CN101484468A - 新型血管活性肠肽类似物 - Google Patents

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Abstract

例如，通过吸入给药式[X－(SEQ ID NO：2)－Y]的VPAC－2受体激动剂而治疗肺部阻塞性病症，例如，COPD。

Description

新型血管活性肠肽类似物
首次从猪肠发现、分离和纯化了血管活性肠肽(VIP)[US 3,879,371]。该肽具有二十八(28)个氨基酸，并带有对促胰液素和胰高血糖素广泛的同源性。[Carlquist等，激素和代谢研究(Horm.Metab.Res.)，14，28-29(1982)]。VIP的氨基酸序列如下：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-
                 Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn
                             (SEQ ID NO：1)
已知VIP表现出遍及肠胃道和循环系统的广泛范围生物学活性。根据其与肠胃激素的相似性，发现VIP刺激胰腺和胆汁分泌、肝糖原水解、胰高血糖素和胰岛素分泌，并活化胰腺碳酸氢盐释放。
已知并从人、大鼠、小鼠、鸡、鱼和青蛙中克隆了两种类型的VIP受体。目前将它们确定为VPAC1和VPAC2，并响应具有相似亲和性的天然VIP。VPAC2受体mRNA存在于人呼吸道，包括气管和支气管上皮、腺细胞和免疫细胞、肺泡壁和巨噬细胞中。[Groneberg等，实验室研究(Lab.Invest.)81：749-755(2001)和Laburthe等，受体和通道(Receptors andChannels)8：137-153(2002)]。
已通过免疫测定将含有VIP的神经细胞定位在内分泌和外分泌系统、肠和平滑肌的细胞内。发现VIP是神经效应子，其引起若干激素包括催乳激素、甲状腺素、和胰岛素和胰高血糖素的释放。还发现VIP刺激由肾体内和体外释放肾素。发现VIP存在于多种动物物种和人呼吸道中的神经和神经末梢中。VIP的心血管和支气管肺效应是感兴趣的，因为发现VIP是强血管扩张剂和强平滑肌弛缓剂，其作用于外周、肺部、和冠状血管床。发现VIP具有对脑血管的血管扩张作用。体外研究证明外源应用于脑动脉的血管活性肠肽诱导血管舒张，这提示VIP作为可能的脑血管舒张递质。据此，也显示出VIP是强血管扩张剂。
VIP可以对免疫系统具有调节作用，例如，VIP能够调节淋巴细胞的增殖和转移。已显示出天然VIP抑制在LPS-刺激的巨噬细胞中生成IL-12，影响IFNγ合成。VIP抑制在鼠科巨噬细胞中生成TGF-β1，并抑制在人单核细胞中经过NFκB生成IL-8。[Sun等，神经免疫性杂志(J.Neuroimmunol.)107：88-99(2000)和Delgado和Ganea，生物化学和生物物理学研究专栏(Biochem.Biophys.Res.Commun.)302：275-283(2003)]。
由于发现VIP松弛平滑肌，并且其通常存在于呼吸道组织中，如上所示，假设了VIP可能是内源的支气管平滑肌松弛介质。显示出来自在哮喘患者的组织，与来自正常患者的组织相比，不含免疫反应性VIP。这可能指示出与哮喘疾病相关的VIP或VIPergic神经纤维的缺乏。体外和体内检验显示VIP松弛气管平滑肌并保护以避免支气管收缩剂诸如组胺和前列腺素F2α。当静脉内给药时，发现VIP保护以避免支气管收缩剂诸如组胺、前列腺素F2α、白三烯、血小板活化因子以及抗原-诱导的支气管收缩。还发现VIP体外抑制人呼吸道组织中的粘液分泌。
呼吸道病症具有多种原因，但是共有若干病理生理和临床特征。这些病症的特征是由呼吸道阻塞、呼吸道壁变厚，炎症或间质组织弹性缺乏引起的气流限制。共同-病状可以包括粘液分泌过多、呼吸道超反应性、和气体交换异常，这可以引起咳嗽、痰产生、喘息和呼吸困难。常见呼吸道病症包括：哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、肺气肿、和肺部高血压。[Mayer等，呼吸生理学(Respiration Physiol.)128：3-11(2001)]。
COPD是一组由肺呼吸道阻塞定义的慢性病症。COPD包括两种主要的呼吸疾病，即慢性(阻塞性)支气管炎和肺气肿。这两种疾病均与呼吸困难和不呼吸相关。COPD可以伴随着肺病高血压。长期吸烟是COPD的主要风险因素。通常认为与COPD相关的呼吸道限制是不能逆转的。
慢性支气管炎是累进的炎性疾病。与该疾病相关的是呼吸道中粘液产量的增多和细菌感染发生率的增高。该慢性炎性病症诱导支气管壁的加厚，从而引起增加充血和呼吸困难。
肺气肿是通过利用扩大气体空间和减小肺泡表面积而损伤肺组织的潜在COPD病理学。肺损伤是由弱化和破坏肺内的气囊所引起的。肺组织的天然弹性也降低，从而导致过度伸展和破裂。可以损伤较小的支气管管，这能够导致它们破碎并阻塞气流，从而引起呼吸不足。
COPD，在其基本医学意义中，通常伴随着支气管阻塞。因此，最常见的COPD症状包括呼吸缺乏、慢性咳嗽、胸紧、更努力去呼吸、增多的粘液产量和频繁清喉咙。患者不能进行它们平常的日常活动。单独形成慢性支气管炎和肺气肿是可能的，但是大多数患有COPD的人具有这些病症的组合。
分解肺实质中结缔组织，具体地弹性蛋白，导致许多呼吸道疾病中存在的弹性降低。已在肺气肿和COPD中显示出了弹性蛋白降解的证据。认为嗜中性弹性蛋白酶是造成弹性蛋白破坏的主要蛋白酶。[Barnes等，欧洲呼吸作用杂志(Eur.Respir.J.)22：672-688(2003)]。显示出在COPD患者的肺中，嗜中性弹性蛋白酶的产量增多。[Higashimoto等，呼吸作用(Respiration)72：629-635(2005)]。
由于令人感兴趣的和潜在的VIP临床有效生物学活性，所以该肽一直是若干报告的合成程序的目标，目的是增强该分子一种或多种性质。Takeyama等报告了在位置8处具有谷氨酸取代天冬氨酸的VIP类似物。发现该化合物没有天然VIP有效。[化学和制药学期刊(Chem.Pharm.Bull.)28：2265-2269(1980)]。Wendlberger等公开了制备在位置17处具有正亮氨酸取代甲硫氨酸的VIP类似物。[肽程序(Peptide Proc.)第16界欧洲肽研讨会(16th Eur.Pept.Symp.)，290-295(1980)]。发现该肽在从肝膜制品中转移放射性碘标记的VIP的能力上与天然VIP均等。Watts和Wooton报告了一系列线性和环状VIP片段，其包含6-12个来自天然序列的残基。[EP184,309，EP 325,044；US 4,737,487，US 4,866,039]。Turner等报告了片段VIP(10-28)是VIP的拮抗剂[肽(Peptides)7：849-854(1986)]。还报告了取代的类似物[4-Cl-D-Phe6，Leu17]-VIP与VIP受体结合，并对抗VIP的活性[Pandol等，胃肠和肝生理学(Gastrointest.Liver Physiol.)13：G553-G557(1986)]。Gozes等报告了类似物[Lys1，Pro2，Arg3，Arg4，Pro5，Tyr6]-VIP是VIP的竞争性抑制剂，从而与其在神经胶质细胞上的受体相结合。[内分泌学(Endocrinology)125：2945-2949(1989)]。Robberecht等报告了若干在天然VIP N-末端中具有D-残基取代的VIP类似物。[肽(Peptides)9：339-345(1988)]。全部这些类似物较不紧密地与VIP受体结合，并在c-AMP活化中显示出比天然VIP低的活性。Tachibana和Ito报告了前体分子的若干VIP类似物。[在：肽化学(Peptide Chem.)中，Shiba和Sakakibara(版本)，保护研究基础(Prot.Res.Foundation)，1988，481-486，JP 1083012，US4,822,774]。这些化合物显示出是比VIP1-3倍更有效的支气管扩张剂，并具有1-2倍更高的低血压活性。Musso等还报告了若干VIP类似物在位置6-7、9-13、15-17、和19-28处具有取代。[生物化学(Biochem)27：8174-8181(1988)；US 4,835,252]。发现这些化合物在与VIP受体结合和生物学响应中与天然VIP等效或不如其有效。Bartfai等报告了一系列多重取代的[Leu17]-VIP类似物[WO 89/05857]。
Gourlet等报告了具有对VIP受体亲和性的[Arg16]-VIP衍生物[BBA1314：267-273(1996)]。Onoue等报告了VIP的一系列精氨酸衍生物和平截体[Onoue等，生命科学(Life Sci.)74：1465-77(2004)和Ohmori等，调节肽(Regul.Pept.)123：201-207(2004)]。还报告了一系列聚-丙氨酸衍生物[Igarashi等，药理学和实验治疗学杂志(J.Pharm.Exper.Ther.)303：445-460(2002)和Igarashi等，制药学和实验治疗学杂志(J.Pharm.Exper.Ther.)315：370-81(2005)]。
在US20050203009中，描述了具有选择性VPAC1激动剂活性的VIP类似物。报告了VIP类似物和C-末端加入聚乙二醇的衍生物一直用于治疗代谢病症，包括糖尿病[例如，WO2006042152]。识别了具有VPAC2激动剂活性的肽，其包括PACAP和VIP类似物[Gourlet等，肽(peptides)18：403-408；Xia等，药理学和实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)281：629-633(1997)]。报告了VIP环状类似物具有提高的稳定性和活性[Bolin等，生物多聚体(Biopolymers)37：57-66(1995)，US 5,677,419]。
