2] - 6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Lys8,

Asp12, Nle17, Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Lys8 _> Asp12) [Ac-(SEQ ID NO:24) -NH2] .

7. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syklinen peptidi on Ac-[Glu8, 15 Orn12, Nle17, Vai26, Thr28]-VIP-syklo-(Glu8 -> Orn12) [Ac-(SEQ ID NO: 25) -NH2] .

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan II mukainen syklinen peptidi, joka on Ac-[Asn8, Asp9, Lys12, Nle17, 20 Vai26, Thr28] -VIP-syklo- (Asp9 —> Lys12) [Ac-(SEQ ID NO:22)-NH2] .

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan III mukainen peptidi, joka on Ac-[Lys12, G1u1d, Nle17, Vai26, Thr28]- 25 VIP-syklo-(Lys12 _> Glu16) [Ac-(SEQ ID NO:26)-NH2].