CN114377050A - 一种含葵花盘小分子的抗痛风组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药剂领域,具体涉及一种含葵花盘小分子的抗痛风组合物,所述组合物包含葵花盘提取物,可降尿酸和降低关节肿胀度。所述葵花盘提取物通过以下方法制备所得:将葵花盘粉碎物与水按1:10‑20的重量比混合,浸泡后调节pH至5.0‑6.0,并加热至45‑55℃,加入纤维素酶酶解1‑3小时;调节pH至3.0‑6.0,温度为35‑55℃,加入果胶酶反应0.5‑2小时;调节pH至6.0‑7.0,温度为55‑65℃,加入木瓜蛋白酶反应1‑3小时,反应结束后,同样条件加风味酶,反应1‑2小时;所得酶解液压滤,过滤,离心,取上清液超滤膜超滤,收集膜下液体,干燥得葵花盘提取物。
Description
技术领域
本发明涉及药剂领域,具体涉及一种含葵花盘小分子的抗痛风组合物。
技术背景
痛风是由单钠尿酸盐晶体诱发的炎症性疾病,长期嘌呤代谢活跃、嘌呤摄入过多或尿酸排泄障碍,均可导致高尿酸血症。长期高尿酸血症可引起关节及周围软组织尿酸盐晶体沉积,进而出现反复发作的急性关节和软组织炎症、痛风石沉积、慢性关节炎和关节损坏。高尿酸血症亦可累及肾脏,引起慢性间质性肾炎和尿酸盐结石形成。痛风患者早期积极降尿酸治疗,可延缓或阻止脏器损害。
近年来,随着饮食结构的变化,痛风的发生率呈现出增长的趋势,已成为高血糖、高血脂之后的第三类富贵病。目前治疗痛风的药物一般采用非甾体类消炎药或激素类药物,疗效不明显的同时,副作用大。中医药治疗痛风具有其特有的优势。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了一种含葵花盘小分子的抗痛风组合物。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
一种含葵花盘小分子的抗痛风组合物,所述组合物可降尿酸和降低关节肿胀度,包含葵花盘提取物,所述葵花盘提取物通过以下方法制备所得:将葵花盘粉碎物与水按1:10-20的重量比混合,浸泡1-2小时后调节pH至5.0-6.0,并加热至45-55℃,加入纤维素酶酶解1-3小时;然后调节pH至3.0-6.0,温度为35-55℃,加入果胶酶反应0.5-2小时;然后调节pH至6.0-7.0,温度为55-65℃,加入木瓜蛋白酶反应1-3小时,反应结束后,同样条件加风味酶,反应1-2小时;所得酶解液120-240目压滤,过滤后8000-12000rpm离心,上清液用截留分子量300kDa超滤膜超滤,收集膜下液体,干燥得葵花盘提取物。
进一步地,所述纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、风味酶的质量均为葵花盘粉碎物与水混合物的0.1-0.3%。
进一步地,该组合物包含葵花盘黄酮提取物。
进一步地,该组合物包含葵花盘提取物和VC。
本发明具有以下有益效果:
本发明的含葵花盘小分子组合物具有降低血尿酸、促进尿酸排泄、降低关节肿胀度的作用;保肝护肾的作用。
附图说明
图1不同时间点关节肿胀度(%)比较.
