CN113456695B - 琴叶榕石油醚部位在制备预防或治疗肝癌药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了琴叶榕石油醚部位在制备预防或治疗肝癌药物中的应用，经体内外研究结果显示：琴叶榕石油醚部位在体外实验中表现出良好的抗肝癌细胞增殖作用，同时能够诱导肝癌细胞凋亡的发生；琴叶榕石油醚部位在体内实验中表现出较好的抑瘤作用，与20mg/kg索拉菲尼的抑瘤率无显著性差异，其作用机制可能与对Wnt/β‑catenin、JAK/STAT、NF‑kB通路的调节有关。表明琴叶榕石油醚部位具有较好的抗肝癌活性，在抗肝癌活性方面具有较高的研究价值和开发潜力。

Description

琴叶榕石油醚部位在制备预防或治疗肝癌药物中的应用
技术领域
本发明涉及中药技术领域，具体涉及琴叶榕石油醚部位在制备预防或治疗肝癌药物中的应用。
背景技术
肝癌具有肿瘤进展快、预后情况差等特点，肝癌目前在全世界范围内的癌症致死率中排在第二位，且逐年攀升。肝癌在国内的治疗现状更是不容乐观：中国的肝癌病例约占全世界总数的50％，而且中国的肝癌病例表现出预后差、病死率高的特点，五年生存率不足15％。在中医药角度来说，肝癌常分为肝郁脾虚、肝胆湿热、肝热血瘀、脾虚湿困、肝肾阴虚等证型。目前研究表明许多中药都表现出抑制肿瘤的作用。同时中药长于扶正固本，鉴于中药的依从性而言，中药的应用在康复、疗养和联合用药等方面均有一定优势。
琴叶榕为桑科榕属的植物，拉丁名为Ficus pandurata Hance。中医典籍记载琴叶榕性平，味甘、微辛，归属肝、脾、胃经，具有行气活络、通经、祛湿、消肿等作用。目前针对琴叶榕的研究主要围绕琴叶榕的大极性部位，如水提物、多糖的药理活性，而对于小极性部位的活性几乎没有涉及，且未见将琴叶榕石油醚部位用于预防或治疗肝癌的文献报道。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供琴叶榕石油醚部位在制备预防或治疗肝癌药物中的应用。
本发明采用80％乙醇对琴叶榕全株干燥粗粉进行提取，使用了不同极性的溶剂对醇提得到的粗提物进行萃取而得到琴叶榕的石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位。在此基础上，使用MTT法对不同部位进行了抗肝癌活性追踪，确定了抗肝癌部位的有效成分主要集中在琴叶榕石油醚部位，即琴叶榕石油醚部位为琴叶榕抗肝癌的有效部位。
本发明进一步对琴叶榕石油醚部位的成分进行了GC-MS分析，琴叶榕石油醚部位主要包含补骨脂素、佛手柑内酯等香豆素类化合物，以及羽扇豆醇、Urs-12-en-24-oicacid,3-oxo-,methyl ester,(+)-等三萜类物质，这都为琴叶榕石油醚部位抗肝癌活性奠定了相关的物质基础，同时也为琴叶榕石油醚部位后续的化学成分研究指明了方向。
在确定了琴叶榕石油醚部位为抗肝癌活性的有效部位之后，本发明采用四种肝癌细胞对其抗肝癌活性进行了进一步的验证。发现琴叶榕石油醚部位对HepG2、SMMC7721肝癌细胞具有较好的选择性，在高浓度下表现出高的增殖抑制率，同时琴叶榕石油醚部位对这两株细胞也表现出较低的IC50值。为探讨琴叶榕石油醚部位对于肝癌细胞的增殖抑制方式，通过AnnexinⅤ和PI染料对细胞进行染色，流式细胞术检验在琴叶榕石油醚部位处理后HepG2、SMMC7721肝癌细胞的细胞凋亡率。结果显示，相较于对照组而言，多种浓度下的琴叶榕石油醚部位均能够诱导肝癌细胞HepG2、SMMC7721凋亡的发生，且表现出浓度依赖性，优选的，所述琴叶榕石油醚部位的浓度范围内30μg/ml～250μg/ml，更优选为125μg/ml～250μg/ml。而琴叶榕石油醚部位对于HepG2的凋亡诱导效果优于SMMC7721细胞。
在选择体内移植瘤的借种细胞时，根据文献调研及细胞来源信息选择了SMMC7721肝癌细胞，因此在体外进行了体外的抗肝癌机制筛选研究。在结合琴叶榕抗肝炎的报道后，选择了NF-kB、JAK/STAT、Wnt/β-catenin三条围绕炎癌紧密相关的抗癌通路。Western-Blot结果显示琴叶榕石油醚部位能够下调JAK/STAT通路的STAT3的表达，下调NF-kB通路中的NF-kB、IKB-α的表达，下调Wnt/β-catenin通路中β-catenin、Axin1的表达，从而抑制肝癌细胞SMMC7721的增殖。
本发明在体外验证了琴叶榕石油醚部位的抗肝癌活性之后，紧接着开展了体内实验。索拉菲尼是国内唯一上市的针对晚期肝癌的抗癌药物，在结合了相关报道之后，本发明选择使用索拉菲尼作为体内实验的阳性药。体内实验结果表明，统计分析结果表明阳性药20mg/kg索拉菲尼对与琴叶榕石油醚部位高剂量组的抑瘤率无显著性差异，而瘤重均显著低于模型组。同时在对药物毒性的观察中，琴叶榕石油醚部位对于心、脾、肺、肾的相对质量无显著影响，而对于肝的相对重量具有轻微上调的作用，与索拉菲尼组的下调作用呈相反调节。
本发明还提供了一种预防或治疗治疗肝癌的药物，包含有效含量的琴叶榕石油醚部位和药学上可接受的载体。本发明预防或治疗治疗肝癌的药物可经本领域常规方法制备成适宜的剂型。优选的，所述药物的剂型为片剂、胶囊、粉剂或颗粒剂。
本发明与现有技术相比，具有如下优异效果：
本发明提供了一种琴叶榕石油醚部位在制备预防或治疗肝癌药物中的应用。经体内外研究结果显示：琴叶榕石油醚部位在体外实验中表现出良好的抗肝癌细胞增殖作用，同时能够诱导肝癌细胞凋亡的发生；琴叶榕石油醚部位在体内实验中表现出较好的抑瘤作用，与20mg/kg索拉菲尼的抑瘤率无显著性差异，其作用机制可能与对Wnt/β-catenin、JAK/STAT、NF-kB通路的调节有关。表明琴叶榕石油醚部位具有较好的抗肝癌活性，在抗肝癌活性方面具有较高的研究价值和开发潜力。
