CN116808172B - 葵花盘肽、复合脂质体及其在制备降低尿酸和溶解痛风石产品中的应用 - Google Patents

葵花盘肽、复合脂质体及其在制备降低尿酸和溶解痛风石产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及葵花盘相关原料技术领域，具体涉及一种葵花盘脂质体及其在制备降低尿酸和溶解痛风石产品中的应用。该葵花盘脂质体以二茂铁葵花盘肽、生物碱和黄酮作为原料自组装形成，能够降低尿酸，溶解通风石，平衡体内酸碱平衡，抑制黄嘌呤氧化酶合成尿酸，促进体内尿酸排泄和肠道蠕动，修复受损肝肾细胞，消肿抗炎止痛，预防治疗高尿酸血症，缓解痛风炎症，降低血压，提高免疫力。

Description

葵花盘肽、复合脂质体及其在制备降低尿酸和溶解痛风石产 品中的应用
技术领域
本发明涉及葵花盘相关原料技术领域，具体涉及一种葵花盘肽、复合脂质体及其在制备降低尿酸和溶解痛风石产品中的应用。
背景技术
向日葵为菊科向日葵属一年生植物，是一种值得开发利用的药用植物,其味甘,性温,无毒；功能主治：清热、利水、通尿、治胃癌等。向日葵的化学成分类型多样，包括倍半萜内酯类、二萜类、倍半萜类、单萜类、黄酮类、香豆素类和甾醇类等，其中以倍半萜内酯类和二萜类居多。而倍半萜类、黄酮类和烷烃类成分多聚集在叶片，芳香类成分多聚集在种子。向日葵中化合物多变的结构类型和空间构型使其呈现广泛的生物活性。向日葵籽在驱虫、抗肿瘤、抗衰老等方面均有显著疗效；向日葵花盘具有抗肿瘤、抗心绞痛、抑菌、镇痛、降血压等多种功效；向日葵叶具有降压、抑菌、降血糖等功效；向日葵茎有抗肿瘤、利下等作用；向日葵根在抑菌方面有显著疗效。然而，充分开发向日葵相关活性成分，为进一步在药物开发应用上提供帮助仍然具有十分重大的潜力。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了葵花盘脂质体及其在制备降低尿酸和溶解痛风石产品中的应用。该葵花盘脂质体以二茂铁葵花盘肽、生物碱和黄酮作为原料自组装形成，能够降低尿酸，溶解通风石，平衡体内酸碱平衡，抑制黄嘌呤氧化酶合成尿酸，促进体内尿酸排泄和肠道蠕动，修复受损肝肾细胞，消肿抗炎止痛，预防治疗高尿酸血症，缓解痛风炎症，降低血压，提高免疫力。为此，本发明公开了以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种对葵花盘肽修饰的方法，包括：对葵花盘肽的氨基进行保护；将氨基二茂铁与氨基保护的葵花盘肽反应形成叔丁基氧-葵花盘肽-二茂铁，再对其进行酸水解可得二茂铁修饰的葵花盘肽；其中，所述葵花盘肽为PDP-9，氨基酸序列如SEQID NO.1所示，或PDP-17，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，“对葵花盘肽的氨基进行保护”的步骤具体包括：
配制得到碳酸氢钠的饱和溶液，与溶解有二碳酸二叔丁酯的二氧六环溶液混合；然后少量多次加入葵花盘肽以上混合液，TLC跟踪反应进程；
反应过夜后，用乙酸乙酯洗2-3次；
取水相用乙酸乙酯洗2次；用饱和碳酸氢钠洗油相2次；
然后混合所有的水相用10％的盐酸调节水相的pH＝1，再用乙酸乙酯洗水相2次；集中以上油相用无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干即可得到晶体产物。
进一步地，“将氨基二茂铁与氨基保护的葵花盘肽反应形成叔丁基氧-葵花盘肽-二茂铁”的步骤包括：
用无水二氯甲烷将上述得到的氨基保护的葵花盘肽溶解于干燥的圆底烧瓶中，于0℃下加入三乙胺，再加入苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸反应1小时后；
加入氨基-二茂铁，反应2h后移入室温反应，过夜反应，TLC跟踪反应进程；
反应结束后，分别依次用饱和碳酸氢钠溶液、0.5M盐酸、0.5M碳酸氢钠溶液和水洗涤，最后用无水硫酸钠干燥油相，过滤，蒸干得到固体；
用二氯甲烷和乙醇将固体溶解，以二氯甲烷和乙醇(混合体积比95:5)的混合溶液为淋洗液过层析柱，收集组分，干燥，得纯化的叔丁基氧-葵花盘肽-二茂铁固体。
进一步地，“对其进行酸水解可得二茂铁修饰的葵花盘肽”的步骤具体包括：
将叔丁基氧-葵花盘肽-二茂铁溶于乙酸乙酯溶液中，然后在0℃通干燥的HCl气体1h，再在室温下反应0.5h，最后蒸干即可；
用甲醇将固体溶解，用乙醚反复重结晶多次，得比较纯的产物葵花盘肽，
第二方面，本发明提供了一种葵花盘脂质体的制备方法，包括：