图2不同给药组对模型动物血尿酸水平的影响。
图3不同给药组对模型动物尿尿酸水平的影响。
图4不同给药组对模型动物肾脏细胞结构形态的影响。
图5不同给药组对模型动物肝脏细胞结构形态的影响。
图6葵花盘不同剂量对血尿酸的影响。
图7葵花盘-葛根不同剂量对血尿酸的影响。
图8不同给药组对大鼠血尿酸浓度的影响。
图9不同给药组对大鼠尿尿酸12h排泄量的影响。
图10不同给药组对痛风性关节炎大鼠关节肿胀度的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白,以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
一、葵花盘提取物的药效评价
1.实验目的
评价葵花盘提取物治疗痛风的效果
2.实验方法
2.1葵花盘提取物前处理
1)不同浓度醇沉处理组:所述葵花盘提取物通过以下方法制备所得:将葵花盘粉碎物与水按1:10-20的重量比混合,浸泡1-2小时后调节pH至5.0-6.0,并加热至45-55℃,加入纤维素酶酶解1-3小时;然后调节pH至3.0-6.0,温度为35-55℃,加入果胶酶反应0.5-2小时;然后调节pH至6.0-7.0,温度为55-65℃,加入木瓜蛋白酶反应1-3小时,反应结束后,同样条件加风味酶,反应1-2小时;所得酶解液120-240目压滤,过滤后8000-12000rpm离心,上清液用截留分子量300kDa超滤膜超滤,收集膜下液体,干燥得葵花盘提取物。所述纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、风味酶的质量均为葵花盘粉碎物与水混合物的0.1-0.3%。
分别取100g葵花盘提取物4份,将
其加蒸馏水500ml超声溶解,分别加95%乙醇至终浓度为20%、30%、40%、50%静置过夜,过滤取上清,浓缩至给药所需浓度(0.34g/ml)。4℃冷藏备用。
2)制剂组:取葵花盘提取物60g,加蒸馏水187.5ml,配至0.34g/ml,超声溶解,4℃冷藏备用。
2.2造模方法:
将Wistar雄性大鼠(体重200-250g)适应环境3天后,随机分成9组(1)空白对照组(KB)(n=10):连续13天按照0.5mL/100g体重腹腔注射生理盐水,每日两次;(2)高尿酸血症模型组(MX)(n=10):连续13天按照0.5mL/100g体重腹腔注射造模药(黄嘌呤和氧嗪酸钾均为60mg/mL的混合液),每日两次;(3)其他给药组,按模型组同样方法注射造模,同时从腹腔注射那天起,给药组(制剂组、20%乙醇组、30%乙醇组、40%乙醇组、50%乙醇组)按照0.34g/mL浓度、别嘌醇组、苯溴马隆组按临床使用量给药,0.5ml/100g体重灌胃给药,共8天,每天1次。
腹腔注射第6天,模型组和各给药组大鼠右侧关节腔注射尿酸钠100μL(30mg/mL)。
2.3测定和取样:
1)注射尿酸钠后,利用软尺测定大鼠的关节肿胀度,测定时间点为0、2、4、6、12、24、48h(届时计算一下具体时间,可适当调整)。
2)给药第7天,动物禁食不禁水,置于代谢笼中,收集24h尿液,4000rpm/min,4℃离心,取上清,分装,冻于-80℃。取分装1份,作为尿酸待测样本,其他冻存留用。
3)第8天,末次给药后1h,处死动物,收集血清样本,4000rpm/min,4℃离心,取上清,分装,冻于-80℃;收集胃、肾脏、肝脏和关节固定于10%甲醛中,用于H&E染色分析。
3.结果与讨论
由图1和表1可以看出,从关节肿胀度结果可以看出,在给药后0h时,各给药组肿胀度均低于模型组;给药后48h之内,制剂和30%、40%乙醇组的肿胀度均低于模型组,别嘌醇和苯溴马隆组对关节肿胀度降低效果不明显。
由图2可以看出,空白对照组大鼠血尿酸水平为102.21±13.89μmol/L,模型组血尿酸水平较之有极显著升高;各给药组中均可降低模型动物血尿酸水平,其中以别嘌醇降低血尿酸水平效果最好,其次为40%乙醇组、50%乙醇组,这两组醇沉组降血尿酸水平与制剂组接近。