附图说明
图1为琴叶榕各部位高剂量下的抗肝癌增殖活性(n＝3)；
图2琴叶榕石油醚部位对肝癌细胞(从左到右依次为Hep3B、PLC-PRF-5、HepG2、SMMC7721)的增殖抑制活性(n＝3)；
图3为琴叶榕石油醚部位诱导HepG2肝癌细胞凋亡(n＝3)；
图4为琴叶榕石油醚部位诱导SMMC7721细胞凋亡(n＝3)；
图5为不同浓度的琴叶榕石油醚部位诱导肝癌细胞(从左到右依次为HepG2、SMMC7721)的凋亡率(n＝3)，*：在HepG2组，P＜0.05VS 0ug/ml；#：在SMMC7721组，P＜0.05VS0ug/ml；
图6为琴叶榕石油醚部位对SMMC7721肝癌细胞相关蛋白的影响(n＝3)；
图7为琴叶榕石油醚部位作用下SMMC7721肝癌细胞相关蛋白的表达量(n＝3)*：P＜0.05VS0ug/ml；
图8为体内移植瘤实验中各处理组瘤体对比(n＝6)；
图9为体内移植瘤实验裸鼠体重变化曲线(n＝6)；
图10为体内移植瘤实验各处理组瘤体积变化曲线(n＝6)；
图11为体内移植瘤实验各处理组(从左到右依次为模型组、索拉菲尼、低剂量、高剂量)脏器指数对比(n＝6)*：P＜0.05VS模型组；ns：各组间无显著性差异。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
实施例1：琴叶榕各部位的抗肝癌活性筛选
一、仪器与材料
(一)实验仪器
Figure BDA0003206998800000031
Figure BDA0003206998800000041
(二)实验试剂
Figure BDA0003206998800000042
Figure BDA0003206998800000051
蒸馏水由中山市中医院制剂室提供。
琴叶榕全株采集于广东省江门市开平市大津村，经广州中医药大学中药鉴定教研室黄海波教授鉴定为桑科榕属植物Ficus pandurata Hance。
(三)实验溶剂配制
DMEM完全培养基：取500ml DMEM培养基加入56ml的FBS及5.6ml的青链霉素，即终浓度为10％FBS+1％青链霉素，即得DMEM完全培养基。
PBS缓冲液：取PBS缓冲液干粉溶解于2L超纯水中，超声或磁力搅拌至粉末完全溶解，溶液置于高温高压灭菌后冷却至室温使用。
1×胰酶：取10×胰酶溶液，加入9倍体积的PBS缓冲液，即得1×胰酶。
细胞冻存液：取DMSO加入9倍体积的FBS(10％DMSO+90％FBS)，即得细胞冻存液。
MTT溶液：取噻唑蓝250mg，加入50ml PBS缓冲液，避光超声半小时，过0.22um滤膜除菌，即得MTT溶液，避光4℃保存。
琴叶榕各部位的药液配制：琴叶榕粗提物、石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位均难溶于水，故使用DMSO进行溶解调整至特定浓度，体外细胞实验给药时稀释1000倍；正丁醇部位、水部位直接使用DMEM完全培养基进行溶解后过0.22um滤膜除菌，调整至特定浓度后进行给药。
(四)实验细胞株
HepG2肝癌细胞购买自中科院细胞库(中国上海)，以干冰冻存管方式运输，使用时复苏，隔天换液，之后进行传代、冻存等操作。
二、实验方法
(一)琴叶榕各部位的提取
提取：取琴叶榕全株干燥粉末粉粹成粗粉。使用80％乙醇加热回流提取，料液比为1：10，每次提取1.5h，提取液趁热过滤，连续提取三次，三次提取液合并。使用旋转蒸发仪对提取液进行浓缩干燥，得到琴叶榕粗提物。
萃取：取琴叶榕粗提物，加入水混悬，得到水相1，之后使用石油醚对水相1萃取三次，得到石油醚部位和水相2，其中石油醚部位经浓缩干燥后留存；水相2使用氯仿进行萃取三次，得到氯仿部位和水相3，其中氯仿部位经浓缩干燥后留存；使用乙酸乙酯对水相3进行萃取，得到乙酸乙酯部位及水相4，其中乙酸乙酯部位经浓缩干燥后留存；使用正丁醇对水相4进行萃取，得到水部位和正丁醇部位，水相5和正丁醇部位经浓缩干燥后，使用冷冻干燥机进行冷冻干燥除去残余水分后留存。
(二)细胞培养
经文献查询及细胞来源检索，HepG2肝癌细胞所采用的培养基为DMEM培养基，使用含有10％FBS+1％青链霉素的DMEM完全培养基对细胞进行培养。
细胞复苏：取液氮冻存或干冰运输的细胞冻存管，置于37℃水浴迅速解冻，解冻后加入一定量的培养基后，离心(5min,1000rpm)，后小心弃上清加入DMEM完全培养基吹散细胞，转移至培养皿中，添加适量的DMEM完全培养基，隔天换液。
细胞传代：细胞生长至融合度70～80％时，进行传代操作，吸出培养皿中的旧培养基弃除，加入适量PBS缓冲液润洗去除残余培养基和细胞代谢废物，后吸出PBS缓冲液，加入适量的胰酶，放置37℃细胞培养箱中消化，显微镜下观察，细胞变圆出现间隙时加入两倍于胰酶的培养基终止消化，吹散细胞转移至离心管，离心(1000rpm，5min)后弃上清加入新的DMEM完全培养基，吹散细胞，按照传代的需要取适量细胞加入皿中，再补充足够的培养基。细胞应定期在倒置显微镜下观察，根据细胞生长情况及融合度进行传代、换液等操作。细胞在恒湿的37℃，5％CO2条件的细胞培养箱进行培养。
(三)MTT法测定琴叶榕各部位的对肝癌细胞的体外增殖抑制作用