在人中，当通过静脉内灌输对哮喘患者给药时，VIP显示出引起峰呼气流速的增高，并保护以避免组胺-诱导的支气管舒张。[Morice和Sever，肽(peptides)7：279-280(1986)；Morice等，The Lancet，II 1225-1227(1983)]。然而，通过该静脉内灌输VIP观察到的肺部作用伴随着心血管的副作用，最显著地，血压过低和心动过速，以及脸红。当以不引起心血管作用的静脉内剂量给药时，VIP不改变特定的呼吸道电导率。[Palmer等，胸(Thorax)41：663-666(1986)]。将活性的缺乏解释为是由于施用了低剂量和可能由于该化合物的快速降解。当通过气雾剂向人给药时，天然VIP在保护以避免组胺-诱导的支气管收缩中仅具有或多或少的效力。[Altieri等，药理学家(Pharmacologist)25：123(1983)]。发现当通过吸入对人给药时，VIP对基线呼吸道参数没有显著影响，但确实具有抗组胺-诱导的支气管收缩的保护作用。[Barnes和Dixon，美国呼吸疾病综述(Am.Rev.Respir.Dis.)，130：162-166(1984)]。报告了当通过气雾剂给药时，VIP不表现出与支气管舒张一起的心动过速或血压过低作用。[Said等，在：血管活性肠肽(Vasoactive Intestinal Peptide)，所述]版本)中，Raven出版社(RavenPress)，纽约，1928，185-191]。
报告了VIP衍生物，即RO25-1553，在轻度哮喘病中，具有临床前和临床支气管扩张剂的功效。[Kallstrom and Waldeck，欧洲制药学杂志(Eur.J.Pharm.)430：335-40(2001)和Linden等，胸(Thorax)58：217-21(2003)]。报告了天然VIP有效治疗COPD、肺病高血压和其他呼吸道病症[WO03061680，WO0243746和WO2005014030]。
然而，存在对新型血管活性肠肽类似物的需要，所述新型血管活性肠肽类似物具有对VPAC2受体的选择性，同时具有比现存VPAC激动剂同等或更好的潜力、药物动力学性质和药理学性质。优选地，存在对这样的化合物的需要，所述化合物具有比先前可获得的那些更长的活性持续时间。
本发明包括式(I)的VPAC-2受体激动剂：
X-His-R2-Asp-Ala-R5-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-R16-Nle-R18-
        Ala-Lys-Lys 21 -Tyr-Leu-Asn-Asp 25 -Leu-R27-R28-Gly-Thr-Y
                          [X-(SEQ ID NO：2)-Y]
其中，
X是组氨酸N-末端氨基的氢，其可以任选地被能水解的氨基保护基团，最优选地，被乙酰基替代，
Y是苏氨酸C-末端羧基的羟基，其可以任选地被能水解的羧基保护基团，最优选地，被NH2替代，
下划线标识的残基表示片段内第一(Lys21)和最后(Asp25)氨基酸的侧链与侧链的共价连接，
R2是Ser或Ala，
R5是Thr，Ser，Asp，Gln，Pro或CαMeVal，
R16是Gln，Ala，或Arg，
R18是Ala，Lys或Glu，
R27是Lys或Leu，除了当R5是CαMeVal且R16是Arg时，R27必须是Lys以外，
R28是Lys或Asn，
或其药用盐。
本发明的化合物是VPAC2受体的活性激动剂，并具有提高的针对人嗜中性弹性蛋白酶的稳定性。因此，该化合物，作为具有针对人肺中存在的弹性蛋白酶作用的改良抗性的天然VIP选择性稳定类似物，应该有效地治疗呼吸道病症，包括COPD。
按照通常的惯例书写本文中提及的全部肽序列，由此N-末端氨基酸位于左侧，且C-末端氨基酸位于右侧，除非另外注明。两个氨基酸残基之间的短线表示肽键。下划线标识的氨基酸片段表示该片段内第一和最后氨基酸的侧链与侧链的共价键。典型地，其为酰胺键。当氨基酸具有同分异构形式时，代表的是氨基酸的L形式，除非另外特别指出。为了方便地描述本发明，使用了多种氨基酸的常规和非常规缩写。这些缩写是本领域技术人员所熟悉的，但是为了清楚，如下列出：
Asp＝D＝天冬氨酸；Ala＝A＝丙氨酸；Arg＝R＝精氨酸；Asn＝N＝天冬酰胺；Gly＝G＝甘氨酸；Glu＝E＝谷氨酸；Gln＝Q＝谷氨酰胺；His＝H＝组氨酸；Ile＝I＝异亮氨酸；Leu＝L＝亮氨酸；Lys＝K＝赖氨酸；Met＝M＝甲硫氨酸；MeVal＝MeV＝CαMeVal；Nle＝正亮氨酸；Phe＝F＝苯丙氨酸；Pro＝P＝脯氨酸；Ser＝S＝丝氨酸；Thr＝T＝苏氨酸；Trp＝W＝色氨酸；Tyr＝Y＝酪氨酸；和Val＝V＝缬氨酸。
关于术语“能水解的氨基保护基团”和“能水解的羧基保护基团”，按照本发明能够使用任何能够通过水解去除的常规保护基团。在下文中显示所述基团的实例。优选的氨基保护基团是酰基，其式如下：
Figure A200780025494D00101
或
其中，X3是低级烷基或卤代低级烷基。在这些保护基团中，其中X3是C1-C3烷基或卤代-C1-C3烷基的那些是特别优选的。优选的羧基保护基团是低级烷基酯，NH2和低级烷基酰胺，其中C1-C3烷基酯、NH2和C1-C3烷基酰胺是特别优选的。
也为了方便，且本领域技术人员容易知道地，下列缩写或符号用于代表本发明中使用的部分、试剂等：Nle：正亮氨酸；CαMeVal：Cα-甲基-L-缬氨酸；MeVal：Cα-甲基-L-缬氨酸；CH2Cl2：二氯甲烷；Ac：乙酰基；Ac2O：乙酐；AcOH：乙酸；ACN：乙腈；DMAc：二甲基乙酰胺；DMF：二甲基甲酰胺；DIPEA：N，N-二异丙基乙胺；TFA：三氟乙酸；HOBT：N-羟基苯并三唑；DIC：N，N’-二异丙基碳二亚胺；BOP：苯并三唑-1-基氧-三-(二甲基氨基)鏻-六氟磷酸盐；HBTU：2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓-六氟磷酸盐；NMP：1-甲基-2-吡咯烷酮；MALDI-TOF：矩阵辅助激光解吸附离子化-飞行时间；FAB-MS：快原子轰击质谱法；ES-MS：电喷质谱法；RT：室温。
用于本文时，术语“烷基”意指支链或者直链的、环状或无环的、饱和或不饱和的(例如，链烯基或炔基)的烃基，其可以是取代的或未取代。当是环状的时候，烷基优选地是C3-C12，更优选地C5-C10，更优选地C5-C7.当是无环的时候，烷基优选地是C1-C10，更优选地，C1-C6，更优选地，甲基、乙基、丙基(正丙基或异丙基)、丁基(正丁基，异丁基或叔丁基)或戊基(包括正戊基和异戊基)，更优选地，甲基。
用于本文时，术语“低级烷基”意指支链或者直链的、环状或无环的、饱和或不饱和的(例如，链烯基或炔基)烃基，其中所述环状低级烷基是C5、C6或C7，且其中所述无环低级烷基是C1、C2、C3或C4，且优选地选自甲基、乙基、丙基(正丙基或异丙基)或丁基(正丁基，异丁基或叔丁基)。
用于本文时，术语“酰基”意指任意取代的烷基、环烷基、杂环的、通过羰基键合的芳基或杂芳基，并包括诸如乙酰基、丙酰基、苯甲酰基、3-吡啶羰基、2-吗啉代羰基、4-羟基-丁酰基、4-氟苯甲酰基、2-萘甲酰基、2-苯乙酰基、2-甲氧乙酰基等基团。
用于本文时，术语“芳基”意指取代的或未取代的碳环芳香基团，诸如苯基或萘基，或取代的或未取代的杂芳香基团，其包含一个或多个，优选地一个，杂原子。
烷基和芳基可以是取代的或未取代的。当是取代的时候，通常存在1-3个取代基，优选地1个取代基。取代可以包括：含碳基团，诸如烷基、芳基、芳烷基(例如，取代的和未取代的苯基、取代的和未取代的苄基)；卤原子和含卤基团，诸如卤代烷基(例如，三氟甲基)；含氧基团，诸如醇(例如，羟基、羟烷基、芳基(羟基)烷基)，醚(例如，烷氧基，芳氧基，烷氧基-烷基，芳氧基烷基)，醛(例如甲醛)，酮(例如烷基羰基，烷基羰基烷基，芳基羰基，芳基烷基羰基，芳基羰基烷基)，酸(例如羧基，羧基烷基)，酸衍生物如酯(例如烷氧羰基，烷氧羰基烷基，烷基羰氧基，烷基羰氧基烷基)，酰胺(例如氨基羰基，单-或者二-烷基氨基羰基，氨基羰基烷基，单-或二-烷基氨基羰基烷基，芳基氨基羰基)，氨基甲酸酯(例如烷氧基羰基氨基，芳氧羰基氨基，氨基羰氧基，单-或二-烷基氨基羰氧基，芳基氨基羰氧基(arylminocarbonloxy))和脲(例如单-或二-烷基氨基羰基氨基或者芳基氨基羰基氨基)；含氮基团如胺(例如氨基，单-或二-烷基氨基，氨基烷基，单-或二-烷基氨基烷基)，叠氮化物，腈(例如氰基，氰基烷基)，硝基；含硫基团如硫醇、硫醚、亚砜和砜(例如烷硫基，烷基亚磺酰基，烷基磺酰基，烷基硫代烷基，烷基亚磺酰基烷基，烷基磺酰基烷基，芳硫基，芳基亚磺酰基，芳基磺酰基，芳硫基烷基，芳基亚磺酰基烷基，芳基磺酰基烷基)；和含有一个或多个，优选一个杂原子的杂环基团。
用于本文时，术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘，优选氟、氯或溴，并且更优选为氟或氯。
“药用盐”指常规酸式加成盐或碱式加成盐，其保持式I化合物的生物有效性和性质，并由合适的非毒性有机或无机酸或有机或无机碱形成。样品酸式加成盐包括源自无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸的那些；和源自有机酸，诸如对甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸等的那些。样品碱式加成盐包括源自铵、钾、钠、和氢氧化季铵的那些，诸如例如，四甲基氢氧化铵。将药物化合物(即，药物)化学修饰为盐是众所周知的技术，其用于试图改良涉及化合物物理或化学稳定性的性质，例如吸湿性、流动性或溶解性。见例如，Ansel等，制药剂量形式和药物递送系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)(第6版，1995)在第196页和第1456-1457页。
