JPS60501861A - インスリン増強ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インスリン増強にプチド 本発明はＤＨＨ８（ＮＴＨ）からの助成金として、政府援助を受けて実施された ものであり、政府は本発明に成る程度の権利を有している。

本発明はインスリンとヒト成長ホルモンの分野て全面的に関係しており、さらに 詳しくは、本発明は顕著なインスリン増強活性を有することがわかっているヒト 成長ホルモン・フラグメントに関する。

発明の背景 インスリンは肝臓及びその他の器官に糖をグリコーゲンとして貯えさせる他、哺 乳動物体内の糖酸化全制御するホルモンである。糖尿病対象では、運動がインス リンの必要量を低下させる。正常対象では、急激な運動が低インスリン血症を招 き、筋肉のグルコース利用率を著しく高める。従って、運動中にインスリンに対 する筋肉感受性が育まることが仮定されている、急激な運動中に、ラジオイムノ アッセイ検出可能な成長ホルモ７（ＧＨ）の血清レベルが数倍に上昇する。Ｇ　 Ｈｆ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　投与するとラットにおけるグルコース利用塞が増強する のでＣインスリン様活性）、ホルモンまたはホルモン・フラグメントがインスリ ンに対する筋肉の感受性の増強に関係してい乙という可能性がある、ヒトＧＨの 早期インスリン様作用の研究中に、分子のアミノ酸残基３２〜４６に相当するフ ラグメントがマウスにおけるグルコース耐性全改良し得ることが観察された（Ｌ 、Ｇ。

Ｆｒｉｇｅｒｉ等、内分泌学会第６４回年金、抄録＃８８）。

発明の概要 ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の５０００ダルトンフラグメントを臨床用成長ホル モン製剤から単離した。このフラグフッ１ｆ分析すると、このフラグメントがｈ ＧＨの残基１〜４３であることがわかった。以下ではｈＧＨと呼ぶこのフラグメ ントけ、次のようなアミノ酸配列順序を有した：　Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−１ １ｅ−Ｐｒ。

−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｍｅｔ −Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−１（ｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅ ｕ−ハ１ａ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌ ｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙ ｓ　−Ｔｙｒ−３ｅｒ。

これと同じように単離された；慎２フラグメントばｈＧ−Ｈ（１７〜４３）であ シ、次のアミノ酸配列を有することが発見された：Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌ ｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ− Ｇｌｎ　−Ｇｌ　ｕ　−Ｐｈｅ−Ｇｌ’ｕ　−Ｇｌ　ｕ　−Ａｌ　ａ、−Ｔ７． ｒｒ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇ−ｘｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−’ｓｅｒ 。

これらのはプチドが顕著なインスリン増強作用を有することが発見されてた。本 発明による薬剤学的組成物はｈＧＨｒｌ〜４３）もしくはｈＧＨ（１７〜４３） フラグメント、才たけ生物学的シて活性な、中間長さのフラグメント、あるいは 薬剤１学的に受容できるキャリヤに分散σせたこれらの非毒性塩を含むものであ る。このようなはプチド捷たばこれらの薬剤学的に受容できる塙を哺乳動物に投 与してインスリン作用全増進することができる、好寸しい態様の詳細な説明 にプチドの定義に用いる命名法（ｒｌ　、　５ｃｈｒｏｅｄｅｒとＬｖ−ｂｋｅ が「Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　Ｊ　（アカデミツク・プレス、１９６５）に述 べている命名法であり、これで・け通常の表現法に従って、左側をＮ末端、右側 をＣ末端と表している。本出願に関してＩｄ、アミノ酸残基が異性体を有してい るときは、アミノ酸はＬ形が表現されることとする。

本発明は次式を有するｈＧＨ（１〜４．３）　：　Ｈ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ −１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈ、ｅ−へ５ｐ−Ａｓ ｎ−ハｌａ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉ ｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌ ｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｐｒｏ−ＬｙＳ−Ｇｌ ｕ−（Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−ＯＨ及び次式ヲ有するｈＧＨ（１７〜 ４３　）　７ラグメント：　１（−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ− Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−４ｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙ　ｒ−Ｇ１ｒｒ７Ｇ１ −＊−Ｐｈｏ−Ｃ：　ｊ　Ｊ−Ｇｌ　ｕ７Ａ１　ａ７Ｔｙｒ−Ｉ　１ｅ−Ｐｒｏ −Ｌｙｓ−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌ　ｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−’５ｅｒ−○Ｈを提供すみ。

