DE3706731A1 - Neues cardiodilatinfragment und verfahren zur gewinnung von cardiodilatinfragmenten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Cardiodilatinfragment und Verfahren zur Gewinnung von Cardiodilatinfragmen­ ten aus Körperflüssigkeiten.

Biologisch aktive Peptide wie insbesondere Hormone werden in geringen Mengen in verschiedenen endokrinen Drüsen produziert und werden über das Blut zu den Zielorganen transportiert. Dort regulieren sie eine ganze Reihe von physiologischen und metabolischen Aktivitäten. In der Regel werden inaktive Formen der jeweiligen Peptide in der jeweiligen endokrinen Drüse synthetisiert und durch die Einwirkung von Proteasen in ihre aktive Form umgewandelt. Nur in dieser aktiven Form haben sie die gewünschte Wirkung auf das Zielorgan.

Ein Hormon, das erst in jüngster Zeit entdeckt wurde und das Einfluß hat auf die Ionotropie des Herzmuskels und auf die glatte Gefäßmuskulatur sowie Einflüsse auf die Schweißsekretion aufweist und dem daher große klinische und therapeutische Bedeutung zukommt, ist das Peptidhormon Cardiodilatin. Einige Fragmente dieses Peptidhormons zeigen, zum Teil in abgeschwächter Form, biologische Aktivität. Die einzige bisher bekannte aktive Form des Cardiodilatins, die im Blut zirkuliert, ist das Fragment human-CDD(99-126) mit der folgenden Aminosäuresequenz:
Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp- Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe- Arg-Tyr-OH, die als alpha-ANP, alpha atrial natriuretic polypeptide, bezeichnet wird. Dieses alpha-ANP kann aus Atriumextrakten nur in verschwindend geringen Mengen erhalten werden.

Es war nun Aufgabe der Erfindung, weitere biologisch aktive Fragmente des Cardiodilatins zu finden und weiterhin Verfahren zur Gewinnung von biologisch akti­ ven Cardiodilatinfragmenten zu schaffen, die von einem leicht zugänglichen Ausgangsmaterial ausgehen und zu Produkten führen, die in der im Körper aktiven Form vorliegen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch das Cardiodilatinfrag­ ment human-CDD(95-126) mit der Peptidsequenz:
Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe- Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly- Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß das Fragment human-CDD-(95-126) eine biologisch aktive Form des Cardiodilatins ist, das nicht nur eine abgeschwächte Aktivität aufweist, sondern die volle Aktivität be­ sitzt.

Dieses neue Cardiodilatinfragment human-CDD(95-126) kann synthetisch in an sich bekannter Weise z. B. durch Merrifield-Synthese mit BOC-Aminosäuren hergestellt werden. Ebenso ist die Herstellung durch klassische Fragmentsynthese in Lösung möglich.

Eine weitere Möglichkeit besteht darin, alpha-ANP direkt mit dem N-terminal verlängernden Tetrapeptid Thr-Ala-Pro-Arg-OH umzusetzen. Da das Peptid alpha-ANP keine Seitengruppe mit freien Aminofunktionen enthält, ist diese Synthese relativ problemlos durchzuführen. Das Tetrapeptid wird in an sich bekannter Weise vorher synthetisiert.

Da diese Syntheseverfahren noch relativ aufwendig sind, war es wünschenswert, ein Verfahren zur Gewinnung der aktiven Cardiodilatinfragmente zu schaffen, bei dem ein leicht zugängliches Ausgangsmaterial verwendet werden kann. Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß in Humanurin das Cardiodilatin-aktive Peptid human-CDD(95-126) enthalten ist. Weiterhin wurde überraschenderweise festgestellt, daß in Hämodialysat und Hämofiltrat bio­ logisch aktive Peptide, insbesondere Hormone wie z. B. alpha-ANP, in ihrer aktiven Form enthalten sind und aus dieser Lösung gewonnen werden können.

Hämofiltration und Hämodialyse sind Verfahren, in denen aus dem Blut über eine natürliche oder künstliche Membran Stoffwechselprodukte, Wasser und Ionen entfernt werden. Diese Verfahren werden insbesondere bei Niereninsuffizienz, Intoxikationen und Hyperhydratation durchgeführt. Über­ raschenderweise wurde nun festgestellt, daß in Hämodialy­ sat und Hämofiltrat alpha-ANP in die Aufarbeitung lohnender Menge enthalten ist und aus dieser Lösung gewonnen werden kann.