称取大豆卵磷脂、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺甲氧基聚乙二醇于250mL单口圆底烧瓶中，加入二氯甲烷使固体全部溶解；
再加入含有二茂铁葵花盘肽、葵花盘总生物碱和葵花盘总黄酮的甲醇溶液，超声30s使其混合均匀；
随后，将烧瓶连接至旋转蒸发器，真空状态下于42℃水浴中使二氯甲烷-甲醇溶液完全蒸发从而在烧瓶壁上形成一层均匀带有折光的黄色磷脂膜；以及
取下烧瓶，加入8mL无菌的pH 7.4的PBS溶液，于超声波清洗器中分离磷脂薄膜，再将烧瓶转至超声波细胞破碎仪中用300W超声10min从而使磷脂膜自组装成葵花盘脂质体；
其中，二茂铁葵花盘肽由权利要求1～4所述的方法制得。
进一步地，所述葵花盘总生物碱和葵花盘总黄酮的提取方法包括：
取葵花盘粉颗粒用10倍质量的50％乙醇回流提取1次，提取15min，过滤，滤液减压浓缩到葵花盘粉质量的0.5倍，即得醇提液；
将已预处理好的D001大孔树脂1000mL，装入内径为60mm，高为1200mm的玻璃柱，加入上述提取所得的醇提液，缓慢充分吸附后，以约5倍柱体积的蒸馏水，4BV/h的流速洗去水溶性杂质；
再用5BV50％乙醇以1BV/h的流速洗脱，收集洗脱液Ⅰ。再用5BV氨水含量为1％的50％乙醇以1BV/h的流速洗脱，收集洗脱液Ⅱ；
洗脱液Ⅰ浓缩干燥后即得葵花盘总黄酮，洗脱液Ⅱ浓缩干燥后即得葵花盘总生物碱。
第三方面，本发明提供了第一方面所述的方法制得的二茂铁葵花盘肽。
第四方面，本发明提供了第二方面所述的方法制得的葵花盘脂质体。
第五方面，本发明提供了第二方面所述的方法制得的葵花盘脂质体载制备降低尿酸和溶解痛风石产品中的应用。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果之一：
本发明中涉及的脂质体能够将该高尿酸血症模型细胞的上清液尿酸含量降低至最低，不仅选用二茂铁葵花盘肽和提取自葵花盘的生物碱和黄酮作为原料，经过自组装形成脂质体，而且还选用Fc-PDP-9和Fc-PDP-17而非Fc-SFTI-1作为原料，能够获得一种能够明显干预肝细胞尿酸代谢，并显著降低尿酸代谢量的制剂。
相对于以PDP-9和PDP-17和SFTI-1作为原料得到脂质体以及以Fc-PDP-9、Fc-PDP-17和Fc-SFTI-1作为制剂干预小肠黏膜上皮细胞，以Fc-PDP-9、Fc-PDP-17和Fc-SFTI-1作为原料得到的脂质体不仅能够促进其对尿酸的转运，还能减少其炎症反应的发生。
本发明中涉及的脂质体体及二茂铁葵花盘肽对高尿酸血症治疗效果良好，并且是基于对PI3K/AKT信号通路的调控实现治疗作用的。
附图说明
图1为本发明实施例提供的Fc-PDP-9(图1A)、Fc-PDP-17(图1B)和Fc-SFTI-1(图1C)的红外图谱。
图2为本发明实施例提供的动物实验中正常组、模型组、实验组(实施例1提供的脂质体处理)及对照组的小鼠关节滑膜组织切片的HE染色图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
1、材料
葵花盘肽(参照“Evolutionary Origins of a Bioactive Peptide Buriedwithin Preproal bumin[J]The Plant Cell,Vol.26:981-995,March 2014”提供的方法合成)。本发明涉及的有：PDP-9：GDCYWTSTPPFFTCTPD，SEQ ID NO.1所示；PDP-17：GDCHWIPAPPFFMCTPD，SEQ ID NO.2所示；SFTI-1：GRCTKSIPPICFPD，SEQ ID NO.3所示。
2、对葵花盘肽的修饰
本发明提供了一种对葵花盘肽的修饰的方法，包括：对葵花盘肽的氨基进行保护；将氨基二茂铁与氨基保护的葵花盘肽反应形成叔丁基氧-葵花盘肽-二茂铁，再对其进行酸水解可得二茂铁修饰的葵花盘肽。具体包括：
(1)肽氨基的保护
取780mg碳酸氢钠于圆底烧瓶中，在4℃下用蒸馏水溶解，配制得到碳酸氢钠的饱和溶液，另外称取460mg二碳酸二叔丁酯((Boc)2O，CAS：24424-99-5，南京奥普奇医药科技有限公司)，将其溶解于大约50mL二氧六环(CAS：123-91-1，上海阿拉丁)中，将上述两种溶液混合；然后称取700mg葵花盘肽分批少量多次加入以上混合液，TLC跟踪反应进程。反应过夜后，用乙酸乙酯洗2-3次；取水相用乙酸乙酯洗2次；用饱和碳酸氢钠洗油相2次。然后混合所有的水相用10％的盐酸调节水相的pH＝1，再用乙酸乙酯洗水相2次。集中以上油相用无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干即可得到白色晶体产物。用甲醇将固体溶解，用乙醚反复重结晶多次，可得比较纯的Boc保护过后的Boc-PDP-9、Boc-PDP-17和Boc-SFTI-1分别为450mg、537mg和514mg。
