CN101906144B - 一根Arg-Gly-Asp-Val链通过Asp与两根脂肪醇链的偶联物、它们的合成及在医学中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类肽链与双脂肪醇链的偶联物及其制备方法和应用，是将一条Arg-Gly-Asp-Val链通过Asp与两条脂肪醇链偶联，所得偶联物的通式为Arg-Gly-Asp-Val-Asp[OCH₂(CH₂)_nCH₃]₂，其中n＝6，8，10或12。本发明的偶联物除具有优秀口服抗血栓活性外，还具有优秀的自组装性能，可作为制备微乳、脂质体等药物载体的制剂材料。

Description

一根Arg-Gly-Asp-Val链通过Asp与两根脂肪醇链的偶联物、它们的合成及在医学中的应用

技术领域

本发明涉及一类肽链与双脂肪醇链的偶联物，尤其涉及一根Arg-Gly-Asp-Val链通过Asp与两根脂肪醇链的偶联物，及其制备方法和该偶联物作为抗血栓剂、药物载体或制剂材料的应用，属于生物医药领域。

背景技术

心血管疾病是危害我国人民身体健康的三大疾病之一，血管栓塞性疾病是危害人们生命健康的重要疾病。

血小板在血栓形成过程中举足轻重。血小板被诱导剂激活时，表面膜糖蛋白GPIIb/IIIa受体暴露，与纤维蛋白原结合，形成血栓。文献报道纤维蛋白α和γ链中的Arg-Gly-Asp-Ser、Arg-Gly-Asp-Phe和隐义的Arg-Gly-Asp-Val序列是识别血小板表面GPIIb/IIIa受体的关键序列。

多肽类药物作为一类高效低毒的化合物已经引起研究者们广泛的关注，但此类药物存在易被酶解、生物半衰期短、易代谢、口服给药活性很低等问题。

外源Arg-Gly-Asp肽可竞争性地抑制纤维蛋白原等黏附蛋白与血小板的结合，从而达到抑制血小板聚集和抗血栓的作用。含Arg-Gly-Asp序列的化合物可以向血栓、炎症、癌转移和骨质疏松的患病部位富集。国内外及发明人前期工作曾研究过含有Arg-Gly-Asp的线性肽是一种优秀的抗血栓多肽，Arg-Gly-Asp序列常作为研究新型抗(溶)血栓药的靶头。然而Arg-Gly-Asp肽虽具有免疫原性低，毒副作用小的优点，但其具有半衰期短等缺点。

在将含Arg-Gly-Asp序列的寡肽与各种不同的长链脂肪链以及各种不同长度的长链脂肪链进行偶联后，发现这些脂肪链修饰的Arg-Gly-Asp伪肽不仅保留着Arg-Gly-Asp肽的强的抗血栓活性，克服了寡肽易被体内酶降解、不稳定的缺点即稳定性得到增强，可以采用口服给药的方式，给药剂量在10nM仍具有理想的抗血栓活性。

在这样一个前提下，把一根Arg-Gly-Asp-Val链通过Asp与两根脂肪醇链偶联物，便可以获得偶联物。

发明内容

本发明的目的之一是提供一类具有抗血栓作用的肽链与双脂肪醇的偶联物。

本发明的目的之一是通过以下技术方案实现的：

一类肽链与双脂肪醇链的偶联物，是将一根Arg-Gly-Asp-Val链通过Asp与两根脂肪醇链偶联的偶联物，所述偶联物的通式为

Arg-Gly-Asp-Val-Asp[OCH₂(CH₂)_nCH₃]₂，其中n＝6，8，10或12。

本发明结合了下述认识或依据完成了上述技术方案：以天冬氨酸为连接臂，将两条饱和脂肪醇链连接到一个Arg-Gly-Asp-Val-Asp五肽上，使制得的分子获得四种性能，即依赖于饱和脂肪链的疏水性、依赖于Arg-Gly-Asp肽的胍基和α-氨基质子化形成的阳离子性、亲水性和依赖于Arg-Gly-Asp肽对GP IIb/IIIa受体特异亲和作用获得的靶向性。这样一来，以天冬氨酸为连接臂，将两条饱和脂肪醇链连接到一个Arg-Gly-Asp-Val-Asp五肽上而得到含一个阳离子头两条疏水链尾的偶联物。

