HU230354B1 - Javított szilárd fázisú peptidszintézis és a szintézisben alkalmazható anyagok - Google Patents

Javított szilárd fázisú peptidszintézis és a szintézisben alkalmazható anyagok Download PDF

Info

Publication number
HU230354B1
HU230354B1 HU0102900A HUP0102900A HU230354B1 HU 230354 B1 HU230354 B1 HU 230354B1 HU 0102900 A HU0102900 A HU 0102900A HU P0102900 A HUP0102900 A HU P0102900A HU 230354 B1 HU230354 B1 HU 230354B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
peptide
acid
group
protected
synthesis
Prior art date
Application number
HU0102900A
Other languages
English (en)
Inventor
Arne Holm
Bjarne Due Larsen
Original Assignee
Zealand Pharma A/S
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zealand Pharma A/S filed Critical Zealand Pharma A/S
Publication of HUP0102900A2 publication Critical patent/HUP0102900A2/hu
Publication of HUP0102900A3 publication Critical patent/HUP0102900A3/hu
Publication of HU230354B1 publication Critical patent/HU230354B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C07K1/042—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers characterised by the nature of the carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Prostheses (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

ANYAGOK
A TALÁLMÁNY SZAKTERÜLETE
A találmány pepudek víbrd fa 'ViJ s/h íí? issei törtet:» elomsáaMra vvratko?ik
SZAKIRODALMI HATTÉR
A sziláid fázisú pepüdszintézis: (SEFS) nagy hatásfokú eljárás, amelyet Merrtdeld, R, B. ismerteted i963-ban p. Amer. Chetn. Soc,, 85,2149-2154 (I9í>3}j. Azóta ezzel az el j árással sz&nos pepiidét szintetizáltak. A peptldek és fehérjék manapság alkalmazott kémiai szmtéziseljárásaU kitünően összefoglalta Kent, S. B, H. {AtmaRev. Bióchetn,, 5.7, 957-989 (1988)]. amely össze foglalót at referenciaként: adunk meg,
A peptídjáficofc szilárd fázisú szintézissel történd felépítéséhez a gyakorlatban kétféle stratégiái: használnak., mégpedig a. lépésenként!: szilárd fázisa: szintézist és a szilárd fázisa tfognmos-kondeoaáciöí..
Á lépésenként! szilárd fázisú pspíldsz»iiézis esetében az N-o-védett és kívánt esetbe» az olballáncön: is védett reaktív származék: C-terminálís aminosavát vagy közvetlenül vagy egy megfelelő kőzvetttőcsoporíen át kovalensen kötik ''szilárd hordozóhoz, példán! poihnergyastáboz, amely szerves oldószerben Azzad. Az N-et-vedőesoportot eltávolítják, ezután a védett aminosavakat lépésedként adják hozzá.
A kívánt peptíd-láncbosszöság eléréseikor az oldaíláne védóesoportjalt eltávoHiják, és a pepiidét lehasitjak a gyantáról. Ezi: végezhetik külön lépésekben vagy egyidejűleg.
Szilárd fázisa ffogmons-konöenzaeio esetébe» & eélszekveneiáí a hordozóit a ífogmsnsek egymást követő kendenzáclöjával ápitik fel, lépésenként! szilárd fázisú pepüdszimézíssel előállítót! védett fragmensek alkalmazásával.
Az elmúlt é vekben két kapcsolási stratégiát fejlesztettek ki, a különböző Ν-α-védőcsoportok és az illeszkedő oldallánchan védett: csoportok alkalmazása alapján.
N-a-védőesppörtks»í Merrifield teÍ'c-hütii-oxi-karlroriíl'-óSOporiot (Boc), míg Carpsno, L.A. és Na», 6. Y, 9-SöoreníLmöEÍ-öxi-kaibosíl-csoportot (Ffnoc) használt ££ Org, Chem... 37,34Ö4-34Ö9 (1972)]:.
A Boc- és Fmoe-esopörtökkai végrehajtott lépésenként! szilárd fázisú pepíidszimézlsse! történő iánenövesztés egy ciklusát ismertetjük az I) es 2) í «akció vázlatokban: (Kenu S.B.B,: Anno Rév. Bioehem., 52, 957-989(1988.)!.
A PAM-gyaniáboz kötött bl-a-Boc-védett pepiid N-ce^vétfőesoporíját tnílnor^-eeetsavval (TEA) távolítsák el. A képződött aminsof mossák és termer-ammsai semlegesítik, Bzatáit a peptiáköiési egy aktivált Boo-aminosav, példáéi: szímmsirikós ónhidrid reakciójával alakitjak ki. Az oldaliáncoi általában benzii-alapá csoporttal védik, és a védőcsoporfof hidrogén-Etíoríddaí vagy szüifonsavval eltávolítják,
A gyantához kötött S-a-Fmöe-védett pepiid N-n-védőcsoportját általában szerves oldószerben, például NkN-dimeúLfermamiábs» tOMK) egy szekunder anrlnnoi vagy díklór-metáohan (DCM) piperidínnel táyolítják el. Mosás: után a setnloges pepddgyantát aktivált f moc-áminosavval, például: hidroxi-benzótrlazol aktív észterrel reagálíatjék.
Az oldallánc véáőesoporíjakéítf tere-tedfe, fmil- vagy arll-szdíöníl-alapú csoportot és az oldalláneok védőesoportjánák eltávolítására előnyösen triSaer-eceíssvsít használnak.
7® 7R-2ó9ö FOT£
Bár a pepfídszlutézis szokásos gyakörfefábsn lényegében Boc- és Fmoo-véáŐesopsrtökat használnak, más N-a-vcdőcsoportokat: is: leírtak (Stewart, X M. és Yb®»gf X. £>.:: Solid phase pepbde synthcsís, Férce Chemical Corspany 0 9&4)'j.
A Bee savérzékeny nreiáncsoportöt képez. Más ilyen dpnsú csoportok is alkalnsazhsúók, például bíténíl-ízopropli-exi-katbonil- (Bpoc), S.ő-dimetoxi-feníbizoprapil-oul-karhonll- (Ddz), féníl-lzopropihoxi-karbonil(Foc) vagy S.S.S-tWaaasin-benaál^xí-k^teö-cSiöp^t (Truz).
Egyéb bl-a-védöcsopottök is afkaim-azbatók, például nííre-feml-szulien 1 «.söpört (bípsk amely vagy nagyón híg vízmentes savval, például sósavval, vagy nukleofil támadással, pe.dául metí 1-3-aitro-d-merkapto-benzöáttal távol ifetók el Ddia<szok£isii-csoport (Dts) is alkalmazható, amely nukileofíl: támadással távolítható el
A szilárd fázisú pepiidsziníezis általános előnye, hogy önmagáim teljesen áúhnuatiktís vagy fék -automatikus iánefeléphést tesz lehetővé. Dryiand, A. és Sheppard, R. C. kis nyomáson folyamatos. áramoltatással végrehajtható szilárd fázlsó pepddszimézísen alapuló rendszert fejleszted ki jX Chem. Soc. Perkia Trans. 1, 125-137 (IRSófj, amelyet Cameron, X., Rfcldal, M. és Sheppard, R. G. ,|X Chem, Soe. Chem, Cotataun, 279-272 0987-j, továbbá Meldal, M., Btsgaard ílolm, C„ Boejesen, C., Havsleen Jakobsen, M és Hóim, A. (int, X Pepiidé ttod Protew· Rés., 41, 250-260 (im-Ck. valamint WQ90/02605 számú nemzetközi közzétételi iratban ismerteted eljárás szerint tovább finomítöttáL llabár a szilárd fázisú peptidszíntézls: mára a fehérje és a peptídszímézis sarokkövévé vált, bizonyos problémák megoldatlanok maradtak. Mivel ezen problémák egy része a pepiid szerkezetével is kapcsolatban állhat, szükségesnek iá-sz-k az alábbi rövid ismerleíes.
Chou, P.Y. és Fástnan, C D kidolgoztak a fehérje konformációk empirikus előrejelzését íAnsm Rév, Bíoehem., 47, 251-276 (.1978)]. Jós ismert, hogy a fehérjék felépítése primer, szekunder, tercier és kvalerner szerkezettel írható: le, A primer szerkezet a tekerte ammosav szekvenciájára voriafkozik. A szekunder szerkezet a pohraervsz helyi térbeli elrendeződésére vonatkozik az oldailánc keu&rtuáeiójának ltgyetetube: vétele: nélkül Szekunder szerkezetek például az u-hélixefo β-íemezék és β-meoetek, amelyek tetrapcptídiápcbói álló ismétlődő régiók. A tercier szerkezet az atomok térbeli elhelyezkedését tSkrözí, beleértve a álszalfid-hidakat és az okiaíláneök helyzetét, amelybe minden rövid és hosszú távú kölcsönhatás heíeérteudő,
Kvaíemer szerkezet kifejezéssel a fehérje alegységek közötti kölcsönhatást jelöljSk, például az ot- és β-hemoglobmiáncökat.
A fehérjék szekunder szerkezete és aonnösav-összetéíele közötti összefüggésre vonatkozó korábbi elemzések alapján: — ahol például a Ser, 'fhr, Val, Re és Cys arainosavakat a héímet bontó® és az Alá, Xea és Cin amínosavakat a béleset képző® csoportba sorolták, míg a hidrofob csoportokat erős a p-képző és a praliné, valamint a töltött aminossvesoportokat p-bontó: csoportba sorolták — Chou és Fashmaa 29' ismert röntgen szerkezetű fehérje statisztikai analízisét végezte el egy, az «- és S-régiókra vonatkozó előrejelzési szabály felállítása céljából.
Ezen vizsgálatok alapján meghatározták a fehérjéket alkotó természetes L-amlnosavak úgynevezett Pa, Ρβ és Et vonzási faktorait, amelyek rendre az u-héfa, β-íemoz és β-menef helyzeti preferenciáit meghatározó konformációs paraméterek.
A Pa és Ρβ értékeket az áttekinthetőség kedvéért az alábbi táblázatban adjuk nreg. Az adott aminosay egybetSs rövidítését zárójelben adjuk meg.
P« P,
Gle (E) 1,51 Val 1,70
Mei s'M) 1/15 He 1,00
Alá (A) 1,42 Tyr 1,47
Hsa ()-) 1,21 ; Phe 1,38
Lys (K) 1,16 W“ 1,37
Phe (F) l.B Len 1,3 0
Gin O 1,11 Cyr Llö
W (W) 1,08 Thr 1,19
ile (1) LOS Gin 1,10
Val (V) 1,06 Met 1,05
Asp Φ) Löl ARg 0,93
HL (11)............... Löö Asn Ö,89
Arg (H.) 0,98 Kis 0,87
Thr ; ί Π 0,83 Alá 0.83
Ser (S) 0,77 Ser 0,75
Cys (C) 0,70 Oly 0,75
Tyr (Y) 0,69 l..ys 0,74
Asn (Li) 0.6? Pro ö,55
Pro (P) 0,57 Asp 0,54
Glv |G) 0,5? Gin 0,37
Álíakfeissságbán írsegádapithátó, hogy az LÖD alatti értékek azt jelentik, hogy a kérdéses aminösavat .az. adóit szekunder szerkezet szempenp^ából kedvezőtlennek kell tekinteni,.
Példáni a fodroiob savak (például Vak pAeunez-képzŐ, míg a töltőit anrinosavak (például
GU Asp, Bisj fl-lemez-bontő tulaldönságóak.
Az sx-hélix szerkezetben. a spirális pepiid kotdlgoráclóí a (VH1) képietö Ismétlődő egységben lévő ak?»gésái®inhoz kapcsolódó Indrogdnatötn es a szénatomhoz kapcsolódó oxágénate» kősóéi hídrogéskötések rögzítik szilárdan ahelyén a lánc mentés bárom egységben.
Ba a poiipeptiöet oldatba visszük, az u-hélix a pH beállításával kitekerhető, pzáhal rendezetlen gombolyag jön létre;. Az o-hélixből a rendezetlen. gombolyagba történő átmenet szak pH tartómánybas? következik be. Mivel a hldrogénkótések köteserőxsége az o.~héli síben egyforma, ezért hajlamosak egyszerre felnyílni. Ez az átalakulás hővel Is kiváltható.
A β-lemezes szerkezet teljesen klnyuuoa peptsdláncökfeól áll, amelyekben az egyik lánc hidrogénatomjai a szomszédos lánc oxigénaiemjaihoz íudrogénkötéssei kapcsolódnak. így ezek a hidrogénkötések az o-héllx-szel eliemétbee nem vesznek reszt a -tóm belső szerkezetében, csak a láncok közötti kötésben, A szomszédos láncok gárhamazösak és azonos Irányúnk (parallel) vagy párhuzamosak és ellentétes iránynak (antiparalfel) lehetnek.
Gyakran figyeltek mag olyan ffimensteket a pepfiálársu «zen részeiben, amelyek aofipar&llel láncokat kapesoltták össze egymással |3-!emezes szerkezeiben.
Egy β-spirálban a pepíidláne n-szútnó anrinossyjának CO és W csoportjai az.ní-4 számú anúnosav megfelelő csoportjaivá! képeznek hitkogénkötest.
Az «-héiix és a β-lemez a fehérjék peptid-koníormádójában nagymértékben változó részi tesz ki (ö-tól: 80 %-sg) és a fehérjék fennmaradó része más szerkezetit. A peptiáláneok fehérjéinek legnagyobb része szabálytalanéi hajlított rendezetlen gombolyag.
Rátérve a szilárd fázisú pepiidszintózíssel kapcsolatos általánosat; jellemző problémákra, Kent, S.B.fe. hívta fel a figyelmet a problémás szekvenciák szintézisére (Ár®« Rév, Brechem., 57,957-989 <1988)1.
Nyilvánvaló, Itogy a szilárd lazám peptldszintezis teljes elemezése során mindegyik kapes?fiási lépést megelőzően az N-ct-védöcsöpottoi fellesett eltávolítják.
Esnek alapját? elméletileg az Összes olyas aisisöesapofísak, amelynek N-a-helyzetü vedöesoportját eltávolították, a reaktív arnmosav-szárrauzékhoz s kívánt szekvencia szerint kellene kapcsolódnia, azaz teljes anslnomctlezésnek kellene végbementbe.
Kent azt állítja, hogy a lépésenként! szilárd fázisú peptídszintézis legkomolyabb potenciális problémája, hogy a peptidkötesek képződése sem megy tevésen végbe, ami olya?·, a ceiszekvenclához. hasonló tnlajdonságá peptideke! eredményez, ahol egy vagy több ammosav hiányzik (deléeió).
Ez a ?-e?n teles kapcsolódás bizonyos szekvenciák esetében gyakoribb, mint másoknál, lnne?; ered a pteblémás szekwm. fek” kifejezés, és ez láthatóan szintén sokkal gyakoribb az Fmoe-e'sopartokaáívmrnt a Boc-csoppítoknál,
A kutatók számos azonosított prolfiémás szekvenciát* ta?mlröáayozfek, beleértve a jeles feltalálókat is.