(2)叔丁基氧-葵花盘肽-二茂铁的合成
用无水二氯甲烷将上述得到的Boc-PDP-9、Boc-PDP-17和Boc-SFTI-1溶解于干燥的圆底烧瓶中，于0℃下加入三乙胺2.0mL，再加入苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸(HBTU，CAS：94790-37-1，上海共价化学科技有限公司)430mg，反应1小时后，加入氨基-二茂铁303mg(CAS：1273-82-1，北京百灵威)，反应2h后移入室温反应，过夜反应，TLC跟踪反应进程(茚三酮显色)。反应结束后，分别依次用饱和碳酸氢钠溶液、0.5M盐酸、0.5M碳酸氢钠溶液和水洗涤，最后用无水硫酸钠干燥油相，过滤，蒸干得到固体。用二氯甲烷和乙醇将固体溶解，以二氯甲烷和乙醇(混合体积比95:5)的混合溶液为淋洗液过层析柱，收集组分，干燥，得纯化的叔丁基氧-葵花盘肽-二茂铁固体分别为298mg、285mg和279mg。
(3)二茂铁葵花盘肽的合成
将上述得到的叔丁基氧-葵花盘肽-二茂铁溶于乙酸乙酯溶液中，然后在0℃通干燥的HCl气体1h，再在室温下反应0.5h，最后蒸干即可。由于氨基化合物容易氧化变质，所以须低温干燥保存。用甲醇将固体溶解，用乙醚反复重结晶多次，得比较纯的产物葵花盘肽，Fc-PDP-9、Fc-PDP-17和Fc-SFTI-1分别为179mg、164mg和171mg。
(4)红外检测
测定了二茂铁葵花盘肽(KBr压片)在4000～400cm-1范围内的IR谱。如图1为Fc-PDP-9(图1A)、Fc-PDP-17(图1B)和Fc-SFTI-1(图1C)的红外图谱。其中，3247cm-1附近出现一个宽的单峰，这归属于N-H的伸缩振动吸收；1537cm-1附近显示N-H面内弯曲振动吸收，为一般胺类二茂铁衍生物具有的共同特征吸收峰。1598cm-1附近出现酯基中C＝O的伸缩振动吸收峰；1136cm-1附近出现C-O-C的伸缩振动吸收峰；1403cm-1出现-COO-反对称伸缩振动峰。2927cm-1附近出现亚甲基的C-H伸缩振动吸收。1302cm-1附近出现较弱的C-N伸缩振动吸收峰。3082cm-1处出现茂环C-H伸缩振动吸收，1009cm-1及824cm-1附近出现单环取代二茂铁的特征吸收峰。由此说明，上述Fc-PDP-9、Fc-PDP-17和Fc-SFTI-1被成功制得。
3、葵花盘提取物
参照“一种抗种抗痛风中草药葵花盘粉的药理作用[J]内蒙古中药2016(08):130-1”的过程提取葵花盘生物碱和黄酮，具体如下：
总黄酮和生物碱的提取：取葵花盘粉颗粒100g，用10倍质量的50％乙醇回流提取1次，提取15min，过滤，滤液减压浓缩到葵花盘粉质量的0.5倍，即得醇提液。将已预处理好的D001大孔树脂1000mL，装入内径为60mm，高为1200mm的玻璃柱，加入上述提取所得的醇提液，缓慢充分吸附后，以约5倍柱体积的蒸馏水，4BV/h的流速洗去水溶性杂质。再用5BV50％乙醇以1BV/h的流速洗脱，收集洗脱液Ⅰ。再用5BV氨水含量为1％的50％乙醇以1BV/h的流速洗脱，收集洗脱液Ⅱ。洗脱液Ⅰ浓缩干燥后即得葵花盘总黄酮，其含量以芦丁计为61.4％(参照“HPLC法同时测定麦芽总碱提取物中生物碱及麦黄酮的含量[J]中药新药与临床药理,2020年1月”)为葵花盘总黄酮组分。洗脱液Ⅱ浓缩干燥后即得葵花盘总生物碱，其含量以甲基葵花碱计含量为75.8％(参照“HPLC法同时测定麦芽总碱提取物中生物碱及麦黄酮的含量[J]中药新药与临床药理,2020年1月”)为葵花盘总黄酮组分。
4、制备脂质体
(1)脂质体的制备过程