本发明的目的之二是提供一种制备上述具有抗血栓活性的肽链与双脂肪醇链偶联物的方法。

本发明的目的之二是通过以下技术方案来实现的：

一种制备所述肽链与双脂肪醇链的偶联物的方法，包括如下步骤：

按照常规液相接肽技术分别合成保护基保护的Arg-Gly-Asp-Val-Asp[OCH₂(CH₂)₆CH₃]₂、Arg-Gly-Asp-Val-Asp[OCH₂(CH₂)₈CH₃]₂、Arg-Gly-Asp-Val-Asp[OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]₂、Arg-Gly-Asp-Val-Asp[OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]₂，脱去保护基，即得。

具体的，包括如下步骤：

(1)将N端保护基保护的天冬氨酸与两个脂肪醇缩合，所述脂肪醇为CH₃(CH₂)_nCH₂OH，n＝6、8、10或12；

(2)脱去N端保护基得到双脂肪醇天冬氨酸酯；

(3)按照现有液相合成技术，将双脂肪醇天冬氨酸酯依次与缬氨酸的保护中间体、天冬氨酸的保护中间体、甘氨酸的保护中间体和精氨酸的保护中间体逐步接肽合成保护基保护的肽链和双脂肪链醇偶联物；

(4)依次脱去保护基保护的肽链和双脂肪链醇偶联物的C端保护基和N端保护基得到目标化合物。

其中所述N端保护基是对多肽的N端进行保护时常用的保护基团，例如可以是叔丁氧羰基(Boc)；所述C端保护基是对多肽的C端进行保护时常用的保护基团，例如可以是甲氧基(OMe)；所述侧链保护基是对多肽侧链进行保护时常用的保护基团，例如可以是苄氧基(OBzl)、硝基(NO₂)；所述液相合成技术及所述保护、缩合、脱保护的过程是本领域的常规并公知的技术。

该制备方法可以用图1的路线概括，具体的，所述方法包括：

(1)在DCC、HOBt、NMM和THF存在下将叔丁氧羰基保护的天冬氨酸分别与CH₃(CH₂)₇OH、CH₃(CH₂)₉OH、CH₃(CH₂)₁₁OH以及CH₃(CH₂)₁₃OH偶联；

(2)在氯化氢/乙酸乙酯溶液中加入步骤(1)所得的偶联物，脱去叔丁氧羰基；

(3)在DCC、HOBt、NMM和THF存在下将叔丁氧羰基保护的缬氨酸与步骤(2)所得产物偶联；

(4)在氯化氢/乙酸乙酯溶液中加入步骤(3)所得的偶联物，脱去叔丁氧羰基；

(5)在DCC、HOBt、NMM和THF存在下将N端叔丁氧羰基、保护侧链苄氧基保护的天冬氨酸与步骤(4)所得产物偶联；

(6)在氯化氢/乙酸乙酯溶液中加入步骤(5)所得的偶联物，脱去叔丁氧羰基；

(7)在DCC、HOBt、NMM和THF存在下将N端叔丁氧羰基保护、侧链硝基保护的精氨酸与甲氧基保护的甘氨酸偶联；

(8)在2NNaOH存在下将(7)所得产物脱除C端保护基；

(9)在DCC、HOBt、NMM和THF存在下将(6)与(8)所得产物偶联；

(10)将(9)所得产物脱除保护基得到通式所示化合物。

在大鼠血栓形成模型上的评价表明，本发明偶联物具有优秀的口服抗血栓活性，可作为抗血栓剂应用；在水相和生物相检测了这4种偶联物自组装成为纳米颗粒的性能，试验结果表明，本发明偶联物具有优秀的自组装性能，可作为制备微乳、脂质体等的制剂材料。

