TW200819139A - Novel analogs of vasoactive intestinal peptide - Google Patents

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200819139 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種式[X-(SEQ ID NO: 2)-Υ]之VPAC-2受 體激動劑，其係藉由（例如）吸入法投藥用以治療肺梗阻病 症（例如COPD)。 【先前技術】 激脈腸肽（VIP)最初係自豬腸内發現、分離及純化的。 [US 3,879,371]。該肽具有二十八個（28)胺基酸並具有與胰 泌素及高血糖素之廣泛同源性。[Carlcluist等人，Horm. Metab· Res·，14,28-29 (1982)]。VIP之胺基酸序列如下： His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Ar g-Lys-Gin-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-A sn-Ser-Ile-

Leu-Asn (SEQ ID NO: 1) VIP已知可在胃腸道及循環系統各處展示廣範圍的生物 活性。根據其與胃腸道荷爾蒙的相似性，已發現VIP可刺 激胰及膽囊的分泌、肝糖原積累病、騰高血糖素及胰島素 的分泌，並可激活胰碳酸氫鹽釋放。 已知具有兩種類型的VIP受體，並已自人類、大鼠、小 鼠、雞、魚及蛙中將其克隆出來。當前，其經鑑別為 VPAC1及VPAC2並能以可比親和力對天然VIP進行反應。 VPAC2受體mRNA據發現存於人類呼吸道（包括氣管及支氣 管）上皮細胞、腺體及免疫細胞、肺泡壁及巨噬細胞中。 [Groneberg等人，Lab· Invest· 81:749-755 (2001)及 Laburthe 122234.doc 200819139 等人 RecePtors and Channels 8:137-153 (2002)]。 藉由免疫測定法已將包含VIp之神經元定位於内分泌系 統及外分泌系統、腸及平滑肌細胞中。據發現，vIp係一 種神經效應$ ’其可引起多種荷爾蒙（包括促乳素、甲狀 腺素、及胰島素及胰高血糖素）之釋放。亦已發現VIp可於 活體内及活體外刺激腎素自腎臟釋放。已經發現，VIP存 在於多種動物及人類氣道中的神經及神經末稍中。νιρ之 心血管及支氣管肺效應令人感興趣，因為人們已經發現 VIP係強效血管舒張劑及有效的平滑肌弛緩劑，可作用於 外周的、肺的、及冠狀血管床。據發現，VIP對大腦血管 具有舒血官作用。活體外研究已經顯示，激脈腸肽（外源 性地施用於孕育血管）引發了血管舒張，表明VIP作為大腦 血管舒張之一可能遞質。在眼睛中，VIp已顯示係有效的 血管舒張劑。 VIP可此對於免疫糸統具有調節作用，例如，νιρ可調變 淋巴細胞的增殖及遷移。已證明，天然VIp通過影響IFN/ 合成來抑制經LPS刺激的巨噬細胞中之IL-12產生。VIP可 在小鼠巨噬細胞中抑制TGF-βΙ產生並可在人類單核細胞中 經由 NFkB 來抑制 IL-8產生。[Sun等人，j· Neuroimmun〇1 107:88-99 (2000)及 Delgado &Ganea，Bi〇chem.BiophyS·

Res. Commun. 302:275-283 (2003)] 〇 由於據發現VIP可放鬆平滑肌並且其通常存在於氣道組 織中，如上文所述，已經猜想，VIP可能係支氣管平滑肌 鬆驰之内源性調介物。已經顯示，取自哮喘病患者之組織 122234.doc 200819139 與取自正常患者之組織相比較不含免疫反應性VIP。此可 能指示與哮喘病有關之VIP或激脈腸肽能神經纖維之缺 失。在活體外及活體内試驗中已經顯示，VIP可放鬆氣管 平滑肌並保護性抵抗支氣管收縮劑（例如組胺及前列腺素 ha)。當靜脈内給藥時’ VIP已據發現可抵抗支氣管收縮 劑（例如組胺、前列腺素Fk、白細胞三烯、血小板活化因 子、以及抗原）誘導的支氣管收縮。亦已發現，VIP在活體 外可抑制人類氣道組織中的黏液分泌活動。 呼吸道病症具有多種多樣的原因，但共同具有多種病理 生理的及臨床的特點。該等病症之特徵係氣道梗阻引起的 氣流受限、氣道壁增厚、炎症或間質組織之彈性損失。併 發病狀包括黏液分泌過多、氣道高反應性及氣體交換異 常，此可導致咳嗷、痰產生、喘鳴及呼吸困難。普通呼吸 道病症包括：哮喘病、慢性阻塞性肺病（C〇pD)、慢性支 氣官炎、肺氣腫、及肺動脈高血壓症。[Mayer等人，

Respiration Physiol. 128:3-1 1 (2001)]。 COPD係一組藉由肺氣道梗阻定義的慢性病況。c〇pD包 括兩類主要的呼吸疾病，為慢性（梗阻性）支氣管炎及肺氣 腫。兩種疾病皆與呼吸困難及氣喘有關。（：〇1>]0可能伴有 肺動脈高血壓症。長期吸煙係c〇pD之主要的危險因子。 通常認為，與C0PD有關之氣道受限係不可逆的。 陵性支氣官炎係進行性的發炎疾病。與此疾病相關現象 係氣道中黏液產生量增加及細菌感染發生率之增大。此慢 性發炎性病況可引起會導致充血及呼吸困難加重之支氣管 122234.doc 200819139 壁之增厚。 肺氣腫因損傷肺組織（擴大空隙及損失肺泡表面積）而係 COPDi ,曰在病因。肺損傷係藉由使肺内的肺泡變弱及破 碎而引起。肺組織之天然彈性亦會損失，導致過度牵張及 破裂。小支氣管可受到破壞，此可導致其塌陷並阻塞氣 流，導致呼吸氣體不足。 COPD(以其κ質上醫學含義）總伴隨有支氣管梗阻。因 ζΛ 此，C〇PD之最通常症狀包括呼吸急促、久咳、胸部緊迫 感呼及費力、黏液產生量增多及頻繁地清喉嘴。患者不 月匕進行其普通日常活動。慢性支氣管炎及肺氣腫有可能獨 立發展，但大多數C〇PD患者具有該等病症之組合。 肺實質中結締組織（尤其彈性蛋白）之損壞可導致在許多 氣道病症中出現的彈性損失。在肺氣腫及C〇PD中已經顯 不出彈性蛋白降解跡象。據認為，中性白細胞彈性蛋白酶 係引起彈性蛋白破壞的主要蛋白酶。[Barnes等人，Eur. t / Respir· J· 22:672-688 (2003)]。已經顯示，中性白細胞彈 性蛋白酶之產生在C0PD患者肺中係增強的。[Higashim〇t() 等人 ’ Respiration 72:629-635 (2005)] 〇 因VIP具有令人感興趣的潛在臨床可用的生物學活性， 該肽已經係數種已報告以增強此分子之一或多種特性為目 的之合成程序的目標。Takeyama等人已經報告一具有一取 代8位天冬胺酸之麩胺酸的νΐρ類似物。此化合物據發現具 有更小有效性。[Chem· Pharm. Bull. 28:2265-2269 (1980)]。 Wendlberger等人已經揭示一具有一在17位取代 122234.doc 200819139 甲硫胺酸之正白胺酸的VIP類似物之製備。[Peptide Proc. 16th Eur. pept· Symp·，290-295 (1980)]。據發現，該肽與 天然VIP係等效的，其具有自肝細胞膜標本中置換經放射 性碘化的VIP之能力。Watts及Wooton已經報告了一系列的 直鏈及環形VIP片段，包含6至12個來自天然序列之殘基。 [歐洲專利第£? 184,309號、第丑？ 325,〇44號；美國專利第 US 4,737,487號、第 US 4,866,039號]。Turner等人已經報 告’片段 VIP( 10-28)係 VIP[Peptides 7:849-854 (1986)]之 拮抗劑。亦已經報告，經取代類似物[4-Cl-D-Phe6，Leu17]_ VIP可與VIP受體結合，並可對抗VIP之活性[Pandol等人， Gastrointest. Liver Physiol. 13 :G553-G557 (1986)]。Gozes 等人已經報告’類似物[[Lys^Pro'Arg^Arg^Pro^Tyr6]-VIP係在神經膠質細胞上與其受體結合的VIP競爭性抑制 劑。[Endocrinology 125:2945-2949 (1989)]。Robberecht等 人已經報告若干在天然VIP之N末端中具有經取代D殘基的 VIP類似物。[Peptides 9:339-345 (1988)]。所有該等類似 物與天然VIP相比較皆在c-AMP激活作用中以更小堅固度 與VIP受體結合’並顯示更小活性。Tachibana及Ito已經報 告，前體分子之若干VIP類似物。[於下面文獻中：peptide

Chem. Shiba及 Sakakibara(編輯），pr〇t. Res. Foundation， 198 8，481-48 6，日本專利第jp 1083012號，美國專利第US 4,822,774號]。該等化合物顯示係較VIP高出1至3倍有效性 的支氣管擴張劑並具有一高出1至2倍水平的降血壓活性。 Musso等人亦已經報告了在6-7、9-13、15-1 7及19-28位 122234.doc •10- 200819139 上具有取代基的VIP類似物。[Biochem 27:8174-8181 (1988);美國專利第US 4,835,252號]。據發現，該等化合 物在與VIP受體之結合中及在生物學反應中與天然VIP比較 係係等效的或具較小有效性。Bartfai等人已經報告了一系 列經多取代的[Leu17]-VIP類似物。[WO 89/05857]。

Gourlet等人已經報告了一具有對VIP受體之親和力的 [Arg16]-VIP衍生物[BBA 1314:267-273 (1996)]。Onoue 等 人已經報告了 一系列VIP精胺酸衍生物及截短物[〇noue等 〇 人，Life Sci. 74:1465-77 (2004)及 Ohmori 等人，Regul. Pept. 123:201-207 (2004)]。亦有人報告了一系列聚丙胺酸 衍生物[Igarashi等人，J. Pharm. Exper. Ther. 303:445_460 (2002)及 Igarashi 等人，J. Pharm. Exper. Ther. 3 15:370-81 (2005)] 〇 在美國專利第US20050203009號中闡述了具有選擇性 VPAC1激動劑活性之VIP類似物。VIP類似物及C末端聚乙 / 二醇化的衍生物已據報告具有治療代謝性疾病（包括糖尿 病）之功用[例如W02006042152]。具有VPAC2激動劑活性 之肽已被鑑別出來，並包括PACAP及VIP類似物[Gourlet等 ， 人，Peptides 18:403-408 ; Xia 等人，J. Pharmacol. Exp.