称取200mg大豆卵磷脂、50mg胆固醇和25mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺甲氧基聚乙二醇(DSPE-PEG2000，广州为华生物科技有限责任公司)于250mL单口圆底烧瓶中，加入50mL二氯甲烷使固体全部溶解；再加入50mL含有1.0mg/mL二茂铁葵花盘肽、4mg/mL葵花盘总生物碱(上述实施例制得)和2.5mg/mL葵花盘总黄酮(上述实施例制得)的甲醇溶液，超声30s使其混合均匀。随后，将烧瓶连接至旋转蒸发器，真空状态下于42℃水浴中使二氯甲烷-甲醇溶液完全蒸发从而在烧瓶壁上形成一层均匀带有折光的黄色磷脂膜。取下烧瓶，加入8mL无菌的pH 7.4的PBS溶液，于超声波清洗器中分离磷脂薄膜，再将烧瓶转至超声波细胞破碎仪中用300W超声10min从而使磷脂膜自组装成葵花盘脂质体。
再将脂质体溶液转移到10mL离心管中于3000rpm中离心5min以去除未包封上的二茂铁葵花盘肽，离心后的沉淀保留以测定包封率。最后，将得到的脂质体溶液放置于4℃冰箱中保存。
作为对照，在上述步骤不添加二茂铁葵花盘肽，而进行相同的脂质体制备过程，得到空白脂质体。
本步骤中，分别以Fc-PDP-9、Fc-PDP-17和Fc-SFTI-1作为二茂铁葵花盘肽，与葵花盘总生物碱和2.5mg/mL葵花盘总黄酮配合制得了对应的脂质体，分别作为实施例1、2和对比例1；空白脂质体作为对比例2。
对比例3提供的脂质体制备：
取200mg大豆卵磷脂、50mg胆固醇和25mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺甲氧基聚乙二醇(DSPE-PEG2000，广州为华生物科技有限责任公司)于250mL单口圆底烧瓶中，加入50mL二氯甲烷使固体全部溶解；再加入50mL含有1.0mg/mL葵花盘肽(PDP-9)、4mg/mL葵花盘总生物碱(上述实施例制得)和2.5mg/mL葵花盘总黄酮(上述实施例制得)的甲醇溶液，超声30s使其混合均匀。随后，将烧瓶连接至旋转蒸发器，真空状态下于42℃水浴中使二氯甲烷-甲醇溶液完全蒸发从而在烧瓶壁上形成一层均匀带有折光的黄色磷脂膜。取下烧瓶，加入8mL无菌的pH 7.4的PBS溶液，于超声波清洗器中分离磷脂薄膜，再将烧瓶转至超声波细胞破碎仪中用300W超声10min从而使磷脂膜自组装成葵花盘脂质体。其中，葵花盘肽为PDP-9。
对比例4提供的脂质体制备：
取200mg大豆卵磷脂、50mg胆固醇和25mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺甲氧基聚乙二醇(DSPE-PEG2000，广州为华生物科技有限责任公司)于250mL单口圆底烧瓶中，加入50mL二氯甲烷使固体全部溶解；再加入50mL含有1.0mg/mL葵花盘肽(PDP-17)、4mg/mL葵花盘总生物碱(上述实施例制得)和2.5mg/mL葵花盘总黄酮(上述实施例制得)的甲醇溶液，超声30s使其混合均匀。随后，将烧瓶连接至旋转蒸发器，真空状态下于42℃水浴中使二氯甲烷-甲醇溶液完全蒸发从而在烧瓶壁上形成一层均匀带有折光的黄色磷脂膜。取下烧瓶，加入8mL无菌的pH 7.4的PBS溶液，于超声波清洗器中分离磷脂薄膜，再将烧瓶转至超声波细胞破碎仪中用300W超声10min从而使磷脂膜自组装成葵花盘脂质体。其中，葵花盘肽为PDP-17。
对比例5提供的脂质体制备
取200mg大豆卵磷脂、50mg胆固醇和25mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺甲氧基聚乙二醇(DSPE-PEG2000，广州为华生物科技有限责任公司)于250mL单口圆底烧瓶中，加入50mL二氯甲烷使固体全部溶解；再加入50mL含有1.0mg/mL葵花盘肽(SFTI-1)、4mg/mL葵花盘总生物碱(上述实施例制得)和2.5mg/mL葵花盘总黄酮(上述实施例制得)的甲醇溶液，超声30s使其混合均匀。随后，将烧瓶连接至旋转蒸发器，真空状态下于42℃水浴中使二氯甲烷-甲醇溶液完全蒸发从而在烧瓶壁上形成一层均匀带有折光的黄色磷脂膜。取下烧瓶，加入8mL无菌的pH 7.4的PBS溶液，于超声波清洗器中分离磷脂薄膜，再将烧瓶转至超声波细胞破碎仪中用300W超声10min从而使磷脂膜自组装成葵花盘脂质体。其中，葵花盘肽为-SFTI-1。
(2)脂质体的粒径的表征
制得的脂质体粒径和Zeta电位通过MalvernZetaSizerNanoZSCModel：ZEN3600)测定，其中测定Zeta电位时所用的脂质体在制备时用不含PBS的去离子水超声水化。为研究脂质体的短期生理稳定性，将三组以PBS溶液(pH7.4)稀释过的脂质体溶液放置于37℃摇床中孵育7天，测定其粒径分布，结果如表2所示。
(3)脂质体负载性能