附图说明

图1为本发明肽链与双脂肪醇链偶联物的合成路线；i)HOBT/DCC，NMM/THF；ii)HCl/EtOAc；iii)Pd/C，H₂；iiii)2N NaOH/CH₃OH；其中9a n＝6，9b n＝8，9c n＝10，9d n＝12。

图2为本发明化合物9a-9d在水相中自组装的粒径随时间变化的折线图。

图3为本发明的化合物9a-9d在水相组装的纳米球的透射电镜图；9a(放大2.5万倍，标尺1μm)；9b(放大5万倍，标尺0.2μm)；9c(放大10万倍，标尺0.2μm)；9d(放大10万倍，标尺1μm)。

图4为本发明的化合物9a-9d在固相中的形态的扫描电镜图；9a(放大180倍，标尺100μm)；9b(放大65倍，标尺200μm)；9c(放大140倍，标尺100μm)；9d(放大140倍，标尺100μm)。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1Arg-Gly-Asp-Val-Asp[OCH₂(CH₂)₆CH₃]₂的制备(9a)

1)Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl：

将1.600g(5.0mmol)Boc-Arg(NO₂)溶于20ml无水THF成白色乳浊液，冰浴下加入0.745g(5.5mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)，10分钟后加入1.23g(6mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)，得到反应液A，待用。冰浴下把1.61g(5.25mmol)TOS H·Gly-OBzl悬浮于20ml无水THF中，然后加N-甲基吗啉(NMM)调pH为8-9。搅拌35分钟，得到反应液B，待用。冰浴下把反应液A加入反应液B中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌12h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示Boc-Arg(NO₂)消失。滤除二环己基脲(DCU)，滤液减压浓缩得黄色油状物，50ml乙酸乙酯溶解，再次过滤滤出析出的DCU，滤液依次用5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液、饱和NaCl水溶液、5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液各洗3次。乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，氯仿重结晶得到2.2g(94％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：467[M+H]⁺。

2)Boc-Arg(NO₂)-Gly

将0.466g(1.0mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl溶于10ml甲醇。冰浴下将得到的溶液用2N NaOH水溶液调pH至12，冰浴维持反应液温度在0℃，2h后TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl消失。反应混合物用饱和KHSO₄水溶液调pH7，减压浓缩除甲醇。残留物再用饱和KHSO₄水溶液酸化至pH2，乙酸乙酯萃取(30ml×3)。合并的乙酸乙酯相用饱和NaCl水溶液洗至中性，无水Na₂SO₄干燥。过滤，滤液减压浓缩至干，柱层析分离(CHCl₃∶CH₃OH，10∶1)得0.32g(85％)标题化合物，为无色固体。ESI^--MS(m/z)：375.3[M-H]⁺， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-2.16(c=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$

3)Boc-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃(1a)

将1.165g(5.0mmol)Boc-Asp溶于20ml无水THF中，冰浴下加入0.675g(5.0mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)，10分钟后加入1.23g(6mmol)DCC，得到反应液C，待用。冰浴下把1.43g(11.0mmol)CH₃-(CH₂)₆CH₂-OH溶于20ml无水THF中，得到反应液D，待用。冰浴下把反应液D加入反应液C中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌12h，TLC(石油醚/乙酸乙酯，2∶1)显示Boc-Asp消失。滤除二环己基脲(DCU)，滤液减压浓缩得黄色油状物，50ml乙酸乙酯溶解，再次过滤滤出析出的DCU，滤液依次用5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液、饱和NaCl水溶液、5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液各洗3次。乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干得2.27g(99％)标题化合物，为无色类固体。ESI-MS(m/z)：459[M+H]⁺.

4)HCl·H-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃(2a)

将0.458g(1.0mmol)1a用2ml乙酸乙酯溶解，冰浴搅拌下加入10ml4N HCl/乙酸乙酯溶液反应，2h后，TLC(石油醚/乙酸乙酯，2∶1)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气。最后加少量石油醚将残留物研磨得0.354g(99％)标题化合物，为无色类固体，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)：359[M+H]⁺.