由图3可以看出,空白对照组大鼠尿尿酸水平为433.62±70.00μmol/L,模型组与之比较有极显著差异(P<0.01),即造模后尿尿酸水平会急剧升高;各给药组尿尿酸较模型组均有显著下降,其中以别嘌醇组、制剂组、20%乙醇组效果最好,可将尿尿酸水平降低至空白组水平以下。但尿尿酸含量测定的组内差异较大,可能原因是尿液收集时不同个体喝水量及排泄时间不同,导致所收集的同一组尿样中尿酸浓度差异较大。
表1不同给药组各时间点的关节肿胀度(%)
表2各组肾脏形态变化分级评价表
由图4和表2可以看出:较空白组,动物模型复制是成功的,肾脏内可见肾小球扩张,肾小管变性、扩张,肾内可见多处肾小管变性、扩张等形态改变;阳性药物组(别嘌醇和苯溴马隆组)效果较好,可以减轻(P<0.05)肾损伤程度,有一定的保护肾脏形态和功能的作用;制剂组保护肾脏的作用较好,可以显著减轻(P<0.01)肾脏损伤程度,有效保护肾脏形态和功能,效果优于阳性药物组;30%乙醇提取组、40%乙醇提取组和50%乙醇提取组显著减轻(P<0.01)肾脏损伤程度,有效保护肾脏形态和功能,效果优于阳性药物组。
表3各组肝脏形态变化分级评价表
由图5和表3可以看出:较空白组,模型组肝细胞未见明显形态差异,说明造模药物尚不能明显改变肝细胞形态。各给药组动物肝细胞无明显肝细胞疏松变性。醇沉组个别动物出现肝细胞变形,初步怀疑药物浓缩时乙醇有残留导致。后期分离纯化小分子后再进一步观察。
二.葵花盘对血尿酸影响的时间动态变化
1.实验目的:
临床反应有的病人服药后会发生关节疼痛情况,观察是不是由于药物引起的暂时性血尿酸升高。
2.实验方法:
空白对照组(KB)、模型对照组(MX)、制剂组(QF)2.5(0.053mg/ml)、制剂组(QF)5.0(0.106mg/ml)、制剂组(QF)7.5(0.16g/ml)、制剂-葛根组(GG)7.5(制剂:葛根=10:3,其中按照制剂0.16g/ml剂量给药)、制剂-葛根组(GG)5.0(制剂:葛根=10:3,其中按照制剂0.106g/ml剂量给药)、制剂-葛根组(GG)2.5(制剂:葛根=10:3,其中按照制剂0.053g/ml剂量给药)、阳性药组1(Y1)(别嘌醇)、阳性药组2(Y2)(苯溴马隆)
模型组及各给药组连续8天,每日早晚两次腹腔注射造模药0.5ml/100g(黄嘌呤和氧嗪酸钾均为60mg/mL的混合液,生理盐水配制);空白组注射等体积生理盐水。从腹腔注射之日起,各组按照表1所示剂量灌胃给药。连续8天,每天一次。腹腔注射第6天,模型组及各给药组大鼠右侧关节腔注射尿酸钠100μL(30mg/mL)。注射尿酸钠后,利用软尺测定大鼠的关节肿胀度,测定时间点为3、6、12、24、48h。
第8天,末次给药后,15min、30min、45min、60min、75min、90min、2h、3h、4h眼角静脉丛取血,测定给药后血尿酸随时间变化情况。
3.实验结果
从图6、图7结果可以看出,葵花盘不同剂量均可降低模型动物血尿酸水平,口服1小时之后效果开始较显著;葵花盘-葛根配伍对血尿酸水平无降低作用,反而会升高血尿酸水平。
三.葵花盘中黄酮类成分液质联用分析
1.实验目的:
对葵花盘黄酮提取物进行液质联用分析,并利用UNIFI软件对液质数据进行处理,同时根据其中化合物的结构特征进行分析鉴定。
2.实验方法
2.1样品制备
称取葵花盘20g,将药品过40目筛,加入60%乙醇溶液200mL,浸泡1h,加热回流提取2次,每次2h,过滤,合并滤液,滤液于60℃旋转蒸发浓缩,冻干,分装,于干燥器中保存。取0.5g生药,溶于1mL 50%的甲醇水溶液中,涡旋震荡10min,超声10min,取上清液10μL进质谱分析检测。
2.2液质条件
Waters Acquity UPLC液相色谱系统高效液相色谱仪,Waters ACQUITY UPLC BEHC18色谱柱(1.7μm,2.1×50mm),柱温30℃,为获得更好的分离度同样正负离子模式采取不同流动相体系,在负离子模式下,流动相为乙腈(A)和0.1%甲酸(C),正离子模式下,流动相为甲醇(B)和0.1%甲酸(C),流速300μL/min,进样体积5μL。