收集上市脂质体的超声清洗液，取2mL于石英比色皿中测定其在441nm处的吸光值，依次计算其中的二茂铁葵花盘肽的含量，从而根据该超声清洗液的体积与二茂铁葵花盘肽的加入量差值计算脂质体对其包封率。另外，根据参照“HPLC法同时测定麦芽总碱提取物中生物碱及麦黄酮的含量[J]中药新药与临床药理,2020年1月”公开的方法检测超声清洗液中总生物碱和总黄酮含量，依次计算脂质体对葵花盘的总生物碱和总黄酮的包封率。
表2
由表2可知，实施例1～2和对比例1～5分别制得的脂质体水化动力直径差别不大。实施例1与对比例3分别提供的脂质体对二茂铁葵花盘肽、总生物碱和总黄酮的包封率差异不大，实施例2与对比例4分别提供的脂质体对二茂铁葵花盘肽、总生物碱和总黄酮的包封率差异不大，对比例1与对比例5分别提供的脂质体对二茂铁葵花盘肽、总生物碱和总黄酮的包封率差异不大。
5、肝细胞试验
(1)材料
供试品：实施例1～3和对比例1～5提供的脂质体，以及实施例1～3分别提供的二茂铁葵花盘肽。
选用人原代肝细胞(L-O2细胞，上海慧颖生物科技有限公司)来衡量上述实施例1～3和对比例1～5分别提供的脂质体，以及实施例1～3分别提供的二茂铁葵花盘肽对其是否具有细胞毒性以及对高尿酸血症模型细胞的干预作用。
(2)细胞毒性试验
选择在对数期生长的L-O2细胞，用含0.25％EDTA胰蛋白酶消化并轻轻吹散成细胞悬液并计数，加培养基稀释至1×105个/mL。在96孔细胞培养板中每孔接种细胞5000个，然后加含血清培养基200μL，放入细胞培养箱培养过夜使细胞完全贴壁。待细胞完全贴壁后，去除孔中的培养基，用无菌PBS溶液润洗一次，加入200μL、200μM含不同供试品(叔丁醇溶解)后加入至无血清培养基。
随后于37℃培养箱孵育24h、48h和96h，孵育结束后，吸出孔板中的培养基，无菌PBS润洗两次，避光环境下加入100μL含1mg/mL MTT的无血清培养基，37℃培养箱孵育4h。吸出孔板中的培养基，加入100μL DMSO在37℃恒温震荡箱中孵育20min，随后用酶标仪测定孔板中各孔溶液在570nm出的吸光值，以无血清培养基为对照组。每组做6个平行组，并用下式计算细胞存活率＝试验组吸光值/对照组吸光值×100％。
表3
表3示出了各处理组人原代肝细胞分别于24h、48h和96h时的细胞存活率。由表3可知，各组在24h、48h时的细胞存活率均高于100％，在96h时有所下降，说明各组供试品对人原代肝细胞几乎无毒性作用。
(3)体外高尿酸血症模型细胞干预试验
取对数生长期的人原代肝细胞分成对照组、模型组和观察组，每组9孔。
1)高尿酸血症模型细胞的建立：
取对数生长期的LO2细胞以105个/mL的密度接种于24孔板上，于37℃、5％CO2培养箱中培养48h后，去除培养液，分别加入不同浓度的腺苷溶液2.5mM(CAS：58-61-7，南京斯拜科生物科技股份有限公司)，每个浓度设置3个平行孔，继续培养36h后取出细胞上清液，添加黄嘌呤氧化酶使其浓度为0.005U/mg，继续孵育12h，高效液相分析，细胞上清液中尿酸浓度(检测方法参照“高尿酸血症细胞模型的构建及其在降尿酸肽筛选中的应用[J]现代食品科技，2017年第33卷第8期”)。以未经过上述腺苷诱导过程为对照，模型组尿酸生成量显著增高，空白对照组基本无尿酸生成，表明高尿酸血症模型基本构建成功。
2)分组试验
将上述经诱导的高尿酸血症模型细胞作为模型组铺板，设置为模型组、阳性药物组和试验组，贴壁生长24h后。模型组加入完全培养基，阳性药物组加入0.5mg/mL非布索坦溶液(CAS:144060-53-7，北京世纪迈劲生物科技有限公司)，试验组加入200μM含不同供试品(叔丁醇溶解)的上述供试品孵育24h后，去除上清液，PBS清洗三次，空白对照组加入完全培养基，模型组、阳性药物组和乳清蛋白多肽组加入腺苷溶液继续孵育36h，高效液相测定细胞上清液中尿酸含量。
各组细胞继续培养4h后，收集培养液1000r/min离心5min，取上清，按照XO酶检测试剂盒(K710-100，Biovision)说明书检测XO酶活性。以模型组酶活为参照，根据各组细胞上清液的酶活与模型组上清液酶活差与模型组酶活的百分比值作为酶活下降比例。
表4
表4示出了各组细胞在经过处理后的细胞上清液中尿酸含量，对其中的数据进行多重比较和显著性差异标记，“—”表示未检出。由表4可知，模型组尿酸含量和XO酶活最高，而阳性药物组中尿酸含量降低至其大约一半含量，XO酶活也大幅降低，说明阳性药物具有降低尿酸含量和抑制XO酶活的能力。而实验组中，脂质体和二茂铁葵花盘肽均对L-O2模型细胞的XO酶活和尿酸合成进行了干预，导致XO酶活和尿酸含量呈现不同程度的降低。