5)Boc-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃(3a)

将0.228g(1.05mmol)Boc-Val溶于20ml无水THF，冰浴下加入0.149g(1.1mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)，10分钟后加入0.247g(1.2mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)，得到反应液E，待用。冰浴下把0.394g(1mmol)2a悬浮于20ml无水THF中，然后加N-甲基吗啉(NMM)调pH为8-9。搅拌35分钟，得到反应液F，待用。冰浴下把反应液E加入反应液F中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌12h，TLC(石油醚∶丙酮，5∶1)显示2a消失。滤除二环己基脲(DCU)，滤液减压浓缩得黄色油状物，50ml乙酸乙酯溶解，再次过滤滤出析出的DCU，滤液依次用5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液、饱和NaCl水溶液、5％NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液各洗3次。乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，柱层析分离(石油醚∶丙酮，15∶1)得到0.53g(95.0％)标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/z)：558[M+H]⁺.

6)HCl·H-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃(4a)

用与制备2a相同的方法，以0.558g(1.0mmol)3a为原料，得到0.452g(99％)标题化合物。ESI-MS(m/z)：458[M+H]⁺.

7)Boc-Asp(OBzl)-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃(5a)

按照3a的制备方法，以0.323g(1.0mmol)Boc-Asp(OBzl)和0.493g(1.0mmol)4a为原料，经柱层析分离(石油醚∶丙酮，4∶1)得到0.65g(85.4％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：762[M+H]⁺， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=6.82(c=1.25,\mathrm{CH}{\mathrm{Cl}}_3),$ Mp：60-62℃.

8)HCl·H-Asp(OBzl)-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃(6a)

用与制备2a相同的方法，以0.761g(1.0mmol)5a为原料，得到0.6g(91％)标题化合物。ESI-MS(m/z)：662[M+H]⁺.

9)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃(7a)

将1.88g(5.0mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly溶于30ml无水THF中，冰浴下加入0.675g(5mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)，10分钟后加入1.112g(5.24mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)，得到反应液G，待用。冰浴下把3.17g(4.54mmol)6a溶于40ml无水THF中，得到反应液H，待用。冰浴下把反应液H加入反应液G中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌12h，TLC(氯仿/甲醇，15∶1)显示6a消失。布氏漏斗滤除二环己基脲(DCU)，滤液减压浓缩得黄色油状物，150ml二氯甲烷溶解，滤液依次用5％NaHCO₃水溶液、5％KHSO₄水溶液、饱和NaCl水溶液各洗3次。二氯甲烷层直接减压浓缩至干，干法拌样后柱层析分离(氯仿∶甲醇，15∶1)，再经板层析分离(氯仿∶甲醇，15∶1)即得2.73g(58.9％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：1021[M+H]⁺， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-19.49(c=0.85,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}),$ Mp：128-130℃.

10)Boc-Arg-Gly-Asp-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃(8a)

将0.102g(0.1mmol)7a置于50ml茄形瓶中，用甲醇溶解，加10mgPd/C(10％)，通H₂(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用乙醚研磨，制得0.083g(90.3％)标题化合物，为无色固体粉末。ESI^--MS(m/z)：919[M-H]⁺.

11)HCl·Arg-Gly-Asp-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃(9a)

按照2a的制备方法，以0.920g(1.0mmol)8a为原料，得到0.78g(95％)目标化合物，无色固体粉末。ESI-MS(m/z)：821[M+H]⁺， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-20.16(c=0.8,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}),$ Mp：125-127℃.

实施例2Arg-Gly-Asp-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃的制备(9b)

1)Boc-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃(1b)

按照1a的制备方法，由1.165g(5mmol)Boc-Asp和1.659g(10.5mmol)CH₃-(CH₂)₉-OH制得2.565g(99.9％)目标化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/z)：536[M+Na]⁺， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-14.80(c=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$

2)HCl·Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃(2b)

用与制备2a相同的方法，以0.513g(1mmol)1b为原料制得0.449g(99.9％)目标化合物，为无色油状物，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)：414[M+H]⁺.

