JP2000500497A

JP2000500497A - コラーゲン様ペプトイド残基含有構造物

Info

Publication number: JP2000500497A
Application number: JP9519839A
Authority: JP
Inventors: グッドマン，マレー; トゥレーン，ヨセフ・ピー; フェン，ヤンボー; メラシーニ，ジュセッペ
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1995-11-17
Filing date: 1996-11-18
Publication date: 2000-01-18
Also published as: WO1997019106A2; EP0861264A2; US6096710A; AU716531B2; WO1997019106A3; AU1054997A; CA2237845A1; US6329506B1

Abstract

(57)【要約】トリプルヘリックスのコンホメーションの、高密度のコラーゲン配列およびプロリンまたはヒドロキシプロリン残基がペプトイド残基と置換されている配列の反復するトリマーのアミノ酸鎖からなる、合成コラーゲン。本発明は、コラーゲンに存在しているトリプルヘリックスコンホメーションをもつ合成コラーゲン構造のコラーゲンタイプポリペプチドおよびポリ（ペプチド−ぺプトイド残基）鎖からの、ヘリックス誘導テンプレートによる製造方法をも含んでいる。

Description

【発明の詳細な説明】コラーゲン様ペプトイド残基含有構造物この研究は、国立科学財団助成金第DMR-9201133号(National Science Foundat ion Grant No．DMR-9201133)によって一部補助された。合衆国政府はこの発明に権利を有する。本発明は、アミノ酸の１つがペプトイド残基で置換されている、反復するトリマーアミノ酸配列もしくはトリマー配列を含むその合成コラーゲン様ポリマーに関する。それは、具体的には、３本のポリプロリンII様の鎖からなるコラーゲン様トリプルヘリックスコンホメーションを有する合成コラーゲンポリマーに関する。それはまた、らせんアレイ(helix array)の形成を誘導するテンプレート分子の用途にも関する。発明の背景天然のコラーゲンは、反復するトリマーアミノ酸配列の一次構造を有する。約９５％の分子を構成するらせん領域内では、アミノ酸グリシン(Gly)は、トリマーペプチドの全ての第３番めの位置毎に生じる。イミノ残基(I)、すなわちプロリン(Pro)およびヒドロキシプロリン(Hyp)のいずれも、５６％のトリマーで生じ、２０％はGly-X-I：２７％はGly-I-Y；および９％はGly-I-Iである。Proは、通常、反復するトリマーの第２番目の位置に生じ；一方Hypは、通常、最後の位置に生じる。(Bhatnagar，R．and R．Rapaka（1976）Chap．10 Biochemistry of C ollagen R.Ramachandren，ed．Plenum Press，New York，pp.481-482)。トリペプチド配列(Gly-X-Y)は、ＸおよびＹがプロリン(Pro)またはヒドロキシプロリン(Hyp)以外のアミノ酸残基であり、コラーゲンアミノ酸トリマーの４４％を構成している。グルタミン酸、ロイシン、およびフエニルアラニンは、ほとんどがＸの位置に、そしてスレオニン、グルタミン、メチオニン、アルギニンおよびリシンはＹの位置に生じる。アラニンおよびセリンは例外であるが、Ｘの位置のアミノ酸はかさばった側鎖を有する。合成コラーゲンは、それが多様な臨床応用（薬剤送達デバイス、眼用デバイス、および創傷治癒デバイスを含む）を有するコラーゲン様生物材料用の物質を提供するため、興味深い。プロリンおよびヒドロキシプロリン（翻訳後に修飾されたプロリン残基）残基は、天然のコラーゲン配列では豊富なので、トリマーアミノ酸配列Gly-Pro-XaaおよびGly-Xaa-Pro(Xaaは任意の天然のアミノ酸残基）からなる多くの連続したポリマーが、コラーゲン構造を擬態するように調製されてきた。(Segal,D.M.，and Traub，W.(1969)J.Mol.Biol.43:487-496は、ポリ(L-アラニル-L-プロリル-グリシン)を開示し；Segal,D.(1969)J.Mol.Biol.43:497-517)はコラーゲン様ポリヘキサペプチド(Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Pro)_n、(Gly-Pro-Ala-G ly-Pro-Pro)_n、(Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Ala)_nおよび(Gly-Ala-Ala-Gly-Pro-Pro)_n を開示し；Sakakibara，S.(1973)Biochim.Biophys.Acta 303:198-202は(Pro-Hyp -Gly)_nを開示し；Scatturin,A.(1975)Intl.J.Peptide Protein Res.7:425-435は (Pro-Leu-Gly)_nおよび(Leu-Pro-Gly)_nを開示し；Bansal,M.(1978)Peptide Prote in Res.11:73-81は(Gly-Pro-Leu)_nおよび(Gly-Leu-Pro)_nを開示し；そしてMille r，M.(1980)Macromolecules 13:910-913)は、ポリ（グリシルプロリルアラニル）を開示している。Ananthanarayanan,V.et al.(1976)はChap.15，Biopolymers ，pp.707-716(J.Wiley & Sons)で、トリプレットが同質異性のＮ−メチルグリシンサルコシンを(Gly-Pro-Sar)_nおよび(Gly-Sar-Pro)_nとして含有しているポリマーを開示している。コラーゲンは、特徴的な三次、二次および一次構造を有する。ほとんどのポリペプチドは、αヘリックスすなわち右巻きのらせんまたはプリーツシートβコンホメーションのいずれかで並んだペプチド結合しているアミノ酸の配列を含む。これらのアレイのそれぞれにおいて、隣り合うポリペプチド鎖のアミノ酸は、分子間水素結合によりその位置に保持される。対照的にコラーゲンは反復するアミノ酸トリマーを含む３本のポリペプチド鎖から構成されている。これらの鎖は１回転当たり約３残基の３本の伸びた(extended)左巻きのらせんで並ぶ、ポリプロリンII様の鎖である(Rich,A.et al.(1955)Nature 176:915)。コラーゲンのポリプロリンII様の鎖は、同じ方向に配置され、互いに絡み合ってスーパーコイルしたあるいはコイルしたらせん、すなわち、右巻きのトリプルヘリックスコンホメーションをとるが(Bella,J.et al.(1994)Science 266:75-81)、それもまたコラーゲンの特徴である。コラーゲンのトリプルヘリックスを構成する鎖はホモトリマー性、すなわち、同一の反復するアミノ酸トリマーから構成されるか、あるいは異なるアミノ酸トリマーの鎖で構成されるヘテロトリマー性のいずれかであり得る。ポリプロリンII様鎖のトリプルヘリックスへの会合(association)は、自然に起こる；しかし、ヘリックス形成の速度は、鎖の会合に反発する、ポリペプチド配列のカルボキシ末端のアミノ酸での反発するような電荷のため、遅い。この「末端効果」は、鎖長が長くなるにつれ重要性が低くなる。ヘリックス形成の速度はまた、各鎖のアミノ酸が、最初に整列するかあるいはお互いに正しく「整合(r egister)」されなければならず、そうするためにそれらは他方の鎖の長さに沿って位置を正しく調整しなければならないため、遅くなり得る。コラーゲン鎖は、適切に整合し全てのペプチド結合のためにトランスアミドを形成するため、各鎖の対応するアミノ酸の間で１残基のシフトを必要とすることがわかった。天然のコラーゲン構造の擬態は、非天然の残基をそのペプチド配列に挿入することによりそれらの生物学的安定性を増強することを意図していた。したがって、コラーゲン様構造の生物学的安定性の増強のために、多くの非天然プロリンアナログおよび他の非天然イミノ酸残基が、そのペプチド配列中で頻繁に生じるプロリン残基を置換するために用いられてきた。しかし、そのような残基、例えば、プロリンの低級ホモログであるアゼチジン-2-カルボン酸(Aze)の取り込みは、コラーゲンのトリプルヘリックス構造を脱安定化させるか、あるいはその形成を妨げることがわかった(Zagari,A.et al.(1994)Biopolymers,34:51-60)。ペプトイド残基は、新しいクラスの非天然イミノ酸であり(Simon,R.J．et al. (1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:9367-9371)、窒素原子上の置換基がアミノ酸のα位の側鎖であるＮ−置換グリシン残基を含む。それらは天然には生じないアミノ酸なので、ペプトイド残基またはペプトイド残基を含むペプチドは、酵素の攻撃により高い抵抗性を有している。近年、ペプチド残基は薬剤および他のペプチド関連生物材料の設計および合成に広く用いられてきた。テンプレートを用いる合成、すなわち、好ましい分子構造を誘導するための原子の集合体(assembly)との１つの分子の相互作用が天然では公知である。例えば、ＤＮＡの複製は、同じ三次構造を有する祖先分子からの娘ポリヌクレオチドのテンプレートによる合成を含む。テンプレートによって集合させる方法は、高分子量のタンパク質アナログの設計および合成に広く用いられてきた。分子テンプレートはペプチドループを適合させたり、ポリペプチドのαヘリックスおよびβターン構造を誘導するため、化学合成において用いられてきた。Kelly,T.R.et al. (1990).Amer.Chem.Soc.112:8024-8034は、β構造を形成するための直鎖状テンプレートの使用を報告した。Mullerは、２つの逆方向ペプチドβ鎖を架橋するかまたはβターンを誘導するアントラセン型のトリサイクリック構造を開示している。Mullerはまた、グリシンまたはアラニンで縮合したケンプトリ酸(Kemptriacid )が、付加したポリペプチドのαヘリックス性を誘導するためのテンプレートとして作用し得ることも示した(Muller,K.et al.(1993)Chap.33 in Perspectives in Medicinal Chemistry，B.Testa et al.,eds,Verlag，Basel)。Ghadiri,M.et al.(1993)Angew,Chem.Int.Ed.Engl.32.1594-1597は、ルテニウム金属ビピリジル複合体を含む３−αヘリックスの束のポリペプチドを調製した。 Roth,W.et al.(1980)Biopolymers 19:1909-1917は、リシンダイマーおよび1,2 ,3-プロパンカルボン酸を用いて共有結合で架橋した合成コラーゲンモデルペプチドを調製した。このペプチドはトリプルヘリックスに集合する（assemble）ことがわかった。Fields,C.G.et al.(1993)Biopolymers 33:1695-1707およびTanak a,T et al.(1993)FEBS 13257 334(3)272-276は、３つのペプチド鎖をＣ末端またはＮ末端で連結するために、３つのアミノ官能基を有する２つの連続して連なったリシン残基を用いた。Fields et al.は、温度に安定なトリプルヘリックスコンホメーションのコラーゲン様ポリペプチド配列の、固相法による形成を報告しているが、ここで、３本のコラーゲン様ペプチド鎖は、Ｃ末端で隣接したアミノ基でのオリシンから同時に合成された。ペプチド鎖の分岐は、それらが天然のコラーゲン中でそうであるようにトリプルヘリックスのポリペプチドにおける鎖の適切なアラインメントもしくは整合を確実にしていることが報告されている。天然のコラーゲンの特性を有する合成コラーゲンを調製するため、合成物質は三次構造、ならびに一次および二次構造においてコラーゲンを擬態しなければならない。発明の要旨本発明によると、反復するトリマーアミノ酸ビルディングブロックの鎖を含む合成コラーゲン様物質が提供され、ここで３０％のアミノ酸がグリシンであり、そして少なくとも約１０％がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、改良は、該反復トリマービルディングブロックへのペプトイド残基の少なくとも一部の取り込み、およびペプトイド残基を含有するトリプルヘリックスの、それらペプトイド残基含有ビルディングブロックから集合した鎖からの形成を包含する。好ましい実施態様において、この合成コラーゲン様物質は、反復するトリマービルディングブロックの鎖を含み、ここで、このトリマー配列は１つのペプトイド残基および２つのアミノ酸残基から構成される。特に好ましい実施態様においては、このトリマー配列の残基の３０％がグリシンアミノ酸残基であり、そして少なくとも約１０％がプロリンもしくはヒドロキシプロリンアミノ酸残基であり、そして少なくとも１０％がペプトイド残基である。これらのトリマー配列は、その各々が２つのアミノ酸残基と１つのペプトイド残基から構成され、ペプトイド残基含有アミノ酸鎖に取り込まれ、この鎖は次いでペプトイド残基含有トリプルヘリックスに形成される。本発明のこの局面の好ましい実施態様において、合成コラーゲン物質は、反復するビルディングブロックの鎖を含み、それらはトリペプチド配列、トリマージペプチド-ペプトイド残基配列またはペプチド-ペプトイド残基-ペプチド配列のいずれかであって、Gly-Xp-Pro;Gly-Pro-Yp;Gly-Pro-Hyp;およびGly-Pro-Pro；あるいはそれらの組合せ（ここで、XpおよびYpはペプトイド残基である）からなる群から選択され、この鎖はコラーゲンのそれと同様のトリプルヘリックスコンホメーションを有している。特に好ましい実施態様において、合成コラーゲン物質は、Gly-Xp-ProおよびGly-Pro-Ypまたはそれらの組合せからなる群から選択される反復するトリマービルディングブロックから構成されるアミノ酸鎖を含む。場合により、この鎖はGly-Pro-ProおよびGly-Pro-Hypトリマーを含むことができる。本発明は、末端ブロック基(terminal blocking group)を有するアミノ酸鎖を含み、ここで、この鎖は、式Ｘ−（Ｚ）_n−Ｙを有し、 (Gly-Xp-Pro)_j；および (Gly-Pro-Yp)_k；（式中XpおよびYpはペプトイド残基である）からなる群から選択される少なくとも１つのジペプチド−ペプトイド残基トリマー、Ｚ；および場合により (Gly-Pro-Pro)_l；および (Gly-Pro-Hyp)_m；からなる群から選択される少なくとも１つのトリペプチドを含み、該アミノ酸鎖中のｊ、ｋ、ｌ、およびｍの合計がｎであり、ｎが＞３であり；ここでＸは直鎖状、分岐鎖状、飽和もしくは不飽和脂肪酸、芳香族カルボン酸およびアラールキルカルボン酸からなる群から選択され、ポリペプチドのＮ−末端アミノ酸にアミド結合により結合されており；そしてＹは、アンモニア、直鎖状、分岐鎖状、飽和もしくは不飽和脂肪族アミン、芳香族アミン、およびアラールキルアミンからなる群から選択され、そしてＹはポリペプチドのＣ−末端にアミド結合により結合されている。本発明のペプトイド残基含有合成コラーゲン物質において、反復するトリマー配列のペプトイド残基は、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、リシン、フェニルアラニン、およびアスパラギン酸残基のＮ置換ペプトイド同質異性からなる群から選択される。例えば、反復するペプトイド残基含有トリプレットは、式Gly-Pro-NleuまたはGly-Nleu-Proのそれである。本発明はまた、反復するGly-Pro-Hypトリマー配列を含むアミノ酸鎖またはペプトイド残基を含有する反復するトリマー配列を含むアミノ酸鎖も含み、ここで、その鎖の末端でらせん性を妨害するような反発する電荷は、Ｎ末端でのアセチル化とＣ末端でのアミド化により除かれる。本発明はまた、式TP-[A-(Gly-Xp-Pro)_nNH₂]₃、TP-[A-(Gly-Pro-Yp)_nNH₂]₃またはそれらの組合せの反復するペプチド−ペプトイド残基トリマーのテンプレートに結合したアミノ酸鎖を提供し、式中TPは、ポリペプチド鎖のトリプルヘリックスの折り畳みを誘導することができるテンプレート分子で、３つの規則正しくスペースをおく官能基を有し、官能基のそれぞれは反復するペプチド-ペプトイド残基の鎖に共有結合し；Ａは随意の多官能性スペーサー分子であり；XpおよびＹｐはペプトイド残基であり；そしてｎ＞３である。本発明のこの局面の実施態様によると、式TP-[A-(Gly-Pro-Hyp)_nNH₂]₃の反復するペプチドトリマーであるテンプレートに結合したポリマーが提供される。テンプレートに付着しているアミノ酸鎖は、トリペプチドおよび１つのペプトイド残基と２つのペプチド残基から構成されるトリマー配列の組合せを含むことができる。関連する実施態様によると、テンプレートに結合したアミノ酸鎖集合体が提供され、これは：３つの規則正しくスペースをおく官能基を有するテンプレート分子、ＴＰ；官能性末端基を有するＣ₁〜Ｃ₆アルキル鎖を含む随意のスペーサー、Ａ；反復するトリマーペプチド配列またはペプトイド残基がペプチドを置換しているトリマー配列、あるいは(Gly-Xp-Pro)j、(Gly-Pro-Yp)k；(Gly-Pro-Pro)l；および(Gly-Pro-Hyp)mからなる群から選択される記載されたトリマー配列の混合物、ここでXpおよびYpはペプトイド残基であり；そしてｊ，ｋ，ｌおよびｍはそれぞれ０−ｎであり；ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍの合計＝ｎであり；ここでｎは＞３である、を含む３本のアミノ酸鎖を含み、ここでアミノ酸鎖は同じまたは異なるアミノ酸配列を有し、該テンプレート分子の官能基に直接的にまたはスペーサーＡを介して共有結合し；そしてこのテンプレート分子はこの鎖のトリプルヘリックスの折り畳みを誘導する。