其中，实施例1～2提供的脂质体能够将该高尿酸血症模型细胞的上清液尿酸含量降低至最低。相对于实施例1，对比例1提供的二茂铁葵花盘肽未表现对XO酶活的抑制和降尿酸的作用。相对于实施例1～2，对比例3～4中的脂质体选用葵花盘肽、生物碱和黄酮作为原料，其XO酶活的抑制和降尿酸的作用显著降低，可能和其原料中的生物碱和黄酮有关，而和其葵花盘肽的作用关系不大。由此表明，对比上述对实施例1～2和对比例1～5分别提供的脂质体的制备过程描述发现，实施例1～2不仅选用二茂铁葵花盘肽和提取自葵花盘的生物碱和黄酮作为原料，经过自组装形成脂质体，而且还选用Fc-PDP-9和Fc-PDP-17而非Fc-SFTI-1作为原料，能够获得一种能够明显干预肝细胞尿酸代谢，并显著降低尿酸代谢量的制剂。
6、小肠黏膜上皮细胞试验
(1)材料
大鼠的小肠黏膜上皮细胞，购自ATCC细胞库。
供试品：实施例1～3和对比例1～5提供的脂质体，以及实施例1～3分别提供的二茂铁葵花盘肽。
(2)大鼠的小肠黏膜上皮细胞培养与传代
大鼠的小肠黏膜上皮细胞用加入100mL/L的胎牛血清、10g/L的青霉素和链霉素的DMEM培养基，在体积分数为于37℃、5％ CO2培养箱中培养，每2d换液。当细胞的数量生长到80％～90％左右时，用胰酶消化细胞，按照1:3的比例进行传代培养，试验所用细胞为第3代细胞。将细胞按5×104/cm2的比例接种于孔板进行后续试验。(3)小肠黏膜上皮细胞炎症模型的建立
细胞尿酸处理按照每孔大约1000个的比例，将细胞接种于96孔板，每孔体积100μL。用50mg/L浓度的尿酸(同时保证模型建立和细胞活性)对其进行处理，每个浓度设置4个复孔，细胞培养箱放置48h。应用MTS法检测细胞活性几乎无衰减。
(4)分组试验
取对数生长期的小肠黏膜上皮细胞作为正常组。其上述小肠黏膜上皮细胞炎症模型细胞作为模型组。
取对数生长期的小肠黏膜上皮细胞大约1000个的比例，将细胞接种于96孔板，每孔体积100μL，用50mg/L浓度的尿酸(同时保证模型建立和细胞活性)对其进行处理，每个浓度设置4个复孔，细胞培养箱放置48h后，加入100μL 2mg/mL的上述供试品孵育24h后，待用。
(5)实时荧光定量PCR
检测小肠黏膜上皮细胞TSPO(转运蛋白)、ABCG2(ATP结合膜转运蛋白)、IL-1β的mRNA表达，用Trizol(TAKARA公司)提取RNA，然后用逆转录试剂盒(TAKARA公司)将1μgRNA反转录合成cDNA，操作方法按试剂说明书进行。用SYBRExTaq试剂盒(TAKARA公司)来检测基因的表达含量，以GAPDH作为内参。引物序列见表4。
表5
(7)结果
表6mRNA相对表达量
表6示出了各组细胞经RT-PCR检测的TSPO、ABCG2和IL-1β的相对表达水平，对每列数据进行多重比较和显著性差异标记。结果如表5所示，相对于正常组，模型组细胞经尿酸处理24h后通过TSPO、ABCG2和IL-1β的表达量均显著上升。由此表明，尿酸会刺激小肠黏膜上皮细胞TSPO、ABCG2和IL-1β的表达，不仅加快了细胞的尿酸转运，同时还让细胞产生了炎症反应。
表6中，实施例1～2提供的二茂铁葵花盘肽处理细胞后，其细胞TSPO表达量相对于正常组提升并与模型组相当，ABCG2表达量相对于模型组显著提升，而IL-1β表达量相对于模型组显著降低。同样地，实施例1～2提供的脂质体处理细胞后，其细胞TSPO表达量相对于模型组显著提升，ABCG2表达量相对于模型组显著提升，而IL-1β表达量相对于模型组显著降低。而对比例3～5提供的脂质体，分别以PDP-9和PDP-17和SFTI-1作为原料，而非Fc-PDP-9、Fc-PDP-17和Fc-SFTI-1作为原料，其处理细胞后，其细胞TSPO表达量相对于模型组显著下降，而ABCG2和IL-1β表达量相对于模型组无显著变化。
结果表明，相对于以PDP-9和PDP-17和SFTI-1作为原料得到脂质体以及以Fc-PDP-9、Fc-PDP-17和Fc-SFTI-1作为制剂干预小肠黏膜上皮细胞，以Fc-PDP-9、Fc-PDP-17和Fc-SFTI-1作为原料得到的脂质体不仅能够促进其对尿酸的转运，还能减少其炎症反应的发生。
7、动物实验
(1)实验动物
选取健康雄性SD大鼠，清洁级，体重(250±25)g，共60只，由上海斯莱克实验动物中心提供，动物许可证号:SCXK(沪)2017-0005。动物饲养环境：洁级实验室饲养，温度20～25℃，湿度40％～70％，噪声＜60分贝，换气次数10～20次/h，工作照度L/D＝12h/12h。所有动物购回后适应性分笼饲养1周，无不良反应，饮食、饮水正常者，即纳入实验。