3)Boc-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃(3b)

按照3a的制备方法由1.139g(5.25mmol)Boc-Val和2.247g(5.0mmol)2b制得3.06g(99.9％)标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/z)：635[M+Na]⁺.

4)HCl·Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃(4b)

用与制备2a相同的方法，以0.612g(1.0mmol)3b为原料制得0.549g(99.9％)标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/z)：514[M+H]⁺.

5)Boc-Asp(OBzl)-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃(5b)

按照5a的制备方法由0.678g(2.1mmol)Boc-Asp(OBzl)和1.097g(2.0mmol)4b制得1.471g(90％)标题化合物，为白色类固体。ESI-MS(m/z)：840[M+Na]⁺， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-28.00(c=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}),$ Mp：65～67℃.

6)HCl·Asp(OBzl)-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃(6b)

用与制备2a相同的方法，以0.817g(1.0mmol)5b为原料制得0.754g(99.9％)标题化合物，为白色类固体。ESI-MS(m/z)：719[M+H]⁺.

7)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃(7b)

按照7a的制备方法，由0.79g(2.1mmol)实施例1中制备的Boc-Arg(NO₂)-Gly和1.507g(2.0mmol)6b经柱层析(氯仿∶甲醇，15∶1)制得1.204g(56％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：1098[M+Na]⁺， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-22.10(c=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}),$ Mp：118～119℃.

8)Boc-Arg-Gly-Asp-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃(8b)

用与制备8a相同的方法以0.215g(0.2mmol)7b为原料制得0.182g(97％)标题化合物，为无色固体。ESI^--MS(m/z)：939[M-H]⁺.

9)HCl·Arg-Gly-Asp-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃(9b)

按照2a的制备方法，从0.188g(0.2mmol)8b制得0.160g(95％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：841[M+H]⁺， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-22.50(c=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}),$ Mp：201～203℃.

实施例3Arg-Gly-Asp-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃的制备(9c)

1)Boc-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃(1c)

按照1a的制备方法，由1.165g(5mmol)Boc-Asp和1.953g(10.5mmol)CH₃-(CH₂)₁₀CH₂-OH制得2.854g(99.9％)目标化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/z)：593[M+Na]⁺， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-8.93(c=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$

2)HCl·H-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃(2c)

用与制备2a相同的方法，以0.569g(1mmol)1c为原料制得0.506g(99.9％)目标化合物，为无色油状物，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)：471[M+H]⁺.

3)Boc-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃(3c)

按照3a的制备方法由1.139g(5.25mmol)Boc-Val和1.07g(5.0mmol)2c制得3.34g(99.9％)标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/z)：692[M+Na]⁺.

4)HCl·Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃(4c)

用与制备2a相同的方法，以0.668g(1.0mmol)3c为原料制得0.554g(99.9％)标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/z)：569[M+H]⁺.

5)Boc-Asp(OBzl)-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃(5c)

按照5a的制备方法由0.678g(2.1mmol)Boc-Asp(OBzl)和1.209g(2.0mmol)4c制得1.514g(90％)标题化合物，为白色类固体。ESI-MS(m/z)：896[M+Na]⁺， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-29.20(c=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}),$ Mp：76～78℃.

6)HCl·Asp(OBzl)-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃(6c)

用与制备2a相同的方法，以0.873g(1.0mmol)5c为原料制得0.81g(99％)标题化合物，为白色类固体。ESI-MS(m/z)：774[M+H]⁺.

7)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃(7c)

按照7a的制备方法，由0.79g(2.1mmol)实施例1中制备的Boc-Arg(NO₂)-Gly和1.619g(2.0mmol)6c经柱层析(氯仿∶甲醇，15∶1)制得1.131g(50％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：1154[M+Na]⁺， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-23.17(c=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}),$ Mp：97～99℃.

8)Boc-Arg-Gly-Asp-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃(8c)

用与制备8a相同的方法以0.226g(0.2mmol)7c为原料制得0.195g(98％)标题化合物，为无色固体。ESI^--MS(m/z)：996[M-H]⁺.