A leacmt vagy alantot tartalmazó bomo-eligopeptklekFmoc~sí?atégia alkalmazásával végrehajtott szilárd fázisú peptidszíntézlse során megfigyeltek, hogy az: N-a-helyzefbetí pjperidmttel végzett szekvenciafílggo vódácsopört-élfávofitás hatástalan (társén, B. D., társén, C. és Hóim, A.: Eepiídes (199Ö); Gsrah, F„ és Andrea, Ö>: (Eds). 1SCOM Science Pubüshcrs B.V., 183-185 (1991); harsén, B.D, és Hohtt, A.: fel, J, Pepiidé <fc Erőiéin Rés., 43, 1-9 ί 1 Q9a)]. λ vizsgalatok szerint ez: a jelenség az amfcossvak egymást követő lassú vagy' sem: teljes kacsokkiásával tegg össze, és a növekedő peplidlánc β-lemezés aggregáíóbását tekintik a nehéz kapcsolódás ós nem teljés Emoe-védőesopoö-eltávoiitás ©kának, Ennek bizonyítását általános fizikai-kémiai megfigyelésekkel [Larsen. 8. 0. és Holta, A,; fet, 1, Pept-de & Erőiem Res„ 43, 1-9 G9l>4)j es részletes Ea?n;?n közeli infravörös spektresszkőpiás vizsgálattal [IXte Laersen B., Christensen, D.H., Kölnt, A., Zíllroer, R. és Faorskov. Ο,: X Amer, Ghem. Soe,, 11:5, Ó247-6253 (1993)] végezték el. Az említett fizikai-kén;iái megfigyelések az alábbiak szerint foglalhatók össze: AK-(Ala)„-Lys-OH poliamiddal polimerizált Kíeseíguhr mátrixon (PepSyo Ki végzett szintézise esetében: tmó értékig sem észleltek problémát, de .irt értéknél: piperidinncl végzett szokásos védőcsopori-eltávohtás: után <29 3« plpcrídfjvdmmtii-fbrsnamiif) kOrSlhelöl 2Θ % és.25 % közötti mennyisége Fmoc-védeft pepiid maradt. A szintézist tt-IÖ értékig folytéivá viszonylag bonyolait keverék képződött, amely ; (.cfeeptidet <n 10), továbbá o-o, 7, 8 es 9 értéknek megfelelő déíéeíós pcptldekeí és rendre :n=6, 7, 8 és 9 é’teőí o’yus öeléeiós pepfeieket tartalmazott, amelyek N-fertntuáfisáhőz. Ftnoe-csoportok kapcsolódtak, ahogy ez: az 1. ábrán látható. Ezt a keveréket az egyes komponensek Wf,C elválasztása mán FAB MS analízissel azonosították. Hibás szekvenciákat vagy «»2-5' értekek közötti részleges védőesopori-lehassdást vagy' nem teljes nfertékő védöosopörí-iebassdást: az n-IÖ értékű célpeptld esetében: nem Egyeltek meg, ezzel a pr?feléma egy adott homo-oilgöpepiíd-lánchcsszúságrá baíárolődótt be. Ezt a problémás atnino-aciíezést ás a nem tejes vődőasoportúebasarlást áeiö^rendszertetenneb tsevezzük, szemben. a csupán szokásos szteríkus problémákra visszavezethető rendszertelenségből fakadó nehczségektel jKesf, S. E, 11.: .Ansu Rév. Etocbw., 57, §57-» <08)1 A kísérteti körülmények. úgy tnlnt a gyanta típusa, védőcsoport: eltávölitásánnk ideje, öldószersk, chaoteópok hozzáadása, változtetásávak a problémák tncgtmaradtek, azonban 50 “C-ra íörtéttő hevítéssel optimális hatás gytihoroíható a nem teljes Fntoc-vedőcsoport-eltávohtáara [harsén, B. D. és; Hóim, A.:: Int. J. Pepiidé & Protein Rés., 43, í-9 (1994)].
A homo-oligo-atenm-lánc legjeltemzöbb tölígdensága, begy a sem tejes fmoc-véábessport eltávolitásl lépés alán a szekvenciában következő; arnínosavval végzete acilezés rendkívül lassan megy végbe. Esnek megtételen az első ő alsóin mindegyikére vonatkozóan a hatásos acilezési idő őö percnél rövidebb, amíg a tejes adtezés az Alá-?, Ala«, Ala<?, Aiaif5 esetében rendre 26, 20,10 vagy 7 őrá [Kent, S. B, .Hu Áuau Rév. Bioehem,, 5.7, 057-989(1948)1
Kent a Iént említek iratban számos megoldást javasolt a szekvsnesafsggö kapcsolódás pmbternálnsR kezelésére, példáéi hőt; alkalmasod a kapcsolási lépésben, és a maradék el nem reagált gyantához kötött pepodláncot, úgyse vezeti1 befedési (capping) eljárásban kvantitatív módos', alakította át a kívánt sennékké.
Az; 5 021; 551 számú amerikai szabadalmi leírásban eljárást ismertetnek szilárd Ihzisú pepiid szintézisére, amely eljárásban; az elreagálatktn köztitermékeket a reakcióból úgy távolították el, hogy azok reaktív N-termísálisaü kovalensen kötötték a szilárd hordozóhoz, ezáltal a köztitermékeket két helyen rögzítették.
A TAI.ÁLMÁN Y ÖSSZEFOGLALÁSA
Találmányunk célja szilárd fázisú peptsdsztetezis kidolgozása, amelynek során a “problémás szekveneíákkéttf' ismert vagy ilyen tnímdon.ságú pepiinek nagy kitermeléssel és tisztasággal állíthatók elő,
Táláhpáuyunk további célja szilárd fázisú peptidsziniézis kidolgozása, amellyel a kapcsolási; idd, nemcaak problémás szekvenciák esetén, hanem egyébként nem problémás szekvenciák esetén is csökkenthető, ahol á normális hosszúságú kapcsolási idő csökkentése kívánatos.
Találmányunk lentiekben ismertetett és egyéb céljait a leírás további részeiben és a mellékeit ábrákon mutatjuk be, amelyeken különböző, szilárd fázisú szintézissel; előállítóit peptidek HPLC diagramjai látfeaisk.
A RAJZOK RÖVID ISMERTETÉSE
Az 1, ábrán :a nyers H-AÍa1(f-Lys-ÖH HFLG diagramját mutatjuk be, amelyben jelentős mennyiségé deléeiós pepiid (t., 2., 3: és 4. csúcs) és nem teljesen eltávolítóit Fmoc-védőcsoportú peptktek (6,, 7,, § és F, csúcs) mellett a célpeprid (5. csúcs)jelenléte látható;
á 2, ábrán hemtstatete diagrammon az· egyes alsntnok szekvenciális faspesolődásl Ideje látható a H-Áb!0-Lys-ÖH szimezise során;
s 3. ábrán a .H-Átei9.-hys3-OH HPLC diagramja látható a célpeptiádel, delédós pepítdek nem észlelhetők;
a 4, ábrán a lí-ÁláM-Lys3-QH HPLC dingramja látható defeelös pepítdek {!., 2,;, 3., 4. és 5, csúcs) mellett íí eéipcptul jelenléte (ő. csúcs) figyelhető meg;
az ó-ábrán; a. H-Alají;-L.yss-OIÍ ItFLC diagrarsrja látható, cteléclós peptidek nem észlelhetők; a ő, ábrás a H-Ala?a-Lysri-GH HPLC diagramja látható, deíéctús peptidek nem észlelhetek;
« JLJhjte a H-VQAA)ÖYfNö-ÖH aciLhordozOtehege (ACP) 65-74) HPLC diagramja látható, a célpepíid; (3. csúcs) mellett dőteciós peptidek iá 2. csúcs a des-Yal-pepiid) észlelhetők;
a 8:. .ábrán a l^feBoejs-előszekvesrciához kapcsolt O-VQAAffiYWö-Ke-öí'I acbbtordozöfehérje (ÁCF) 65-74 HPLC biagramja látható, csupán kis mennylsegó des-Vai-peptíd: figyelhető meg (1· esúcsj;
a 9.:.Ábrán egy HMPA közveiítőesopon ^Iktatásával eiöállííotl: E-Afe!e-í,ys-<iH 11PLC bfegrahpa látható, több deiéeiós peptid figyelhető meg éAÍajö-Lys(tSöC)-EMFA-{Lys(iBoc))s-gyamáböl);
a. 10. ábrán. egy hassnlő diagram, az Mkía-kózvetitö esopoó alkalmazásával előállított H-ÁlaS:;,-Lys-OH idPLC diagramja látható, ahöl a 9. ábrával összehasonlítva a deléctős peptídek.'mennyisége jelentősen csökkeni (.A.fe:!o-ty:5MMá.“(Lys(t.Bee) Vgysstúbőfp ezt .az ábrát pasztán: szemléltetés céljából mutatjuk be, társén, B. D-. és: muKkatársat fentiekben vázolt inhnkáinak iapplmásyozása sorára- a jelen feUslálékbau felmer® a kérdés, hagy a kömo-öligo-afenin-iáncban a képződés milyen mértekben befolyásolható úzálSsl, ha a Cdermináiisánál a láncba egy rüvldebh peptidsz®venc:iáf, egy döszekvenesát építenek be. Sas: a kérdés azzal a ténnyel all kapcsolatban, hagy a fehérje szerkezetek és a poiipepííb-szekveneíák a szekvenciában lévő amínosavuktöl és az előző aminos&vaktől függő jól definiált szerkezetekbe is átnyúlhatnak, Ahogy ezt fentebb említettük, Chou és Fasmaa fehérje szerkezeteken végzett vizsgálatai során (Chou, P.Y. és fasman^ ö, Amm feev. Sióéként., 47, 251-276 (1978)] olyazs aminosavősztályokat azonosítottak, amelyek fálnyötsóan a-helixet, (Mentest vagy mnbezetien gombolyagot Indukált®, Habár előre várható, hogy hasonló- előrejelzés aikahnazholő a homo-oiígo-alamnokra vagy ieucioskre Is, azonban harsén, B.D. és Hőim, A. kimutatták [int. í. Pepiibe & Protein kés., 43, 1-9 fi 994)j, hogy Chou és F&smao szabálya alapján előre nem jelezhető, hogy a homö-oligo-alanin- vagy -leuetn-pepídek 8-lemsá képzó láncok. Ezen túlmenően Choa és Fásma» szabálya várhatősít nem alkalmazható gyantán végrehajtott pepllászlntézishen és határozottan nem. alkalmazható, ha a.
szintézisben oldall®®ap védett amiuosav szerepei.
Az álápvtzsgáiaiek során olyas li-fÁís^tysVÖH ákalásms képiéin vegyület szintézisét vizsgáltok, ahol íkys)i;; jelentése előszekveneia és m értéke 1, 3 vagy 6, A pohamidos szilárd, fázisa eljárásnak (Dryiand, A. és Sheppard, fe. C,: J.. éhet», Soc> Perkin Trarss, 1, 125-137 09§6)j egy teljesen, automatizált pept idszlntetizálorra kifejlesztett folyamatos áramoltatásé változatát használtak, ahogy est korábban említettük: jGatneron, L,, Melbal, fel. és Bheppard, R. C.: 1. Chem. Sec. Chem,. Common, 2.78-272. (1987)j, ahol oldószerként bimetil-íormaobdoí alkalmaztuk, továbbá rendre az Fmoe-alsnln és Fmoe-liziu-(t«rc-Böe)-pft>-észterek háromszoros feleslegét alkalmaztuk. Az Ernoc védöcsoport eltávolítását 28 %-os dímetli-formamídos ptpertdlnfees végezték lő percig, A kapcsolási időt Dhbí-Ofi-val követtük, mivel az. sárga színű Dhht~O' anionná deproíonálódik, ha még vannak jelen nem acílezett atninocsoportok, és. a sárga szín eltűnése jelzi a szintézis végpontját, A pepiidet a gyantáról 95 kk-os vizes trifíutir-eceisavval hasítottak, majd a termékei éterrel mostak és HPLC-vei analizáltuk. Az m~i érték esetében kaprát eredményeket az: 1. ábrán mutatjuk be. m~:3 értek esetén a 3. ábrán bemutatott RPfX nyomokból látható, hogy' a szintézis Aiá;í;~ig folytatható anélkül, hogy detektálható mennyiségű deiéeíos pepiidet vagy nem teljes Pmóe-védőesöport iehasabást észlelnénk. Azonban, ha a szintézist Afesrlg tolylaljnk, a 4. ábra szerinti kroisáfögrammon: látható, hogy deléclős pepiibek jelennek meg. Az eredmények még kifejezettebbek E-<AÍa)n-(LysfeÖiŰ esetében, ahol a termékek detektálható mennyiségű beláciős peptid nélkül állíthatók: elő mind Áí»j« (5. :ábra), mind Ahoe fő, ábra): esetében, Ezen tölménöes a kapcsolási idők határozottan lecsökkennek, mégpedig egyetlen lépésben 38 óráról 2 óránál róvibebb szokásos- kapcsolási időre. Korábban góc-eljárással szinienzák H-Atejo-OH szekvenciát kíséreltünk meg előállítani, azonban nagymértéké pepuddeléciot és beépülést észleltünk iMemneid, R, B., Sisger, J,. és Chait, B. T,: Anak Biochem.. .174, 399-414 (19®)]. A l.ys,·, előszekveneia, amely a szintézisben. oralkodó körülmények közölt tere7
-Boc-esopofttal teljeses védett, a növekedő pepddláne szerkezetére a leghálánstotínbö előnyös hatást fejti ki, ez megszünteti az egyébként nem teljes véőöcsopert-eltávolitáshől és a rendktvíd lassú kapcsóiódásból adódó nagyon komoly sztutézts-probfemákaf.
Ezzel a meglepő felismeréssel összhangban íuiúhnártyunk a szilárd hordozóhoz a C-tennmális részen kapcsolódó bizonyos elöszekveneiák beépítésén alapul
Ez alapvető eltérést jelent a problémás szekvenciákra vonatkozóan a szakírodalömhan ismertetett megoldásokhoz képest, ahol a reakciókörülmények és a szilárd hordozó tulajdonságai álltak a fókuszba».
Ahogy az alábbiakban részletesen bemutatjuk, a C-íerstmális szekvencia, amellyel: a. pepiid a szilárd hordozóhoz kötődik, megfelelő közvetitőesöportot Is tattalniazhat. például a jobb kötődés vagy a hasítási körűiményék biztosítása céljából
Esnek megfelelően találmányunk egyrészt az fi) általános képietű peptidek, a képletben
A A jelentése 1,- vagy ö-aminosav-mtodék,
X jelentése hidrogénatom vagy anuno-védőesoport,
V jelentése hidrofil- vagy aminoesoport és s értéke 2-nél nagyobb egész szám;
szilárd fázisú: szintézissel végzett előállítására vonatkozik, ahol egy Ν-α-védett és adott esetben okblfáncbats védett reaktív származék formájú CAsrminsfis amiuosavní egy szilárd; hordozóhoz vagy egy polimerhez kapcsolunk adott; esetben: egy kózvetitöcsoporton át, ezután az fe-a-védőesoportot eltávolspuk, majd ts pepiid szekvenciái képező további aminesavakai lépésenként kapcsoljak vagy peptid-feagtnensként kapcsoljuk, amely peptid-fragmensek megfelelően védett: reaktív származék vagy iragmens iormájú&k, ahol az N-cr-védőeseportot a kívánt pepiid képződése «tán- eltávolítjuk, és a pepiidet; lehasitjnk a szilárd hordozóról, azzal jeliemezve, hogy az eljárás tartalmazza továbbá a következőket kiválasztunk egy eiőszekveneiát, amely természetes ammosavak közül egymástól iliggeliesöl kiválasztott 3-9 maradékot tartalmaz, amely természetes ammosavak olyan oldallánc fetíkdőscsoportokaí tartalmaznak, amelyek a kapcsolást lépésekbe» vádettek és Pa: vonzási faktoruk >0,57 és Pp vorzás: faktoruk < 1,10. ahol az említett pepiid C-terminális része tartalmazza az eiőszekveneiát; és M eml K h ete'.zehveneiót lehajtja*, a képződött pepiidről
A Ptx és PB vonzási faktorok feni említett határán: lévő t-aminosavak a Lys, Gitt, Ásp, Ser, Íjig, Ásó, Arg, klet és Gin.
A fenti aminosavak mindegyike a következő funkciós csoportokat tartalmazza: karhoxi-, tójexamtdo», amlso-, hídrozí-, gaanldíno-, szülőd- vagy Inudazöfesopört,
Az eiőszekveneláhan jelenleg előnyösnek tekinteti ammosavak a Lys és a Glu, valamint ezek kombinációi, például föiujqfLysjp, ahol p + q értéke 3 és 9 közötti, előnyösen ó és 9 közötti, és. a lyís és Gla rendje önkényesen meghatározott.
