JPH02502636A

JPH02502636A - 新規なカルジオジラチン断片およびその製造方法

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Publication number: JPH02502636A
Application number: JP63502001A
Authority: JP
Inventors: ホルゼマン、ヴォルフ‐ゲオルク; アルト、ジャネット　エム; ベッカー、ゲルヘルド; ハープスト、フランツ
Original assignee: ファーマ・ビッセンドルフ・ペプタイド・ゲーエムベーハー; ヴォルフ―ゲオルグ・ホルゼマン
Priority date: 1987-03-02
Filing date: 1988-02-27
Publication date: 1990-08-23
Anticipated expiration: 2013-10-30
Also published as: DK174112B1; WO1988006596A1; EP0349545A1; JP2819467B2; AU614738B2; EP0349545B1; DE3878231T2; AU1348188A; ATE85345T1; DK610888D0; DE3878231D1; DK610888A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】新規なカルジオシラチン断片、その製造方法およびその用途本発明は、新規なカルジオシラチン断片、その製造方法およびその断片を含む医薬に関する。

生物的に活性なペプチド、特にホルモンは、様々な内分泌腺において少量生産され、血液により標的器官へ運ばれる。ペプチドは標的器官において、非常に多くの生理的および代謝的な活性を制御する。原則として、各ペプチドの不活性体がそれぞれの内分泌腺において合成され、なんば〈質分解酵素の作用により活性体に転換する。ペプチドはそのような活性体においてのみ、標的器官に望ましい効果を及ぼすのである。

近年において、ラットの心臓からの心房抽出物が、綿密に研究されている。その結果、多くの様々なペプチドが単離さ九ている。これらは、強弱に差はあるがナトリウム排泄作用および利尿作用を示し、加えて、血管の平滑筋を弛緩させる機能がある。こわまでのところ、これらのペプチドの命名は、かなり混乱している（心房のナトリウム排泄性因子、アラリフリン（ａｕｒｉｃｕｌｉｎ）　Ａ、カルジオナトリン（ｃａｒｄ　１ｏｎａｔｒｉｎ）、アウリクリンＢ、アトリオベブチン（ａｔｒｊｏｐｅｐｔｉｎ）　Ｉ、■およびｍ、心房のガンマ−およびアルファーナトリウム排泄性因子等）。このように用語が様々である理由の一部は、調製時の人為産物を原因とするように思われる。また、共通の前駆体から、異なるペプチドが調製されたとも考えられる。ラットのペプチドと同様に、ヒトのペプチドの共通のプレカーサーは、環状ＤＮＡのクローンから調製ざわだ。この環状ＤＮＡは、心房のｍＲＮＡから調製さ九た。ヒトのプレプロペプチドは１５１個のアミノ酸からなる。このペプチドの最初の２５個のアミノ酸は、シグナルペプチドと称するプレプロペプチド部位に相当し、リポソームでの合成および続く分泌の過程においてプロセッシングを制御する。その後、１２６個のアミノ酸からなるペプチドであるＡＮＦ／ＣＤＤＩ−１２６（ガンマ−ｈＡＮａＰ）が放出される。このペプチドは分子量が１３５００であり、この状態のものがヒトの心房において同定された。

本質的に生物的活性を有するペプチドは、ＡＮＦ／ＣＤＤＩ−１２６（ガンマ− ｈＡＮａＰ）のＣ末端における最後の２８個のアミノ酸に相当する。このペプチドは、ＡＮＦ／ＣＤＤ９９−１２６（ヒトの心房のアルファーナトリウム排泄性ペプチド、アルファーｈＡＮａＰ）と呼ばれている。そのアミノ酸配列は、カンガワ・ケイ（Ｋａｎｇａｗａ、に、）およびマツオ（Ｍａｓｔｕｏ）により解明され、公表されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１１８．１３１−１３９　（＋９８４）参照）。

λＮＦ／ＣＤＤ　　ｌ−１２６（ガンマ−υボとｐ＞＋このアミノ酸配列の１〜２５の位置が、シグナルペプチドであるとみなされる。

これに対して、２５〜１５１の位置は、ガンマ−ｈＡＮａＰを表わし・、とりわけ、そのＣ末端の領域（１２４〜１５１の位置）は、アルファーｈＡＮａＰと一致する（Ｏｉｋａｗａ。

Ｓ、他、”Ｎａｔｕｒｅ″那（１９８４）、　７２４−７２６．およびＮａｋａｙａｍａ、　Ｈ，他。

−Ｎａｔｕｒｅ″３１０　（＋９８４）、　６９９−７０１参照）。ただし、以下において採用するアミノ酸の番号は、シグナルペプチドを除外して検討する。

よって、ガンマ−ｈＡＮａＰのアミノ酸配列としては１〜１２６の位置が妥当であり、アルファーｈＡＮａＰのアミノ酸配列としては９９〜１２６の位置（ＡＮＦ／ＣＤＤ９９−１２６）が妥当である。

このペプチドホルモ〉゛は、カルジオシラチンｆｃａｒｄｉｏｄｉ　Ｉａｔｉｒ＋）の名称でも知られており、臨床および治療において、非常に重要である。これは、このペプチドホルモンが心筋の変力による腎臓における利尿、血管の平７１筋系、さらに発汗にも作用を有しているからである。このペプチドホルモンの断片のいくつかは、いくふん弱められた状態の生物的活性を示す。ＡＮＦ／ＣＤＤ９９−１２６は、カルジオシラチンの活性断片であり、血液中を循環している。こ九は、以下のアミノ酸配列を有している。

Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−＾ｒｇ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ− Ｇｌｙ−＾ｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−＾ｒｇ−１１ｅ−Ｇ　１ｙ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｎ−５ｅｒ−Ｇ　１　ｙ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ｃｙｓ　−Ａ　５ｎ−５ｅｒ− Ｐ　ｈｅ−＾ｒｇ−Ｔｙｒ−［１j１このＡＮＦ／ＣＤＤ９９−１２６は、非常に少量か心房抽出物から得られる。

本発明の目的は、カルジオシラチンの生物的な活性断片を、さらに見い出すことであり、そして、生物的に活性であるカルジオシラチンの断片を合成により調製する方法を創造することでもある。

上記の目的は、以下のアミノ酸配列を有するカルジオシラチンの断片、ウロジラチン（ｕｒｏｄｉｌａＬｉｎ　、　ＡＮ　Ｆ／’ＣＤＤ　９５−１２６）により達成された。

上記式において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、ＡＮＦ／ＣＤＤＩ−１２６（ガンマ−ｈＡＮａＰ）の別のペプチド断片を意味し、特に、Ｒ１はＴｈｒ−Ａ　Ｉａ−Ｐｒｏ−八ｒｇ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−５ｅｒ−５ｅｒであり、そして　Ｒ２はＡｓｎ−５Ａｓｎ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒである。