これらの−ぐプチド、すなわちｈＧＨ（１〜４３）とｈＧｌ（（１７〜４３）の 間の中間長さの生物学的に活性なフラグメントは列えａ完全固相法、部分的固ｔ ｑ／τｔ、フラグメント縮合法寸たは典型的な溶液添加法のような適当な方法に よって合成することができる。最近開発された、大規模生産にも適用可能と思Ａ つれる組明え体Ｄ’Ｎ　Ａ法によっても、合成はプチドを製造することができる − はプチドのカップリング型什学合成に共通していることは、種々なアミノ酸部分 の不安定な側鎖４を適当な保護基で保ｄ−イすることによって、その部位に化学 反応が起ることを阻市し、ダー後にその基を除去することである。アミノ酸また はフラグメントに存在してカルボキシル基と反応するα−アミン基を保護し、次 にこのα−アミノ保てζ４を選択的に除去してその部位におい４ て次の反応を行わせることも、通常共通している。従って、合成の一段階として 、深プチド鎖の望ましい配列頭片に位置した各アミノ酸残基金倉み、種々のこれ ら残基が側鎖保護基を有する中間化合物が製造されることが共通している。

°次式（汀）の中間体も本発明の範囲に含まれると考えられる：Ｘ１−Ｐｈｅ− Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（Ｘ２）−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−８ｅｔ（Ｘ　）　−Ａｒｇ （Ｘ３）　−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ−Ａｓｐ（Ｘ’）−Ａｓｎ（Ｘ５）−Ａｌａ−Ｍ ｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｘ　）　−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｘ　）−Ａｒｇ（Ｘ　）　 −Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（Ｘ　）−０１ｎ（Ｘ　）−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ （Ｘ　）−Ｔｈｒ（Ｘ　）−Ｔｙｒ（Ｘ　）−Ｇｌｎ（Ｘ　）−Ｇ：１ｕ（Ｘ　 ）”Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（Ｘ　）−Ｇｌｕ（Ｘ’　）−Ａｈａ−Ｔｙｒ　（Ｘ７）− １１ｅ−Ｐｒｏ’−Ｌｙｓ　（Ｘ８）−Ｇｉｎ　（Ｘ”）　−Ｇ１ｎ’ｒＸ　） −Ｌｙｓ（Ｘ　）−Ｔｙｒ（Ｘ　）−３ｅｒ（Ｘ　、）　−ｘｃ式中、Ｎ末端で は、１６個１でのアミノ酸残基が削除されてもよく、Ｘｌは水素またはα−アミ ノ保護基である）。Ｘｌによって表きれるα−アミン保護基は先行技術において ポリにプチドの段階的合成に有用であるとわかっている基である、ｘｌとして用 いられるα−アミン保護基の種類には、次のものがある：　（１）１３’ｌｌえ ばフルオレニルメチルオキ７カルボニル（Ｆ’ＭＯＣ）、ベンジルオキ７カルボ ニル（狗ならびに置換したＺであるｐ−クロロベンジルオキ７カルボニル、ｐ− ニトロベンジルオキシカルボニル、Ｐ−ブロモばンジルオキシ力ルボニル及びｐ −メトキンインジルオキシカルボニルのような、芳香族ウレタン型保護基；（２ ）例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ジイソプ口ピルメトキ７カ ルボニル、イノプロ上０ルオキシ力ルボニル、エトキンカルボニル及びアリルオ キシカルボニルのヨウナ脂肪族ウレタン保護基；及び（３）７クロＲンチルオキ ７カルボニル、アダマンチルオキシカルボニル及びシクロへキンルオキ７カルポ ニルのような、シクロアルキルウレタン型保護基、好ましいα−アミン保護基は ＢＯＣである。

Ｘ２ｋｆ、　Ｔｈｒ　及びＳｅｒのヒドロキシル基の保護基であり、アセチル（ Ａｃ）、ヘンジイル（Ｂｚ）、ｔ−ブチル、トリフェニルメチル（トリチル）、 テトラヒドロピラニル、ベンジルエーテル（ＢＺユ）及び２６−ジクロロにンジ ル（ＤＣＢ）から成る群からＡ択するのが好捷しい、最も好ましい基はＢＺＩで あるーＸ２は水素でもめシ得るが、このことはとｈ゛ｏｏキシル基する保護基が ないことを意味する− Ｘ　けＡｒｇのグアニジノ基の保護基であシ、ニトロ、Ｐ−）ルエンスルホニル （ＴＯ９）、Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル及びＢｏＣから成る群から選択 するのが好ましいが、水素でもあシ得る。Ｔｏｓが号も好ましい保護基である。

ｘ４は水素、またはＡｓｐもしくは０１ｕのβ−もしくはγ−力　。

ルボキシ基に対するエステル形成保護基であり、ベンジル、２．６−ジクロロベ ンジル、メチル、エチル及びｔ−ブチルエステルから成る群から選択するのが好 ましい、○Ｂｚ１が最も好ましい。

ｘ５は水素、またはＡｓｎもしくはＧｌｎのアミド辛に対する保護基であり、キ サンチル（Ｘａｎ）が好ましい。

ｘ６は水素、またはＨｌｓ　のイミダゾールの窒素に対する保護基であり、例え ばＴｏｓまたは２．４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ　）である。

Ｘ　はＴｙｒのフェノール性水酸基に対する保護基であり、例えばベンジル、２ ．６−ジクロロはンジルｒＤＣＢ）、テトラヒト９０ピラニル、ｔ−ブチル、ト リチル、Ｚ及び図１えば４Ｂｒ−Ｚのような置換Ｚである。ＤＣＢが好ましい。

