CN109721653A - 一种胰高血糖素样肽-1片段类似物及其应用 - Google Patents
一种胰高血糖素样肽-1片段类似物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有减肥降糖活性的胰高血糖素样肽‑1片段类似物，或其药学上可接受的盐，其序列为以下通式(I)所示。本发明采用微波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略高效快速地合成得到上述目标化合物。制备得到的GLP‑1片段类似物，结构全新，适合作为治疗糖尿病和肥胖药物的活性成分。利用本发明提供的微波促进固相合成技术制备的GLP‑1片段类似物，收率高、合成周期短、粗品纯化容易，生产成本低、易于工业自动化生产。Phe‑Ile‑Ala‑Trp‑Leu‑Val‑Lys‑Gly‑Arg‑X1‑X2(I)。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有减肥降糖活性的胰高血糖素样肽-1片段类似物及其合成方法和应用，属于胰高血糖素样肽-1片段类似物技术领域。
背景技术
随着生活水平的提高，超重和肥胖在全球范围内呈高发趋势，已成为全球死亡的第五大风险因素，每年至少有280万成年人因此而死亡。尽管中国成人肥胖率较低，但是绝对肥胖人数已跃居世界首位。过度肥胖可导致2型糖尿病，心血管疾病和血脂异常等多种并发症，其中，肥胖症合并糖尿病，即“肥胖2型糖尿病”正逐步流行。
目前临床上用于降低肥胖2型糖尿病患者体重的药物包括氯卡色林、芬特明/托吡酯等，然而大部分减肥药物存在不良反应多和价格昂贵等问题。此外，用于控制肥胖2型糖尿病患者血糖稳态的大多数经典降血糖药物都有增重作用并且存在低血糖风险。因此，开发安全有效且具有减肥降糖双重作用的新型药物已成为目前人类健康所关注的重要课题。
近年来，以胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)为代表的胃肠激素多肽类药物在糖尿病治疗领域受到广泛关注。GLP-1最明显直观的生理效应就是在高血糖环境下，促进胰岛素的释放，抑制胰高血糖素的生成，从而降低血糖，该作用具有葡萄糖依赖性，可避免低血糖的发生。此外，GLP-1还可提高中枢神经系统对饱腹感的感应，从而减少患者的摄食量；增加骨骼肌和肝脏对葡萄糖的摄取，生成糖原储存能量，从而加快葡萄糖的利用；增加脂肪细胞对葡萄糖的作用，加快脂肪分解；可通过促进细胞再生并抑制细胞凋亡来增加β细胞数量，这使其成为治疗肥胖2型糖尿病的新途径。
但是，天然的GLP-1具有明显缺陷：(1)在体内易被血浆蛋白酶生物降解并且经肾脏快速滤过代谢，生物半衰期极短，仅为1～2min，临床应用受限。(2)GLP-1肽链较长，合成难度大，产物纯度低。考虑到GLP-1半衰期较短且分泌部位局限，其多种生物活性可能归因于下游代谢产物。因此，若能根据GLP-1代谢酶的酶切位点，合成并筛寻短链GLP-1活性代谢片段，接着进一步设计合成具有减肥降糖双重作用的新型GLP-1片段类似物，有可能对肥胖2型糖尿病的治疗具有十分重要的意义。
发明内容
发明目的：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种具有减肥降糖活性的胰高血糖素样肽-1片段类似物及其合成方法和应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种具有减肥降糖活性的胰高血糖素样肽-1片段类似物，或其药学上可接受的盐，其序列为以下通式(I)所示：
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-X1-X2
(I)
其中，X2为NH2或COOH，X1为以下序列中的一种或不存在：
Lys-Lys-Lys；
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys；
Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Ser；
Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala；
Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser；
Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys；
Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln。
作为优选，所述胰高血糖素样肽-1片段类似物或其药学上可接受的盐选自：
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2；(SEQ.ID NO.1)
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-COOH；(SEQ.ID NO.2)
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-Lys-Lys-NH2；(SEQ.ID NO.3)
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2；(SEQ.ID NO.4)
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-NH2；(SEQ.ID NO.5)
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-NH2；(SEQ.ID NO.6)
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2；(SEQ.ID NO.7)
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2；(SEQ.ID NO.8)