驚くべきことに、ヒトの尿が、これまで未知のカルジオシラチンの生物的活性体、すなわちウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）を含むことが判明した。ラットおよび犬を用いた動物試験が示すところでは、ウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）は、ＡＮＦ／ＣＤＤ９９−１２６と比較してやや多い投与量においてのみ、ＡＮＦ、／ＣＤＤ９９−１２６の作用に相当する作用を示すが、明らかに、ウロジラチンの方がより強い利尿効果を有している。この生物的活性物質は、カルジオシラチン断片の分離に用いられるクロマトグラフィー系において、その分離のある段階で溶出するが、ＡＮＦ／ＣＤＤ９９−１２６とはかなり異なる挙動を示す。

ウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）は、腎臓において翻訳後のプロセッシングにより形成されるプレカーサーたんば〈質に起源があることが明らかとなった。

トーーー込ｒ／ＣＤＤニー１２６（ガンマ−励Δとｐ）−一一一刊（入ＮＦ／ＣＤＤ　　９５−ユ２６）このアミノ酸配列の１〜２５の位置が、シグナルペプチドであるとみなされる。

これに対して、２５〜１５１の位置は、ＡＮＦ／ＣＤＤＩ−１２６（ガンマ−ｈＡＮａＰ）を表わす（Ｏｉｋａｗａ。

Ｓ、他、”Ｎａｔｕｒｅ”　３０９　（１９８４）　、　７２４−７２６　；およびＮａｋａｙａａ＋ａ、に、他。

−Ｎａｔｕｒｅ″３１０　（１９８４）、　６９９−７０１参照）。千〇Ｃ末端の領域（１２０〜１５１の位Ｍ）はウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）と一致する。ただし、以下において採用するアミノ酸の番号は、シグナルペプチドを除外し、て検討する。よって、ガンマ−ｈＡＮａＰのアミノ酸配列としては１〜１２６の位置が妥当であり、ウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）のアミノ酸配列としては９５〜１２６の位置が妥当である。

この新規なカルジオシラチンの断片は、驚くべき生物的活性を示し、ＡＮＦ／ＣＤＤ９９−１２６と区別される。この断片は、その構造を解明するために充分な量がヒトの尿から分離さｎ、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰ　ＬＣ）技術を用いて特に純度の高い状態で得られる。このため、アミノ酸配列の解析により、単一の分子として、その構造が解明さ九た。この断片のアミノ酸配列を以下に示す。

Ｔｈｒ−Ａ　１ａ−Ｐ　ｒｏ−Ａ　ｒｇ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｒｇ −５ｃｒ−５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｇ　ｌ　凵|Ａ　ｒｇ− Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｇｌｙ−＾１ａ−［ｉｌｎ−５ｅｒ−Ｇｌｙ −Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒウロシラチン（ＡＮＦ、、／ＣＤＤ９５−１２６）の活性について、インどホおよびインビトロでの研究によ４ば、この物質は平滑筋系に対して顕著な弛緩効果を有している。アドレナリン前処理により収縮したウサギの腎動脈、ウサギまたはラットの腹部大動脈、またはウサギの肺動脈の組織洛中におけるインビトロでの研究によっても、ウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の弛緩効果が示される。最も明らかな証拠は、腎動脈の筋肉切片の弛緩に示されている。その場合、組織洛中において１０ｍ１当り約１．０乃至１０．００ｍｇの投与量でも弛緩が検出される。ウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）は、利尿性およびナトリウム排泄性に加えて、血管拡張性も示す。

ＡＮＦ、／ＣＤＤ９９−１２６が血液透析あるいは血液濾過により得られた物質から分離されるのに対して、ウロジラチンはヒトの尿から分離することかできる。ウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の回収において、尿（必要に応じて酸性化した後）は、最初にアルギン酸に接触させる。カルジオシラチン断片はアルギン酸に吸着する。アルギン酸から脱着によるカルジオシラチン断片の分離および精密な検査、さらにクロマトグラフィーによる精製は、西独国公開明細１（ＤＥ−０５）　３３４６９５３号に既に記載されているＡＮＦ／ＣＤＤＩ− １２６の分子全体（ガンマ−ｈＡＮａＰ）のための方法で実施される。

求める生物的に活性であるカルジオシラチン断片をざらに精製するだめには、生物的活性分子を含む分画を、逆相クロマトグラフィー・シリカゲルを用いるＨＰＬＣによる二次分離にかける。この二次のクロマトグラフィ一段階において、水、メタノールおよびトリフルオロ酢酸からなる混合物を、溶離剤として連続勾配で用いることが好ましい。

この新規なカルジオシラチン断片であるウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）は、それ自体は公知の方法、例えば、ＢＯＣアミノ酸を用いるメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）の合成法によっても合成することができる。溶液中での古典的な断片合成の方法によっても調製は可能である。

本発明の別の主題は、以下のアミノ酸配列を有するカルジオシラチン断片、ウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の製造方上記式において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、ＡＮＦ／ＣＤＤＩ−１２６（ガンマ−ｈＡＮａＰ）の別のペプチド断片を意味し、特に、Ｒ１はＴｈｒ−Ａ　Ｉａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−５ｅｒ −Ｌｅｕ−Ａｒｇ−＾ｒｇ−５ｅｒ−５ｅｒであり、そして、Ｒ２は八ｓｎ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒである。

この製造方法は、通常の保護基により保護されたアミノ酸を使用する固相上での段階的な合成である。

保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニルまたは３．５−ジメトキシフェニル−２，２−プロピルオキシカルボニル基が好ましい。

本発明に従う方法の別の態様においては、ＡＮＦ／ＣＤＤ９９−１２６を直接、Ｎ−末端を延長するテトラペプチド、Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨと反応させる。ＡＮＦ／ＣＤＤ９９−１２６ベブチドは、遊離のアミノ基の機能を存する付属基を含まないため、この合成は比較的問題な〈実施することができる。テトラペプチド、丁ｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇは、それ自体は公知の方法で合成しておき、そのカルボキシル基の機能を活性化させた後、必要に応じてそれを保護した状態で、遊離のＡＮＦ／ＣＤＤ９９−１２ｓと反応させる。

本発明に従う、カルジオシラチン断片、すなわちウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の調製方法のさらに別の態様は。