る。適当な側鎖アミノ保護基の例はＺ、２−クロロベンジルオキ７カルボニル（ ２−（Ｊ−Ｚ）、Ｔｏｓ％ｔ−アミルオキシ力ルポニル（Ａｏｃ）、ＢＯＣ及び 前述したような、芳香族または脂肪族ウレタン型保護基である。

Ｍｅｔは酸素によって場合により保護することができるが、保護しないでおくこ とが望塘しい一 側鎖アミン保護基の選択は厳格ではなくてよいが、保護与は合成過程のα−アミ ノ基保護解除中に除去されない基であるべきである。このため、α−アミノ保護 娠と側鎖アミノ保護基は同一の基ではあり得ない。

Ｘ　はＯｆ（、○ＣＨ３、ヒトゝラジド、エステルまたは、次式で表烙れるよう な、固体樹脂支持体に結合させるために固相合成で用いるエステル固定結合であ り得るニ ー０−ＣＨ２−７リスチレン樹脂支持体及び−〇−ＣＨ２−ベンジルーポリスチ レン樹脂支持体、 中間体の式■では、Ｘ、Ｘ、Ｘ、Ｘ、Ｘ、Ｘ、Ｘ、Ｘ　及びＸ　の少なくとも１ つが保護基または固定結合である。この上うに、本発明は次の段階： （α）式ｌのはプチド（式中、Ｘｌ、ｘ２．Ｘ３．ｘ４．Ｘ５．Ｘ６．ｘ７及ヒ Ｘ　かそれぞれ水素、または保護基であり、Ｘ　が保護基または、樹脂支持体に 対する固定結合あるいは○Ｈであり、Ｘ基の少なくとも１つが保、４ｓ−またけ 甲定結合のいずれかである）を先ず最初Ｃで形成する； （５１式（印の前記Ｒプチドから保護基（複数の場合も）または固定結合を解離 する；及び （ｃ）　望ましい場合には、生成するにプチドヲそれの非毒性堵（（転化させる から成る、式（＋ｌの啄ゾチドの製造方法を提供する。

又プチドの合成に用いる背定の側鎖保護基の選択・：す、次のルール知従って行 わすしる： （（Ｚ）　保護基は合成の各段階において、ｎ′−アミノ保護播を除去するため に選択した試薬及び反応条件に対して安定でａするべきである； （ｂ）　保護基は結合条件下でその保護性を維持し、解離されないものでなけれ ばならない；及び （Ｃ）望ましいアミノ酸配列順序がイ４　Ｌっれて、合成が完ｒｈ　Ｌだ場合に 、側鎖保護基はＲプチド鎖を変化させないような反応条件下で除去可能でなけれ ばならない。

組換え体ＤＮＡテクノロジーを用いないで、深プチドを製造する場合には、例え ばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄがＪ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ　、。

８５号、２１４９頁（１９６４年）に述べているような、固相合成法を用いては プチピを製造するのが望ましいが、先行技術で公知の同じような他の化学合成法 を上述の方法と同様に用いることができる。固相合成法１．、□　ＱプチビのＣ 末端から合成を開始シ、Ｇｕｔｌｌｅｍｉｎ　等に１９８２年２月２３日゛で付 与された米国・特許第３．３１６，８９１号に一般的に述べられているように、 適当な樹脂て保護されたα−アミノ酸を結合させる方法である。前記特許の開示 は引用文献としてこの明細書に含まれる。ｈＧＨ（，１〜４３）に対するこのよ うな出発物質は、α−アミンを保護し側鎖ヒドロキシル基全保護したＳｅｒ　ｆ クロルメチル化樹脂に結合させることによって製造することができる。

Ｂｏｃ及びＢｚｌによって保護した５ｅｒｉ、塩化メチレン及びジメチルホルム アミ）”（ＤＭＦ）ｋ用（／′１てクロルメチル化樹脂に結合させる。Ｂｏ　− ８ｅｒ　ｆ樹脂支持体に結合させた後に、塩化メチレンに溶かしたトリフルオロ 酢酸（ＴＦ’Ａ）、ＴＦＡ単独またはジオキサンに溶かしたＨＣｌ　ｆ用いて、 α−アミノ保護基を除去する。塩化メチレンに溶かした５０重量％ＴＦ’Ａを１ ，２−エタンジチオールＯ〜５重量係とともに用いるのが好ましい。保護解除は 約り℃〜室温の温度において実施する。特定のα−アミノ保護基を除去するため のこの他の標準の解離試薬と条件としては、５ｃｈｒｏｄｅｒとＬｕ　ｂｋｅが Ｉ″Ｔｈｅ　ＰｅｐｔｉｄｅＪ　１巻、７２〜７５頁（アカデミツクプレス、１ ９６５年）に述べているような試薬及び条件を用いることができる。