“药用酯”指具有羧基的常规酯化式I化合物，所述酯保持式I化合物的生物有效性和性质，并在体内(生物体内)分裂为相应的活性羧酸。体内分裂(在该情形中是水解)为相应羧酸的酯基团实例是其中分裂的氢被低级烷基取代的那些，所述低级烷基任选地被杂环、环烷基，等取代。取代的低级烷基酯的实例是其中的低级烷基被吡咯烷、哌啶、吗啉、N-甲基哌嗪，等取代的那些。体内分裂的基团可以是例如乙基、吗啉代乙基、和二乙基氨基乙基。连同本发明，也认为-CONH2是酯，因为-NH2体内分裂，并被羟基替代，从而形成相应的羧酸。
前药设计(Design of Prodrugs)，Bundgaard(版本)(Elsevier，1985)中可以获得关于递送药物化合物的酯的实例和应用的其他信息。也见，Ansel等，制药剂量形式和药物递送系统(Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems)(第6版，1995)在第108-109页；Krogsgaard-Larsen等，药物设计与开发教科书(Textbook of Drug Design and Development)(第2版，1996)在第152-191页。
在一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中X是组氨酸N-末端氨基的氢或其中所述氢被乙酰基替代。在另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中X是组氨酸N-末端氨基的氢。
在一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中Y是苏氨酸C-末端羧基的羟基或其中所述羟基被NH2替代。在另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中Y是苏氨酸C-末端羧基的羟基。
在一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中R2是Ser。在另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中R2是Ala。
在一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中R5是Thr、Ser或CαMeVal。在另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中R5是Thr。在另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中R5是Ser。在另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中R5是CαMeVal。
在一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中R16是Gln或Arg。在另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中R16是Gln。在另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中R16是Arg。
在一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中R18是Ala。在另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中R18是Lys。在另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中R18是Glu。
在一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中R27是Lys。
在一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中R28是Lys。
在一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中
X是组氨酸N-末端氨基的氢或所述氢被乙酰基替代，
Y是苏氨酸C-末端羧基的羟基或所述羟基被NH2替代，
R2是Ser或Ala，
R5是Thr、Ser或CαMeVal，
R16是Gln或Arg，
R18是Ala、Lys或Glu，
R27是Lys或Leu，除了当R5是CαMeVal且R16是Arg时，R27必须是Lys以外，和
R28是Lys。
另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中
X是组氨酸N-末端氨基的氢或所述氢被乙酰基替代，
Y是苏氨酸C-末端羧基的羟基或所述羟基被NH2替代，
R2是Ser或Ala，
R5是Thr，Ser或CαMeVal，
R16是Gln或Arg，
R18是Ala、Lys或Glu，
R27是Lys或Leu，除了当R5是CαMeVal且R16是Arg时，R27必须是Lys以外，和
R28是Lys。
另一个实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中
X是组氨酸N-末端氨基的氢或所述氢被乙酰基替代，
Y是苏氨酸C-末端羧基的羟基或所述羟基被NH2替代，
R2是Ser或Ala，
R5是Ser或CαMeVal，
R16是Gln，
R18是Ala，
R27是Lys或Leu，和
R28是Lys。
可以通过任何已知的形成氨基酸间肽键的常规程序，容易地合成本发明典型的化合物。所述常规程序包括，例如任何溶液相程序，其允许氨基酸或其具有其羧基和其他受保护反应基的残基的游离α氨基与另一个氨基酸或其具有其氨基或其他受保护反应基的游离伯羧基(primary carboxygroup)之间的缩合。
所述合成本发明新型化合物的常规程序包括，例如，任何固相肽合成方法。在这样的方法中，新型化合物的合成能够通过按照固相方法的普遍原理将理想的氨基酸残基逐个顺序引入到生长肽链中而进行。所述方法公开在，例如Merrifield，美国化学界杂志(J.Amer.Chem.Soc.)85：2149-2154(1963)；Barany等，肽、分析、合成和生物学(The Peptides，Analysis，Synthesis and Biology)，卷2，Gross和Meienhofer，(版本)科学出版社(Academic Press)1-284(1980)中，将其引入本文作为参考。可以手工或利用自动化装置进行肽合成。还可以利用微波-辅助的合成。
通常肽化学合成是用合适保护基团保护多种氨基酸部分的反应性侧链基团，这将保护在该位点不发生化学反应，直到最终去除保护基团。通常还常见的是保护氨基酸或片段上的α氨基，同时该实体在羧基上反应，随后选择性去除α氨基保护基团，从而容许在该位点处发生随后的反应。虽然关于固相合成方法公开了具体保护基团，但是应该注意到，每种氨基酸能够受到对溶液相合成中的各种氨基酸常规使用的保护基团的保护。
α氨基可以受到合适保护基团的保护，所述合适保护基团选自芳香尿烷-型保护基团、诸如烯丙氧基羰基、苄氧基羰基(Z)和取代的苄氧基羰基，诸如，对-氯苄氧基羰基、对-硝基苄基-氧羰基、对-溴苄氧基羰基、对-联苯-异丙基氧基羰基、9-芴基-甲氧基羰基(Fmoc)和对-甲氧基苄氧基羰基(Moz)；脂肪族尿烷-型保护基团，诸如叔-丁氧基羰基(Boc)、二异丙基甲氧基羰基、异丙基氧基羰基、和烯丙氧基羰基。在此，Fmoc对α氨基的保护是最优选的。
胍基可以受到合适保护基团的保护，所述合适保护基团选自硝基、对-甲苯磺酰基(Tos)，(Z，)2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)；4-甲氧基-2，3，6，-三甲基苯磺酰基(Mtr)。Pmc和Mtr是对精氨酸(Arg)最优选的。
ε-氨基可以受到合适保护基团的保护，所述合适保护基团选自2-氯-苄氧基羰基(2-Cl-Z)、2-溴-苄氧基羰基(2-Br-Z)-和Boc。Boc对(Lys)最优选。
羟基(OH)可以受到合适保护基团的保护，所述合适保护基团选自苄基(Bzl)、2，6二氯苄基(2，6-二Cl-Bzl)、和叔-丁基(t-Bu).tBu是对(Tyr)，(Ser)和(Thr)最优选的。
β-和γ-酰胺基可以受到合适保护基团的保护，所述合适保护基团选自4-甲基三苯甲基(Mtt)、2，4，6-三甲氧基苄基(Tmob)、4，4-二甲氧基二苯甲基(dityl)/二-(4-甲氧基苯基)-甲基(Dod)和三苯甲基(Trt)。Trt是对(Asn)和(Gln)最优选的。
吲哚基团可以受到合适保护基团的保护，所述合适保护基团选自甲酰基(For)，mesityl-2-磺酰基(Mts)和Boc。Boc是对(Trp)最优选的。
β-和γ-羧基可以受到合适保护基团的保护，所述合适保护基团选自叔-丁基(tBu)、和2-苯基异丙基酯(2Pip)。tBu是对(Glu)最优选的，且2Pip是对(Asp)最优选的。
咪唑基团可以受到合适保护基团的保护，所述合适保护基团选自苄基(Bzl)、Boc、和三苯甲基(Trt)。Trt是对(His)最优选的。
所有的溶剂，即异丙醇(iPrOH)、二氯甲烷(CH2Cl2)、DMF和NMP购自Fisher、JTBaker或Burdick & Jackson，并在不另外蒸馏的条件下使用。TFA购自Halocarbon，Aldrich或Fluka，并在不进一步纯化的条件下使用。
DIC和DIPEA购自Fluka或Aldrich，并在不进一步纯化的条件下使用。HOBT、二甲硫(DMS)和1，2-乙二硫醇(EDT)购自Aldrich、SigmaChemical Co.或Anaspec，并在不进一步纯化的条件下使用。受保护的氨基酸通常具有L构型且商购自Bachem、Advanced ChemTech、CEM或Neosystem。使用前，由薄层色谱法、NMR和熔点证实这些试剂的纯度。二苯甲基胺树脂(BHA)是获自Bachem，Anaspec或Advanced Chemtech的苯乙烯—1％二乙烯基苯的共聚物(100-200或200-400网孔)。这些树脂的总氮含量通常是0.3-1.2meq/g。