Ther· 281:629-633 (1997)]。已經報告，VIP環狀類似物具 有增強的穩定性及活性[Bolin等人，Biopolymers 37:57_66 (1995)，美國專利第 US 5,677,419號]。 在人類中，當藉由靜脈輸注投與哮喘患者時。已經顯 示，VIP可引起最高呼氣流速之增加並可預防組胺誘導的 122234.doc -11 - 200819139 支氣管擴張。[Morice及 Sever，Peptides 7:279-280 (1986); Morice等人，The Lancet，II 1225-1227 (1983)]。然而，藉 由此靜脈輸注觀察到的肺部結果伴有心血管副作用，最顯 著的是低血壓及心動過速以及面紅。當與靜脈内劑量給與 時，其未引起心血管影響，VIP未能改變比氣道傳導率。 [Palmer等人，Thorax 41:663-666 (1986)]。將活性缺乏解 釋為係由於所投與之低劑量，並可能由於該化合物之快速 降解。當藉助氣溶膠投與人類時，VIP對於防止組胺誘導 的支氣管收縮僅部分有效。[Altieri等人，Pharmacologist 25:123 (1983)]。據發現，當藉由吸入法投與人類時，VIP 對基礎氣道參數不具有顯著影響，但確實具有抗組胺誘導 之支氣管收縮的保護作用。[Barnes及Dixon，Am· Rev. Respir. Dis·，130:162-166 (1984)]。已經報告，當藉由氣溶 膠投與時，VIP顯示不存在與支氣管擴張聯合的心動過速 或降血壓效應。[Said等人，於以下文獻中：Vasoactive Intestinal Peptide，Said ]ed·)，Raven Press，New York， 1928, 185-191]。 已經報告，在輕度哮喘症中，一 VIP衍生物（RO 25-1 553)在臨床前及臨床上皆具有作為支氣管擴張劑之效力 [Kallstrom及 Waldeck，Eur. J. Pharm. 430:335-40 (2001)及 Linden等人，Thorax 58:217-21 (2003)]。已經報告，天然 VIP具有治療COPD、肺動脈高血壓症及其他氣道病症之功 用[W003061680、WO0243746及 W02005014030]。 然而，當前需要新穎的具有對VPAC2受體之選擇性的激 122234.doc -12· 200819139 脈腸肽類似物，其同時應具有較現存VPAC激動劑相等或 更佳之效力、藥代動力學特性及藥理性質。更恰當而言， 當前需要具有較彼等先前可用者更大之活性期程的化合 物。 【發明内容】 本發明涵蓋式（I)之VPAC-2受體激動劑： X-His_R2-Asp-Ala_R5-Phe-Thr_Glu-Asn-Tyr-Thr_Lys-Leu-Arg-Lys-R^-Nle-R18-Ala-Lys-Lys21-Tyr-Leu-Asn-Asp25-

Leu_R27-R28-Gly-Gly-Thr_Y [X-(SEQ ID NO: 2)-Y] 其中 X 為組胺酸N末端胺基之氫，其可視情況藉由可水解胺 基保護基團置換，最佳係藉由乙醯基置換， Y 為蘇胺酸C末端敌基上的經基，其可視情況經可水解 的羧基保護基團置換，最佳藉由NH2置換， 下劃線殘基表明該片段中第一個胺基酸（Lys21)與最後一個 胺基酸（Asp25)之側鏈至側鏈的共價鏈接， R2 為 Ser或 Ala， R5 為 Thr、Ser、Asp、Gin、Pro 或 CaMeVa卜 R16 為 Gin、Ala或 Arg， R18 為 Ala、Lys 或 Glu， R27 為 Lys 或 Leu，只是當 R5 為 CaMeVal 且 R16 為 Arg 時，r2? 必須為Lys， R28 為 Lys 或 Asn， 122234.doc 13 200819139 或其醫藥上可接受之鹽。 本發明化合物係VPAC2受體之活性激動劑並對於人嗜中 性細胞彈性蛋白酶具有增強的穩定性。因此，該等化合 物’作為對人類肺中存在的彈性蛋白酶之作用具有改良抗 性的天然VIP選擇性穩定類似物，應可用於治療氣道病 症，包括COPD。 【實施方式】 本文所提及之所有肽序列皆根據通常規約書繕寫，因 此’除另外指明，否則N末端胺基酸位於左側且C末端胺 基酸位於右側。介於兩胺基酸殘基之間的短線表示肽鍵。 T有下劃線之胺基酸區段表示該區段中最前面胺基酸與最 後面胺基酸之側鏈與側鏈共價鏈接。通常此係醯胺鍵。其 中忒胺基酸具有同分異構形式，除非另外明確指明，其代 表L型胺基酸。為便於闡述本發明，使用了多種胺基酸的 4用及非4用縮寫。該等縮寫為彼等業内熟練的技術人員 所熟悉，但為清楚起見將其列示在下方··

Asp—D—天冬胺酸；Aia=A=丙胺酸；精胺酸； Asn=N=天門冬醯胺；G1y=G=甘胺酸；Glu=E=麩胺酸； Gin Q-麵月女酿胺，His=H=組胺酸；iie=卜異白胺酸； Leu=L=白胺酸；Lys=K=離胺酸；Met=M=甲硫胺酸； MeVal=MeV= CaMeVal ; Nle=正亮胺酸；Phe=F=苯丙胺 酸，Pro=P=脯胺酸；Ser=s=絲胺酸；丁匕二丁二蘇胺酸； TrP W—色fe酸，Tyr=Y=酿胺酸，·及Val=V=結頁胺酸。 關於術語”可水解胺基保護基團，，及"可水解羧基保護基 122234.doc -14- 200819139 可使用任何可藉由水解去除的習用保

團係下面化學式之醯基基團 團Π ’根據本發明， 護

其中X3為低碳㈣基或_代低碳數燒基。對於該等保護基 團’彼等其巾燒基或幽代_Ci_c3烧基者尤其較 仏較佳羧基保護基團係低碳數烷基酯類、NH2及低碳數 烷基醯胺類， 其中CrC3烷基酯類、nh2& Ci-Cg烷基醯胺 類尤其較佳。 亦為便利起見’且對於業内熟練的技術人員而言易於理 解用以下縮寫或標魂、來表示本發明中所用之部分、試劑 及諸如此類：Nle :正亮胺酸；CocMeVal : Coc_甲基纈 胺酸；MeVal : Coc_甲基-L-結頁胺酸；CH2C12 :二氯甲烷； Ac ·乙酿基；Ac2〇 :乙酸酐；ac〇H :乙酸；ACN :乙 腈；DMAc :二甲基乙醯胺；DMF :二甲基甲醯胺； DIPEA : N，N-二異丙基乙胺；TFA :三氟乙酸；HOBT : N-羥基苯并三唑；DIC : N，N，-二異丙基碳化二亞胺； BOP :苯并三唑-1-基氧基-三·（二曱胺基）磷鏽-六氟磷酸 鹽；HBTU : 2·(1Η-苯并三唑_1-基>1，1，3,3-四甲基脲鏽六 氟磷酸；ΝΜΡ : 1-甲基-2-吡咯啶酮；MALDI-TOF :基質 輔助的激光解吸離子化-飛行時間；FAB-MS :快速原子轟 擊質譜測定法；ES_MS :電子噴霧質譜測定法；RT :室 122234.doc -15 - 200819139 溫。 本文所用術語，’烧基”指具支鍵的或不具支鍵的、環狀的 或非環狀的、飽和的或不飽和的（例如烯基或炔基）烴基基 團’其可經取代或未經取代。當為環狀時，烷基較佳為q 至C】2、更佳係匚5至<：1()、更佳係C5至C7烷基。當為非環狀 時，烷基較佳為CiSCM、更佳係(：！至（：6、更佳係甲基、 乙基、丙基（正丙基或異丙基）、丁基（正丁基、異丁基或第 二丁基）或戊基（包括正戊基及異戊基）、更佳係甲基。 本文所用術語，，低碳數烷基”指具支鏈的或不具支鏈的、 裱狀的或非環狀的、飽和的或不飽和的（例如烯基或炔基） 炝基基團，其中該環狀的低碳數烷基係C5、匕或心烷基， 且其中該非環狀低碳數烷基係匕、C2、（^或山烷基，且較 佳係選自甲基、乙基、丙基（正丙基或異丙基）或丁基（正丁 基、異丁基或第三丁基）。 本文所用術語”醯基"指經由一羰基結合的視情況經取代 的烧基、環院基、雜環基、芳基或雜芳基，並包括諸如乙 醯基、丙醯基、苯甲醯基、3“㈣基幾基、2嗎琳基幾 基、4_經基丁醯基、4-氟苯甲醯基、2-萘甲醯基、2_苯基 乙醯基、2-甲氧基乙醯基及諸如此類等基團。 本文所用術sf芳基"指經取代或未經取代的碳環芳香族 基團，例如苯基或萘基，或—包含—或多個、較佳包含一 個雜原子之經取代或未經取代的雜芳香族基團。 烷基及芳基基團可經取代或未經取代。當經取代時，通 常存在1至3個取代基、較佳存在1個取代基。取代基可包 122234.doc 200819139 括：含碳基團，例如烷基、芳基、芳烷基（例如經取代及 未經取代的苯基、經取代及未經取代的节基）；_素原子 及含i素基團，例如函代烷基（例如三氟甲基含氧基 團’例如醇類（例如羥基、羥烷基、芳基（羥基）烷基）、峻 類（例如烷氧基、芳氧基、烷氧基烷基、芳氧基烷基）、醛 類（例如甲醛）、酮類（例如烷基羰基、烷基羰基烷基、芳基 幾基、芳烷基羰基、芳基羰基烷基）、酸類（例如羧基、幾 基烧基）、諸如酯類等酸衍生物類（例如烷氧羰基、烷氧幾 基烧基、烷基羰氧基、烷羰氧基烷基）、醯胺類（例如胺基 羰基、單或二烷基胺基羰基、胺基羰基烷基、單或二烷胺 基羰基烷基、芳基胺基羰基）、胺基甲酸酯類（例如烷氧幾 基胺基、芳氧羰胺基、胺基羰氧基、單或二烷基胺基羰氧 基、芳基胺基羰氧基）及脲類（例如單或二烷基胺基羰胺基 或芳基胺基羰胺基）；諸如胺等含氮基團（例如胺基、單或 二烷胺基、胺基烷基、單或二烷基胺基烷基）、疊氮化 物、腈類（例如氰基、氰基烷基）、硝基；含硫基團，例如 硫醇類、硫鱗類、亞礙類及礙類（例如烧硫基、烧基亞石黃 醯基、烷基磺醯基、烷硫基烷基、烷基亞磺醯基烷基、燒 基磺醯基烷基、芳硫基、芳基亞磺醯基、芳基磺醯基、芳 硫基烧基、芳基亞磺醯基烧基、芳基磺醢基院基）；及包 含一或多個、較佳包含一個雜原子之雜環基團。 本文所用術語π鹵素”指氟、氯、溴或峨基團，較佳係 氣、氣或漠，且更佳係氟或氯。 π醫藥上可接受之鹽”指習用酸加成鹽或鹼加成鹽，其應 122234.doc -17- 200819139 保持式I化合物之生物學有效性及特性且係自適宜的無毒 有機或無機酸或有機或無機驗形成。示例酸加成鹽包括衍 生自無機酸（例如氫氯酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、胺基 磺酸、磷酸及硝酸）之彼等及衍生自有機酸（例如對甲基苯 石黃酸、水揚酸、曱烧續酸、草酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果 酸、乳酸、富馬酸）之彼等及諸如此類。示例鹼加成鹽包 括衍生自銨、鉀、鈉及四級銨氫氧化物（例如氫氧化四甲 銨）之彼等。將醫藥化合物化學改質成鹽係熟知技術，通 常將其用於改良包括物理及化學穩定性在内之特性（例如 化合物之吸濕性、流動性或溶解性）的嘗試中。參見（例 如）Ansel 等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug

Delivery Systems (第 6版，1995)於第 196 頁及 1456-1457 頁 中。 •醫藥上可接受之自旨”指具有魏基之照慣例經酸化的式1化 合物，此酯類可保保持式I化合物之生物學有效性及特性 並可在活體内（在有機體内）解離成相應的活性羧酸。可在 活體内（在有機體内）解離成相應羧酸之酯基團之實例係其 中經解離之氫係經低碳數烷基置換（例如經雜環、環烷基 等置換）之彼等。經取代低碳數烷基酯類之實例係其中低 碳數烧基係經吼u各咬、六氫。比唆、嗎琳、N-甲基旅嗪等取 代之彼等。該可在活體内解離之基團可係（例如）乙基、嗎 啉基乙基及二乙胺乙基。結合本發明，亦考慮-CONH2係 酯（因-NH2可在活體内解離並經一羥基置換）以形成相應的 羧酸。 122234.doc -18· 200819139 對於與用於遞送醫藥化合物之酯的實例及用途有關的其 他 4口 息參見 Design of pr〇drugs，Bundgaard(編輯）(Elsevier， 1985)亦參見 Ansel 專人 ’ Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (第 6版，1995)，第 108-109 頁 ’ Krogsgaard-Larsen等人 ’ Textbook of Drug Design and Development (第 2版，1996)第 152至 191 頁。 在本發明一實施例中，提供一種式j化合物，其中χ為組 胺酸Ν末端胺基之氫或其中該氫係經乙醯基置換。在本發 明另一實施例中，提供一種式Ϊ化合物，其中χ為組胺酸!^ 末端胺基之氫。 在本發明一實施例中，提供一種式j化合物，其中γ為蘇 胺酸C末端羧基之羥基或其中該羥基係經1^出置換。在本 發明另—實施例中，提供一種式Ϊ化合物，其巾γ為蘇胺酸 之c末端羧基之羥基。 在本發明一實施例中，提供一種其中尺2為Ser之式J化合 物。在本發明另一實施例中，提供一種其中尺2為Ala之式工 化合物。 在本發明一實施例中，提供—種其中汉5為丁心、Ser或 CaMeVal之式ί化合物。在本發明另一實施例中，提供一 種其中R5為Thr之式I化合物。在本發明另—實施例中提 供-種其中R、Ser之式！化合物。在本發明另—實施例 中，提供一種其中R5為CaMeVal之式I化合物。 在本發明-實施例中，提供_種其中Rl6為Gin或心之 式I化合物。在本發明另-實施例中，提供_種其中r16為 122234.doc -19- 200819139

Gin之式I化合物。在本發明另一每 不知月另只施例中，提供一種其中 R為Arg之式I化合物。 在本發明-實施例中，提供一種其中r18為施之式ι化合 物。在本發明另一實施例中，提供一種其中Ri8為^之式t 化合物。在本發明另—實施例中，提供—種其中r18為giu 之式I化合物。 在本發明一實施例中，提供一種其中r27為Lys之式】化合 物0

在本發明一實施例中，提供一種其中R28為Lys之式I化合 物0 在本發明一實施例中，提供一種式j化合物，其中 X為組胺酸N末端之氫或該氫經乙醯基置換， Y為蘇胺酸C末端羧基之羥基或該羥基係經NH2置換， R2 為 Ser或 Ala， R5 為 Thr、Ser或 CocMeVal， R16 為 Gin或 Arg， R18 為 Ala、Lys 或 Glu， R 為 Lys4Leu ’ 只是當 R5 為 CocMeVal且 R16為 Arg 時，R27 必須為Lys，及 R28 為 Lys。 在本發明另一實施例中，提供一種式j化合物，其中 X 為組胺酸N末端之氫或該氫係經乙醯基置換， Y 為蘇胺酸C末端羧基之羥基或該羥基係經NH2置換， R2 為 Ser或 Ala， 122234.doc -20 - 200819139 R5 為 Thr、Ser或 CaMeVa卜 R16 為 Gin 或 Arg， R18 為 Ala、Lys 或 Glu， R27為Lys或Leu，只是當R5為c a MeVal且R16為Arg時， R27必須為Lys，及 R28 為 Lys。 在本發明另一實施例中，提供一種式I化合物，其中 X 為組胺酸N末端之氫或該氫係經乙醯基置換， γ 為蘇胺酸c末端羧基之羥基或該羥基係經νη2置換 R2 為 Ser或 Ala， R5 為 Ser或 CocMeVal， R16 為 Gin， R18 為 Ala， R27 為 Lys 或 Leu，且 R28 為 Lys 〇 u藉助用於形成一介於胺基酸之間之肽鍵的任何已知習用 裝私可谷易地合成本發明代表性化合物。此等習用製程 包括（例如）任何容許在已對其㈣及其他反應性基團加以

保4的胺基^或其殘基之游離α胺基與已對其胺基或其他 反應性基團加以保護的另-胺基酸或其殘基之游離的首要 羧基之間發生縮合的溶液相製程。 此等口成本發明新穎化合物之習用製程包括(例如)任何 固相狀合成方法。户+ 在此一方法中，新穎化合物之合成可藉 由根據固相法眉目,丨立A ^ ，、、母_人一種依序將期望胺基酸殘基納入生 122234.doc -21 . 200819139 長肽鏈中而實施。此等方法揭示於GWW^Merrinelc^J·

Amer· Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963) ; Barany等人，The Peptides, Analysis，Synthesis and Biology，第 2卷，Gross 及 Meienhofer，（編輯）Academic Press 1-284 (1980)，其以 引用的方式併入本文中。肽合成可手工實施或利用自動化 儀器操作來實施。亦可利用微波辅助合成。 對於肽化學合成而言’通常用適宜保護基團對各種胺基 酸部分之反應性側鏈基團加以保護，該等適宜保護基團將 防止彼位點處發生化學反應直至保護基團最終移除。亦常 見的是’當胺基酸或片段在羧基處反應時對彼實體上之α 胺基加以保護，隨後選擇性地移除胺基保護基團，允許 在彼位點發生隨後的反應。儘管關於固相合成方法已經揭 示了具體的保護基團’但應注意，可藉由通常在溶液相合 成中用於各胺基酸之保護基團來保護各胺基酸。 α胺基可藉由選自下列之適宜保護基團加以保護：芳族 胺基甲酸酯型保護基團，例如烯丙氧基羰基、苄氧羰基 (Ζ)及經取代苄氧羰基，例如對氯苄氧羰基、對硝基苄氧 幾基、對溴苄氧羰基、對聯苯基異丙氧羰基、9_ g基甲氧 罗厌基（Fmoc)及對甲氧基苄氧羰基（M〇z);脂族胺基甲酸酉旨 型保護基團，例如第三丁氧羰基（Boc)、二異丙基甲氧魏 基、異丙氧羰基、及烯丙氧羰基。本文中，對於胺基保護 基團而言Fmoc最佳。 脈基可藉由選自下列之適宜保護基團加以保護：硝基、 對甲苯磺醯（Tos)、（Z，）2,2,5,7,8-五甲基苯并二氫〇比喃_6_ 122234.doc -22- 200819139 磺醯基（Pmc) ; 4-曱氧基-2,3,6，-三甲基苯磺醯基（Mtr)。對 於精胺酸（Arg)而言，Pmc及Mtr最佳。· ε-胺基可藉由選自2-氯-苄氧幾基（2-C1-Z)、2-漠-节氧幾 基（2-Br-Z)及Boc之適宜保護基團加以保護。對於（Lys)而 言，B 〇 c最佳。 羥基（OH)可藉由選自苄基（Bzl)、2,6_二氯苯甲基（2,6-diCl-Bzl)及第三丁基〇Βιι)之適宜保護基團加以保護。對 於（Tyr)、（Ser)及（Thr)而言，tBu 最佳。 β-及γ-醯胺基團可藉由選自4-甲基三苯甲基（Mtt)、 2,4,6-三甲氧基苄基（Tm〇b)、4,4-二甲氧基二苯甲基/雙_(4_ 甲氧苯基）-曱基（Dod)及三苯甲基（Trt)之適宜保護基團加以 保護。對於（Asn)及（Gin)而言，Trt最佳。 °引°朵基可藉由選自甲醯基（For)、三甲苯基-2-磺醯基 (Mts)及Boc之適宜保護基團加以保護。對於（Trp)而言， Boc最佳。 β-及γ-幾基可藉由選自第三丁基（tBu)及2-苯基異丙酯 (2Pip)之適宜保護基團加以保護。對於（Glu)而言，tBu最 佳，而對於（Asp)而言，2pip最佳。 嗦°坐基可藉由選自苄基（Bzl)、Boc及三苯甲基（Trt)之適 宜保濩基團加以保護。對於（His)而言，Trt最佳。 所有溶劑、異丙醇（iPrOH)、二氣甲烷（CH2C12)、DMF及 白講自 Fisher、jt Baker 或 Burdick & Jackson，且未經 進 v蒸館即使用。TFA購自Halocarbon、Aldrich或 Fluka ’且未經進一步純化即使用。 122234.doc •23 - 200819139 DIC及DIPEA購自Fluka或Aldrich，且未經進一步純化即 使用。HOBT、二甲硫醚（DMS)及1，2-乙二硫醇（EDT)購自 Aldrich、Sigma Chemical公司或 Anaspec，且未經進一步 純化即使用。經保護胺基酸一般具有L構型，且係購自 Bachem、Advanced ChemTech、CEM 或 Neosystem。該等 試劑之純度係在使用前藉由薄層層析法、NMR及熔點進行 確定。二苯甲基胺樹脂（BHA)係一得自Bachem, Anaspec or Advanced Chemtech之苯乙浠-1%二乙稀基苯的共聚物 (100-200或200-400網目）。該等樹脂之總含氮量通常介於 0.3至1.2 meq/克之間。 高效液相層析法（HPLC)係在一由Constametric I及III幫 浦、一 Gradient Master溶劑程序控制器及混合器及一 Spectromonitor III可變波長UV檢測器組成的LDC儀器上實 施。分析型HPLC係使用Pursuit C18管柱（4.5x50毫米）以反 相模式實施。製備型HPLC分離係在Pursuit管柱（50x250毫 米）上運行。 在一較佳實施例中，儘管如上文所提及可使用業内已知 其他等效化學合成法，肽係藉由Merrifield (J. Amer. Chem. Soc· 85:2149 (1963))—般闡述之方法利用固相合成 法製得。固相合成係藉由將一經保護α胺基酸偶合至一適 宜樹脂而自該肽之C末端開始。此一起始材料可藉由藉助 一酯鏈接將一 α胺基經保護的胺基酸附接至對苄氧基苄醇 (Wang)樹脂上，或藉助一介於Fmoc·連接子（例如對-((R， S)-a-(l-(9H-芴-9-基）-甲氧基甲醯胺基）-2,4-二甲基氧基苄 122234.doc -24- 200819139 基）_笨氧基乙酸（Rink連接子）間之醯胺鍵附接至二苯甲胺 (BHA)樹脂上。羥曱基樹脂之製法為業内人士所熟知。 Fmoc-連接體-BHA樹脂支承可商業購得，且通常當所合成 之期望肽在C末端具有一未經取代醯胺時使用。 通常’該等胺基酸或模擬物係利用胺基酸或模擬物之經 Fmoc保護形式用1-5當量的胺基酸及一適合的偶合反應試 劑偶合至该Fmoc-連接體-BHA樹脂上。偶合後，對該樹脂 實施沖洗並在真空中實施乾燥。該胺基酸於該樹脂上之負 載量可藉由對一分量之Fmoc-胺基酸樹脂進行胺基酸分析 加以測定或藉助UV分析測定Fmoc基團而加以測定。任何 未反應的胺基皆可藉由用存於二氣曱烷或DMF中之乙酸酐 及二異丙基乙胺對樹脂加以處理而實施加帽。 使該等樹脂進行數個重複循環以依序添加胺基酸。在鹼 性條件下去除α胺基Fm〇c保護基團。溶於DMF之六氫吡 咬、哌嗪或嗎啉（20-40% v/v)可用於此目的。較佳地，通 常使用4〇%溶於DMF之六氫吡唆。 去除α胺基保護基團後’使隨後經保護的胺基酸以期望 -人序逐步偶合以獲得一中間體，經保護的肽-樹脂。用於 在肽之固相合成中偶合胺基酸之激活試劑為業内人士所熟 知。舉例而言，用於此合成法之適宜試劑為Bop、溴_三_ °比σ各σ定基-麟鏽六就鱗酸鹽（PyBroP)、HBTU及DIC。此處 較佳者為HBTU及DIC。可使用由Barany及Merrifield闡述 (於：The Peptides，第 2卷，Meienhofer(編輯），Academic