α−アミン保護基ヲ除去した後に、残りのα−アミノ酸と側鎖保護アミノ酸を望 ましい順序で段階的に結合させて、前記で定義したような中間化合物を得る。各 アミノ酸を別々に合成に加える代替法として、アミノ酸を固相反応器に添加する 前に、このようなアミノ酸の幾らかを互い１１ζ結合させることができる。

適当な結合試薬の選択は技術上の単なる置換の範囲内である。

結合試薬として特に適しているのは、Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシル・カルボジイ ミドゝ（ＤＣＣＩ）である。

はプチドの固相合成に用いる活性化試薬ははプチド技術において周知のものであ る。適当な活性化試薬の例は、例えばＮ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド 及びＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドゝのよ うな、カルボジイミド への使用については、ＳｃｈｒｏｄｅｒとＬｕｂｋｅが上記文献の第３章に、ま たＫａｐｏｏｒがＪ．Ｐｈａｒ．Ｓｃｉ　、、　５　９号、１〜２７頁（１９７ ０年）に述べている。

保護された各アミノ酸及び各アミノ酸配列を約４倍の過剰量で固相反応器に導入 し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　：ＣＨ２Ｃ１２（１：１）の媒質中また はＤＭＦ単独もしくはＣＨ２Ｃ１２単独中で結合を実施する。結合を手動操作で 行う場合には、Ｋａｉｓｅｒ等がＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　、３　４号、５ ９５頁（１９７０年）に述べているように、合成の各段階における結合反応の成 否を二ノヒドリン反応によってモニターする。不完全な結合が生じた場合には、 α−アミン保護基を除去する前に結合反応ヲクリ返してから、次のアミノ酸結合 を実施する。この結合反応Ｃ・オ、Ｒｉｖｉｅｒ等がＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　 （　１　９　７　８年）１７号、１９２７〜１９３８頁　に報告しているような プログラムを用いて、Ｂｅｃｋ−ｍａｎ９９０自動合成装置（Ｃおけるように自 動的に実施することもできる。

望ましいアミノ酸配列が完成した後に、例えば液体フッ化水素のような試薬で処 理することによって中間体Ｒプチドヲ樹脂支持体から除去する，このような試薬 はＲプチドヲ樹脂力・ら解０ 離するのみではなく、全ての残留側鎖保護基ｘ，ｘ，ｘ，ｘ。

Ｘ６，Ｘ７及びＸ８ならびにσーアミン保護基ｘｌ解離して、Ｒプチドを形成す る。

次の実施例は固相法による、好ましいｈＧＨ（１−４３）合成方法を述べるもの である。

実施例１ 次式を有するｈＧＨ（１〜４３）：　Ｈ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−工１ｅ−Ｐ ｒｏ−Ｌｅｕ”Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａ．１ａ− Ｍｅｔ　−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ −Ｌｅｕ−Ａｌａ　−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｃ−１ｎ−Ｇｌｕ−、 Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ　−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ −Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ　−ＯＨの合成は、Ｌａｂ　Ｓｙｓｔｅｍｓ 社から入手されるような、約０９ｍｅｑＣｌ　ｆ含有するクロルメチル化樹脂に 基ついて、段階的に行われる。この合成けＢｅｃｋｍａｎ　９　９　０　Ｂ自動 はプチド合成装置にしいて実施する。Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚ（？）　ｆ結合させ ると、樹脂１ｇにつき約０．　３　５　ｍｍｏｌのｓｅｒ　の置換が生ずる。使 用する溶媒は全て例えばヘリウムまたは窒素のような、不活性ガスでスバージン グすることによって、細心に脱ガス化する。用いるプログラムは一般に、Ｒｉｖ ｅｒがＪ　、Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　、　、］−　Ｘ’、３４３ −３６７頁（１９７８年）に報告しているプログラムである。

Ｍｏｎａｈａｎ等がＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　、　］　２２巻１９７３年）２５ １３〜２５１９頁に述べている方法も用いることができる。

保護を解除し中和した後（／Ｃ、樹脂上１ｃ　Ａ？プチド鎖を段階的に構成する 、一般に、樹脂１グラムに付き塩化メチレンに溶かしたＢｏｃ保護アミノ酸１〜 ２ｍｍｏｌの他、塩化メチレンに溶かし１ たＤＣＣＩ　２　ｍａｌの等個物を２時間に用いる。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（’ｆ”ｏ ｓ）を結合する場合には、５０係ＤＭＦ”　と塩化メチレンの混合物を用いる。

Ｂｚ７はＳｅｒ及びＴｈｒに対するヒト′ロキンル側鎖保護基として用いられる 。ＤＣＢはＴ５’ｒのフェノール性ヒトゞロキシル基を保護するために用いられ る．、Ｐ−ニトロフェニルエステル（ＯＮｐ）　ｋ用いて、ＡＳ’ｎのカルボキ シル端部全活性化し、例えばＢｏｃ−Ａｓｎ（ＯＮｐ）　ｆ　Ｄ　Ｍ　Ｆと塩什 メーｆ−ｖン（Ｂ５　０％ｍ合’ｈに溶かしたＨＯＢｔ等価物を用いて、−晩装 置して結合させる。