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln-NH2；(SEQ.ID NO.9)。
本发明采用微波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略高效快速地合成得到上述目标化合物。
所述的具有减肥降糖活性的胰高血糖素样肽-1片段类似物的合成方法，包括以下步骤：
首先溶胀树脂，然后利用微波条件促进Fmoc保护基的脱除以及促进Fmoc保护的碳端初始氨基酸MBHAResin的合成，而后进行肽链的延长，最后将树脂上多肽进行裂解，纯化，即得。
优选的，包括以下步骤：
(1)树脂的溶胀：
取Fmoc-Rink amide-MBHA Resin，经DCM溶胀；
(2)微波促进Fmoc保护基的脱除：
将溶胀好的树脂，用含HOBT的哌啶/NMP溶液，在微波条件下反应，反应结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净，得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂；
(3)微波促进Fmoc保护的碳端初始氨基酸MBHAResin的合成：
将Fmoc保护的碳端初始氨基酸，HBTU，HOBT和DIPEA溶于NMP中，再将此溶液加入上面的树脂中，在微波条件下反应，反应结束后滤除反应液，用DCM和NMP洗涤树脂；
(4)偶合效率的检测：
定性检测树脂的偶合效率，显色反应为阴性即可进入下一个偶合循环；
(5)肽链的延长：
按照肽链的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸，偶合，然后继续重复脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸直至肽链合成完毕，得到连有化合物的树脂。
(6)树脂上多肽的裂解
将上述得到的连有化合物的树脂，利用裂解剂裂解，冷冻离心得到目标多肽的粗品；
(7)多肽的纯化：
将所得多肽的粗品，采用制备液相色谱进行纯化，即得。
一种药物组合物，包含治疗有效量的至少一种所述的胰高血糖素样肽-1片段类似物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体和/或辅料。
所述的胰高血糖素样肽-1片段类似物或其药学上可接受的盐、所述的药物组合物在制备治疗肥胖药物中的应用。
所述的胰高血糖素样肽-1片段类似物或其药学上可接受的盐、所述的药物组合物在制备治疗糖尿病药物中的应用。
本发明所述药学上可接受的辅料，是指制备不同剂型时加入所需的各种常规辅料，例如稀释剂、黏合剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、矫味剂、包合材料、吸附材料等以常规的制剂方法制备成任何一种常用的制剂，例如可以是颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液、汤剂、滴丸剂、注射剂等。
本发明所述药学上可接受的载体，是指能够与药物进行化学或非化学形式结合的载体，其能够起到转运药物、增加药物稳定性、增加药物溶解性、利于制剂或者利于基体吸收等作用，如有机高分子载体等等。
本发明提供的上述化合物肽链结构短，可大大降低应用成本，部分化合物具有较好的减肥降糖效果。另外，本发明提供的上述化合物或化合物作为有效成分制备的药物组合物用于治疗肥胖型糖尿病时，具有胃肠道给药的潜力，而且可避免药剂学手段长效化产品易产生的注射部位出现局部瘙痒等不良反应。
技术效果：与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
(1)提出的一种GLP-1片段类似物，在具有一定降糖活性的基础上，还呈现减肥降糖活性。
(2)微波促进固相合成的GLP-1片段类似物大大的提高了偶合反应速率，常规固相合成方法充分偶合一个氨基酸到树脂上去，往往需要2小时到20小时不等，甚至更长。而微波促进则平均只需要10分钟左右；常规固相合成方法脱Fmoc保护基，往往需要30分钟到1小时不等，而微波促进则平均只需要5分钟左右，这极大的提高了多肽合成的效率，缩短了合成周期。此外，合成GLP-1片段类似物的粗品纯度大于80％，较常规固相合成方法大大提高，这方便了后续的纯化工作。微波促进固相合成GLP-1片段类似物的方法易于实现自动化、大规模化，这使其更适合工业化生产。
因此，用本发明提供的微波促进固相合成技术制备的GLP-1片段类似物，收率高、合成周期短、粗品纯化容易，生产成本低、易于工业自动化生产。制备得到的GLP-1片段类似物，结构全新，适合作为治疗糖尿病和肥胖药物的活性成分。
附图说明
图1显示的是GLP-1在正常小鼠上的急性降糖活性曲线图(A)和曲线下面积柱形图(B)；
图2显示的是GLP-1在糖尿病小鼠上的长期血糖控制效果柱形图；
图3显示的是GLP-1在肥胖小鼠上的长期体重控制效果柱形图；
具体实施方式
下面结合具体实例，进一步阐明本发明。
在本说明书全文中采用以下缩写：
Et3N：三乙胺；NMM：N-甲基吗啉；DIEA：N，N'-二异丙基乙胺；DMF：二甲基甲酰胺；DMSO：二甲亚砜；DCM：二氯甲烷；Fmoc：N-9-芴甲氧羰基；DIC：N，N’-二异丙基碳二亚胺；CDI：N，N’-羰基二咪唑；DMAP：4-二甲氨基吡啶；HOSU：N-羟基琥珀酰亚胺；EDC.HCl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯；HBTU：苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯；HCTU：6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯；HOAT：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；HOBT：1-羟基-苯并三氮唑；PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷；HPLC：高效液相色谱；ESI-MS：电喷雾质谱；Gly：甘氨酸；Ser：丝氨酸；Ala：丙氨酸；Thr：苏氨酸；Val：缬氨酸；Ile：异亮氨酸；Leu：亮氨酸；Tyr：酪氨酸；Phe：苯丙氨酸；His：组氨酸；Pro：脯氨酸；Asp：天门冬氨酸；Met：蛋氨酸；Glu：谷氨酸；Trp：色氨酸；Lys：赖氨酸；Arg：精氨酸。Asn：天冬酰胺；Gln：谷氨酰胺。