Az egyes kapcsolási lépésekben alku InrazoU anunosavak vagy fehérjeiragmensek N-ot-aminocsoporíja a kapcsolás folyamári megfelelően védett, A védőesoport lehet Fmoc vagy Bee vagy bármilyen megfelelő más, például a szukitoáalemban ismert védőesoport fStevvarf X M, és Vonng, X Dg Solid phase pepiidé synfhesis, Fiercc Chemical Company (1984), Feptldes:: Syntbesls, sfeuetnres and applkailoos,, Gntte, B,, Ed. Acadsrnic Press· Inc, (1995)). jelenleg előnyösnek tekinteti N-ö-védőesoport az Emoc-esoport.
Nagyon fontos, hogy a kapcsolási lépés folyamán az előszskvendában lévő oidalláne-védŐcsöporíök megfelelően védettek tegyenek. Az ilyen védőcsoportok a szakterületen járatos, személy számára j ól ismertek, az dteiyps csoportok listáját a 7-12. igény pcmtet, bán adjak meg
Anélkül, hogy egy bizonyos elmélethez kötnénk, föltételezzük, hogy a példaként fölhozott üzín előszekvescia védett oldalláncának fizikai-kénüas tulajdonságai felelősek a megügyelt szerkezetileg iántogatotí peptidszintézisért (SABS), mivel a polkalanimszekvenclában csökkentik v&gv megakadályozzák a β-fösnez képződést.
Más hotbö-öligó-elószekvenciák esetében megfigyeltük, hogy a (Giuítere-Hthb, akárcsak a kevert (Gl8(íerc-Ba)kys(íere-Bocj):5 szekvencia a pok-alammtáoehaa előnyös: szerkezetei indukál, ezáltal deléelőa pepiidet nem tartalmazó termék képződik.
Annak tanulmányozására, hogy a szerkezetileg: támogatott pepf idsziniézíx egy általánosabb jelenség vagy csak olyan homa-oligo-peptidekre korlátozódik, mint például a poli-alanln-xzekvencia, megvizsgáltunk bizonyos problémás szekvencia bitében álló ismert kevert szekvenciákat.
A H-VQAAlBYfNö-öli adkfeortfozófölför|e (ACR) 45-74 szintézise egy jól ismert problémás szintézis, amelyet számos esetben modeflreakciöként használtak jCameron, L, R,, Meldai, M, és Ssoppard, R,. C.t J. Chem. Soe, Chem:. Gonmmtg 270-272:(1987)]. Szokásos isódon végrehajtva a szintézist deléciós pegiidek és áes-Val pepiid (2. esáes), mint jellemé tneUékförmék képződését észlelték, ahogy ezt a 7, példában és a 7. ábrán látható.
Találmányunk értelmében a. H-YQAA1DY1NG-KS-O:H szekvenciái egy K-pepszín Crtermmálisához kötött (lys{íére-Boe))<, elószekvénela alkalmazásával szihteíizáljttk. A szintézisbest pontos snofökídatömegű, nagy tisztasága és jelentősen csökkent des-Val-pepiid tartalmá lernfökgi: állíhmk elő, ahogy ezt a 8;. példában és a k, ábrán bemutóijuk.
Szinten problémás szekvenciaként ismert a H-VNVNVOVQVD-OH. amelyet különböző áramló gyantákonszintetizáltak [Rapp polymer, PEG-PS, Pepsyn K, PRO A 1900-300, RS3A. 800/1.30; és BRQA 30Ö/13Ö). Minden esetben már a Vak-bőt eredő jelentés: mennyiségű itatet kísérve, kivéve PBGA 1900/300 gyanta alkaltnazása esetén [Meldak M.: Reptldes (:1393); Kelméidért C. & és Eberie. A. N. (eds),r ESCöM Science Robiishers δ. V,, él»ö2 (1993)]:. Találmányunk szerint a M-VNYWQVQVDfG-ÖH szintézise pontos tsolekulatótnegű terméket eredményez, A spektrumban doléciős peptideket nem mutatkoznak, ahogy· ez a 3. példában látható.
Találmányuk egy másik nagyon fontos vonatkozása, hogy a kívánt pepiid C-termínálís részén egy élőszek vénéig bevezetésével a kapcsolási idő csökken, ennek bizonyítására megvizsgáljuk az enkefálin H-Tyr-Cly-Gfy-Phe-keu-ÖH (kysCisre-Roc)),; jelenlétében és íávollétében végzett szintézisében ;az egyes· amlnsavsk kapcsolási idejét, ahogy ezt a 15. példában bemutatjuk,
A mérések eredménye azt mutatja, hegy ebben az egyébként nem komplikált szithézisben a kapcsolási idők a választott előszekvescia kombinálásával jelentősen változnak.
A fönt ismertetett esetekben a pegridszékvenciáksí hexartizín-elöszekvéne iával ál lítjuk elő, amely bizonyos. célokra elfogadható, sőt előnyős is lehet. Így a b-lemez képző szekvencia súlyos oldhatósági problémákat okozhat, de H-Ál&^<Lys)e-ÖS esetében a pepiid oldhatónak bizonyult vizes oldatban, míg a H-Aiaíö-:Lys-OB nagyon gyorsan kicsapódott tetrafiuor-eeetssvas oldatból vízzel hígítva, (CiuK esetében az előszekvemda által biztosított oldhatóság és a karbonsav csoportok mennyisége példán! BO'SA céljából használható, ahol a megfo9 telő amioocsoport alkalmazásával az aktivált helyre Irányltoíí kötődés tehetővé vilik vizes oldaliban, példás! karbediimlddei könnyen elvégezhető aktiválással. Azonban: azt is rneg kell feniöíni, hogy a fenti megfigyelések hogyan, hasznosíthatók a gyakorlati peptidsziníézisfeen snéiküi, hogy az előszeteveRclák a végtermékben rnegjetennének. Ezért megkíséreltünk az eíoszekvencla és a féipepiíÖ, példás! gyanta:-(kys(tere-Eee))á~közveí:ítócsöpert-pepdö közé egy célcsoportot bevinni ami: lehetővé teszi a pepiidnek a közveüsóesoporirél szokásos: reagensekkel. példás! adszorber gyantái tartalmazd íriRuor-eeetssvas oldatta! történő lehasítását. Azonban a szokásosan alkalmazod HMFA közvedtocsöport, a gx®^<LyX>e«;-8öC}}6-HMPA-Lys{»rcvB)ei}AÍ8:io· bevezetése, amelyet a 10. példában ismertetőnk, határozottan negatív hatást fejt ki a H-Alá(-1 ><-ÖR szintézisére, mivel deléetes peptidek képződését eredményezi, ahogy es a 9, ábrán látható. Az doszehtermának a polí-alanm-szerkezefre gyakorolt hatása láthatóan elvész, ami arra mutat, fogy a közvetitőesoport aromás csoportja lerontja a (Afek-fLysb pepiid alap vázának szerkezeti hatását.
A találmányunk kidolgozása során végrehajtott kísértetekbe·!: sifealmozöií töriílmenyekeí az alábbi: általános eljárásokban istnértefjök.
Az elöszekveneiáí'a és a hasító közvétitőcsopöítokrá: vonatkozó jellemző tnlajdonságoktöi eltekintve a ta~ láirnáíivsnk szerinti eljárást általában a szákhxxdaksnfean ismert módon a szilárd fázisé peptldszintézls szokásos körülményei között hajthatjuk végre a hátsérirodálomra hivatkozva.
Ez az alábbiak szerint foglalható össze.
Az Fmac védőcsoportők. egy andnoal, például píperidmncl vagy d!azabie&loí5.4.Öjnndee-7-ennei (!>BU) távoli-hatók cl.
Az: oldaliáne védöesoportok egy savval, példán! trifuor-eeetsawaí (TEA), td^mr--m^á»$zulStwv-vaÍ fTElMSA), feiárogés-bremiddsk sósavval vagy hidrogés-f uoriödai távolíthatók el.
A szilárd: hordozó előnyösen mnkeíós csoportokat tartalmazó gyanta, példán! poliszítrol, poüakrííamid, poltetlíén-ghko!, célhdöz, poí teti lén, látes. vagy dynahead.
Kívánt esetben a C'-lermínálís aminosavakat szokásos kőzvetítöcsoportokka! kötjük a szilárd hordozóhoz, mint a 2.4-dlnteíoxl-4’-biároxi-benzöfenon, 4-(4-hidróXí-íneíll-3-;neiöxi-fenoxi)-vajsnv (HM PB), 4-hldroxi-tneíil-benzoesav:, 4-hldfoxi-meti!~fenoxi~ecetsav {HMPA.1, 3-(4~hidroxi-metiÍ-íenox i)-propionsav vagy p-[(K,Sj-a[l-(9H-ílv.oren-9-íi)-metoxi-formamtdo|-2,4-dimetox}-ben?.il]-fer:oxÍ-ecetsav (AM).
A szintézist sarzsookení vagy folyamatosan végezzük sgy automata vagy félautomata pepiid szintetizátorban.
Az egyes kapcsolási lépéseket oldószer, például acetonhríl, H'.H-rbmetil-fbrtnstród (DM'F), H-metl!-pirroiidon (HMF), díkíór-metán (1X1M), teiflaor-elaoél (TEE), eíanol, metanol, víz, vagy az említett oldószerek keverékének jelenlétében végezzük adalékanyag, példáid perkloráí vagy etilén-karbonát jelenlétében vagy távoílétéhen.
Két aminosav összekapcsolását. egy' asnhíesav és egy korábban előállított peptídszekveneia vagy egy pepíldfragmens és. egy korábban előállított pspíidszekvencia között végezzük szokásos kondenzációs eljárással, mint például az azidos eljá-ás, vegyes suxunmoj dús eljárás, szimmetrikus snhldddes eljárás, karbtxiínnides eljárás, aktív ész-eres eljárás, például p<u taíkor enil- íPfp), 3,4-dihidro-4-axo-bcnzoí!razí»-3-ií- (Dhbt), benzotriazol-1 ói- (Bt), 7-azabenzoíriazoí-!-ií- (At), 4-nitro-íení.i-. N-hidíoxi-borostyánsav-lrnids-észterek (NHSl, savkloridök, savliuorídok, in síin aktiválása ö-(7-azabenzötrlazol-!-il)--i,i.,:3,3~telrainetil~nróni3m-hexanuor-foszfádaí (HÁTÚ),, 0-(benzotrlazoi-i-ii)-i,l,3,3-íetrametü~urőn:juin-bexalláor-feszfáttaí (HBTU),
SÖ
O-fbenzotriazoí-i-íí)-f,1 ,3,3-teizametil-nróalum-teiraflimr-boráftal fTSTU) és beozoíriazolil-oxi-irisz-fdimetll-amino)-S)sztenium-hexaSuor-lbszfaííai (BÖP),
A képződöd pepiidet a hordozórőt egy savval, példán! tri'fiwr-ecetsayval <TFA), tóilluorrmetáwtófoasavvaf (TFkiSA), hldrogén^bromiddai^ KW),. hidrogén-kloríddal (líGl), hldíogén-ünoriddal (HF) vagy egy bázissal,. például ammóniával, hidrámnál» alkohöiáííal vagy hldroxiddafhasítjnfe ek
Alternatív módon a pepiid a hördözőről fotoíizisseí ís lehaslfeíó,
Annái a megvalósítási módnál almi a hordozóhoz; kötött elöszekvenda ős az ΑΑ;-ΑΑ„ szekvencia közé' .közveíítőeseporíöt viszitek be·, .tehetővé teszi az adok szekvencia szelektív hasítását, ahol a hasítást savval példáéi trideoreeetsavval (YFA), iriFnor-ínefánsznlforssavva! (TFMS.A), hldrogéR-bromiddal (ISt), hidrogénddoriddai (IfCl), hídrögéo-fitmriddaí (FíF) vagy egy bázissal, például ammóniával, bidtezteoaí, alkokoláhai vagy lódrexíddal bajijuk végre.
Egyik változat szerint a pepiidet a hordozóval tetellzisseí hasítjuk le.
Annái a megvalósítási módnál, ahol az közveíitőcsopöböl a hordozóhoz kötött eíőszekyegcta és az említett szekvencia szelektív iehasadását lehetővé tevő .ΑΑτΑΑ2,..,ΑΑη szekvencia közé llleszdak be, az említett hasítást végrehajthatjuk egy savval» például triíluor-eeetsavval (IFA! trítluor-metáuszulfbnsavval (TFMSá), hídrogétebremuddai íHBrk tedfogén-kloríddai (HG1)» hidrögén-feöúddal (HF) vagy egy bázissal, például amteőniávul, biárszíssal, aikoboláPsI vagy hldtoxiddal.
Az előszekvendíát enzimes hton .hsxlijak le & képződött pepiidről Előnyös megvalósítást módnál az en/r\1 cg eb > «ómul t\eudopepuduiOs kivid választjuk
Szekvenciával elősegített peptidszíntezis (SAPS)
Kísérleti eljárások
Péptídszmtézis
Aköí&ms Níárdr
Á pepiidekeí szórós céljából ponpropilen-szarővelellátott polietilén edényben, sarzsonként vagy poliamidos szilárd; fázisú eljárással, folyamatos áramoltatással állítjuk elő [Diyíand, A. és Sbeppard, R.C.: 1 Chest Soe. Perkín Trans, L 1.25-13? (198ő)j egy teljesen antemterzált peptídszlntetizátorbsn jCámeron, L,» Meldai, M.
és Sheppard, R. C.- 1. Chem. Soe. Cher;. Combé, 270-272 G987)1 ahol N-o-ammo-védöcsoporíkéní 9-fluorenikmetil-oxí-karbnötl- (Fmoc-j vagy tere-bubl-oxi-karboníl-csoporlot (Boc) és m oldalláncbas lévő ínnkcióscsopóríok védésére megfelelő szokásos védőexopozteRaí használunk.
Oldószerek
A dímetd-főmtamld oldószert (DMP,. Rísde! de-Flően, Németország): erős katíoncserélö gyantával (kewatif S 1ÖŐ, NtíKl-í erősen savas, Byer AG, lever&nsen, Németország) megtöltött oszlopon törtem! áttolvafással tisztítjuk, és felhasználás előtt megvizsgáljak szabad amlnfartalmát oly módon, hogy 3,ő-díhidrö-3-hidrí>xí-4-oxo~:.2.3-benzóíriázint (Dhbt-OH) adunk hozzá, aminek hatására szabad aminjefcnléteben sárga szintivé válik {Dhbt-O anion), A dlklór-metán oldószert (DCM,. analitikai minőség Rtedel áe-i-Men, Németország) tisztítás nélkül közvetlenül használjuk tel.
Aminosayak
Az Fnme-vedeit amínosavakst és a tnegfélető pentaHuor-feúl-észtereket (Pfp) öldallámfban; megfelelően védett fötmában a kővetkezőktől szerezzük be: kldhOes (Fgyesölt Királyság), NövaSloehém (Svájc) és
Bacbem (Svájc } és a Dbbí-észtereket a NövaBroehem-tŐl (Svédország) szerezzük be. A Böe-védett: aminosavakafc Bachemfói szemezik (Svájc),
Kapcsoló reagensként alkalmazott d zopr, >pil-harhod hm ide· (OIC, Riedol de-Baen, Németország) használat eiótt áesAilláljuk, a íPcíkiohexiMí&cbix m >4eí (OCG, beszerezve Merck-Scteehardt, München, Németország) deszitlláiásssi tisAitjük, Az: O-fev ,zon 5»!ojikN,N,NkN'-tetrameti)-nróotam-tetrahnör-horátot: (T8TU) PerSeptbe Biosystems örnbH-fói szerezzük be (Hamburg, Németország).
Közytetpcsppertok
Közvetítoesopnrtkénl az. alábbiakat használjuk: HMPA (NGvaBioehem, Svájc); 4-hidroxi~metil-henzoesav (NovaBioehssn); á-mctoxl-mandulasav iAíorleh. Németország); HMPB (Novabiochem); AM (Novablochetn); ?-(4-h;dr<ixi'-n;etsl-ieno>;s}-propionsav (Novabiochem) a gyantához kötve mist DíC-vel előzetesen előállított 1 -hidroxi-henzotriazolos (KObt) észter formában.
Szilárd hordozók