活性エステル法の代りＫＤＣＣ結合を用いる場合（Ｃは、Ａ　ｓ　ｎまたはＧｌ ｎのアミド基’ｚＸａｎによって保護する、Ｌｙｓ側ｍに対しては保護基として 、２−ＣＩ−Ｚｆ用いる。Ａｒｇのグアニジノ基及びＨｉｓのイミグノールー盾 ヲ保護する（７けＴ６ｓｉ用い、ＧｌｕｉたはＡｓｐの側鎖カルボキシル基はＯ Ｂｚｌによって保護する。合成終了時に次の組成％′ｌ：　ＢＯＣ−Ｐｈｅ−’ Ｐｒｏ−Ｔｈ．ｒ（Ｂ１．）一ＩｌｅーＰｒｏーＬｅｕ−δｅｒ（Ｊ：３ｚｌ） −Ａｒｇ（Ｔ’ｏｓ）−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ａｓｎ（Ｘａｎ ）−Ａｌａ．−ｉｖ＋ｅｔ−Ｌｅｕ−、へｒｇｒＴｏｓ）−Ａｌａ−１−１ｉｓ （Ｔｏｓ）−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｌｅｕ−１（ｉ’ｓ（Ｔｏｓ）−Ｇｌｎ（Ｘａ ．ｎ）−Ｌｅｕ−Ａ］．ａ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｔｈｒ（ｒｊｚｌ） −Ｔ−ｙｒ（ＤＣＢ）−Ｇｌｎ（Ｘａｎ）−Ｇｌｕ’（ＯＢｚｌ）−Ｐｈｅ−Ｇ ］．ｕ（ＯＢｚｌ）−ＧｌｕｒＯＢｚｌ）−Ａｌａ−Ｔｙｒ（ＤＣＢ）−１１ｅ −Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（：２−ＣＩ−Ｚ）−Ｇｌｕ（ＯＢＺＩ）−Ｇｌｎ（Ｘａｎ） −Ｌｙｓ（２−ＣＩ−Ｚ）−Ｔｙｒ（ＤＣＢ）−Ｓ．ｅｒ（Ｂｚｌ）−樹脂支持 体：が得らｎる。α−アミノ保護基のブロック解除に用・ハら−１．１、ＴＦ” Ａ処理によって、Ｘａｎが部分的−１：たは全体的に除ノーをえ）、たと考えら ｎる。

１２ 暑初にＢｏｃがＣＨ２Ｃｌ２　に溶かした５Ｑ’％ＴＦ’Ａによって除去される 。生成する保護Ｒプチド樹脂を解離し保護全解除するために、この生成物をＲプ チド樹脂１ｇにつきアユリール１５ｒｕｌ、硫化メチルエチル０．５　ｍｌ及び フッ化水素（ＨＦ）１５ｍ／によって、最初は一２０℃において２０分間、次に ０℃においてｈ時間処理する。高度な真空下でＨＦＱ除去した後、樹ｑ旨−−＜ ７’チト９残渣を無水ジエチルエーテルとクロロホルムによって交互に洗浄し、 次に深プチドヲ脱ガス化した２Ｎ酢酸水溶液で抽出し、濾過によって樹脂から分 離する。

次に、このＲプチド’に５％酢酸に溶解して５ｅｐｈａａｅｘ　Ｇ−５０フアイ ンによるゲル濾過を含む、−吹精製を行う。次にはプチトＳｌ！ｉｌ＋Ｒ１ｖｅ ｒ等が「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　：　５ｔｒｕｃｔｕｒｑ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉ ｃａｌＦｕｎｃｔｉｏｎ　Ｊ　（１９７９年）１２５〜１２８頁に述べ、Ｍａｒ ｋｉ等がＪ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ　、　、　１．０３巻、３１７８頁（１９ ８１年）に述べているような、調製用または半調製用ＨＰＬＣによってさらに精 製する。クロマトグラフィのフラクション−、）ＨＰＬＣによって細心にモニタ ーし、実際に純粋なフラクションのみをプールする。

アミノ酸の添加全１７位にＡｌａ’ｚ結合させた後終了することによって、全く 同じ方法でｈＧＨ（］、７〜４３）フラグメントｔ−合成する。

天然に生成するヒト成長ホルモン・フラグメントのｈＧＨ（１〜４３）とｈＧＨ （１７〜４３　）は、ＳｉｎｇｔｈとＬｅｗｉｓ（１９８１年）が「ヒト成長ホ ルモンの２０００ダルトン変異体の単離方法」。