取96孔板，使用HepG2肝癌细胞的细胞悬液(密度：3×104/ml)进行铺板，每孔100μl，培养24h。24h后，小心吸取并弃除旧培养基，注意不要接触板底部的细胞。药物处理组加入不同浓度的含药培养基(粗提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位:250、50、10、2ug/ml；正丁醇部位、水部位：1000、200、40、8ug/ml)，对照组加入不含药而含0.1％DMSO的完全培养基，体积为150ul/孔。各处理组设置至少三个复孔。含药培养基与细胞共培养48h后，小心吸取并弃除含药培养基，每孔加入20ul MTT溶液及80ul新鲜DMEM完全培养基。孵育4h之后，小心吸取并弃除旧培养基，每孔加入150ul的DMSO。将96孔板去盖后放入酶标仪，选择中速震荡5min后，在570nm波长下测定OD值。抑制率计算公式：抑制率(％)＝100*(OD对照组-OD给药组)/(OD对照组-OD空白组)。
(四)琴叶榕石油醚部位的GC-MS检测
1.样品处理：取琴叶榕石油醚部位5mg采用丙酮1ml溶解后进行GC-MS检测。
2.检测条件
GC条件：进样口温度310℃，气质接口温度310℃，载气流速1.5mL/min。
升温程序：初始80℃，保持2min，以8℃/min升温到180℃保持2min；5℃/min升温到250℃保持2min；5℃/min升温到310℃保持10min。
MS条件：离子源温度230℃，四级杆温度150℃，EI电离70eV，全扫描35～550da。
3.数据分析：
利用自建成分数据库和NIST17联合检索，使用AMDIS软件人工逐一解谱。去除相似度在80以下的成分，将所得的化学组分进行汇总。通过峰面积百分比进行相对定量。
(五)数据处理
所有正态计量资料以均数加减标准差
Figure BDA0003206998800000071
表示。α＝0.05，所在计量资料先进行正态性检验：<50例正态分布检验用ShaPiro-Wilk，≥50例用Kolmogrov-Smirnov，符合正态分布者，多组间均数的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，先行Levene Statistic方差齐性检验，方差齐采用F检验进行总均值比较、SNK(检验用于两两比较，方差不齐改用Welch检验进行总体均值比较、Dunnett T3检验进行两两比较，如多组计量资料全部或部分不服从正态分布，以平均秩和
Figure BDA0003206998800000072
和四分位数(P25、P50、P75)表示，采用Kruskal-Wallis+Mann-Whitney非参数检验；由SPSS22.0软件完成。
三、实验结果
(一)琴叶榕各部位的提取
琴叶榕各部位的提取分为三次进行，采用的同一批次采集的药材。
第一次使用琴叶榕全株干燥粉末50g，对粗提物进行提取，得到琴叶榕粗提物(4.844g，得率：9.688％)。
第二次使用琴叶榕全株干燥粉末50g，对各部位进行提取，得到各部位提取物：石油醚部位(0.525g，得率：1.05％)、氯仿部位(0.626g，得率：1.252％)、乙酸乙酯部位(0.210g，得率：0.420％)、正丁醇部位(0.931g，得率：1.862％)、水部位(1.967g，得率：3.934％)。
第三次使用琴叶榕1500g，对石油醚部位进行提取，得到琴叶榕石油醚部位15.35g，得率：1.023％。
以上提取得到的琴叶榕各部位用于后续的活性检测或GC-MS检测实验。
(二)琴叶榕各提取部位的抗肝癌细胞增殖活性筛选
对于HepG2肝癌细胞，琴叶榕各提取部位在最高剂量(250ug/ml)下的抗增殖活性(n＝3)如下：粗提物(250ug/ml)：65.58±4.07％；石油醚部位(250ug/ml):81.48±5.62％；氯仿(250ug/ml)：6.61±8.76％；乙酸乙酯(250ug/ml)：32.89±3.91％；正丁醇(1000ug/ml)：51.73±14.39％；水部位(1000ug/ml)：-1.53±12.44％。对数据进行统计学分析，6组数据(n＝3)均不符合正态分布，进行单因素方差分析，各组数据方差齐(经单因素方差分析，Levene Statistic＝2.643，P＝0.078>0.05)六组间均值比较有显著性差异(F＝40.192，P＝0.000<0.05)，结果显示：对于HepG2肝癌细胞的抗增殖活性，琴叶榕石油醚部位明显高于粗提物(p＝0.088＜0.1)，同时显著高于氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水部位(p＜0.05)(如图1所示)。
综上所述，在对琴叶榕各提取部位的抗肝癌增殖活性的追踪中发现：石油醚部位的抗肝癌活性最为突出，并由此围绕琴叶榕石油醚部位展开后续的抗肝癌活性研究。
(三)琴叶榕石油醚GC-MS检测结果
在前期的抗肝癌活性筛选中，确定了琴叶榕石油醚部位为抗肝癌有效部位。紧接着对石油醚部位进行了相关化学成分的检测，考虑到石油醚部位为小极性成分，因此采用了GC-MS进行检测。利用自建成分数据库和NIST17联合检索，使用AMDIS软件人工逐一解谱，剔除相似度在80以下的成分。使用峰面积百分比进行相对定量。按照保留时间顺序，将所得的化学组分进行汇总如表1所示。
表1.GC/MS检测结果
Figure BDA0003206998800000081
续表1：
Figure BDA0003206998800000082
Figure BDA0003206998800000091
续表1：
Figure BDA0003206998800000092
续表1.