本発明のこの局面の好ましい実施態様において、テンプレート分子はケンプトリ酸(KTA)(cis,cis-1,3,5-トリメチルシクロヘキサン-1,3,5-トリカルボン酸)またはトリメシン酸(TMA)(1,3,5-ベンゼントリカルボン酸)；であり、ＡはGly(-NH -CH₂-COO-)および6-アミノヘキサン酸(-NH₂-(CH₂)₅-COO-)からなる群から選択されるスペーサーであり；そしてXpおよびYpはNleu（他のペプチドを付加）からなる群から選択される。本発明のこの局面の特定の実施態様において、下式のテンプレート結合アミノ酸鎖 KTA-(Gly-(Gly-Pro-Yp)_n-NH₂)₃； KTA-(Gly-(Gly-Xp-Hyp)_n-NH₂)₃； KTA-(Aha-(Gly-Pro-Yp)_n-NH₂)₃；または KTA-(Aha-(Gly-Xp-Hyp)_n-NH₂)₃；が提供され、ここで、YpおよびXpはペプトイド残基であり；KTAはケンプトリ酸( cis,cis-1,3,5-トリメチルシクロヘキサン-1,3,5-トリカルボン酸)であり；Aha は、6-アミノヘキサン酸(-NH₂-(CH₂)₅-COO-)であり；そしてｎは＞１である。下式のテンプレート結合アミノ酸鎖 TMA-(Gly-(Gly-Pro-Yp)_n-NH₂)₃；または TMA-(Gly-(Gly-Xp-Hyp)_n-NH₂)₃；もまた提供され、ここで、YpおよびXpはペプトイド残基であり；TMAはトリメシン酸(1,3,5-ベンゼントリカルボン酸）であり；そしてｎは＞１である。本発明のテンプレート結合集合体の好ましい実施態様において、XpはＮ−置換グリシンおよび他のペプトイド残基からなる群から選択される。本発明はまた、３本のアミノ酸鎖のトリプルヘリックスの折り畳みを誘導する方法であって、（ａ）１つのアミノ酸鎖のＮ−末端をヘリックスを誘導するテンプレート分子の３つの官能基のそれぞれに直接的にもしくは多官能性スペーサー分子を介して共有結合させる工程；（ｂ）テンプレートに集まった(template-as sembled)アミノ酸鎖が安定なトリプルヘリックスコンホメーションをとるのを可能にする工程を包含する方法も提供する。本発明のこの局面の１つの実施態様は、３本のアミノ酸鎖を、樹脂支持体上で固相セグメント縮合法により集める(assemble)予備工程を包含する。関係する手法には、樹脂に結合した集まったアミノ酸鎖のＮ末端を、テンプレートの官能基に、場合によりテンプレートに結合したスペーサーを介して、付着させる工程がある。あるいは、集合させた後に樹脂からアミノ酸を離して、集められた遊離のアミノ酸鎖のＮ末端を、次に、テンプレート分子の官能基に溶液中で付着させる。記載されるテンプレート集合体のいかなる好ましい実施態様においても、アミノ酸鎖は、Gly-Xp-Pro；Gly-Pro-Yp；Gly-Pro-Hyp；およびGly-Pro-Pro；またはそれらの組合せ（ここで、XpおよびYpはペプトイド残基である）からなる群から選択されるトリマー配列を含むことができる。本発明によるヘリックス状に整列されたコラーゲン様ポリマーはまた、次式：(Gly-Xp-Pro)_n；または(Gly-Pro-Yp ) _n またはそれらの組合せ（ここで、XpおよびYpはペプトイド残基であり、ｎ＞３である）、の反復するトリマー配列のアミノ酸鎖を含み得る。同様に、このコラーゲン様ポリマーは、反復するペプチドトリマーを含み得る。特に好ましい実施態様において、反復するペプチドトリマーは、Gly-Pro-Hyp、Gly-Pro-Proまたはそれらの組合せからなる群から選択される。本発明はさらに、開示した方法により調製したヘリックス状に整列した３本のアミノ酸鎖を含む合成コラーゲン物質を提供する。図面の簡単な説明図１は、ケンプトリ酸テンプレート構造を示す。図１（ａ）は、イス型コンホメーションのケンプトリ酸をしめし、その３つのカルボキシル官能基が３アミノ酸鎖のＮ末端に結合することができる。図１（ｂ）は、ケンプトリ酸分子の３つのカルボキシ官能基にグリシルスペーサーを介して付着した反復した配列(Gly-Pro-Hyp)₃の３本のアミノ酸鎖を示す。最終的なKTAg-3,3:(ケンプトリ酸-(Gly-(Gly-Pro-Hyp)₃)₃)生成物の純度を、分析的RP-HPLC上での均質な単一ピークにより確認した。図２は、反復したジペプチド-ペプトイド残基配列Ac-(Gly-Pro-Nleu)₉-NH₂の、水中、２０℃、０．２mg/mlの円二色性（ＣＤ）スペクトルである。図３は、テンプレートに結合した反復したジペプチド-ペプトイド残基配列KTA -[Gly-(Gly-Pro-Nleu)₆-NH₂]₃-の円二色性（ＣＤ）スペクトルである。図４は、以下のペプトイド残基：KTA-[Aha-(Gly-Pro-Nleu)₆-NH₂]₃-；TMA-[Gl y-(Gly-Pro-Nleu)₆-NH₂]₃-；KTA-[Gly-(Gly-Pro-Nleu)₆-NH₂]₃-を含む反復するトリマーのテンプレート結合鎖の融解曲線の比較を示す。好ましい実施態様の詳細な説明Ｉ．総論Ａ．用語Ｂ．本発明の全体的な説明 II．ペプチド-ペプトイド残基のトリマーのポリマーＡ．反復するトリマービルディングブロックＢ．トリマーの一本鎖ポリマー III.コラーゲン様トリプルヘリックス IV．ヘリックス誘導テンプレートＶ．コンホメーション分析 VI．実施例Ａ．一本鎖構造Ｂ．テンプレートに集まった構造Ｉ−Ａ．用語以下の頻繁に用いられる用語および略語は、以下の意味を有することを意図する：コラーゲン様コラーゲンに特徴的な、ポリペプチド鎖のトリプルヘリックスに調整されたαアミノ酸を含む構造。各ポリペプチド鎖は右巻きのらせんの二次構造、ポリプロリンII様鎖有し；そして３つの鎖は左巻きのヘリックスアレーでコイルしている。ケンプトリ酸(KTA) （cis,cis-1,3,5-トリメチルシクロヘキサン-1,3,5-トリカルボン酸）ポリマーおよびバイオポリマーのモノ分散とは、同じ大きさの単一の分子、または同じ長さで同じ分子量を有する配列からなる構造をいう。ポリマーおよびバイオポリマーのポリ分散とは、重合したモノマーまたは適切なビルディングブロックをいう。重合過程で、鎖の伸長は異なる鎖長を有するポリマーを導く。このポリマー分子はポリ分散であるといわれ、大きさまたは長さおよび分子量の分布がある。ペプチドまたはペプチド残基ペプチド結合でお互いが付着し合っているアミノ酸のオリゴマーのメンバー。ペプトイド残基ペプチド結合でお互いが付着し合っているアミノ酸のオリゴマーのメンバーとしてのＮ−置換グリシン同質異性であって、αアミノ酸の側鎖がその分子のα炭素の代わりにアミノ窒素に付着している。具体的なペプトイドモノマーの例は： Sar：N-メチルグリシン Nval：N-イソプロピルグリシン Nleu：N-イソブチルグリシン Nile：N-sec-ブチルグリシン Nglu;Nlys;Nphe；Nasp：それぞれグルタミン、リシン、フェニルアラニン、およびアスパラギン酸に関連したペプトイド残基。ペプトイドＮ−置換グリシンのオリゴマーまたはポリマーポリプロリンII様左巻きの伸びたヘリックスコイルを含む一本鎖コラーゲンポリペプチドの特徴的なヘリックスコンホメーション。ポリプロリンIIでは、ペプチド結合はtransコンホメーションを有する。整合(register) 鎖間水素結合に好ましい隣り合うコラーゲンポリペプチド鎖のアミノ酸のアラインメント。Rpn コラーゲン様集合体の円二色性（ＣＤ）スペクトルのポジティブピークとネガティブピークの強度の比であるトリプルヘリックスの指数。スペーサーテンプレート分子をその官能基を介して合成コラーゲン鎖に連結する多官能性分子。例えば、Gly：グリシン(NH-CH2-COO-)およびAha:6-アミノヘキサン酸(NH₂-(CH₂)₅-COO-)。TASP テンプレートに集合した合成タンパク質(Template-Assembled Synthetic Protein)は、二次構造物を形成するペプチドブロックを、ペプチドをパッキングして整列させる目的にあった(tailor-made)テンプレート分子に固定するという過程により形成されたあらかじめ決められた三次元構造を有する人工タンパク質である。テンプレート分子ツール、代表的には多官能性分子で、好ましい分子構造または組織の、多くの方法で（規則正しいヘリックスアレーを含む）集合させる能力を有する付着した鎖からの形成を行わせることができる。コラーゲンのトリマービルディングブロック反復するトリマー配列で、トリマーの各モノマーがペプチド残基もしくはペプトイド残基のいずれかである。トリマーまたはトリマー反復物ともいう。このトリマー配列は、トリペプチド、ペプトイドに付着したジペプチド、またはペプチド-ペプトイド-ペプチド残基配列であり得る。トリメシン酸(TMA) （1,3,5-ベンゼントリカルボン酸）Ｉ−Ｂ．本発明の全体的な説明コラーゲン鎖の反復するアミノ酸トリマー中のペプトイド残基の置換が、改良された特性を有するコラーゲン様物質を提供し得ることが発見された。この発明は、ペプチド-ペプトイド残基トリマーの新規なコラーゲン様構造物を形成するためのビルディングブロックとしての用途を含む。もちろん、それはまた、ビルディングブロックとしてトリペプチドビルディングブロックを含むコラーゲン様構造物中に特別に配置されたコ（ペプチド-ペプトイド残基）配列も含む。このコラーゲン様物質のペプトイド残基含有量は最少であり得る。あるいは、ペプトイド残基は典型的なコラーゲンアミノ酸組成の全てのプロリンおよびヒドロキシプロリンを置き換えることができる。例えば、コラーゲン様物質は、少なくとも約３０％のグリシン；およびプロリンまたはヒドロキシプロリンを置換した少なくとも約１０％のペプトイド残基を含み得る。残りのアミノ酸は、Bhatna gar,R.and R.Rapaka（上記で引用）に記載された天然のコラーゲン中に生じるもののようであり得る。本発明の物質はまた、ペプトイド残基が全てのアミノ酸トリプレットに生じているコラーゲン様物質を含み得る。ヘリックスを誘導するテンプレートは、コラーゲン様ポリトリペプチドおよびポリ（ペプチド-ペプトイド残基）を天然のコラーゲンに特徴的なトリプルヘリックスコンホメーションに集合させることを助けることがさらに発見された。いかなる特定の場合においても、トリプルヘリックス形成は、実施例においてのように、実証され得る。 II．ペプチド-ペプトイド残基トリマーのポリマーＡ．反復するトリマービルディングブロック以前の研究は、多くのタイプのプロリンアナログおよび他の非天然のイミノ酸の一本鎖コラーゲン様アミノ酸配列への取り込みが、コラーゲントリプルヘリックス構造の形成を妨げることを示している。コラーゲン様構造をより綿密に擬態する方法において、本発明の一つの実施態様によると、ペプチド残基をコラーゲン様反復アミノ酸トリマーにおいてプロリン代用物として用いた。ペプトイド残基は、Ｎ−置換グリシンであり、アミノ酸の側鎖はα炭素からα 窒素へ移動している。これらのアミノ酸同質異性は、Ｎ−アミノ酸、すなわち例えば、Nleu、Nval、およびNlysと名付けられている。本発明における用途のための好ましいペプトイド残基は、Ｎ−置換基が、アミノ酸またはそれらのアナログの疎水性非極性側鎖基であり、例えば、バリン(Nval)のイソプロピル基、ロイシン(Nleu)またはイソロイシン(Nile)のイソブチル基、ノルバリンのプロピル基、ノルロイシンのブチル基である。他の有用なペプトイド残基は、Ｎ−グルタミン酸(Nglu)、Ｎ−リシン(Nlys)である。本発明の例示において、ペプトイド残基、Ｎ−イソブチルグリシン(Nleu)をプロリン代用物として用いた。本発明は、天然のアミノ酸の側鎖を有するペプトイドに限定されるわけではないが、ペプチド残基と類似の側鎖基を有するＮ−置換ペプトイド残基を含むコラーゲン様ポリマーは、天然のコラーゲン配列に匹敵し、他の非天然のイミノ酸残基よりも天然のタンパク質とより適合性であるようである。生物物理学的および生物化学的研究は、他のプロリンアナログおよび非天然のイミノ酸と異なり、そのようなペプトイド残基は、コラーゲン様配列に組み込まれる場合、コラーゲントリプルヘリックス構造と本当に適合性である。しかしながら、本発明によると、ペプトイド残基の窒素に付着した置換基は、いかなる基、例えば、芳香族基またはアラールキル基、または少なくとも２つの炭素原子の直鎖もしくは分岐鎖のアルキル基でもあり得る。置換基はまた、親水性もしくは疎水性であり得、そして官能基を含んでもよい。しかしながら、Ｎ−置換基すなわちアラニンのメチル基が、もっとも疎水性が低くもっともかさの低いアミノ酸側鎖であるＮ−メチルグリシン（サルコシン）の取り込みは、トリプルヘリックスに満足のいくほど集合させられているペプトイド残基を含有する鎖を提供しない。ペプトイド残基、例えばＮ−置換グリシン、の合成は、グリシンのアミノプロトンのα位の側鎖、好ましくは天然のアミノ酸の側鎖による置換を伴う。この反応は、いくつかの合成経路、例えば、Rogers,T．et al.(1986)Chem.Abstr.105:2 26986z；により開示されたグリオキシル酸による側鎖アミンの還元的アミノ化、あるいはBuckus,P.(1964)Cem.Abstr．61:5511bによって開示されたように、側鎖のハロ酢酸によるアルキル化により溶液中で行うことができ、あるいはNg lnペプトイド残基（グルタミンに関する）のためには、グリシンのアクリルアミドへのMichael付加が用いられてきた。Zuckerman,R.N.et al.(1992)J.Amer.Chem .Soc.114:10646-10647またはSakakibara,S.et al.(1973)Biochim.Biophys.Acta 303:198-202によるハロ酢酸および一級アミンの固相縮合が好ましい。本発明によるＮ−置換グリシン構造のペプトイド残基は、したがって、アルキル−またはイソアルキルアミンのエチルブロモアセテートでのアルキル化により調製される。これらのペプトイド残基はまた、Ｃ−末端保護グリシンのアルキルアルデヒドでの還元的アミノ化によっても調製される。アルキル化および還元的アミノ化法によるペプトイド残基の合成は、実施例４に例示する。どちらのルートも収率は高い。本発明の一つの局面によるコラーゲン様構造を形成できる一本鎖構造は、各々が１ペプトイド残基を含むコラーゲン様トリペプチドのポリマーから構成される。好ましいペプチド−ペプトイド残基トリマーは、式Gly-Xp-ProまたはGly-Pro- Yp(式中XpおよびYpはペプトイド残基である)を有する。これらのトリマービルディングブロックは、末端保護アミノ酸とペプトイド残基を、溶液中でステップワイズ法を用いてカップリングさせることにより調製される。好ましいダイマーBoc-Gly-Pro-OH（Boc:t-ブチルオキシカルボニル）を得るため、p-ニトロフェノール活性エステルBoc-Gly-ONpを最初に調製し、次いで、少量の水を伴ったジメチルホルムアミド(DMF)中で触媒としてトリエチルアミン(TE A)を用いてプロリンと反応させる。Ｎ−アルキルグリシンエステル(Yp-OEt)をこのジペプチド−遊離酸に、DMF中で、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)- カルボジイミド(EDC)およびＮ−ヒドロベンゾトリアゾール(HOBt)をカップリング試薬として用いてカップリングさせ、トリ（ペプチド-ペプトイド残基）Boc-G ly-Pro-Yp-OEtを得る。末端エチル基を、加水分解により除去してビルディングブロックトリペプトイド−遊離酸Boc-Gly-Pro-Yp-OHを得る。Gly-Xp-Proペプチド-ペプトイド種を同様の方法で調製する。好ましいダイマーBoc-Gly-Xp-OEtを得るため、Boc-Gly-OHをXp-OEtに、DMF中でベンゾトリアゾリルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム-ヘキサフルオロホスフェート(BOP)をカップリング試薬として用いてカップリングさせる。加水分解後、得られたジペプチド遊離酸Boc-Gly-Xp-OHをEDCおよびHOBtを冷却試薬として用いてPro-OBzにカップリングさせ、ペプトイド残基含有トリマーBoc -Gly-Xp-Pro-OBzを得る。次いで、ベンジル保護基をPd/Cを触媒として用いる水素化により除去し、トリマービルディングブロックBoc-Gly-Xp-Pro-OHを得る。すべての好ましいトリマー生成物(Gly-Pro-Yp-NH₂、Ac-Gly-Pro-Yp-NH₂、Ac-Gly -Pro-Yp-NHCH₃、Gly-Xp-Pro-NH₂、Ac-Gly-Xp-Pro-NHCH₃)および(Gly-Pro-Yp)₂-N H₂を、溶液中のペプチド合成法により調製することができる。ペプトイド残基を含有するトリマービルディングブロックの合成を実施例５および６で説明する。 II−Ｂ．トリマーペプトイド残基含有ビルディングブロックの一本鎖ポリマー反復するトリマーペプトイド残基含有配列のビルディングブロックを含むコラーゲン様鎖を調製した。本発明のこの局面による実施態様の中では、Nlueペプトイド残基を取り込んだGly-Pro-NleuおよびGly-Nleu-Pro反復配列からなるコラーゲンアナログを形成し得る一本鎖が好ましい。ペプトイド残基を含むトリマーのモノ分散配列を、１０未満のトリプレット反復物を有するモノ分散配列でGly-Pr o-NleuまたはGly-Nleu-Pro配列からなるトリプルヘリックスの性質を試みた全ての条件下でコラーゲン様トリプルヘリックスアレーを形成することができないことが既に示されている(Gly-Pro-Leu)₁₀の配列のそれ(Scatturin,A.et al.(1975) Int.J.Peptide and Protein Research 7:425-435)と比較するために調製した。この比較は、トリプルヘリックス形成においてはペプトイド残基のほうがアミノ酸残基よりも好都合であることを示す。 4-メチルベンズヒドリルアミン(MBHA)樹脂を用いるSakakibara et al.によって紹介された方法を基にした固相セグメント縮合法を用いて実施例の一本鎖コラーゲン様配列を調製した。例えば、ペプトイド残基Nglu、Nlys，Nphe、Nval、NaspおよびSarを含有する対応する配列を調製し、これらのペプトイド残基もまたトリマー配列Gly-Pro-Xa aまたはGly-Xaa-Proに挿入することができる。トリマービルディングブロックBoc-Gly-Pro-Yp-OHおよびBoc-Gly-Xp-Pro-OHは、溶液中で、標準的なペプチドステップワイズカップリングにより合成することができる。溶液セグメント縮合法を用いて(Gly-Pro-Yp)₂-NH₂を調製した。Boc-G ly-Pro-Yp-OHをDMF中でBOPをカップリング試薬として用いてGly-Pro-Yp-NH₂にカップリングさせ、Boc-(Gly-Pro-Yp)₂-NH₂を得た。次いで、Boc基を除去してＮ− 末端遊離アミントリマー(Gly-Pro-Yp)₂-NH₂を得た。溶液中で調製したこれらの小さいトリマー配列の全てもまたRP-HPLCにより精製した。固相合成に用いたカップリング試薬には、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC )およびHOBtを含み；カップリング反応に用いた溶媒はＤＣＭ中２５％ＤＭＦであった。ＤＣＭ（３０％）中のＴＦＡの溶液を用いて各カップリング後にBoc基を除去し、ＤＣＭ中１０％ＴＥＡの溶液を中和のために用いた。カイザーニンヒドリンテストを用いて各カップリング反応をモニターした。好ましいビルディングブロックトリマーBoc-Gly-Pro-Yp-OHの１．２から１．５当量を、約２当量のカップリング試薬ＤＩＣおよびＨＯＢｔとともに各カップリング毎に用い、ペプチド結合形成は通常４−８時間かかった。反復するトリマービルディングブロックAla-Sar-Gly，Gly-Sar-Ala、Ala-Nphe -Gly-、Glu-Sar-Gly、Lys-Sar-GlyおよびGly-Pro-Sarを伴う他の配列の合成および特徴づけはGoodman,M.et al.(1994)Polymer Preprint 35(1):767-768にも報告されている。 III．コラーゲン様トリプルヘリックス天然のコラーゲンおよびＮ−末端遊離アミンおよびＣ−末端遊離酸中のコラーゲン様ポリペプチド配列は、鎖が非常に長い場合、自然にトリプルヘリックスコンホメーションをとることができる。しかし、鎖長が限られたアナログでは、Ｎ −末端での陽イオン形成およびＣ−末端での陰イオン形成は、鎖間で反発力を誘導し、ヘリックス形成を妨害する負の「最終効果(end effect)」を誘導し得る。例えば、(Gly-Pro-Hyp)₁₀-OHは室温で自然にトリプルヘリックスコンホメーションをとる(Venugopal,M.et al.(1994)Biochemistry 33:7948-7956）；しかし、(Gly -Pro-Hyp)₅は、５℃より高いとヘリックスを維持しない。より短い鎖のヘリックス形成は、Ｎ−末端のアセチル化と記載した最終効果を除去するＣ−末端のアミド化により達成することができる。適切なＮ−末端アセチル化物質は、末端アミンの結合に利用できるカルボキシル基を有するいかなるものであってもよい分子である。好ましい物質は、直鎖、分岐鎖、飽和もしくは不飽和脂肪酸、芳香族カルボン酸およびアラールキルカルボン酸である。適切なＣ−アミド化物質は、鎖の末端カルボキシルの結合に利用できるアミン基を有するいかなるものであってもよい分子である。好ましい物質は、アンモニア、直鎖、分岐鎖、飽和もしくは不飽和脂肪族アミン、芳香族アミンおよびアラルキルアミンである。制限するのではない適切なＣ−末端基の例は、アミド、ビピリシンおよびマレイミドである。Ｃ−末端アミド化合物を合成するため、NH₄ClおよびHCl-NH₂CH₃を、トリエチルアミンと共に用いてアミンNH₃およびNH₂CH₃を生成し、これらを次に、Boc-Gly -Pro-Yp-OHまたはBoc-Gly-Xp-Pro-OHと同時に反応させて、Ｎ−末端Boc保護トリマーペプトイド残基含有アミド化合物を得た。Boc基を次いで、ＤＣＭ中３０％ＴＦＡの溶液を用いて除去した。HCl/ジオキサン（４Ｎ）を用いて塩化水素塩として生成物を得た。固相のＣ−末端アミド化合物を得るため、4-メチルベンジルアミン樹脂（ＭＢＨＡ、２００−４００メッシュ、１％ＤＶＢ，０．４５mmol/g ）（これはＨＦ開裂後Ｃ−末端ペプチドでアミドを生じる）を用いた。アセチル化合物を調製するため、酢酸無水物を用いてトリマーペプトイド残基含有アミド化合物のＮ末端を、塩基としてトリエチルアミンを伴うＤＣＭ中でアセチル化した。これらの生成物の調製を実施例８で説明する。固相のアセチル化合物を調製するため、予想される鎖長に達した後、Boc基を除去して５％ＴＥＡをともなうＤＣＭ中の酢酸無水物を用いて、ペプチド鎖のＮ −末端をアセチル化した。アセチル化には３０−６０分かかった。以下の化合物をこの固相セグメント縮合法により調製した：(Gly-Pro-Nleu)_n-NH₂(n＝1,2,3,4 ,5,6,7,9)、Ac-(Gly-Pro-Nleu)_n-NH₂(n＝1,6,9)、(Gly-Nleu-Pro)₉-NH₂(n＝1,9) 、Ac-(Gly-Nleu-Pro)n-NH2(n＝3,6,10)およびAc-(Gly-Pro-Sar)₁₀-Gly-OH。本発明の一本鎖コラーゲンアナログの合成は、スキーム４─５に概説し、実施例７および８に例示する。一本鎖のＮ−末端アセチル化の効率は、(Gly-Pro-Hyp)₅(５℃、５０％エタノール／水中）とAc-(Gly-Pro-Hyp)₅-NH₂（２３℃、５０％エタノール／水中）の融点を比較することにより示すことができる。したがって、本発明のこの局面の実施態様は、一般式Ａｃ−ｎのＮ−末端アセチル化一本鎖ポリペプチドを含み、ここでｎは反復するコラーゲン様トリマーの数を示す。この群の好ましいメンバーは、式Ac-(Gly-Pro-Hyp)_n-NH₂、Ac-(Gly-Xp-Hyp)_nまたはAc-(Gly-Hyp-Yp)_nのコラーゲン鎖である。ＩＶ．ヘリックス誘導テンプレート天然のコラーゲンのトリプルヘリックス構造には絡み合ってスーパーヘリックスを形成する３本の平行なポリプロリンII様鎖が含まれるので、これら３本の鎖を共有結合でもしくは非共有結合でペプチド鎖の同じ末端(Ｃ−末端またはＮ− 末端)につなぐ３つの官能基を有するテンプレートが、コラーゲントリプルヘリックス形成の核をなし伸長させる適切な経路であると考えられる。したがって、本発明の第２のタイプのコラーゲン様ペプトイド残基含有構造物は、トリプルヘリックスコンホメーションをこれらのポリ（ペプチド−ペプトイド残基）鎖に誘導する末端テンプレートを有するアナログに基づく。テンプレート法では、官能基を有するテンプレートを、特定のタンパク質（またはポリペプチド）コンホメーションの形成を助けるために用いる。テンプレートは、テンプレートに集合した合成タンパク質(TASP;Tuchscherer,G．and Mutter,M.(1995)Jo urn.Peptide Sci.1:3-10)と呼ばれるポリペプチドのαヘリックスおよびβターン構造を擬態する工程の一部として用いられてきたが、コラーゲン様トリプルヘリックスコンホメーションを擬態するためにこれまで用いられたことはない。２つのタイプのテンプレートを、本発明による好ましい方法で用いることができる。１つはケンプトリ酸(KTA)の誘導体、全てアクシャル(axial)の位置にある３つのカルボキシル官能基を有するシクロヘキサンの誘導体に基づく（Kemp,D.and K .Petrakis(1981) J.Org.Chem.46:5140-5143)。２番目は、ベンゼン環の平面方向を向いている３つのカルボキシル官能基を有するトリメシン酸(TMA)誘導体に基づく。２つのテンプレートは以下の構造を有する：高度に圧迫された(constrained)三官能性分子テンプレート（例えば、ケンプトリ酸およびトリメシン酸）は、これまでコラーゲン様トリプルヘリックスコンホメーションをモノ分散コラーゲン様鎖に誘導するために用いられたことはない。これらのテンプレートはコラーゲントリプルヘリックス形成を劇的に容易にし、そのトリプルヘリックスコンホメーションを、コラーゲン様ポリトリペプチドおよびポリ（ペプチド-ペプトイド残基）のどちらについても安定化する。本発明の高度に圧迫されたテンプレートは、リシンジペプチドおよびRoth(198 9)およびFields(1993)（上で引用）の他の架橋構造を基にした高度に可撓性のテンプレートよりも優れていると考えられている。本発明の高度に圧迫されたテンプレートは、鎖を平行に維持するが、分子フレームを撓ませ曲げることにより、これらの鎖の残基がパス(path)に沿った動きにより最適な整合を探すことを可能にする。RothおよびFieldsのテンプレートは、対照的に、各鎖のアラインメントを単一残基の増加シフトを有するもう一方に合わせることにより鎖の整合を促進する。本発明のコラーゲン様ポリペプチドまたはペプトイド残基含有鎖にコラーゲントリプルヘリックス形成を誘導するのに適切な、制限するのではない他の三官能性テンプレートの例は（多少より可撓性であるが）、αシクロデキストリン、およびアミノトリチオール化合物である。融合したシクロヘキサン、縮合した芳香族、アダマンタンまたはステロイドの構造を有する官能化された分子は、本発明のヘリックス誘導テンプレートとして適している。当業者は、他の適切なテンプレート構造を同定することができる。 KTAテンプレートは、コラーゲントリプルヘリックス構造とより適合性であるので好ましい。なぜなら、トリ酸の３つの官能基は、コラーゲントリプルヘリックス構造内の３つのペプチド鎖にカップリングすることができるからである。ケンプトリ酸KTA(cis,cis-1,3,5-トリメチルシクロヘキサン-1,3,5-トリカルボン酸)は、構造的に圧迫された有機構造物で、したがって、(Gly-Pro-Hyp)トリプレット反復物を含有する３つのポリペプチドのトリプルヘリックスの折り畳みの核となるテンプレートとして用いた。以前のＮＭＲ研究は、KTAが、その中で３つのカルボキシル官能基がアクシャルの位置にあるイス型コンホメーションを好むことを示した。このコンホメーションにおいて、３つのアクシャルなカルボニル炭素原子間の間隙は２．５−３．５Å(Kemp,D．and K.Patrakis，1981)であり、一方トリプルヘリックス配列内の Gly-NHに結合したシンメトリーな関係のカルボニル炭素原子間の距離は、常に４ Åより大きい。直径および間隔のこの差を埋めるため、スペーサー、例えば、グリシン残基を各ペプチド鎖と、テンプレート分子（この場合の例はKTA）上の各カルボキシル基との間に挿入することができる。３つのポリペプチドまたはペプトイド残基含有鎖は、したがって、好ましくはスペーサー分子を介してテンプレートに結合する；スペーサーとして働くグリシン残基が好ましい。テンプレートとヘリックス鎖との間のスペーサー接合部は、それが鎖間の立体障害を和らげるという目的に都合がよい。また、トリプルヘリックスのスーパーコイル構造においては、３つの鎖が１残基シフトしている。例えば、Gly-Pro-Hyp配列において、どのような所定のレベルでも、トリプルヘリックスのパッキングは１つの鎖からのGly、二番目の鎖からのProおよび３番目の鎖からのHypを含んでいる。スペーサーは異なるコンホメーションになるように捻れたり伸びたりできるので、３本のペプチド鎖はコラーゲン様トリプルヘリックスアレイに必要な適切なシフトをとることができる。したがって、ケンプトリ酸またはトリメシン酸の各カルボキシル基は、グリシンのような可撓性スペーサーを介してトリプルヘリックスの鎖にカップリングし、その集合には、適当なシフトとヘリックス整合が可能である。ヘリックス誘導テンプレートを調製するため、Ｃ−末端ベンジルエステル保護スペーサー残基(Gly-OBz,Aha-OBz)を最初にKTAおよびTMAにＤＭＦ中でＥＤＣおよびＨＯＢｔをカップリング剤として用いてカップリングさせた。Ｃ−末端ベンジル基をメタノール中でＰｄ／Ｃを触媒として用いて水素化により除去し、３つのカルボキシル基を有する好ましいテンプレートを生成した：KTA-(Gly-OH)₃、K TA-(Aha-OH)₃、およびTMA-(Gly-OH)₃。これらのテンプレートの純度を分析的ＨＰＬＣプロファイルによりチェックし、必要ならばそれらをさらに調製的ＲＰ− ＨＰＬＣを行うことにより精製した。２つの方法を用いてカルボキシル官能基を有するテンプレートをペプチド鎖のＮ−末端に付着させた。好ましい方法の１つにおいて、ペプチド-ペプトイド残基鎖を最初に樹脂上に集合させた。特定の鎖長を達成した後、このテンプレートをＤＩＣおよびＨＯＢｔをカップリング剤として用いてＮ−末端にカップリングさせた。この生成物をＨＦ開裂法により樹脂から除き、ＨＰＬＣで精製した。この方法を、Gly-Pro-Hyp配列からなるテンプレートに集合したコラーゲン様ポリペプチド化合物の調製に用いて成功した。Gly-Pro-YpおよびGly-Xp-Pro配列からなる好ましいテンプレートに集合したコラーゲン様ポリペプチド-ペプトイド残基トリマーのいくつかもまたこの方法により調製した。本発明の別の好ましい方法によると、テンプレートおよびペプチド鎖は溶液中でペプチド結合形成を介して連結された。ペプチド-ペプトイド残基鎖は、固相合成法により集合させ、Ｎ−末端遊離アミンとして樹脂から開裂させた。これらのペプトイド残基鎖はＨＰＬＣにより精製した。テンプレートと遊離アミンペプチド-ペプトイド残基鎖を溶液中でＥＤＣおよびＨＯＢｔを用いてカップリングさせた。この方法は、いくつかの標的テンプレート集合反復トリマービルディングブロック（場合によりペプトイド残基を含有する）の調製に用いた。革新的なコラーゲンテンプレート設計本発明によるコラーゲンテンプレートの革新的な設計は、分子メカニックシミュレーションによって示されたように、KTAテンプレートがトリプルヘリックス軸と比べて歪んでいるという観察に基づく。この観察は、コラーゲントリプルヘリックステンプレートの一般的な設計原理に関連する２つの重要な結果を有する。第１に、上記のゆがみはテンプレートがその外形を著しく歪めることなくコラーゲントリプルヘリックス整合シフトに適合するのを可能にし、そのことは構造変化に敏感なKTAメチレンケミカルシフトにより示されるとおりである(Kemp,D.e t al.1981 J.Org.Chem.46:5140-5143)。したがって、テンプレートはトリプルヘリックスアレイを著しく歪めるという危険性なしに高度に圧迫される。このことは、コラーゲントリプルヘリックス形成における適当なスペーサーを有する高度に圧迫されたテンプレートによって得られる自由エネルギーの獲得が、これまでに公開された高度に可撓性のテンプレート(Roth,W.et al.198Biopol.,19:1909-1 917 ； Fields,C.G.et al.1993 Biopol.,33:1695-1707 ；Tanaka,T.et a.1993 ,FEBS，334(3):272-276)によって可能なそれよりも大きいことを意味する。増大した自由エネルギーの獲得は、テンプレートの高度に圧迫されているという性質により可能となるエントロピー消失のよりよい最適化の結果であり、それは同時にいかなる重大なエンタルピー変化も導かない。第２に、トリプルヘリックスの軸と比較した場合のテンプレートの歪みは、高度に圧迫されたテンプレートが正しいトリプルヘリックスキラリティの三重らせん(ternary screw)シンメトリーを有するという必要性を排除する。コラーゲントリプルヘリックスはその代わりに、設計研究により、およびトリプルヘリックスが存在する条件で獲得されるＮＭＲスペクトル中のKTAシグナルの分割により示されるように、正しいシンメトリーを誘導し、キラリティーをテンプレートに移す。高度に圧迫されたテンプレートは、したがって、アキラルであり得、三回転したシンメトリー(ternary rotational symmetry)を有する。この設計原理は、化学合成により、らせんシンメトリーを有するキラルテンプレートよりも容易に接近可能な標的分子を導く。化合物TMA-[(Gly-Pro-Nleu)₉-NH₂]₃は、テンプレート(TMA)とペプチド鎖との間にいかなるスペーサー残基をも有していない分子を示す。この化合物は、トリプルヘリックス形成に関する、特にペプチド鎖が好ましくないテンプレートの構造的効果を補償するのに十分長い場合の、スペーサーの必要性およびテンプレートの好ましいコンホメーションを示すために調製した。この化合物を合成するため、 TMAを酸塩化物に活性化し、ペプチド-ペプトイド残基(Gly-Pro-Nleu)₉-NH₂のＮ −末端に溶液中でカップリングした。テンプレートに結合したコラーゲン様ポリペプチドの調製の例を実施例９−１１に示す。上記の２つの合成系路において、用いるテンプレートの量が決定的であるということに注意することが重要である。テンプレートに付着した一本鎖および／または二本鎖しか持たない化合物のような副産物の形成を排除するため、用いるテンプレートの同等物が制御されなければならない。好ましい合成においては、テンプレートは一部ずつ(portionwise)添加した。添加と添加の間に、カイザー試験を用いて反応をモニターした。この方法で、テンプレートのポリペプチド-ペプトイド残基鎖へのカップリングは、通常２、３日かかり、用いたテンプレートの官能基当量は一般に０．９未満であった。テンプレートに集合したポリペプチド鎖の合成概要は合成スキーム６−８で提供する。Ｖ．コンホメーション分析本発明のペプトイド残基を含有するコラーゲンアナログに関する、分光旋光計（ＣＤ）、紫外線分光（ＵＶ）、旋光測定（ＯＲ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）を用いる生物物理学的研究は、クリティカルな鎖長に達した場合に、本発明のペプトイド残基含有配列がトリプルヘリックスアレイを形成できることを示す。コラーゲン様およびポリプロリンII様構造は、溶液中でユニークなＣＤスペクトルを示す(Sakakibara,S.et al.(1968))。これらのスペクトルは、２００nm近辺の大きなネガティブピークと２１７−２２７nm近辺の小さなポジティブピークによって特徴付けられる。これらの特徴を基礎として用いて天然のおよび合成のペプチドについて、溶液中のポリプロリンII様のまたはコラーゲン様のヘリックス構造の存在を確立した(Inoue,K.et al.(1982))。しかしながら、これらのＣＤスペクトルの形とピークの位置は、ポリプロリンII様ペプチド鎖がトリプルヘリックス構造と関連しているかどうかは示さない。したがって、これらのパラメーターは必要ではあるが、それらを、コラーゲン様トリプルヘリックスコンホメーションの存在を確立するために終局的に使うことはできない。ヘリックス性のＲｐｎ指数ペプチド／ペプトイド残基含有分子におけるトリプルヘリックス性の発生および程度の評価の基準は、これらの分子のＣＤスペクトルのピークの強度と最小および最大の波長によって規定される。ポジティブおよびネガティブピークの強度はどちらも鎖長が増えるにつれ増加し、温度が上がるにつれ減少する。ピーク強度とそれらの位置は多くの要因に依存するので、ポリプロリンII型構造のような他の構造アレイからトリプルヘリックス性を区別するためにそれらを明確に使うことはできない。しかし、本発明者らは、ピーク強度に関連する重要なパラメーターが溶液中のトリプルヘリックスアレイの存在を確立するのに有用であり得ることを見いだした。このパラメーターはネガティブピークに対するポジティブピークの強度の比である。このパラメーターをＲｐｎと称する。絶対的なピーク強度とは異なり、この強度比はコンホメーションに対してより敏感である。Ｒｐｎは、いくつかの要因、例えば、溶媒、配列組成、鎖長および温度に依存する。しかし、本発明者らは、関連する一連の分子内では、鎖長に対してプロットされたＲｐｎ値が、トリプルヘリックス形成に必要な決定的な鎖長で変曲を示すことを見いだした。溶解曲線熱溶解測定は、コラーゲン様ヘリックスの物理的性質の変化、例えば、温度による特定の回転またはＵＶ吸収の変化を説明する。これは、トリプルヘリックス形成および安定性のもう一つの指標を提供する。ヘリックス形成は、温度による性質変化速度の変遷により、すなわち溶解曲線の変曲により示される。変遷温度はその温度より高いとヘリックスが変性する温度を示す。Gly-Pro-Nleu鎖のテンプレート結合鎖の溶解曲線を図４に示す。ペプトイド残基含有配列Ac-(Gly-Pro-Nleu)₉-NH₂とポリペプチド配列Ac-(Gly- Pro-Pro)₁₀との間の生物物理学的性質の比較は、Gly-Pro-Nleu配列がトリプルヘリックス温度安定性においてGly-Pro-Pro配列に匹敵するが、ペプトイド残基含有配列はペプチド化合物より１トリマー反復分少ないことを示す。この結果は、他のプロリンアナログおよび非天然のイミノ酸残基とは対照的に、ペプトイド残基Nleuがコラーゲントリプルヘリックス構造と適合性であることを明確に示す。この知見は、本発明のコラーゲン様分子の新しいファミリーの最初の実証である。さらに、テンプレートは、より短い鎖をトリプルヘリックス構造に形成させそのトリプルヘリックス構造を安定化させることによりトリプルヘリックス形成を著しく容易にすることができる。KTA-[Gly-(Gly-Pro-Hyp)₃-NH₂]₃系はトリプルヘリックスを形成し、これまで報告された最も短い鎖のコラーゲン様トリプルヘリックスを示す。結果は、[KTA-[Gly-(Gly-Pro-Hyp)₅-NH]₃およびKTA-[Gly-(Gly -Pro-Hyp)₆-NH₂]₃のどちらも、わずか７０℃より高い温度で水中で変性し得るトリプルヘリックス構造を形成することを示す。アセチル連続(sequential)ポリペプチド、Ac-(Gly-Pro-Hyp)_n-NH₂(n＝6,9)は、室温より高い温度で水中で安定なトリプルヘリックス構造を形成することができるが、ｎ＝５の場合には、トリプルヘリックス構造は＜１８℃でのみ生じる。テンプレート−スペーサー効果は、 Gly-Pro-Hypトリマーからなる短い鎖に関してさらにより劇的である。[KTA-[Gly -(Gly-Pro-HyP)₃-NH₃]₃は室温で水中でトリプルヘリックスであるが、Ac-(Gly-P ro-Hyp)₃-NH₂は、たとえより好ましい溶媒系（エチレングリコール：水）（v/v ，２：１）の中であっても、より低い温度であってもトリプルヘリックス構造はとらない。この発明は、同様に、新規なコラーゲン様構造を形成するため他のペプチド- ペプトイド残基ビルディングブロックの使用を含む。もちろん、コ（ペプチド- ペプトイド残基）配列は、コラーゲン様構造中の特定のビルディングブロックの特定の配置により含まれ得る。本発明の配列は、ホモトリマー鎖またはヘテロトリマー鎖のいずれかを含む天然のコラーゲンに類似し得る。ヘテロトリマー鎖は例えば以下の構造： (Gly-Hyp-Pro)_j(Gly-Pro-Yp)_k(Gly-Pro-Pro)_l(Gly-Pro-Hyp)_m （式中、ｊ，ｋ，ｌおよびｍはそのトリマーの反復数を示し、ｊからｍまでの合計はｎ、すなわち反復するトリマーユニットの数である）を有するトリペプチドおよびジペプチド-ペプトイド残基トリマーの混合物を含み得る。好ましくは鎖中に少なくとも３つのトリマーがある（ｎ＞３）。このトリマーはいかなる順番でも生じ得る。本発明のトリプルヘリックスは同じ配列のトリマーまたは異なる配列の鎖を同様に含み得る。いかなる特定の場合においても、トリプルヘリックス形成は実施例においてのように実証することができる。 VI．実験の項材料：用いた全てのキラルアミノ酸は、Ｌ−型であった。保護アミノ酸、ＥＤＣ、ＤＣＣ、およびベンゾトリアゾリルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）はBachemから購入した。ＡＣＳグレードおよびＨＰＬＣグレードの溶媒（ＤＣＭ、ＤＭＦ、Ｈ２０、アセトニトリル、クロロホルム、メタノール、酢酸エチル、ヘキサン、ＴＨＦ）はFisher Scien tificから購入し、さらに精製せずに使用した。ＴＥＡ、Ｐｄ／Ｃおよびｐ−ニトロフェノールはAldrichから購入した。ＨＯＢｔ、ＴＦＡ（ＨＰＬＣグレード）およびＨＣｌ／ジオキサン（４Ｎ）は、Chem-Impex Internationalから購入した。一般情報：溶液中の全ての反応は、あらかじめコーティングされたシリカゲル60 F-54プレート(Merck)上で溶媒系クロロホルム／メタノール／酢酸（ＣＭＡ）または酢酸エチル／ヘキサン（Ｅ／Ｈ）を用いて行う薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によりモニターした。化合物はＵＶ、ニンヒドリン、またはブロモクレゾール溶液により可視化した。シリカゲル60(Merck,0.040-0.063mm,230-400メッシュ ASTM)を用いてカラムクロマトグラフィーを行った。２つのタイプのＨＰＬＣ機器を用いて生成物を分析および精製した。１つはWaters(510ポンプ、484検出器)系である。もう一つはWaters 715 Ultra WISPサンプルプロセッサー、Waters TM 996フォトダイオードアレイ検出器、２つのWaters 510ポンプおよびNECPowe rMate 486/331コンピューターからなるMILLENNIUM 2010系である。ＨＰＬＣに用いた溶媒は、溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡを含むか含まないＨ２０、溶媒Ｂ：０．１％ＴＦＡを含むか含まないアセトニトリルであった。流速は調製カラムについては１０ml/分、セミ調製カラムについては４ml/分、そして分析カラムについては１．０−１．２ml/分であった。ＮＭＲ：ＮＭＲスペクトルを用いて中間体および小さなペプチドの構造を確認した。いくつかの化合物については、２−ＤＮＭＲ(COSYおよびHOHAHA)スペクトルを測定してピーク量を測定した。これらのスペクトルは、Bruker AMX 500MHz SpectrometerまたはTechmagパルスプログラマーおよびデジタル化装置と共に一つに集合させられた360MHzスペクトロメーターのいずれか、およびOxford Instr uments Superconducting magnetで得た。円二色性（ＣＤ）：測定は、改変したCary-61 Spectropolarimeterで行った。ＣＤスペクトルは０．０２cmのセルを用いてシグナル平均１０スキャンにより得た。波長範囲は１８５−３００nmにセットし、走査速度は１．０nm／秒であった。試料を０．２mg/mlの濃度で測定した。トリプルヘリックス形成の適切な平衡化を可能にするため、溶液を冷蔵庫に（〜４℃）、各実験の少なくとも２４時間前に、およびデータを得る前に特定の温度でさらに２時間保持した。ＵＶ：紫外線（ＵＶ）溶解曲線は、Cary-1E UV Spectrometerで行った。試料濃度は、０．０４mg/mlであり、ＣＤ測定用の０．２mg/ml溶液から調製した。この溶液を実験の少なくとも２４時間前に冷蔵庫に（４℃）保持した。溶解実験を行うため、試料を開始温度で１時間平衡化した。加熱速度は０．２度／分であった。測定波長は２２３nmに設定した。ＭＳ：マススペクトルはUC RiversideおよびScripps Research Instituteで得た。高速原子衝撃(FAB)法、エレクトロスプレーイオン化(ESI)法およびマトリックス補助式レーザー脱着イオン化(MALDI)法を用いて生成物の構造を確認した。合成スキーム1・8 スキーム1 方法1: 方法2: スキーム2 スキーム3 スキーム4 スキーム5．溶液中のAc-Gly-Pro-Nlcu-NH₂の合成スキーム6 スキーム7 スキーム8 実施例１トリマービルディングブロックBoc-Gly-Pro-Hyp(OBz)-OHの合成 Boc-Gly-Pro-OBz Boc-Gly-OH（３５ｇ、０．２mol）、Tos-Pro-OBz（７５．５ｇ、０．２mol）およびＨＯＢｔ（３０ｇ、０．２２mol）をＤＭＦ６００mlに溶解した。溶液を氷水浴で冷却し、ＴＥＡ（３５ml、０．２５mol）を徐々に添加した。５分後、ＥＤＣ（４０ｇ、０．２１mol）を添加した。溶液を０℃で１時間撹拌後、氷水浴を除去し、溶液を室温で一晩撹拌した。ＤＭＦを減圧下で除去した。残存混合物を酢酸エチル８００ml中にデカントした。酢酸エチル溶液を、２×２００mlの H₂O、３×１００mlの飽和 NaHCO₃、２×１００mlの飽和NaCl（ブライン）、３× １００mlの２N NaHSO₄およびブラインで、ブライン相のpHが約７になるまで洗浄した。Na₂SO₄を用いて乾燥し、溶媒を除去して、粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（溶離溶媒：酢酸エチル／ヘキサン，２：１）を行って、精製化合物（白色固体、６９ｇ、９５．５％）を得た。ＴＬＣ Rf＝０．４２（酢酸エチル／ヘキサン３：１）。 Boc-Gly-Pro-OH Boc-Gly-Pro-OBz（１９．４ｇ、０．０５４mol）をH₂O １００mlおよびＴＨＦ１００mlの混合物に溶解した。溶液を０℃に冷却後、H₂O ５０ml中のＫＯＨ（４．８ｇ、０．０８５mol）を徐々に添加した。溶液を１時間撹拌した。次に、ＴＨＦを減圧下で除去し、水性溶液を酢酸エチルで抽出して、ベンジルアルコールを除去した。得られた水性相を酢酸エチル２００mlで覆い、濃塩酸を徐々に添加して（同時に溶液を激しく撹拌する）、０℃で酸性化して、約pH２とした。生成物を酢酸エチル３×２００mlで水性相から抽出した。有機相をあわせ、ブライン２×３０mlで洗浄して、Na₂SO₄により乾燥した。酢酸エチルを除去して、生成物 Boc-Gly-Pro-OH（白色固体、１２．３ｇ、８５％）を得た。ＴＬＣ Rf＝０．２５（ＣＭＡ，８５：１５：３）ＦＡＢ−ＭＳ実測値MH⁺=273．¹H-NMR(360MHz， DMSO-d₆，20℃)δ12.55(s，1H，カルボキシル)，6.79(s，NH-major)，4.50(dd， 0.25H，Pro α-minor)，4.20(dd，0.71H，Pro-α-major)， 3.81-3.62(m，1.7H，Gly-α-major)，3.47-3.33(m，2H，Pro-δおよびGly-α-mi nor)，2.25-2.00(m，1.2H，Pro-β)，1.96-1.60(m，2.7H，Pro-βおよびPro-γ) ，1.36(s，9H，Boc)． Boc-Gly-Pro-ONpの合成 Boc-Gly-Pro-OH（２.８ｇ、０.０１mol）およびｐ−ニトロフェノール(１．７ｇ、０.０１２mol）をＤＣＭ（１００ml）に溶解し、ＤＣＣ（２．１ｇ、０．０１mol）を溶液を撹拌しながら一部ずつ溶液に添加した。沈殿(ジシクロヘキシルウレア、ＤＣＵ）がすぐに生じた。溶液を室温で３．５時間撹拌後、ＴＬＣ分析（展開溶媒：酢酸エチル／ヘキサン３：１）は、出発物質Boc-Gly-Pro-OHがすべて消費されたことを示した。生成物Boc-Gly-Pro-ONpのRfは、この溶媒系では０．４５であった。濾過によりＤＣＵを除去し、減圧下でＤＣＭを除去した。酢酸エチルを残存油状物に添加し、得られた溶液を０℃に冷却した。さらなる沈殿が生じ、これを濾過して除去した。上記の操作を反復し、褐色がかった油状物を得た。再度精製し、特徴付けすることなくこの生成物を直接Boc-Gly-Pro-Hyp(OBz) -OHの合成に用いた。 Boc-Hyp(OBz)-OH Boc-Hyp-OH（９．３ｇ、０．０４mol）を液体アンモニア約２００mlに一部ずつ添加し、反応フラスコをドライアイス−イソプロパノール浴に入れた。溶液を５分間撹拌した。ナトリウム（１．８ｇ、０．０８mol）を添加すると、溶液は暗青色になった。５分後、塩化ベンジル（８ml、０．０６９mol）を徐々に添加すると、青色が消えた。反応溶液を−７９℃で２時間撹拌し、浴をアンモニアがほとんど出てしまうまで（さらに３時間）撹拌し続けながら、とり去った。得られた反応混合物に、H₂O １５０mlを注意深く添加した。水性溶液を酢酸エチル２ ×１００mlで抽出し、未反応塩化ベンジルを除去した。次に、水性溶液を酢酸エチル２００mlで覆い、濃塩酸を徐々に添加して（同時に溶液を激しく撹拌する）、０℃で酸性化して、pH３とした。生成物を酢酸エチル２×２００mlで水性相から抽出した。ＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／酢酸（ＣＭＡ）８５：１５：３）により有機相中に２つの化合物が見出された。ＮＭＲにより、それらは予期された生成物Boc-Hyp(OBz)-OH（Rf．０．３６）であることが立証された。酢酸エチル溶液をNa₂SO₄により乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。カラムクロマトグラフィー（溶離溶媒：酢酸エチル／ヘキサン，３：１）を用いて混合物を分離した。Boc-Hyp-OH３．７ｇを回収し、７．５ｇの生成物Bo c-Hyp(OBz)-OH（白色固体、５８．４％）を得た。ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H)⁺=32 2．¹H-NMR(360MHz，DMSO-d₆，20℃)δ12.48(s，1H，CO₂H)，7.31(m，5H，フェニル)， 4.48(q，2H，ベンジル)，4.11(m，2H，Hyp-αに関しては1HおよびHyp-γ に関しては 1H)，3.43(m，1H， Hyp-δ-l)，3.25(m，1H，Hyp-δ-h)，2.34(m，1 H，Hyp-β-l)，1.98(m，1H，Hyp-β-h)，1.36(d，9H，Boc)． Boc-Gly-Pro-Hyp(OBz)-OH Boc-Hyp(OBz)-OH（３．２ｇ、０．０１mol）およびＴＦＡ／ＤＣＭ（３０％）５０mlを混合し、溶液を室温で３０分間撹拌した。ＴＬＣ分析は、Boc-Hyp(OBz) -OHが存在しないことを示した（ＣＭＡ，８５：１５：３中でRf＝０．５２）。溶媒を除去し、トルエンを添加し（３×５０ml）、蒸留して微量ＴＦＡを除去した。上記で得られたHyp(OBz)-OHのＴＦＡ塩をＤＭＦに溶解した。溶液を撹拌し、水氷浴上で０℃に冷却した。pHが約９になるまで、トリエチルアミンを徐々に溶液に添加した。次に、Boc-Gly-Pro-ONp（０．０１ml）を添加し、得られた溶液を１時間撹拌した。浴を除去し、撹拌を一晩継続した。溶媒を減圧下で蒸留し、残留混合物を飽和NaHCO₃ ５０ml中に注ぎ入れた。水性溶液を酢酸エチル２× ５０mlで抽出して有機不純物を除去した。残留水性溶液を酢酸エチル１００mlで覆い、濃塩酸を徐々に添加して（同時に溶液を激しく撹拌しながら）、０℃で酸性化して、約pH２とした。生成物を酢酸エチル２×１５０mlで水性溶液から抽出した。有機相をあわせ、ブライン２×１５mlで洗浄して、Na₂SO₄により乾燥した。溶媒を減圧下で除去して、粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィー処理（溶離溶媒：酢酸エチル／ヘキサン，３：１）を行って、精製物質（白色固体、２．６ｇ、５５％）を得た。ＴＬＣ Rf＝０．４２（ＣＭＡ，８５：１５：３）。ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム分析は、単一均質ピークを示し、保持時間はＲＴ＝１３．８分であった（溶離媒質中０．１％ＴＦＡ，３０〜６０％Ｂ、２５分）。ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H)⁺=476．¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆ ，27℃，HOHAHAにより測定)（ｌおよびｈは低および高磁場を表す）δ12.36(s， 1H，CO₂H)，7.34(m，5H，フェニル)，6.74(d，1H，NH)，4.92(dd，0.3H，Pro-α ，minor)，4.63(dd，0.7H，Pro-α，major)，4.52(q，2H，ベンジル），4.32-4. 20(m，2H，Hyp-αおよびHyp-γ)，4.21(d，0.35H，Hyp-δ-minor-1)，3.92(d，0 .65H， Hyp-δ-major-1)，3.80(m，1H，Gly-α-l)，3.70-3.60(m，1.65H，Gly- α-hに関しては1H，Hyp-δ-major-hに関しては0.65H)，3.54(d，0.35H，Hyp-δ- minor-h)，3.47-3.36(m，2H，Pro-δ)，2.40-2.20(m，1.5H，Hyp-β-lおよびPro -β-l-minor)，2.10-1.84(m，3.2H，Pro-β-l-major，Pro-β-h-minor，Hyp-β- h-minor，Hyp-β-h-majorおよびPro-δ-major)，1.80-1.60(m，1.3H，Pro-γ-l- minor，Pro-β-h-major，Pro-γ-l-minorおよびPro-γ-h-minor)，1.36(s，9H， Boc)．実施例２ Gly-Pro-Hypトリマーからなるコラーゲンアナログの合成 Ac-Gly-Pro-Hyp-NH₂ 一般情報の項に記載された一般固相セグメント縮合操作後に、Boc-Gly-Pro-Hy p-(OBz)-MBHA(０．３mmol、樹脂置換を基礎にして)を調製した。ＤＣＭ中３０％ＴＦＡ１５mlの溶液を用いて、Boc保護基を除去し、アニソール１．０mlをスカベンジャーとして添加した。樹脂をＤＣＭ２０ml、メタノール２０ml、ＤＣＭ２０ml、その後ＤＣＭ中の１０％ＴＥＡ２×１５mlで洗浄した。５％ＴＥＡを含有するＤＣＭ１５ml中に溶解した無水酢酸０．５mlを用いてＮ末端をアセチル化して、Ac-Gly-Pro-Hyp(OBz)-MBHAを得た。ＨＦ開裂（一般情報の項）を行った後、粗生成物７２mgを得た。ＲＰ−ＨＰＬＣを行って、精製物質Ac-Gly-Pro-Hyp-NH₂ （白色固体、４５mg、４６％）を得た。ＨＰＬＣ分析は、均質単一ピーククロマトグラムを示した。ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H)⁺=327.1678，計算値(M+H)⁺=327.16 68．¹H-NMR(500MHz，D₂O，NHシグナルを得るためにH₂Oを使用。27℃，DQF-COSY 法により測定)δ8.14(s，1H，Gly-NH)，7.75(s，1H，C末端NH₂)，7.01(s，1H，C 末端NH₂)，4.95(dd，0.15H，Pro-α)，4.74(m，H₂Oシグナル，Pro-α)，4.62(m ， 1H，Hyp-γ)，4.53(t，1H，Hyp-α)，4.15(d，1H，Gly-α-a)，4.00(d，1H，Gly -α-h)，3.88(d，1H，Hyp-δ-l)，3.81(dd，1H，Hyp-δ-h)，3.60(m，2H，Pro- δ)，2.34(m，2.1H，Hyp-β-l，Pro-β-l)，2.06(m，5.6H，Hyp-β-h，Pro-γおよびアセチル)，1.93(m，1.3H，Pro-β-l)． Ac-(Gly-Pro-Hyp)_n-NH₂(n=3,5,6,9) これらの化合物の合成、精製および特徴付けは、Ac-Gly-Pro-Hyp-NH₂の場合と同様であった。Gly-Pro-Hyp化合物の合成の結果を、表１に要約する。実施例３ KTAテンプレート集合(Template Assembled)コラーゲン様構造物：（Gly-Pro-H yp)_nの合成 KTA-[Gly-Gly-Pro-Hyp-NH₂]₃ 一般情報の項に記載された一般固相合成操作後に、Boc-Gly-Pro-Hyp(OBz)-MBH A（樹脂置換レベルを基礎にして０．３mmol）を調製した。ＤＣＭ中３０％ＴＦＡの溶液を用いて、Boc基を除去し、アニソール１．０mlをスカベンジャーとして添加した。樹脂をＤＣＭ、メタノール、ＤＣＭ中の１０％ＴＥＡおよびＤＣＭで洗浄して、Gly-Pro-Hyp-(OBz)-MBHAを得た。KTA-(Gly-OH)₃(３５mg、０．０８ mmol)およびＨＯＢｔ（５０mg）を容器に添加し、約２５％ＤＭＦを添加してＨＯＢｔの溶解を助けた。次に、ＤＣＭ中の１．０M ＤＩＣ（０．４mmol）４mlを添加した。カイザー試験は、３日間容器を振盪後にアミンが存在しないことを示した。ＤＣＭおよびメタノールで樹脂を数回洗浄し、デシケーター中で一晩乾燥させた。ＨＦ開裂法（一般情報の項に記載）を行って樹脂からペプチドを除去し、得られた樹脂と生成物の混合物をヘキサンとエチルエーテルの混合物で洗浄した。H₂Oで抽出して樹脂から生成物を分離した。抽出H₂O溶液を凍結乾燥して、粗生成物を得た。ＲＰ−ＨＰＬＣを行って、精製物質（白色固体、５５mg、収率５６％）を得た。分析的ＨＰＬＣプロフィールは、単一均質ピークを示し、ＲＴは１３分であった（ＴＦＡ非含有、７−５０％Ｂ、３０分）。ESI-MS(M+Na)⁺=1251 ．¹H-NMR(500MHz，D₂O，27℃，NHシグナルを得るために5℃でH₂Oを使用。DQF-CO SY) δ8.84(m，3H，Gly-NH)，8.57(m，3H，スペーサーGly-NH)，7.89(m，3H，末端NH₂ )，7.33(m，3H，末端NH₂)，4.61(m，3H，Hyp-γ)，4.49(t，3H，Hyp-α)，4.06 (q，6H，Gly-α)，3.86-3.70(m，12H，スペーサーGly-αおよびHyp-δ)，3.67-3 .54(m，6H，Pro-δ)，2.65(d，3H，メチレンエクアトリアル結合），2.37-2.2 6(m，6H，Pro-βおよびHyp-β)，2.10-2.00(m，9H，Pro-γおよびHyp-β)，1.97 -1.90(m，3H，Pro-β)，1.33(d，3H，メチレン−アキシアル結合)，1.26(s，9H ，メチル)． KTA-[Gly-(Gly-Pro-Hyp)_n-NH₂]₃(n=3,5,6) これらの３つの化合物に関する合成および特徴付けの方法は、KTA-[Gly-(Gly- Pro-Hyp-NH₂)]₃の場合と同様であった。結果を、下記の表１に要約する。 a:Vydac分析カラム。溶離溶媒：A,H₂O,0.1％TFA.B,アセトニトリル0.1％TFA． b:収率は樹脂置換レベルと、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製から得た物質を基にして計算した。 c:溶離溶媒にＴＦＡを含まない。実施例４ Nleu-OEtのようなペプトイド残基Xpの合成アルキル化によるNleu-OEt イソブチルアミン（５０ｇ、０．６８mol）をＴＨＦ３００mlに溶解し、溶液を０℃に冷却した。エチルブロモアセテート（５０ｇ、０．３mol）を、溶液を撹拌しながら徐々に添加した。撹拌を３時間継続した。ＴＨＦを減圧下で除去し、得られた混合物を酢酸エチル３００ml中に注ぎ入れた。イソブチルアミンの臭化水素塩の沈殿が生じ、これを濾過により除いた。酢酸エチルを減圧下でロートベイパーで蒸留して、溶液の容量を５０mlとした。カラムクロマトグラフィー（溶離溶媒：Ｅ／Ｈ，３：１）を行って生成物を精製した。ＴＬＣ Rf＝０．５（展開溶媒：Ｅ／Ｈ，３：１）。クロマトグラフィーから収集した溶出物をあわせ、０℃に冷却した。ジオキサン中のHCl（４N）を沈殿が認められなくなるまで添加した。生成物を塩化水素塩（白色固体、４９ｇ、８３％）の形態で析出させた。還元的アミノ化によるNleu-OEt Gly-OEtの塩化水素塩（１４ｇ、０．１mol）、イソブチルアルデヒド（７．３ｇ、０．１mol）およびＫＯＨ（１ｇ）をメタノール２００mlに溶解した。溶液を水氷浴上で０℃に冷却し、１時間撹拌した。NaCNBH₃（５．７ｇ、０．０９mol ）を徐々に添加した。撹拌を一晩継続した。メタノールを減圧下で除去し、得られた混合物を酢酸エチル３００ml中に注ぎ入れた。生成物を飽和NaHSO₄ ５×５０mlにより有機相から抽出した。水性相を０”℃に冷却し、溶液を激しく撹拌しながら、NaHCO₃をゆっくりと添加してpHを約９に調整した。遊離アミン形態の生成物を酢酸エチル３×３００mlにより水性溶液から抽出した。有機相をNa₂SO₄により乾燥し、酢酸エチルを減圧下で除去して、粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィー(溶離溶媒:Ｅ／Ｈ，４：１)を行って精製物質を得た(油状物、１１. ５ｇ、７２％）。ＴＬＣ Rf＝０．５５（展開溶媒：クロロホルム／メタノール４：１）．ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H)⁺=160．¹H-NMR(360MHz，DMSO-d6，20℃)HCl 塩に関して，δ9.16(s，2H，NH₂ ⁺)，4.20(q，2H，OCH₂)，3.91(s，2H，α-CH₂) ，2.74(d，2H，イソブチルCH₂)，1.94(m，1H，イソブチルCH)，1.20(t，3H，エチルCH₃)，0.90(d，6H，イソブチルCH₃)．実施例５トリマービルディングブロックBoc-Gly-Pro-Nleu-OHの合成 Boc-Gly-ONp Boc-Gly-OH（３２．６ｇ、０．１８６mol）、およびｐ−ニトロフェノール（２７．８ｇ、０．２０mol）をジクロロメタン（ＤＣＭ）３００mlに溶解し、溶液を水氷浴上で０℃に冷却した。溶液を撹拌しながら、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ，３９ｇ、０．１９mol）を４回に分けて添加した。ジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ）の沈殿が間もなく生じた。溶液を室温で一晩撹拌した後、ＴＬＣ分析は、もはや出発物質Boc-Gly-OHを示さなかった。ＤＣＵを濾過して除去した。得られた溶液を４℃に冷却すると、さらに沈殿が生じ、これを濾過により除去した。ＤＣＭを減圧下で除去して、黄色の油状物を得た。油状物を真空系に一晩置いて、エーテル／ヘキサンを用いて生成物Boc-Boc-ONp（白色固体、５０ｇ、９１％）を集めた。ＴＬＣ Rf＝０．７（展開溶媒：ＣＭＡ，８５：１５：３）． Boc-Gly-Pro-OH Boc-Gly-ONp(５０ｇ、０.１７mol)およびプロリン(２０．７ｇ、０.１７５mol )をＤＭＦ３００mlに溶解した。溶液を撹拌しながら、ＴＥＡ２０mlおよび水３０mlを添加した。撹拌を一晩継続し、ＴＬＣ分析はもはや出発物質を示さなかった。溶媒を減圧下で除去し、得られた混合物を飽和Na₂CO₃ ２５０mlに溶解した。水性溶液を酢酸エチル３×１００mlで抽出して、ｐ−ニトロフェノールを除去した。次に、０℃に冷却後、濃HClをゆっくりと添加して（同時に激しく撹拌しながら）、水性溶液を約pH＝３の酸性にした。酢酸エチル３×１５０mlにより、生成物を水性相から抽出した。有機相をあわせ、飽和NaCl（ブライン）３×２０ mlで洗浄して、Na₂SO₄を用いて乾燥した。ＴＬＣ分析は、ｐ−ニトロフェノールが溶液中に依然として存在することを示した。酢酸エチルを減圧下で除去し、カラムクロマトグラフィー（溶離溶媒：Ｅ／Ｈ，２：１）を行って、精製物質Boc- Gly-Pro-OH（白色固体、４１．２ｇ、８８％）を得た。ＴＬＣ Rf＝０.２５( ＣＭＡ、８５：１５：３)ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H)⁺=273．1H-NMR(360MHz，DMSO -d6，20℃)δ12.55(s，1H，カルボキシル)，6.79(s，NH-major)，6.44(s， NH-minor)，4.50(dd，0.25H，Pro-α-minor)，4.20(dd，0.71H，Pro-α-major) ，3.81-3.62(m，1.7H，Gly-α-major)，3.47-3.33(m，2.5H，Pro-δおよびGly- α-minor)，2.25-2.00(m，1.2H，Pro-β)，1.96-1.60(m，2.7H，Pro-βおよびPr o-γ)，1.36(s，9H，Boc-CH₃)b． Boc-Gly-Pro-Nleu-OEt Boc-Gly-Pro-OH(３．８５ｇ、０．０１４mol)、Nleu-OEtのHCl塩(２．７６ｇ、０．０１４mol）およびＨＯＢｔ（２．８ｇ、０．０２mol）をＤＭＦ１００ml に溶解し、溶液を水水浴上で０℃に冷却した。ＴＥＡ(２．８ml、０．０２mol) を溶液に添加した。溶液を１０分間撹拌後、ＥＤＣ(４．０ｇ、０．０２１mol) を添加した。撹拌を一晩継続した。ＤＭＦを減圧下で除去し、得られた混合物を酢酸エチル２００ml中に注ぎ入れた。有機相をH₂O ２×３０ml、飽和NaHCO₃ ３ ×１０ml、ブライン２×１０ml、飽和NaHSO₄ ３×１５mlそして再度ブラインで、ブライン相のpH値が約７になるまで洗浄した。酢酸エチル溶液をNa₂SO₄を用いて乾燥し、溶媒を減圧下で蒸留して除去した。カラムクロマトグラフィー(溶離溶媒：Ｅ／Ｈ，２：１)を行って、精製物質(帯黄色の油状物、４．７ｇ、８１％ )を得た。ＴＬＣ Rf＝０．５４（展開溶媒：ＣＭＡ，８５：１５：３）およびR f＝０．３４（展開溶媒：Ｅ／Ｈ，２：１） Boc-Gly-Pro-Nleu-OH Boc-Gly-Pro-Nleu-OEt（４．３ｇ、０．０１０４mol）をＴＨＦ／H₂O（v/v，１：１）８０ml中に溶解し、溶液を水氷浴上で０℃に冷却した。ＫＯＨ（１．１ｇ、H₂O ２０ml中に溶解）を、溶液を撹拌しながら添加した。しばらくして、浴を除去し、撹拌を再度１時間継続した。ＴＨＦを減圧下で除去した。水性溶液を酢酸エチル２×５０mlで抽出した。次に、水性相を０℃に冷却し、溶液を同時に激しく撹拌しながら濃HClを添加して酸性にし、pHを約３とした（水性相を酢酸エチル５０mlで覆った）。生成物を酢酸エチル３×５０mlにより水性相から抽出した。有機相をあわせ、Na₂SO₄で乾燥した。酢酸エチルを減圧下で除去した。カラムクロマトグラフィー(Ｅ／Ｈ，５：２)を行って精製物質(白色固体、３．６ｇ、９２％）を得た。ＴＬＣ Rf＝０．４４（展開溶媒：ＣＭＡ，８５：１５：３）．ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H)⁺=386．分析的ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム、単一ピーク、保持時間ＲＴ＝１３分（３０分で２５−６０％Ｂ）．¹H-NMR(500MHz，D MSO-d₆，25℃,TOCSYにより測定）δ12.50(s，1H，カルボキシル)，6.62(m，1H， Gly-NH)，4.92(d，Pro-α)，4.72(d，Pro-α)，4.56(d，Nleu-α)，4.48(d，Pro -α)，4.12(m，Nleu-α)，4.00-3.90(m，Nleu-α)，3.83-3.66(m，Nleu-α，Gly -α)，3.64-3.50(m，Gly-α，Nleu-α)，3.50-3.33(m，Pro-δ)，2.34-1.60(数セットのバンド、Pro-β，Pro-γ，Nleu-γ)，1.38(s，9H，Boc-CH₃)，0.88(dd ，Nleu-δ)，0.75(dd，Nleu-δ)．実施例６トリマービルディングブロックBoc-Gly-Nleu-Pro-OHの合成 Boc-Gly-Nleu-OEt Boc-Gly-OH(４．４ｇ、０．０２５mol)およびNleu-OEt（３．２ｇ、０．０２m ol）をＤＭＦ１００mlに溶解し、溶液を水氷浴上で０℃に冷却した。ＢＯＰ(１１ｇ、０.０２５mol)を溶液に添加した。トリエチルアミンを用いて溶液のpHを約９に調整した。溶液を一晩撹拌した。ＤＭＦを減圧下で除去し、得られた混合物を酢酸エチル３００ml中に注ぎ入れた。酢酸エチル溶液をH₂O、飽和NaHCO₃、ブライン、飽和NaHSO₄そして再度ブラインで洗浄した。有機相をNa₂SO₄で乾燥し、酢酸エチルを減圧下で除去して、粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（溶離溶媒：Ｅ／Ｈ，２：１）を行って、精製物質（５．９ｇ、９４％）を得た。ＴＬＣ Rf＝０．５２（展開溶媒：Ｅ／Ｈ，２：１）．¹H-NMR(360MHz，DMSO- d₆)δ6.74(m，Gly-NH)，6.68(m，Gly-NH)，4.18(s，Nleu-α)，4.12(q，エチルエステル-CH₂)，4.04(q，エチルエステル-CH₂)，3.94(s，Nleu-α)，3.79(d，Gl y-α)，3.65(d，Gly-α)，3.07(m，Nleu-β)，1.79(m，1H，Nleu-γ)，1.34(s， 9H，Boc-CH₃)，1.16(m，エチルエステル-CH₃），0.87(d，Nleu-δ)，0.78(d，Nl eu-δ)． Boc-Gly-Nleu-OH Boc-Gly-Nleu-OEt（２８．８ｇ、０．０９４mol）をH₂O １５０mlおよびＴＨＦ１５０mlの混合物中に溶解した。H₂O ５０ml中に溶解したＫＯＨ（１１．９ｇ、０．１８mol）を、溶液を撹拌しながら添加した。１時間後、ＴＨＦを減圧下で除去した。水性溶液を０℃に冷却し、濃HClを添加して（同時に溶液を激しく撹拌する）酸性にし、pH２とした。生成物を酢酸エチル３×１００mlにより水性相から抽出した。有機相をあわせ、ブラインで洗浄して、Na₂SO₄で乾燥した。酢酸エチルを減圧下で除去し、粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（溶離溶媒：Ｅ／Ｈ，１：１。この溶媒系を用いて不純物を除去し、メタノールおよび酢酸エチルの混合物により精製物質をカラムから洗い出した）を行って、精製物質（白色油状物、２０ｇ、７４％）を得た。ＴＬＣ Rf＝０．２（展開溶媒：Ｅ／Ｈ，３：１）．ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H)⁺=289．¹H-NMR(360MHz，DMSO-d6 )δ6.72(m，Gly-NH)，6.62(m，Gly-NH)，4.03(s，Nleu-α)，3.87(s，Nleu-α) ，3.78(d，Gly-α)，3.68(d，Gly-α)，3.06(m，Nleu-β)，1.82(m，1H，Nleu- γ)，1.32(s，9H，Boc-CH₃)，0.85(d，Nleu-δ)，0.76(d，Nleu-δ)． Boc-Gly-Nleu-Pro-OBz Boc-Gly-Nleu-OH（１２．５ｇ、０．０４３mol）、HCl・-Pro-OBz（１１ｇ、０．０４６mol）およびＨＯＢｔ（６．０ｇ、０．０４５mol）をＤＭＦ３００mlに溶解し、溶液を０℃に冷却した。トリエチルアミン（１２ml）を、溶液を撹拌しながら徐々に添加した。５分後、ＥＤＣ（８．５ｇ、０．０４３mol）を溶液に添加し、撹拌を室温で一晩継続した。ＤＭＦを減圧下で除去し、得られた混合物を酢酸エチル３５０ml中に注ぎ入れた。酢酸エチル溶液を、H₂O、飽和NaHCO₃、ブライン、飽和NaHSO₄そして再度ブラインで、ブライン相のpHが約７になるまで洗浄した。有機相をNa₂SO₄で乾燥し、酢酸エチルを減圧下で除去して、粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（溶離溶媒：Ｅ／Ｈ，３：１）を行って、精製物質（１７．５ｇ、８５％）を得た。ＴＬＣ Rf＝０．４５（展開溶媒：Ｅ／Ｈ，３：１）。 Boc-Gly-Nleu-Pro-OH Boc-Gly-Nleu-Pro-OBz（７．９ｇ、０．０１６６mol）をH²O ５０mlおよびＴＨＦ８０mlの混合物中に溶解した。溶液を０℃に冷却した。H₂O ３０ml中に溶解したＫＯＨ（１．９ｇ、０．０３３mol）を、溶液を撹拌しながら添加した。撹拌を室温で１時間継続した。ＴＨＦを減圧下で除去した。水性溶液を０℃に冷却し、濃ＨＣｌを添加して（同時に溶液を激しく撹拌しながら）酸性にし、約pH＝３とした。生成物を酢酸エチルにより水性溶液から抽出した。あわせた有機相を Na₂SO₄で乾燥し、酢酸エチルを減圧下で除去して、生成物を得た（５．７ｇ、８９％）。ＴＬＣ Rf＝０．３８（展開溶媒：ＣＭＡ，８５：１５：３）．ＦＡＢ −ＭＳ実測値(M+H)⁺=386．¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆，27℃，TOCSYにより測定)δ 6.69(m，Gly-NH)，6.57(m，Gly-NH)，4.56(m，Pro-α)，4.28-4.14(m，Pro-α) ，4.14-3.97(m，Nleu-α)，3.83-3.62(m，Gly-α)，3.62-3.44(m，Gly-α，Pro- δ)，3.44-3.28(m，Pro-δ)，3.12-2.92(m，Nleu-β)，2.23-1.58(m，Pro-β，P ro-γ，Nleu-γ)，1.34(m，Boc-CH₃)，0.85(m，Nleu-δ)，0.78(m，Nleu-δ)．実施例７連続ペプトイド残基含有トリマー：(Gly-Pro-Nleu)_n-NH₂の鎖の合成 Boc-Gly-Pro-Nleu-NH₂ Boc-Gly-Pro-Nleu-OH（４．１ｇ、０．０１０６mol）、NH₄Cl（１．７ｇ、０．０３２mol）およびＨＯＢｔ（１．７６ｇ、０．０１３mol）をＤＭＦ１００ml に溶解し、溶液を０℃に冷却した。ＴＥＡ（４．５ml）を、溶液を撹拌しながら溶液に徐々に添加した。しばらくして、ＥＤＣ（２．６ｇ、０．０１３mol）を溶液に添加した。撹拌を一晩継続した。ＤＭＦを減圧下で除去し、得られた混合物をクロロホルム３５０ml中に注ぎ入れた。クロロホルム溶液をH₂O ２×２０ml 、飽和NaHCO₃ ２×２０ml、ブライン２×２０ml、飽和NaHSO₄ ２×２０mlそして再度ブラインで、ブライン相のpHが約７になるまで洗浄した。有機相をNa₂SO₄を用いて乾燥し、クロロホルムを減圧下で蒸留して生成物（３．５ｇ、８４％）を得た。ＴＬＣ Rf＝０．３６（展開溶媒：ＣＭＡ，８５：１５：３）． Gly-Pro-Nleu-NH₂ Boc-Gly-Pro-Nleu-NH₂（３．５ｇ、０．００８９mol）をＤＣＭ（５０ml）中の３０％ＴＦＡの溶液に溶解した。溶液を４０分間撹拌した。ＤＣＭおよびＴＦＡを減圧下で除去し、ベンゼン３×５０mlを添加して、減圧下で蒸留し、微量ＴＦＡを除去した。得られた混合物をメタノール３０ml中に溶解し、溶液を０℃に冷却した。HCl／ジオキサン（４Ｎ、１０ml）を溶液に添加して、生成物をＴＦＡ塩からHCl塩に移した。エチルエーテル（２００ml）を溶液に添加すると沈殿が生じた。エーテルを濾過して除去し、白色固体生成物を得た（２．９ｇ、８７％）。分析的ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム、単一ピーク、ＲＴ＝１５．７分（３０分で５−１５％Ｂ）。ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H)⁺=285．¹H-NMR(500MHz，DMS O-d6，25℃，TOCSYにより測定)δ8.03(m，3H，Gly-NH₃)，7.65(s,C末端NH₂)，7. 46(s，C末端NH₂)，7.34(s，C末端NH₂)，7.24(d，C末端NH₂)，7.08(s，C末端NH₂) ，6.92(s，C末端NH₂)，4.94(d，Pro-α)，4.76(m，Pro-α)，4.59(m，Pro-α)， 4.25-3.52(数セットのバンド，Nleu-α，Gly-α)，3.52-3.44(m，Pro-α)，3.42 -2.70(数セットのバンド，Gly-α，Nleu-β)，2.36-1.65(数セットのバンド，Pr o-β，Pro-γ，Nleu-γ)，0.90(m，Nleu-δ)，0.79(m，Nleu-δ)． (Gly-Pro-Nleu)₂-NH₂ Boc-Gly-Pro-Nleu-OH（０．３ｇ、０．７６mol）およびGly-Pro-Nleu-NH₂（０．０００７５mol）をＤＭＦ２０mlに溶解し、溶液を０℃に冷却した。ＴＥＡ（０．３ml）を、溶液を撹拌しながら徐々に添加した。１０分後、ＢＯＰ（０．５ｇ、０．００１２mol）を溶液に添加し、撹拌を一晩継続した。ＤＭＦを除去し、得られた混合物をクロロホルム１５０ml中に注ぎ入れた。クロロホルム溶液を H₂O ２×１０ml、飽和NaHCO₃ ２×１０ml、ブライン２×１０ml、飽和NaHSO₄ ２ ×１０mlそして再度ブラインで、ブライン相のpHが約７になるまで洗浄した。有機相をNa₂SO₄を用いて乾燥し、クロロホルムを減圧下で蒸留してBoc-(Gly-Pro-N leu)₂-NH₂を得た。この物質をＤＣＭ（３０ml）中の３０％ＴＦＡの溶液中に溶解し、溶液を室温で３０分間撹拌した。ＤＣＭおよびＴＦＡを減圧下で除去し、ベンゼン３×２０mlを添加して、減圧下で蒸留して微量ＴＦＡを除去した。粗生成物を水に溶解し、ＨＰＬＣを行って精製物質を得た(白色固体、０．２５ｇ、６０％)。ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H)⁺=552．分析的ＨＰＬＣクロマトグラム、単一ピーク、ＲＴ＝９．３分（３０分で１０−３０％Ｂ）。 (Gly-Pro-Nleu)₃-NH₂ 一般情報の項に記載の一般固相合成法を用いて、(Gly-Pro-Nleu)₃ＭＢＨＡ(樹脂置換を基礎にして０．２mmol)を得た。スカベンジャーとしてアニソール(１ml )を用いてＨＦ開裂法により樹脂からペプチド−ペプトイド残基を除去した。ＨＦ開裂を−５℃〜０℃で１時間進行させた。ＨＦ開裂後、生成物と樹脂の混合物を焼結した(sintered)ガラスフィルター上で無水エチルエーテルで数回洗浄し、 H₂OとCH₃CNの混合物で抽出して樹脂から生成物を分離した。凍結乾燥を行って、粗生成物を得て、ＨＰＬＣを行って、精製物質を得た（９０mg、５５％）。ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H)⁺=819．分析的ＨＰＬＣクロマトグラム、単一ピーク、ＲＴ＝１５．８分（３０分で１５−６０％）。 (Gly-Pro-Nleu)_n-NH₂(n=4,5,6,7,9) これらの化合物の合成、精製および特徴付けは、(Gly-Pro-Nleu)₂-NH₂の場合と同様であった。実施例８連続ペプトイド残基含有トリマー鎖：Ac-(Gly-Pro-Nleu)_n-NH₂の合成 Ac-Gly-Pro-Nleu-NHCH₃ Boc-Gly-Pro-Nleu-OH(０．７７ｇ、２mmol)、HClNH₂CH₃(０．２７ｇ、４mmol) およびＨＯＢｔ（０．３５ｇ、２．５mmol）をＤＭＦに溶解し、溶液を水氷浴上で０℃に冷却した。トリエチルアミン（０．７ml）を、溶液を撹拌しながら徐々に添加した。５分後、ＥＤＣ（０．４６ｇ、２．４mmol）を溶液に添加し、撹拌を一晩継続した。ＤＭＦを減圧下で除去し、得られた混合物をクロロホルム１５０ml中に注ぎ入れた。クロロホルム溶液をH₂O、飽和NaHCO₃、ブライン、飽和NaH SO₄そして再度ブラインで、ブライン相のpHが約７になるまで洗浄した。有機相をNa₂SO₄を用いて乾燥し、クロロホルムを減圧下で蒸留してBoc-Gly- Pro-Nleu-NHCH₃を得た。ＴＬＣ Rf＝０．４４（展開溶媒：ＣＭＡ，８５：１５：３）．この生成物を、再度精製および特徴付けせずに次の工程に直接用いた。ＤＣＭ中の３０％ＴＦＡ溶液３０mlを用いてBoc基を除去した。脱保護化を３０分間進行させた。次に、ＤＣＭおよびＴＦＡを減圧下で除去し、ベンゼン３×２０mlを添加し、蒸留して微量ＴＦＡを除去した。 Gly-Pro-Nleu-NHCH₃のＴＦＡ塩を５０mlに溶解し、溶液を０℃に冷却した。トリエチルアミンを徐々に添加してペプチドを中和した。しばらくして、無水酢酸（２ml）を添加し、アセチル化を４０分間進行させた。ＤＣＭを除去し、得られた混合物をクロロホルム１００ ml中に溶解した。クロロホルム溶液をH₂O、飽和NaHCO₃、ブライン、飽和NaHSO₄ そして再度ブラインで、ブライン相のpHが約７になるまで洗浄した。有機相をNa₂ SO₄を用いて乾燥し、クロロホルムを減圧下で蒸留して最終生成物Ac-Gly-Pro-N leu-NHCH₃を得た（０．６ｇ、８８％）。分析的ＨＰＬＣプロフィール、単一ピーク、ＲＴ＝１０．５分（３０分で１０−５０％Ｂ）。ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H )⁺=341．¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆，28℃，TOCSYにより測定)δ8.04(m，C末端NH) ，7.93(m，Gly-NH)，7.71(m，C末端NH)，7.48(m，C末端NH)，4.94(d，Pro-α)， 4.81(m，Pro-α)，4.68(m，Pro-α)，4.50(m，Pro-α)，4.29-3.52(数セットのバンド，Nleu-α，Gly-α)，3.52-3.42(m，Pro-δ)，3.36(m，Pro-δ)，3.29-2. 86(数セットのバンド，Nleu-β)，2.59(m，C末端N-CH₃)，2.53(m，C末端N-CH₃) ，2.31-2.03(数セットのバンド，Pro-β)，1.96(m，Pro-β，Pro-γ)，1.92-1.6 1(m，アセチル-CH₃，Pro-β，Nleu-g，Pro-γ)，0.86(dd，Nleu-δ)，0.75(m，N leu-δ)． Ac-Gly-Pro-Nleu-NH₂ HCl-Gly-Pro-Nleu-NH₂（０．３２ｇ、０．００１mol）をＤＣＭ５mlに溶解し、溶液を０℃に冷却した。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）０．３mlを溶液に徐々に添加した。しばらくして、無水酢酸（０．３ml）を、溶液を撹拌しながら添加した。撹拌を室温で１時間継続した。ＤＣＭを減圧下で除去し、得られた混合物をH₂Oに溶解した。ＲＰ−ＨＰＬＣを行って、精製物質を得た（２１０mg、５９％）。ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H)⁺=327．分析的ＨＰＬＣ、単一ピーク、ＲＴ＝１２．２分(３０分で１０−２０％Ｂ)。¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆ ，TOCSYにより測定）δ7.97(m，1H，Gly-NH)，7.52(m，0.5H，C末端NH₂)，7.22( m，0.5H，C末端NH₂)，7.05-6.80(m，1H，C末端NH₂)，4.94(d，0.11H，Pro-α)， 4.78(，0.16H，Pro-α)，4.69(d，0.41H，Pro-α)，4.51(d，0.32H，Pro-α)，4 .18(d，0.35H，Nleu-α)，4.05-3.60(m，Gly-α，Nleu-α)，3.56-2.90(m，Gly- α，Nleu-β，Pro-δ)，2.60-1.40(m，Pro-γ，Pro-δ，Nleu-γ)，0.87(dd，Nl eu-δメチル)，0.76(dd，Nleu-δメチル)． Ac-(Gly-Pro-Nleu)₆-NH₂ Ac-(Gly-Pro-Nleu)₆-MBHA（０．４５mmol、樹脂置換を基礎にして）を、一般情報の項に記載の固相合成法を用いて得た。ＨＦ開裂後、凍結乾燥を行って粗生成物を得て、ＨＰＬＣを行って精製物質を得た（４７％）。ＦＡＢ−ＭＳ実測値 (M+H)⁺=1663．分析的ＨＰＬＣクロマトグラム、単一ピーク、ＲＴ＝１８．２分（３０分で１５−８０％Ｂ）。 Ac-(Gly-Pro-Nleu)₉-NH₂ 本化合物の合成、精製および特徴付けは、Ac-(Gly-Pro-Nleu)₆−NH₂の場合と同様であった。Gly-Pro-Nleu配列で構成される合成ペプチドペプトイド残基化合物に関する物理化学的データを、下記の表２に示す。 [a]:VydacC-18カラム,0.46x25cm,流速 :1.0ml/分． [b]:固相法によって調製した化合物については、収率は樹脂置換とＨＰＬＣ精製で得た物質とを基に計算した。 [c]:溶液ペプチド合成法により調製。コラーゲン様ポリ（ペプチド−ペプトイド残基）構造物のトリプルヘリックス傾向を確定するための参考として、Gly-Pro-HypおよびGly-Pro-Pro配列からなるポリペプチドを調製した。以下のポリペプチドの調製： (Ala-Sar-Gly)_n(Ala-NpHe-Gly)_n (Gly-Sar-Ala)_n(Glu-Sar-Gly)_n (Gly-Pro-Sar)_n(Lys-Sar-Gly)_n が、Goodman,M.et al.(1994)Polymer Preprint 35(1):767-768により報告されている。質量スペクトルおよびＮＭＲを用いて構造を立証した。収率は、樹脂置換およびＨＰＬＣ精製後に得られた物質を基礎にして算出された。実施例９テンプレートスペーサーKTA-(Gly-OH)₃の合成 KTA-(Gly-OBz)₃ ケンプトリ酸（KTA）（０．１ｇ、０．００３９mol）、TOS-Gly-OBz（６．５ｇ、０．０１９mol）およびＨＯＢｔ（２．６ｇ、０．０１９mol）をＤＭＦ５０ mlに溶解した。溶液を０℃に冷却し、ＴＥＡ（５ml、０．０３６mol）を徐々に添加した。溶液を５分間撹拌後、ＥＤＣ（３．７ｇ、０．０１９mol）を添加した。反応は室温で４時間継続した。ＤＭＦを減圧下で蒸留し、残留混合物を酢酸エチル３００ml中に注ぎ入れた。酢酸エチル溶液を一般的手法（H₂O、飽和NaHCO₃ 、ブライン、飽和NaHSO₄そして再度ブラインで、中性になるまで）で洗浄し、N a₂SO₄を用いて乾燥した。溶媒を除去して粗生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（溶離溶媒：酢酸エチル／ヘキサン，Ｅ／Ｈ，３：２）を行って、KTA-(G ly-OBz)₃（白色油状物、２．６５ｇ、９７．８％）を得た。ＴＬＣ Rf＝０．５５（Ｅ／Ｈ，３：１）． KTA-(Gly-OH)₃ KTA-(Gly-OBz)₃（２．６５ｇ、０．００３８mol）をメタノール２００mlに溶解した。溶液中に１０分間Ｎ₂を発泡させて溶解した空気を除去後、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．２ｇ）を添加した。水素を溶液中に通して、水素の消費が停止するまで水素添加を継続した。濾過して触媒を除去し、溶媒メタノールを減圧下で除去して、精製物質を得た（白色固体、１．５５ｇ、収率９７％）。ＴＬＣ Rf＝０．０５（ＣＭＡ，８５：１５：３）。分析的ＨＰＬＣプロフィールは単一均質ピークを示し、ＲＴ＝１４分（溶離媒質中０．１％ＴＦＡ、３０分で１０−３０％Ｂ）であった。ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H)⁺=430．¹H-NMR(360MHz，DMSO-d₆，20 ℃)δ7.93(s，3H，NH)，3.64(s，6H，Gly-α)，2.54(d，3H，CH₂- エクアトリアル結合)，1.24-1.18(m，12H，CH₃に関しては9H，CH₂アキシアル結合に関しては3H)．実施例１０テンプレートスペーサーKTA-(Aha-OH)₃の合成６−アミノヘキサン酸ベンジルエステルAha-OBz ６−アミノヘキサン酸（Aha-OH）（１３．１ｇ、０．１mol）、ベンジルアルコール（１００mL）、ベンゼン（１００mL）およびトリルスルホン酸（１９ｇ、０．１mol）を混合し、混合物をディーン−スターク(Dean Stark)装置を用いて３時間還流した。得られた混合物を室温に冷却し、エチルエーテル５００mLを添加した。濾過して沈殿物を収集し、エチルエーテルで洗浄して、真空中で一晩乾燥し、白色生成物Tos-Aha-OBz（４０．５ｇ、９８％）を得た。 KTA-(Aha-OBz)₃ ケンプトリ酸（１．０ｇ、０．００３８７mol）、Tos-Aha-OBz（８．０ｇ、０．０１９４mol）およびＨＯＢｔ(２．６ｇ、０．０１９４mol)をＤＭＦ(５０mL) に溶解し、溶液を０℃に冷却した。ＴＥＡ（５mL）を一部ずつ溶液に添加した。溶液を１０分間撹拌後、ＥＤＣ（３．７ｇ、０．０１９４mol）を添加し、溶液を室温で一晩撹拌した。ＤＭＦを減圧下で除去し、得られた混合物を酢酸エチル２００mL中に注ぎ入れた。酢酸エチル溶液をH₂O（２×３０mL）、飽和NaHCO₃（３×１５mL）、ブライン（２×１０mL）、飽和NaHSO₄(３×１５mL）そして再度ブラインで、ブライン相のpHが約７になるまで洗浄した。有機相を無水Na₂SO₄で乾燥し、酢酸エチルを減圧下で蒸留して除去した。カラムクロマトグラフィー（溶離溶媒：Ｅ／Ｈ，３：１）を行って、精製物質（白色固体、３．４ｇ、８９％）を得た。ＴＬＣ Rf＝０．５６(展開溶媒：Ｅ／Ｈ，３：１).¹H-NMR(360MHz， DMSO-d₆，20℃)δ7.84(m，3H，NH)，7.52(m，15H，フェニル)，5.26(s，6H，ベンジルCH2)，3.12(m，6H，CH₂)，2.77(d，3H，エクアトリアル結合KTA-CH₂)，2. 49(t，6H，α-CH₂)，1.70(m，6H，δ-CH₂)，1.53(m，6H，β-CH₂)，1.42(b，6H ，γ-CH₂),1.29(m，12H，KTA-CH₃およびアキシアルKTA-CH₃)． KTA-(Aha-OH)₃ KTA-(Aha-OBz)₃（３．０ｇ、０．００３５mol）をメタノール（１００mL）に溶解した。Ｐｄ／Ｃ（１０％、約０．３ｇ）を溶液に注意深く添加した。溶液を室温で一晩H₂下に置いた。濾過してＰｄ／Ｃを除去し、メタノールを減圧下で除去した。白色固体を得た（２．０ｇ、９６％）。ＴＬＣ Rf＝０．２７（展開溶媒：ＣＭＡ，８５：１５：３）。ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H)⁺=599．分析的ＲＰ− ＨＰＬＣ、均質単一ピーク、ＲＴ＝１５分（３０分で２５−５０％Ｂ）。¹H-NMR (360MHz，DMSO-d₆，20℃)δ12.0(s，3H，カルボキシル)，7.63(m，3H，NH)，2.9 3(m，6H，CH₂)，2.57(d，3H，エクアトリアルKTA-CH₂)，2.16(t，6H，α-CH₂)， 1.47(m，6H，δ-CH₂)，1.34(m，6H，β-CH₂)，1.24(m，6H，γ-CH₂)，1.10(m，1 2H，KTA-CH₃およびアキシアルKTA-CH₂)．実施例１１ TMAテンプレートスペーサーの合成 TMA-(Gly-OBz)₃ Tos-Gly-OBz（８．４ｇ、０．０２５mol）をＤＣＭ（１５０mL）に溶解し、溶液を０℃に冷却した。ＴＥＡ（５mL）を徐々に添加した。１０分後、塩化トリメシン酸（１．４ｇ、０．００５mol）を添加し、溶液を室温で５時間撹拌した。ＤＣＭを減圧下で除去し、得られた混合物を酢酸エチル３００mL中に注ぎ入れた。酢酸エチル溶液をH₂O（２×３０mL）、飽和NaHCO₃（３×１５mL）、ブライン（２×１０mL）、飽和NaHSO₄（３×１５mL）そして再度ブラインで、ブライン相のpHが約７になるまで洗浄した。有機相を無水Na₂SO₄で乾燥し、酢酸エチルを減圧下で蒸留して除去した。白色固体を得た(２．４ｇ、７４％)。ＴＬＣ Rf＝０．５４（展開溶媒：Ｅ／Ｈ，３：１）．¹H-NMR(360MHz，DMSO-d₆，20℃)δ9.18( m，3H，NH)，8.43(s，3H，ベンゼン)，7.18(m，15H，フェニル)，5.11(s，6H，ベンジル)，4.05(m，6H，グリシンα-CH₂)． TMA-(Gly-OH)₃ TMA-(Gly-OBz)₃（２．４ｇ、０．００３５mol）をメタノール（１５０mL）中の１０％ＤＭＦの溶液に溶解した。Ｐｄ／Ｃ（１０％、約０．３ｇ）を溶液に添加し、溶液をH₂下に置いた。３時間後、濾過してＰｄ／Ｃを除去し、溶媒を減圧下で除去した。エーテル（５０mL）を添加し、沈殿物を濾過により収集した。白色固体生成物を得た(１．４ｇ、１００％)。ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H+NH₃)⁺=399 ．¹H-NMR(360MHz，DMSO-d₆，20℃)δ12.57(s，3H，カルボキシル)，9.00(m，3H ，NH)，8.43(s，3H，ベンゼン)，3.91(m，6H，グリシンα-CH₂)．実施例１２ KTAテンプレート集合コラーゲン様構造物の合成 KTA-[Gly-Gly-Pro-Nleu-NH₂]₃ KTA-(Gly-OH)₃(０．１１ｇ、０．２５mmol)、HCl-Gly-Pro-Nleu-NH₂(０．４ｇ、１．２５mmol）およびＨＯＢｔ（０．１４ｇ、１．０mmol）をＤＭＦ（５mL）に溶解し、溶液を０℃に冷却した。ＴＥＡ（０．２mL）を徐々に添加した。１０分後、ＥＤＣ（０．１９ｇ、１．０mmol）を添加し、室温で一晩撹拌を継続した。ＤＭＦを減圧下で除去し、得られた混合物を水に溶解した。カットオフが１，０００ダルトンのメンブレンチューブで透析を１日行って、低分子量不純物を除去した。凍結乾燥後に粗生成物を得て、ＨＰＬＣを行って精製物質を得た（０．２５ｇ、８０％）。ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H)⁺=1229．分析的ＨＰＬＣクロマトグラム、均質単一ピーク、ＲＴ＝１８．７分（２５分で３０−７０％Ｂ）。¹H-N MR(500MHz，DMSO，23℃，2-D TOCSYにより測定）δ8.22(m，3H，スペーサーGly- NH)，7.85-7.70(m，2セット，3H，Gly-NH)，7.60-6.85(4セット，6H，C末端NH₂) ，4.95-4.45(4セット，3H,Pro-α)，4.22(d,1H，Nleu-α)，4.10-3.70(m，Gly- α，Nleu-α)，3.70-3.30(m，ウォーターシグナルによる，スペーサーGly-α，G ly-α， Pro-δ，Nleu-α)，3.28-2.81(数セットのバンド，Nleu-β)，2.64(d， 3H，エクアトリアルKTA-CH₂)，2.36-1.60(数セットのバンド，Pro-β，Pro-γ， Nleu-γ)，1.14(s，9H，KTA-CH₃)，1.07(d，3H，アキシアルKTA-CH₂)，0.88(dd ，Nleu-δ)，0.78(dd，Nleu-δ)． KTA-[Gly-(Gly-Pro-Nleu)₃-NH₂]₃ 一般情報の項に記載された一般固相合成法を用いて得た(Gly-Pro-Nleu)₃-ＭＢＨＡ（樹脂置換レベルを基礎にして０．４５mmol）を固相反応器中に入れた。KT A-(Gly-OH)₃（５８ｍｇ、０．１３５mmol）を容器に添加し、カップリング試薬としてＤＩＣおよびＨＯＢｔ、そして溶媒としてＤＭＦ／ＤＣＭ（v/v，１：４）を用いてカップリング反応を開始した。１日後に再度ＤＩＣを添加して、カップリング反応を２日間進行させ、この時点まででカイザー試験は遊離アミンをもはや示さなかった。ＨＦ開裂後、粗生成物２５５mgを得た。ＨＰＬＣを行って、精製物質（６５mg、６％）を得た。ＭＡＬＤＩＭＳ実測値(M+Na)⁺=2852．分析的ＨＰＬＣクロマトグラム、均質単一ピーク、ＲＴ＝１５．２５分（３０分で３０％−９０％Ｂ）。 KTA-[Gly-(Gly-Pro-Nleu)₆-NH₂]₃ 固相法：一般情報の項に記載された一般固相合成法を用いて、(Gly-Pro-Nleu)₆ -ＭＢＨＡ(樹脂置換レベルを基礎にして０．３mmol)を得た。KTA-(Gly-OH)₃(３０mg、０．０７mmol）を、カップリング試薬としてＤＩＣおよびＨＯＢｔ、そして溶媒としてＤＭＦ／ＤＣＭ（v/v，１：１）を用いて、ペプチド−ペプトイド残基鎖のＮ末端とカップリングさせた。カップリングを２回行って、完全な官能化を保証した。最初のカップリングでは、テンプレート０．０３５mmolを用いて、カップリングを１日間進行させた。溶液を濾過して反応容器から取り出し、樹脂をＤＣＭ（３×２０mL）で洗浄した。別の０．０３５mmolのテンプレートを第二のカップリングに用いて、２日間進行させた。第二カップリングでは１日後に、再度ＤＩＣを添加した。３日間の２回のカップリング後には、カイザー試験は遊離アミンをもはや示さなかった。ＨＦ開裂法を用いてペプチド−ペプトイド残基を樹脂から除去した。凍結乾燥して、粗生成物(２４５mg)を得、ＨＰＬＣを行って、精製物質（１４％）を得た。溶液法：一般情報の項に記載された一般固相合成法を用いて得られた(Gly-Pro -Nleu)₆-NH₂（１６６mg、０．１mmol)とKTA-(Gly-OH)₃（１４．５mg、０．０３３mmol）をＤＭＦ（２mL）に溶解した。溶液を０℃に冷却し、ＴＥＡ（０．０３mL）を、溶液を撹拌しながら添加した。５分後、ＢＯＰ（７５mg、０．１７mmol）を溶液に添加し、カップリング反応を室温で１８時間進行させた。溶媒を減圧下で除去し、得られた混合物をH₂O（２５mL）に溶解した。水性溶液をカットオフ３，５００ダルトンのメンブレンチューブ中で水に対して１０時間透析して、低分子量不純物を除去した。凍結乾燥して粗生成物を得、ＨＰＬＣを行って、精製物質(３５ｍｇ，２１％)を得た。ＥＳＩＭＳ実測値(M+H)⁺=5238 ．分析的ＨＰＬＣクロマトグラム、単一ピーク、ＲＴ＝１３．４分(３０分で３５％−９０％Ｂ)。 KTA-[Gly-(Gly-Pro-Nleu)₉-NH₂]₃ 一般情報の項に記載された一般固相合成法を用いて得られた(Gly-Pro-Nleu)₉- NH₂（４００mg、０．１６４mmol）とKTA-(Gly-OH)₃(２３．５mg、０．０５５mmo l)およびＨＯＢｔ（２２mg、０．１６４mmol）をＤＭＦ（３mL）に溶解した。溶液を−５０℃に冷却し、ＴＥＡ（０．０２mL）を添加した。５分後、ＥＤＣ（３８mg、０．２mmol）を添加し、溶液を−５０〜−２０℃で２時間撹拌した。ドライアイス−イソプロパノール浴を除去し、溶液を室温で一晩撹拌した。溶液を０ ℃に冷却し、ＢＯＰ（５０mg、０．１１mmol）を添加した。ＴＥＡを添加して溶液のpHを約９に調整した。溶液を室温で再度３日間撹拌した。ＤＭＦを減圧下で除去し、得られた混合物をアセトニトリルと水の混合物に溶解し、カットオフ３，５００ダルトンのメンブレンチューブ中で水に対して３日間透析した。凍結乾燥して粗生成物（３３０mg）を得、ＨＰＬＣを行って、精製物質（４３mg、１０％）を得た。ＥＳＩＭＳ実測値(M+H)⁺=7645．分析的ＨＰＬＣクロマトグラム、単一ピーク、ＲＴ＝１４．２分（３０分で５０％−９０％Ｂ）。 KTA-[Aha-(Gly-Pro-Nleu)₆-NH₂]₃ 一般情報の項に記載された一般固相合成法を用いて、(Gly-Pro-Nleu)₆-ＭＢＨＡ（樹脂置換レベルを基礎にして０．４５mmol）を得た。KTA-(Aha-OH)₃（６５m g、０．１０８６mmol）を、KTA-[Gly-(Gly-Pro-Nleu)₆-NH₂]₃の合成に関して記載されたように、ペプチド−ペプトイド残基鎖のＮ末端にカップリングさせた。ＨＦ開裂後、凍結乾燥により粗生成物（２００mg）を得、ＨＰＬＣを行って、精製物質（５３mg、９％）を得た。ＥＳＩＭＳ実測値(M+H)⁺=5407．分析的ＨＰＬＣクロマトグラム、単一ピーク、ＲＴ＝１３．９分（３０分で３５％ −９０％Ｂ）。 KTA-[Gly-(Gly-Nleu-Pro)₃-NH₂]₃ 一般情報の項に記載された一般固相合成法を用いて、(Gly-Nleu-Pro)₃-ＭＢＨＡ（樹脂置換レベルを基礎にして０．３５mmol）を得た。テンプレートKTA-(Gly -OH)₃（４５mg、０．１０５mmol）を、カップリング試薬としてＤＩＣおよびＨＯＢｔ、そして溶媒としてＤＭＦ／ＤＣＭ（v/v，１：４）を用いて、ペプチド −ペプトイド鎖のＮ末端とカップリングさせた。カップリング反応を１日間進行させ、カイザー試験はペプチド−ペプトイド遊離アミンの完全消費を示した。一般情報の項に記載のＨＦ開裂法および処理操作を用いて、粗生成物を得て、ＨＰＬＣを行って、精製物質（２０mg、６％）を得た。分析的ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム、単一ピーク、ＲＴ＝１６．１分（３０分で２５−７０％Ｂ）、ＭＡＬＤＩＭＳ実測値(M+Na)⁺=2855． KTA-[Gly-(Gly-Nleu-PrO)₆-NH₂]₃ 一般情報の項に記載された一般固相合成法を用いて、(Gly-Nleu-Pro)₆-ＭＢＨＡ（樹脂置換を基礎にして０．５mmol）を得た。テンプレートKTA-(Gly-OH)₃(計５６mg、０．１３１mmol）を、カップリング試薬としてＤＩＣおよびＨＯＢｔ、そして溶媒としてＤＭＦ／ＤＣＭ（v/v，１：４）を用いて、２回の連続カップリングにより、ペプチド−ペプトイド鎖のＮ末端とカップリングさせた。最初のカップリングに関しては、KTA-(Gly-OH)₃３６mg(０．０８４mmol)を用いた。カップリングを１日間進行させた。混合物を濾過し、さらに２０mg（０．０４７mm ol）のKTA-(Gly-OH)₃を第二カップリングに用いた（カップリング試薬ＤＩＣとＨＯＢｔを用いて）。この第二カップリングも１日間進行させた。テンプレート集合ペプチド−ペプトイド物質をＨＦ開裂法により樹脂から除去し、カットオフ３，５００ダルトンのメンブレンチューブ中で水に対して３日間透析した。ＨＰＬＣを行って、精製物質（３０mg、４．４％）を得た。テンプレートに付着した２つの鎖を有する生成物も得た。ＭＡＬＤＩＭＳ実測値(M+Na)⁺=52 59．分析的ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム、ＲＴ＝１４．３分（３０分で３５− ７０％Ｂ）．実施例１３ TMAテンプレート集合コラーゲン様構造物の合成 TMA[Gly-Gly-Pro-Nler-NH₂]₃ TMA-(Gly-OH)₃(０．１ｇ、０．２５mmol)、HCl(Gly-Pro-Nleu-NH₂(０．２６ｇ、０．８５mmol)およびＨＯＢｔ（０．１４ｇ、１．０mmol）をＤＭＦ（３mL）に溶解し、溶液を０℃に冷却した。ＴＥＡ（０．２mL）を、溶液を撹拌しながら徐々に添加した。１０分後、ＥＤＣ（０．１９ｇ、１．０mmol）を添加し、室温で一晩撹拌を継続した。ＤＭＦを減圧下で除去し、得られた混合物を水に溶解した。カットオフ１，０００ダルトンのメンブレンチューブで透析を９時間行って、低分子量不純物を除去した。凍結乾燥して粗生成物（０．２９ｇ）を得て、ＨＰＬＣを行って精製物質を得た（１１３mg、３８％）。ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+N a)⁺=1203．分析的ＨＰＬＣクロマトグラム、単一ピーク、ＲＴ＝１５．９分（３０分で３０−７０％Ｂ）。¹HNMR(500MHz，DMSO，23℃，2-D TOCSYにより測定） δ8.94(m，3H，テンプレートスペーサーGly-NH)，8.48(s，3H，ベンゼン)，8.05 (m，3H，Gly-NH)，7.60-6.80(4セットのシグナル，6H，C末端NH₂)，4.95-4.50(4 セットのシグナル，3H，Pro-α)，4.20(d，1H，Nleu-α)，4.10-3.70(m，16H，スペーサーGly-α，Gly-α，Nleu-α)，3.63(d，2H，Nleu-α)，3.55-2.85(m，G ly-α，Pro-δ，Nleu-β)，2.40-1.60(m，Pro-δ，Pro-γ，Nleu-γ)，0.88(dd ，Nleu-δ)，0.76(dd，Nleu-δ)． TMA-[Gly-(Gly-Pro-Nleu)₆-NH₂]₃ 一般情報の項に記載された一般固相合成法を用いて、(Gly-Pro-Nleu)₆-ＭＢＨＡ（樹脂置換を基礎にして０．３mmol）を得た。テンプレート TMA-(Gly-OH)₃を、カップリング試薬としてＤＩＣおよびＨＯＢｔ、そして溶媒としてＤＭＦ／ＤＣＭ（v/v，１：１）を用いて、Ｎ末端とカップリングさせた。標的３本鎖物質の高収率を保証するため、カップリングを２回行った（一般情報の項参照）。最初のカップリングでは、TMA-(Gly-OH)₃０．０３５mmolを用いた。１日後、溶液を濾過し、樹脂をＤＣＭ（３×２０mL）で洗浄した。陽性カイザー試験結果が観察され、別の０．０３５mmolのTMA-(Gly-OH)₃を第二のカップリングに用いた。カップリングを２４時間継続し、この時点でカイザー試験は遊離アミンがそれ以上存在しないことを示した。したがって、計０．０７mmolのテンプレートを用いて、０．３mmolの(Gly-Pro-Nleu)₆-ＭＢＨＡとカップリングさせた。ペプチド−ペプトイドをＨＦ開裂法により樹脂から除去し、ＨＰＬＣを行って、精製物質（３５mg、１０％）を得た。ＥＳＩＭＳ実測値(M+H)⁺=5190．分析的ＨＰＬＣクロマトグラム、単一ピーク、ＲＴ＝１５．９分(３０分で４０％−９５％Ｂ)。 TMA-[(Gly-Pro-Nleu)₉-NH₂]₃ 一般情報の項に記載された一般固相合成法を用いて得られた(Gly-Pro-Nleu)₉- NH₂(７４mg、０．０３mmol)をＤＣＭ（２mL）に溶解し、溶液を０℃に冷却した。塩化トリメシン酸（２．７mg、０．０１mmol）を添加し、５分後、トリエチルアミン（０．１mL）を溶液に添加し、反応液を室温で一晩撹拌した。ＤＣＭを減圧下で除去し、得られた混合物をH₂OとCH₃CNの混合物中に溶解した。この溶液をカットオフ３，５００ダルトンのメンブレンチューブ中で水に対して３日間透析した。浴水を４〜８時間毎に取り換えた。凍結乾燥して粗生成物（６５mg）を得、ＨＰＬＣを行って、精製物質（１５mg、２０％）を得た。ＥＳＩＭＳ実測値 (M+H)⁺=7424．分析的ＨＰＬＣクロマトグラフィー、ＲＴ＝１８分（３０分で３５％−９０％Ｂ）。生成物をＨＰＬＣで精製後、それらの純度を分析的ＨＰＬＣプロフィールにより確認した。質量スペクトルを用いて構造を確認した。収率は、樹脂置換レベルおよびＨＰＬＣ精製後に得られた精製物質を基礎にして算出した。上記の２つの合成経路の一方または両方を用いて、以下の化合物を合成した： KTA-[Gly-(Gly-Pro-Nleu)_n-NH₂]₃(n=1,3,6,9) KTA-[Gly-(Gly-Nleu-Pro)_n-NH₂]₃(n=1,3,6,9) KTA-[Aha-(Gly-Pro-Nleu)₆-NH₂]₃(Ahaは6-アミノヘキサン酸残基を表す） KTA-[Gly-(Gly-Pro-Hyp)_n-NH₂]₃(n=1,3,5,6) TMA-[Gly-(Gly-Pro-Nleu)_n-NH₂]₃(n=1,6) （ここで、テンプレートと結合したGlyおよびAha残基は、ペプチド−ペプトイドビルディングブロックが結合するスペーサーを示す）。合成テンプレート集合化合物に関する物理化学的データを、以下の表３に示す。 ^*:VydacC-18カラム,0.46x25cm,流速 :1.0mL/分 [a]:溶液法により調製。 [b]:固相法により調製。実施例１４ Gly-Nleu-Pro配列からなるペプチド−ペプトイド残基鎖の合成 Gly-Nleu-Pro-NH₂ Boc-Gly-Nleu-Pro-OH(１．１ｇ、２．８５mmol)、NH₄Cl(０．５ｇ、８．６mmo l)およびＨＯＢｔ（０．５ｇ、３．７mmol）をＤＭＦに溶解し、溶液を水氷浴上で０℃に冷却した。トリエチルアミン（１．４ml）を、溶液を撹拌しながら溶液に徐々に添加した。１０分後、ＥＤＣ（０．７３ｇ、３．７mmol）を溶液に添加し、撹拌を一晩継続した。ＤＭＦを減圧下で除去し、得られた混合物を酢酸エチル３００ml中に注ぎ入れた。酢酸エチル溶液をH₂O ２×１０ml、飽和NaHCO₃ ２× １０ml、ブライン２×１０ml、飽和NaHSO₄ ２×１０mlそして再度ブラインで、ブライン相のpHが約７になるまで洗浄した。有機相をNa₂SO₄を用いて乾燥し、酢酸エチルを減圧下で蒸留して生成物Boc-Gly-Nleu-Pro-NH₂を得た。この生成物の Boc基をＤＣＭ中の３０％ＴＦＡの溶液３０ml中に取り出した。脱保護反応を４０分間進行させた。ＤＣＭおよびＴＦＡを減圧下で除去し、ベンゼン３×２０ml を添加して、蒸留して、微量ＴＦＡを除去した。生成物であるGly-Nleu-Pro-NH₂ のＴＦＡ塩をエチルエーテル１００ml中に溶解し、溶液を０℃に冷却した。HCl ／ジオキサン（４N）を、沈殿が認められなくなるまで溶液に添加した。エーテルを濾過により除去して、本生成物を得た（白色固体、０．６５ｇ、６９％）。分析的ＨＰＬＣプロフィール、単一ピーク、ＲＴ＝１０．５分（３０分で８−４０％Ｂ）．ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H)⁺=285．¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆，27℃，TO CSYにより測定）δ8.15(s，3H，NH₃+)，7.70(s，C末端NH₂)，7.58(s，C末端NH₂) ，7.38(s，C末端NH₂)，7.26(s，C末端NH₂)，7.23(s，C末端NH₂)，6.92(m，C末端 NH₂)，4.38(m，Pro-α)，4.30(s，Nleu-α)，4.26(s，Nleu-α)，4.22-4.13(m， Nleu-α，Pro-α)，4.10(s，Nleu-α)，4.07(s，Nleu-α)，3.81(m，Gly-α)，3 .73-3.63(m，Nleu-α，Gly-α)，3.61-3.55(m，Gly-α，Pro-δ)，3.43(m，Pro- δ)，3.17-2.97(m，2H，Nleu-β)，2.23-1.62(m，5H，Nleu-γ，Pro-β，Pro-γ )，0.83(m，6H，Nleu-δのメチル)． (Gly-Nleu-Pro)₉-NH₂ 一般情報の項に記載の一般固相合成法を用いて、(Gly-Nleu-Pro)₉-ＭＢＨＡ( 樹脂置換を基礎にして０．２mmol)を得た。スカベンジャーとしてアニソールを用いてＨＦ開裂法により樹脂からペプチド−ペプトイドを除去した。ＨＦ開裂を −５℃〜０℃で１時間進行させた。ＨＦ開裂後、本生成物と樹脂の混合物を焼結したガラスフィルターで無水エチルエーテルで数回洗浄し、H₂OとCH₃CNの混合物で抽出して樹脂から生成物を分離した。凍結乾燥により、粗生成物を得て、ＨＰＬＣを行って、精製物質を得た（９０mg、５５％）。ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H )⁺=2422．分析的ＨＰＬＣクロマトグラム、単一ピーク、ＲＴ＝１５．８分（３０分で１５−６０％Ｂ）。 Ac-(Gly-Nleu-Pro)₃-NH₂ 一般情報の項に記載された一般固相合成法を用いて、Boc-(Gly-Pro-Nleu)₃-ＭＢＨＡ（０．３５mmol、樹脂置換を基礎にして）を得た。ＤＣＭ中３０％ＴＦＡの溶液を用いて、Boc基を除去した。脱保護を３０分間進行させた。５％ＴＥＡを含有するＤＣＭ中の無水酢酸（２ml）を用いて、Ｎ末端をアセチル化した。アセチル化反応は３０分間を要した。ＨＦ開裂後、凍結乾燥して粗生成物を得て、ＨＰＬＣを行って精製物質を得た（４７％）。ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H)⁺=861．分析的ＨＰＬＣクロマトグラム、単一ピーク、ＲＴ＝１５．１分（３０分で１５ −６０％Ｂ）． Ac-Gly-Nleu-Pro-NHCH₃ 本化合物の調製のために、 Ac-Gly-Pro-Nleu-NHCH₃の場合と同様の合成経路を用いた。Boc-Gly-Nleu-Pro-OH（１．２ｇ、０．３１mmol）を出発物質として用いた。最終生成物Ac-Gly-Nleu-Pro-NHCH₃（１．１ｇ、９１％）は、Ｃ末端アミド化、Ｎ末端脱保護化およびアセチル化後に得られた。分析的ＨＰＬＣプロフィール、単一ピーク、ＲＴ＝１２．２分（３０分で７−７０％Ｂ）．ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H)⁺=341．¹H-NMR(360MHz，DMSO-d₆，27℃)δ8.05(d，C末端NH)，7.98( d，C末端NH)，7.90(m，Gly-NH)，7.70(d，C末端NH)，7.61(d，C末端NH)，4.35(m ，Pro-α)，4.22-4.15(m，Pro-α，Nle-α)，4.13(s，Nleu-α)，4.12(s，Nleu- α)，4.10(s，Nleu-α)，4.08(s，Nleu-α)，4.01-3.86(m，Gly-α，Nleu-α)， 3.83(d，Gly-α)，3.80(d，Gly-α)，3.74(m，Gly-α)，3.69(d，Gly-α)，3.66 (m，Gly-α)，3.62(s，Nleu-α)，3.60-3.30(m，ウォーターシグナルによる、Pr o-α)，3.15-2.83(m，Nleu-β)，2.61-2.50(m，C末端NCH₃)，2.20-1.65(m，Nleu -γ，Pro-β，Pro-γ)，1.82(s，アセチルCH₃)，0.85(m，Nleu-δ)，0.77(m，Nl eu-δ)．一般情報の項に記載された一般固相合成法を用いて、Boc-(Gly-Pro-Nleu)₃-ＭＢＨＡ（０．３５mmol、樹脂置換を基礎にして）を得た。ＤＣＭ中３０％ＴＦＡの溶液を用いて、Boc基を除去した。脱保護を３０分間進行させた。５％ＴＥＡを含有するＤＣＭ中の無水酢酸（２ml）を用いて、Ｎ末端をアセチル化した。アセチル化反応は３０分間を要した。ＨＦ開裂後、凍結乾燥して粗生成物を得て、ＨＰＬＣを行って精製物質を得た（４７％）。ＦＡＢ−ＭＳ実測値(M+H)⁺=861．分析的ＨＰＬＣクロマトグラム、単一ピーク、ＲＴ＝１５．１分（３０分で１５− ６０％Ｂ）． Ac-(Gly-Nleu-Pro)₆NH₂およびAc-(Gly-Nleu-Pro)₁₀NH₂ これら２つの化合物の合成、精製および特徴付けは、Ac-(Gly-Nleu-Pro)₃NH₂ の場合と同様であった。 [a]:VydacC-18カラム,0.46x25cm,流速 :1.0ml/分 [b]:固相法によって調製した化合物については、収率は樹脂置換とＨＰＬＣ精製で得た物質とを基に計算した。 [c]:溶液ペプチド合成法により調製。ペプトイド含有コラーゲン様構造物に関する明らかな利点は、これらのアナログがこれらの化合物の生物学的安定性を増強する非天然残基（ペプトイド残基）を含有することである。ペプチド−ペプトイドコラーゲン様構造物は、新しいクラスの新規なコラーゲン様生体物質を意味する。開示された本発明には種々の修正、改良および用途があり、それらは当業者には明らかであって、本出願はこのような実施態様を網羅する。本発明をある好ましい実施態様で説明してきたが、開示の全範囲は、以下の請求の範囲を参照することによってのみ判断し得るものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者トゥレーン，ヨセフ・ピーアメリカ合衆国、カリフォルニア 92129、サン・ディエゴ、スティムソン・コート 8939 (72)発明者フェン，ヤンボーアメリカ合衆国、カリフォルニア 92037、ラ・ホヤ、ミラマー・ストリート 4099− ビー (72)発明者メラシーニ，ジュセッペアメリカ合衆国、カリフォルニア 92037、ラ・ホヤ、ヴィア・アリカンテ 3131−ジェー

Claims

【特許請求の範囲】１．アミノ酸残基の少なくとも約３０％がグリシンであり、アミノ酸残基の少なくとも約１０％がプロリンまたはヒドロキシプロリンである、反復するアミノ酸トリマーの鎖を含む合成コラーゲン様物質において、該アミノ酸鎖における、少なくとも１部での、ペプトイド残基の取り込みおよび該鎖からのペプトイド残基含有トリプルヘリックスの形成を含む改良。２．該アミノ酸鎖において少なくとも１０％のペプトイド残基を含む、請求項１記載の合成コラーゲン様物質。３． Gly-Xp-Pro； Gly-Pro-Yp； Gly-Pro-Hyp；および Gly-Pro-Pro；またはこれらの組合わせ、からなる群から選択される少なくとも３つのトリペプチドまたはジペプチド−ペプトイド残基トリマーの少なくとも１つのポリペプチド鎖を含んでいる合成コラーゲン物質であって、ここで、XpおよびYpは、ペプトイド残基であり、該コラーゲンがらせん二次構造およびトリプルヘリックスコンホメーションを含む三次構造を有している３つのポリペプチド鎖で並んでいる、物質。４．Gly-Xp-ProおよびGly-Pro-Yp；またはそれらの組合わせからなる群から選択される反復するペプチド−ペプトイド残基トリマーの少なくとも１つの鎖を含んでいる請求項３記載の合成コラーゲン物質。５．反復するペプチド−ペプトイド残基トリマーのペプトイド残基がＮ−置換グリシンである請求項４記載の合成コラーゲン物質。６．該ペプトイド残基が、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、リシン、フェニルアラニンおよびアスパラギン酸のＮ−置換ペプトイド同質異性からなる群から選択される、請求項５記載の合成コラーゲン物質。７．該ペプトイドが、Ｎ−イソブチルグリシン(Nleu)、Ｎ−メチルグリシン(Sar )；Ｎ−イソプロピルグリシン（Nval）；およびＮ−sec−ブチルグリシン（Nile ）からなる群から選択される請求項６記載の合成コラーゲン物質。８．反復するペプチド−ペプトイド残基トリマーが、式Gly-Pro-NleuまたはGly- Nleu-Proのものである請求項７記載の合成コラーゲン物質。９．式 (Z)_n ［式中、Zは、 (Gly-Xp-Pro)_j； (Gly-Pro-Yp)_k；（式中、XpおよびYpは、ペプトイド残基である）からなる群から選択されるジペプチド−ペプトイドトリマーである］で示される合成コラーゲンアミノ酸鎖であって、場合により該鎖は、 (Gly-Pro-Pro)_l;および (Gly-Pro-HyP)_m からなる群から選択される少なくとも１つのトリペプチドを含み、そして該アミノ酸鎖におけるj、k、l、およびmの合計はnであり、nは＞３である、合成コラーゲンアミノ酸鎖。１０．式 X-(Z)_n-Y で示される合成コラーゲンアミノ酸鎖であって、 (Gly-Xp-Pro)_j； (Gly-Pro-Yp)_k；（式中、XpおよびYpは、ペプトイド残基である）、からなる群から選択される、少なくとも１つのジペプチド−ペプトイド残基トリマーZ、および場合により、 (Gly-Pro-Pro)_l；および (Gly-Pro-Hyp)_m；からなる群より選択される少なくとも１つのトリペプチドを含み、そして該アミノ酸鎖において、j、k、l、およびmの合計はnであり、nは＞３である；合成コラーゲンアミノ酸鎖。（式中、Xは、直鎖、分岐鎖、飽和または不飽和脂肪酸、芳香族カルボン酸、およびアラールキルカルボン酸からなる群から選択され、アミド結合によりポリペプチドのN−末端アミノ酸に結合しており、かつ Yは、アンモニア、直鎖、分岐鎖、飽和または不飽和脂肪族アミン、芳香族アミン、およびアラールキルアミンからなる群から選択され、Yは、アミド結合によりポリペプチドのC−末端に結合している）１１．Xが、アセチル基であり、Yが、アミド、ビピリシンおよびマレイミドからなる群から選択される、請求項１０記載の合成コラーゲンアミノ酸鎖。１２．式 TP-[A-(Gly-Xp-Pro)_n-NH₂]₃またはTP-[A-(Gly-Pro-Yp)_n-NH₂]₃ （式中TPは、３つの規則正しくスペースをおく官能性基を有するテンプレート分子であって、各該基は反復するペプチド−ペプトイド残基鎖に共有結合しており、該テンプレート分子は該鎖のトリプルヘリックス折りたたみを誘導することができ； Aは、随意の２官能性スペーサー分子であり； XpおよびYpは、ペプトイド残基であり； nは、＞３である）またはこれらの組合せ；で示される反復するペプチド−ペプトイド残基トリマーのテンプレート結合アミノ酸鎖集合体。１３．式 TP-[A-(Gly-Pro-Hyp)_n-NH₂]₃ （式中、TPは、３つの規則正しくスペースをおく官能性基を有するテンプレート分子であって、各該基は、反復するトリペプチドの鎖に共有結合されており、該テンプレート分子は該鎖のトリプルヘリックス折りたたみを誘導することができ、 Aは、随意の２官能性のスペーサー分子であり、 nは、＞３である）で示される反復するトリペプチドのテンプレート結合ポリマー。１４．テンプレート結合アミノ酸鎖集合体であって、３つの規則正しくスペースをおいた官能性基を有しているテンプレート分子、TP ;官能性末端基を有するＣ₁〜Ｃ₆アルキル鎖を含む随意のスペーサー、A； (Gly-Xp-Pro)_j； (Gly-Pro-Yp)_k； (Gly-Pro-Pro)_l；および (Gly-Pro-HyP)_m （式中、XpおよびYpは、ペプトイド残基である）；からなる群から選択されるトリペプチドおよびペプチド−ペプトイド残基トリマーを含み、そして、j、k、l、およびmの合計＝nであり、ここで、nは＞３である、３アミノ酸鎖；を含み、該鎖は同じかまたは異なるアミノ酸配列を有し、直接的にまたは該スペーサー、Aを介して間接的に該テンプレート分子の官能性基に共有結合し、それによって該テンプレート分子は該鎖のトリプルヘリックス折りたたみを誘導する、テンプレート結合アミノ酸鎖集合体。１５．TPがケンプトリ酸（KTA）（cis,cis−１，３，５−トリメチルシクロヘキサン−１，３，５−トリカルボン酸）、またはトリメシン酸(TMA)（１，３，５ −ベンゼントリカルボン酸）である、請求項１２記載のテンプレート結合集合体。１６．「A」が、Gly-（NH-CH₂-COO-）および６−アミノヘキサン酸(NH₂-(CH₂)₅- COO-)からなる群から選択されるスペーサーである、請求項１２記載のテンプレート結合集合体。１７．XpおよびYpが、各々、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、リシン、フェニルアラニンおよびアスパラギン酸に関連するN−置換ペプトイドからなる群から選択されるペプトイド残基である、請求項１２記載のテンプレート結合集合体。１８．該ペプトイド残基が、N−イソブチルグリシン（Nleu）、N−メチルグリシン（Sar）；N−イソプロピルグリシン（Nval）；およびN-sec-ブチルグリシン（ Nile）からなる群から選択される請求項１７記載のテンプレート結合集合体。１９．式 KTA-(Gly-(Gly-Pro-Yp)_n-NH₂)₃； KTA-(Gly-(Gly-Xp-Hyp)_n-NH₂)₃； KTA-(Aha-(Gly-Pro-Yp)_n-NH₂)₃；または KTA-(Aha-(Gly-Xp-Hyp)_n-NH₂)₃ （式中、YpおよびXpはペプトイド残基であり； KTAは、ケンプトリ酸（cis,cis−１，３，５−トリメチルシクロヘキサン−１，３，５−トリカルボン酸）であり； Ahaは、６−アミノヘキサン酸（-NH₂-(CH₂)₅-COO-）であり；そして、 nは、＞１である）で示されるテンプレート結合アミノ酸鎖集合体。２０．式 TMA-(Gly-(Gly-Pro-Yp)_n-NH₂)₃；または TMA-(Gly-(Gly-Xp-Hyp)_n-NH₂)₃；（式中、XpおよびYpはペプトイド残基であり； TMAは、トリメシン酸（１，３，５−ベンゼントリカルボン酸）であり；そして、 nは、＞１である）で示されるテンプレート結合アミノ酸鎖集合体。２１．Xpがグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、リシン、フェニルアラニンおよびアスパラギン酸に関連するN−置換ペプトイドからなる群から選択されるペプトイド残基である、請求項１２記載のテンプレート結合アミノ酸鎖集合体。２２．該ペプトイド残基が、N−イソブチルグリシン（Nleu）、N−メチルグリシン（Sar）；N−イソプロピルグリシン（Nval）；およびN−sec−ブチルグリシン（Nile）からなる群から選択される、請求項２１記載のテンプレート結合集合体。２３．XpがNleuである、請求項２２記載のテンプレート結合集合体。２４．３アミノ酸鎖のトリプルヘリックス折りたたみを誘導するための方法であって、（ａ）１つの該アミノ酸鎖のN−末端を、ヘリックス誘導テンプレート分子の３つの官能性基の各々に、直接的にかまたは２官能性スペーサー分子を介してかのいずれかで、共有的に付着させる工程；および（ｂ）テンプレートに集合しているアミノ酸鎖が安定なトリプルヘリックスコンホメーションをとることを可能にする工程、を含む方法。２５．該アミノ酸鎖を樹脂支持体上の固相セグメント縮合法により集合させる予備的工程を含んでいる、請求項２４記載の方法。２６．工程（ａ）が、樹脂に結合した集合させられたアミノ酸鎖のN末端を該テンプレートの官能性基に付着させることを含んでいる、請求項２５記載の方法。２７．工程（ａ）が、集合した遊離のアミノ酸鎖のN末端を溶液中の該テンプレートの官能性基に付着させることを含んでいる、請求項２４記載の方法。２８．各該アミノ酸鎖が Gly-Xp-Pro； Gly-Pro-Yp； Gly-Pro-Hyp；および Gly-Pro-Pro またはこれらの組合せ（式中、XpおよびYpは、ペプトイド残基である）からなる群から選択される反復するトリマー配列を含んでいる、請求項２４記載の方法。２９．該アミノ酸鎖が、式 (Gly-Xp-Pro)_n；または (Gly-Pro-Yp)_n またはこれらの組合せ（式中、XpおよびYpはペプトイド残基であり、nは＞１である）で示される反復するペプチド−ペプトイド残基トリマーを含んでいる、請求項２４記載の方法。３０．ポリペプチド鎖が反復するトリペプチドを含む、請求項２４記載の方法。３１．該ポリペプチド鎖が、Gly-Pro-HypおよびGly-Hyp-Proまたはこれらの組合せからなる群から選択される反復するトリペプチドを含んでいる、請求項３０記載の方法。３２．請求項２４記載の方法により調製されるヘリックスにコンホメーションを形成しているトリプレックスアミノ酸鎖を含んでいる合成コラーゲン材料。３３． Gly-Xp-Pro； Gly-Pro-Yp； Gly-Pro-Hyp；および Gly-Pro-Pro；（式中、XpおよびYpは、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、リシン、フェニルアラニンおよびアスパラギン酸のＮ−置換ペプトイド同質異性からなる群から選択される）からなる群から選択される少なくとも１つのトリペプチドを含んでいる、単離され、精製されている化合物。３４．XpおよびYpがＮ−イソブチルグリシン(Nleu)、Ｎ−メチルグリシン(Sar) ；Ｎ−イソプロピルグリシン（Nval）；およびＮ−sec−ブチルグリシン（Nile ）からなる群から選択される請求項３３の化合物。