CN102827268B - 新型血管肠肽类似物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的血管肠肽的类似物及其制备方法，与天然血管肠肽相比，本发明的化合物的化学稳定性得以提高，同时保留了天然血管肠肽的药理活性。本发明的血管肠肽类似物具有如下化学结构：

Description

新型血管肠肽类似物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及血管肠肽类似物及其制备方法。
背景技术
血管活性肠肽(VIP)是具有28个氨基酸的肽，由以下氨基酸序列组成：
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn。在70年代中期首次纯化。
VIP是一种分布广泛的肽激素，主要分布在内分泌和外分泌系统、肠和平滑肌的细胞内。VIP是一种神经效应子，其引起若干激素包括催乳素、甲状腺素和胰高血糖素的释放。VIP是一种强效的血管扩张剂和平滑肌迟缓剂，作用于外周、肺部和冠状血管，对脑血管也有一定的舒张作用。
VIP能够调节淋巴细胞的增殖转移，抑制人单核细胞中IL-8的合成，对免疫系统有一定调节作用。
在胃肠道，VIP主要以神经递质的方式发挥局部作用，具有使平滑肌松弛和舒张血管的作用，以及促进分泌和吸收的功能，可以促进肠道水合电解质的分泌。与胰泌素-胰高血糖素族相似，VIP能刺激胰岛素释放，抑制胃酸分泌，释放肝糖，致血浆葡萄糖暂时升高。
VIP对支气管平滑肌具有显著的松弛作用，研究表明，VIP可以用于哮喘等疾病的治疗。
随着对VIP的广泛研究，其临床应用前景越来越得到人们的关注，然而，天然VIP在体内的半衰期仅有2min，容易被弹性蛋白酶降解，极大程度的限制了其临床应用的前景。
WO2006042153公开了C端加入聚乙二醇的VIP衍生物，用于代谢系统疾病，例如糖尿病的治疗。
CN101484468公开了一种环状VIP多肽类似物，具有增加多肽稳定性的效果。
US6239107公开了截短的VIP片段用亲脂基团修饰的VIP类似物，由于分子量的降低，类似物的稳定性得到提升。
发明内容
本发明的目的是提供一种血管活性肠肽的类似物，其化学结构式如下：
其中每个R1、R2、R3、R4独立的选自H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基或杂环基烷基；R1、R2、R3、R4优选烷基，更优选C1-C4的烷基，最优选甲基；
R5和R6独立的选自烷基、烯基、炔基、[R1′-K-R1′]n；
所述的R1′选自烷基、炔基(烯基)或炔基；
所述的K是O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR2′、或
所述的R2′是H或烷基；
n是2-7的整数。
R5和R6优选烯基。
本发明血管活性肠肽的类似物优选具有下列结构的化合物：
其中每个R1、R2、R3、R4独立的选自H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基或杂环基烷基；优选烷基，更优选C1-C4的烷基，最优选甲基；
n和m分别选自2-7的整数，优选当n是3时，m是6。
本发明血管活性肠肽的类似物更优选具有下列结构的化合物：
本发明的血管活性肠肽类似物具有天然的多肽二级结构，α螺旋程度增加，使其更接近于血管活性肠肽的四级结构特点，更容易与靶位相结合，降低了在体内被降解的可能。与天然血管活性肠肽序列相比，本发明的多肽化合物的化学稳定性得以提高。而且本发明的多肽化合物保留了天然血管活性肠肽的药理活性。
本发明血管活性肠肽类似物尤其优选分别以具有光学活性的(R)-2-氨基-2-甲基-6-癸烯酸(即图1中的R8)和(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸(即图1中的S5)取代序列中的天然氨基酸，所述的取代基通过化学催化的方式彼此环合后获得的多肽化合物。
所述的取代基以Fmoc进行保护，参与多肽的合成，所述的Fmoc-(R)-2-氨基-2-甲基-6-癸烯酸具有如下化学结构：
所述的Fmoc-(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯酸具有如下结构：
本发明的另一方面提供了制备上述血管活性肠肽类似物的方法。可以采用本领域技术人员熟知的方法，选择顺序的或次序不同的合成步骤产生具有如下化学结构的物质：
所述的合成方法包括：例如液相合成或固相合成(SPPS)进行制备，优选SPPS。所述的固相合成可以选择常规聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇类树脂等，例如：王氏树脂(Wang Resin)，Rink amide linker MBHA树脂等，优选Rinkamidelinker MBHA树脂本发明化合物的环状结构是通过催化环合的方式制备的，所述的催化剂可以是：钌催化剂，优选的催化剂是苯基亚甲基双(三环己基磷)二氯化钌(Grubbs1st)，或Grubbs2st。