固相上に固定化したＡＮＦ／ＣＤＤ９９−１２６を、テトラペプチド、Ｔｈｒ− Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇと反応させることを特徴とする。テトラペプチドは必要に応じて保護基を含む。得られたペプチドは担体から分離し、保護基の除去と共に結晶化し、それ自体は公知の方法で精密に検査して精製する。

テトラペプチドは１通常の保護基により保護することができる。

テトラペプチドとして、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ　（Ｂｕｔ）　−Ａ　１ａ−Ｐｒｏ− Ａｒｇ（Ｍｔｒ）またはＤｄｚ４ｈｒ　（Ｂｕｔ、）−＾１ａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）を用いることが好ましい。テトラペプチドにおけるアルギニンの付属基は、臭素塩または過塩素塩の状態で保護されていてもよい。

活性化剤としては、カルボニルジイミダゾールを２当量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールと共に用いることが好ましい。

本発明のさらに別の主逆は、ＡＮＦ／ＣＤＤ９９−１２６ベブチドを溶媒に溶解し、必要に応じて保護基を配したテトラペプチド、Ｔｈｒ−Ａｈａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを活性化剤と共に加え、最終産物を保護基の除去後クロマトグラフィーにかけて、そしてそれ自体は公知の方法で精製することを特徴とするカルジオシラチン断片、ウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の製造方法である。

ウロジラチン（ＡＮ　Ｆ　／　ＣＤ　Ｄ　９５−１２６　）は、ＢＯＣアミノ酸を用いるメリフィールドによる固相合成方法（Ｒ，Ｂ、、”５ｏｌｉｄＰｈａｓｅ　ｌ’ｅｐＬｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｊｓｌ、　Ｔｈｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ａ　Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｊｄｅ−。

Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓａｃ、　８５，２］４９−２１５６．　（１９６３）　参照）を用いて完全に合成された。これにより、ウロジラチンは、非常に純粋な物質（純度は９８％以上）として、非常に活性な状態で得られた。

ウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６＞の合成は、自動ペプチド合成装置において支持ポリ１マーとしてベンズヒドリルアミンを用いるメリフィールドの固相合成方法（１９６３）に類似の方法で実施することができる。粗製調製物は、セファデックス−０２５（Ｆ）を用いて予備の精製を行ない、次いで準調製用の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製する。このようにして、ＡＮＦ／ＣＤＤ１−１２６　（ガ”、ｒマーｈＡＮａＰ）の最後のＣ末端のアミノ酸（９５から１２６まで）の完全合成によるレプリカが形成される。生産物は、凍結乾燥粉末で白色の綿状の低密度粉末として得ら九る。この生産物の純度は少なくとも９８％である。使用前に１０乃至５００μｇの量をとり、生理的食塩水（０，９％塩化ナトリウム）に溶解させる。例えば、この物質を凍結乾燥粉末として補助物質なしの５０μｇの量を２ｍＪ２のガラス瓶にとる。１ｒｒ＋４２の生理的食塩水（０，９％塩化ナトリウム）を溶解のために使用した。これらの物質を注入または注射することについては、全く問題ない。基本的には、ペプチドを生理的食塩水、あるいは他の等強性の生理的に適合性のある溶液中に調製および保存することも可能である。任恩に、生理的に適合性のある殺菌剤および／または安定化剤がこれらの溶液に加えられる。

クロマトグラフィーによる分離において、求めている生物的活性のあるカルジオシラチン断片を含む各分画を決定するためには、それ自体は公知の生物的活性を検出する方法が用いられる。１つの分画においてウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６１またはＡＮＦ／ＣＤＤ９９−１２６を検出するために適切なものとして、この化合物の平滑筋肉系に対する弛緩効果がある。この検査において、組織洛中におけるウサギの腎動脈、ウサギまたはラットの腹部大動脈、またはウサギの肺動脈を用いることが好ましい。この検査は、ノルエどネフリンの前処理により収縮した血管の筋肉の切片か、活性カルジオシラチン断片を添加することにより顕著な弛緩を示すことによる。この反応は、腎動脈からの筋肉切片を用いると最も明瞭に認めることができる。その場合、組織洛中において１０ｍＩＬ当り約１．０乃至１０．００ｍｇの投与量でも弛緩が検出される。

Ｃｙｓ１０５およびＣｙｓ１２］の間に含まれるジスルフィド架橋は、生物的作用に不可欠であると思われる。

これらの生物的作用は、ペプチドホルモンであるカルジオシラチン、そして驚くへきことにウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）断片も同様に、臨床、診断および治療において重大な異義を有していることを示す。さらに具体的には、カルジオシラチン断片て°あるウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）は、様々な分野に好ましく通用することができる。すなわち、ある血管床の分化した血管拡張、高血圧の診断および治療、人工心臓を移植した患者の代わりに血液量および血液の電解質の同時調節、皮膚の疾患、特に発汗障害、心臓血管系のショック、腎臓および副腎皮質の障害を伴なう皮膚の疾患、胃腸管の疾患、特に運動性障害および腸閉塁、脳水腫および緑内障の治療、狭心症のような痙彎性の冠動脈炎の治療、急性腎不全の治療、ネフローゼおよび腎炎の症候群、末端腎不全、急性冠動脈不全、腹水、全身水腫、肺水腫、脳水腫、−次および二次のリンパ水腫、水胴症、緑内障、大静脈狭窄症、低たんば〈血症、聴覚障害、本態性かつ腎性高血圧、悪性高血圧、妊娠中の高血圧のようなＥＰＨ妊娠中毒症、妊娠中のネフローゼ、大脳のナトリクム貯蔵症候群、レーノー病のような血管痙彎、腹部アンギナ、冠動脈痙彎、冠動脈性心臓疾患、血管運動性の頭痛、高血圧性の頭痛、ピング−ホートン片偏頭痛症候群、基底椎骨流路領域における血液循環障害、レニンーアンギオテンシン系の障害、−次および二次の高アルドステロン症、レニン分泌性腫瘍、褐色細胞腫、バーター症候群、シュヴアルツーバーター症候群、肝不全、無発汗症のような一次汗腺不全、排尿および排便障害、下垂体膣前葉の不順、カテコール増加を伴なう精神性の疾患および動揺の治療における心臓血管系の副作用、心臓移植、ＰＥＥＰ呼吸（Ｍ極末端呼気圧を伴なう人工呼吸）およびバイパス手術における支援治療、人工心臓の移植後の合併症の治療等である。クロシラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）は、複数の疾患、例えば、高血圧／心不全を伴なう痛風、あるいは高血圧／゛心不全を伴なう糖尿病の治療のため利尿剤として用いることもできる。また、クロシラチンは、セファレスボリン、アミノグリコシドまたは抗凝血剤と組み合わせて利尿剤として用いることもできる。さらに、腎臓移植後の急性腎不全の予防、シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）　、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａＬｉｎ）およびイフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄ）のような腎毒素物質の治療、手術後、高血圧の発症後あるいは腎臓の機能障害の患者への対照中膜の実施後の急性腎不全の予防にも、クロシラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６３は通している。本発明に従う薬剤を、内皮の変化の鑑別診断における診断薬として使用することもできる。