Press，1979，第1至284頁）之其他激活劑。為使合成循環達 122234.doc -25- 200819139 最佳化，可向偶合混合物中添加多種試劑，例如HOBT、 N-羥基琥珀醯亞胺（HOSu)及3,4-二氫-3-羥基-4-氧代-1，2,3· 苯并三嗪（ΗΟΟΒΤ)。此處較佳者為HOBT。 一典型合成循環方案如下： 方案1 步驟 試劑 時間 1 DMF 2x30 秒 2 20%六氫吡啶/DMF 1分鐘 3 20%六氫σ比唆/DMF 15分鐘 4 DMF 2x30 秒 5 iPrOH 2x30 秒 6 DMF 3x30 秒 7 偶合 60分鐘-18小時 8 DMF 2x30 秒 9 iPrOH 1x30 秒 10 DMF 1x30 秒 11 CH2C12 2x30 秒

用於所有沖洗及偶合之溶劑皆經量測至10_20毫升/克樹 脂之體積。合成中之偶合反應係藉由Kaiser茚三酮試驗進 行監測以確定完成程度[Kaiser等人，Anal.Biochem· 34:595-598 (1970)]。所有未完全偶合的反應部分皆用新製 備的經活化胺基酸實施再偶合或藉由用如上文所述乙酸酐 處理該肽樹脂而實施加帽。在真空中對完全組合的肽樹脂 實施若干小時乾燥。 肽合成可利用一 Applied Biosystem 433A合成儀（Foster City，CA)實施，使用進行樹脂取樣或不進行樹脂取樣之 FastMoc 0.25毫莫耳循環，41毫升反應器。用2.1克NMP、 122234.doc -26- 200819139 2 克 0.45 M HOBT/HBTU(於 DMF 中）及 2 M DIEA對 Fmoc-胺 基酸樹脂實施溶解，然後轉移至反應容器中。該基本的 FastMoc偶合反應循環由模組nBADEIFD，n表示，其中每一 字母代表一個模組。例如：B代表利用20%六氫吡啶/NMP 之Fmoc脫保護作用及相關洗滌及30分鐘讀數（UV監測或傳 導性）模組；A代表於反應器中利用0.45 M HBTU/HOBT及 2.0 M DIEA之胺基酸活化及利用Ν2鼓泡之混合模組；D代 表於反應容器中樹脂之ΝΜΡ洗滌模組；Ε代表活化的胺基 酸向用於偶合反應之反應容器轉移之模塊；I代表反應容 器斷續渦旋之10分鐘等待期之模組；及F代表清洗反應 器、偶合約10分鐘及排幹反應容器。偶合通常係藉由一次 或多次添加模組’’Γ而經擴展。舉例而言，雙偶合係藉由執 行製程nBADEIIADEIFD1’而運行。可使用其他模組，例如 氯甲烷洗滌之c及利用乙酸酐實施加帽之’’C”。藉由（例如） 改變各種功能之定時，例如轉移時間，以改變所轉移溶劑 或試劑之數量，可對單個模組加以改變。通常將上述循環 用於偶合一胺基酸。然而，對於合成四肽，重複該等循環 並將其連貫起來。舉例而言，用BADEIIADEIFD來偶合第 一胺基酸，隨後用BADEIIADEIFD來偶合第二胺基酸，隨 後用BADEIIADEIFD來偶合第三胺基酸，隨後用 BADEIIADEIFD來偶合第四胺基酸，隨後用BIDDcc來進行 最終脫保護作用及洗滌。 肽合成可利用微波肽合成儀（Liberty (CEM Corporation， Matthews，NC))來實施。藉由改變預裝載的0.25毫莫耳循 122234.doc -27- 200819139 環’針對雙偶合及加帽對合成儀實施程式化。用微波編輯 器來程式化微波功率方法用於在^⑽脫保護作用、胺基酸 偶合反應及利用乙酸酐之加帽期間使用。此類型之微波控 制容許達成對在m度下經—設定數量之時間的反應 進行控制的方法。Liberty可自動調節遞送至反應之能量的 數量以保持溫度處於設定點。在循環編輯器中對胺基酸添 加及最終脫保護作用之默認循環進行選擇並在創建一肽時 進行自動加載。 該合成係利用Fmoc-連接子-BHA樹脂（450毫克，〇.25毫 莫耳）在一0.25毫莫耳級上實施。將樹脂添加至帶有1〇毫升 DMF之30毫升反應器中。Fmoc脫保護作用係利用一2〇%溶 於DMF之六氫吼咬溶液實施。對於各胺基酸偶合，將 Fmoc保護的胺基酸溶解於DMF中以獲得一 〇·2 “溶液並將 其添加至反應容器中。所有偶合反應皆利用〇·5 Μ HOBT/HBTU及2 M DIEA/NMP實施。任何不完全偶合反應 物皆與新製備的活性胺基酸進行再偶合或者藉由用25%溶 於DMF之乙酸酐處理該肽樹脂而實施封端。各脫保護作用 作用、偶合及加帽反應係在70°C下經300秒在50瓦功率及 氮鼓泡之條件下利用微波完成。 對於各胺基酸偶合反應，使用以下0.25毫莫耳偶合反廣、 循環： 122234.doc -28 - 200819139

方案2 將樹脂轉移至容器 添加六氫吼啶脫保護劑（10毫升） 用於脫保護作用之微波法(50瓦；70°C ; 300秒) 用DMF(10毫升)洗滌樹脂 添加胺基酸(5毫升） 添加活化劑(HOBT/HBTU)(2毫升） 添加活化劑基質(DIE A)( 1毫升） 用於偶合反應之微波法(50瓦；70°C ; 300秒） 用DMF(10毫升)洗滌樹脂 添加胺基酸(5毫升） 添加活化劑(HOBT/HBTU)(2毫升） 添加活化劑基質(DIE A)( 1毫升） 用於偶合反應之微波法(50瓦；70°C ; 300秒） 用DMF(10毫升)洗滌樹脂 添加加帽劑（乙酸酐10毫升）。 微波法(加帽)(50瓦；70°C ; 300秒） 用DMF(10毫升)洗滌樹脂 對於合成此處提供的化合物，在反應圖1中出示了一較 佳合成製程。 122234.doc -29- 200819139 反應囷1

Fmoc-Rink-MBHA-樹脂 1

1)六氫吡啶/DMF

” 2) Fmoc-AA(P)3VDIC, BOP or HBTU

Fmoc_AA(P)31-Rink-MBHA-樹脂 2 重複上面步驟1&2

1) 2% TFA/CH2CI2

2) PdCI2/Bu3SnH

3) BOP/NMM

Ac-AA(P)1-AA(P)2-AA(P)3-AA(P)4-AA(P)5-AA(P)6-AA(P)7-AA(P)8-AA(P)9-AA(P)10-AA(P)11- AA(P)12-AA(P)13-AA(P)14-AA(P)15-AA(P)16-AA(P)17-AA(P)18-AA(P)19-AA(P)20-AA21-AA(P)22- AA(P)23-AA(P)24.AA25-AA(P)26.AA(P)27.AA(P)28.AA(P)29.AA(P)3〇.AA(P)3i-Rink-MBHA-Resin 4

97% TFA/H20/TIPS

Ac-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-AA9-AA10-AA11-AA12-AA13-AA14-AA15-AA16-AA17-AA18 \ "AA19-AA20-AA21 -AA22-AA23-AA24-AA25-AA26-AA27-AA28-AA29-AA30-AA31 -N H 2 5 利用六氫σ比咬/DMF對Fmoc-Rink-MBHA樹脂1進行處 理，隨後利用一試劑（例如DIC、BOP或HBTU與Fmoc-AA(P)31偶合，其中AA31代表第31個胺基酸殘基且p代表 一適宜保護基團，產生Fmoc_AA(P)31-Rink-樹脂2。藉由在 各循環中添加適宜的經保護胺基酸將步驟1 & 2重複30個 循環，產生肽樹脂3。藉由分別用2%存於CH2C12中之TFA 及PdCh/nBhSnH實施處理去除AA25及AA21上的側鏈保護 122234.doc -30- 200819139 基團。藉由用存於DMF中之BOP及NMM實施處理對AA21 及AA25上的側胺及羧基實施環化，產生4。 對於各化合物，將封阻基團移除並在同一步驟中使肽自 樹脂解離。舉例而言，可在室溫下用1 〇〇微升乙二硫醇、 100微升二甲硫醚、300微升苯甲醚及9.5毫升TFA(每克樹 脂）對狀樹脂實施1 8 0分鐘處理。或者，可在室溫下用1. 〇毫 升三異丙基矽烷及9.5毫升TFA(每克樹脂）對肽樹脂實施 1 8 0分鐘處理。將樹脂渡除並在冷;東乙鱗中使滤液發生沉 殿。對 >儿殿物實施離心並潷去醚層。殘餘物用兩或三倍體 積的Et2〇實施洗條並實施再次離心。在真空中對粗產物$ 實施乾燥。 在Shimadzu LC-8A系統上於一反相Pursuit c_18管柱 (50x250毫米，300 A，10微米）上藉由高效液相層析法 (HPLC)對粗製肽實施純化。將肽溶解於一最小量之水及乙 腈中並將其注入一管柱中。梯度洗脫通常始於2% B緩衝 劑’經70为鐘自2¾至70% B(緩衝劑A : 〇·ι% tfa/H2〇，緩 衝劑Β : 0.1% TFA/CH3CN)，流率為5〇毫升/分鐘。在 220/280奈米處實施UV檢測。將包含產物之部分分離出來 並於Shimadzu LC-10AT分析系統上利用反相pursuh 〇18管 柱（4·6χ50毫米）（流率為2.5毫升/分鐘，梯度（2·7〇%)，經1〇 分鐘[缓衝劑A : 0.1% TFA/H2〇，緩衝劑β : 〇1% TFA/CH/N)])對其純度進行判定。將經判定具有足夠純度 之部分收集起來並實施低壓凍乾。 於-上文所闊述RP反相管柱上藉由分析型HpLC對最終 122234.doc •31- 200819139 產物之純度進行檢驗。亦對所有最終產物實施快速原子轟 擊質譜測定法（FAB-MS)或電噴射質譜測定法（ES_MS)。在 該等實例中，所有產物皆在可接受的限度内產生了期望的 母體M+H離子。 本發明中所闡述之νιρ的類似物為如在實例25中所說明 之VPAC2受體的激動劑。根據實例25中之彈性蛋白酶穩定 性實驗’言亥等化合物對人嗜中性細胞彈性蛋白酶具有增強