实施例1
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2；(SEQ.ID NO.1)的微波促进固相合成
(1)树脂的溶胀
称取Fmoc-Rink amide-MBHAResin 50mg(取代量0.4mmol/g)，经7mL DCM溶胀30min，抽滤去DCM，再用10mL NMP溶胀30min，最后分别用NMP，DCM，NMP 7mL冲洗干净。
(2)微波促进Fmoc保护基的脱除
将溶胀好的树脂放入反应器中，加入7mL含0.1M HOBT的25％哌啶/NMP(V/V)溶液，在微波反应器中反应1min，微波功率为15W，反应温度控制在50℃以内，使用空气压缩机压缩空气冷却，反应结束后滤去溶液；再加入7mL含0.1M HOBT的25％哌啶/NMP(V/V)溶液在微波反应器中再反应4min，微波功率为25W，反应温度控制在50℃，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净。得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂。
(3)微波促进Fmoc-Arg(Pbf)-Rink amide-MBHA Resin的合成
将Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.04mmol)，HBTU(0.04mmol)，HOBT(0.04mmol)和DIPEA(0.08mmol)溶于10mL NMP中，再将此溶液加入上面的树脂中，在微波反应器中反应7min，微波功率为25W，反应温度控制在50℃，使用空气压缩机压缩空气冷却。反应结束后滤除反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。
(4)偶合效率的检测
用茚三酮法或者溴酚兰法定性检测树脂的偶合效率，显色反应为阴性即可进入下一个偶合循环。
茚三酮法：取少量树脂颗粒用乙醇洗涤，放入透明小瓶中加入5％茚三酮乙醇、KCN吡啶溶液(2ml 0.001M KCN稀释于98ml吡啶中)、80％苯酚乙醇溶液各2滴，于100℃加热5分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。
溴酚兰法：取少量树脂颗粒用二甲酰乙酰胺洗涤，放入透明小瓶中加入3滴1％的溴酚蓝二甲基乙酰胺溶液，常温下振摇3分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。
(5)肽链的延长
按照肽链的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸，偶合45min，然后继续重复脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸直至肽链合成完毕，得到连有化合物的树脂。
(6)树脂上多肽的裂解
将上述得到的连有化合物的树脂放入反应瓶中，各加入裂解剂Reagent K(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5:5:5:5:2.5，V/V)10mL，先在0℃下振摇30min，再在常温下反应3h。反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤三次，合并滤液。将滤液加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品。最终得到化合物的粗品，收率为94.3％。
(7)多肽的纯化
将粗品多肽溶于50％的乙腈/水中，使用制备液相色谱纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 20％～80％，20min；流速为6mL/min检测波长为214nm。收集的溶液冻干得纯品30mg。理论相对分子质量为1088.3。ESI-MS m/z:found[M+H]+1088.8；calu[M+H]+1089.3。
根据实施例1所述的方法，根据相应的序列合成得到实施例2～9的GLP-1片段类似物，通过电喷雾质谱(ESI-MS)确证各自的分子量。
实施例2
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-COOH；(SEQ.ID NO.2)
理论相对分子质量为1088.3。ESI-MS m/z:found[M+2H]2+545.6；calu[M+2H]2+545.1。
实施例3
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-Lys-Lys-NH2；(SEQ.ID NO.3)
理论相对分子质量为1473.9。ESI-MS m/z:found[M+2H]2+737.9，[M+3H]3+492.2；calu[M+2H]2+737.9，[M+3H]3+492.3。
实施例4
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2；(SEQ.ID NO.4)
理论相对分子质量为1858.4。ESI-MS m/z:found[M+2H]2+930.2，[M+3H]3+620.4；calu[M+2H]2+930.2，[M+3H]3+620.4。
实施例5
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-NH2；(SEQ.ID NO.5)
理论相对分子质量为1611.8。ESI-MS m/z:found[M+2H]2+806.9，[M+3H]3+583.2；calu[M+2H]2+806.9，[M+3H]3+583.2。