Die Hämodialyse bzw. Hämofiltration ist inzwischen ein sehr weit verbreitetes Verfahren, insbesondere für Patienten, die unter Niereninsuffizienz leiden und oft mehrmals wöchentlich an ein entsprechendes Gerät ange­ schlossen werden müssen. Die dabei anfallende Lösung, die die vom Körper nicht ausgeschiedenen Stoffe enthält, fällt in großen Mengen an und ist daher leicht zugänglich.

Überraschenderweise konnte gefunden werden, daß im Urin eine bisher unbekannte aktive Form des Cardiodilatins - human-CDD(95-126) - enthalten ist und in die Aufarbeitung lohnenden Mengen vorliegt. Weiterhin konnte überraschen­ derweise festgestellt werden, daß biologisch aktive Cardiodilatinfragmente, die ein Molekulargewicht von weniger als 20 kg/Dalton, bei der Hämodialyse bzw. Hämofiltration in das Dialysat bzw. Filtrat übergehen und dort in die Aufarbeitung lohnenden Mengen vorliegen. Dies war überraschend, da man bisher annahm, daß nur niedermolekulare Substanzen bei dieser Blutbehandlung ausgeschieden werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktiven Cardio­ dilatinfragmenten aus Körperflüssigkeiten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Urin, Hämodialysat oder Hämofiltrat als Ausgangsmaterial verwendet, dieser Lösung Alginsäure zusetzt, die an der Alginsäure adsor­ bierten Cardiodilatinfragmente eluiert und das Eluat nach üblichen biochemischen Reinigungsmethoden frak­ tioniert und die aktive Fraktion durch übliche Methoden zum Nachweis der biologischen Aktivität bestimmt.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Urin oder Hämodialysat bzw. Hämofiltrat gegebenenfalls nach Ansäuerung zuerst mit Alginsäure in Kontakt gebracht. An der Alginsäure werden die Cardiodilatinfragmente adsorbiert.

Anschließend wird die mit den Cardiodilatinfragmenten beladene Alginsäure eluiert. Zur Elution eignen sich insbesondere verdünnte Carbon- und Mineralsäuren. Bevorzugt verwendet man Salzsäure einer Konzentration von 0,1 bis 0,3 M.

Das Eluat wird dann mit üblichen biochemischen Reinigungs­ methoden fraktioniert. Bevorzugt wird dabei zuerst eine Salzfällung, bevorzugt mit Natriumchlorid, durchgeführt. Der dabei gebildete Niederschlag wird dann direkt ent­ salzt und gereinigt an einer Gelchromatographiesäule. Bevorzugt wird dazu Sephadex-G-25 verwendet.

Die das gewünschte biologisch aktive Cardiodilatinfrag­ ment enthaltenden Fraktionen, die durch übliche Methoden zum Nachweis der biologischen Aktivität bestimmt werden, werden gesammelt und anschließend weiter aufgereinigt. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsge­ mäßen Verfahrens werden sie dazu zuerst über eine Ionenaustauschersäule chromatographiert. Besonders bevorzugt werden die Fraktionen vor der Ionenaustausch­ chromatographie lyophilisiert.

Die Elution von der Ionenaustauschersäule erfolgt mit einem Gradienten. In der Regel sind die biologisch aktiven Cardiodilatinfragmente in den Fraktionen, die mit der höchsten Ionenstärke eluiert werden, zu finden. Diese Fraktionen werden dann einer Hochdruckflüssig- Chromatographie an einem Umkehrphasen-Kieselgel unter­ worfen. Besonders bevorzugt werden die Fraktionen auch vor der HPLC lyophilisiert. Als Elutionsmittel für die HPLC wird ein geeignetes Lösungsmittel bzw. Lösungsmittel­ system verwendet. Als besonders geeignet hat sich ein Gemisch aus Wasser, Acetonitril und HCl mit einem kontinuierlichen Gradienten erwiesen.

Um das gewünschte biologisch aktive Cardiodilatinfrag­ ment noch weiter aufzureinigen, kann die Fraktion, die das biologisch aktive Material enthält, ein zweites Mal über HPLC an einem Umkehrphasen-Kieselgel aufgetrennt werden. Bei diesem zweiten Chromatographieschritt wird bevorzugt als Elutionsmittel ein Gemisch aus Wasser, Methanol und Trifluoressigsäure mit einem kontinuier­ lichen Gradienten verwendet. Auf diese Weise erhält man ein sehr reines Material.