在LDC设备上进行高通量液相色谱法(HPLC)，所述LDC设备由Constametric I和III泵、梯度主溶剂程序设计器和混合器(Gradient Mastersolvent programmer and mixer)、和具有可变波长UV检测器的光谱监测仪III组成。利用Pursuit C18柱(4.5 x 50mm)，反相进行分析HPLC。在Pursuit柱(50 x 250mm)上进行制备型HPLC分离。
在优选的实施方案中，通过由Merrifield(美国化学界杂志(J.Amer.Chem.Soc.)85：2149(1963))概括描述的方法，利用固相合成法制备肽，尽管如前所述地，能够使用本领域中已知的其他等价化学合成法。固相合成法通过偶联受保护的α-氨基酸和合适树脂，起始自肽的C-末端。这样的起始物能够通过酯键将α-氨基-保护的氨基酸附着到对-苄氧基苄基醇(Wang)树脂上，或由Fmoc-连接体，诸如对-((R，S)-α-(1-(9H-芴-9-基)-甲氧基甲酰胺基)-2，4-二甲氧基苄基)-苯氧基乙酸(Rink连接体)之间的酰胺键将α-氨基-保护的氨基酸附着到二苯甲基胺(BHA)树脂上。羟基甲基树脂的制备在本领域中众所周知。Fmoc-连接体-BHA树脂支持体是可商购的，且通常，当理想的合成肽在C-末端具有未取代的酰胺时使用。
典型地，利用氨基酸或模仿物的Fmoc保护形式，用1-5个氨基酸等价物和适合偶联试剂将氨基酸或模仿物偶联在Fmoc-连接体-BHA树脂上。偶联后，可以在真空下清洗和干燥树脂。将氨基酸加载到树脂上可以由Fmoc-氨基酸树脂等分试样的氨基酸分析，或由UV分析确定Fmoc基团来确定。可以在二氯甲烷或DMF中，通过用乙酐和二异丙基乙基胺处理树脂，而对任何未反应的胺基加帽。
树脂经历若干重复循环，以顺序加入氨基酸。在碱性条件下去除α氨基Fmoc保护基团。为了该目的，可以使用DMF中的哌啶，哌嗪或吗啉(20-40％v/v)。优选地，典型使用40％哌啶的DMF溶液。
在去除α氨基保护基团后，随后保护的氨基酸以理想顺序逐渐偶联，以获得中间产物，即受保护的肽-树脂。用于在肽的固相合成中偶联氨基酸的活化试剂是本领域众所周知的。例如，对所述合成合适的试剂是BOP、溴-三-吡咯烷子基-鏻六氟磷酸盐(PyBroP)、HBTU和DIC。此处优选的是HBTU和DIC。可以使用由Barany和Merrifield(在：肽(The Peptides)，卷2，Meienhofer(版本)，科学出版社(Academic Press)，1979，第1-284页)描述的其他活化试剂。可以将不同试剂，诸如HOBT、N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)和3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HOOBT)加入到该偶联混合物中，从而最优化合成循环。在此优选的是HOBT。
典型的合成循环方案如下：
 
方案1 步骤 试剂 时间
1 DMF 2 x 30秒
2 20％哌啶/DMF 1分钟
3 20％哌啶/DMF 15分钟
4 DMF 2 x 30秒
5 iPrOH 2 x 30秒
6 DMF 3 x 30秒
7 偶联的 60分钟-18小时
8 DMF 2 x 30秒
9 iPrOH 1 x 30秒
10 DMF 1 x 30秒
11 CH2Cl2 2 x 30秒
称量体积为10-20ml/g树脂的所有清洗和偶联溶剂。偶联反应在合成全过程中由Kaiser茚三酮检验监测，从而确定完成的程度[Kaiser等，分析生物化学(Anal.Biochem.)34：595-598(1970)]。任何不完全的偶联反应与新鲜配制的活化氨基酸再偶联或如上所述通过用乙酐处理肽树脂而被加帽。在真空中干燥完整组装的肽-树脂若干小时。
可以利用应用生物系统433A合成器(Applied Biosystem 433Asynthesizer)(Foster City，CA)，进行肽合成。对树脂取样或非树脂取样，41mL反应容器，使用FastMoc 0.25mmole循环。用DMF中的2.1g NMP、2g 0.45M HOBT/HBTU，和2M DIEA溶解Fmoc-氨基酸树脂，然后将其移至反应容器中。基本FastMoc偶联循环由模块“BADEIFD”代表，其中每个字母代表一个模块。例如：B代表利用20％哌啶/NMP的Fmoc去保护和相关清洗和读数30分钟的模块(UV监测或传感性)；A代表在盒内用0.45M HBTU/HOBt和2.0M DIEA活化氨基酸并与N2泡混合的模块；D代表在反应容器中NMP清洗树脂的模块；E代表将活化的氨基酸移至反应容器中从而偶联的模块；I代表10分钟等待时期的模块，其中涡旋搅拌反应容器或不搅拌反应容器；和F代表清洁盒、偶联约10分钟并排空反应容器的模块。典型地，通过一次或多次添加模块“I”来扩大偶联。例如，通过进行程序“BADEIIADEIFD”来进行双偶联。还存在其他模块，诸如c关于二氯甲烷清洗，和“C”关于用乙酐加帽。还可以通过，例如改变不同活动的时间，诸如转移时间来改良各个模块，从而改变转移的溶剂或试剂的量。以上循环典型地用于偶联一个氨基酸。然而，为了合成四肽，重复所述循环，并将其连在一起。例如，使用BADEIIADEIFD偶联第一氨基酸，随后使用BADEIIADEIFD偶联第二氨基酸，随后使用BADEIIADEIFD偶联第三氨基酸，随后使用BADEIIADEIFD偶联第四氨基酸，随后为了最后的去保护和清洗而进行BIDDcc。
可以利用微波肽合成器，即Liberty(CEM公司(Corporation)，Matthews，NC)进行肽合成。将该合成器程序设计为通过改良预加载的0.25mmol循环而双偶联和加帽。使用微波编辑器对微波功率方法进行编程，从而在Fmoc去保护、氨基酸偶联和用乙酐加帽过程中使用。这种类型的微波控制容许创建这样的方法，即将反应控制在一组温度和进行一组时间段。Liberty自动地调节递送到反应中的功率的量，从而将温度保持在设置点。在循环编辑器中选择氨基酸添加和最终去保护的默认循环，并在形成肽时对其进行自动的加载。
利用Fmoc-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)，以0.25mmol规模进行合成。将树脂加入到装有10mL DMF的30mL反应容器中。利用DMF溶液中的20％哌啶进行Fmoc的去保护。对于每个氨基酸偶联，将Fmoc保护的氨基酸溶于DMF中，以制成0.2M溶液，并将其加入到反应容器中。利用0.5M HOBT/HBTU和2M DIEA/NMP进行所有的偶联反应。任何不完全的偶联反应与新鲜配制的活化氨基酸再偶联或通过用DMF中25％乙酐处理肽树脂而被加帽。利用微波，在70℃，在50瓦功率和氮起泡条件下，进行各个去保护、偶联和加帽反应300秒。
对于每个氨基酸偶联，使用了下列0.25mmol偶联循环：
 
方案2 将树脂移至容器加入哌啶去保护(10mL)用于去保护的微波方法(50瓦；70℃；300秒)用DMF(10mL)清洗树脂加入氨基酸(5mL)加入活化剂(HOBT/HBTU)(2mL)加入活化剂碱(DIEA)(1mL)用于偶联的微波方法(50瓦；70℃；300秒)用DMF(10mL)清洗树脂加入氨基酸(5mL)加入活化剂(HOBT/HBTU)(2mL)加入活化剂碱(DIEA)(1mL)用于偶联的微波方法(50瓦；70℃；300秒)用DMF(10mL)清洗树脂加帽(乙酐10mL)微波方法(加帽)(50瓦；70℃；300秒)用DMF(10mL)清洗树脂
为了合成在此出现的化合物，在流程图1中显示了优选的合成程序。
流程图1
Figure A200780025494D00201
用哌啶/DMF处理Fmoc-Rink-MBHA树脂1，随后在试剂诸如DIC、BOP或HBTU存在下与Fmoc-AA(P)31偶联，生成Fmoc-AA(P)31-Rink-树脂2，其中AA31代表第31个氨基酸残基，且P代表合适的保护基团。通过在每次循环时加入合适的保护氨基酸重复30次步骤1和2的循环，生成肽树脂3。通过用CH2Cl2中2％ TFA和PdCl2/nBu3SnH分别处理，去除AA25和AA21上的侧链保护基团。通过利用DMF中的BOP和NMM的处理，环化AA25和AA21的侧链胺和羧基，从而生成4。
对于每种化合物，去除封闭基团，并且肽在相同步骤中从树脂中分裂出来。例如，可以用100μL乙二硫醇、100μl二甲硫、300μL茴香醚、和9.5mL TFA/克树脂，在RT处理肽-树脂180分钟。或备选地，可以用1.0mL三异丙基硅烷和9.5mL TFA/克树脂，在RT处理肽-树脂180分钟。滤掉树脂，在冷乙醚中沉淀滤出液。离心沉淀，并倒出醚层。用2或3倍体积的Et2O清洗剩余物，并再-离心。在真空下干燥粗产物5。
通过反相Pursuit C-18柱(50 x 250mm.300
Figure A200780025494D0021154850QIETU
，10μm)上的高效液相色谱法(HPLC)，在Shimadzu LC-8A系统上进行粗肽的纯化。将肽溶解在最小体积的水和乙腈中，并将其注射到柱中。梯度稀释通常从2％B缓冲液开始，处于2％-70％ B/70分钟(缓冲液A：0.1％ TFA/H2O，缓冲液B：0.1％TFA/CH3CN)，流速50ml/分钟。在220/280nm处进行UV检测。分离含有产物的组分，并利用处于流速2.5ml/分钟，梯度(2-70％)/10分钟的反相Pursuit C-18柱(4.6 x 50mm)，在Shimadzu LC-10AT分析系统上鉴定它们的纯度。[缓冲液A：0.1％ TFA/H2O，缓冲液B：0.1％ TFA/CH3CN)]。收集并冻干被鉴定具有足够纯度的级分。