従って、本発明の主題は、以上述べたような診断および治療方法に使用するため、新規なカルジオシラチン断片であるクロシラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）を含む医薬でもある。この医薬は従来の静脈、経口または非経口の投与形態とすることができる。例えば、錠剤、圧側、糖剤、液剤、スプレー、吸入用の処方、さらにマイクロカプセル化等である。さらに、必要に応し°Ｃ賦形剤および／または希釈剤と共に用いてもよい。本発明に従う医薬は、遅延投与形態として処方することもできる。クロシラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の使用量は、１投与９単位当たり５ｎｇ乃至５０μｓであることが好ましい。

さらに、本発明によれば、免疫学的検定法の原則に従いクロシラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６２に対する抗体を用いて、カルジオシラチンに特異的な検出方法が提供される。驚くべきことに、クロシラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）に対する抗体を用いると、体液中においてカルジオシラチンが高度に特異的かつ非常に鋭敏に検出されることが明かとなった。上記の特異的なカルジオシラチンの検出方法は、脳を髄液中のカルジオシラチンまたはその断片を特異的に検出することにより、神経系統の疾患の診断に使用することができる。

本発明に従う医薬の使用においては、活性物質としてクロシラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６１を含む。クロシラチンの作用の有益な特異性およびその低毒性により、本発明に従う医薬は様々な疾患の治療に処方される。この疾患には、前末期または末期の腎不全、レニンーアンギオテンシンーアルドステロン系の機能不全、バソプレッシンの分泌不全、液状壊死（腹水、緑内障、脳水腫、水胴症等の第三体腔の問題）のような電解質と水の平衡の不全、さらにリンパ水腫、ＥＰＨ妊娠中毒症、大静脈狭窄症、あるいは腎臓疾患、腸症および肝臓疾患等の低たんばく血症を伴なう疾患のような溢血の蓄積量の増加を伴なう疾患が含まれる。

本発明に従う医薬は、その血管拡張性により、血管収縮の増大を伴なう全ての疾患の治療に用いることができる。従って、本発明に従うクロシラチン（ＡＮＦ／ ’ＣＤＤ９５−１２６）を含む医薬は、シーノー病、心房隔壁筋の痙彎等の血管の疼管および聴覚障害等の治療に使用することができる。クロシラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）は、さらに他の血管の疾患の治療、例えば、冠動脈性心臓疾患、腹部アンギナ、血管運動性の頭痛、基底椎骨流路傾城における血液循環障害を伴なう脳底動脈性偏頭痛、ビングーホートン症候群等の治療にも用いることができる。

本発明に従うクロシラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）を含む医薬は、その血圧低丁性により、−次の血圧増加を伴なう全ての疾患に有効である。すなわち、この医薬は悪性高血圧、妊娠中の高血圧、高血圧による頭痛、痛風や糖尿病等の他の疾、邑を伴なう高血圧に処方される。

本発明に従う医薬は、ナトリウム維持機能、水分維持機能および血管収縮性ホルモンに対して拮抗性を示す。これにより本発明の医薬を、−次および二次の高アルドステロン症、腎血管性高血圧、レニン分泌性腫瘍、褐色細胞腫、バーター症候群およびシュヴアルツーバーター症候群の治療に用いることが可能である。

本発明に従うクロシラチン（ＡＮＦ、／ＣＤＤ９５−１２６３を含む医薬は、心臓移植における、または人工心臓に伴なう心不全の治療、バイパス手術および関心手術におけるＰＥＥＰ　（積極末端呼気圧）の支援等にも用いることができる。積極末端呼気圧を伴なう呼吸において、大気圧以上の圧力に対する呼気に効果がある。

本発明に従う医薬は、腎臓移植の手術後の急性腎不全の予防、移植される腎臓の機能を本発明の医薬で前処理することによる移植腎臓機能の向上にも用いることかできるう本発明に従うクロシラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）をよむ医薬は、診断を目的として使用することもできる。その血管拡張性は内皮と独立しているため、内皮依存性の血管拡張剤との比較により、内皮の状態についての所見を作成することができる。

本発明に従う医薬の用途は、膵臓の分泌の変化および付随的な利用不全、外分泌肝不全、腸および膀胱の馬蹄（排尿および排便障害）のような胃腸糸にも処方される。

皮膚科においても、本発明に従う医薬は無発汗症に対して使用することかできる、′ＩｉＩ神科においても、本発明に従う薬剤は、カテコール増加を伴なう精神性の疾患および動揺の治療における心臓血管系の副作用の治療に用いることができる。

これらの効果は、ナノ分子量の範囲の濃度でも認められる。ただし、この薬剤は低毒性および優れた適合性があるため、より高濃度で注射または注入しても良い。

クロシラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）は、固相合成法により得られる高純度の状態で、注射または注入用の液剤、鼻用スプレー、眼用の滴下剤、あるいは以上述べたような投与の場合における遅延投与形態等の医薬の調剤に使用することができる。

動物の急性毒性試験が示すところによれば、体重当たり４００μｇ／ｋｇまでの範囲では、従来の（生化学的）対照パラメーターを用いて検出できる毒性反応は認められなかりだ。ＬＤｓｏ値は、この物質の毒性が低いため、決定できなかった。心臓−循環系、気管支系、肝臓または腎臓機能、性腺および中枢神経系において１重大な副作用は全く認められなかった。

以上述べたような疾患の治療における薬理学的な有効性は、静脈投与における急激な利尿性およびナトリウム外分泌性の上昇という結果を示すナトリウム排泄効果が認められたことによる。さらに、クロシラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６３は、ノルアドレナリンの血管収縮効果を代償できることも認められた。

さらにまた、この物質はアンギオテンシンの収縮効果を阻害することも認められた。これが特に有益な場合として、従来の治療方法では対応できない全身水腫を伴なう深刻な心不全を挙げることができる。血圧調節系およびバンプレシン調節系に対する作用も重要であると考えられる。このため、下垂体後葉の障害およびそれにより起こる精神性の作用にも通用できる。この物質について、さらに詳細な臨床的研究により、より有益な適用分野が見付かることも否定できない。