在负离子模式下,液相洗脱程序为:0-2min5-10%A,2-4min10-13%A,4-6min13-13%A,6-8min13-15%A,8-9min15-20%A,9-12min20-25%A,12-15min25-45%A,15-16min40-44%A,16-19min44-56%A,19-20min56-60%A,20-22min60-100%A,22-24min100-100%A,24-25min100-5%A,25-29min5-5%A。
Waters Q-TOF SYNAPTGS HDMS质谱仪,ESI离子源,全扫描模式,扫描范围100-1300Da。离子源温度100℃,脱溶剂气温度450℃,锥孔气(N2)和去溶剂气(N2)流速分别为50L/h及70L/h。,毛细管电压、锥孔电压及提取锥孔电压负离子模式下分别为2.5kV,40kV及4.0kV。用甲酸钠建立标准曲线,亮氨酸脑啡肽(正离子模式556.2771,负离子模式554.2615)进行实施质量校正。
3.实验结果
黄酮类
在葵花盘提取物中,含有多种黄酮类成分。先将葵花盘提取物现进行大孔吸附树脂纯化处理,收集20-35%乙醇洗脱部分,35-50%乙醇洗脱部分,50-65%乙醇洗脱部分。将此三部分样品进行处理后进行液质分析,并利用UNIFI软件对液质数据进行处理,同时根据其中化合物的结构特征进行了针对性分析。
通过UPLC-Q-TOF-MS,在负离子模式下分析了葵花盘提取物中的黄酮类化合物,分析并鉴定了其中黄酮类成分21种,分别为quercetin-3′-glucoside,quercetin-3-O-β-D-6″-acetylglucopyranoside,Isorhamnetin 3-O-glucoside,Mikanin,Tricin 5-glucoside,Hyperoside(Quercetin 3-O-galactoside),Isoquercetin,quercetin-7-O-β-D-glucopyranoside,saxifragin,Apigenin 7-glucoside,Genistin,Kaempferol 3-O-rhamnoside,Nevadensin,tambulin,Daidzin,Astragalin,Cynaroside,Acacetin,quercetin,Kaempferol 7-O-(6″-p-coumaroyl)hexoside,rutin。
四、葵花盘中黄酮类成分对痛风的治疗作用
1.实验目的
考察葵花盘总黄酮对痛风的治疗作用,主要从降尿酸、关节肿胀度及组织病理切片几个角度评价,并评价葵花盘提取物颗粒、葵花盘提取物颗粒+加Vc、芹菜籽粉对痛风性关节炎的影响。
2.试剂与仪器
黄嘌呤,氧嗪酸钾,尿酸钠盐均购自Sigma(美国);非布司他购自杭州朱养心药业有限公司;血尿酸试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司;实验用水为Milli-Q超纯水。
酶标仪;Milli-Q Gradient A10超纯水系统;Centrifuge 5810R超高速冷冻离心机。
3.实验方法
3.1造模与分组
将Wistar雄性大鼠(体重200-250g)适应环境3天后,随机分成7组(1)空白对照组(KB)(n=10):连续7天按照0.5mL/100g体重腹腔注射生理盐水,每日两次;(2)高尿酸血症模型组(MX)(n=10):连续8天按照0.5mL/100g体重腹腔注射造模药(黄嘌呤和氧嗪酸钾均为60mg/mL的混合液),每日两次;(3)其他给药组,按模型组同样方法注射造模,同时从腹腔注射那天起,开始灌胃给药,共13天,每天1次。空白对照组和模型组灌胃蒸馏水,其余各组给药剂量分别为:芹菜籽组(QCZ)0.62g/kg,葵花盘提取物颗粒+Vc组(JKL+Vc)0.8g/kg+Vc54mg/kg,葵花盘总黄酮纯化组(ZHT)8.9mg/kg,葵花盘提取物颗粒组(JKL)0.8g/kg,非布司他组(FBST)4.3mg/kg,