Um bei den chromatographischen Auftrennungen jeweils die Fraktionen, die das gewünschte biologisch aktive Cardiodilatinfragment enthalten, zu bestimmen, werden an sich bekannte Nachweismethoden für die biologische Aktivität angewendet. Geeignet ist beispielsweise zum Nachweis von CCD(95-126) bzw. alpha-ANP der Nachweis der relaxierenden Wirkung auf glatte Muskulatur. Dazu wird bevorzugt Arteria renalis vom Kaninchen, Aorta abdominalis von Kaninchen oder Ratte oder Arteria mesenterica inferior vom Kaninchen im Organbad benutzt, wobei die nach Adrenalinvorbehandlung kontrahierten Gefäßmuskelstreifen nach Zugabe des aktiven Cardiodi­ latinfragments eine deutliche Relaxation zeigen. Am deutlichsten ist diese Relaxation bei Muskelstreifen aus Arteria renalis, wo die Relaxation schon bei Dosen von ca. 10 bis 100 ng pro 10 ml im Organbad nachweisbar ist.

Die Erfindung wird noch durch die folgenden Figuren und Beispiele erläutert.

Fig. 1 zeigt das Chromatogramm eines auf einer 50 mm i. D. × 850 mm Sephadex G 25 Fine-Säule in 0,2 M Essigsäure aufgetrennten Peptidmaterials. Die schraffierte Fläche zeigt das eluierte bioaktive Material.

Fig. 2 zeigt das Chromatogramm eines auf einer Sephadex G25-Säule aus TSK-CM-50S (50 mm i. D. × 850 mm) aufgetrennten bioaktiven Materials. Die Sternchen zeigen den schrittweisen An­ stieg der Molarität der Ammoniumbicarbonat­ konzentration (0,01 M, 0,08 M, 0,2 M, 0,5 M). Die Elution wurde in 16 ml Fraktionen durch­ geführt. Die Cardiodilatin-Bioaktivität wurde in den Fraktionen 71 bis 91 gefunden.

Fig. 3 zeigt das Chromatogramm einer HPLC von 1 mg human-CDD-bioaktivem Material aus der Kationen­ austauschchromatographie. Als Säule wurde 7,8 mm i. D. × 300 mm (TSK-ODS-120 T) verwen­ det. Durchflußrate: 1,5 ml/min; Lösungsmittel A: 0,01 N HCl; Lösungsmittel B: 80% CH-CN in 0,01 N HCl. Das CDD-aktive Material wurde durch 14% CH-CN/0,01 N HCl eluiert, wo die stärkste Vasorelaxation beobachtet wurde. Die Fraktionen in dem schraffierten Bereich wurden für die weitere Reinigung gesammelt.

Fig. 4 zeigt ein Reversephase-HPLC-Chromatogramm. Die Frakionen mit der stärksten Vasorelaxation wurden zur letzten Aufreinigung an einer ana­ lytischen TSK-ODS-120T (4,8 mm i. D. × 250 mm) Säule chromatographiert. Durchflußrate: 0,5 ml/min; Lösungsmittel A: 0,1% TFA in 40% Methanol; Lösungsmitel B: 0,1% TFA in Methanol. Es wurden fünf Fraktionen gesammelt.

Fig. 5 zeigt die Kontrolle der Vaso-relaxierenden Aktivität der in der HPLC erhaltenen Frak­ tionen, die in dem Chromatogramm von Fig. 4 gezeigt sind. Ein Aliquot von 0,1 µl jeder HPLC-Fraktion wurde in ein Medium gegeben, das mit Norepinephrin vorkontraktierte Kaninchen Aortamuskelstreifen enthielt. Fraktion 3, die für die Sequenzanalyse ver­ wendet wurde, enthielt 200 µl Eluat. Der Biotest zeigt, daß mehr als 2 µg alpha-ANP (human CDD(99-126)) in diesem Durchlauf erhalten wurden.

Fig. 6 zeigt ein HPLC-Chromatogramm von human-CDD (95-126). Elutionsmittel ist Methanol.
Rf-Werte: 25 Minuten
Bedingungen:
Säule: TSK-ODS-120T, 250 × 4,8 mm
Laufmittel A: 40% Methanol in Wasser (0,1% Trifluoressigsäure)
Laufmittel B: 100% Methanol (0,1% Trifluor­ essigsäure)
Gradient: 10 Minuten isokratisch A, dann 30 Minuten Zudosierung von B bis 100% B ansteigend.
Fluß: 0,5 ml/min. 20°C; Papiervorschub 5 mm/min; Abs. ber. 0,08, UV 254 nm.

Fig. 7 zeigt ein HPLC-Chromatogramm von human-CDD (99-126) mit Methanol als Elutionsmittel zum Vergleich. Rf-Werte: 35 Minuten. Die Bedingun­ gen waren dieselben wie bei Fig. 6.