本発明を添付の図面および以下の各側を用いて、さらに詳細に説明する、第１図は、尿から分離したクロシラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）のＨＰＬＣクロマトグラＡを示す。溶離剤はメタノールである。

Ｒｆ値：２５分ゑ１二カラム：ＴＳＫ−ＯＤＳ−１２０Ｔ、２５０ｍｍｘ４．８ｍｍｍｍ可動溶媒水：水中４０タノール（０，１％トリフルオロ酢酸）可動溶媒Ｂ二１００％メタノール（０，１％トリフルオロ酢酸）勾配＝１０分間均等にＡを加えたのち、Ｂを３０分間かけて加えて、Ｂを１００％まで増加させる。

流速：０．５ｍｆｉ／分：２０℃：用紙の補充５ｍｍ／分：計算上の吸収０．０８、ＬＪＶ２５４ｎｍ、。

第２図は、メタノールを溶離剤として用いた、比較用のＡＮＦ／ＣＤＤ９９−１２６のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

Ｒｆ値：３５分条件は第１図と同じであった。

第３図は、クロシラチン（ＡＮＦ／’ＣＤＤ９５−１２６）の生物的活性を示す図表である。第１図に示される第一から第四分画について大動脈の筋肉切片を用いて弛緩検定法で試験した。投与量は、組織浴１０ｍ１ｌ当たりＨＰＬＣの各分画を１μＪＬ（ｉμには、クロシラチン（ＡＮＦ／′ＣＤＤ９５−１２６）約３ μｇに相当する）である。

第４図は、第３図と同様に、分画■の生物的活性を示す図表である。

第５図は、ＨＰＬＣの図表である。ハツチングを加えた領域は、カルジオシラテン型の生物活性を有する主領域を示す。

第６図は、１０の独立したピークを含むＨＰＬＣの図表である。

ピークの１つ（ハツチングを加えた）、すなわち２８．２分の停留時間のピークのみが生物的な活性物質を含む。

第１例健康なヒトの尿を採取した。尿を直ちに氷酢酸を用いて酸性化し、最終濃度を０．２Ｍとした。２００乃至４００１のバッチを、それぞれ水を用いて１：ｌの比率に希釈し・、ついで、濃塩酸を用いてｐＨ２，７に調整した。第一のバッチにアルギン酸２．５ｋｇを加え、混合物を８乃至１２時間攪拌した。そし・て、アルギン酸を固化して、ｈ［みを酸性化した尿の新しいバッチと取り替えた。この操作を、１０００ｆｆ以上の尿が２．５ｋｇのアルギン酸と反応するまで綬り返した、さらに、アルギン酸を沈殿させ、上澄みから分離して、エタノールおよびＣ１００５Ｍｍ酸を用いてブフナー漏斗上で洗浄した。アルギン酸上に沈殿したポリペプチドは、０．２Ｍ塩酸を用いてｆＪｔａシた。溶１１１ｆｉのｐ）ｌを４．０に調整し、塩化ナトリウムを飽和状態まで加えた。４℃で２４時間後、飽和食塩水上に形成された塩のかたまりを取り出した。

この操作をカルジオシラチンについて放射免疫測定を用いてモニターした。それにより、検出物質の９０％以上が得られたことが分った。そして、塩のかたまりをセファデックスＧ−２５のカラムにかけて、得られたペプチドについて大動脈の筋肉切片を用いるカルジオシラチンのバイオアッセイによって試験した。カルジオシラチンの生物活性の大部分を含む分画を乾燥凍結し、イオン交換カラム上でクロマトグラフにかけた。生物活性のある血管弛緩物質がこれらの分画中に認められ、これらの分画を最高のイオン強度の段階的な勾配で溶離した。

最初のＨＰＬＣにおいて、ＴＳに一〇ＤＳ−１２０７の逆相カラムを使用した。

溶離剤としては、水−アセトニトリル−ＨＣＱを連続勾配で使用した。生物活性物質は、比較用に用いる合成ＡＮＦ／ＣＤＤ９９−１２６が溶離する場合と同じ位置を示す。生物活性物質は、同じ種類の分析用逆相カラムの上にかけて、そして、溶離を水−メタノール−トリフルオロ酢酸を第１図に示される連続勾配で使用することにより実施した。そこで、生物活性物質が２５分の停留時間を示すのに対して、比較用に用いた合成ＡＮＦ／ＣＤＤ９９−１２６は３５分後に溶離した（第２図参照）。

第２例　゛構造解析：第１図に従いヒトの尿から蓄横され、そしてＡＮＦ／ＣＤＤ９９−１２６とは異なつく第２図参照）カルジオシラチン様の活性を有する生物活性物質を、・室温のｐＨ６，０の６Ｍグアニジン／Ｈ（１！（５０ｍＭＰＯ，）の緩衝液系中におけるＨＰＬＣタンデムカラム（ＴＳＫ３００ＳＷ＋ＴＳＫ２０００ＳＷ））：のクロマトグラフイ−にかけた。カルジオシラチン様の生物活性物質の主要部分は、この精製過程の小さな６２分画（第５図のハツチングを加えた領域）に認められた。６２分画の液量は、トリフルオロ酢酸を用いて０．１％に調整し、脱塩のため、Ｃ−１８−ＳＥＰＡＲＫ　（商Ｒ）カートリッジに充填し・た。この目的のため、充填したカートリッジを、ついで水（０，１％のトリフルオロ酢酸）を用いて塩分がなくなるまで洗浄した。そして、生物的活性物質をカートリッジからメタノール（またはアセトニトリル）から溶離した。溶ｌｌｌ液を凍結乾燥した。凍結乾燥物は再度、水（０，１％のトリフルオロ酢酸）に採取して、ＲＰ− ＨＰＬＣを用いて分離した。

カラム：　１２５ｍｍＸ４ｍｍ；Ｃ−４−相、０ＲＰＥＧＥＮ、ＨＤゲル緩衝液Ａ：水（０，１％のトリフルオロ酢酸）緩ＪＯＢニアセトニトリル中２０％の水（０，１％のトリフルオロ酸１ｍ）流速：０．５ｍｆｆ１／分温度＝４５℃ 検出：　２３０ｎｍ１０．０４Ｄｅｔ、５ｅｎｓ。

ＨＰＬＣの図表は、分ｍ’ａ域において１０以上の独立したピークを示す（第６図参照）。ピークの１つ（矢印で示す）、すなわち２８．２分の停留時間のピークのみが生物的な活性物質を含む。このピークを第８ピークと命名する。