Figure BDA0003206998800000093
Figure BDA0003206998800000101
实施例2：琴叶榕石油醚部位的抗肝癌活性研究一、仪器与材料
(一)实验仪器
Figure BDA0003206998800000102
Figure BDA0003206998800000111
(二)实验试剂
Figure BDA0003206998800000112
Figure BDA0003206998800000121
蒸馏水由中山市中医院制剂室提供。
(三)实验溶剂配制
DMEM完全培养基：DMEM完全培养基：取500ml DMEM培养基加入56ml的FBS及5.6ml的青链霉素，即终浓度为10％FBS+1％青链霉素，即得DMEM完全培养基。
PBS缓冲液：取PBS缓冲液干粉溶解于2L超纯水中，超声或磁力搅拌至粉末完全溶解，溶液置于高温高压灭菌后冷却至室温使用。
PBST溶液：取配置好的PBS缓冲液2L，加入1ml的吐温20，磁力搅拌均匀，即得PBST溶液。
5％脱脂牛奶：取1.25g脱脂奶粉加入PBST溶液，定容至25ml，即得5％脱脂牛奶。
电泳液：取30.3g的Tris、144.2g的甘氨酸、10g的SDS，加入适量超纯水，磁力搅拌至溶解均匀后定容至1000ml，即得10*电泳液，使用时取10*电泳液加入9倍体积的超纯水即得1*电泳液。
转膜液：取58g的Tris、29g的甘氨酸、3.7g的SDS，加入适量超纯水，磁力搅拌至溶解均匀后定容至1000ml，即得10*转膜液，使用时取10*转膜液加入7倍体积的超纯水和2倍体积的甲醇即得1*转膜液。
一抗溶液：取不同的一抗抗体，使用一抗稀释液进行1：1000稀释，混匀，即得一抗溶液。
二抗溶液：取鼠抗或兔抗的二抗抗体，使用5％的脱脂牛奶进行1：10000稀释，混匀，即得二抗溶液。
细胞裂解液：取RIPA裂解液，加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，后分装冻存于-20℃。
ECL化学发光液：取等量化学放光液A液和B液，混合均匀，现配现用。B液分为皮克级和飞克级，灵敏度：飞克级＞皮克级，根据条带显影情况进行调整B液的选择。
1×胰酶：取10×胰酶溶液，加入9倍体积的PBS缓冲液，即得1×胰酶。
细胞冻存液：取DMSO加入9倍体积的FBS(10％DMSO+90％FBS)，移液枪吹打均匀，即得细胞冻存液。
MTT溶液：取噻唑蓝250mg，加入50ml PBS溶液，避光超声半小时使充分溶解，过0.22um滤膜除菌，即得MTT溶液，避光4℃保存。
CMC-Na溶液：取5g CMC-Na粉末加入1000ml超纯水，在高温下(80℃)溶解后，即得0.5％CMC-Na溶液。
索拉菲尼溶液：使用5％DMSO+95％CMC-Na进行配制，即取20mg索拉菲尼溶于0.5mlDMSO中，加入9.5ml CMC-Na，超声混悬，即得。
琴叶榕石油醚部位的药液配制：琴叶榕石油醚部位难溶于培养基，故使用DMSO进行溶解调整至特定浓度。体外细胞实验中给药时稀释1000倍，在体内实验中使用DMSO溶解后使用CMC-Na溶液稀释10倍(5％DMSO+95％CMC-Na),超声混悬。
(四)实验细胞株
HepG2,SMMC7721,PLC-PRF-5,Hep3B肝癌细胞均购买自中科院细胞库(中国上海)，以干冰冻存管方式运输，使用时复苏，隔天换液，之后进行传代、冻存等操作。
(五)实验动物
雄性BALB/C nude小鼠共24只，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证：SCXK(浙):20190001。饲养于中山市中医院中药药理实验室SPF级动物房，许可证号：SYXK(粤)2020-0109。湿度维持在40％～60％，温度维持在22～26℃，光照条件为黑暗/光照各12h循环，隔天换垫料。并给予充足的食物和饮水，保证其自由摄入饮食。
二、实验方法
(一)细胞培养
经文献查询及细胞来源检索，HepG2,SMMC7721,PLC,Hep3B四种肝癌细胞所采用的培养基均为DMEM培养基，使用含有10％FBS+1％青链霉素的DMEM完全培养基对细胞进行培养。
细胞复苏：取液氮冻存或干冰运输的细胞冻存管，置于37℃水浴迅速解冻，解冻后加入一定量的培养基后，离心(5min,1000rpm)，后小心弃上清加入DMEM完全培养基吹散细胞，转移至培养皿中，添加适量的DMEM完全培养基，隔天换液。
细胞传代：细胞生长至融合度70～80％时，进行传代操作，吸出培养皿中的旧培养基弃除，加入适量PBS缓冲液润洗去除残余培养基和细胞代谢废物，后吸出PBS缓冲液，加入适量的胰酶，放置37℃细胞培养箱中消化，显微镜下观察，细胞变圆出现间隙时加入两倍于胰酶的培养基终止消化，吹散细胞转移至离心管，离心(1000rpm，5min)后弃上清加入新的DMEM完全培养基，吹散细胞，按照传代的需要取适量细胞加入皿中，再补充足够的培养基。细胞应定期在倒置显微镜下观察，根据细胞生长情况及融合度进行传代、换液等操作。细胞在恒湿的37℃，5％CO2条件的细胞培养箱进行培养。
(二)MTT法体外测定琴叶榕石油醚部位的对肝癌细胞的增殖抑制作用