㈣定性。^，投與該等VPAC2受體激動劑可用於治療 氣道病症，例如COPD。 本發明化合物可呈醫藥上可接受之鹽的形式提供。較佳 鹽之實例係彼等利用醫藥上可接受之有機酸（例如乙酸、 乳酸、馬來酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、號站酸、苯 甲酸、水揚酸、甲續酸、甲苯續酸、三氣乙酸或巴莫酸， 以及聚合酸’❹丹寧酸或缓甲基纖維素）形成之鹽及利 用無機酸(例如氫氯酸(例如氫氯酸)、硫酸或磷酸及諸如此 類）形成之鹽。熟練技工所瞭解之任何獲取醫藥上可接受 之鹽的製程皆可使用。 在本發明方法之實踐中，有效量之任一種本發明多肽或 一任何本發明多肽之組合或—其醫藥上可接受之鹽係經由 業内已，任何常用且可接受方法單獨或組合地投與。因 此，該等化合物或組合物可經口（例如口腔）、經舌下、非 經腸(例如經肌内、經靜脈内、或經皮下)、經直腸(例如藉 :栓劑或洗劑)、透皮(例如皮膚電穿孔)或藉由吸入⑼如 精助氣溶膠）而投與，及呈固體、液體或氣體劑型（包括鍵 122234.doc -32- 200819139 劑及懸浮劑）而投與。此投藥可隨連續療法呈單獨的單位 劑量形式實施，或可任何地於一單獨劑量治療中實施。士 治療組合物亦可呈與一親脂鹽（例如巴莫酸）結合的油乳^ 液或分散液形式，或呈生物可降解的緩釋組合物形式，用 於皮下注射或肌内投與。 因此，當特別需要或可能急於緩解症狀時實踐本發明方 法。或者，本I明方法係有效地作為連續的或預防性的治 療加以實踐。 ^用於製備此等組合物之可用醫藥載劑可係固體、液體或 氣體；因此，該等組合物可呈錠劑、丸劑、膠囊、栓劑、 粉劑i腸道經塗覆的或其他經保護的調配物（例如結合於 離子交換樹脂上或封裝於脂質-蛋白小囊泡）、持續釋放調 配物、溶液、懸浮液、酏劑、煙霧劑及諸如此類等形式。 載劑可選自多種油脂，包括石油油脂、動物油脂、植物油 脂或合成來源的油脂’例如花生油、大豆油、礦物油、芝 麻油及諸如此類”卜鹽水、水性葡萄糖及乙二醇係較佳 液體載劑’尤其（當與企液等渗時）用於可注射溶液。舉^ 而言’用於靜脈内投藥之調配物包括活性成分之無菌水性 溶液’該無菌水性溶液係藉由將固體活性成分溶解於水中 以產生一水性溶液並致使該溶液無菌而製得。適宜醫藥賦 形：包括澱粉、纖維素、滑石粉、葡萄糖、乳糖、明膠、 麥芽、稻米、麵粉、白适、—备 白堊一乳化矽、硬脂酸鎂、硬脂酸 鈉甘油單硬脂酸g旨、氯化納H 1 1二 醇、水、乙醇及諸如此類。組合物中可添加習用醫藥添加 122234.doc -33· 200819139 醫藥添加劑，例如保存劑、穩定劑、潤濕劑或乳化劑、調 整滲透壓之鹽、緩衝劑及諸如此類。適宜醫藥载劑及其調 配物由 E· W· Martin 闡述於 Remingt〇n,s 此—

Sciences中。該等組合物在任何情況下皆應包含有效量之 活性化合物連同一適宜載劑以便製備用於恰當地投與接受 者之恰當劑型。 r'、

本發明化合物之劑量端視許多因素而定，例如投藥方 式、受試者之年齡及體重及擬治療受試者之病況，且最終 應由主^醫師或獸醫決定。如藉由主治醫師或獸醫所決定 的此/¾性化合物之數量在本說明書及中請專利^圍中稱 為”有效量，，。舉例而言，吸入劑投藥之劑量通常處於約〇.5 至約100微克/公斤體重之範圍内。較佳地，本發明化合物 係以自約1微克/公斤至約50微克/公斤/天之劑量率投藥。 代表性遞送方案包括經口遞送、非經腸的（包括皮下 的、肌内的及靜脈内的）遞送、直腸遞送、經口腔（包括經 舌下）遞辽""皮遞送、經肺遞送及經鼻内遞送。較佳投 藥途徑為藉助經π吸人劑之經肺投藥。經肺投藥之方法可 包括本發明環肽之水溶液的兩 八夜的煙務化或微粉化乾燥粉劑調配 物之吸入。經煙霧仆夕έ日人& 1 [ 、、’ &物可包括封裝於反微胞或脂質 體中的化合物。製備且右奴<、益Α 辰備具有經適當控制粒徑之經微粉化粉劑 以有效提供肺泡遞送之方法糸 乃沄為吾人所熟知。用於直接遞送 特定劑量之此等調配物$胎士 物至肺中之吸入器（定量吸入器或 ’’MDI”）為業内人士所熟知。 因此， 本發明亦涵蓋包含此 等激動劑之醫藥組合物 ，及 122234.doc -34. 200819139 此等激動劑於治療包括C〇pd在内之肺 心那疾病之用途。 在一實施例中，本發明提供一種用於 人骗甘*人 、入奴樂之醫藥組 否物’其包含一種式I化合物及至少一 種呈溶液或經微粉 化乾燥粉劑形式之醫藥上可接受的载劑或賦形劑，亥 化合物係以-對於經肺遞送該組合物_理學上有效^ 度存在。在另-實施射，本發明提供—㈣於吸入投: 之醫樂組合物，其包含一種幻化合物及至少一種呈溶液

或經微粉化乾燥粉劑形式之醫藥上 卞工』筏文的載劑或賦形 劑，其中該化合物之濃度足以在一單 ^ ^ 早及入劑量中遞送自約 1微克/公斤至約50微克/公斤之化合物。 在一實施例中，本發明提供一種用於治療肺梗阻病症 ⑼如COPD)之方法’該方法包括對(例如)患此病症之人藉 由吸入法投與一有效量（例如自約丨微克/公斤/天至約％微 克/公斤/天)之用於吸入投藥之醫藥組合物，該醫藥組合物 包含-種式“匕合物及至少一種呈溶液或經微粉化乾燥粉 劑形式之醫藥上可接受的載劑或賦形劑，彡中該化合物係 以一對於經肺遞送該組合物係藥理學上有效之濃度存在。 現於以下實例中對本發明進一步加以闡述，僅欲將該等 實例作為說明，而非對本發明範圍加以限制。 實例 實例1 ·製備 Ac-His-Ser-Asp-Ala-Thr-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr.Lys-Leu-Arg.Lys.Gln.Nle-AIa.Ala.Lys. Lxg-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly^Thr> NH2 [Ac-(SEQ ID ΝΟ:3)·ΝΗ2]，即其中 χ為 Ae，γ 122234.doc -35- 200819139 為 NH2，R2 為 Ser，R5 為 Thr , R16 為 Gin , R18 為 Ala，R27為Lys且R28為Lys之式I化合物。

上述狀係利用Fmoc化學於一 Applied Biosystem 433A或 一微波肽合成儀上合成得到的。利用上文方案1或2中所闌 述模組對該合成儀進行程式化以用於雙偶合反應。該合成 係利用Fmoc-Rink Linker-BHA樹脂（450毫克，0.25毫莫耳）

於一 0.2 5宅莫耳等級上實施。在該合成結束時，將樹脂轉 移至一位於振盪器上的反應器中。對存於DMF中之肽樹脂 實施過濾並用CH^Cl2洗條之。用2%存於CH2C12中之TFA將 樹脂處理五次，每次3分鐘。迅即用5% DIPEA/CH2C12將樹 脂處理兩次，並用CHeh及DMF洗滌之。將肽樹脂懸浮於 存於一牢固地裝配有一橡膠隔片的振盪容器中之DMF中。 向此中添加60毫克PdCl2(Ph3P)2、150微升嗎啉及300微升 AcOH。用Ar對該容器實施徹底淨化。然後經由注射器添 加nBi^SnH。將黑色溶液搖動30至45分鐘，用DMF實施洗 務並重複操作。第二次Pd處理後，用DMF、2xiPrOH、 DMF、5% DIPEA/DMF及DMF對樹脂實施洗滌。於DMF 122234.doc -36- 200819139 中，藉由用BOP及NMM處理過夜對肽樹脂實施環化。用 DMF及Cl^Ch對樹脂實施洗滌，並隨後在真空中乾燥之。 在室溫下經180分鐘用13.5毫升97 % TFA/3% H20及1.5毫 升三異丙基矽烷使肽自樹脂解離。將脫保護作用溶液添加 至100毫升冷Et2〇中，並用1毫升TFA及30毫升冷Et2〇實施 洗務以沉殿肽。於兩5 0毫升聚丙烯試管中對肽實施離心。 將各單個試管中之沉澱物合併至一單獨試管中，並用冷 EhO洗滌3次，再於室真空下於乾燥器中實施乾燥。 藉由製備型HPLC於一 Pursuit C18-管柱（250x50毫米，1〇 微米粒徑）上對粗製材料實施純化，並用一線性梯度之2至 70%B(緩衝劑 A : 〇·1% TFA/H20 ;緩衝劑 B ·· 〇1〇/〇 TF A/CH3 CN)洗脫90分鐘（流率60宅升/分鐘）並在220/2 80奈 米處進行檢測。將各部分收集起來並藉由分析型Hplc實 施檢測。將包含純產物之部分合併並實施凍乾，產生1 〇6 毫克（9.7%)白色無定形粉末。Cl59H256N46〇47之（ES)+_ LCMS m/e計算值（’’calcd”）3565.05 觀測值 3563.7。 實例2:製備 Ac_His-Ser_Asp-AU_Ser_Phe-Thr-Glu-Asn_ Tyr_Thr-Lys_Leii_Arg-LyS_Gln-Nle-Ala-Ala_Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asn-Leu-T ys-T ciy Till NH2 [Ac_(SEQ ID NO:4)-NH2]，即其中又為 Ae，γ 為 NH2，R2 為 Ser，R5 為 Ser , R16 為 Gin，R18 為

Ala，R27為Lys且R28為Lys之式I化合物 藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink-連接子_BHA樹脂 (450¾克’ 0.25¾莫耳）實施固相合成及純化以產生μ毫克 122234.doc -37- 200819139 (2.5%)白色無定形粉末。c158H254N46047 之（ES)+-LCMS m/e 計算值3551.02觀測值3548.7。

Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys_Gln_Nle_Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Glv-Glv-Thr-NH2 [Ae-(SEQ ID N0:5)-NH2]，即其中 X為 Ac，Y 為 NH2，R2 為 Ser，R5 為 Asp，R16 為 Gin，R18 為 Ala，R27為Lys及R28為Lys之式I化合物 藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink-連接子-BHA樹脂 (450毫克，〇·25毫莫耳）實施固相合成及純化，產生9.2毫 克（1%)白色無定形粉末。C159H254N46048 之（ES)+-LCMS m/e計算值3579.03觀測值3577.8。

Tyr-Thr_Lys_Leu-Arg，Lys-Gln_Nle-Ala-Ala-Lys_ Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Gly-.CIy-Thr-NH2 [Ac-(SEQ ID NO:6)-NH2]，即其中 X為 Ac，Y 為 NH2，R2 為 Ser，R5 為 Gin，R16 為 Gin，R18 為 Ala，R27為Lys且R28為Lys之式I化合物 藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink-連接子-BHA樹脂 (450毫克，〇·25毫莫耳）實施固相合成及純化，產生9.8毫 克（1%)白色無定形粉末。C160H257N47O47 之（ES) + -LCMS m/e計算值3592.07觀測值3589.5。

Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys- 122234.doc •38- 200819139

Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2 [Ac-(SEQ ID N0:7)-NH2】，即其中 X為 Ac，Y 為 NH2，R2 為 Ser，R5 為 Pro，R16 為 Gin，R18 為 Ala，R27為Lys且R28為Lys之式I化合物 藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink-連接子-BHA樹脂 (450毫克，0.25毫莫耳）實施固相合成及純化，產生15.2毫 克（1.4%)白色無定形粉末。c160H256N46O46 之（ES)+-LCMS m/e的計算值3561.06觀測值3560.0。 實例 6 :製備 Ac-His-Ser_Asp-Ala-MeVal_Phe-Thr-Glu-Asn_Tyr-Thr-Lys_Leu-Arg_Lys-Gln-Nle_Ala_Ala-Lys-Lvs-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-T,yg-r：iy>my-Thr-NH2 [Ac-(SEQ ID NO:8)-NH2]，即其中X為 Ac，Y 為 NH2，R2 為 Ser，R5 為 MeVal，R16 為 Gin , R18為Ala，R27為Lys且R28為Lys之式I化合物

藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink-連接子-BHA樹脂 (450¾克’ 〇·25毫莫耳）實施固相合成及純化，產生4〇毫克 (3.6%)白色無定形粉末。（：16111260>^46〇46之斤8) + -1^]\48 111仏 122234.doc -39- 200819139 計算值3577.10觀測值3576.8。

Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Glu-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Glv-Oly-Thr-NH2 [Ac-(SEQ ID N0:9)-NH2]，即其中 X為 Ac，Y 為 NH2，R2 為 Ser，R5 為 Ser，R16 為 Gin，R18 為 Glu，R27為Lys且R28為Lys之式I化合物 藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink-連接子-BHA樹脂 (450毫克，〇·25毫莫耳）實施固相合成及純化，產生126毫 克（11.4%)白色無定形粉末。（：16011256>^6〇49之斤8)+-1^]^8 m/e計算值3609.06觀測值3609.2。

Tyr_Thr_Lys_Leu_Arg-Lys_Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Lvs-Glv-Gly-Thr-NH2 [Ac_(SEQ ID ΝΟ:10)·ΝΗ2]，即其中 X為 Ac， Y 為 NH2，R2 為 Ser，R5 為 Ser，R16 為 Gin，R18 為 Ala，R27為Leu且R28為Lys之式I化合物 藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink-連接子-BHA樹脂 (450毫克，〇·25毫莫耳）實施固相合成及純化，產生77毫克 (7.3/))白色無疋形粉末。c158H253N45047之（ES)+-LCMSm/e 計算值3536.00觀測值3534.95。

Tyr_Thr_Lys-Leu-Arg-Lys_Gln-Nle-Lys-Ala_Lys·

Lys-Tyr-Ley-Asn-Asp-Leu-Lys-Lvs-Gly-dy-Thr- 122234.doc -40- 200819139 NH2 [Ac-(SEQ ID ΝΟ:11)-ΝΗ2]，即其中 X為 Ac， Y 為 NH2，R2為 Ser，R5為 Ser，R16為 Gin，R18 為 Lys，R27為Lys且R28為Lys之式I化合物 藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink-連接子-BHA樹脂 (450毫克，0.25毫莫耳）實施固相合成及純化，產生79毫克 (7.5%)白色無定形粉末。C161H261N47047 之（ES)+_LCMS m/e 計算值3608.1 1觀測值3607.6。 實例10 :

Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg_Lys-Ala_Nle-Glu-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Glv-Glv-Thr-NH2 [Ac-(SEQ ID NChl2)-NH2]，即其中 X 為 Ac，Y 為 NH2，R2 為 Ser，R5 為 Ser，R16 為 Ala， R18為Glu，R27為Lys且R28為Lys之式I化合物 藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink-連接子-BHA樹脂 (450毫克，0.25毫莫耳）實施固相合成及純化，產生65毫克 (6%)白色無定形粉末。C158H253N45048i(ES)+-LCMS m/e 計算值3552.00觀測值355 1.2。 實例 11 :製備 Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr_Thr_Lys_Leu-Arg_Lys-Gln_Nle-Ala-Ala-Lys· Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Asn-Glv-Glv-Th r-NH2 [Ae-(SEQ ID NO:13)-NH2]，即其中 X 為 Ac，Y 為 NH2，R2 為 Ser，R5 為 Ser，R16 為 Gin， R18為Ala，R27為Leu且R28為Asn之式I化合物 藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink>連接子-BHA樹脂 122234.doc -41 - 200819139 (450毫克，0.25毫莫耳）實施固相合成及純化，產生i〇9毫 克（10.6%)白色無定形粉末。C156H247N45048i(ES)+-LCMS m/e計算值3521.93觀測值3520.5。

Tyr-Thr-Lys_Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala_Ala_Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-T.ys-dy-Oly-Thr-NH2 [Ac-(SEQ ID NO:14)-NH2]，即其中 X 為 Ac，Y 為]VH2，R2 為 Ala，R5 為 Ser，R16 為 Gin， R18為Ala，R27為Lys且R28為Lys之式I化合物 藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink-連接子-BHA樹脂 (450毫克，0.25毫莫耳）實施固相合成及純化，產生2〇毫克 (1·8/ώ)白色無疋形粉末。C158H254N46O46 之（ES)+-LCMS m/e 計算值3535.02觀測值3533.4。 實例 13 ·製備人卜1118-861^_入8卩-八13-861*_?1|6-1111#-0111-人811· Tyr-Thr_Lys_Leu-Arg-Lys_Arg-Nle-Ala_Ala_Lys-

Lys-Tvr-Ley-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Gly-dy-Thr-NH2 [Ac_(SEQ ID NO:15)-NH2]，即其中 X 為 Ac，Y 為 NH2，R2 為 Ser，R5為 Ser，R16為 Arg， R18為Ala，R27為Lys且R28為Lys之式I化合物 藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink-連接子-BHA樹脂 (450毫克’ 0.25毫莫耳）實施固相合成及純化，產生6〇毫克 (5.3/8)白色無疋形粉末。c159H258N48〇46 之（ES) + -LCMS m/e 計算值3579·08觀測值3577.8。 實例 14 ·製備 Ac-His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn- 122234.doc -42- 200819139

Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle-Ala-AIa-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Asn-Glv-Glv-Thr-NH2 [Ac-(SEQ ID N0:16)-NH2]，即其中 X 為 Ac，Y為 NH2，R2 為 Ser，R5為 Ser，R16為 Arg， R18為Ala，R27為Leu且R28為Asn之式I化合物 藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink-連接子-BHA樹脂 (450毫克，0.25毫莫耳）實施固相合成及純化，產生40毫克 (3.7%)白色無定形粉末。c157H251N47047 之（ES)+-LCMS m/e 計算值3549.99觀測值3549.2。 實例 15 :製備人〇1118-861#-入8卩-八13-8€1#-?116-11111*_01|1-人811-Tyr-Thr_Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle_Glu-Ala_Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Glv-Glv-Thr-NH2 [Ac-(SEQ ID N0:17)-NH2】，即其中 X 為 AC，Y為 NH2，R2為 Ser，R5為 Ser，R16為 Arg， R18為Glu，R27為Lys且R28為Lys之式I化合物 藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink-連接子-BHA樹脂 (450毫克，〇·25毫莫耳）實施固相合成及純化，產生36毫克 (3.6%)白色無定形粉末。c161H260N48O48 之（ES)+-LCMS m/e 計算值3637.1 1觀測值3636.4。 實例 16 :製備入卜1118-861#-人8卩-人13-861#-?116-111|卜0111-入811-Tyr_Thr_Lys-Leu_Arg_Lys-Arg-Nle_Lys_Ala_Lys-Lys-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Glv-G1v-Th r-NH2 [Ac-(SEQ ID N0:18)-NH2]，即其中 X 為 Ac，Y為 NH2，R2為 Ser，R5為 Ser，R16為 Arg， 122234.doc •43- 200819139 R18為Lys，R27為Lys且R28為Lys之式I化合物 藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink-連接子-BHA樹脂 (450毫克’ 0.25¾莫耳）實施固相合成及純化，產生51毫克 (4.4%)白色無定形粉末。Cl62H265N49〇46i(ES)+_LCMS m/e 計算值3636.17觀測值3634.8。

Tyr_Thr-Lys_Leu-Arg-Lys_Arg_Nle_Glu-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Cly-dy-Th r-NH2 [Ac-(SEQ ID N0:19)-NH2]，即其中 X 為 Ac，Y 為 NH2，R2 為 Ala，R5 為 Ser，R16 為 Arg， R18為Glu，R27為Lys且R28為Lys之式I化合物 藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink-連接子-BHA樹脂 (450毫克，0.25毫莫耳）實施固相合成及純化，產生27毫克 (2.7%)白色無定形粉末。C161H260N48O47之（ES)+-LCMS m/e 計算值3621.1 1觀測值3620.4。

Tyr_Thr-Lys-Leu-Arg_Lys_Arg-Nle_Lys_Ala-Lys_ Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Glv-Gly-Thr-NH2 [Ac-(SEQ ID NO:20)-NH2]，即其中 X 為 Ac，Y為 NH2，R2 為 Ala，R5 為 Ser，R16為 Arg， R18為Lys，R27為Lys且R28為Lys之式I化合物 藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink-連接子-BHA樹脂 (450毫克，0.25毫莫耳）實施固相合成及純化，產生53.5毫 克（4.6%)白色無定形粉末。C162H265N49045 之（ES)+-LCMS 122234.doc -44- 200819139 m/e計算值3620.17觀測值3618.8。

Tyr-Thr_Lys_Leu_Arg-Lys_Arg-Nle-Glu-Ala-Lys-

Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Lvs-C1y-f；1y-Thr-NH2 [Ac-(SEQ ID NO:21)-NH2]，即其中 X為 Ac，Y為 NH〗，R2為 Ser，R5為 Ser，R16為 Arg， R18為Glu，R27為Leu且R28為Lys之式I化合物 藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink-連接子-BHA樹脂 (450毫克，〇·25毫莫耳）實施固相合成及純化，產生33毫克 (3.3%)白色無定形粉末。c161H259N47048之（ES)+-LCMS m/e 計算值3622.10觀測值3620.8。 實例 20:製備 Ac_His-Ser-Asp_Ala-MeVal-Phe-Thr_Glu-Asn-Tyr_Thr_Lys-Leu-Arg_Lys-Gln_Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Lvs-Gly-Gly·· Thr-NH2 [Ac-(SEQ ID NO:22)-NH2】，即其中 X 為 Ac，Y 為 NH2，R2 為 Ser，R5 為 MeVal，R16 為 Gin，R18為Ala，R27為Leu且R28為Lys之式I化合物 藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink-連接子-BHA樹脂 (450毫克，0.25毫莫耳）實施固相合成及純化，產生55毫克 (5.2%)白色無定形粉末。（^161只25以45〇46之（£8) + -1^]^18 111/6 計算值3562.09觀測值3561.09。 實例21:

Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-

Lys-Lys-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Gly-Gly- 122234.doc -45- 200819139

Thr-NH2 [Ac-(SEQ ID ΝΘ:23)-ΝΗ2]，即其中X 為 Ac，Y 為 NH2，R2 為 Ala , R5 為 MeVal，R16 為 Gin ’ R18為Ala，R27為Lys且R28為Lys之式I化合物 藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink-連接子-BHA樹脂 (450宅克’ 〇·25毫莫耳）實施固相合成及純化，產生49毫克 (4.5%)白色無定形粉末。cl6iH26〇N46〇45 之（ES)+-]LCMS m/e 計算值3561.10觀測值3560.0。 實例 22:

Asn-Tyr_Thr_Lys-Leu-Arg_Lys_Arg_Nle，Ala-Ala_ Lys-Lys-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lvs-Lvs-Gly-Gly-Thr-NH2 [Ac-(SEQ ID NO:24)-NH2]，即其中X 為 Ac，Y 為 NH2，R2 為 Ser，R5 為 MeVal，R16 為 Arg，R18為Ala，R27為Lys且R28為Lys之式I化合物 藉由遵循實例1中製程對Fmoc-Rink-連接子-BHA樹脂 (450毫克，〇·25毫莫耳）實施固相合成及純化，產生13.8毫 克（1.2%)白色無定形粉末。c162H264N48045 之（ES)+-LCMS m/e計算值3605.16觀測值3604.0。 實例 23 :製備入〇1118-入13-八8卩-八13-]>16\^1-卩116-1'111*-0111-Asn-Tyr-Thr-Lys_Leu-Arg-Lys-Gln_Nle_Ala-Ala_ Lys-Lys-Tvr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Lvs-Glv-Glv-Thr-NH2 [Ac-(SEQ ID NO:25)-NH2]，即其中 X 為 Ae，Y 為 NH2，R2 為 Ala，R5 為 MeVal，R16 為 Gin，R18為Ala，R27為Leu且R28為Lys之式I化合物 藉由遵循實例1申製程對Fmoc-Rink-連接子-BHA樹脂 122234.doc -46- 200819139 (450毫克，0·25毫莫耳）實施固相合成及純化，產生30.2毫 克（2.8%)白色無定形粉末。C161H259N47〇45 之（ES)+-LCMS m/e計算值3546.09觀測值3544.8。 實例24: Sup-TlcAMP激動劑分析 人類T淋巴細胞系Sup-Tl(其表現vpac2受體）自美國典 型培養物保藏中心（ATCC，CRL-1942)獲得，並在一 37°C之 C02培養箱中以介於〇·2與2χ10ό細胞/毫升之間的密度保存 於生長培養基中。生長培養基為增補有25 mM HEPES緩衝 液及 10% 胎牛血清（Gemini Bi〇pr〇ducts)的 RPMI 1640 (Invitrogen) 〇 為評價VPAC2激動劑化合物活性，在室溫下用生長培養 基將處於對數生長期中之細胞洗滌一次，並於150微升生 長培養基中以4x 1 〇4細胞每孔之密度將其鋪板至96孔板 中。然後，將於生長培養基中以恰當濃度製備的50微升化 合物添加至指定孔中。在室溫下經5分鐘後’藉由向各孔 中添加25微升溶解試劑1A(cAMP Biotrak EIA系統， Amersham Biosciences，RPN225)使該等細胞溶解。將該 等96孔板保持於室溫下經1 〇分鐘，同時加以搖動，並隨後 在4 °C下儲存直至c AMP分析（在2小時内）。根據製造商說明 書（Amersham Biosciences，RPN225)利用 cAMP BiotrakS^ 免 疫測定（EIA)套組於100微升各溶解產物中測定環AMP含 量。藉由擬合7-濃度劑量響應數據至一藉由GraphPad Prism程式（GraphPad Software公司）提供的反曲劑量響應方 程對各VPAC2激動劑化合物之活性（EC5G值）進行評價。 122234.doc -47- 200819139 表1 化合物所來自之實例 Sup-Tl cAMP EC50 (nM) 1 38 2 69.7 3 98 4 85 5 1206 6 2.35 7 632 8 11.4 9 1200 10 447 11 16.8 12 7.4 13 17.6 14 94.1 15 116.7 16 1030 17 23.3 18 276 19 68.4 20 9.45 21 4.75 22 10.54 23 4.07 實例25 :肽對中性白細胞彈性蛋白酶之穩定性 肽類似物之蛋白水解穩定性係利用反向高壓液相層析法 (RP HPLC)電喷霧電離質譜法（ESI MS)證實。用人類中性 122234.doc -48- 200819139 白細胞彈性蛋白酶對肽類似物實施培養，並在適宜的時間 點藉由ESI MS對未消化類似物之數量進行測定。在一次實 驗中可包括多種肽類似物，只要其可藉由HpLC保留時間 及/或藉由分子量進行區分即可。在所有實驗中皆用

Ac-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu·

Lys-Lys-Gly-Gly-Thr-NH2作為對照並作為參比標準。多種

肽類似物it同一參比標#之同日夺使用可達成經多：欠實驗時 該酵素之蛋白水解重現精度之校正作用。將針對單獨未經 消化肽獲得的整合離子流用於定量測定。為計算半數時 間’採用-級動力學特性，並將所有計算值根據參比標準 之半數時間實施歸一化。 於水中製備肽儲備溶液至一 2.5毫克/毫升之濃度。除非 在使用中，所有儲備溶液皆應保持在書c下。為確定所 製備儲備溶液中之相對肽含量，制—等分試樣實施反相 HPLC，ϋ將所觀察到的uv吸光率與來自#比標準之可比 等分試樣相比較。相應地對肽類似物之濃度加以調節。為 確保蛋：水解消化，將肽溶解於磷酸鹽緩衝鹽水㈣中 至〇.1笔克/笔升之浪度。將多達六種不同的狀類似物混 合至-顺升反應容積。將參比標準添加至所有實驗作為 -參照及内部標準。自—彈性蛋白酶儲備溶液添加彈性蛋 白酶（人類嗜中性粒細胞’ Calbi0chem’ Cat # 3246川至一 1至2微克/毫升之濃度。潠摆 、擇不同數量之酵素以校正該等 狀類似物之蛋白水解穩定性差異。之前，以一i毫克/毫升 122234.doc -49- 200819139 之濃度於水中製得彈性蛋白酶儲備溶液。將小等分試樣之 酵素儲備㈣保存在便藉由限制解歧冷柬循環 之數目而更佳地保持該酵素之活性。在環境溫度下於 肌C系統（Agilent i i 〇〇系列）之自動取樣器之自動取樣器 官中完成消化過程。對於一時間過程，將5微升等分試樣 以70分鐘間隔注射至反相HPLC管柱（phe_enex，L咖 C18，3 μ，1〇〇 a，150χ2.00毫米）上。對於起始時間點

恰恰在添加該蛋白水解酶之前注射—等分試樣。在—實驗 中可記錄總共八個時間點’包括該起始點。在反相管柱上 利用一50分鐘的5%至3〇%有機相梯度對狀實施分離。水相 為0.05% (ν/ν)存於水中之三氣乙酸，且有機相為〇卿。 (ν/ν)存於乙腈中之二氟乙酸。分別在川及⑽奈米處記錄 吸光度。將所有管柱流出物引入電噴射離子化質譜儀⑽; 4000 QTrap LC/MS/MS系統)之ν型turb〇電離源。在—質量 範圍内以Q3MS模式獲得質譜以包括未經降解肽類似物之 所有三電荷離子。當心以確保肽類似物可藉由色譜保留時 :或：由分子量差異而清晰地進行區分。自整合的總離子 机汁异各未消化肽類似物之相對數量。選擇一 2.5以之 窗’並利用製造商的軟體來整合單獨的離子流。藉由採用 -級動力學特性計算一單獨肽類似物之全部半數時門，並 根據於參比標準之半數時間對其實施歸—化。B 表2

122234.doc -50- 200819139 2 5.2 3 4.5 4 3.9 5 4.9 6 6 7 16.4 8 3.5 9 12.0 10 7.4 11 2.4 12 5.2 13 1.7 14 4.5 15 4.8 16 4.4 17 4.6 18 5.1 19 3.3 20 3.4 21 5.7 22 1.8 23 3.6 實例26 :化合物對於在雄性C57BL/6*鼠中由Lps誘導的 肺炎的影響 廣溶#:用媒劑或藥物對C57bl/6小鼠實施預處理， 隨後實施15至30分鐘的脂多糖（LPS，500微克/毫升於無菌 鹽水中）氣溶膠暴露。該氣溶膠係藉由一 Pari Ultra neb噴射 霧化器產生，該噴射霧化器之出口連接至一小且清晰的容 122234.doc -51 - 200819139 納該等動物的塑料室[HxWxD， 1〇·7χ25·7χΐΐ公分 (4x10x4.5 in)]。24小時後實施支氣管肺泡灌洗（BAL)以測 定細胞炎症之嚴重度。BAL操作係如下面所述實施。 ，經#巧授與藉由媒劑或藥物對小鼠實施預處理， 然後經鼻内投與脂多糖（0.05至〇·3毫克/公斤於無菌鹽水 中；5〇微升總體積，25微升/鼻孔）。經鼻内投藥係藉由利 用25至50微升的艾本德（eppendorff)移液管在鼻孔處遞送數 小滴之劑量溶液而實施。BAL係如上文所闡述在經[^激 發3至2 4小時後實施以測定細胞炎症之嚴重度。 义廣營厣泡耆迸：LPS暴露24小時後，用戊巴比妥（8()至 100¾克/公斤，腹腔注射）、氯胺g同/Xyzaline(g〇至12〇毫克/ A斤/2至4¾克/公斤，腹腔注射）或尿烧（15至24克/公 斤，腹腔注射）實施麻醉；並穿過小的正中線頸部切口（ 1 5 至20¾米）將氣管暴露出來’並插入一 號管狀轉接管。 用2x1毫升不含Ca++及Mg++之無菌漢克氏平衡鹽溶液 (HBSS)對肺實施灌洗。經30秒後藉由輕緩抽吸回收洗出 液，並針對每一動物進行收集。然後，在5。〇下以2〇〇〇 rpm對試樣實施10分鐘離心。吸出上清液，並經％秒鐘用 〇·5宅升瘵餾水使紅血球自所得糰粒中溶解出來，然後藉 由添加5耄升HBSS將莫耳滲透壓濃度恢復至剩餘細胞。在 51下以2000 rpm對試樣實施1〇分鐘再次離心並將上清液 吸出。將所得糰粒再次懸浮於丨毫升HBSS中。總細胞數係 利用一血球計數器或庫爾特（c〇uher)計數器藉由台盼藍 (Sigma Chemical，St· Louis，MO)排除法自細胞懸液之一等 122234.doc -52- 200819139 分試樣進行測定。對於差異細胞計數，在一 Cytospin中對 細胞懸液之一等分試樣實施離心（5分鐘，1300 rpm ; Shandon Southern Instruments，Sewickley，PA)，對載波 片實施固定並用一改良的賴特氏（Wright’s)染劑（Hema 3 stain kit，Fisher Scientific)實施染色。在光學顯微鏡下， 利用標準形態學標準對至少300個細胞進行分類。表3中之 數據表示為中性粒細胞及總細胞之BAL細胞X 104/動物， 或LPS誘導的BAL流體中性白細胞增多響應之抑制百分 比0 表3 化合物所來自之實例 劑量 對LPS誘導的中性白細胞增多之抑制 (+ 10-30%，++>30%) 1 0.1% + 2 0.1% + 6 0.01% ++ 7 0.01% ++ 8 0.1% ++ 9 0.01% + 10 0.01% ++ 11 0.01% ++ 12 0.01% + 13 0.01% ++ 15 0.01% + 17 0.01% + 19 0.01% + 實例27 :化合物對由乙醯曱膽鹼誘導的小鼠支氣管痙攣的 122234.doc -53- 200819139 影響 利用得自BUXCO Electronics公司（Troy，NY)的全身體積 描§己恭（WBP)在有清醒的自由移動小鼠中量測呼吸功能。 WBP室容許動物在該室内自由移動同時對呼吸功能進行量 測。同時使用八個室以便可在同一時間對八隻小鼠進行量 測。母個WBP室皆連接至一偏流調節器以便在測試期間供 應一平滑且連繽的新鮮空氣流。連接至各室之傳感器可檢 測當動物呼吸時發生的壓力變化。藉助一 max π Strain Gauge前置放大器對壓力信號進行放大，並藉由隨系統供 應的 Biosystem XA 軟體（BUXCO Electronics 公司）實施分 析。在測試前藉由穿過注射口注射恰好丨毫升空氣並相應 地調節計算機信號而對各室内之壓力變化進行校準。將小 鼠置於WBP室中並使其適應10分鐘，然後進行測試。藉由 使動物移動並自由呼吸15分鐘實施測試，同時量測以下參 數：潮氣量（毫升）、呼吸率（每分鐘呼吸數）、分鐘容量（潮 氣Ϊ乘以呼吸率，毫升/分鐘）、吸氣時間（秒）、呼氣時間 (秒）、吸氣流量峰值（毫升/秒）、及呼氣流量峰值（毫升/ 秒）。將—上文所列示各參數之原始數據收集於軟體數據庫 中，並母分鐘平均一次以得到每個參數總共15個數據點。 報告15個數據點的平均值。經累積容積（毫升）為一累積值 (未經平均）並表示15分鐘測試階段之潮氣量總數。 對該方案加以設置以包括在_致痙藥激發之前、期間及 之後的量測從而對Penh進行測定。藉由以約5至1〇分鐘之 間隔提供喷霧氣溶膠⑽錢秒暴露）獲得—肖定致癌藥（即 122234.doc -54- 200819139 乙醯甲膽鹼（MCh)、乙醯膽鹼等）之劑量響應效應。 如上文所述藉助氣溶膠用媒劑（2% DMSO於H20中）或溶 解於4毫升媒劑中之藥物對小鼠（balb/c)實施20分鐘處理， 然後進行致痙藥激發。在激發後5分鐘、30分鐘及60分鐘 時對Penh進行測定。以相對於媒劑之Penh百分比抑制形式 報告數據。 表4 化合物所來自之實例 在攻擊後5分鐘時Penh之抑制(+ >50%，++ <50%) 6 ++ 12 + 18 + 19 + 122234.doc -55- 200819139 序列表 <110>瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 <120>新穎之激脈腸肽類似物 <13〇> 23410 <140> TW 096124342 <141> 2007-07-04