配列の分析：応用生物システム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社のガス相−たんば〈質−シークエンサー４２０Ａ中で、ペプチド（第６図に示される停留時間が２８．２分である第８ピーク）をそのまま、段階的にエドマン分解した。ＰＴＨアミノ酸は、ロツベイチの方法じ旧ｇｈ　ＰｅｒｆＯｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”２５９−２６８頁、　Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ　Ｆ、、　Ｈｅｎ５ｃｈｅｎ　Ａ、、　Ｈｕｐｅ　Ｈ，Ｐ、；　Ｗａｉｔｅｒ　ｄｅＧｒｙｔｅｒ、　Ｂｅｒｌｉｎ／Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８］参照）に従い高性能液体クロマトグラフィーを用いて同定した。この高純度のポリペプチドは以下のアミノ酸配列を有していた。

Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−＾ｒｇ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｒｇ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａ@ｒｇ− Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａ　ｒｇ−Ｔ　Ｉ　ｅ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｎ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉｙ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−５ｅ秩|Ｐｈｅ　− ＾ｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨアミノ酸分析：高純度のポリペプチド（第６図の停留時間が２８．２分である第８ピーク）は、１１０℃、真空チューブ内の６ＭＨＣｆｉ、フェノール１．０％中で、２４時間加水分解した。全体の組成は、フェニルインチオシアナートによる誘導後、水− アミノ酸分析系中で決定した。その分析により、配列分析によって得られた１次構造と全体の組成の間には高度の一致が認められた。具体的な値としては、］さ・「０．９　（１）　；Ｍｅｔｏ、９９　（＋）　；Ｃｙｓ２．＋　（２）　；　１ｌｅｌ　、１　（１）　；Ｌｅｕ２．Ｉ　（２）　：Ａｒ＠U．４　（６）であった。

第３例固相（ＡＲＩ−５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　４３０）上での段階的合成１．２２ｇの８ｏｃ−’ｒｙｒ　（Ｂ７．Ｉ）およびメリフィールドの支持体（０゜６７ｍｍｏ１／ｇ；ＤＶＢ１％：２００〜４００メツシユ）から開始して、ＢＯＣ法によるＡＢＩ＋７）標準プログラムに従い配列を合成した。二重のカップリングを１ｉｅ（＋１３）まで実施し１、三重のカップリングをＡｒｇ（＋１２）まで実施する。以下のＢＯＣアミノ酸を用いた。

ＢＯＣ−Ｇ　ｌｙ、　Ｂｏｃ−Ａ　Ｉ　ａ、　Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、　Ｂｏｃ−１１ｅ、　Ｂｏｃ−Ｐｈｃ、　Ｂｏｃ−Ｍｅ　ｔ、　ＢｏＣ−Ｐ窒潤A Ｂｏｃ−Ａｓｎ、　Ｂｏｃ−Ｇ　Ｉｎ、　Ｂｏｃ−Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）　、　Ｂｏｃ−５ｅｒ　（Ｂｚｌ）　、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ、Ｂｏｃ−bｙｓ（Ａｃｔ）、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）乾燥したペプチド−ポリスチレンに、５％のアニソールおよび２．５％のエチル、メチルスルフィドを加えて、０℃で１時間ＨＦ処理を行なった。ＨＦを吸引除去後、粗製ペプチドをＡｃＯＨを用いて高分子支持体から洗浄し、濾液を凍結乾燥する。そして粗製凍結乾燥物をセファデックスＬＨ２０／水（１％Ａ　ｃ　ＯＨ／　１％ＴＦＥｔＯ）ｌ）上で脱塩する。

Ａｃｍ除去と結晶化のため、ペプチドのＡｃＯＨ／Ｈ２０（容積比９：１）溶液を調製し、１．５当量の塩酸を加える。ＡｃＯＨ中１０中量０当量濃縮液を、一度に激しべ攪拌しなからペプチド溶液に加える。１５分後、０．５Ｍのクエン酸中の希釈アルコルビン酸溶液を加えて反応を終了させる。凍結乾燥後、物質をセファテックスＬＨ２０／水（１％Ａ　ｃ　ＯＨ／　１％ＴＦＥｔＯＨ）上で脱塩し、調製用ＨＰＬＣを用いてフラクトゲルＴＳＫ−ＨＷ４０／水（１０％ＡｃＯＨ／１％ＴＦＥｔＯＨ）上で再度クロマトグラフィーにかけた後、精製する。

第４例高分子支持体上での断片縮合による合成第１例と同様の方法でＳｅｒ　（９９）までの配列を合成する。ＢＯＣ除去後、ペプチド（９９−１２６）０．５ｇとポリスチレン結合体の除たんばくを、５　ｍ　Ｊ２のジクロロメタン中の１，１° −カルボニルジイミダゾール０．３５３ｇ　（２，１７７５ｍＭｏｌ）／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール０．６６７ｇ　（４，３６ｍＭｏｌ）により３０分間前段階で活性化させたＢｏｃ−Ｔｈｙ　（Ｂｕｔ）　−Ａ　Ｉａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ　（Ｔｏｓ）１．６０９ｇ（２，１７７５ｍＭｏＩ；５倍過剰）を用いて２０℃て７２時間攪拌反応器内のジクロロメタン５　ｍ　ｌ中で実施した。支持体からの分離、Ａｃｍ除去、結晶化、精密検査および精製は、実施例１と同様に実施した。

第５例断片縮合による溶液中での合成りｏｃ−Ｔｈｙ（Ｂｕｔ）−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）　　２．　０１　ｍｇ　（２，７２ＭＭｏ１）を、２ｍｊ２のＤＭＦ中の１．１′−カルボニルジイミダゾール０．４４ｍｇ　（２，７２ｇＭｏｌ）／１−ヒドロキシベンゾトリアゾールＯ，，８３ｍｇ　（５，４４ｇＭｏ　１　）により３０分間前段階として活性化させ２こわを３ｍｊ２のＤＭＦ中の５ｍｇ　（１，３６ｇＭｏｌ；ペプチド濃度二８４％）のＡＮＦ／ＣＤＤ９９−１２６およびＮ−メチルモルホリン０．１５μＪ２（１，３６ｇＭｏ１）に加える。２０℃で７２時間攪拌後、混合物を吸引濃縮し、少量のＮ　ａ　ＨＣＯｓ溶液を加え、少量の１％Ａ　ｃ　Ｏ）Ｉ　／　１％ＴＦＥｔＯＨで希釈し、１％ＡｃＯＨ／１％ＴＦＥｔＯＨ中のＬ）１２０上でクロマドグラフィーにかける。ＨＦ１５％アニソール／２．５％エチルメチルスルフィトで処理後、物質をＬＨ２０／水（１％ＡｃＯＨ／１％ＴＦＥｔＯＨ）上、次イテフラクトゲルＴＳＫ−ＨＷ４０（Ｓ）／水（１０％ＡｃＯＨ／１％ＴＦＥｔＯ）ｌ）ｌでクロマトグラフィーにかけ、最後に調製用）ＩＰＬｃを用いて精製する。