取96孔板，使用不同肝癌细胞的细胞悬液(密度：3×104/ml)进行铺板，每孔100μl，培养24h。24h后，小心吸取并弃除旧培养基，注意不要接触板底部的细胞。药物处理组加入含药培养基(不同浓度的石油醚部位：250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125μg/ml)，对照组加入不含药而含0.1％DMSO的完全培养基，体积为150μl/孔。各处理组设置至少三个复孔。含药培养基与细胞共培养48h后，小心吸取并弃除含药培养基，每孔加入20μl 5mg/ml的Mtt溶液及80ul的新鲜培养基。孵育4h之后，小心吸取并弃除旧培养基，每孔加入150μl的DMSO，将96孔板去盖后放入酶标仪，选择中速震荡5min后，在570nm波长下测定OD值。抑制率计算公式：抑制率＝(OD对照组-OD给药组)/(OD对照组-OD空白组)。
(三)流式细胞术测定琴叶榕石油醚部位诱导肝癌细胞凋亡
取6孔板，使用HepG2、SMMC7721细胞的细胞悬液进行铺板(2.5×105/孔)，培养24h。24h后，小心吸取并弃除旧培养基，注意不要接触板底部的细胞。药物处理组加入含药培养基(石油醚部位：250、125、62.5、31.25、15.625μg/ml)，对照组加入不含药而含0.1％DMSO的完全培养基，体积为3ml/孔。培养箱中培养48h后，消化收集细胞，离心(500g离心力，5min)后小心吸取并弃除旧培养基，加入PBS混悬洗涤后，再离心洗涤两次以去除残余的血清及胰酶。根据Biosharp凋亡检测试剂盒的说明书进行流式细胞术检测凋亡率。提前开启流式细胞仪，更换新鲜鞘液，清空废液桶，完成每日开机清洗后待机。选择检测通道为FITC和PE通道，后上机检测。先用未染色的对照组细胞进行圈门，之后设置ANNEXINⅤ和PI单染及双染对照组进行补偿调节，后对药物处理组进行上机检测。
(四)Western-Blot检测
1.蛋白提取：取6孔板，使用SMMC7721细胞进行铺板，3×105/孔，培养24h后加药。6个孔分别加入不同浓度的琴叶榕石油醚部位：(250、125、62.5、31.25、15.675、0μg/ml)。在细胞培养箱种孵育24h后，吸取并弃除含药培养基，加入预冷至4℃的PBS缓冲液洗涤三次，之后每孔加入100μl的含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，置于冰上裂解30min，后使用细胞刮刀将细胞从六孔板中刮取下来，收集于1.5ml离心管中。离心管置于冰水中超声，超声3s，停5s，重复3次。将离心管置于低温高速离心机中，离心(15000rpm，15min)后取上清液，即为蛋白溶液。使用BCA蛋白定量试剂盒测定各组蛋白溶液的总蛋白浓度，再使用PBS缓冲液调整至统一浓度。之后加入5*SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，涡旋混合均匀后，置于金属浴架中96℃处理10min进行灭活处理。灭火处理后置于-20℃保存。
2.电泳：使用SDS-PAGE快速配胶试剂盒配制不同百分比的胶，应用于不同分子量目的蛋白的电泳，不同百分比的胶对应的最佳分离范围如下表2。先配置分离胶，后配置浓缩胶，插入泳道梳，待胶体完全凝结后，在SDS-PAGE胶上方的泳道中加入等量的蛋白(10μl/孔)。初始电泳的电压调节为70V，待浓缩胶中的蛋白平齐，调整至120V，待蛋白电泳至接近胶底，停止电泳。
表2不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围：
Figure BDA0003206998800000151
3.转膜：预先将PVDF膜浸润在无水甲醇中活化30s以上，将目的蛋白的胶体小心从玻璃板上切下，浸润在转膜液中，使用转膜夹将平整的滤纸、PVDF膜、胶体夹紧，制作“三明治”。“三明治”制备完成后，插入转膜用的电极槽中，装入盛有预冷转膜液的转膜槽中，插上电极。在恒流300mA的冰浴条件下进行转膜，转膜时间根据目的蛋白分子量而定。
4.封闭：转膜结束后，将转印有目的蛋白的PVDF膜迅速取出，并使用圆珠笔对目的蛋白的条带进行标记，后放入5％脱脂牛奶中，摇床上缓慢摇动，室温孵育2h。
5.孵育一抗：封闭结束后，取出PVDF膜，PBST溶液洗涤两次(5min/次)，然后根据目的蛋白的不同置于相应的一抗溶液中，摇床上室温孵育30min使抗体均匀覆盖膜体后转移至4℃冰箱孵育过夜。
6.孵育二抗：一抗孵育完成后，取出PVDF膜，PBST洗涤5次(5min/次)，然后根据一抗的来源将PVDF膜置于不同的二抗溶液中，置于摇床上室温孵育2h。
7.显影：二抗孵育完成后，PBST洗涤5次(5min/次)，配制ECL发光液，将PVDF膜置于ppp透明塑料袋割开的一侧，小心滴加发光液使其均匀覆盖PVDF膜，盖上ppp塑料袋，置于化学发光显色仪的暗室中进行显影，具体曝光时间根据实际观察进行调整。
(五)Balb/c裸鼠移植瘤实验方法
1.收集细胞：事先培养足量的SMMC7721肝癌细胞，经过消化后制成细胞悬液，使用预冷的PBS溶液洗涤三次，以去除残余的FBS和胰酶。洗涤完成后，使用血球计数器进行计数，并使用预冷的PBS调整浓度至8×106/ml，将细胞悬液分装于冻存管中，置于冰盒中，放入动物房传递窗。
2.接种：取SMMC7721肝癌细胞悬液(8×106/ml)在Balb/c裸鼠腋下进行皮下接种，接种体积为0.1ml/只。从靠近腋下的皮肤处缓慢进针，待针头从皮下延伸至腋下部位时，平稳注射细胞悬液。注射完毕后平稳抽离，旋转拔出。
3.分组：每日观察肿瘤生长情况，测量肿瘤体积(肿瘤体积＝长径×宽径×宽径/2)。待平均肿瘤体积长至40～50mm3时，根据瘤体积及裸鼠体重进行随机分组。