Az Pmoe-cljárás szerte szintetizált peptldeket bárom különböző típusit szilárd hordozón szteetszáljte 0,ö5 mól vagy ennél; nagyobb koncentrációjú: Pmoc-esoponíal védett aktíváit amlnosav használatával dimetiitenatnidbatt. 1) FEG-BS (polRenéit-giikol) pofetifolra olíva; TentaGel S NH2 gyanta (Ö,27 mmol/g, Rapp Polimere, Németország) vagy NovaSyn Tö gyanta (0229 nnnoi/g, Novahiaehem, Svájc)}; 2) PcpSyn Gél [szasRozln-metíl-észter Rsxkeíóscsöporini tartalmazó pobídteetii-akríiamidj-gyania (l,Ö mrsobg, Míliiöen, Egyesült Királyság)}. 3} PepSyn K (szarkozin-metil-észter fbnkcióscsoportot ttirtalmazó peiiídimeííi-akrilamid)-gyanta (Ö,l1 mmohg föeselguhr hordozón, MilÜGen, Egyesült Királyság}).
A Boe-eljárás szerte szteetizált peptldeket Mernlieiá-gyanián jpoit(szíirói-divmtl~benzöl)l: szmíenzáiluk az első kötött aminnsavval (Növahioehem, Svájc),
Katalizl^fcésrtesrgagensek
Diizöpröpii-etil-amls: (DiFA) (Aldrich, Németország), etilémditamh (Pinka, Svájc), pipendi.n (Riedei-de Hóén, Fraakfert, Németország), 4-(H,:N:-dteeiil-amino)-piridÍn (DMAP. Pinka, Svájc), amelyet katalizátorként bísználtmk a sztemetrskus anhidrtdeket magában foglaló kapcsolási reakcióban, 3,4-dihliifo- 3--hídro>;i-4-oxo-1,2,3-benzotriazm (Dfeht-OH, Pinka, Svájc) és l~bidroxi-feen.zotr;azoi (HObt, Novabiochem, Svájc).
KiWóisteü&ások
A megfelelő N-ct-védeti winosavból és :DiG-:ból előállított első aminosavat szimmetrikus anhidridkénf kapcsolják dteetibformarnidbaít. A következő aminosavakat Fíjj- vagy Dnbt-észtersk formájában: vagy előzőleg előállítsd KObt tormájában kapcsoljuk, az utóbbiakat N-tx-védeit ammosavakból és HObt-hől állítjuk elő INC vagy- TBTB segítségével dimetil-formamiában. Pnsnc esetében minden aciiezést Sö ;'C-o« ainbidrin-íeszítel ellenőrzünk, a vizsgálat közben az Pmoc védöcsnport fehasadásán&k megakadályozására, [társén, B,D. es Hóim, Au int. J. Pepiidé & Protein Rés,, 43, 1-19 (1994)},
MN-p-atntaoA^sep^^láyabt^a
Az: Fmoc-csopori eltávolítását .20 % piridte tartalmaz© tiimetíl-fonttamidos oldatban végrehajtott kezeléssel elvégezzük sarzsonkéotí eiöálHtás eseten egyszer 3 perc és egyszer 7 pere alatt, vagy- a véóócsoponot: etesontó oldószert ásáramoirstjuk a gyantán; 10 percig 1 mhjserc áramlási sebességgel folyamatos áramoltatássá'. majd dimetíi-formamiddál mossuk, amíg a kiesepego dimetil-iormamídhöz Dhbt-OK hozzáadása után a sarga szín <Í>hht-Ö'} detektálható. A Sós véáöesopsut eltávolítását 5ő térfogati·» triSnor-ecstsavst tartalmazó diklor-meiánes kezeléssel végezzük egyszer 1,5 percig és egyszer 20 percig, majd diklöo-metámrai mossuk hatszor 9 percig, ezrstán 10 térfogattá trfeiil-amint tartalmazó diklOr-tnétános oldattal setnlegesltjuk kétszer 1,5 percig, végül hatszor 9 percig; áiklör-meiásnni mossuk.
A peptideketa gyantáról 95 %-ös vizes teifltKír-ecetsavval i&veKtjak el ΠΤΆ, Haloearfeöu Froducís Corporation, U.S.A.; Biesíerfold & Ce, Hamburg, Németország) szubahömérsék létén 2 órán át. A leszűrt gyantákat 95 %-es vizes iriduer-eoetsavval mossuk, és a szőrieteket és a tnosófolyadékoí csökkentett nyomáson hepárollak, A visszamaradó anyagot éterrel mossak, és ecetsav- víz elegyból fagyasztva „szárítják. A fagyasztva szárított nyers terméket nagy nyomású .fólyadékkrötnatográftóvai (WLC3 amtliz&lgjfo és flight tőmcgspeteometriás jMALDÍ TOF MS) lézerdsszorpetós ionizációs idővel kísért mátrix-szál vagy elektrospray Ionizációs tőmegspeklíOmetriával (ESMS) azonosítjuk.
g szárított gyantát egy 10 ml 1 moliferes nátrmm-hidroxid-oidadal kezelőnk 4 nC-en és 15 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A gyantát 10 52-os vizes eeetsavat tartalmazó lombikba .szstjűk,. A pepiidet hofolzáiássnl: el választjuk és gélszlirésseí vizsgáljuk.
A pepiid lehasitása a g vonláról HMSA-yM
250 mg szárított gyantát egy keverSvei ellátott gőmblomfeikba bemérürsk, ?5ö pl 2:1 arányú tsoasizothtán-dibol elegyet adunk hozzá, a keveréket jéggel lehűtjük, a keverékhez 5 ml triílnor-ecetsavat adnak és 5-tö percig: keverjük eseppenkénr. 590 pl TFMSA-t adunk hozzá, és a reakciói szohahőinérsékleten 30 perc és: 6Ö pere kSzótti ideig folytatjuk, A pepiidet éter hozzáadásával kicsapjuk.
Az pldahtrótm leső védocsöpörtök eltavo^Usa
Az. oldadáncban lévő védöesoportokaí előnyösen a pepiid gyantáról történd lehasításróí egyidejűleg távíditjnk el.
Ifozgi^l.efoifjfottHObt-észter
a) fij tras ekvivalens N-tz-andnoesoporttal védeti smmosavat oldunk dimetíl-fonnamidbaa 3 ekvivalens HÖbt-vel és 3 ekvivalens DIC-vel együtt, Az oldatot szobahőmérsékleten 10 percig állni hagyjuk, majd a gyantához: adjuk, mnelyei az elóaktiváit amioosav hozzáadását megelőzően 0.2 %-os Dhbt-OH áimedl-formaraidos oldatával mossuk.
ekvivalens N-a-ammoesoporttai védett atninosavat oldunk dírnsiil-fomtamidbán 3 ekvivalens IdObt-vél, .3 ekvivalens TBTü-val és 4,5 ekvivalens öíEA-yal együtt. Az oldatét szobahőmérsékleten 5 percig állni hagyjak, majd a gyantához adjuk.
ő ekvivaleus: N-a-amíaoesaporttal védeti aminosavat oldunk diklór-metánban és ő M'.'-ra hűtjük. 3 ekvivalens BCC-f. adnak hozzá, és a reakciót 10 percig folytatjuk. Az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és a viszszamamdö: anyagot dimedí-formamiában oidjttk. Az. oldatot szikink, és azonnal a gyantához: adjuk,, majd 0,1 ekvivalens: DMAP-t adunk hozzá.
mg és .5 mg közötti mennyiségű «awte Fmoc-csoporttal védett peptid-gyantáí 5 mi 29 %p!pst!ditn tartalmazó 4}»)etM-fenaa»Hdm oldattal kezelünk iö percig szöbafeőmérsékieten, és a dlbeszö-felvén-píperidm-addaktum W abszorpcióját 381 » hnllámhosszon vizsgáljuk. A kitermelést az Fmoe-Aia-OE standard alapjait ejot exíenzlős koefífelens kiszámításával határozzak, meg.
Boe-védöcsopnrt esetében a kapcsolódást a BGC-csoport eltávolítása. mán mnhldrteés eljárással vizsgáljak (Sam, V. K,, Kent, S,B, IL. Τ», 3. E,és:Mernűeiá,. R. B.: AnaL Bioehesn., i17, 147-157 (IBSI )),
Be sgsswBggat isffepSyn K gyantán:
KörülbelSi 590 mg vízmentes FepSyu K-í etilén-diamtnsal borítunk be és szobahőmérsékleten egy éjszakán át állni hagyjuk, A gyantát leesspegíeíjük, és. tízszer 15 ml dimetíl-formamiddal mossak minden esetben 5 percig, A gyantát iecsepegtetés után kétszer 15 mi 10 térfogaik» Ö1EA4 tartalmazó dimebl-formamídos oldattál mosstik, minden esetben Si percig, végül áímetibtbfmamlddal mossuk, amíg a sárga szín a iecsepegő dimetil-fortnaiüídbaü .i>hhf-Ö!-! hozzáadásával detektálható ? ekvivalens HMPA-k 3 ekvivalens Eöbt-t és 3 ekviva^ less DiC-et oldunk 10 ml díme·d-formamiában és 10 percig aktiválódta hagytuk. Ezután a keveréket a gyantához. adjuk., és a kapcsolást 24 órán át folytatjuk. Λ gyantát ^csepegtetjük és tízszer 15 ml dimetiktormamiddsl mossuk, minden esetheti 5 percig, és az aeilezést ninhidrin-teszrtei ellenőrizzük. Az első amipösava? az oldalláncban védett előzetesen előállított szimmetrikus anhidridhez hasonló módon kapcsolják {lásd fentebb), és a kapcsolás kitermelését a lent ismerteted módon határozzuk meg. Ez mindegyik esetben 79 %-ná! jobb volt. Ezután a szintézist ''.folyamatos áramoltatással vagy sarzsonkénX folytatjuk a lém ismertetett módos.
BBaíbEfOíLScMkÉBue^
500 mg első amtnossvval kötött gyantát egy teljesen aatomatizáh pepiid szintetizátorhoz kapcsok oszlopba helyezőnk. Az Emoc-védőesoportot a lentiek szerint eltávolítjuk, A visszamaradó aminosavakat szekvencia szerint i''tnoe-védett és szükséges esetben oldailáncban is védett Pib-észter (3 ekvivalens) formában kapcsollak 1 ekvivalens Pkhf-ÖH hozzáadásávak Mindegyik kapcsolás: végpontját a Dbbí~QH anion sárga szins eltűnésének automatikus spektrofotometriás követésével határozzuk meg. A szintézis befejeződése után a pepiid gyantát 1Ö percig 1 mi/pere áramlási sebességgel dimedl-formamlddál, majd háromszor 5 ml díklőr-metánnal, végül háromszor 5 mi dietil-éterrel mossuk minden esetben 3 percig, az -aszlopről eltávolítják, és vákuumban .sz&it”
5ö0: mg első srnisösavvíd kötöd gyantát szűréshez polipropilén szőrével ellátott polietilén edénybe: méritek be, és az Fmoc-védöesoportot a fent ismertetett módon eltávolítjuk, A visszamaradó sminosavakaf .szekvencia szerint kapcsoljuk előzőleg előállított Pmoc-védett és szükséges esetén oldalláneen Is védett IdQbt-észterek formájába!}, A kapcsolást 2 érán át folytatjuk, hacsak íslues másképpen omgjelöive. Bxutáu a. reagens felesleget dlmetii-tormámiddai 12 percig 1 mí/perc áramlási sebességgel végzett mosással eltávolítjuk. Az adiezésí minden esetben hö nC-ou végzett nmhldrin-íeszlfei vizsgáljuk. A szintézis befejeződése után a pepiid-gyantát 19 percig I mi'perc áramlási sebességgel dimettl-fetmamiddal, majd ötször 5 ml diklóf-tseíásnal, végül 1 percig ötször 5 mi dietil-éterrel mossuk minden esetben I percig és: vákuümlw szárítjuk,
San&ösksníÜK^^
Egy edénybe 250 mg t'0,27 mmol-'g és 9,29 mmoVg közötti mennyiségű) Tenfaöei S blí-E vagy btevaSyn TG gyantát helyezünk szűréshez polipropilén szűrővel ellátott: polietilén edénybe, 5 ml dimetii-förmamidhan
14.
duzzaszíjuk, és 20 % píperídte tartalmazó düneísl-formamid oldatban ke®e?|Ök, ezzel Mj^ssltva a gyantán a nem proionálí amlnocsopor-ok jelenlétét. A gyantát Secsepegtetjük és dimetii-formareíddal mossuk. amíg a iecsöpögó dhneül-fomiatnidhoz Dhbt-ÜH hozzáadása után sárga elszínezódés sem észlelhető, 3 ekvivalens HMPA-t kapcsolnak a fenti módon Dhbt-észtet formában, és a kapcsolási 24 órán át folytatjuk. A gyantát lecsepegtetjük és ötször 5 ml dimetd-forn-tamiddal mossak minden esethet 5 percig, és az: aeilezési nln-ltídrin-teszttel ellenönzzük. Az első aminosavat a fent ismertetett módon előzőleg: előállított szimmetrikus anhidrid; formájába® kapcsoljuk. Az első Fmoe-védett ammosavak kapcsolásának kitermelését a lenti módon határozzak meg. Ez tubáé» esetben 6© %-nál jobb. A következő amioosavakaí a szekvencia szerte kapcsoljuk előzőleg előállított í-'mec-védett és szükséges esetben az. előálláséban Is védeti HÖbt-észterek forszába® (3 ekvivalens) a fent ismertetett módon. A kapcsolást 2 óránál: folytatjuk, hacsak nincs másképp jelölve, A gyantát feesepegtetjuk és ötszór 5 mi dlmetll-formanriddal mossuk minden esetbe® 5 percig á reagens felesleg eltávolítása céljából. Az aetlezésí mindé® esetben 80 HC-on végzek nmhiílrin-tesztfel ellenőrizzük. A szintézis befejeződése titán a pepiid gyantát háromszor 5 ml dimetii-fonősmtddül mossák minden esőikért 5 percig, majd háromszor .5 ml átklön-metámtai, végül háromszor 5 ml diet 1 i-éterrel mossuk minden esetben t percig és vákuumban szárítjuk.
^kait^tWíid&zmtézfelfe^yn^gles
Szűréshez polipropilén szűrővel ellátott polietilén edénybe 50© mg (1 mmóFg) vízmentes BepSyn Del gyantát mérünk be, és rázással óvatosan hevetek 2© órás át, A gyantái leesepegfetjuk és tízszer 15 nő öíntetl-föffeátniddal mossuk míödesl esetben: S percig A leesepegielés után a gyantái kétszer 15 nő 1© lérfegat% DiEÁ-t tartalmazó dímetii-fetmémíddgl, végül ötször lá tni duneoi-formamiádal mossuk minden esetben 5 percig, amíg a. leesepegő diméiil-iormamldtez Dhbt-Ofí adagolása után sárga szín nem detektálható. 3 ekvivalens KM PA-í kapcsolunk s fenti módon: (ja) eljárás} elöaktsválí fíöht-észfer formájában, és a kapcsolási .24 órán át folytatjuk. A gyantát iecsepegtetjSk és ötször IS ml dlmetlMömtamiddal mossuk minden esetben 5 percig. Az acilszési ninbidrin-teszttel ellenőrizzük. Az első amínosavat a fentiek szerte előzőleg előállított, oklallártcban védeti: szimmetrikus anhidrid formájában kapcsoljuk. Az első· Fmoe-védett amloösavak kapcsolásának kitermelését a fent ismertetett módos határozzuk meg, Ez. minden esetben ?ö %-nái jobb, A visszamaradó atnlnosavahat a szekvencia szedni kapcsoljuk: előzőleg előá11boti Fmoe-védett, szükséges esetben tdilai láncban védett flöht-észtersk (3 ekvivalens) formájában s feni ismerteteti módon [(a) eljárás}. A kapcsolási 2 órán át folytatjuk és szükséges esetben kétszeresen kapesoljök egy éjszakán át. A gyantái leesepegíettük és ötször 5 ml dlmetíl-formamkldál mossuk minden esetben 5 percig a reagensfelesiég eltávolítása céljából Az aellezésf minden esetben 80 *Οοη végzett foubidrín-tesztlsl ellenőrizzük. Az Fmee-védőesoportot a fent ismerteteti módon távolítjuk el. A szintézis befejeződése nláu a pept;d-g> arüí háromszor 15 ml ©isnétifeförmtüdiddsí thossük foindén esetben 5 percig, majd háromszor 15 ml dlklör-nrctanual, végül háromszor 15 ml dietíl-eterrel: mossak .minden esetben 2 percig, és vákuumban szárítjuk.