如上所述，在反相柱上，通过分析HPLC检查最终产物的纯度。还对所有最终产物进行快速原子轰击质谱(FAB-MS)或电喷质谱(ES-MS)。在实施例中，所有产物适度有限地生成预期的起源M+H离子。
本发明中所述的VIP类似物是如实施例25中所述的VPAC2受体激动剂。按照实施例25中的弹性蛋白酶稳定性实验，该化合物具有针对人嗜中性弹性蛋白酶的增强的稳定性。因此，这些VPAC2受体激动剂的施用应该对于治疗呼吸道病症，诸如COPD是有效的。
可以以药用盐的形式提供本发明的化合物。优选的盐的实例是利用药用有机酸，例如乙酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、水杨酸、甲磺酸、甲苯磺酸、三氟乙酸、或双羟萘酸，以及聚合酸，诸如丹宁酸或羧甲基纤维素形成的那些，和与无机酸，诸如氢卤酸(例如，盐酸)、硫酸、或磷酸等形成的盐。能够使用技术人员已知的任何获得药用盐的程序。
在实施本发明的方法中，可以将有效量的任何一种本发明肽，或者本发明任何肽的组合，或者其药用盐，通过本领域已知的常用和可接受的方法中的任何一种，单独或组合地给药。因此，可以将化合物或组合物经口给药(例如，口腔)，舌下给药，肠胃外给药(例如，肌肉内，静脉内或者皮下)，直肠给药(例如，由栓剂或洗剂)，透皮给药(例如，皮肤电穿孔)或者通过吸入给药(例如，通过气雾剂)，并且以固体、液体或气态剂型的形式，包括片剂和混悬剂。可以在连续治疗下，以单一单位剂型，或以随意的单一剂量治疗，进行给药。治疗组合物还可以为油乳剂或分散剂的形式，其结合有亲脂性盐如双羟萘酸，或者为可生物降解的持续释放组合物的形式，其用于皮下或者肌肉内给药。
因此，当减轻症状是明确必需的或或许紧急的时候，实施本发明的方法。备选地，本发明的方法有效地作为连续的或预防的治疗来实施。
用于制备其组合物的有用药物载体可以是固体、液体或气体；因此，组合物可以采用的形式有：片剂，丸剂，胶囊剂，栓剂，散剂，肠包衣的或者其它保护制剂(例如结合在离子交换树脂上或者包封在脂-蛋白囊中)，持续释放制剂，溶液，混悬剂，酏剂，气雾剂等。载体可以选自：各种油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，例如，花生油，豆油，矿物油，芝麻油等。水，盐水，葡萄糖水溶液和二元醇是优选的液体载体，特别是(当与血液等渗时)用于可注射的溶液。例如，用于静脉内给药的制剂包含：一种或多种活性成分的无菌水溶液，其是通过将一种或多种固体活性成分溶解于水中以制备水溶液，并且使该溶液无菌而制备的。
适宜的药物赋形剂包括淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、二氧化硅、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、干脱脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇等。组合物可以加入常规的药物添加剂如防腐剂、稳定剂、湿润或乳化剂、用于调节渗透压的盐、缓冲剂等。适宜的药物载体和它们的制剂描述于雷明顿制药科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，E.W.Martin著。在任何情况下，这样的组合物将含有与适宜的载体在一起的有效量的活性化合物，以制备用于给受试者适宜给药的适宜剂型。
本发明化合物的剂量取决于许多因素，例如给药方式、受试者的年龄和体重以及待治疗的患者的症状，并且最终将由主治医生或兽医确定。活性化合物由主治的医生或兽医确定的这样的量在本文中并且在权利要求书中称作“有效量”。例如，吸入给药的剂量典型地在约0.5-约100μg/kg体重的范围内。优选地，以约1μg/kg-约50μg/kg/天的剂量速度施用本发明的化合物。
代表性的递送方案包括口服、肠胃外(包括皮下、肌肉内和静脉内)、直肠、口腔(包括舌下)、透皮、肺部和鼻内。优选给药途径是通过口腔吸入进行肺部给药。肺部给药的方法可以包括气雾化本发明的环状肽水溶液或吸入微粉化的干燥粉末剂。气雾化的组合物可以包括包装在反向胶束或脂质体中(reverse micelles)的化合物。制备微粉化的适当受控颗粒尺寸的粉末，以有效提供肺泡递送是众所周知。将指定剂量的所述制剂直接递送到肺中的吸入器(定量剂量吸入器或“MDI”)是本领域中众所周知的。
因此，本发明还包括含有所述激动剂的药物组合物，和所述激动剂治疗肺部疾病包括COPD的应用。
在一个实施方案中，本发明提供用于吸入给药的溶液或微粉化干燥粉末形式的药物组合物，其包括式I的化合物和至少一种药用载体或赋形剂，其中所述化合物以肺部递送所述组合物的药理学有效浓度存在。在另一个实施方案中，本发明提供用于吸入给药的溶液或微粉化干燥粉末形式的药物组合物，其包括式I的化合物和至少一种药用载体或赋形剂，其中所述化合物的浓度足以在单次吸入剂量中递送约1μg/kg-约50μg/kg的所述化合物。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗肺部阻塞性病症，例如COPD的方法，该方法包括通过吸入对例如患有所述病症的人施用有效量，例如约1μg/kg/天-约50μg/kg/天的用于吸入给药的溶液或微粉化干燥粉末形式的药物组合物，所述药物组合物包括式I的化合物和至少一种药用载体或赋形剂，其中所述化合物以肺部递送所述组合物的药理学有效浓度存在。
现将在下列实施例中进一步描述本发明，这些实施例仅意欲作为举例说明，而非限制本发明的范围。
实施例
实施例1：制备Ac-His-Ser-Asp-Ala-Thr-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQID NO：3)-NH2]，即式I的混合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser，R5是Thr，R16是Gln，R18是Ala，R27是Lys且R28是Lys
Figure A200780025494D00241
在应用生物系统433A或微波肽合成器上，利用Fmoc化学合成上述肽。将合成器程序设计为了利用以上方案1或2中所述的模块进行双偶联。利用Fmoc-Rink连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)，以0.25mmol规模进行合成。在合成结束时，将树脂移至摇动器上的反应容器中。过滤并用CH2Cl2清洗DMF中的肽树脂。用CH2Cl2中2％ TFA处理树脂5次，每次3分钟。立即用5％ DIPEA/CH2Cl2处理树脂2次，并用CH2Cl2和DMF清洗。将肽树脂混悬于装在摇动器容器中的DMF中，所述摇动器容器是用橡胶隔片牢固固定的。向其中加入60mg PdCl2(Ph3P)2、150μl吗啉和300μl AcOH。用Ar净化该容器。然后通过注射器加入nBu3SnH。摇动黑色溶液30-45分钟，用DMF进行清洗，并重复。在第二次Pd处理后，用DMF、2 x iPrOH、DMF、5％ DIPEA/DMF和DMF清洗该树脂。在DMF中，通过利用BOP和NMN处理过夜来环化肽树脂。用DMF和CH2Cl2清洗树脂，并然后在真空下进行干燥。
在RT下，使用13.5mL 97％ TFA/3％H2O和1.5mL三异丙基硅烷180分钟，使肽从树脂中分裂出来。将去保护溶液加入到100mL冷Et2O中，并用1mL TFA和30mL冷Et2O清洗，从而沉淀肽。在2个50mL聚丙烯管中离心所述肽。将来自各个管的沉淀组合到单一管中，用冷Et2O清洗3次，并在家用真空下的干燥器中干燥。
通过在Pursuit C18-柱(250 x 50mm，10μm颗粒尺寸)上的制备型HPLC纯化粗材料，并利用90分钟内，流速60mL/分钟的线性梯度2-70％B(缓冲液A：0.1％ TFA/H2O；缓冲液B：0.1％ TFA/CH3CN)对其进行洗脱，并在220/280nm检测。收集级分并通过分析型HPLC进行检测。合并和冻干含有纯产物的级分，以生成106mg(9.7％)白色无定形粉末。C159H256N46O47的(ES)+-LCMS m/e计算值为3565.05，实际值为3563.7。
实施例2：制备Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asp-Leu-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQID NO：4)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser，R5是Ser，R16是Gln，R18是Ala，R27是Lys且R28是Lys
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成28mg(2.5％)白色无定形粉末。C158H254N46O47的(ES)+-LCMS m/e计算值为3551.02，实际值为3548.7。
实施例3：制备Ac-His-Ser-Asp-Ala-Asp-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQ ID NO：5)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser，R5是Asp，R16是Gln，R18是Ala，R27是Lys且R28是Lys
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成9.2mg(1％)白色无定形粉末。C159H254N46O48的(ES)+-LCMS m/e计算值为3579.03，实际值为3577.8。
实施例4：制备Ac-His-Ser-Asp-Ala-Gln-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQID NO：6)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser，R5是Gln，R16是Gln，R18是Ala，R27是Lys且R28是Lys