9)HCl·Arg-Gly-Asp-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃(9c)

按照2a的制备方法，从0.2g(0.2mmol)8c制得0.172g(96％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：897[M+H]⁺， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-16.8667(c=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}),$ Mp：220～221℃.

实施例4Arg-Gly-Asp-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃的制备(9d)

1)Boc-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1d)

按照1a的制备方法，由1.165g(5mmol)Boc-Asp和2.247g(10.5mmol)CH₃-(CH₂)₁₂CH₂-OH制得3.125g(99.9％)目标化合物，为白色类固体。ESI-MS(m/z)：648[M+Na]⁺， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-5.67(c=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}),$ Mp 28-30℃.

2)HCl·H-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2d)

用与制备2a相同的方法，以0.625g(1mmol)1d为原料制得0.562g(99.9％)目标化合物，为无色油状物，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)：526[M+H]⁺.

3)Boc-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3d)

按照3a的制备方法由1.139g(5.25mmol)Boc-Val和1.21g(5.0mmol)2d制得3.625g(99.9％)标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/z)：748[M+Na]⁺.

4)HCl·Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4d)

用与制备2a相同的方法，以0.725g(1.0mmol)3d为原料制得0.628g(99.9％)标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/z)：626[M+H]⁺.

5)Boc-Asp(OBzl)-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(5d)

按照5a的制备方法由0.678g(2.1mmol)Boc-Asp(OBzl)和1.321g(2.0mmol)4d制得1.558g(83.9％)标题化合物，为白色类固体。ESI-MS(m/z)：952[M+Na]⁺， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-27.10(c=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}),$ Mp：60～62℃.

6)HCl·Asp(OBzl)-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(6d)

用与制备2a相同的方法，以0.929g(1.0mmol)5d为原料制得0.84g(97％)标题化合物，为白色类固体。ESI-MS(m/z)：804[M+H]⁺.

7)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(7d)

按照7a的制备方法，由0.79g(2.1mmol)实施例1中制备的Boc-Arg(NO₂)-Gly和1.731g(2.0mmol)6d经柱层析(氯仿∶甲醇，15∶1)制得1.092g(46％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：1210[M+Na]⁺， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-25.17(c=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}),$ Mp：86～87℃.

8)Boc-Arg-Gly-Asp-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(8d)

用与制备8a相同的方法以0.237g(0.2mmol)7d为原料制得0.189g(90％)标题化合物，为无色固体。ESI^--MS(m/z)：1054[M-H]⁺.

9)HCl·Arg-Gly-Asp-Val-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(9d)

按照2a的制备方法，从0.21g(0.2mmol)8d制得0.185g(97％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：954[M+H]⁺， ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-15.23(c=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}),$ Mp：204～206℃.

试验例1本发明化合物口服给药的抗血栓活性试验

1)实验动物与手术器械

健康wistar雄性大鼠，体重190-210g，军事医学科院医学部实验动物中心

器械：灌胃针，剪刀，眼科剪，动脉夹，止血钳，弯镊等

2)实验方法

2.1原理：

建立颈总动静脉体外循环旁路，丝线法形成血小板血栓，观察药物对大鼠体内血栓形成的影响。动脉血流中的血小板，当接触到丝线时粘附于线上，当血小板聚集受到影响时，形成血栓的重量就发生改变，因此，可以用来评价化合物的抗栓活性。

2.2插管

插管为硅烷化过的聚乙烯胶管，分三段，中段为聚乙烯胶，长60.0mm，内径3.5mm；两端为相同的聚乙烯管，管长100.0mm，内径1.0mm，外径2.0mm该管的一端拉成尖管(用于插入大鼠颈动脉或静脉)，外径为1.0mm。将编好号的5ml离心管中分别装入6cm长的黑色手术线，称重；然后取出丝线，按照编号放入准备好的插管的中段较粗的插管中。