(2)供试品
实施例1～3和对比例1～5提供的脂质体，以及实施例1～3分别提供的二茂铁葵花盘肽作为供试品。
(3)大鼠高尿酸血症模型的建立
大鼠造模组均给予氧嗪酸钾(Sigma)100mg/kg腹腔注射和次黄嘌呤500mg/kg灌胃以诱导高尿酸血症。造模药剂给药1次/d，持续至实验结束，共24d。
(4)实验分组
在常规适应性喂养后按照正常组、模型组、实验组及对照组(非布司他4mg/kg剂量)，各10只，制备大鼠高尿酸血症模型的建立。
(5)实验动物
给药造模成功后，实验组以上述供试品按照7.5/(kg·d)，2次/d，每日灌胃给药；同时非布司他组按4mg/(kg·d)，1次/d给以治疗，其余对照组和模型组以等容量的生理盐水灌胃。在实验的第4天开始，给予造模剂0.5h后，供试品按成人剂量以体表面积换算法换算，给供试品(叔丁醇溶解)溶液灌胃，阳性药物组(非布司他4mg/kg剂量)，模型组与空白组仅以适量生理盐水灌胃。治疗药物1次/d，共治疗21d。整个实验持续24d。正常对照组不进行任何处理。
(6)检测
HE染色：关节滑膜组织放入4％多聚甲醛溶液中固定，梯度酒精脱水，常规石蜡包埋，5μm切片，HE染色后在光镜下读片。
第21天给药治疗3h后通过心脏采血(使用临床上常用的真空采血管)3ml，离心机3000r/min、4℃离心15min分离血清，-80℃保存。
以日立-7150型全自动生化分析仪测定血清中UA浓度、肌酐和尿素氮含量。
ELISA试剂盒(eBioscience)检测大鼠血清TNF-α和IL-1β含量。
RT-PCR检测(相关试剂盒来自TAKARA公司)按照Trizol试剂产品说明书提取细胞总RNA，然后用逆转录试剂盒(TAKARA公司)将1μgRNA反转录合成cDNA，操作方法按试剂说明书进行。用SYBRExTaq试剂盒(TAKARA公司)来检测基因的表达含量，以GAPDH作为内参。相关检测基因及引物如表7所示。
表7
序列名称 核苷酸序列(5’→3’)
TLR4-F ctccattcaagcccaagcct，SEQ ID NO.12所示
TLR4-R gtccttccatgacagaacggt，SEQ ID NO.13所示
AKT-F caggaccacgagaagctgtt，SEQ ID NO.14所示
AKT-R gatctccttggcatcctcgg，SEQ ID NO.15所示
PI3K-F ggagaaccagccctaagctc，SEQ ID NO.16所示
PI3K-R cagtgatggggttttgcagc，SEQ ID NO.17所示
NF-kBp65-F atgcccaacttctccgacag，SEQ ID NO.18所示
NF-kBp65-R aggacttccggtactccctc，SEQ ID NO.19所示
(7)结果
如图2所示，正常组大鼠后足跺关节滑膜组织光滑完整，滑膜下软组织则为脂肪、血管及胶原纤维，偶见充血改变，无炎细胞浸润和血管增生及纤维素渗出。模型组和滑膜充血，表现有渗出的中性粒细胞及纤维素样坏死，滑膜表层细胞灶性增生，滑膜有弥漫性或周围管性炎症细胞浸润，包括中性粒细胞、淋巴细胞和少数浆细胞；而实验组和阳性组炎症减少。
表8
表8示出了各组小鼠血清中尿酸、尿酸蛋和血肌酐含量结果，对每列数据进行多重比较和显著性差异标记。结果可知，在大鼠的血UA检测结果中，模型组血UA水平要远远超过正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)，表明造模方法有效，实验大鼠经氧嗪酸钾腹腔注射和次黄噴呤灌胃后，呈高尿酸血症状态。实验组中，实施例1～2分别提供的脂质体及二茂铁葵花盘肽处理的小鼠血清中尿酸、尿酸氮和血肌酐水平均明显低于模型组，且对小鼠尿酸、尿酸氮和血肌酐控制效果不劣于对照组。
表9
表9示出了各组小鼠血清中TNF-α和IL-1β含量结果，对每列数据进行多重比较和显著性差异标记。实验组中，实施例1～2分别提供的脂质体及二茂铁葵花盘肽处理的小鼠血清中TNF-α和IL-1β水平均明显低于模型组，且对小鼠TNF-α和IL-1β控制效果不劣于对照组，说明实施例1～2分别提供的脂质体及二茂铁葵花盘肽能够有效控制炎症发生。
表10 mRNA相对表达量