本发明另一方面提供了包括上述血管活性肠肽类似物的药物组合物。所述的药物组合物包含有效量的具有上述结构的多肽化合物和药学可接受的载体，所述的组合物可以根据本领域的公知技术进行制备，例如与常规的药用辅料进行混合，制备成注射剂、注射液，或局部给药的制剂类型例如乳剂、膏剂、霜剂或经鼻给药的剂型等，或具有缓释效果的制剂，例如微球、脂质体等。
本发明所述的“药学可接受的载体”包括任何一种药用辅料，例如填充剂、稀释剂、赋形剂等。例如包括但不限于：乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、纤维素类(如羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素等)、乙二醇、豆油、芝麻油、乙醇、无菌生理盐水、无菌水、乙醇等。通常，药学上可接受的载体是水溶性的pH缓冲液，例如柠檬酸盐、磷酸盐等；还可以含有抗氧化剂，稳定剂(如氨基酸)、抑菌剂等。
发明人发现，本发明的VIP类似物具有与天然VIP等同的生物活性，且具有比天然VIP更好的稳定性。
附图说明
图1是本发明优选的血管活性肠肽类似物的制备流程，图1分子式中的R8是(R)-2-氨基-2-甲基-6-癸烯基，S5是(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚烯基
具体实施例
以下的实施例用于进一步的阐明本发明的技术方案。本发明说明书及实施例中所带保护基的氨基酸单体以及其他化学试剂等，均可从相关公司购买获得，未注明具体条件的试验方法，可按常规条件进行，或按商品供货商所建议的条件进行。
实施例1血管活性肠肽类似物的制备
按照固相合成的常规方法，将带保护基的氨基酸逐一接在树脂上，然后用催化剂催化环合，接着脱去保护基并将多肽从树脂上切下，制备如下式的优选血管活性肠肽类似物：
1、固相合成
选择0.402g Rink amide linker MBHA树脂(取代度：0.373mmol/g)制备，在室温条件下用DMF浸泡树脂60min，将带有Fmoc保护的氨基酸按照序列：的顺序排列在合成仪中进行活化连接，获得图1所示的化合物2，结构为：
2、催化环合
将上述步骤所得的化合物2依次用DCM(20ml)和DCE(20ml)各冲洗两次，然后用DCE(8ml)浸泡30min，接着将Grubbs 1st(25mg×2，20mg/0.1mmol)加入反应混合物中，室温振摇3小时。用MS检测环化情况，如果环化不完全，重复该步骤，通常重复2次，获得图1所示的化合物3(1.021g)。
3、切除树脂
将含有上述化合物3的反应混合物放在裂解液中，氮气保护下室温搅拌2.5小时。过滤，去除滤液，滤饼用TFA(2ml)冲洗，接着放置在冷的乙醚(50ml)中沉淀，离心；得到的滤饼用冷的乙醚(50ml)冲洗两次，真空干燥，获得本发明AVIPTADIL多肽类似物(图1所示827173)538mg，产率105％，MW＝3410.2，理论值MW＝3410.2。
4、纯化
将上述粗品用HPLC进行纯化，获得纯度95％以上的纯品35mg。
实施例2血管活性肠肽类似物的稳定性检测
将实施例1的VIP类似物、天然VIP分别溶于PBS缓冲液中，浓度0.1mg/ml，分别加入弹性蛋白酶至浓度约为1μg/ml，室温下保存，分别于0、5、10、30分钟取样，按照人血管活性肠肽(VIP)Elisa试剂盒(购自上海雅吉生物科技)的说明书方法，测定样品中VIP及实施例VIP类似物的含量。结果显示，本发明的VIP类似物相较与天然VIP具有更高的稳定性。
时间 VIP残余量(％) 实施例1类似物残余量(％)
0 100％ 100％
5 64％ 90％
10 40％ 86％
30 27％ 80％
实施例3血管活性肠肽类似物的气管扩张活性
正常豚鼠(300-400g)9只，分为空白对照组、VIP组和类似物组。豚鼠用舒巴坦麻醉。每只豚鼠各取三片气管片，置于37℃含Krebs-Henseleit液的10ml水浴槽内，通氧气，气管静止张力为1.0g。通过换能器输入Medlab生物信号采集处理系统测量张力反应，稳定40-60min后，依次向空白对照组、VIP组和类似物组加入二甲亚砜、天然VIP和实施例1的类似物，天然VIP和实施例1的类似物的浓度连续按μl增加，计算每个组织的累积浓度响应曲线，按照线性回归法确定EC50。结果显示，VIP的气管扩张EC50为12nM，实施例1类似物的气管扩张EC50为10nM。说明本发明VIP的类似物具有与天然VIP等同的生物活性。

Claims (6)

1.一种血管活性肠肽类似物，其化学结构式如下：
2.一种制备权利要求1所述血管活性肠肽类似物的方法，其特征在于：
(1)制备具有下述结构的物质
(2)通过催化剂处理步骤(1)的化合物，使其环合。
3.如权利要求2的方法，其特征在于，步骤(1)通过固相合成技术制备。
4.如权利要求3的方法，其特征在于，步骤(1)采用Fmoc保护的固相合成技术。
5.如权利要求2的方法，其特征在于，步骤(2)的催化剂是钌催化剂。
6.如权利要求5的方法，其特征在于，所述的钌催化剂是Grubbs 1st。
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