１３　特表昭ＧＯ−５０１８６１（５）る方法を用いて、約１０００　下垂体か ら約１２ｍ９のｈＧＨ（，１〜４３）と約５ｍＦのｈＧＨ（１７〜４３）が回収 される程豊富に存在する、不純なｈＧＨ製斉１の一般的な汚染物であることがわ がっている。実際に用いられる抽出方法の詳細は、　Ｓｉｎｇｔｈ等の「ヒト成 長ホムノアノセイによると、１μＦｌ／ｒｕｅで測定した場合に抽出された天然 ＲプチドはＧＨ＝＜含有していない、ＧＨが存在しないことは、下垂体切除ラッ トからの脂肪組織におけるグルコース酸化を刺激するにプチドの能力を測定子る テストにおいて、この天然４プチドが５０μ９　／ｒｕｇまでの濃度において不 活性であることからも実証される。このテストでは、精製ＧＨが０．”２ｎＥＩ ／ｍｌのレベルにおいて活性であることを示す。

次の実施例（で述べる方法によって、マウスの種々の組織におけるグルコース利 用率の増強に関す冬深プチド・テストを行った。

実施例Ｉ マウス１匹につき約８Ｘ１０５ｄｐｍの放射ラベルされたグルコースが投与され るような適当量の（Ｕ、７．　Ｃ）−Ｄ−グルコース（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｒａ ｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　、インジアナ州、アーリント／・ハイド）ヲ含む、 ２７１１７／マウス体重ｇのグルコース負荷を投与する３０分前に、腹腔内に注 入を行？た。混合物を投与した６０分後に、マウスを殺して、肝臓、横隔膜及び 脂肪組織フラグメントラ素早く切り取り、ねじり秤りで秤量した。組織片をビン に装入して、１モルＫＯＨ中で５５℃において２時間消化９４ させた。室温まで冷却した後に、ビンに７ンチレーノヨン液ヲ加えた。翌日、放 射能を測定したが、国際的な標準法を用いて、６０係の平地効率が測定された。

眼窩内穿刺てよって、９盪しい時に血液サンプルを採取した。冷蔵血漿中のグル コース含量モグルコースオキシダーゼ法によって３連で測定した。放射性グルコ ースの血中濃度を２０μｌの血漿を用いて測定した。暫定的単位で表現した、グ ルコース取込み量（Ｇ工）ｋ種々の組織に対して、次式によって算出した： の放射能崩壊ｘ１０００ｋ、血漿１００ｍ１あたりのグルコースｍ！７によって 割った値として定義きれる。統計的有意性は変数の一方向分析及びＤｕｎｃａｎ の多重範囲ｔ−テストによって決定した一ＢＡＬＢ／ｃｓｔ　（ｒ６ｆｃ３Ｈｆ ／Ｎｃｔｒ−Ａ／Ａ）メスとＶ　Ｙ／Ｗｆｆｃ３Ｈｆ／Ｎｃｔｒ−Ａｖｙ／／ａ オスの交配によって、黄色（ＡＶｙ／Ａ）とアグーチ（Ａ／ａ）ヴアージ７（Ｂ ＡＬＢ／ｃｘＶＹ）Ｆ−１雑種メスのマウスを得た。床として松利力／すくずを 敷いた７“×５“×１１“のポリプロピレン・ケージ１個に３匹のマウス全収容 し、Ｗａｙｎｅ　Ｌａｂ　Ｂｌｏｘ（Ａ１１ｉｅａ　Ｍ４１１ｓ社）１０％脂肪 食餌及び水道水を自由に与えた。周囲温度は約２２±１℃であり、１２時間照明 サイクルを維持した、結果は次の表１に示す取込み量に対する影響はかなり小ざ いものであり、この数値によってこの筋肉のグルコース等大利用率を表すことが できる。

表ＩＡはり、ＧＨ（１７〜４３）が肝臓内のグルコース取込みを３５係近く亮め ることを示している。

１６ 別のマウスを用いて更にテストヲ実施し、同様なマウスにおけるグルコース利用 率に対するインスリンの影響音調べた。動物は肥満しており、最大効果が望まし かったので、大量のホルモン（マウス１匹につき５０ミリ単位）？用いた。結果 は表Ｈに示す。この用量において、血清グルコース・レベルは急激（で低下しく グループＢ）、横隔膜と脂肪組織のグルコース取込み量は食塩水処理対照動物（ グループＡ）に比べて、上昇した。

これとは対照的に、肝臓グルコース取込み量は対照レベル以下まで急激に低下し た。グルコースは肝臓にグリコーゲンとして貯えられるので、このデータによる と肝臓からこの代謝産物の消耗が生じたことになる。血清グルコースの低下を避 けるためにグルコース負荷のわずか５分前にインスリンを投与した場合取込み量 は３０分前処理グループ（グループＢ）に見ら力、る値と同じ値にまで上昇した 。従って、ｈＧｋｌ（１〜４３）の１′Ｆ用はグルコース利用率を増強させる能 力においてインスリンと同じであるが、このペプチドは組織には直接作用しない ので、この作用はインスリンによって刺、敬されるグルコース摂取の強化に用い られうると考えられ、しかもｈＧＨ（１〜４３）投与後に血漿グルコースの有意 な低下は見られない。