íiPlAjkMlntények
A HPLC eljárást égy Waters 9©ö fotodíodás detektorral ellátod Waters ŐÖ© ft berendezésben végezzük Waters tedul Fák 8 x löö »ro oferdő €>» reverz fázisú oszloppal. Α» pufimként 0,1 térfogat!·* triflaor-ecétsto'íít tartemazó vizes oldatot és 8} ptdferkénl 0(1 térfogati <> acetoniíril, 9,9 térfogat!» víz és Ö,1 térfogati© irifluor-eceísav összetételű oldatot használunk, A. puffeteket: az oszlopon 1,5 utl/perc áramlási sebességgel szivattyúzzuk áfa kővetkező grádiens alkalmazásával::
SS
Ο δ es 76 % Β) palfer közöd lineáris: gradiens 28 percig, 78 % és 100 % B) puítof között lineáris gradiens 1 percig, ixokratikns SCO % B: poBer 5 permg,
2) izokmtlktís 8 % B) paffer 2 percig, 0 és: 50 %. B> putfer közötti lineáris gradiens '23: percig, 50 % és, 100 % B) paffét' közötti lineáris gradiens 3 percig, izokratikas I88 % B) puí&r 5 percig.
l&W^tesgkssb
Mátrix-szartámogstott lézer deszorbeiős ionizációs repülési inön alapuló (MALD1 TÖF) tömegspektrumókátveszünk lel Elsons TöíSpfee-B készüléken. Az elekírospray ionizációs tosnegspcktrumokíí· elekírospray (ESI) próbával (ES-MS) ellátott Elanígsn Mát LCQ készülékkel határozik meg.
Az egyzz pepííAsk zzmiéziziz
1. Példa ίΤΑΙ^ί,ν^θ^
500 mg (0,086 mmol/g) Fmoe-Lys(Boe) PepSyn: KA gyantát használunk «folyamatos árarooitstási eljárással végrehajtott szintézisben.
A nyers, fagyasztva szárított terméket ííPLC eljárással analizáljuk, és azt találjuk, hogy az a célpeptld (n-l©), továbbá n-6, 7, S és 9 értéknek megfeleld delémós pepiidet, valamint n:::6, 7, S és 9 éríékíl, az N-tezmináiisltoK még kötötten még Pmoc csoposokattaAttlmazó deléclós psptldek bonyolult keveréke. Az egyes peptidek azonosítását MALD1TÖFMS eljárással végezzük.
2. Példa
500 mg (0.086 nanoKg) Fmoe-Lys(Boc:l PepSyn KA gyantát használunk fblyarsaíos áramoltatás! eljárással” végrehajtott szintézisben, •A nyers, fagyasztva ámított terméket: OPEC eljárással analizáljuk, és azt találjak, hogy az dslécíós és Pmec-védett szekvenciákat nem tartalmazó homogén termék. Kitermelése 910 %. Tisztasága 98 %-uál nagyobb .HPLG eljár ássál meghatározva, ahogy ez, a 3. ábrán látható, A pepiid, azonosítását MÁEDI: TOP MS eljárással végezzük.
Példa
500 mg: (0,,086 mmol/gj Fmoe-l..ys(Boc) PepSyn KA gyantát használunk, folyamatos áramoltatásl eljárással*' végrehajtott szintézisben,
A nyers, isgyasztva szárított terméket F1FLC eljárással analizálink, és azt találjak, hogy az deléclós és Pmomvédeit szekvenciákat nem tartalmazó homogén tömték. Kitermelése 90,9 %. Tisztasága 98 36-náí nagyobb HPLC eljárással meghatározva, ahogy ez az 5. ábrán látható. A pepiid azonosítását BS MS eljárással végezzük.
4,Példa
LI-AJa>. .-La5”QH .Miífeézjse
500 mg Freoc-Ala(.<-< L>RBoejjj PepSyn KA gyantát (B~Áia;ö-I,ysj-OH szintéziséből) használunk folyamatos áramoltatást eljárással végrehajtott szintézishez, és a szintézist folytatják.
A nyers, lágyasztva szárított terméket HPEB eljárással analizáljuk, es azt találjak, hogy az o.-28 értékű R'Akfe-Lysj-Öl5 eelpepodet, továbbá n—19, 18, 17 és ló értéknek megfelelő deléclós peptjdeket: tartalmaz, ahogy ez a 4. ábrán lathato Bmoe-yedett szekvenciákat nem detektálunk, A pegtidek azonosítását ES MS eljárással végezzék.
5. Példa
588 mg. (8,:886 mmol/g) Písöc-1.,yx(Boe) PepSyn KA gyantát feasztiálimk fóíy»ates ársmoltalásl eljárással”' végrebajtotí szintézisben,
A nyers, fagyasztva szárított termeket HPLC eljárással analizáljuk, és azt találjuk, hogy az deléctós és Emec-védetí szekvenciákat sw tartalmazó homogén termek. Kitermelése 91.4 %. Tisztasága 98 %-nál nagyobb WtC eljárással meghatározva, ahogy ez a 6. ábrán látható. A pepiid azonosrtását ES MS eljárással végezzük.
6. Példa •$98 mg (8.886: mmökg) Fmec-Lys(3oe) PepSyn KA gyantát használunk folyamatos áramoltatás! eljárássá! végrehajtott szintézisben.
A nyers, fagyasztva szárítok terméket HPLC eljárással analizáljuk. Azt találjuk, hogy tisztasága 98 %-sál nagyobb, áelécíós és Ernoc-védett szekvenoiákaí tiefu tarhtlntáz. Kitermelése 97 %. A pepiid azonosítását ES MS eljárással végezzük.
2AbsKeLfh7miííá.p.S.kía
580 mg í0,074 atomiig) Pmoc-Gly PepSyn KA gyantái használunk 'folyamatos áramoltatás! eljárással végrehajtott szintézisben.
A nyers, fagyasztva szárított terméket PíPEC eljárással analizáljuk és azt találjuk, hogy a eélvegyölet melled körülbelül 16 % des-Val-peptldet tartalmaz. A peptkiek azonosítását MALDI. TOP MS eljárással végezzük.
8. Példa .iüéü*dk.dcsrekyeÍg:!aajkain:azásáya!
588 mg (8,886 mmol/g) Emöc-Éys(Boe) FepSyn KA gyantát használunk folyamatos áramoltatást eljárással’’ végrehajtott szintézisben.
A nyers, fagyasztva szárított termékei 1-1P1..C eljárással analizáljuk és szí találjuk, hogy a céípeptidel nagy tisztaságban <95 %) tartalmazza jelentősen lecsökkent mennyiségű des-Val -pepiid meíleti. A peptid azonosítását MALDI TOF MS eljárással végezzük.
9. Példa zásával .088 mg (8,886 rmnekg) Emee-Lys(öoe) PepSyít KA gyantát használónk folyamatos áramoltatás! eljárással végrehajtott szintézisben.
A nyers, fagyasztva szárított termékei MPLC eljárással analizáljuk. és azt találjuk, hogy tisztasága 98 %~ -sál nagyobb, delécíós és Emoc-védeít Szekvenciákat sem tartalmaz. Kitermelés 108 %. A peptid azonosítását MALDI TOF MS eljárással végezzük.
KkPBb aAlm^ygOB.mimézisé.eloszekyeneiafe^
50ö mg fő,1 mmol/gj vtoteafes PepSy» K-hoz S ml etilén-diamint adunk, és egy éjszttkán át. szobahőmérsékleten állni hagyjak, A gyantát lecsepegíeiíük és feze? 15 ml dimeíll-formanűddal mossuk minden esetben 5 percig,. A gyanta leesepegfeíése után. kétszer 15 ml IS % DfBA-t tartabttazó dimetil-fermamidoa oldattal mináenesetbes 5 pecíg, végül datíebl-fórmamiádal mossuk, sutig a tecsepegő átmeíil-főrmamsdban Dhbt-OH hozzáadásakor sárga szín n észlelhető, A módosítod gysnlát folyamatos áramoltatás! eljárás szerint végrehajtott szintézishez használjuk fel.
Az előszekvetmiáf alkotó első 6 lizint Ffnoc-f,ys(Boe)-Pfp-ésAerkám kapcsoljuk (3 ekvivalens) 1 ekvivalens Dsbt-ÖH hozzáadásával.. Mindegyik kapcsolás végpontját a fent ismertetett módon automatikus határozzak meg Az Fmoc-csoportot a lentiekben ismertetett módon tehasltjuk. Az előszekvencia befejezése áfán 3 ekvivalens eiöakíiváh HObt-észter formájában kapcsolt HMFA-t viszünk az oszlop tetejére, A szintetizáló berendezést 2' órán át recirfculácíős: üzemmódban mökődtetjök, ás. a reagens-felesleget dlmetii-feamamíüos mosással távoliíjuk el 12 pere alatt 1 mixere áramlási sebességgel, Kis mennyiségű gyanta mintát veszünk az acitezés nlnhídrin-teszttel iöriénő ellenőrzése céljából. A szekvenciának megfelelő kővetkező aminosavat oláailánbhan védett szümneírikus anhtdndként előzőleg előállítón formában az előzőekben ismertetett módon kapcsoljak és az oszlop tetejére visszük 0,1 ekvivalens DMAP-vel együtt, majd a szintetizáló berendezést ® percig: recírkuláeiós üzemmódban működtetjük. Ezmás a reagens-felesleget dinmífi-formanüdos mosással 12 perc alatt 1 mi/perc áramlási sebességgel eltávolítják. Kis mennyiségű gyanta mintát, veszüttk a kapcsolás kitermelésének ellenőrzése céljából, amelyet a korábban Ismertetett módon végzünk és 84 %-os találjak. Ezután a szintézist az Emoc-esoport fent ismerteiéit hasításával folytatjuk. A visszamaradó szekvencia szerimi aminosavakat Emoo -védelü szükséges esetben sldalláncban' védett Pfp-ószter <3 ekvivalens) formában kapcsoljuk 1 ekvivalens Dhbí-ÖB hozzáadásával. Mindegyik kapcsolás: végpontját a fent ismertetett móílcm astomáf ikusan határozzuk meg. A szintézis befejeződése mán a pepílágyamáf B) percig 1 mügére áramlási sebességgel dlznetiMbrmamiddal, háromszor 3 ml díklőr-metásmai, végül háromszor 5 tní dietll-éterrel mossak minden esetben 1. percig, majd az oszlopról eilávobijuk, és vákuumban szárítják.
A pepiidet a gyantáról a fent ismerteteti módon hasítjuk le,
Á nyers, fagyasztva szorított terméket I1P1..C eljárással analizáljuk, és azt találjuk, hogy a 1-í-Aia„-Ly's-ÖH képletű eelgegtidet, ahol n értéke 1Ö, továbbá n-S, 8, 7 és ó értéknek megfelelő deléciós peprideket tartal maz, ahogy ez a Ű, ábrán látható. Pmoe-védett szekvenciákat nem detektálunk. A pepiid azonosítását MALDI Tök MS eljárással végezzük.
5Ű8 mg (S,l mmoÜgj vízmentes EepSyn K-í kezelünk a fent ismertetett módon etilén-diammnal. A módosított gyantát használjuk fél a folyamatos áramoltatást eljárás szerint végzett szintézisben. lő ekvivalens (fe.)-4-metöxl-mándnfesavat, 10 ekvivalens Böbt-t és 19 ekvivalens DfC-et 5 ml dimeril-ioPP&nhdhan oldunk, 19 percig efdakítváiunk, az oszlop tetejére fetvtsszük és a szmteozálő berendezést 2 érán át reeirkaiáeiós iizeminódban működtetjük. Ezután a reagens feleslegét 12: percig, 1 mfeperc áramlási sebességgel dimsíil-lotmamidos mosással eltávolítjuk. Kis mennyiségű gyasíammtáí veszitek sz acilezés íünhidrte-ieszttel történő ellenőrzéséhez. A szekvencia szerinti első aminosavat Fmoc-védett formában és oldallaneban védett előzőleg előállított szimmetrikus arthldrid tonnájában a fent ismertetet; módon kapesoíjük, és 0,1 ekvivaless ÖMAP-vel együtt felvísszük sz oszlop tetejére, és a szintetizáló berendezést 90 percig reelrknlációs Üzeinntódbtm műkődtetjüL A reagens-felesleget 12 percig 1 tnl/perc áramlási sebességgel dhnetíl-íormamíóos mosással eltávolítjuk. Kis mettnyiségő gysntasnintát veszünk a. kapcsolás kitetmelésmrek ellenótzésére, amelyet a te: ismertetéh: módon végzünk, és a 75 %-osnak találjuk; A szintézist az bmoe-esoport korábban ismertetett: fehtsitásávaí felytatjuk. A szekvencia szerinti további aimnosavakat Froec-védeö Pip-észterék (3 ekvivalens) Ibrmájában kapcsoljak 1 ekvivalens DnbfeÖH hozzáadásával. Mindegyik kapcsolás végpontját a fent ismertetett módon automatikusan halározzuk meg. A szintézis befejeződése után a pepfidgyantát 10 percig 1 ml/trere áramlást sebességgel dm?elii-ferutamtddal, háromszor 5 ntl dtklór-meiánsaí és végíii dictil-éíertcl mossuk minden esette 1 percig, az: oszlopról eltávolítjuk és: vákuumban száriunk.
A pepiidet & gyantáról a korábban ismertetett módon iehasípek és ecelsav-viz eiegyhoi tioiibzáljuk,
A nyers, fagyasztva szárított terméket HPLC eljárással analizáljuk, és azt találjuk, hogy H-Aía,;-Lys-Oíí képletit célpeptidet, ahol o értéke 10, továbbá n ::9, 8, 7 és ó értéknek megfelel© delecíós pepítdekei tartalmaz. A peptid azonosításai MALD1 TOP MS eljárással végezzük.
zásával
8ÖÖ írig (ö. l untad gl vízmentes PepSyn K-i kezelünk a fentiekben ismerteteti módos etiién-diamteti. A módosított gyártól M kamatos árantoliaiasi eljárás szerint végrehajtóit szintézisben használjuk. Az eiószekveneiát alkotó első 6 fizlní bame-védeti és oldaliónete védeti: Pfp-észterként <3 ekvivalens) kapcsoljttk 1 ekvivalens Dhbí-ÖH hozzáadásával. Mindegyik, kapcsolódás végpontját a fent ismertetett módon atiíomaókusan határozzuk meg. Az Fsroc-csopoxíot a fent Ismertetett: módos hasítjuk. Az elószekvettela szintézisének befejeződése uíán 1Ö ekvivalens fev-M-rneiom-mandulasavaf elóaktívált ílöbí-észter tormában a korábban Ismertetett módon kapcsoljuk és az oszlop: tetőiére feivisszük, A sxinfeiizáló berendezést 2 órás áírecitoiáelős üzemmódban működtetjük és a reagens-felesleget ezótán 12 percig I mtiperc áramlási sebességgel dtmetil-formamldos mosással eltávolítjuk, .Kis gy&níammtáí \\«m κ az aefaéx uinhidrm-teszítel történő ellenőrzésére. A szekvencia szerint kővetkező amirsosavat Fmoc-vedeít ea oldalláncban védeti tormában előzőleg: elóallkoti szimmetrikus anhidotikéni: kapcsoljuk a korábban ismerteteti modort, és az oszlop tetejére felvisszük 0,1 ekvivalens Ö.MÁR-vel együtt. A szimedzáló berendezést 90 percig reeirkuláeios feemniódban működtetjük és a reagens-feleslegei ezután 12 percig 1 mkpérc áramlási sebességgel dimetil-fenhanődos mosással eltávolítjuk. Kis gyanísmintát veszünk a kapcsolás kitermelésének meghatározására, amelyet a korábbat? ismerteteti módon haj' lünk végre és 68 %-nak találisk, A szintézist ezután az Fmoc-csopori iehasltásával folytatjuk a korábban ismertetett. módon. A szekvencia szertóti további aminosavakat bmos-védeíí Pfp-észter (3 ekvivalens) formában kapcsoljuk I ekvivalens Dbbt-ÖH hozzáadásával. Mindegyik kapcsolás végpontját a fent ismertetett módon automatikusan határozzak meg,. A szintézis befejeződése után a pepfidgyantát íö percig 1 ml/pere áramlási, sebességgel dfmetf-foratamiddai, 1 mí/perc áramlási sebességgel háromszor 5 ml dtkkk-íneíánnal,. végül í ml/perc ártania:© sebességgel háromszor 5: mi dieíil-éterrel mossuk, az oszlopról ellávoitijttk és vákuumban szaru ttk A peptidet a gyantáról a korábban ssmerfeielt módon lebasiíjuk és fagyasztva szárítjuk: eeefsav-víz: élsgybol \ nyers, fagyasztva szárítóit terméket OPEC eljárással analizáljuk, és azt találjuk, hogy B-Afee-Lys-GB képlett célpeptidet, ahol n értéke 11), továbbá n~9, 8, 7 és 6 értétasek megfelelő deléelós: peptldeket tártál19 tnaz. A deléclós pspttdek mennyisége jelentősen csökkent összehasonlítva a Uh és 1 1. példába® me^MáPOZöttal, ahogy ez a 1Ö, ábrán látható, Fume-védett szekvemltet nem detektálunk. A pepfisi azonosítását MALDi: Tök MS eljárással végezzük.