Fig. 8 zeigt ein Diagramm, in dem die biologische Aktivität von CDD(95-126) wiedergegeben ist. Getestet wurden die Fraktionen 1 bis 4 der HPLC, die in Fig. 6 dargestellt ist, im Relaxationsassay mit Aorta-Muskelstreifen. Dosiert wurden je 1 µl der HPLC-Fraktionen pro 10 ml Organbad (1 µl entspricht ca. 3 µg human-CDD(95-126).

Fig. 9 zeigt ein Diagramm, in dem die biologische Aktivität der Fraktion II wie in Fig. 8 dargestellt ist.

Beispiel 1

Menschliches Hämofiltrat von Patienten, die an Nieren­ insuffizienz leiden, wurde verwendet. Das Hämofiltrat wurde sofort angesäuert mit Eisessig auf eine Endkon­ zentration von 0,2 M. Chargen von jeweils 200 bis 400 l wurden dann auf einen pH von 2,7 eingestellt mit kon­ zentrierter Salzsäure. Zu der ersten Charge wurden 2,5 kg Alginsäure zugegeben und es wurde 8 bis 12 Stun­ den gerührt. Dann setzte sich die Alginsäure ab und der Überstand wurde durch eine neue Charge von angesäuertem Hämofiltrat ersetzt. Dieses Verfahren wurde so lange wiederholt, bis mehr als 1000 l Hämofiltrat mit den 2,5 kg Alginsäure umgesetzt worden waren. Die Alginsäure wurde dann sedimentiert und von dem Hämofiltrat abge­ trennt und mit Ethanol und 0,005 M Salzsäure in einem Büchner-Trichter gewaschen. Die Polypeptide wurden dann mit 0,2 M Salzsäure eluiert. Der pH des Eluates wurde auf 4,0 eingestellt und Natriumchlorid wurde bis zur Sättigung zugegeben. Nach 24 Stunden bei 4°C wurde ein Salzkuchen, der sich auf der salzgesättigten Lösung gebildet hatte, abgenommen. Dieses Verfahren wurde über ein Radio-Immuno-Assay für Cardiodilatin verfolgt, wobei sich zeigte, daß mehr als 90% der nachweisbaren Substanz erhalen worden waren. Der Salzkuchen wurde dann auf eine Sephadex G-25 Säule aufgegeben und die Peptide, die erhalten wurden, wurden durch ein Bioassay für Cardiodilatin unter Verwendung von Aorta Muskel­ streifen getestet. Die Fraktionen, die die meiste Cardiodilatin-Bioaktivität enthielten, wurden dann lyo­ philisiert und auf einer Ionenaustauschsäule chromato­ graphiert. Die Verteilung der Bioaktivität ist in Fig. 1 dargestellt. Das bioaktive, vasorelaxierende Material wurde in den Fraktionen gefunden, die bei der höchsten Ionenstärke mit schrittweisem Gradienten eluierten, wie es aus Fig. 2 zu entnehmen ist. Diese Fraktionen wurden wieder lyophilisiert und zweimal einer HPLC unterworden. Bei der ersten HPLC wurde eine Reverse-Phase-Säule TSK-ODS-120T verwendet. Als Eluierungsmittel wurde Wasser-Acetonitril-HCl mit einem kontinuierlichen Gradienten eingesetzt, wie es in Fig. 3 dargestellt ist. Das bioaktive Material erscheint dort, wo zum Vergleich eingesetztes synthetisches alpha-ANP eluiert. Die bioaktiven Fraktionen wurden auf eine analytische Reverse-Phase-Säule desselben Typs ge­ geben, wobei Wasser-Methanol-Trifluoressigsäure mit einem kontinuierlichen Gradienten, wie er in Fig. 4 dargestellt ist, eluiert wurde. Das bioaktive Material wurde wiederum in derselben Fraktion gefunden, in der zum Vergleich eingesetztes synthetisches alpha-ANP eluiert. Die Analyse der Aminosäuresequenz, des An­ teils der einzelnen Aminosäuren und der C-terminalen Aminosäure durch Carboxypeptidase-A-Spaltung dieses hochgereinigten Materials ergab, daß es sich um alpha- ANP handelte.