ＦＩＧ、　１勾配ＦＩＧ、　２応答時間ＦＩＧ、　３応答任意の単位時間Ｄ時間カルジオシラチン断片であるウロジラチンの分Ｍ　（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）ＨＰＬＣタンデムカラム（ＴＳＫ３０００ＳＷ＋ＴＳＫ２０００ＳＷ）緩　衝　液二　６Ｍグアニジン／ＨＣ又、ｐＨ６流　　　　量：　　０．２ｍｌ／分チ　ャ　−　）：　　ｌｅｍ／分検　　　　　出：　　　２７０ｎｍＦＩＧ、　５ＦＩＧ、６カ　　ラ　　ム：　　　１２５＋ｅｍＸ４ｍｍ；Ｃ−４−ｐｈａｓｅ　　、０ＲＰＥＧＥＮ　　、ＨＤ　　　ｇｅｌ。

１　衝液Ａ：　水（０，１％トリフルオロ詐酸）緩衝液Ｂ：　アセトニトリル中２０％の水（０，１％トリフルオロ酢酸）漬　　　　速：　　０．７ｍ４／分温　　　度：　４５℃ 検　　　　出：　　２３０ｎｍ１０．０４　　Ｄｅｔ、５ｅｎｓ。

Claims

【特許請求の範囲】１。下記式に従うウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）を表わす、ＡＮＦ／ＣＤＤ１−１２６（ガンマーｈＡＮａＰ）の９５から１２６までのアミノ酸配列を有するペプチド：▲数式、化学式、表等があります▼ 上記式において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、ＡＮＦ／ＣＤＤ１−１２６（ガンマーｈＡＮａＰ）の別のペプチド断片を意味する。２。Ｒ１がＴｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ −Ｓｅｒ−Ｓｅｒであり、そして、Ｒ２はＡｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｙｒであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のペプチド断片。３。特許請求の範囲第１項および／または第２項に従うカルジオジラチン断片であるウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）を、保護基により保護されたアミノ酸を使用する固相上での段階的な合成で製造する方法。４。ｔ−ブトキシカルボニル、フルオレニルメチルオキシカルボニルおよび／または３，５−ジメトキシフェニル−２，２−プロピルオキシカルボニル基を保護基として使用することを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の方法。５。固相に結合させたＡＮＦ／ＣＤＤ９９−１２６を、テトラペプチドＴｈｒ− Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇと反応させ、得られたペプチドを担体から分離し、保護基の除去後環状化し、それ自体は公知の方法で精密に検査して精製することを特徴とする特許請求の範囲第１項および／または第２項に従うカルジオジラチン断片であるウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の製造方法。６。ＡＮＦ／ＣＤＤ９９−１２６ペプチドを溶媒に溶解し、必要に応じて保護基を伴なう、テトラペプチドＴｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを活性化剤と共に加え、得られたペプチドを保護基の除去後クロマトグラフィーにかけ、さらにそれ自体は公知の方法で精製することを特徴とする特許請求の範囲第１項および／または第２項に従うカルジオジラチン断片であるウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の製造方法。７。Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）をテトラペプチドとして用いることを特徴とする特許請求の範囲第５項または第６項のいずれかの項記載の方法。８。出発物質として尿を用い、アルギン酸を溶液に加え、アルギン酸に吸着したペプチドを溶離させ、溶離液を従来の生化学的精製方法に従い分画化し、そして活性のある分画を従来の生物活性の検出方法により決定することを特徴とする特許請求の範囲第１項および／または第２項に従うカルジオジラチン断片であるウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）を体液から回収する方法。９。アルギン酸に吸着したウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）を溶離し、溶離液の塩を沈殿させるか、あるいは溶離液を凍結乾燥し、沈殿物をゲルクロマトグラフィーで脱塩し、得られた粗製抽出物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、続いてＨＰＬＣで分離することを特徴とする特許請求の範囲第８項記載の方法。１０。ＨＰＬＣによる分離を逆相シリカゲルを用いて実施することを特徴とする特許請求の範囲第９項記載の方法。１１。尿をアルギン酸と接触させ、アルギン酸に吸着したウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）を溶離し、ウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）を含む分画を平滑筋系に対するその弛緩効果によって決定する試験方法を用いる従来の生化学的精製方法に従い、溶離液を分画化することを特徴とするウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の回収方法。１２。活性成分として特許請求の範囲第１項および／または第２項に従うウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）を、薬理学的に適合性のある担体および／または希釈剤と共に含む医薬。１３。高血圧、血管および心臓の疾患、発汗障害を含む皮膚の疾患、心臓血管系のショック、時調節、皮膚の疾患、特に発汗障害、心臓血管系のショック、腎臓および副腎皮質の障害、胃腸管の疾患、特に連動性障害、脳水腫、緑内陣、痙攣性の冠動脈灸および神経性疾患の診断および治療のための特許請求の範囲第１２項記載の医薬。１４。急性腎不全、ネフローゼおよび腎炎の症候群、末端腎不全、急性冠動脈不全、腹水、全身水腫、肺水腫、脳水腫、一次および二次のリンパ水腫、水胸症、緑内障、大静脈狭窄症、低たんばく血症、聴覚障害、本態性かつ腎性高血圧、悪性高血圧、妊娠中の高血圧のようなＥＰＨ妊娠中毒症、妊娠中のネフローゼ、大脳のナトリウム貯蔵症候群、レーノー病のような血管痙攣、腹部アンギナ、冠動脈痙攣、冠動脈性心臓疾患、血管運動性の頭痛、高血圧性の頭痛、ビングーホートン片偏頭痛症候群、基底椎骨流路領域における血液循環障害、レニン−アンギオテンシン系の障害、一次および二次の高アルドステロン症、レニン分泌性腫瘍、褐色細胞腫、バーター症候群、シュヴァルツーバーター症候群、膵不全、無発汗症のような一次汗腺不全、排尿および排便障害、下垂体腺前葉の不順、カテコール増加を伴なう精神性の疾患および動揺の治療における心臓血管系の副作用の治療のための特許請求の範囲第１２項記載の医薬。１５。心臓移植、ＰＥＥＰ呼吸（積極末端呼気圧を伴なう人工呼吸）およびバイパス手術における支援治療のための特許請求の範囲第１２項記載の医薬。１６。人工心臓移植後の合併症の治療のための特許請求の範囲第１２項記載の医薬。１７。複数の疾患、例えば、高血圧／心不全を伴なう痛風および高血圧／心不全を伴なう糖尿病の治療のための利尿剤としての特許請求の範囲第１２項記載の医薬。１８。セファレスポリン、アミノグリコシドまたは抗凝血剤と組み合わせた利尿剤としての特許請求の範囲第１２項記載の医薬。１９。腎臓移植後の急性腎不全の予防、およびシクロスポリン、シスプラチンおよびイフォスファミドのような腎毒素物質の治療のための特許請求の範囲第１２項記載の医薬。２０。手術後、高血圧の発症後あるいは腎臓の機能障害の患者への対照中膜の実施後の急性腎不全の予防のための特許請求の範囲第１２項記載の医薬。２１。内皮の変化の鑑別診断のための診断薬としての特許請求の範囲第１２項記載の医薬。２２。１投与量単位当たりウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）を１０ｎｇ乃至５０μｇ含むことを特徴とする特許請求の範囲第１２項記載の医薬。