表10示出了各组小鼠血清中TLR4、AKT、PI3K、NF-κB-P65基因表达量结果，对每列数据进行多重比较和显著性差异标记。实验组中，实施例1～2分别提供的脂质体及二茂铁葵花盘肽处理的小鼠血清中TLR4、AKT、PI3K、NF-κB-P65基因表达量均明显高于模型组，且对小鼠TLR4、AKT、PI3K、NF-κB-P6基因表达控制效果不劣于对照组，说明实施例1～2分别提供的脂质体及二茂铁葵花盘肽对高尿酸血症治疗效果良好，并且是基于对PI3K/AKT信号通路的调控实现治疗作用的。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种对葵花盘肽修饰的方法，其特征在于，包括：对葵花盘肽的氨基进行保护；将氨基二茂铁与氨基保护的葵花盘肽反应形成叔丁基氧-葵花盘肽-二茂铁；再对其进行酸水解可得二茂铁修饰的葵花盘肽；其中，所述葵花盘肽为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的PDP-9，或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的PDP-17；
其中，“对葵花盘肽的氨基进行保护”的步骤具体包括：
配制得到碳酸氢钠的饱和溶液，与溶解有二碳酸二叔丁酯的二氧六环溶液混合；然后少量多次加入葵花盘肽以上混合液，TLC跟踪反应进程；
反应过夜后，用乙酸乙酯洗2-3次；
取水相用乙酸乙酯洗2次；用饱和碳酸氢钠洗油相2次；
然后混合所有的水相用10%的盐酸调节水相的pH=1，再用乙酸乙酯洗水相2次；集中以上油相用无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干即可得到晶体产物；
其中，“将氨基二茂铁与氨基保护的葵花盘肽反应形成叔丁基氧-葵花盘肽-二茂铁”的步骤包括：
用无水二氯甲烷将上述得到的氨基保护的葵花盘肽溶解于干燥的圆底烧瓶中，于0℃下加入三乙胺，再加入苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸反应1小时后；
加入氨基-二茂铁，反应2h后移入室温反应，过夜反应，TLC跟踪反应进程；
反应结束后，分别依次用饱和碳酸氢钠溶液、0.5M盐酸、0.5M碳酸氢钠溶液和水洗涤，最后用无水硫酸钠干燥油相，过滤，蒸干得到固体；
用二氯甲烷和乙醇将固体溶解，以二氯甲烷和乙醇(混合体积比95:5)的混合溶液为淋洗液过层析柱，收集组分，干燥，得纯化的叔丁基氧-葵花盘肽-二茂铁固体；
其中，“酸水解”的步骤具体包括：
将叔丁基氧-葵花盘肽-二茂铁溶于乙酸乙酯溶液中，然后在0℃通干燥的HCl气体1h，再在室温下反应0.5h，最后蒸干即可；
用甲醇将固体溶解，用乙醚反复重结晶多次，得比较纯的二茂铁葵花盘肽。
2.一种葵花盘脂质体的制备方法，其特征在于，包括：
称取大豆卵磷脂、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺甲氧基聚乙二醇于250 mL单口圆底烧瓶中，加入二氯甲烷使固体全部溶解；
再加入含有二茂铁葵花盘肽、葵花盘总生物碱和葵花盘总黄酮的甲醇溶液，超声30 s使其混合均匀；
随后，将烧瓶连接至旋转蒸发器，真空状态下于42℃水浴中使二氯甲烷-甲醇溶液完全蒸发从而在烧瓶壁上形成一层均匀带有折光的黄色磷脂膜；以及
取下烧瓶，加入8 mL无菌的pH 7.4 的PBS溶液，于超声波清洗器中分离磷脂薄膜，再将烧瓶转至超声波细胞破碎仪中用300 W超声10 min从而使磷脂膜自组装成葵花盘脂质体；
其中，二茂铁葵花盘肽由权利要求1所述的方法制得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述葵花盘总生物碱和葵花盘总黄酮的提取方法包括：
取葵花盘粉颗粒用10倍质量的50%乙醇回流提取1次，提取15min，过滤，滤液减压浓缩到葵花盘粉质量的0.5倍，即得醇提液；
将已预处理好的D001大孔树脂1000mL，装入内径为60mm，高为1200mm的玻璃柱，加入上述提取所得的醇提液，缓慢充分吸附后，以5倍柱体积的蒸馏水，4BV/h的流速洗去水溶性杂质；
再用5BV50%乙醇以1BV/h的流速洗脱，收集洗脱液Ⅰ，再用5BV氨水含量为1%的50%乙醇以1BV/h的流速洗脱，收集洗脱液Ⅱ；
洗脱液Ⅰ浓缩干燥后即得葵花盘总黄酮，洗脱液Ⅱ浓缩干燥后即得葵花盘总生物碱。
4.根据权利要求1所述的方法制得的二茂铁葵花盘肽。
5.权利要求2或3所述的方法制得的葵花盘脂质体。
6.权利要求2或3所述的方法制得的葵花盘脂质体载在制备降低尿酸和溶解痛风石产品中的应用。
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