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成9.8mg(1％)白色无定形粉末。C160H257N47O47的(ES)+-LCMS m/e计算值为3592.07，实际值为3589.5。
实施例5：制备Ac-His-Ser-Asp-Ala-Pro-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQID NO：7)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser，R5是Pro，R16是Gln，R18是Ala，R27是Lys且R28是Lys
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成15.2mg(1.4％)白色无定形粉末。C160H256N46O46的(ES)+-LCMS m/e计算值为3561.06，实际值为3560.0。
实施例6：制备Ac-His-Ser-Asp-Ala-MeVal-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQ ID NO：8)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser，R5是MeVal，R16是Gln，R18是Ala，R27是Lys且R28是Lys
Figure A200780025494D00261
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成40mg(3.6％)白色无定形粉末。C161H260N46O46的(ES)+-LCMS m/e计算值为3577.10，实际值为3576.8。
实施例7：制备Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Glu-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQ ID NO：9)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser，R5是Ser，R16是Gln，R18是Glu，R27是Lys且R28是Lys
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成126mg(11.4％)白色无定形粉末。C160H256N46O49的(ES)+-LCMS m/e计算值为3609.06，实际值为3609.2。
实施例8：制备Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQ ID NO：10)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser，R5是Ser，R16是Gln，R18是Ala，R27是Leu且R28是Lys
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成77mg(7.3％)白色无定形粉末。C158H253N45O47的(ES)+-LCMS m/e计算值为3536.00，实际值为3534.95。
实施例9：制备Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Lys-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQID NO：11)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser，R5是Ser，R16是Gln，R18是Lys，R27是Lys且R28是Lys
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成79mg(7.5％)白色无定形粉末。C161H261N47O47的(ES)+-LCMS m/e计算值为3608.11，实际值为3607.6。
实施例10：制备Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Ala-Nle-Glu-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQ ID NO：12)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser，R5是Ser，R16是Ala，R18是Glu，R27是Lys且R28是Lys
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成65mg(6％)白色无定形粉末。对C158H253N45O48的(ES)+-LCMS m/e计算值为3552.00，实际值为3551.2。
实施例11：制备Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Asn-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQ ID NO：13)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser，R5是Ser，R16是Gln，R18是Ala，R27是Leu且R28是Asn
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成109mg(10.6％)白色无定形粉末。C156H247N45O48的(ES)+-LCMS m/e计算值为3521.93，实际值为3520.5。
实施例12：制备Ac-His-Ala-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQID NO：14)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ala，R5是Ser，R16是Gln，R18是Ala，R27是Lys且R28是Lys
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成20mg(1.8％)白色无定形粉末。C158H254N46O46的(ES)+-LCMS m/e计算值为3535.02，实际值为3533.4。
实施例13：制备Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQID NO：15)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser，R5是Ser，R16是Arg，R18是Ala，R27是Lys且R28是Lys
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成60mg(5.3％)白色无定形粉末。C159H258N48O46的(ES)+-LCMS m/e计算值为3579.08，实际值为3577.8。
实施例14：制备Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Asn-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQ ID NO：16)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser，R5是Ser，R16是Arg，R18是Ala，R27是Leu且R28是Asn
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成40mg(3.7％)白色无定形粉末。C157H251N47O47的(ES)+-LCMS m/e计算值为3549.99，实际值为3549.2。
实施例15：制备Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle-Glu-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQ ID NO：17)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser，R5是Ser，R16是Arg，R18是Glu，R27是Lys且R28是Lys
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成36mg(3.6％)白色无定形粉末。C161H260N48O48的(ES)+-LCMS m/e计算值为3637.11，实际值为3636.4。
实施例16：制备Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle-Lys-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQID NO：18)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser，R5是Ser，R16是Arg，R18是Lys，R27是Lys且R28是Lys
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成51mg(4.4％)白色无定形粉末。C162H265N49O46的(ES)+-LCMS m/e计算值为3636.17，实际值为3634.8。
实施例17：制备Ac-His-Ala-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle-Glu-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQ ID NO：19)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ala，R5是Ser，R16是Arg，R18是Glu，R27是Lys且R28是Lys