２３。ウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）を活性成分として含むことを特徴とする血管拡張効果を有する特許請求の範囲第１２項記載の医薬。２４。免疫学的検定法の原則に従って作業し、かつウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）に対する抗体を用いることを特徴とするカルジオジラチンの特異的な検出方法。２５。急性腎不全、ネフローゼおよび腎炎の症候群、末端腎不全、急性冠動脈不全、腹水、全身水腫、肺水腫、脳水腫、一次および二次のリンパ水腫、水胸症、緑内障、大静脈狭窄症、低たんばく血症、聴覚障害、本態性かつ胃性高血圧、悪性高血圧、妊娠中の高血圧のようなＥＰＨ妊娠中毒症、妊娠中のネフローゼ、大脳のナトリウム貯蔵症候群、レーノー病のような血管痙攣、腰部アンギナ、冠動脈痙攣、冠動脈性心臓疾患、血管運動性の頭痛、高血圧性の頭痛、ビングーホートン片偏頭痛症候群、基底椎骨流路領域における血液循環障害、レニン−アンギオテンシン系の障害、一次および二次の高アルドステロン症、レニン分泌性腫瘍、褐色細胞腫、バーター症候群、シュヴァルツーバーター症候群、膵不全、無発汗症のような一次汗腺不全、排尿および排便障害、下垂体腺前葉の不順、カテコール増加を伴なう精神性の疾患および動揺の治療における心臓血管系の副作用の治療のための特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかの項記載のウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の使用。２６。心臓移植、ＰＥＥＰ呼吸（積極末端呼気圧を伴なう人工呼吸）およびバイパス手術における支援治療のための特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかの項記載のウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の使用。２７。人工心臓移植後の合併症の治療のための特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかの項記載のウロシラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の使用。２８。複数の疾患、例えば、高血圧／心不全を伴なう痛風および高血圧／心不全を伴なう糖尿病の治療のための利尿剤としての特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかの項記載のクロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の使用。２９。セファレスポリン、アミノグリコシドまたは抗凝血剤と組み合わせた利尿剤としての特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかの項記載のウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の使用。３０。腎臓移植後の急性腎不全の予防、およびシクロスポリン、シスプラチンおよびイフォスフアミドのような腎毒素物質の治療のための特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかの項記載のウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の使用。３１。手術後、高血圧の発症後あるいは腎臓の機能障害の患者への対照中膜の実施後の急性腎不全の予防のための特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかの項記載のクロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の使用。３２。内皮の変化の鑑別診断のための診断薬としての特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかの項記載のウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の使用。３３。急性腎不全、ネフローゼおよび腎炎の症候群、末端腎不全、急性冠動脈不全、腹水、全身水腫、肺水腫、脳水種、一次および二次のリンパ水腫、水胸症、緑内障、大静脈狭窄症、低たんばく血症、聴覚障害、本態性かつ腎性高血圧、悪性高血圧、妊娠中の高血圧のようなＥＰＨ妊娠中毒症、妊娠中のネフローゼ、大脳のナトリウム貯蔵症候群、レーノー病のような血管痙攣、腹部アンギナ、冠動脈痙攣、冠動脈性心臓疾患、血管運動性の頭痛、高血圧性の頭痛、ビングーホートン片偏頭痛症候群、基底椎骨流路領域における血液循環障害、レニン−アンギオテンシン系の障害、一次および二次の高アルドステロン症、レニン分泌性腫瘍、褐色細胞腫、バーター症候群、シュヴァルツ−バーター症候群、膵不全、無発汗症のような一次汗腺不全、排尿および排便障害、下垂体腺前葉の不順、カテコール増加を伴なう精神性の疾患および動揺の治療における心臓血管系の副作用の治療のために、注射または注入用液剤のような医薬を調製するための特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかの項記載のウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の使用。３４。心臓移植、ＰＥＰ呼吸（積極末端呼気圧を伴なう人工呼吸）およびバイパス手術における支援治療のために、注射または注入用液剤のような医薬を調製するための特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかの項記載のウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の使用。３５。人工心臓移植後の合併症の治療のために、注射または注入用液剤のような医薬を調製するための特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかの項記載のウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の使用。３６。複数の疾患、例えば、高血圧／心不全を伴なう痛風および高血圧／心不全を伴なう糖尿病の治療のための利尿剤として、注射または注入用液剤のような医薬を調製するための特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかの項記載のウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の使用。３７。セファレスポリン、アミノグリコシドまたは抗凝血剤と組み合わせた利尿剤として、注射または注入用液剤のような医薬を調製するための特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかの項記載のウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５− １２６）の使用。３８。腎臓移植後の急性腎不全の予防、およびシクロスポリン、シスプラチンおよびイフォスファミドのような腎毒素物質の治療のために、注射または注入用液剤のような医薬を調製するための特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかの項記載のウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の使用。３９。手術後、高血圧の発症後あるいは腎臓の機能障害の患者への対照中膜の実施後の急性腎不全の予防のために、注射または注入用液剤のような医薬を調製するための特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかの項記載のウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の使用。４０。内皮の変化の鑑別診断のための診断薬として、注射または注入用液剤のような医薬を調製するための特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかの項記載のウロジラチン（ＡＮＦ／ＣＤＤ９５−１２６）の使用。