８ ズ コ つ ９ 肥満マウスによるグルコース利用率に対するインスリン作用のデータ（表■）は 、成長ホルモン・フラグメントのインスリン様活性を理解する場合に役に立つ。

グルコース負荷投辱３０分前にインスリンで処理したマウス肝臓内のグルコース 取込み量が低下することは、器官からグルコースが活発に放出されることを示し ている。この放出（は低血糖及び血清外因性インスリンの急激な増加の両方に反 応したグルカゴン媒介グリコーゲン分解によるものと考えられる。グルカゴンま たは他の解糖作用ホルモンが肝臓のグリコーゲン放出に関係していることｌ＃′ ｌ：、グルカゴ７によって彫型をれない横隔膜及び脂肪組織において、表Ｈのグ ループＢが示すように、取込み量が増加するという事実（でよって示唆される。

血糖低下を避けるためにグルコース負荷のわずか５分前にインスリンを投与した 場合には、肝臓グルコース取込み量の低下は綱琴キれない−しかし、インスリン 投与が横隔膜及び脂肪組織におけるグルコース取込み量を増加させたとしても、 肝臓で・は食塩水処理＠物に比べて取込み量の増加がみられなかった。このこと はインスリン投与後の幾らかのグルカゴン放出がインスリン・ホルモンの作用に 反作用していること全示唆すると思われる。

ｈＧＨペプチドの作用機序はまだ知られていない。インスリンとの相違点を挙げ ると、本Ｒプチドはｉｎ　ｖｉｔｒｏで、脂肪組織内のグルコース酸化を刺激せ ず、しかしｉｎ　ｖｉｖｏで投醇した場合には、Ｕ−Ｃグルコースの利用率を増 強する。このにブチドをインスリンとともに投与した場合（では、ｋプチドの血 糖低下作用の増強が観察され、このことはペプチドがこのホルモンの作用２０ を強化し得ることを示唆している。この結果、ｈＧＨ（１〜４３）はインスリン 欠乏問題全有する哺乳動物、特にヒトの治療に特に有効であると考えられる。正 常以下のインスリン・レベルを有する患者を、体内の天然インスリン自体の作用 を強化するこのような合成Ｒプチドの投与によって助けることができると考えら れる。また他方では、インスリンを全く有さない寸たはインスリンレベルが非常 に低い患者を、通常層下のインスリン用量の使用全当然可能にするような、イン スリンとこのようなはプチビの併用投与によって治療することができる。

このように、ｈＧＨ（１〜４３）捷たはｈＧＨ（１７〜４３）もしくはこれらの 非毒性塩を薬剤学的に受容できるキャリヤと組合わせて薬剤学的組成物を形成し て、ヒＩｆ含めた哺乳動物に静脈内、皮下、筋肉内または経皮的に、例えば鼻腔 内に投与することができる。ｋプチドは少なくとも約９０係純度及び好ましくは 、少なくとも約９８係の純度を有するべきである。しかし、これよりもはるかに 低い純度でもまた、天然に生成するはプチトゞの純度よりも実際に高く、生物学 的反応を行い得ると考えられる。

ここにいう純度とは意図されたペプチドが、実際に存在すると考えられる全ての Ｒプチド及びはプチド・フラグメントの中の一定の重量％に占めることを意味す る。投与は医師が規定すべきであり、用量は治療すべき特定の症状によって変化 する。

このようなペプチドは例えば酸付加塩または、亜鉛、鉄、カルシウム、バリウム 、マグネシウム、アルミニウム等の金属錯塩（この出願の目的のためには、付加 塩と考えられる）のような、薬剤学的に受容できる非毒性塩としてしばしば投与 される。

このような酸付加塩の例は塩酸塩、臭化水素９塩、硫酸塩、リン酸塩、タンニン 酸塩、シュウ酸塩、フマル酔塩、グルコン酸塩、アルギン酸塩、マレイン酸塩、 酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コ・・り酸塩、リンゴ９塩、アスコルビン酸 塩、酒石酸塩等である。

はプチドは医師の指導下で投与するべきであり、薬斉１１学的組成物は通常、薬 剤学的に受容できる慣習的なキャリヤとともににプチドヲ含むことになろう。用 量は患者又は宿主の体重ＬｋｇにつきＲプチド約１μｓ〜約２００μＩの範囲で ある。

この明細書で用いるかぎり、温度は全て℃であり、比は全て容量比である。液体 利料の係も容量係である。

本発明者が今までて知るかぎりで最も良い態様全構成する、本発明の実施態様に 関して本発明を説明したが、当業者に１って明らかであるような、種々な変更及 び改良が明細書に添付さｎた特許請求の範囲に述べりれている本発明の婦囲から 逸脱することなく、実施され得ることは当然理解きれることである。