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成27mg(2.7％)白色无定形粉末。C161H260N48O47的(ES)+-LCMS m/e计算值为3621.11，实际值为3620.4。
实施例18：制备Ac-His-Ala-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle-Lys-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQID NO：20)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ala，R5是Ser，R16是Arg，R18是Lys，R27是Lys且R28是Lys
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成53.5mg(4.6％)白色无定形粉末。C162H265N49O45的(ES)+-LCMS m/e计算值为3620.17，实际值为3618.8。
实施例19：制备Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle-Glu-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQ ID NO：21)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser，R5是Ser，R16是Arg，R18是Glu，R27是Leu且R28是Lys
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成33mg(3.3％)白色无定形粉末。C161H259N47O48的(ES)+-LCMS m/e计算值为3622.10，实际值为3620.8。
实施例20：制备Ac-His-Ser-Asp-Ala-MeVal-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQ ID NO：22)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser，R5是MeVal，R16是Gln，R18是Ala，R27是Leu且R28是Lys
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成55mg(5.2％)白色无定形粉末。C161H259N45O46的(ES)+-LCMS m/e计算值为3562.09，实际值为3561.09。
实施例21：制备Ac-His-Ala-Asp-Ala-MeVal-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQ ID NO：23)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ala，R5是MeVal，R16是Gln，R18是Ala，R27是Lys且R28是Lys
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成49mg(4.5％)白色无定形粉末。C161H260N46O45的(ES)+-LCMS m/e计算值为3561.10，实际值为3560.0。
实施例22：制备Ac-His-Ser-Asp-Ala-MeVal-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQ ID NO：24)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ser，R5是MeVal，R16是Arg，R18是Ala，R27是Lys且R28是Lys
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成13.8mg(1.2％)白色无定形粉末。C162H264N48O45的(ES)+-LCMS m/e计算值为3605.16，实际值为3604.0。
实施例23：制备Ac-His-Ala-Asp-Ala-MeVal-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2[Ac-(SEQ ID NO：25)-NH2]，即式I的化合物，其中X是Ac，Y是NH2，R2是Ala，R5是MeVal，R16是Gln，R18是Ala，R27是Leu且R28是Lys
通过按照实施例1中的程序，对Fmoc-Rink-连接体-BHA树脂(450mg，0.25mmol)进行固相合成和纯化，从而生成30.2mg(2.8％)白色无定形粉末。C161H259N47O45的(ES)+-LCMS m/e计算值为3546.09，实际值为3544.8。
实施例24：超-T1 cAMP激动剂测定
表达VPAC2受体的人T-淋巴细胞系超-T1获自美国典型培养物保藏(ATCC，CRL-1942)，并将其以0.2-2 x 106细胞/ml的密度，保持在处于37℃CO2培养箱中的生长培养基中。该生长培养基是增补了25mM HEPES缓冲液和10％胎牛血清(Gemini Bioproducts)的RPMI 1640(Invitrogen)。
为了评估VPAC2激动剂化合物活性，在RT下，用生长培养基清洗对数生长期的细胞一次，并将其以150μl生长培养基中4 x 104细胞/孔的密度接种到96-孔板中。然后，将生长培养基中处于合适浓度的50μl待测试化合物加入到指定的孔中。在RT下5分钟后，通过向每个孔中加入25μl裂解试剂1A(cAMP Biotrak EIA系统，Amersham生物科学(AmershamBiosciences)，RPN225)，而裂解细胞。将该96-孔板在RT下伴随着摇动保持10分钟，并然后保存在4℃直到分析cAMP(2小时内)。
利用cAMP Biotrak酶免疫测定(EIA)试剂盒，按照制造商的说明书(Amersham Biosciences，RPN225)，在100μl各种细胞溶解产物中确定环状AMP水平。通过将7-浓度剂量响应数据拟合到由GraphPad Prism程序(GraphPad软件公司(GraphPad Software，Inc.))提供的S性剂量-响应等式中，来估算各种VPAC2激动剂化合物的活性(EC50值)。
表1
 
实施例中的化合物 超-T1 cAMP EC50(nM)
1 38
2 69.7
3 98
4 85
5 1206
6 2.35
7 632
8 11.4
9 1200
10 447
11 16.8
12 7.4
13 17.6
14 94.1
15 116.7
16 1030
17 23.3
18 276
19 68.4
20 9.45
21 4.75
22 10.54
23 4.07
实施例25：肽针对嗜中性弹性蛋白酶的稳定性
利用反相高压液相色谱(RP HPLC)电喷离子化质谱(ESI MS)确定肽类似物的蛋白水解稳定性。用人嗜中性弹性蛋白酶培育肽类似物，并在合适的时间点，通过ESI MS确定未消化的类似物的量。一个实验中可以包括多种肽类似物，只要它们能够通过HPLC保留时间和/或通过分子量区别开。在全部实验中使用Ac-HisAc-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2作为对照并作为参考标准。同时使用多种肽类似物以及参考标准容许补偿多个实验间酶蛋白水解保真度的变化。使用针对各种未消化的肽获得的整合离子电流进行定量。为了计算半衰期，设定了第一-级动力学行为，并将所有的计算都针对参考标准的半衰期进行规格化。
在水中配制浓度为2.5mg/mL的肽储液。除非在使用中，将全部储液保存在-20℃。为了确定制备的储液中的相对肽含量，对等分试样进行反相HPLC，并且将观察到的UV吸光率与来自参考标准的相似等分试样进行比较。相应地调节肽类似物的浓度。为了进行蛋白水解消化，将肽溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，至浓度为0.1mg/mL。将多至6种的不同肽类似物混合为一个50μL反应体积中。将参考标准加入所有实验中，作为参考和内部标准。加入来自弹性蛋白酶储液中的弹性蛋白酶(人嗜中性，Calbiochem，Cat # 324681)，直至浓度为1-2μg/mL。选择了不同量的酶，以补偿肽类似物蛋白水解稳定性的不同。先前，在水中配制浓度为1mg/mL的弹性蛋白酶储液。将酶储液的小等分试样保存在-20℃，从而通过限制解冻和冷冻循环的次数，更好地维持酶活性。
在HPLC系统(Agilent 1100系列)的自动取样器中的自动取样器管中，在环境温度下，进行消化。关于时间段，以70分钟的间隔，向反相HPLC柱(Phenomenex，Luna C18，3μ，100，150 x 2.00mm)上注射5μL等分试样。关于起始时间点，在即将添加蛋白水解酶之前注射等分试样。由一个实验能够记录总共8个时间点，包括起始点。在具有5％-30％有机相的50分钟梯度的反相柱上分离肽。水相是水中的0.05％(v/v)三氟乙酸，且有机相是乙腈中的0.045％(v/v)三氟乙酸。分别在214和280nm处记录吸光率。将全部柱流出物引入到电喷离子化质谱(ABI 4000 QTrap LC/MS/MS系统)的涡轮V源中。在包括全部非降解的肽类似物的三重带电离子的质量范围内，以Q3MS模式获得质谱。进行了努力，以确保肽类似物能够通过色谱保留时间或通过分子量的不同而被明显区分开。由整合的总离子电流计算各种未消化的肽类似物的相对量。选择了2.5Da的窗口，并使用制造商的软件整合各个离子电流。通过设定第一-级动力学行为计算各种肽类似物的总半衰期，并相对参考标准的半衰期进行规格化。