<150> US 60/818,805 <151> 2006-07-06 <160> 25 <170> Patentln Ver. 3.3 <210> 1 <211〉 28 <212>蛋白質 <213>智人 <400> 1

His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gin

15 10 15

Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser lie Leu Asn 20 25 <210> 2 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人工序列 <22〇> <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220> <221> MOD_RES <222> (2) 122234-序列表.doc 200819139 <223> Ser 或 Ala <220> <221> MOD—RES <222〉 （5) <223> Thrf Ser, Asp, Gin, Pro,或C-alpha-Methyl-L-Valine <220> <221> MOD一RES <222> (16) <223> Gin, Ala,或Arg <220〉

<221> M〇D_RES <222> (17) <223> Nle <220> <221> MOD_RES <222〉 （18) <223> Ala, Lys,或Glu <220> <221> M〇D_RES <222> (27) <223> Lys 或 Leu, and must be Lys when position 5 is C-alpha-Methyl-L-Valine and position 16 is Arg <220〉 <221> MOD一RES <222> (28) <223> Lys 或 Asn <220> <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <400> 2

His Xaa Asp Ala Xaa Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Xaa Xaa Gly Gly Thr -2- 122234-序列表.doc 200819139 20 25 30 <210> 3 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220> <221> MOD—RES <222> (17) ί、 1 <223> Nle <220> <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <400> 3

Thr Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys 5 10 15 Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 25 30

His Ser Asp Ala Gin 1

Xaa Ala Ala Lys 20 <210> 4 / <211> 31 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> Nle <220> <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 122234-序列表.doc 200819139 <400> 4

His Ser Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gin 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30 <210> 5 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220> <221> MOD__RES <222> (17) <223> Nle <220〉 <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結. <400> 5

His Ser Asp Ala Asp Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gin 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30 <210〉 6 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人工序列 <22〇> <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 -4- 122234-序列表.doc 200819139 <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> Nle <220> <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <400> 6

His Ser Asp Ala Gin Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gin 15 10 15 ^ Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30 <210> Ί <211> 31 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220>

<221> MOD_RES / <222> (17) 1. / <223> Nle <22〇> <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <400> 7

His Ser Asp Ala Pro Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gin 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30 <210> 8 122234-序列表.doc 200819139 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220> <221> MOD—RES <222> (5) <223> C-alpha-Methyl-L-Valine <220>

V <221> M〇D_RES <222> (17) <223> Nle <220> <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <400〉 8

His Ser Asp Ala Xaa Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gin 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr / 20 25 30 (： <210> 9 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人工序列 <22〇> <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> Nle 122234-序列表.doc 200819139 <220> <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <400〉 9

His Ser Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gin 15 10 15

Xaa Glu Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30

<210> 10 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220〉 <221〉 MOD一RES <222> (17) <223> Nle <220> <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <400> 10

His Ser Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gin 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30 <210> 11 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> 122234-序列表.doc 200819139 <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> Nle <22〇> <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <400> 11 ί

His Ser Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gin 15 10 15

Xaa Lys Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30 <210> 12 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> Nle <220> <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <400〉 12

His Ser Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Ala 15 10 15

Xaa Glu Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 122234-序列表.doc 200819139 20 25 30 <210> 13 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> Nle <220>

Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys 5 10 15 Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Leu Asn Gly Gly Thr 25 30 <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <400〉 13 His Ser Asp Ala Gin 1

Xaa Ala Ala Lys 20 <210> 14 <211> 31 <212〉蛋白質 <213〉人工序列 <220> <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> Nle <220> <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 122234-序列表.doc 200819139 <400> 14

His Ala Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gin 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30 <210> 15 <211> 31 <212>蛋白質 <213〉人工序列 <220> <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220> <221> MOD__RES <222> (17) <223> Nle <220〉 <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <400〉 15

His Ser Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Arg χ 5 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30 <210> 16 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223〉人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 12223 4-序列表.doc •10- 200819139 <220> <221> MOD_RES <222〉 （17) <223> Nle <220〉 <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <400〉 16

His Ser Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Arg 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Leu Asn Gly Gly Thr 20 25 30 <210> 17 <211〉 31 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220> <221> MOD一RES <222> (17) <223> Nle <220> <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <400> 17

His Ser Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Arg 15 10 15

Xaa Glu Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30 <210> 18 -11 - 122:234-序列表.doc 200819139 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> Nle <220> % <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <400> 18

His Ser Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Arg 15 10 15

Xaa Lys Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30 <210> 19 <211〉 31 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220> <221> MOD—RES <222> (17) <223> Nle <220> <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <400> 19 -12- 122234-序列表.doc 200819139

His Ala Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Arg 15 10 15

Xaa Glu Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30 <21〇> 20 <211> 31 <212>蛋白質 <213〉人工序列 <220> <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> Nle <220〉 <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <400> 20

His Ala Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Arg 15 10 15

Xaa Lys Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30 <210> 21 <211> 31 <212>蛋白質 <213〉人工序列 <220> <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220>

<221> MOD RES -13 - 122234·序列表.doc 200819139 <222> (17) <223> <220> Nle <223> 殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <400> 21

His Ser Asp Ala Ser Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys

Arg 1 5 10 15

Xaa Glu Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Leu Lys Gly Gly Thr 20 25 30 ( <210〉 22 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220> <221> M0D_RES <222> (5) <223> <22 0> ί % C-alpha-Methyl-L-Valine V ^ <221> MOD—RES <222> (17) <223> <220> Nle <223> 殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <400> 22

His Ser Asp Ala Xaa Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys

Gin 1 5 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Leu Lys Gly Gly Thr -14- 122234-序列表.doc 200819139 20 25 30 <210> 23 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220> <221> MOD_RES <222> (5)

<223> C-alpha-Methyl-L-Valine <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> Nle <220> <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <4〇0> 23

His Ala Asp Ala Xaa Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gin 1 5 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30 <210> 24 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220>

<221> MOD RES -15- 122234-序列表.doc 200819139 <222> (5) <223> C-alpha-Methy1-L-Valine <22〇> <221> MOD_RES <222> (17) <223> Nle <220> <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <40〇> 24

His Ser Asp Ala Xaa Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Arg 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Lys Lys Gly Gly Thr 20 25 30 <210> 25 <211〉 31 <212>蛋白質 <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：激脈腸肽之合成類似物 <220> <221> M〇D_RES <222> (5) <223> C-alpha-Methy1-L-Valine <220〉 <221> MOD_RES <222> (17) <223> Nle <22〇> <223>殘基21及25係藉由側鏈至側鏈共價鍵結 <400> 25 -16· 122234-序列表.doc 200819139

His Ala Asp Ala Xaa Phe Thr Glu Asn Tyr Thr Lys Leu Arg Lys Gin 15 10 15

Xaa Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Asn Asp Leu Leu Lys Gly Gly Thr 20 25 30

17- 122234-序列表.doc

Claims (1)

1. 200819139 十、申請專利範圍： 1. 一種式I之環狀激脈腸肽類似物， X-His-R2-Asp-Ala-R5-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lvs-R16-Nle-R18-Ala-Lys-Lvs21-Tyr-Leu-Asn-Asp25-Leu-R27-R28-Gly-Gly-Thr-Y [X-(SEQ ID NO: 2)-Y] 其中 X 為組胺酸N末端胺基之氫，其可視情況由可水解的 ( ' 胺基保護基團置換，最佳係由乙醯基置換， Y 為蘇胺酸C末端羧基上的羥基，其可視情況由可水 解的羧基保護基團置換，最佳由NH2置換， 下劃線殘基表示該片段中第一個胺基酸（Lys21)與最後一 個胺基酸（Asp25)之側鏈至侧鏈的共價鏈接， R2 為 Ser或 Ala， R5 為 Thr、Ser、Asp、Gin、Pro或 CaMeVal， R16 為 Gin、Ala或 Arg， u 18 R 8 為 Ala、Lys或 Glu， R27為Lys或Leu，只是當R5為CocMeVal且R16為Arg時， R27必須為Lys， t R28 為 Lys 或 Asn， 或其醫藥上可接受之鹽。 2·如請求項1之類似物，其中R5為Ser或CaMeVal。 3·如請求項2之類似物，其中R27為[γ。 4· 一種化合物，其係選自由下列組成之群： 122234.doc 200819139

   His-Ser-Asp-Ala-Thr-Phe-Thr_Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu_ Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr (SEQ ID NO: 3)， His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tvr-Leu-Asn~ Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr (SEQ ID NO: 4)， His-Ser-Asp-Ala-MeVal-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr (SEQ ID NO: 8) ^ His-Ser-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Lys-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys_Lys-Gly-Gly-Thr (SEQ ID NO: 11)， His-Ala-Asp-Ala-Ser-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Arg-Nle-Glu-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Thr (SEQ ID NO: 19)， His-Ala-Asp-Ala-MeVal-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lys-Lvs-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu_Lys-Lys_Gly-Gly-Thr (SEQ ID NO: 23)及 His-Ala-Asp-Ala-MeVal-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Nle-Ala-Ala-Lvs-Lvs-Tyr-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu_Lys_Gly_Gly-Thr (SEQ ID NO: 25)。 5. 如請求項1之類似物，其為X-(SEQ ID NO: 8)·Υ。 6. —種醫藥組合物，其包含如請求項1之類似物及至少一 醫藥上可接受之載劑或賦形劑。 122234.doc 200819139 用於製備用以治 7. —種如請求項1之類似物之用途，其 療肺梗阻病症之藥物。 8. —種製備如請求項1之類似物之方法。

   122234.doc 200819139 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：（無） (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：

   X-His-R2-Asp-Ala-R5-Phe-Thr-Glu-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-R16-Nle-R18- Ala-Lys-Lvs21-Tyr-Leu-Asn-Asp25-Leu-R27-R28-Gly-Gly"Thr-Y [X-(SEQ ID NO: 2)-Y] 122234.doc