实施例6
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-NH2；(SEQ.ID NO.6)
理论相对分子质量为2056.5。ESI-MS m/z:found[M+2H]2+1029.2，[M+3H]3+686.5；calu[M+2H]2+1029.2，[M+3H]3+686.5。
实施例7
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2；(SEQ.ID NO.7)
理论相对分子质量为1866.1。ESI-MS m/z:found[M+2H]2+934.8，[M+3H]3+623.5；calu[M+2H]2+934.6，[M+3H]3+623.4。
实施例8
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2；(SEQ.ID NO.8)
理论相对分子质量为2636.9。ESI-MS m/z:found[M+2H]2+1319.4，[M+3H]3+879.8；calu[M+2H]2+1319.5，[M+3H]3+879.9。
实施例9
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln-NH2；(SEQ.ID NO.9)
理论相对分子质量为2540.2。ESI-MS m/z:found[M+2H]2+1271.1，[M+3H]3+847.7；calu[M+2H]2+1271.1，[M+3H]3+847.7。
以下是本发明中涉及的GLP-1片段类似物的体内药理实验方法以及结果：
(1)GLP-1片段类似物的降血糖实验
10周龄雄性昆明小鼠适应性饲养一周后随机分组，每组6只，禁食不禁水12h。阴性对照组小鼠在-30min腹腔注射生理盐水，阳性对照组小鼠注射GLP-1(25nmol/kg)，给药组小鼠注射相应待测化合物溶液，所有小鼠在0min腹腔注射18mmol/kg的葡萄糖溶液，监测0、15、30、45、60和120min的血糖水平。观察各组血糖值变化情况并进行统计分析来评估化合物的降糖活性。
如图1所示，GLP-1片段类似物与艾塞那肽(Ex-4)相比，具有一定的降糖生物活性，降血糖实验显示，GLP-1片段类似物可通过一定机制，而呈现优于原型的降糖效果，说明本发明提供的GLP-1片段类似物具有较大的应用前景。
(2)GLP-1片段类似物在糖尿病小鼠上的降糖试验
20-22g清洁级雄性昆明小鼠分笼适应性饲养一周，自由饮食，室内通风情况良好，12h交替白昼，室温约为25℃，相对湿度为40％～70％。所有小鼠在注射链脲佐菌素(STZ)前禁食不禁水12h，STZ柠檬酸盐缓冲液现配现用。除作为正常对照组的小鼠外，其他组小鼠根据体重每日腹腔注射STZ 40mg/kg，连续注射五天，阴性对照组每天腹腔注射对应体积的柠檬酸缓冲液。注射完全结束后，模型组小鼠在72h后进行血糖的监测，再过72h后，小鼠血糖若持续高于11.1mmol/l，同时出现三多一少的症状，即多饮多尿多食且体重降低，则认为该小鼠符合模型要求。成模糖尿病小鼠随机分组，阴性对照组腹腔注射生理盐水，阳性对照组注射Ex-4(25nmol/kg)，给药组注射GLP-1片段，治疗结束后，测定小鼠空腹血糖。从而考察药物治疗对糖尿病小鼠血糖控制的作用。
如图2所示，与阴性对照相比，GLP-1片段均具有不同程度地血糖控制效果，其中SEQ.ID NO.3、SEQ.ID NO.4和SEQ.ID NO.8呈现较好的血糖控制效果，说明GLP-1片段具有开发成为糖尿病治疗药物的潜力。
(3)GLP-1片段类似物在肥胖小鼠上的减肥试验
20-22g雄性C57BL/6小鼠分笼饲养三个月，自由饮食，室内通风情况良好，12h交替白昼，室温约为25℃，相对湿度为40％～70％。对照组小鼠喂食低脂饲料，高脂组小鼠喂食高脂饲料。根据人类肥胖和超重标准，肥胖度大于10％视为超重，20％则视为肥胖，因而，当体重超过正常20％时，则认为模型建立成功。肥胖小鼠适应性饲养一周后随机分组，每组6只，正常饮食饮水。每天定时给药，阴性对照组腹腔注射生理盐水，阳性对照组注射Ex-4(25nmol/kg)，给药组(1μmol/kg)注射GLP-1片段，记录小鼠体重，从而考察药物治疗对小鼠体重的影响。
如图3所示，与阴性对照相比，GLP-1片段均具有不同程度地减重效果，其中SEQ.IDNO.3、SEQ.ID NO.4和SEQ.ID NO.8呈现较好的减重活性，说明GLP-1片段具有开发成为减肥药物的潜力。
序列表
<110> 嘉兴学院
<120> 一种胰高血糖素样肽-1片段类似物及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> ACETYLATION
<222> (9)..(9)
<223> 第9位的Arg为羧基端
<400> 2
Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
1 5
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Lys Lys Lys
1 5 10
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser
1 5 10 15
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile
1 5 10 15
Ala
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro
1 5 10 15
Pro Ser
<210> 8
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro
1 5 10 15
Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys
20
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys Lys Asn Asp Trp Lys