2.3口服给药抗血栓活性测定的实验方法：将购自军事医学科院医学部实验动物中心的Wistar雄性大鼠(190-210g)，随机分组，每组12只，静悉饲养一天。将大鼠用临时配置的本发明化合物的生理盐水溶液(剂量为1.0nmol/kg)灌胃给药，30分钟后用20％(1200mg-kg^-1)剂量乌来糖溶液麻醉，分离右颈动脉和左颈静脉。将插管充满肝素钠的生理盐水溶液后，一端插入左侧静脉，另一端用注射器加入定量肝素钠抗凝后再插入右侧动脉。血流即从右侧动脉流经聚乙烯管流入左侧静脉循环，即时间监测血流循环状况，15分钟后取出附有血栓的丝线并记录重量，以生理盐水(NS，3ml/kg)做空白对照，以阿司匹林(60mg/15ml，3ml/kg)作阳性对照。

3)结果

经口服给药，本发明的化合物都具有很好的抗栓活性。结果见表1。

表1本发明化合物的抗栓活性结果-口服给药

a与生理盐水比，P＜0.01；b与阿司匹林比，P＞0.05；c与阿司匹林比，P＜0.05试验例2本发明化合物在水相中组装成为纳米球试验

1)本发明的4种偶联物按照10^-3mol/l的浓度配置成为水溶液，在激光纳米粒度仪上连续测定8天，观察粒径分布情况，结果见表2和图2。得到的数据表明，这4种偶联物在水相中可以自组装成为稳定的纳米粒，因而可以是优秀的微乳和脂质体药物的制备材料。

表2本发明的化合物的粒径随时间变化的测定结果(n＝3，单位：nm)

2)按照透射电镜的测定要求，配置4种偶联物的(10^-3mol/l)水溶液，置于铜网上挥发干后观察本发明的化合物在水相组装的纳米球的形态和粒径。结果表明，这4种偶联物组装的纳米球在透射电镜下可以看到粒子状态，如图3所示。

3)按照扫描电镜的样品准备方法，将10^-3mol/l的4种偶联物水溶液冷冻干燥，取少量固体与铜片上，在观察本发明化合物在固体状态下的形态，如图4所示。

Claims (5)

1.一类肽链与双脂肪醇链的偶联物，是Arg-Gly-Asp-Val肽链通过Asp与两根脂肪醇链偶联的偶联物，所述偶联物的通式

Arg-Gly-Asp-Val-Asp[OCH₂(CH₂)_nCH₃]₂，其中n＝6，8，10或12。

2.一种制备权利要求1所述肽链与双脂肪醇链的偶联物的方法，其步骤包括：

按照常规液相接肽技术分别合成保护基保护的

Arg-Gly-Asp-Val-Asp[OCH₂(CH₂)₆CH₃]₂、

Arg-Gly-Asp-Val-Asp[OCH₂(CH₂)₈CH₃]₂、

Arg-Gly-Asp-Val-Asp[OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]₂、

Arg-Gly-Asp-Val-Asp[OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]₂，脱去保护基，即得。

3.根据权利要求1所述肽链与双脂肪醇链的偶联物的制备方法，其包括如下步骤：

(1)将N端保护基保护的天冬氨酸与两个脂肪醇缩合，所述脂肪醇为CH₃(CH₂)_nCH₂OH，n＝6、8、10或12；

(2)脱去N端保护基得到双脂肪醇天冬氨酸酯；

(3)按照现有液相合成技术，将双脂肪醇天冬氨酸酯依次与缬氨酸的保护中间体、天冬氨酸的保护中间体、甘氨酸的保护中间体和精氨酸的保护中间体逐步接肽合成保护基保护的肽链和双脂肪链醇偶联物；

(4)依次脱去保护基保护的肽链和双脂肪链醇偶联物的C端保护基和N端保护基得到目标化合物。

4.权利要求1所述肽链与双脂肪醇链的偶联物在制备抗血栓药物中的用途。

5.权利要求1所述肽链与双脂肪醇链的偶联物在制备微乳或脂质体药物中的用途。

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