4.给药：分组次日进行灌胃给药干预。共分为四组：模型组、阳性药组、低剂量组、高剂量组。裸鼠的灌胃的给药体积为10ml/kg。给药方式如下
低剂量组：石油醚部位125mg/kg，一日两次；
高剂量组：石油醚部位250mg/kg，一日两次；
阳性药组：索拉菲尼20mg/kg，一日一次；
模型组：给与同等体积不含药的混悬液(5％DMSO+95％CMC-Na)。
5.观察记录：开始给药后，每三天记录一次瘤体积，每日记录体重。
6.取材：给药第18天时，测量完瘤体积后，进行取材。对裸鼠进行快速脱颈处死后，解剖取皮下移植瘤组织、心、肝、脾、肺、肾等脏器，称量并留存于-80℃。计算抑瘤率及相对脏器质量。计算公式：
抑瘤率＝(模型组瘤重-处理组瘤重)/模型组瘤重；
相对脏器质量＝脏器重量(mg)/裸鼠体重(g)。
(六)数据处理
所有正态计量资料以均数加减标准差
Figure BDA0003206998800000161
表示。α＝0.05，所在计量资料先进行正态性检验：<50例正态分布检验用ShaPiro-Wilk，≥50例用Kolmogrov-Smirnov，符合正态分布者，多组间均数的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，先行Levene Statistic方差齐性检验，方差齐采用F检验进行总均值比较、SNK(检验用于两两比较，方差不齐改用Welch检验进行总体均值比较、Dunnett T3检验进行两两比较，如多组计量资料全部或部分不服从正态分布，以平均秩和
Figure BDA0003206998800000162
和四分位数(P25、P50、P75)表示，采用Kruskal-Wallis+Mann-Whitney非参数检验；由SPSS 22.0软件完成。
三、实验结果
(一)琴叶榕石油醚部位抗肝癌细胞增殖活性
在确定以石油醚部位作为抗肝癌活性研究的有效部位后，进行了第二批次的石油醚部位提取，用于后续的抗癌活性实验中。在体外实验中，选用了HepG2、SMMC7721、Hep3B、PLC-PRF-5四种肝癌细胞测定石油醚部位的抗肝癌细胞增殖活性，以验证石油醚部位对于肝癌细胞的选择性抑制。选用了(250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125ug/ml)浓度的琴叶榕石油醚部位，对于四种细胞的各浓度下增殖抑制率如图2所示。实验结果表明，琴叶榕石油醚部位对于HepG2、SMMC7721肝癌细胞均有较好的抑制增殖的活性，且具有剂量依赖性，而对于PLC-PRF-5、Hep3B细胞的增殖抑制活性较低。琴叶榕石油醚部位对于四种肝癌细胞的半数抑制率如下表2。
在对琴叶榕石油醚部位高剂量(250μg/ml)对于四种肝癌细胞的增殖抑制率比较中，经单因素方差分析：处理因素各水平组方差齐(Levene Statistic＝2.416，P＝0.142>0.05)，五组间均值总体比较有显著性差异(F＝90.949，P＝0.000<0.05)。经SNK检验：琴叶榕石油醚部位在高剂量下对于HepG2、SMMC7721肝癌细胞的抑制率无显著性差异(P＝0.479＞0.1)，而显著高于PLC-PRF-5、Hep3B细胞的抑制率(P＜0.05)。
表3琴叶榕石油醚部位对于肝癌细胞HepG2、SMMC7721、Hep3B、PLC-PRF-5的半数抑制率(IC50)(n＝3)
Figure BDA0003206998800000171
在对琴叶榕石油醚部位对于四种肝癌细胞的IC50值比较中，经单因素方差分析：处理因素各水平组方差不齐(Levene Statistic＝8.442，P＝0.007＜0.05)，五组间均值总体比较有显著性差异(F＝14.463，P＝0.001<0.05)。经Dunnett’s T3检验：琴叶榕石油醚部位在高剂量下对于HepG2、SMMC7721肝癌细胞的IC50无显著性差异(P＝0.387＞0.1)，而显著高于PLC-PRF-5、Hep3B细胞的抑制率(0.01＜P＜0.05)。
经过数据分析，得出结论：琴叶榕石油醚部位对于HepG2、SMMC7721肝癌细胞的选择性较高，因此后续的实验将围绕这两株细胞展开。
(二)琴叶榕石油醚部位诱导肝癌细胞凋亡
对于细胞而言，凋亡是一种自发的主动的程序性死亡。在细胞凋亡的平衡时，正常情况下，细胞凋亡的进行起到清除坏变得细胞、维持组织细胞的更新等，维护着机体的稳定。而在肿瘤的发生发展中，凋亡基因往往被突变抑制，清除癌细胞的效果有限。而诱导癌细胞凋亡是抗肿瘤药物的机制研究中的一个重要方面。
实验选用了250、125、62.5、31.25、15.625μg/ml浓度的琴叶榕石油醚部位对HepG2、SMMC7721肝癌细胞作用48h，后通过流式细胞术测定对于HepG2、SMMC7721肝癌细胞的凋亡率，以确定琴叶榕石油醚部位对于HepG2、SMMC7721肝癌细胞的凋亡诱导效果，各浓度下的凋亡率如下表4所示：
表4琴叶榕石油醚部位诱导SMMC7721、HepG2肝癌细胞凋亡(n＝3)
Figure BDA0003206998800000181
经过数据分析(如图3)，琴叶榕石油醚部位各浓度对于HepG2细胞的凋亡率对比，各组数据经过单因素方差分析：处理因素各水平组方差齐(Levene Statistic＝4.608，P＝0.014＞0.05)，六组间均值总体比较有显著性差异(F＝108.514，P＝0.000<0.05)。经SNK检验：琴叶榕石油醚部位在高剂量下(62.5、125、250ug/ml)诱导的HepG2肝癌细胞凋亡率无显著性差异(P＝0.274＞0.1)，而显著高于低剂量组和正常组(0、15.625、31.25ug/ml)(0.01＜P＜0.05)。