腹腔注射第6天,模型组和各给药组大鼠右侧关节腔注射尿酸钠100μL(30mg/mL)。
3.2测定和取样:
注射尿酸钠后,利用软尺测定大鼠的关节肿胀度,测定时间点为0、3、6、12、24、48h。
给药第7天,动物禁食不禁水,置于代谢笼中,收集12h尿液,测定尿液总体积。收集的尿液4000rpm/min,4℃离心,取上清,测定尿尿酸含量,计算12h尿酸总排泄量。
第8天,末次给药后1h,处死动物,收集血清样本,4000rpm/min,4℃离心,取上清,测定血尿酸含量。取各组动物肾脏、肝脏和关节固定于10%甲醛中,用于H&E染色分析。
4.实验结果
4.1不同组别大鼠血尿酸浓度测定
由图8结果分析可知,模型组血尿酸浓度与空白组有显著差异,表明造模成功。芹菜籽组与模型组血尿酸浓度无明显差异,不能降低血尿酸浓度。阳性药非布司他组可显著降低血尿酸浓度(P<0.01)。葵花盘提取物颗粒及葵花盘总黄酮组的血尿酸浓度与阳性药组的浓度接近,均可显著降低模型动物的血尿酸浓度(P<0.01)。而葵花盘提取物颗粒+Vc组虽然可降低血尿酸浓度,但是效果没有单独使用葵花盘颗粒效果好(P<0.05)。
4.2不同组别大鼠12h尿尿酸总排泄量
由图9结果分析可知,模型组12h尿尿酸排泄量与空白组有显著差异,表明造模成功。芹菜籽组与模型组12h尿尿酸排泄量无显著性差异(P>0.05)。葵花盘总黄酮可降低模型动物12h尿尿酸排泄量,但是与模型组相比没有显著性差异(P>0.05)。阳性药非布司他组与模型组12h尿尿酸排泄量有一定差异,表明非布司他对高尿酸血症药效作用。葵花盘提取物颗粒以及葵花盘提取物颗粒+Vc组的12h尿尿酸排泄量与阳性药组相近(P<0.05或0.01),表明葵花盘总提物的降尿酸作用较好,Vc对尿尿酸的总排泄量没有影响。
4.3不同组别大鼠关节肿胀度
由图10结果分析可知,不同给药组(阳性药非布司他组、葵花盘提取物颗粒+Vc组、葵花盘提取物颗粒组、总黄酮组)在48h时都将关节肿胀度降于15.5%以下,作用显著。而芹菜籽组在48h时,关节肿胀度虽没有以上三组明显但也低于模型组。其中葵花盘总黄酮组的大鼠关节肿胀度最低,作用优于葵花盘提取物颗粒和非布司他,表明葵花盘总黄酮具有良好的抗炎作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种含葵花盘小分子的抗痛风组合物,其特征在于:该组合物包含葵花盘提取物。
2.如权利要求1所述的一种含葵花盘小分子的抗痛风组合物,其特征在于:所述葵花盘提取物通过以下方法制备所得:将葵花盘粉碎物与水按1:10-20的重量比混合,浸泡1-2小时后调节pH至5.0-6.0,并加热至45-55℃,加入纤维素酶酶解1-3小时;然后调节pH至3.0-6.0,温度为35-55℃,加入果胶酶反应0.5-2小时;然后调节pH至6.0-7.0,温度为55-65℃,加入木瓜蛋白酶反应1-3小时,反应结束后,同样条件加风味酶,反应1-2小时;所得酶解液120-240目压滤,过滤后8000-12000rpm离心,上清液用截留分子量300kDa超滤膜超滤,收集膜下液体,干燥得葵花盘提取物。
3.如权利要求2所述的一种含葵花盘小分子的抗痛风组合物,其特征在于:所述纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、风味酶的质量均为葵花盘粉碎物与水混合物的0.1-0.3%。
4.如权利要求1所述的一种含葵花盘小分子的抗痛风组合物,其特征在于:所述组合物可降尿酸和降低关节肿胀度。
5.如权利要求1所述的一种含葵花盘小分子的抗痛风组合物,其特征在于:该组合物包含葵花盘黄酮提取物。
6.如权利要求1所述的一种含葵花盘小分子的抗痛风组合物,其特征在于:该组合物包含葵花盘提取物和VC。
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