LLkéjdalkjy;áróiag.szeniN
Ι.ΕΑΗίκ.Ι^ΟΗ^ΖΛηΐόζΰο. ejő^ d«taöi:AlaWxU&^
M
5Ö0 rúg (8,1 mtnol/g) vízmentes PepSya K-í szűréshez, polipropilén szűröve; ellátott polietilén-edénybe mérnök be, és a korábban ismertetett módon etilén-dlaminuai kezeljük. Az c leszek ve nciát alkotó első ó lizln Fmoc-védett és oldaiíáneban védett Efp-észter (3 ekvivalens) formába?) kapcsoljuk 1 ekvivalens Dhbt-OH hozzáadásával, Az acllezést fent ismertetett módon 80 aC~on végzett mnbldnn-teszttei ellenörizzök. Az Fxpoc-yádócsoponot a fent isu;erteíeít módon eihasitjnk. .4?: elöszekvenefe befejeződése után a peptid-gyanta védőcsőportját ehávoliíjuk, és 10 ekvivalens elóaktívált HObt-észter formájú (Tj^-aWőxHnunáuíasavvai. feni ismertetett módon reagáüatittk (fent ismertetett módon rezolváÉak, 95,8 %-os optikai tisztaságot érőnk el) és a kapcsolást 24 órán: át felyíatjuk, A reagessfelesleget 12 percig I ml/perc áramlási sebességgel dinmtil-formanddos mosással távolítjuk el. Az aetzelési nmhidrín-tevrttel ellenófizxsk, A szekvencia szerinti következő .amtosavat Fmee-védeíí és láncban védett formáló, előzőleg előállított szimmetrikus anhídriddel a fent ismertetett módon kapcsoljuk, és » reakciói 2 órán át fogatjuk, A reagens-felesleget ezután 1:2 percig 1 ml/perc áramlási sebességgel diíoelil-forntamidos mosással távolítjak el. Kis mennyiségű gyanratnintát veszünk a kapcsolás kitermelésének ellenőrzésére, amelyet a fent ismertetett módon hajtok végre és bő %-osmtk találjuk.: Ezután a szintézist: az Frtmc-esoport hasításával folytatjuk a fent ismertetett módos..
Az: első alsínnt Fmec-védett Píp-észter (3 ekvivalens) farinában kapcsoljuk I ekvivalens Dhbt-OH. hozzáadásával 2 ml dimetii-ibrmíanidban 2 órán át Ezután a reagens-felesleget 12 percig 1 ml/perc áramlási sebességgel dimetii-formainidos mosással eltávolítjuk, és az acilezést a fent ismertetett módon 80 ;>C-on ninindrin-tesztel eifenorizzSfe, Ezután az Fmoc-csoponoi 2 térfogat3) piperidint tartalmazó dimetil-lomtatnidos oldatban 1 pereig, 1 ml/perc áramlást sebességgel végzett kezeléssel ehávoiitjnk, majd lö perem 10 ml/perc áramlási sebességgel dhnetil-fonnamiddal öblígűk, 20 percig I ml/perc áramlási sebességgé; 0 2 % Dhbí-Öil-t tartttimaző dimetll-iórmamidos oldatot árampltatank át, végttl kétszer 5 ml drmeth-íhmmmidda! mossuk minden esetben 1 percig, A következő Ftsoe-védeh alanmt közvetlenül Pfp-észfer formába® (3 ekvivalens) kapcsoljuk 1 ekvivalens Dhbt-O:H/2 ml dimetil-íórmarsld hozzáadásával 2 órán át. Az acizelést: a fent ismertetett módon umbídrin-teszttel ellenörízzök. A szekvencia szerinti: további: ammosavakat l'moc-védett Píp-észterek (3 ekvivalens) tbrtnájábim kapcsoljuk; 1 ekvivalens Dhbt-OH hozzáadásával 2 tnl dunetibformítmídfesn. A reagens-feleslegei 12 percig 1 ml/perc áramlási sebességgel dime-ű-iorreamidos mosással ehávc-Süjuk, és az acilezést a feni ísfoerietétt modem 88 *C-öo végzett nmfejdr ín-teszttel ellenőrizzük. Az Fmae-vétlöesoporíof a fent ismertetet; módon eltávolítjuk. A szintézis befejeződése mán a peptidgyamá; 18 percig, 1 ml/perc áramlási sebességgel dímetíl-íormamíddal. ftárosnszor 5 mi diklór-metánoai, háromszor 5 tnl: dietü-éterreí mossuk, minden esetben 1: percig és vákuumban szárítjuk.
A pepiidet a gyantáról a fent ismertetett módon basájuk fe és jégecetből fagyasztva szárítjuk. A nyers, lágyasztva szárított terméket HEEC eljárással snálízáljnk és deléclós és Fmoe-védett szekvenciákat nem tartalmazó homogén terméknek lalátjuk ías»R>tecBoBésJwygfo&gspg^^ «dsfessvJljAb^^^ alkalmazásával
KSrülbelhl 508 mg vízmentes PepSyn K-t szűrés eéfjábéd propilén szűrővel ellátott pol leli len edénybe mérünk be, és á fent ismertetett módon etifén-diamitmal kezeljük. Az előszekveneiát alkotó első 6 glnlátninsavai Fmoc-(ölufO-ferc-Bu)-Plp-ászterek (3 ekvivalens) formájában kapcsoljuk 1 ekvivalens Dbbt-01-f hozzáadásával. Az sdiezést a fent ismertetett módon 88 ;5C-en végzett níHlridnn-fesZfod ellenőrizzük. Az Emsc-vádőcsupödsí a fent ismerteteti: triódon távölhjúk el. Az elöszekvencfa befejeződése után: 18 ekvivalens (+)-4-me£oxí~5U3.ndniasav (fent ismertetett módon rezerválva, optikai tisztaság 95:,8 %) előáktlvált HObt-észter fórmájában kapcsoljuk a feni ismertetett: utódon. A kapcsolást 24 órán: át folytatjuk, és a reagens-felesleget ezótán 12 percig 1 mkpere áramlást sebességgel dímetd-formamidus mosással eltávolítjuk, Az: aoífezést nlnhldriiv -teszítei ellenőrizzük. A szekvencia s/ermó itevefeezo amlnosavat Fsrtoe-védeft es láncban védeti: előzőleg előállított szimmetrikus anhidrid formájában kapcsoljuk a fent Ismertetett: módon 8,1 ekvivalens DMA? katalizátor jelenlétében és a reakciót 2 órán át folytatjuk, A. reageotefolesfegól 12 percig 1 m Epére áramlási sebességgel dinretll-formamidos mosással eltávolítjuk, Kis mennyiségű: gyautamlníát veszünk a kapcsolási; kitermelés ellenőrzése céljából, a fent ismerteteti módon meghatározott kitermelés 75 %. Azután a szintézist az Fmoc-véáŐesopört hasításával folytatjuk a fent ismertetett módom
Az: első alantul Emee-védett Ftp-észter p ekvivalens) formájában kapcsoljuk 1 ekvivalens Dhbt-ÖR hozzáadásával 2 mi ditnetil-fonuamidban .2 órán át A reagens-felesleget ezután 12. percig: 1 nti/perc áramlási sebességgel dimedl-forntamidus mosással eltávolítjuk, és az Keltezése a fent ismerteteti: módún S8 °C-on végrehajtott ninhídrin-teszttei ellenőrizzek, Ezótán az Fmoe-esuportet 2 térfegabfe plperidiot tartalmazó dimetii-fórtnamülos oldattal 1 percig 1 mil/pere áramlási sebességgel végzett kezeléssel eltávolítják, majd 18 másodpercig 1.8 ml/perc áramlási sebességgel dinteíil-formamtddul öblítjük, 28 peréig i ml/perc áramlási sebességgel
8,2 % Ohbt-OB ditueíil-lbrmatuid-oldaíot áramoltatunk át, végül kétszer 5 ml dlmetil-fonüKodádal mossuk minden esetnem 1 percig. A kővetkező Fmoe-védsd alánint kdzvetígdui Ptp-észler (3 ekvivalens) formájában kapcsoljuk 1 ekvivalens Dhbt-011 hozzáadását2 tnl drEHetil-fefmamidban 2 órán át. Az aerlezést a fent ismertetett módon végzett mnldátin-teszltei ellenőrizzük. A szekvencia szerinti további amtnosavakat Fmoc-védett.Pfp-észterek (3 ekvivalens) iurtnájáhan kapcsoljuk 1 ekvivalens Dhbt-Ofi hozzáadásával 2 tnl dímetil-fortnanndban. A reagens-felesleget 12 percig 1 mEperc áramlási sebességgel végzett dimetil-formanddox mosással eltávolítjuk, és az acilezést fent ismertetett módon 88 “C-on végrehajtott ninhidrin-teszitel eiieaőrizzhk. Az Fmoc-védőcsoporiot a fent ismertetett módon eltávolítjuk. A szintézis befejeződése után a peptidgyantáf 18 percig 1 ml/perc áramlást sebesség dímetíi-iőrmamiddal, háromszor 5 ml diklór-metánnal, majd háromszor 5 mi dleiii-óterrei mossuk minden esetben 1 percig és vákuumban megszántjuk.
A peptidet a gyantáról a feni ismertetett módon hasítjuk le és jegeeeíhen fagyasztva szárítjuk. A nyers, fegjusztea szárított teret,\et HP1C ehartss&ai anabzáljuk, es delectos es Emoe-védeh s/ekvcmak&t nem taratmazó homogén terméknek találjuk.
15, Példa
12F szűrés cédából polipropilén szűrővel ellátott polietilén: edénybe 25Ö mg (8,29 mmol/g) vízmentes
AiovaSy» TG gyantái mérünk be, és az sarzsonkéntí peptidszímézls PEG-PS-en'1 eim alatt: leírt módon kezeljük a Lys6 előszekveneia befejeződéséig. A Lea-enkeíaíin szekvenciái: képező további amíuosavakat előzőleg előállított Emec-védeít ] fObftSzswfc 0 ekvivalens) iormájában kapcsoljuk 5 ml dimetíl-fettnamidban, amelyet D1C segítségével állnunk elő, .Az utolsó 5 kapcsolás mindegyike előtt a gyantát 80 mg Hhbt-GI-l-t lartahnaző 25 ml oldattal mossuk, a kapcsolást reakció előrehaladásával a sárga szín: eittmésének. követése céljából,.Araikor a sátga szírt atár rtem látható, a kapcsolást megszakítjuk, és a gyantát ötször 5 mi dimetil-tbrmatníádal tnossak tnmóén esetben 5 percig. Az aeriezésí ezután korábban ismertetett módon 8ö cC-oa végrehajtott ninfaiórin-teszttel ellenőrizzük. A szintézis befejeződése után a pepttágyaníát háromszor S ml áimetil-főrmamídőal, háromszor 5 ml áíktór-mstáanah majd háromszor 5 ml dietil-éterreí mossuk minden esetima 1 percig és vákuumIma szárijuk..
A pepiidet s gyantáról fent ismertetett módon hasítjuk, le, és ecetsavból fagyasztva szárítjuk. A nyers, fagyasztva szárított terméket HPEC eljárással analizáljuk, deléelős és Fatoc-védett szekvenciákat tteru tartalmazó hemogéu terméknek találjuk. Tisztasága 98 őó-nál nagyobb, a pepiid azonosítását ES-MS eljárással végezzük. Kitermelés: 84 %.
f, Táblázat
Ámmosav Peptíd-gyanta Elöszekvencía (tys (í8oe))s Kapcsolási idő
riószekten- étával Előszekvencia nélkül
Pmoc-Leu-GI-I H-Lys(Boc>HMPA-R < 2 min
Fmoc-Phe-OH H-Len-Lys(BocVHMPA-B. < 5 min < 120 min
Fmoo-Giy-Olí H- Phe- Le n-Ly sí Boc \,-H MPA-R <' 2 mit: < 6í> min
Pmoc-tíiy-GH Ι-1-Gly-Phc- Len -Lys(t8ocfe-B MPA-R < 2 min <60 min
Fmoc-'fyr-ÖM H-Gly-Gly-Phe-J..en-l..ysítBoc)ft-flMPA~R < 1 min < 40 min
H-Tyr-Cdy-Gly-Phe-Leu-Lys(tBocVHMPA-R
R - NovaSyn ÍG módosítva d-mdroxi-metii-fenoxí-eeetsav (HMPA) közvetitöcsoporí-al (szubszt:
0,29 úmtöttg):. A kapcsolási idők a Dhbt-ÖH és ntnbldrín-íeszlsu: alapulnak.
FélhaszítáR ataysgok és eljárások: Rövidítések:
ÁM- p-:[(R,S)-a:íÍA9:H-flnoren-9-íÍ)-m«taxi-formamíŐo]-2,4-óhi5éi:oxí-bettzil j-tenoxi-i
Át ~ 7-aza-behzötriazöl-idl
Bon - terc-budl-oxi-karbonil
BGP - benzötriázolil-oxí-írtsz-(dimetíi-amino)-foszío'uinn-bexailóöi-íbszfat:
Bpoc - bittmll -pfopi i-oxi-karhotíí.i
Bt- benzetnázol-i-il
t8u - nőt tere-butil
Ddz- 3,5-dimete.xs-fetal-tzopropti-oxi-karbonli
ÍXO dfeiklohexil-katboditmid
ix.:M': diklör-metán
??
D1CD1FADMAPDhb:-OH:::
DMFDts~
BOTFÁÉFmoe:;:
HÁTIT
BBTIT·
BMfoT
HMPB::
Höbí:::
HOAtHFLC-MCPSMHCMMa-NMRNHSNMPNFSMft—
PAM Pbf-PEG-PS PepSy&Gel PepSy n KPfoPiUCPec
Ϊ3ΤΙ.Ρ
TFÁ~
TPBTEMSÁTus» dd z.o p í <; p i I - ka rhod i) í n i d
N-N-diszopropd-edbaadn
4-(N.N-dlmetíi-a?tt»:0>-pírí<l»Í
3,4-dih«dro-3-hidfoxt-4-o<o-1 üfo-benzídnaztn
N, N -d i meí; 1 terma irdd dbísszukeiröl eíárs-dio’oi gyors atomokkal történő bombázás
Űdfeoroídl-meíd-oxi-kafboíól
0-<7-aza-4>mmrtetd-í-ll>-13,3,3-tomseÖl-wátw»4je^fhluor4<>sz^í
O-fbeirzotriazol-i-ftPTTJ^l-íetrametd-orofoom'-hsxaflíior-foszfát
4-feiátoxí-íseíd-fotoxt-eoetsav fdd-hidroxi-toeUI-a-meíoxí-feoo.G'í-vajsav
-fcidroxi-berizotnazoi l-hídroxi-'y-azo-benzotTiazol nagy nyomású folyatíekkromawgsáSa oszlopos végzett többszörös peptídszantézas tő htsztöfcampaíihiblósi koorplsx d-meioxí-maadölsssv mágneses magrezonancia
N-foíároxs-boi'OStáaykosav-lmtdo-észter
NMnetb-pirro'idoo n>Tro-R-n d-s/uí fend
4·τϊκ·ίη\ί-2Λθ-» imeo.-fenl-»/s..líonb fond -aceíanndo-tneui
2.2.4, ó.3-peidd-meid~odmltodéozoíurss-5-szmlfönd poliedléo-glíkoikd oitoit pohsztírsi szarkozfío-mstdászter tuokcíösesoportot tariídínaző pohf dinsstd-akrdarrsid) gyoota Kiegeigslir szarkozin-metdészter fóbkeiosesoporiöi tartalmazó poliCdlmetil-akriíisoid) gyanta hordozón peatafiuor-feoil
2.2.5, Vü-peoíametd-feremás-ó-szaiibsd fe ni 1 - ízí tpropi í -oxi-ka rbon i 1
O-{be!\<0trim<oÍ-ldl)-1,1 .IkaÁstramsltl-urómum-'teb'atkíöF-’borát ríiloor-ecetsav tríPoor-etattöi trifloor-irieíáir-szölfonsav
2,4,5-teíramettl-besztli-oxt-karboad