经过数据分析(如图4)，琴叶榕石油醚部位各浓度对于SMMC7721细胞的凋亡率对比，各组数据经过单因素方差分析：处理因素各水平组方差齐(Levene Statistic＝1.504，P＝0.260＞0.05)，六组间均值总体比较有显著性差异(F＝70.823，P＝0.000<0.05)。经SNK检验：琴叶榕石油醚部位在高剂量下(125、250ug/ml)诱导的HepG2肝癌细胞凋亡率无显著性差异(P＝0.079＞0.05)，而显著高于低剂量组和正常组(0、15.625、31.25、62.5ug/ml)(0.01＜P＜0.05)。
根据结果显示(如图5)，得出结论：琴叶榕石油醚部位能够显著诱导HepG2和SMMC7721肝癌细胞发生凋亡，且对于HepG2的凋亡诱导效果优于SMMC7721细胞，这也与MTT法测定的IC50结果相对应。相较于对照组细胞(0.1％DMSO)而言，高剂量的琴叶榕石油醚部位处理组的肝癌细胞凋亡率均由正常组的5％左右增加至30％左右，且呈浓度依赖性。
(三)琴叶榕石油醚部位抑制SMMC7721肝癌细胞增殖的相关通路分析
在体外实验中对SMMC7721肝癌细胞进行琴叶榕石油醚部位给药处理，使用Western-blot检测相关蛋白的表达，结果如图6。对于不同处理组的蛋白进行灰度分析，结果如图7。
对不同浓度石油醚部位处理的SMMC7721细胞STAT3表达量的六组数据进行统计学分析。经单因素方差分析：各水平组方差齐(Levene Statistic＝1.193，P＝0.369>0.05)，五组间均值总体比较有显著性差异(F＝9.472，P＝0.001<0.05)。经SNK检验：琴叶榕石油醚部位高剂量组(250、125ug/ml)的STAT3表达量显著低于其他剂量组及正常组(0.01＜P＜0.05)。
对不同浓度石油醚部位处理的SMMC7721细胞NF-kB表达量的六组数据进行统计学分析。经单因素方差分析：各水平组方差齐(Levene Statistic＝1.174，P＝0.377>0.05)，五组间均值总体比较有显著性差异(F＝9.645，P＝0.001<0.05)。经SNK检验：琴叶榕石油醚部位高剂量组(250、125、62.5ug/ml)的NF-kB的表达量相比于其他剂量组及正常组有显著性下调(0.01＜P＜0.05)。
对不同浓度石油醚部位处理的SMMC7721细胞IKB-α表达量的六组数据进行统计学分析。经单因素方差分析：各水平组方差不齐(Levene Statistic＝3.487，P＝0.035＜0.05)，五组间均值总体比较有显著性差异(F＝10.933，P＝0.000<0.05)。经Dunnett’s T3检验：琴叶榕石油醚部位高剂量组(250、125ug/ml)的IKB-α表达量较正常组而言显著下调(P＜0.01)。
对不同浓度石油醚部位处理的SMMC7721细胞β-catenin表达量的六组数据进行统计学分析。经单因素方差分析：各水平组方差齐(Levene Statistic＝1.610，P＝0.231>0.05)，五组间均值总体比较有显著性差异(F＝11.193，P＝0.000<0.05)。经SNK检验：琴叶榕石油醚部位高剂量组(250、125、31.25ug/ml)的β-catenin的表达量相比于其他剂量组及正常组有显著性下调(0.01＜P＜0.05)。
对不同浓度石油醚部位处理的SMMC7721细胞Axin1表达量的六组数据进行统计学分析。经单因素方差分析：各水平组方差齐(Levene Statistic＝0.758，P＝0.597>0.05)，五组间均值总体比较有显著性差异(F＝4.784，P＝0.012<0.05)。经SNK检验：琴叶榕石油醚部位高剂量组(250、125ug/ml)的Axin1表达量显著低于其他剂量组及正常组(0.01＜P＜0.05)。
由以上结果得出结论，琴叶榕石油醚部位能够下调JAK/STAT通路的STAT3的表达，下调NF-kB通路中的NF-kB、IKB-α的表达，下调Wnt/β-catenin通路中β-catenin、Axin1的表达，从而抑制肝癌细胞SMMC7721的增殖。
(四)琴叶榕石油醚部位对于SMMC7721肝癌裸鼠移植瘤影响的体内研究
表5裸鼠移植瘤实验各处理组瘤重、抑瘤率及相对脏器质量(n＝6)
Figure BDA0003206998800000191
*：P＜0.05VS模型组
#：P＜0.05VS低剂量组
根据体重和肿瘤体积进行随机分组，分组后次日起开始给药。每日称量体重，绘制体重变化曲线。隔日测定记录一次瘤体积，绘制瘤体积变化曲线。结果显示，琴叶榕石油醚部位高剂量组在移植瘤发展初期就展现出较好的抑制活性，与索拉菲尼(20mg/kg)所展现的抑瘤效果相当。而在实验进行中，对于裸鼠移植瘤的外观进行观察，发现琴叶榕高剂量组和索拉菲尼组的裸鼠移植瘤的瘤体均较为完整，表现为椭圆突起状，未出现不规则扩散(图8)。在给药后第18天对裸鼠进行解剖取材，取得移植瘤组织后称重，根据各组的瘤重计算抑瘤率。各组的体重记录曲线如图9，各曲线变化基本一致。各组的肿瘤体积记录曲线如图10，与抑瘤率的数据相符。
对表4中的数据进行分析(如图11)：