1 5 10 15
His Asn Ile Thr Gln
20
Claims (7)
1.一种胰高血糖素样肽-1片段类似物，或其药学上可接受的盐，其序列为以下通式(I)所示：
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-X1-X2
(I)
其中，X2为NH2或COOH，X1为以下序列中的一种或不存在：
Lys-Lys-Lys；
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys；
Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Ser；
Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala；
Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser；
Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys；
Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln。
2.根据权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1片段类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述胰高血糖素样肽-1片段类似物选自：
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2；(SEQ.ID NO.1)
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-COOH；(SEQ.ID NO.2)
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-Lys-Lys-NH2；(SEQ.ID NO.3)
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2；(SEQ.IDNO.4)
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-NH2；(SEQ.IDNO.5)
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-NH2；(SEQ.ID NO.6)
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2；(SEQ.ID NO.7)
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2；(SEQ.ID NO.8)
Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln-NH2；(SEQ.ID NO.9)。
3.权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1片段类似物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
首先溶胀树脂，然后利用微波条件促进Fmoc保护基的脱除以及促进Fmoc保护的碳端初始氨基酸-MBHAResin的合成，而后进行肽链的延长，最后将树脂上多肽进行裂解，纯化，即得。
4.根据权利要求3所述的胰高血糖素样肽-1片段类似物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)树脂的溶胀：
取Fmoc-Rink amide-MBHA Resin，经DCM溶胀；
(2)微波促进Fmoc保护基的脱除：
将溶胀好的树脂，用含HOBT的哌啶/NMP溶液，在微波条件下反应，反应结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净，得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂；
(3)微波促进Fmoc保护的碳端初始氨基酸MBHA Resin的合成：
将Fmoc保护的碳端初始氨基酸，HBTU，HOBT和DIPEA溶于NMP中，再将此溶液加入上面的树脂中，在微波条件下反应，反应结束后滤除反应液，用DCM和NMP洗涤树脂；
(4)偶合效率的检测：
定性检测树脂的偶合效率，显色反应为阴性即可进入下一个偶合循环；
(5)肽链的延长：
按照肽链的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸，偶合，然后继续重复脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸直至肽链合成完毕，得到连有化合物的树脂。
(6)树脂上多肽的裂解
将上述得到的连有化合物的树脂，利用裂解剂裂解，冷冻离心得到目标多肽的粗品；
(7)多肽的纯化：
将所得多肽的粗品，采用制备液相色谱进行纯化，即得。
5.一种药物组合物，包含治疗有效量的至少一种权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1片段类似物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体和/或辅料。
6.权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1片段类似物或其药学上可接受的盐、权利要求5所述的药物组合物在制备治疗肥胖药物中的应用。
7.权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1片段类似物或其药学上可接受的盐、权利要求5所述的药物组合物在制备治疗糖尿病药物中的应用。
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