Claims (21)

1. Kijárás <1.· általános képletü peptidek, ahol
AA jelentése L- vagy D-ammosav-maradék,
X jelentése hidrogénatom vagy ammo-védőesöport,
Y jelentése hidrovii- vagy amísöcsopcrt és n értéke 2-nel nagyobb egé&z szára;
előállítására szilárd fázisú szintézissel, ahol egy B-o-védelt és adott esetben oídalteneban védett reaktív származék forínágí C-tertnínális atomoséval egy szilárd hordözóhoz vagy egy no! imerhez kapcsolnak adott esetben .egy kőzveiítőesöpertot! ág eznísln az N-o-yédőcsoportot elrávoiífgrk, majd a pepiid szekvenciát képező tovább; anbnossvakat lépésenként kapcsoljuk vagy peptid-teagmenskánt kapcsoljuk,; amely peptiá-fíagmensek tnvgté tetőén védett reaktív származék vagy fragmens idrmájnak, ahol az X-a-védőcsoportot. a kívánt pepiid képződése Piát! eltávolítjuk, és a pepiidet lehasltjuk a szilán! hordozótól, azzal jeltetnezve, hegy az eljárás tartalmazza továbbá a következőket; kiválasztunk egy elöszckvenoiát, amely természetes amfnosavak közöl egymástól függetlenül kiválasztott 3-9 maradékot tartalmaz, amely természetes aminosavak olyan oldaliáne fankelőscsoportokat tartalmaznak, amelyek a kapcsolási lépésekben; védettek és Pa vonzási faktoruk >6,57 és ES vonzási faktoruk < 1,10, ahol az említett, pepiid G-termináiis része tartalmazza az elöszekvcncíát; és az: említett előszekvenciáí lebasítink a képződött pepiidtől,
2. Az: L ígéaypoat szerint; eljárás, azzal jellemezve, hogy az előszekvenciában lévő aminossvákat oldallánc fonkcióscsoportként: karhoz!'!-, karboxanddo-, atnino-, hldroxíl-. goamdino-·, sziilűd- vagy nnidazol-csoportot tartalmazó aminosavak közül választjuk ki,
3. A 2. igénypont szerint; eljárás, azzal jellemezve, hogy sz eiöszekveneia részét képező aminosavakat egymástól függetlenül í,ys, ölő, Asp. Ser, His, Asn, Arg, Met és Gin közöl választjuk ki
4. A 3 igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aínmosavákkérit vagy kizárólag Lys vagy Glu egységet vagy í Ginig Lys)p .képletü szekvenciát használank, ahol a képletben p T q értéke 3-9, előnyösen 6-9, és a Lys és Gin egységek sorrendjét önkényesen választjuk meg,
5. Az: 1. Igénypont szerinti eljárás, azzal jeOémezve, hogy N-a-ammö-védoesoport Emos- vagy Bse-ssopört vagy bármilyen más stegletelö yédőesóport.
6. A,z S. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, begy N-a-amino-védőcsopod Ernőé- vagy Öoc-csoport.
7. Az 1:. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előszekvenolában az oldaliáne flmkelós csoport: egy karboxllesoportottaj'talmaz, amely megfelelően védett, mégpedig; előnyösen tBn-osoporttak
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elösxskvencíában. az oldaliáne fnnkcíős csoport egy amisocsoportoi tartalmaz, amely megfelelően védeti, mégpedig: előnyösen öoc-csoporttai,
9. Az l . igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elöszekvenclában az oldaliáne fuokeiős csoport egy bidroxilesoportot tartalmaz, amely megfelelően védett, mégpedig ciőstyősen fBo-esoporttsl.
löl Az I. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hegy az eleszekvenelában az oldallánc funkciós csopor· egy karboxamidocsoportot tartalmaz, amely a): bcmzlbdrilesoporttal. b) trlilícsopörtíai vagy ej ;Su-csoportm sedett, ít Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzsd jellemezve, hogy az elöszekvenciábanaz oldalláne funkciós csoport egy guaujdinocsoporiot tartalmaz, amely á-metoxí-SA/i-trimetilfenilszultonil-esoportíai (Mír), 2,AV^i>^Méííltema>6-Si£UÍÍmí:li^söp^í^ (Pmcj vagy · 2,2,4,6,7-pörirti:rtetild!lndrobenzofnran:-5-szultootl-csoporttal iPhf) védett,
12; Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elószekvenciúban sz oldáíláns nmíteiós csoport Boo-osoporttai védett inridazofesoportot tartalmaz.
13. Az 5, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az fonoc-esoportok védöcsojXJrtját egy amin, például pipettáin vagy dlaz&b3eíklo[5.4,91nndee-7fe:it f'DBU) alkalmazásával íávoiitjok et
14. Az I, Igéöypoot szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az: otásllánehan lévő védöosoportokat egy sav, példán! rtiduoreceísav (TPÁ), trrlluornmlánszatfousav (TFMSÁ), hlBr. MCI vagy W alkalmazásával távolaink et
15. · Az 1. igénypont szerhrti eljárás, azzal jellemezve, hogy szilárd hordozót fonkciösesoportot íariaksazo gyanták, például podsztirol, poliakriiamid, polletilésglikol, cellulóz, polietilén, látex vagy dynabead gyöngyik közál válaszíjak.
16. A 15. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a funkciós csoportokat tartalmaz® gyantát polisztirolra ejtett polletilés-glikol (PEC-PS) vagy polidimeíilakriknoid gyanták, közöl választják.
17. Az 1. igénypont szerinti eljárás. azzal jellemezve, hogy az elöszekveneia S-7 annnosav-maradékot tartalmaz,
IS, A 15. igénypont szerinti eljárás, azesl jellemezve, hogy s €-terminális: annnosavaí a szilárd hordozóhoz szokásos kpzvetitócseporton, például 2,4-dhneíoxi:-4'~hidrnsi-benzofononon:, 4-(4-fe!drox!:-ntet!l-3-metoví-fenoxij-vajsavon: (HMFB), 4-hldroxl-ne i - \r wesavon, 4-Wr©xi-!Ktet84msíí-ec^savos (HMPA), 3-(4-hídroxi-mettl-tenoxi)-propions3VOn vagy p [iR ‘) aj l-(9H-Snoren-9-!l)-mctöx!-foíntamidoj-7.,4-áintetoxi-benzii)-leoosi-eeetsavon át csatlakoztatjuk.
19, Az j, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szintézist szakaszosan végezzük.
28. Az 1, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az: eljárást folyamatosan végezz&k antomata vagy félautomata peptiá szintstizáloröu.
21. Az 1. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapcsolási: lépéseket acetonkril, N,N-dimeíilfonnamíd OWFs, N-íaetiipiirolidon :(:NMEk dtklónnetán (DCM). trifkiöreíanol (ΤΓΈ), etanol, metanol és víz: közili választott oldószer, vagy ezen oldószerek keveréke jelenlétében végezzük adalékanyagok, pékláöl perkloráí vagy edlénkarbenái: jelenlétéhen vagy távollétéhen,
22. Az 1. igénypont szerinti eljárás, szzal jellemezve, hogy a két aminosav, az aminosav és az. előzőleg előállítod pepiid szekvencia vagy egy pepiid íragmeos: és az előzőleg előállított pepiid szekvencia közötti kapcsolási szokásos kondenzációs eljárással, például azidos eljárással, vegyes savanhidrides eljárással, szimmetrikus anhldrides eljárással, karhodtimides: eljárással, aktív észteres eljárással, például pemaííoorfoiril·- ibipí. 3,4-dihidro-4-oxobfiszelr!:azi:o-3-ii- (öltőt), benzoírtazol-1-11- (Bt), 7-aznbenzotirazoM-U- tÁí), 4-nltrofenll-, N~ -Idároxtborostyánkösav-imído-észterek (NI-IS), savkloridok vagy ssvíluoridok alkalmazásával végzett eljárással, t>(7-azabenzotimzoh I -il s-1,1,3.3-íctrumetilurönium~hexaÍluorfoszfettal (0Alti), CMocnzotirazöl-1 -II)• LI .a.s-ren-ametllurőínum-bexatloorfoszfíítml tllBTU}, O-jbenzotriazol-l-11)-1,1,3.3-tertatnriiforőninm-iclraíluerbörátial (TSTf!) vagy henzoirtazoljl-oxi-trisz-fdimctilandöej-foszfoíílum^hexaSnrotbszfattai (BOB) végzett in shn aktiválással végezzük,
Οχ
23. Az. 1. igénypont szerinti eljárás, ml jellemezve, hogy a pepiidet a hordozóról egy sav, például tdSöorecatsav (TFA), trifínormetánézulfeúsav (TF'MKA), hidregén-feronud (HBr), hidrogén-klorlíí (HCi), hídrogén-íluorid <HF), vagy egy bázis, péiőául ammónia, hittem, alkoxsó. vagy ludroxsd alkalmazásával hasítjuk le,
24. Az 1. igénypont szerinti eljárás, asóssl jellemezve, hogy a pepiidet a hordozóról lóíolizissel hasítjuk le.
25. Az I. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elószekvendáí az előállított pepiidről enzimatikusan hasítjuk le,
2ő, A 24. igénypont: szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az enzimet. megfelelő kathoxll- és esdopepiidázok közül választjuk.
HU0102900A 1996-09-09 1997-09-09 Javított szilárd fázisú peptidszintézis és a szintézisben alkalmazható anyagok HU230354B1 (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK97196 1996-09-09
DK0971/96 1996-09-09
PCT/DK1997/000375 WO1998011125A1 (en) 1996-09-09 1997-09-09 Improved solid-phase peptide synthesis and agent for use in such synthesis