在对抑瘤率的三组数据的分析中，各组数据符合正态分布(Kolmogorov-Smirnov＝0.200，0.200，0.200＞0.05)，经单因素方差分析，各组方差不齐(P＝0.006＜0.05)，各组均值间具有显著性差异(F＝51.395,P＝0.000＜0.01)，Dunnett's T3检验结果显示：索拉菲尼组与高剂量组的抑瘤率无显著性差异(P＝0.187＞0.05)，而均显著高于低剂量组(P＝0.02，0.046＜0.05)。
在对瘤重的四组数据的分析中，各组数据符合正态分布(Kolmogorov-Smirnov＝0.180，0.200，0.200，0.200＞0.05)，经单因素方差分析，各组方差齐(P＝0.393＞0.05)，各组均值间具有显著性差异(F＝46.373,P＝0.000＜0.01)，SNK检验结果显示：索拉菲尼组、低剂量、高剂量组的瘤重均显著低于模型组(P＜0.05)，索拉菲尼组瘤重显著低于高剂量组(P＜0.05)，高剂量组瘤重显著低于低剂量组(P＜0.05)。
在对肝脏相对质量的四组数据的分析中，各组数据符合正态分布(Kolmogorov-Smirnov＝0.200，0.200，0.200，0.200＞0.05)，经单因素方差分析，各组方差齐(P＝0.558＞0.05)，各组均值间具有显著性差异(F＝16.694,P＝0.000＜0.01)，SNK检验结果显示：就肝脏相对质量而言，索拉菲尼组显著低于模型组和琴叶榕低、高剂量组(P＜0.05)，低、高剂量组间无显著性差异(P＞0.05)而均显著高于模型组(P＜0.05)。
在对脾脏相对质量的四组数据的分析中，各组数据符合正态分布(Kolmogorov-Smirnov＝0.103，0.200，0.107，0.200＞0.05)，经单因素方差分析，各组方差不齐(P＝0.777＞0.05)，各组均值间具有显著性差异(F＝46.373,P＝0.038＜0.05)，SNK检验结果显示：各组的脾脏相对质量无显著性差异。
在对肺相对质量的四组数据的分析中，各组数据符合正态分布(Kolmogorov-Smirnov＝0.200，0.200，0.182，0.200＞0.05)，经单因素方差分析，各组方差不齐(P＝0.025＜0.05)，各组均值间无显著性差异(F＝0.786,P＝0.516＞0.05)，表明各组肺的相对质量无显著性差异。
在对肾脏相对质量的四组数据的分析中，各组数据符合正态分布(Kolmogorov-Smirnov＝0.180，0.200，0.113，0.160＞0.05)，经单因素方差分析，各组方差不齐(P＝0.082＞0.05)，各组均值间无显著性差异(F＝1.188,P＝0.340＞0.05)，表明各组肾脏的相对质量无显著性差异。
在对心脏相对质量的四组数据的分析中，各组数据不符合正态分布(Kolmogorov-Smirnov＝0.078，0.023＜0.05，0.200，0.200)，经单因素方差分析，经Kruskal-Wallis检验结果表明：在组别类别上，心脏的相对质量分布相同(P＝0.511＞0.01)，各组间无显著性差异。
根据上述分析结果，得出结论：在抑瘤活性方面，琴叶榕高剂量组的抑瘤率与索拉菲尼组的抑瘤率无显著性差异，均显著高于低剂量组。在根据相对脏器治疗判断药物毒性方面，各处理组的心、肺、脾、肾均无显著性差异，而索拉菲尼组肝脏相对质量下降，琴叶榕高、低剂量组肝脏质量均上调。

Claims (10)

1.琴叶榕石油醚部位在制备预防或治疗肝癌药物中的应用；所述琴叶榕石油醚部位主要包含香豆素类化合物和三萜类物质；所述琴叶榕石油醚部位的有效质量浓度为30μg/ml~250μg/ml；
所述琴叶榕石油醚部位是采用80%乙醇对琴叶榕全株干燥粗粉进行提取，再使用石油醚对醇提得到的粗提物进行萃取而得到。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述琴叶榕石油醚部位的有效质量浓度为125μg/ml~250μg/ml。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述琴叶榕石油醚部位能够显著诱导肝癌细胞发生凋亡。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肝癌细胞为HepG2或SMMC7721肝癌细胞。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肝癌细胞为HepG2肝癌细胞。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述琴叶榕石油醚部位能够抑制肝癌细胞的增殖。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述琴叶榕石油醚部位具有抑瘤作用。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述琴叶榕石油醚部位对肝的相对重量具有轻微上调的作用。
9.一种预防或治疗治疗肝癌的药物，其特征在于，由有效含量的琴叶榕石油醚部位和药学上可接受的载体制成，所述琴叶榕石油醚部位主要包含香豆素类化合物和三萜类物质；所述琴叶榕石油醚部位的有效质量浓度为30μg/ml~250μg/ml；所述琴叶榕石油醚部位是采用80%乙醇对琴叶榕全株干燥粗粉进行提取，再使用石油醚对醇提得到的粗提物进行萃取而得到。
10.根据权利要求9所述的一种预防或治疗治疗肝癌的药物，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊、粉剂或颗粒剂。
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