Aminosäureanalyse

Das hochgereinigte Polypeptid wurde in 6 M HCl, 1,0% Phenol bei 110°C 24 Stunden lang in evakuierten Röhr­ chen hydrolysiert. Die Gesamtzusammensetzung wurde in einem Waters-Aminosäure-Analysesystem bestimmt, wobei vorher mit Phenylisothiocyanat und Biocyanat derivati­ siert wurde. Die Analyse zeigte einen hohen Grad an Übereinstimmung zwischen der Primärstruktur, die durch Sequenzanalyse erhalten wurde und der Gesamtzusammen­ setzung, insbesondere für die Werte von Tyr 0,9 (1); Met 0,99 (1); Cys 2,1 (2); Ile 1,1 (1); Leu 2,1 (2).

Sequenzanalyse

Es wurde ein schrittweiser Edman-Abbau des intakten Peptids durchgeführt in einem Gasphasen-Protein-Se­ quenzer 420 A der Firma Applied Biosystems. Die PTH- Aminosäuren wurden durch high performance liquid chromatography gemäß Lottspeich (High Performance Liquid Chromatography in Protein and Peptide Chemistry, Seiten 259-268, Lottspeich F, Henschen A, Hupe K. P., Walter Dekrüter: Berlin/New York, 1981). Das hochge­ reinigte Polypeptid hatte die folgende Aminosäurese­ quenz: Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg- Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn- Ser-Phe-Arg-Tyr-OH.

Endgruppenanalyse

Die C-terminale Aminosäure wurde durch Spaltung des Polypeptids mit Carboxypeptidase A bestimmt und analy­ siert in dem oben beschriebenen Waters-Aminosäure-Ana­ lysesystem. Nach 30minütiger Inkubation bei Raumtempe­ ratur wurde ein Protein zu Enzym im Verhältnis von 50 : 1 und ein Peak für Tyrosin sowie ein zweiter Peak für Arginin nach 60 Minuten Inkubation erhalten.

Beispiel 2

Es wurde wie im Beispiel 1 beschrieben, verfahren. Dabei wurde jedoch statt Hämofiltrat Urin von gesunden Menschen verwendet. Die Vorgehensweise und die Rea­ genzien waren dieselben wie im Beispiel 1. Für die Durchführung der HPLC wurde jedoch als Vergleichsmate­ rial synthetisches CDD(95-126) eingesetzt. Es wurde bioaktives Material in derselben Fraktion gefunden, in der zum Vergleich eingesetzes synthetisches CDD(95-126) eluierte. Die Analyse der Aminosäuresequenz, des Anteils der einzelnen Aminosäuren und der C-terminalen Aminosäure durch Carboxypeptidase-A-Spaltung dieses hochgereinigten Materials ergab, daß es sich um CDD(95-126) handelte.

Claims (6)

1. Cardiodilatinfragment human-CD-(95-126) mit der Aminosäuresequenz:
Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe- Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly- Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH.

2. Verfahren zur Gewinnung von Cardiodilatinfragmen­ ten aus Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß man Urin, Hämodialysat oder Hämofiltrat als Ausgangsmaterial verwendet, dieser Lösung Alginsäure zusetzt, die an der Alginsäure adsorbierten Peptide eluiert und das Eluat nach üblichen biochemischen Reinigungs­ methoden fraktioniert und die aktive Fraktion durch übliche Methoden zum Nachweis der biologi­ schen Aktivität bestimmt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die an der Alginsäure adsorbierten Cardiodilatinfragmente eluiert, das Eluat einer Salzfällung unterwirft, den Niederschlag mittels Gelchromatographie ent­ salzt, den erhaltenen Rohextrakt einer Ionenaus­ tausch-Chromatographie unterwirft und anschließend über HPLC auftrennt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Auftrennung über HPLC an einem Umkehrphasen-Kie­ selgel durchführt.

5. Verfahren zur Gewinnung von alpha-ANP, dadurch gekennzeichnet, daß man Hämodialysat oder Hämofiltrat mit Algin­ säure in Kontakt bringt, das an der Alginsäure adsorbierte alpha-ANP eluiert und das Eluat nach üblichen biochemischen Reinigungsmethoden frak­ tioniert unter Anwendung eines Tests, bei dem die Fraktion, die alpha-ANP enthält, durch die rela­ xierende Wirkung auf die glatte Muskulatur bestimmt wird.

6. Verfahren zur Gewinnung von human-CDD(95-126), dadurch gekennzeichnet, daß man Urin mit Alginsäure in Kontakt bringt, das an der Alginsäure adsorbierte human-CDD(95-126) eluiert und das Eluat nach üblichen biochemischen Reinigungsmethoden fraktioniert unter Anwendung eines Tests, bei dem die Fraktion, die human-CDD (95-126) enthält, durch die relaxierende Wirkung auf die glatte Muskulatur bestimmt wird.