表2
 
实施例中化合物 相对弹性蛋白酶稳定性
1 3.9
2 5.2
3 4.5
4 3.9
5 4.9
6 6
7 16.4
8 3.5
9 12.0
10 7.4
11 2.4
12 5.2
13 1.7
14 4.5
15 4.8
16 4.4
17 4.6
18 5.1
19 3.3
20 3.4
21 5.7
22 1.8
23 3.6
实施例26：化合物对雄性C57BL/6小鼠中由LPS-诱导的肺炎的作用
气雾剂LPS：在气雾剂暴露于脂多糖(LPS，在无菌盐水中500μg/ml)之前，用媒介物或药物预处理C57bl/6小鼠15-30分钟。所述气雾剂由Pari超尖端喷射喷雾器(Pari Ultra nebjet nebulizer)生成，其出口与容纳动物的小透明塑料室[H x W x D，10.7 x 25.7 x 11cm(4 x 10 x 4.5英寸)]相连。24小时后进行支气管小泡灌洗(BAL)，以确定细胞炎性的强度。如下所述，进行BAL程序。
鼻内施用LPS：在鼻内施用脂多糖(在无菌盐水中0.05-0.3mg/kg；总体积50μl，25μl/鼻孔)之前，用媒介物或药物预处理小鼠。通过利用25-50μleppendorff吸移管向鼻孔递送剂量溶液小滴，进行鼻内给药。在如上所述LPS攻击后3-24小时进行BAL，从而确定细胞炎性的强度。
支气管小泡灌洗：LPS暴露后24小时，用戊巴比妥(80-100mg/kg，i.p.)、氯胺酮/xyzaline(80-120mg/kg/2-4mg/kg，i.p.)或尿烷(1.5-2.4g/kg，i.p.)麻醉动物；并且通过小中线颈部切口(15-20mm)，暴露气管，并插入20-口径管状接合器。用2 x 1ml不含Ca++和Mg++的无菌Hanks平衡盐溶液(HBSS)灌洗肺。30秒后，针对每只动物，通过轻轻吸取，收集灌洗液，并汇聚。然后在2000rpm，5℃，离心样品10分钟。吸出上清液，并且在通过加入5ml HBSS恢复对剩余细胞的同渗容摩之前，使用0.5ml蒸馏水30秒，以将红血细胞从产生的沉淀中溶解出来。在2000rpm，5℃，再离心样品10分钟，并吸出上清液。将生成的沉淀重新混悬在1ml HBSS中。通过利用血细胞计或coulter计数器从细胞混悬液等分试样，通过锥虫蓝(Sigma Chemical，St.Louis，MO)排除，确定总细胞数量。对于不同的细胞计数，在Cytospin(5分钟，1300rpm；Shandon Southern Instruments，Sewickley，PA)中离心细胞混悬液的等分试样，并用改良的瑞氏染液(Hema3染液试剂盒，Fisher Scientific)固定和染色切片。在光学显微镜下，使用标准的形态学标准分类至少300个细胞。针对嗜中性粒细胞和总细胞，表3中的数据表述为BAL细胞×104/动物，或LPS诱导的BAL流体嗜中性响应的百分比抑制。
表3
 
实施例中的化合物 剂量 LPS-诱导的嗜中性的抑制(+10-30％，++>30％)
1 0.1％ +
2 0.1％ +
6 0.01％ ++
7 0.01％ ++
8 0.1％ ++
9 0.01％ +
10 0.01％ ++
11 0.01％ ++
12 0.01％ +
13 0.01％ ++
15 0.01％ +
17 0.01％ +
19 0.01％ +
实施例27：化合物对小鼠中由乙酰甲胆碱-诱导的支气管痉挛的作用
利用来自BUXCO电子公司(BUXCO Electronics，Inc.)(Troy，NY)的全身体积描记器(WBP)，测量有意识、自由移动小鼠的呼吸功能。WBP室容许在测量呼吸功能时，动物在该室内自由移动。同时使用8个室，这样同时可以测量8只小鼠。每个WBP室与偏流量调节器相连，从而在测试过程中提供流畅恒定的新鲜气流。安装在每个室上的传感器检测动物呼吸时的压力变化。由MAX II张力计前置放大器放大压力信号，并通过由所述系统(BUXCO电子公司(BUXCO Electronics，Inc.))提供的Biosystem XA软件对其进行分析。测试前，通过经由注射端口注射正好1ml空气，校准每个室中的压力变化，并相应地调节计算机信号。将小鼠置于WBP室中，并在测试前容许其适应10分钟。测试是通过容许动物自由移动和呼吸15分钟并同时测量下列参数进行的：潮汐体积(ml)、呼吸速率(呼吸/分钟)、分钟体积(潮汐体积乘以呼吸速率，ml/min)、吸气时间(秒)、呼气时间(秒)、峰吸气流(ml/秒)、和峰呼气流(ml/秒)。在软件数据库中捕获关于以上列出的每个参数的原始数据，并每分钟平均一次，从而给出总共15个数据点/参数。报告了这15个数据点的平均值。积聚体积(ml)是累计值(非平均的)，并且代表15分钟测试时间段全部潮汐体积之和。
定制方案，以包括在致痉药攻击之前，之中，和之后的测量，从而确定Penh。通过以约5-10分钟间隔给药雾化气雾剂(30-60秒暴露)获得具体致痉药(即，乙酰甲胆碱(MCh)、乙酰胆碱、等)的剂量-响应作用。
在致痉药攻击前，如上所述，通过气雾剂，用媒介物(H2O中的2％DMSO)或溶于4ml媒介物的药物处理小鼠(balb/c)20分钟。在攻击后5、30和60分钟时确定Penh。将数据表示为相对于媒介物的Penh百分比抑制。
表4
 
实施例中化合物 攻击后5分钟时Penh的抑制(+>50％，++<50％)
6 ++
12 +
18 +
19 +
序列表
<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司
<120>新型血管活性肠肽类似物
<130>23410
<140>
<141>
<160>25
<170>PatentIn Ver.3.3
<210>1
<211>28
<212>PRT
<213>人
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<210>2
<211>31
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<223>Lys或Leu，当位置5是C-alpha-甲基-L-缬氨酸和位置16是Arg时，必须是Lys
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Claims (10)

1.式I的环状血管活性肠肽类似物
X-His-R2-Asp-Ala-R5-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-R16-Nle-R18-
         Ala-Lys-Lys 21 -Tyr-Leu-Asn-Asp 25 -Leu-R27-R28-Gly-Gly-Thr-Y
                           [X-(SEQ ID NO：2)-Y]
其中
X是组氨酸N-末端氨基的氢，其可以任选地被能水解的氨基保护基团，最优选地，被乙酰基替代，
Y是苏氨酸C-末端羧基的羟基，其可以任选地被能水解的羧基保护基团，最优选地，被NH2替代，
下划线标识的残基表示片段内第一(Lys21)和最后(Asp25)氨基酸的侧链与侧链共价连接，
R2是Ser或Ala，
R5是Thr，Ser，Asp，Gln，Pro或CαMeVal，
R16是Gln，Ala，或Arg，
R18是Ala，Lys或Glu，
R27是Lys或Leu，除了当R5是CαMeVal且R16是Arg时，R27必须是Lys以外，
R28是Lys或Asn，
或其药用盐。
2.权利要求1的化合物，其中R5是Ser或CαMeVal。
3.权利要求2的化合物，其中R27是Lys。
4.选自由下列各项组成的组中之一的化合物：
His-Ser-Asp-Ala-Thr-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr(SEQ ID NO：3)，
His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr(SEQ ID NO：4)，
His-Ser-Asp-Ala-MeVal-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr(SEQ ID NO：8)，
His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Lys-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr(SEQ ID NO：11)，
His-Ala-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle-Glu-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr(SEQ ID NO：19)，
His-Ala-Asp-Ala-MeVal-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr(SEQIDNO：23)，和
His-Ala-Asp-Ala-MeVal-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Lys-Gly-Gly-Thr(SEQ ID NO：25)。
5.权利要求1的化合物，所述化合物是X-(SEQ ID NO：8)-Y。
6.药物组合物，包括权利要求1的化合物和至少一种药用载体或赋形剂。
7.治疗肺部阻塞性病症的方法，包括通过吸入有效量的组合物对患有所述病症的人给药，所述组合物包括权利要求1的化合物和至少一种药用载体或赋形剂。
8.权利要求1的化合物在制备用于治疗肺部阻塞性病症的药物中的应用。
9.制备权利要求1的化合物的方法。
10.以上所述的发明。
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