例えば、Ｒプチド鎖の特定の位置における置換及び修正が実際に力価を減するこ とな〈実施可能であり、このようなズプチドも本発明の範囲に含まれると考えら れる。本出願全実際に構成するにあたって、本出願の目的のために、はプチドが 天然の抽出物中に存在する純度よりも実際て太言い純度で存在すること、及び組 成物がはプチドの効果を減するような、生物学的に活性な物質を含まないことが 重要である。実際に同じ生物学的効果’ｘ　示スｈＧＢ（１〜４３）フラグメン トは、特許請求の範囲に記載はれている化合物の等個物であると考えられる。

本発明の種々の特徴については、特許請求の範囲の中で強調する。

国際調査赳牛

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　次式：　Ｈ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｐｒ６−Ｌｅｕ−８ｅｒ− Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ− Ａｌａ−Ｈｉｓ、−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ −Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ −Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−３ｅｒ −ＯＨ０式中、Ｎ末端から始めて１６−位置のＡｒｇまでの範囲で１つ捷たけそ れ以上の残基を削除することが可能である）を有する合成にプチドまたはそれの 非毒性の頃。 ２　次式：　Ｈ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−３ｅｒ　 −Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｈａ、−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｒ ｇ−Ａｈａ　−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉ、５−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ− Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ− Ａｌａ−Ｔｙｒ−工１ｅ−Ｐｒｏ　−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ −８ｅｒ−ＯＨを有する請求の範囲第１項記載のにプチド又はその塩、３　次式 ：　Ｈ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ　−Ａｌａ −Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ −Ａｌａ−Ｔｙｒ−４１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ −８ｅｔ−ＯＨ を有する請求の範叩第１項記載の深プチド又はその塩。 ４　次式：　Ｈ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ　−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−３ｅｒ −Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ −Ａｈａ　−Ｈｌｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−（ｙｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐ ｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−リ１ｕ−Ａ ｌａ−Ｔｙｒ−工１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−８ ｅｒ−ＯＨＣ式中、Ｎ末端から始めて１６−位置のＡｒｇまでの前回で１つまた はそれ以上の残基を削除することが可能である）を有するにプチドまたはそれの 非毒性塩の有効量と薬剤学的に受容できるキャリヤから成る、哺乳動物における インスリン作用を増強するための薬剤学的組成物。 ５、インスリンの有効量と組合わせる、請求の範囲第４項記載の薬剤学的組成物 。 ６　該深プチドが次式：　Ｈ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−工１ｅ−Ｐｒｏ　−Ｌ ｅｕ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｌ ｅａ　−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｉｓ　−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｌｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ −Ａｈａ−Ｐｈｅ　−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ　−Ｐｈｅ−Ｇ ｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ　−工１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ− Ｌｙｓ−Ｔｙｒ＝Ｓｅｔ−ＯＨ全有する、請求の範囲第４項記載の薬剤学的組成 物。 ７　該投プチトゝが次式：　Ｈ−Ａｌ１−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ　− Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｕｎ−Ｇｌｕ− Ｐｈｅ　−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ７１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ −Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙ　ｒ　−８ｅ　ｒ　−ＯＨ を有する、請求の範囲第４項記載の薬剤１学的組吸物。 ８　次式：　Ｈ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−８ｅｒ　 −Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｅｎ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ −Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ −Ａｓｐ−Ｔｈｒ　−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌ ａ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｅ　−Ｔｙｒ−８ ｅｒ−ＯＨ（式中、Ｎ末端から始めて１６−位置のＡｒｇまでの範囲で１つまた はそれ以上の残蘂ヲ削除することが可能である）全有するペプチドまたはその生 物学的に活性なＮ−末端フラグメント、あるいはその非毒性塩の有効量を哺乳動 物に投与することから成る、哺乳動物における糖の酸化及びグリコーゲンとし、 ての糖の貯蔵全制御する方法。 ９　ペプチドが次式：　Ｈ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ −８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−’Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｌｅ ｕ−Ａｒｇ　−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａ ｌａ−Ｐｈｅ−’、Ａｓｐ　−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌ ｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−ＩＣｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙ ｓ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−ＯＨを有する、請求の範囲第８項記載の方法。 １０、ペプチドが次式：　Ｈ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌ ｎ　−Ｌｅ　ｕ−Ａｌａ　＝Ｐｈｅ　−Ａｓ　ｐ−Ｔｈ　ｒ−Ｔｙｒ　＝Ｇ１’ ｎ−Ｇ１　ｕ−Ｐｈｅ　−Ｇｌｕ　−Ｇｌ　ｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−工１．ｅ　＝ Ｐｒ　ｏ　７Ｌｙｓ　−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌ　ｎ−Ｌｙｓ　−Ｔｙｒ−３ｅｒ　−Ｏ Ｈ を有する、請求の範囲第８項記載の方法。 １１、該投与を静脈内、皮下、経皮的または筋肉内に行う、請求の範囲第８項記 載の方法。 １２゜該投与全体重１ｋ１７につき約１μｓから約２００μｇの頻回のレベルに おいて行う、請求の範囲第１１項記載の方法。 １３、該投１’にインスリン有効量の投与と併用して実施する請求の範囲第１１ 項記載の方法。