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0102900A2 HUP0102900A2 (hu) 2002-01-28
HUP0102900A3 HUP0102900A3 (en) 2002-02-28
HU230354B1 true HU230354B1 (hu) 2016-02-29

Family

ID=8099561

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0102900A HU230354B1 (hu) 1996-09-09 1997-09-09 Javított szilárd fázisú peptidszintézis és a szintézisben alkalmazható anyagok

Country Status (14)

Country Link
US (1) US7348404B2 (hu)
EP (1) EP0929567B1 (hu)
JP (1) JP4405594B2 (hu)
AT (1) ATE290014T1 (hu)
AU (1) AU723268B2 (hu)
CA (1) CA2265900C (hu)
CZ (1) CZ295838B6 (hu)
DE (1) DE69732640T2 (hu)
DK (1) DK0929567T3 (hu)
ES (1) ES2239364T3 (hu)
HU (1) HU230354B1 (hu)
IL (1) IL128829A (hu)
PT (1) PT929567E (hu)
WO (1) WO1998011125A1 (hu)

Families Citing this family (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1950223A3 (en) * 1998-03-09 2009-05-13 Zealand Pharma A/S Pharmacologically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis
US6528486B1 (en) 1999-07-12 2003-03-04 Zealand Pharma A/S Peptide agonists of GLP-1 activity
US7550425B2 (en) 2000-06-16 2009-06-23 Zealand Pharma A/S Diuretic peptide conjugates
DE602005023429D1 (de) 2004-10-19 2010-10-21 Lonza Ag Verfahren zur festphasen-peptidsynthese
NZ591178A (en) 2005-05-04 2012-06-29 Zealand Pharma As Glucagon-like-peptide-2 (glp-2) analogues
GB0514071D0 (en) 2005-07-07 2005-08-17 Zealand Pharma As N- or C- terminally modified small peptides
EP1975142A4 (en) * 2005-11-22 2009-12-02 Univ Nihon AUTOMATED SOLID PHASE SYNTHESIS OF PYRROLE-IMIDAZOLE POLYAMIDE
PT1966130E (pt) 2005-12-23 2014-01-30 Zealand Pharma As Compostos miméticos de lisina modificados
EP1991560B1 (en) * 2006-02-20 2018-04-04 Ewha University-Industry Collaboration Foundation Peptide having cell membrane penetrating activity
WO2007114454A1 (ja) * 2006-03-29 2007-10-11 Otsuka Chemical Co., Ltd. ペプチドのチオエステル化合物の製造方法
NZ576260A (en) 2006-11-08 2012-04-27 Zealand Pharma As GLUCAGON-LIKE-PEPTIDE-2 (GLP-2) ANALOGUES comprising one of more substitutions as compared to h[Gly2]GLP-2
US7994122B2 (en) 2007-06-15 2011-08-09 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
JP5635529B2 (ja) 2008-12-15 2014-12-03 ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ グルカゴン類似体
KR20110126591A (ko) 2008-12-15 2011-11-23 질랜드 파마 에이/에스 글루카곤 유사체
KR101593406B1 (ko) 2008-12-15 2016-02-12 질랜드 파마 에이/에스 글루카곤 유사체
CA2747112A1 (en) 2008-12-15 2010-06-24 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
ES2537287T3 (es) 2009-07-13 2015-06-05 Zealand Pharma A/S Análogos de glucagón acilados
SG184988A1 (en) 2010-04-27 2012-11-29 Zealand Pharma As Peptide conjugates of glp-1 receptor agonists and gastrin and their use
AR081975A1 (es) 2010-06-23 2012-10-31 Zealand Pharma As Analogos de glucagon
MX2012014961A (es) 2010-06-24 2013-02-26 Zealand Pharma As Analogos de glucagon.
US20140011733A1 (en) 2011-01-20 2014-01-09 Zealand Pharma A/S Combination of acylated glucagon analogues with insulin analogues
KR20140100947A (ko) 2011-11-03 2014-08-18 질랜드 파마 에이/에스 Ｇｌｐ-1 수용체 효능제 펩타이드 가스트린 접합체들
AU2012357739A1 (en) 2011-12-23 2014-07-03 Boehringer Ingelheim International Gmbh Glucagon analogues
WO2013098408A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Zealand Pharma A/S Glucagon and cck receptor agonist peptide conjugates
AR089860A1 (es) 2012-02-03 2014-09-24 Zealand Pharma As Analogos de la grelina
NZ702333A (en) 2012-05-03 2017-06-30 Zealand Pharma As Gip-glp-1 dual agonist compounds and methods
BR112014027345A2 (pt) 2012-05-03 2019-09-03 Zealand Pharma As análogos de peptídeo 2 semelhante ao glucagon (glp-2)
CA2878991C (en) 2012-07-23 2021-12-07 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
TWI608013B (zh) 2012-09-17 2017-12-11 西蘭製藥公司 升糖素類似物
MX2015012808A (es) 2013-03-12 2016-05-31 Molecular Templates Inc Inmunotoxinas de union a cd20 para inducir internalizacion celular y metodos que usan las mismas.
US9695214B2 (en) 2013-03-15 2017-07-04 Massachusetts Institute Of Technology Solid phase peptide synthesis processes and associated systems
US9169287B2 (en) 2013-03-15 2015-10-27 Massachusetts Institute Of Technology Solid phase peptide synthesis processes and associated systems
ES2624961T3 (es) 2013-03-21 2017-07-18 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Síntesis de productos de péptido que contienen imida cíclica
US10087221B2 (en) 2013-03-21 2018-10-02 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Synthesis of hydantoin containing peptide products
US9988429B2 (en) 2013-10-17 2018-06-05 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
US9896495B2 (en) 2013-10-17 2018-02-20 Zealand Pharma A/S Acylated glucagon analogues
JP6682432B2 (ja) 2013-11-06 2020-04-15 ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ Ｇｉｐ−ｇｌｐ−１デュアルアゴニスト化合物及び方法
KR102310392B1 (ko) 2013-11-06 2021-10-13 질랜드 파마 에이/에스 글루카곤-ｇｌｐ-1-ｇｉｐ 삼원 효능제 화합물
WO2015100246A1 (en) 2013-12-24 2015-07-02 Ossianix, Inc. Baff selective binding compounds and related methods
CN106414483A (zh) 2014-01-27 2017-02-15 分子模板公司 用于哺乳动物中的去免疫化志贺毒素a亚基效应子多肽
EP3604333B1 (en) 2014-03-11 2021-05-05 Molecular Templates, Inc. Proteins comprising amino-terminal proximal shiga toxin a subunit effector regions and cell-targeting immunoglobulin-type binding regions capable of specifically binding cd38
EP3825327A1 (en) 2014-03-11 2021-05-26 Molecular Templates, Inc. Proteins comprising binding regions, shiga toxin a subunit effector regions, and carboxy-terminal, endoplasmic reticulum localization signal motifs
US10815469B2 (en) 2014-06-11 2020-10-27 Molecular Templates, Inc. Cell-targeting molecules comprising protease-cleavage resistant, Shiga toxin A subunit effector polypeptides and carboxy-terminal moieties
EP3160995A2 (en) 2014-06-26 2017-05-03 Ossianix Inc. Semi-synthetic nurse shark vnar libraries for making and using selective binding compounds
WO2016066744A2 (en) 2014-10-29 2016-05-06 Zealand Pharma A/S Gip agonist compounds and methods
WO2016077840A2 (en) 2014-11-14 2016-05-19 Ossianix, Inc. TfR SELECTIVE BINDING COMPOUNDS AND RELATED METHODS
US10392425B2 (en) 2015-02-05 2019-08-27 Molecular Templates, Inc. Multivalent CD20-binding molecules comprising Shiga toxin A subunit effector regions and enriched compositions thereof
EP3271381B1 (en) 2015-03-18 2021-09-08 Zealand Pharma A/S Amylin analogues
GB201506380D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Serodus Asa Materials and methods for treatment of pulmonary hypertension
KR20170137198A (ko) 2015-04-16 2017-12-12 질랜드 파마 에이/에스 아실화된 글루카곤 유사체
AU2016271124C1 (en) 2015-05-30 2020-05-14 Molecular Templates, Inc. De-immunized, Shiga toxin a subunit scaffolds and cell-targeting molecules comprising the same
AU2016297920A1 (en) 2015-07-26 2018-01-18 Molecular Templates, Inc. Cell-targeting molecules comprising shiga toxin A subunit effectors and CD8+ T-cell epitopes
WO2017049128A1 (en) * 2015-09-17 2017-03-23 Massachusetts Institute Of Technology Methods and systems for solid phase peptide synthesis
AU2017311040B2 (en) 2016-08-06 2023-08-31 Ossianix, Inc. In vivo methods for selecting peptides that cross the blood brain barrier, related compositions and methods of use
US10071140B2 (en) 2016-09-09 2018-09-11 Zealand Pharma A/S Amylin analogues
WO2018103868A1 (en) 2016-12-09 2018-06-14 Zealand Pharma A/S Acylated glp-1/glp-2 dual agonists
MX2019006486A (es) 2016-12-09 2019-08-01 Zealand Pharma As Agonistas duales acilados de glp-1/glp-2.
WO2018104558A1 (en) 2016-12-09 2018-06-14 Zealand Pharma A/S Acylated glp-1/glp-2 dual agonists
WO2018104559A1 (en) 2016-12-09 2018-06-14 Zealand Pharma A/S Glp-1/glp-2 dual agonists
KR102587196B1 (ko) 2016-12-09 2023-10-10 질랜드 파마 에이/에스 Glp-1/glp-2 이중 효능제
ES2971981T3 (es) 2017-01-25 2024-06-10 Molecular Templates Inc Moléculas de reconocimiento de células que comprenden efectores de la subunidad A de la toxina Shiga desinmunizados y epítopos de células T CD8+
EP3704149A1 (en) 2017-11-02 2020-09-09 Ossianix, Inc. Improved tfr-selective binding peptides capable of crossing the blood brain barrier
RU2020128624A (ru) 2018-02-27 2022-03-28 Зп Спв 3 К/С Аналоги компстатина и их медицинское применение
CA3097178A1 (en) 2018-04-17 2019-10-24 Molecular Templates, Inc. Her2-targeting molecules comprising de-immunized, shiga toxin a subunit scaffolds
US20220177597A1 (en) 2018-06-22 2022-06-09 Ossianix, Inc. Anti-CD98hc VNARs for Crossing the Blood Brain Barrier and Type IV VNAR Libraries
WO2020056327A1 (en) 2018-09-14 2020-03-19 Ossianix, Inc. Tfr-specific binding moieties and transcytosis method to select vnars that cross cellular barriers
WO2020081493A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
MX2021008790A (es) 2019-01-23 2021-08-24 Millennium Pharm Inc Proteinas de union a cd38 que comprenden efectores de la subunidad a de la toxina shiga desinmunizada.
BR112021020941A2 (pt) 2019-06-14 2021-12-21 Zealand Pharma As Composição farmacêutica parenteral isotônica, método para melhoria da estabilidade química da dita composição e uso de manitol
EP4272751A3 (en) 2019-08-27 2024-02-14 Zp Spv 3 K/S Compstatin analogues and their medical uses
WO2021055816A1 (en) 2019-09-18 2021-03-25 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding molecules comprising shiga toxin a subunit scaffolds
JP2022548956A (ja) 2019-09-20 2022-11-22 ジーランド・ファーマ・ア／エス Ｋｖ１．３遮断剤
US20210155671A1 (en) 2019-11-24 2021-05-27 Molecular Templates, Inc. Uses of cd20-binding molecules and additional therapeutic agents
WO2021198195A1 (en) 2020-03-30 2021-10-07 Zealand Pharma A/S Agonist combination
EP4126003A1 (en) 2020-03-30 2023-02-08 Zealand Pharma A/S Glp-1/glp-2 dual agonists
KR20230039718A (ko) 2020-07-16 2023-03-21 제트피 에스피브이 3 케이/에스 보체 인자 c3의 억제제 및 이들의 의학적 용도
WO2022103769A1 (en) 2020-11-11 2022-05-19 Ossianix, Inc. High affinity human and monkey specific tfr-1 vnars
KR20230121824A (ko) 2020-12-16 2023-08-21 질랜드 파마 에이/에스 Glp-1/glp-2 이중 효능제의 약학적 조성물
WO2022129311A1 (en) 2020-12-16 2022-06-23 Zealand Pharma A/S Pharmaceutical composition of glp-1/glp-2 dual agonists
WO2022129305A1 (en) 2020-12-16 2022-06-23 Zealand Pharma A/S Pharmaceutical composition of glp-1/glp-2 dual agonists
US20240316155A1 (en) 2021-02-18 2024-09-26 Zealand Pharma A/S Composition for treating short bowel syndrome
CA3213295A1 (en) 2021-03-17 2022-09-22 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins comprising shiga toxin a subunit scaffolds and cd8+ t cell antigens
US20240182531A1 (en) 2021-03-23 2024-06-06 Zealand Pharma A/S KV1.3 Blockers
WO2022260877A1 (en) 2021-06-07 2022-12-15 Ossianix, Inc. Shark vnars for treating covid-19
JP2024525144A (ja) 2021-06-18 2024-07-10 北京拓界生物医薬科技有限公司 グルカゴン類似体及びその医薬用途
WO2023023166A1 (en) 2021-08-17 2023-02-23 Ossianix, Inc. Deimmunized vnar domains and scaffolds
CA3228429A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Mikkel Askjar Agersnap Dosage regime
MX2024006556A (es) 2021-12-01 2024-06-12 Zealand Pharma As Inhibidores de peptido del receptor de interleucina-23.
WO2024068848A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Zealand Pharma A/S Methods for treating obesity
WO2024083919A1 (en) 2022-10-18 2024-04-25 Zealand Pharma A/S Inhibitors
WO2024168411A1 (pt) * 2023-02-15 2024-08-22 Proteimax Bio Technology Israel Ltd Aditivo de alimento e/ou suplemento alimentar, processo de obtenção, formulação de alimento funcional e/ou suplemento alimentar, uso

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5116666A (hu) * 1974-07-30 1976-02-10 Shionogi Seiyaku Kk
US5021550A (en) * 1986-10-07 1991-06-04 Thomas Jefferson University Method for preventing deletion sequences in solid phase synthesis
JP2807287B2 (ja) * 1989-10-13 1998-10-08 株式会社医学生物学研究所 ペプチドおよびその用途
CA2170030A1 (en) * 1993-09-14 1995-03-23 Robert A. Lazarus Pharmaceutical compositions containing ecotin and homologs thereof
US7176282B1 (en) * 1996-09-09 2007-02-13 Zealand Pharma A/S Solid-phase peptide synthesis and agent for use in such synthesis
EP1950223A3 (en) * 1998-03-09 2009-05-13 Zealand Pharma A/S Pharmacologically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0102900A2 (hu) 2002-01-28
HUP0102900A3 (en) 2002-02-28
IL128829A (en) 2005-08-31
JP2001500134A (ja) 2001-01-09
US20070004905A1 (en) 2007-01-04
ATE290014T1 (de) 2005-03-15
WO1998011125A1 (en) 1998-03-19
CZ80399A3 (cs) 1999-08-11
US7348404B2 (en) 2008-03-25
AU723268B2 (en) 2000-08-24
EP0929567B1 (en) 2005-03-02
PT929567E (pt) 2005-07-29
DK0929567T3 (da) 2005-06-27
AU4199397A (en) 1998-04-02
JP4405594B2 (ja) 2010-01-27
DE69732640D1 (de) 2005-04-07
ES2239364T3 (es) 2005-09-16
EP0929567A1 (en) 1999-07-21
CA2265900A1 (en) 1998-03-19
IL128829A0 (en) 2000-01-31
DE69732640T2 (de) 2006-01-12
CZ295838B6 (cs) 2005-11-16
CA2265900C (en) 2007-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU230354B1 (hu) Javított szilárd fázisú peptidszintézis és a szintézisben alkalmazható anyagok
Leung et al. Growth hormone receptor and serum binding protein: purification, cloning and expression
Theissen et al. Cloning of the human cDNA for the U1 RNA‐associated 70K protein.
Funakoshi et al. Primary structure of human placental anticoagulant protein
EP0804231B1 (en) Synthetic multiple tandem repeat mucin and mucin-like peptides, and uses thereof
Stiefel et al. Molecular cloning of cDNAs encoding a putative cell wall protein from Zea mays and immunological identification of related polypeptides
JP2000503324A (ja) 固体支持体上でのポリピロール及びポリイミダゾールカルボキサミドの合成方法
HU208162B (en) Process for producing new proteins and pharmaceutical compositions comprising same
WO1995031547A1 (en) Brazzein sweetener
KR20170026326A (ko) Amg 416의 제조 방법
SK15352000A3 (sk) Spôsob výroby cyklických peptidov viazaných k polymérnemu nosiču
JP2000500497A (ja) コラーゲン様ペプトイド残基含有構造物
ES2280170T3 (es) Soluciones de procalcitonina humana.
JPH11512707A (ja) ソマトスタチンの環状ペプチド類似体
EP1578787B1 (en) Novel chi-conotoxin peptides (-ii)
WO1994019467A1 (en) Brazzein sweetener
EP0000252B1 (en) Peptides, pharmaceutical compositions containing the peptides and a process for the preparation of the peptides
Aird et al. The amino acid sequence of the acidic subunit B-chain of crotoxin
TW527361B (en) Cyclic somatostatin analogs
EP1406927B1 (en) Glycopeptides, their preparation and use in the diagnosis or therapeutic treatment of multiple sclerosis
CN113683710B (zh) 一种易于定向偶联的nkg2d受体蛋白及其免疫吸附剂
JPH02500637A (ja) ラミニンレセプターをコード化する組換えｄｎａクローン
US7851444B2 (en) χ-conotoxin peptides (-1)
CN111647049B (zh) 多肽和多肽偶联物及其制备方法和应用
US6280968B1 (en) Human PEC-60-like protein and DNA encoding the same

Legal Events

Date Code Title Description
NF4A Restoration of patent protection
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees