KR102587196B1

KR102587196B1 - Glp-1/glp-2 이중 효능제

Info

Publication number: KR102587196B1
Application number: KR1020197019566A
Authority: KR
Inventors: 라르센 베얀 두에; 리세 기에흠; 알리스테어 빈센트 고르돈 에드와르스
Original assignee: 질랜드 파마 에이/에스
Priority date: 2016-12-09
Filing date: 2017-12-11
Publication date: 2023-10-10
Also published as: KR20190091334A; CA3044915A1; BR112019011859A2; RU2019121280A; EP3551652A1; AU2017373901A1; RU2019121280A3; CN110099922A; EP3551652B1; MX2019006600A; RU2756011C2; SA519401924B1; US20190338009A1; AU2017373901B2; US11130793B2; WO2018104560A1; JP2020500890A

Abstract

본 발명은 GLP-1 (글루카곤-유사-펩티드 1) 및 GLP-2 (글루카곤-유사 펩티드 2) 수용체에서 효능제 활성을 갖는 화합물에 관한 것이다. 상기 화합물은 특히 장 손상 및 기능이상의 예방 또는 치료, 체중 조절, 및 대사 기능이상의 예방 또는 치료에 유용하다.

Description

GLP-1/GLP-2 이중 효능제

인간 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1(7-36)) 및 인간 글루카곤-유사 펩티드 2 (GLP-2 (1-33))는 동일한 세포에 의해 생산되기 때문에 장 조직은 인간 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1(7-36)) 및 인간 글루카곤-유사 펩티드 2 (GLP-2 (1-33)) 모두의 생산을 담당한다. 인간 GLP-2는 하기 서열을 갖는 33-아미노산 펩티드이다: Hy-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH (서열번호 1). 이는 장의 장내분비 L 세포 및 뇌간 (brainstem)의 특정 영역에서 프로글루카곤 (proglucagon)의 특정 번역후 프로세싱으로부터 유래된다. GLP-2는 클래스 II 글루카곤 세크레틴 패밀리에 속하는 단일의 G-단백질-결합된 수용체에 결합한다. GLP-2는 GLP-1, 옥신토모듈린 (oxyntomodulin) 및 글리센틴 (glicentin)과 함께, 영양분 섭취에 반응하여 분비된다. 인간 GLP-1은 하기 서열을 갖는 30-아미노산 펩티드로 생산된다: Hy-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-NH₂ (서열번호 2).

GLP-2는 창자샘 (crypt)에서 줄기세포 증식의 자극을 통해서, 및 융모 (villi)에서 아폽토시스의 저해에 의해 소장 점막 상피의 유의한 성장을 유도하는 것이 보고되어 있다 (Drucker et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7911-7916). GLP-2는 또한 결장에서 성장 효과를 갖는다. 또한, GLP-2는 위 배출 (gastric emptying) 및 위산 분비를 저해하고 (Wojdemann et al., 1999, J. Clin. Endocrinol. Metab. 84: 2513-2517), 장 장벽 기능을 향상시키며 (Benjamin et al., 2000, Gut 47: 112-119), 글루코스 수송체의 상향조절을 통한 장의 헥소스 수송 (hexose transport)을 자극하고 (Cheeseman, 1997, Am. J. Physiol. R1965-71), 장 혈류량을 증가시킨다 (Guan et al., 2003, Gastroenterology, 125: 136-147).

GLP-1은 생리적 인크레틴 (incretin) 호르몬으로 기재되어 왔고, 그러므로 대부분 글루코스 또는 지방의 경구 섭취 후에 인슐린 반응을 증가시키는 것으로 보고되었다. 그러나, 일반적으로 GLP-1은 글루카곤 농도를 낮추고, 빠른 장 운동 억제에 유익한 효과를 가지며 (Tolessa et al., 1998, Dig. Dis. Sci. 43(10): 2284-90), 위 배출을 지연시키는 것으로 이해되었다.

WO2013/164484는 h[Gly2]GLP-2와 비교하여 하나 이상의 치환을 포함하고, 변경된 GLP-1 활성의 특성을 가질 수 있는 GLP-2 유사체, 및 그의 의학적 용도를 개시하였다.

WO2016/066818은 GLP-1 및 GLP-2 수용체에서 이중 효능제 활성을 갖는 펩티드를 개시하고, 또한 그의 의학적 용도를 제시하였다. 그러나, 상기 수용체 모두에서 효과적인 효능제 활성과 허용가능한 수준의 안정성이 조합된 부가적인 화합물을 여전히 필요로 하고 있다.

광의로, 본 발명은 인 비트로 역가 분석 (in vitro potency assay)에서 평가시, GLP-1 (글루카곤-유사 펩티드 1) 및 GLP-2 (글루카곤-유사 펩티드 2) 수용체에서 효능제 활성을 갖는 화합물에 관한 것이다. 이러한 화합물을 본 명세서에서 "GLP-1/GLP-2 이중 효능제" 또는 간단히 "이중 효능제"라고 한다. 그러므로, 본 발명의 화합물은 GLP-1 (7-36) 및 GLP-2 (1-33) 모두의 활성을 갖는다.

본 발명은 하기 화학식으로 표시되는 GLP-1/GLP-2 이중 효능제, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 제공한다:

R¹-X^*-U-R²

상기에서:

R¹은 수소 (Hy), C_1-4 알킬 (예: 메틸), 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸이고;

R²는 NH₂ 또는 OH이고;

X^*는 하기 화학식 I의 펩티드이고:

H-X2-EG-X5-F-X7-X8-E-X10-X11-TIL-X15-X16-X17-A-X19-X20-X21-FI-X24-WL-X27-X28-X29-KIT-X33 (I)

상기에서

X2는 Aib 또는 G이고;

X5는 S 또는 T이고;

X7은 S 또는 T이고;

X8은 S, E 또는 D이고;

X10은 L, M 또는 V이고;

X11은 A, N 또는 S이고;

X15는 D 또는 E이고;

X16은 E, A 또는 G이고;

X17은 Q, E, L 또는 K이고;

X19는 A, V 또는 S이고;

X20은 R 또는 K이고;

X21은 D, L 또는 E이고;

X24는 A, N 또는 S이고;

X27은 I, Y, Q, H 또는 K이고;

X28은 A, E, H, Y, L, K, Q, R 또는 S이고;

X29는 H, Y, K 또는 Q이고;

X33은 D 또는 E이고;

U는 부재하거나 또는 K 및 k로부터 각각 독립적으로 선택되는 1-15개의 잔기의 서열이고;

상기 X5 및 X7 중 적어도 하나는 T이다.

본원에 제공된 화학식 중 펩티드 X^*에서 다양한 아미노산 위치는 아미노산 사슬의 N-말단에서 C-말단까지 그의 선형 위치에 따라 넘버링된다.

위치 3에서 아스파르트산 (Asp, D) 및 위치 4에서 글리신 (Gly)을 갖는 이중 효능제는 GLP-1 및 GLP-2 수용체에서 매우 강력한 효능제일 수 있다. 그러나, 상기 치환의 조합은 화합물을 불안정하게 하고, 수성 용액에서 장기간 보관하는데 적합하지 않을 수 있다. 이론에 국한되지 않고, 위치 3에서 Asp는 그의 곁사슬의 카르복실산 관능기와 위치 4에서 잔기의 주사슬 질소 원자 사이에 형성된 고리형 중간체를 통해 이소-Asp로 이성질체화 (isomerise)될 수 있는 것으로 여겨진다.

위치 3에서 Asp 대신에 글루탐산 (Glu, E)을 갖는 분자는 상기 반응에 대한 감수성이 훨씬 떨어져서 수성 용액 중에 보관될 때 상당히 더 안정할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 위치 3에서 Asp의 Glu로의 대체는 Glu가 네이티브 GLP-1 분자의 위치 3에 존재하더라도, GLP-2 수용체 및 GLP-1 수용체 중 하나 또는 둘 다에서 역가를 감소시킬 수 있다. 위치 5 및 7 중 하나 또는 둘 다에서 Thr 잔기를 동시에 혼입하는 것은, 특히 위치 29에서 야생형 인간 GLP-1 및 2 각각에 존재하는 Gly (G) 및 Thr (T) 잔기 대신에 His (H), Tyr (Y) 또는 Gln (Q)의 혼입과 조합하여, 손실된 역가의 일부 또는 전부를 보충하는 것으로 나타났다.

상기 화학식 I의 일부 구체예에서:

X2는 Aib이고;

X5는 S 또는 T이고;

X7은 S 또는 T이고;

X8은 S 또는 D이고;

X10은 L이고;

X11은 A 또는 S이고;

X15는 D 또는 E이고;

X16은 E 또는 G이고;

X17은 Q 또는 K이고;

X19는 A 또는 S이고;

X20은 R이고;

X21은 D 또는 E이고;

X24는 A, N 또는 S이고;

X27은 I, Y, Q 또는 K이고;

X28은 A, E, H, Y 또는 L이고;

X29는 H, Y 또는 Q이고;

X33은 D이다.

일부 구체예에서, X2는 Aib이다.

일부 구체예에서, X8은 S이다.

일부 구체예에서, X7은 T이다.

일부 구체예에서, X5는 T이다.

일부 구체예에서, X29는 H이다.

일부 구체예에서, X27은 I이다.

일부 구체예에서, X27은 Q이고, X29는 Q이다.

일부 구체예에서, X28은 A이고, X29는 H이다.

일부 구체예에서, X28은 E이고, X29는 H이다.

일부 구체예에서, X11은 A이다.

일부 구체예에서, X16은 E이고, X17은 Q이다. 일부 구체예에서, X16은 G이고, X17은 K이다.

X^*는 X11이 S, X15가 E, X19가 S, 또는 X21이 E인 것 중 어느 것을 포함하는 경우, 이는 상기 잔기를 2, 3 또는 4개 모두 포함할 수 있다. 예를 들어:

X11은 S이고, X15는 E이거나;

X11은 S이고, X19는 S이거나;

X11은 S이고, X21은 E이거나;

X15는 E이고, X19는 S이거나;

X15는 E이고, X21은 E이거나;

X11은 S이고, X15는 E이고, X19는 S이거나;

X11은 S이고, X15는 E이고, X21은 E이거나;

X11은 S이고, X19는 S이고, X21은 E이거나;

X15는 E이고, X19는 S이고, X21은 E이거나; 또는

X11은 S이고, X15는 E이고, X19는 S이고, X21은 E이다.

일부 구체예에서, 잔기 X8-X24는 서열 SELATILDEQAARDFIA와 비교하여 최대 4개의 변경, 예컨대 상기 서열과 비교하여 최대 3개, 최대 2개, 또는 최대 1개의 변경을 포함한다.

일부 구체예에서, X27은 I일 수 있다. 예를 들어, X27은 I이고, X28은 A이다.

일부 구체예에서, X27-X29에서 잔기는 하기로부터 선택되는 서열을 갖는다:

IAH;

HAH;

QAH;

YAH;

IAQ;

IAY;

YEH;

IQH;

IKH;

IRH;

ISH;

HQH;

QAQ;

HAQ;

YAH;

YRH;

KAH;

KSY;

KEQ;

IEH; 및

ILH.

일부 구체예에서, X^*는 하기 화학식 II의 펩티드이다:

H[Aib]EG-X5-F-X7-SELATILDEQAARDFIAWLI-X28-X29-KITD (II)

상기에서

X5는 S 또는 T이고;

X7은 S 또는 T이고;

X28은 A, E, H, Y 또는 L이고;

X29는 H, Y 또는 Q이고;

상기 X5 및 X7 중 적어도 하나는 T이다.

상기에 개시된 화학식 또는 구체예에서, 상기 이중 효능제는 하기 잔기들 조합 중 하나를 포함한다:

X5는 S이고, X7은 T이며;

X5는 T이고, X7은 S이며;

X5는 T이고, X7은 T이다.

X5는 S이고, X7은 T이거나, 또는 X5는 T이고, X7은 T인 것이 바람직할 수 있다.

X29는 H, Y 또는 Q일 수 있고, 일부 구체예에서는 H이다.

U는 존재하는 경우, 1-15개의 리신 잔기, 예컨대 1-10개의 리신 잔기의 펩티드 서열을 나타낸다. 상기 펩티드 서열 U 중에 각 아미노산 잔기는 D-입체형태 ("k"라고 함) 또는 L-입체형태 ("K"라고 함)를 가질 수 있다. 소정의 구체예에서, 모두 L-입체형태를 갖거나 또는 모두 D-입체형태를 갖는다. 예로는 K_1-15, K_1-10 및 K_1-7, 예컨대, K₃, K₄, K₅, K₆ 및 K₇, 구체적으로 K₅ 및 K₆을 포함한다. 부가적인 예로는 k_1-15, k_1-10 및 k_1-7, 예컨대 k₃, k₄, k₅, k₆ 및 k₇, 구체적으로 k₅ 및 k₆을 포함한다.

소정의 구체예에서, U는 부재한다.

일부 구체예에서, R¹은 Hy이고 및/또는 R²는 OH이다.

상기 펩티드 X^*는 하기 서열을 가질 수 있다:

상기 이중 효능제는 하기일 수 있다:

상기 이중 효능제는 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물, 예컨대 약학적으로 허용가능한 산 부가 염의 형태일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 이중 효능제, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을, 담체, 부형제 또는 비히클과 함께 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 담체는 약학적으로 허용가능한 담체일 수 있다.

상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 주사 또는 주입으로 투여하기에 적합한 액체로 제제화될 수 있다. 이는 상기 이중 효능제의 저속 방출 (slow release)을 달성하도록 제제화될 수 있다.

본 발명은 또한 치료 (therapy)에서 사용하기 위해 본 발명의 이중 효능제를 제공한다. 또 다른 양상에서 약제로서 사용하기 위해 본 발명의 이중 효능제가 제공된다. 또한 의학적 치료 방법에 사용하기 위해 본 발명의 이중 효능제가 제공된다.

본 발명은 또한 장 질량 (intestinal mass)을 증가시키고, 장 기능 (구체적으로 장 장벽 기능)을 향상시키며, 장 혈류량을 증가시키거나, 또는 장 손상 또는 기능이상, 예컨대 장 상피 손상을 치유하는 방법에 사용하기 위해 본 발명의 이중 효능제를 제공한다.

본 발명은 또한 흡수장애 (malabsorption), 궤양 (예컨대 소화 궤양, 졸링거-엘리슨 증후군 (Zollinger-Ellison Syndrome), 약제성 궤양 (drug-induced ulcer), 및 감염 또는 기타 병원체와 관련된 궤양), 짧은-창자 증후군, 컬-드-삭 증후군 (cul-de-sac syndrome), 염증성 장 질환 (크론병 및 궤양성 대장염), 과민성 대장 증후군 (IBS), 낭염 (pouchitis), 복강 스프루 (celiac sprue) (예를 들어 글루텐 유발된 창자병증 (enteropathy) 또는 복강병 (celiac disease)으로부터 발생함), 열대 스프루 (tropical sprue), 저감마글로불린혈증 스프루 (hypogammaglobulinemic sprue), 화학요법 또는 방사선요법에 의해 유발된 점막염 (mucositis), 화학요법 또는 방사선요법에 의해 유발된 설사, 저등급 염증 (low grade inflammation), 대사성 내독소혈증 (metabolic endotoxemia), 괴사 소장대장염 (necrotising enterocolitis), 원발 쓸개관 간경화증 (primary biliary cirrhosis), 간염, 지방간 질환 (비경구적 영양 관련 장 위축, 비경구적 영양-관련 간 질환 (Parenteral Nutrition-Associated Liver Disease: PNALD), 비알콜성 지방간 질환 (Non-Alcoholic Fatty Liver Disease: NAFLD) 및 비알콜성 지방간염 (Non-Alcoholic Steatohepatitis: NASH) 포함), 또는 췌장염 또는 이식편대 숙주 질환 (graft versus host disease: GVHD)과 같은 염증 병태의 위장관 부작용의 예방 또는 치료 방법에 사용하기 위해 본 발명의 이중 효능제를 제공한다.

본 발명은 또한 체중 증가의 감소 또는 억제, 위 배출 또는 장 통과 (intestinal transit)의 감소, 음식 섭취의 감소, 식욕의 감소, 또는 체중 감소의 촉진 방법에 사용하기 위해 본 발명의 이중 효능제를 제공한다.

본 발명은 또한 비만, 병적 비만, 비만-관련 담낭 질환 (obesity-linked gallbladder disease), 비만-유발된 수면 무호흡, 불충분한 글루코스 조절, 글루코스 내성 (glucose tolerance), 이상지질혈증 (dyslipidaemia) (예컨대 증가된 LDL 수준 또는 감소된 HDL/LDL 비율), 당뇨병 (예컨대 제2형 당뇨병, 임신성 당뇨병), 당뇨병전기 (pre-diabetes), 대사 증후군 또는 고혈압의 예방 또는 치료 방법에 사용하기 위해 본 발명의 이중 효능제를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 이중 효능제를 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 피험체에서 장 질량을 증가시키고, 장 기능 (구체적으로 장 장벽 기능)을 향상시키며, 장 혈류량을 증가시키거나, 또는 장 손상 또는 기능이상을 치유하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 이중 효능제를 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 피험체에서 흡수장애, 궤양 (예컨대 소화 궤양, 졸링거-엘리슨 증후군, 약제성 궤양, 및 감염 또는 기타 병원체와 관련된 궤양), 짧은-창자 증후군, 컬-드-삭 증후군, 염증성 장 질환 (크론병 및 궤양성 대장염), 과민성 대장 증후군 (IBS), 낭염, 복강 스프루 (예를 들어 글루텐 유발된 창자병증 또는 복강병으로부터 발생함), 열대 스프루, 저감마글로불린혈증 스프루, 화학요법 또는 방사선요법에 의해 유발된 점막염, 화학요법 또는 방사선요법에 의해 유발된 설사, 저등급 염증, 대사성 내독소혈증, 괴사 소장대장염, 원발 쓸개관 간경화증, 간염, 지방간 질환 (비경구적 영양-관련 장 위축, PNALD (비경구적 영양-관련 간 질환), NAFLD (비알콜성 지방간 질환) 및 NASH (비알콜성 지방간염) 포함), 또는 췌장염 또는 이식편대 숙주 질환 (GVHD)과 같은 염증 병태의 위장관 부작용을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 이중 효능제를 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 피험체에서 체중 증가의 감소 또는 억제, 위 배출 또는 장 통과의 감소, 음식 섭취의 감소, 식욕의 감소, 또는 체중 감소의 촉진 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 이중 효능제를 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 피험체에서 비만, 병적 비만, 비만-관련 담낭 질환, 비만-유발된 수면 무호흡, 불충분한 글루코스 조절, 글루코스 내성, 이상지질혈증 (예컨대 증가된 LDL 수준 또는 감소된 HDL/LDL 비율), 당뇨병 (예컨대 제2형 당뇨병, 임신성 당뇨병), 당뇨병전기, 대사 증후군 또는 고혈압의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 장 질량을 증가시키고, 장 기능 (구체적으로 장 장벽 기능)을 향상시키며, 장 혈류량을 증가시키거나, 또는 장 손상 또는 기능이상, 예컨대 장 상피 손상을 치유하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 이중 효능제의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 흡수장애, 궤양 (예컨대 소화 궤양, 졸링거-엘리슨 증후군, 약제성 궤양, 및 감염 또는 기타 병원체와 관련된 궤양), 짧은-창자 증후군, 컬-드-삭 증후군, 염증성 장 질환 (크론병 및 궤양성 대장염), 과민성 대장 증후군 (IBS), 낭염, 복강 스프루 (예를 들어 글루텐 유발된 창자병증 또는 복강병으로부터 발생함), 열대 스프루, 저감마글로불린혈증 스프루, 화학요법 또는 방사선요법에 의해 유발된 점막염, 화학요법 또는 방사선요법에 의해 유발된 설사, 저등급 염증, 대사성 내독소혈증, 괴사 소장대장염, 원발 쓸개관 간경화증, 간염, 지방간 질환 (비경구적 영양 관련 장 위축, PNALD (비경구적 영양-관련 간 질환), NAFLD (비알콜성 지방간 질환) 및 NASH (비알콜성 지방간염) 포함), 또는 췌장염 또는 이식편대 숙주 질환 (GVHD)과 같은 염증 병태의 위장관 부작용의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 이중 효능제의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 체중 증가의 감소 또는 억제, 위 배출 또는 장 통과의 감소, 음식 섭취의 감소, 식욕의 감소, 또는 체중 감소의 촉진을 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 이중 효능제의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 비만, 병적 비만, 비만-관련 담낭 질환, 비만-유발된 수면 무호흡, 불충분한 글루코스 조절, 글루코스 내성, 이상지질혈증 (예컨대 증가된 LDL 수준 또는 감소된 HDL/LDL 비율), 당뇨병 (예컨대 제2형 당뇨병, 임신성 당뇨병), 당뇨병전기, 대사 증후군 또는 고혈압의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 이중 효능제의 용도를 제공한다.

부가적 양상은 본 발명에 따른 이중 효능제, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 치료용 키트 (therapeutic kit)를 제공한다.

본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원에 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 일반적으로, 본원에 개시된 화학, 분자생물학, 세포 암 생물학, 면역학, 미생물학, 약학 및 단백질 핵산 화학의 기술 및 이와 관련하여 사용된 명명법은 당분야에 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 출원에서 언급된 모든 특허, 공개 특허 출원 및 비-특허 간행물은 구체적으로 본원에 참고로 포함된다. 충돌이 있는 경우, 특정 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다.

본원에 개시된 본 발명의 각 구체예는 단독으로 또는 본 발명의 하나 이상의 다른 구체예와 조합하여 채택될 수 있다.

정의

달리 명시하지 않는 한, 본 서면 설명에 사용된 특정 용어에 대해 하기 정의가 제공된다.

본 명세서에서, 용어 "포함하다" 및 그의 문법적 파생어, 예컨대 "포함한다" 또는 "포함하는"은 명시된 정수 또는 성분, 또는 정수들 또는 성분들의 그룹을 포함하고, 다른 정수 또는 성분, 또는 정수들 또는 성분들의 그룹을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해할 것이다.

단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수 형태를 포함한다.

용어 "포함하는"은 "이에 한정되지 않고 포함하는" 것을 의미하는데 사용된다. "포함하는"과 "이에 한정되지 않고 포함하는"은 상호교환 가능하게 사용될 수 있다.

용어 "환자", "피험체" 및 "개체"는 상호교환 가능하게 사용될 수 있고, 인간 또는 비-인간 동물을 나타낸다. 상기 용어는 포유동물 예컨대 인간, 영장류, 가축 (예컨대, 소 및 돼지), 반려 동물 (예컨대, 개 및 고양이) 및 설치류 (예컨대, 마우스 (mouse) 및 래트 (rat))를 포함한다.

본 발명의 문맥에서 용어 "용매화물"은 용질 (이 경우에, 본 발명에 따른 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염)과 용매 사이에 형성된 정의된 화학양론의 복합체를 나타낸다. 이와 관련하여 용매는, 예를 들어, 물, 에탄올 또는 다른 약학적으로 허용가능한, 통상적으로 소분자 유기종, 예컨대 이에 한정되는 것은 아니지만, 아세트산 또는 락트산일 수 있다. 문제의 용매가 물인 경우, 이러한 용매화물을 보통 수화물이라고 한다.

본 발명의 문맥에서 사용되는 용어 "효능제"는 문제의 수용체 타입을 활성화하는 물질 (리간드)을 나타낸다.

본 명세서 및 청구범위에서 자연 발생하는 아미노산에 대해 기존의 3-문자 및 1-문자 코드, 즉

A (Ala), G (Gly), L (Leu), I (Ile), V (Val), F (Phe), W (Trp), S (Ser), T (Thr), Y (Tyr), N (Asn), Q (Gln), D (Asp), E (Glu), K (Lys), R (Arg), H (His), M (Met), C (Cys) 및 P (Pro);

뿐만 아니라 다른 α-아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3-문자 코드, 예컨대 사르코신 (Sar), 노르류신 (Nle), α-아미노이소부티르산 (Aib), 2,3-디아미노프로판산 (Dap), 2,4-디아미노부탄산 (Dab) 및 2,5-디아미노펜탄산 (오르니틴; Orn)이 사용된다. 이러한 다른 α-아미노산은, 본 명세서에서 일반식 또는 서열 중에 사용될 때, 구체적으로 나머지 일반식 또는 서열을 1-문자 코드를 사용하여 나타낼 때 괄호 "[ ]"로 나타낼 수 있다 (예컨대 "[Aib]"). 달리 명시하지 않는 한, 본 발명의 펩티드 중에 아미노산 잔기는 L-입체형태를 갖는다. 그러나, D-입체형태 아미노산이 포함될 수 있다. 본 문맥에서, 소문자로 쓰여진 아미노산 코드는 상기 아미노산의 D-입체형태를 나타내고, 예컨대 "k"는 리신 (K)의 D-입체형태를 나타낸다.

본원에 개시된 서열 중에, 서열의 아미노 말단 (N-말단)에 "Hy-" 모이어티, 및 서열의 카르복시 말단 (C-말단)에 "-OH" 모이어티 또는 "-NH₂" 모이어티를 포함하는 서열이 있다. 이러한 경우에, 달리 지시하지 않는 한, 문제의 서열의 N-말단에서 "Hy-" 모이어티는 수소 원자 [즉 일반식에서 R¹ = 수소 = Hy; N-말단에 유리 1차 또는 2차 아미노기가 존재하는 것에 해당함]를 나타내고, 상기 서열의 C-말단에서 "-OH" 또는 "-NH₂" 모이어티는 각각 히드록시기 [예컨대 일반식에서 R² = OH; C-말단에 카르복시 (COOH) 기가 존재하는 것에 해당함] 또는 아미노기 [예컨대 일반식에서 R² = [NH₂]; C-말단에 아미도 (CONH₂) 기가 존재하는 것에 해당함]를 나타낸다. 본 발명의 각 서열에서, C-말단 "-OH" 모이어티는 C-말단 "-NH₂" 모이어티로 치환될 수 있고, 그 반대로도 치환될 수 있다.

GLP-2 폴리펩티드 서열과 관련하여 "아미노산 서열 동일성 퍼센트 (%)"는, 서열들을 정렬하고, 필요하다면 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 갭을 도입한 후에, 야생형 (인간) GLP-2 서열에서 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열에서 아미노산 잔기의 퍼센트로 정의되고, 서열 동일성의 일부로서 보존적 치환은 고려하지 않았다. BLAST, BLAST2 또는 Align 소프트웨어와 같이 공개적으로 입수가능한 소프트웨어를 사용하는 것과 같이, 당분야에 잘 알려져 있는 기술을 사용하여 당업자가 서열 정렬을 수행할 수 있다. 예를 들어, Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996) 또는 Pearson et al., Genomics 46: 24-36, 1997을 참조한다.

본 발명의 문맥에서 본원에 사용된 서열 동일성 퍼센트는 그의 디폴트 세팅을 갖는 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 보다 일반적으로, 당업자는 비교되는 서열 전장에 대해 최대 정렬을 달성하기 위해 필요로 하는 알고리즘을 포함하는, 정렬을 결정하기 위한 적절한 파라미터를 용이하게 결정할 수 있다.

이중 효능제 화합물

본 발명에 따르면, 상기 이중 효능제는 적어도 하나의 GLP-1 및 적어도 하나의 GLP-2 생물학적 활성을 갖는다. 예시되는 GLP-1 생리학적 활성은 장 통과 속도 감소, 위 배출 속도 감소, 식욕, 음식 섭취 또는 체중 감소, 및 글루코스 조절 및 글루코스 내성 향상을 포함한다. 예시되는 GLP-2 생리학적 활성은 장 질량 (예컨대 소장 또는 결장 질량)의 증가, 장 치유, 및 장 장벽 기능의 향상 (즉 장의 투과성 감소)을 유도하는 것을 포함한다. 상기 파라미터는, 시험 동물을 이중 효능제로 치료한 후에 장 또는 그의 일부의 질량 및 투과성을 결정하는 인 비보 분석 (in vivo assays)에서 평가될 수 있다.

상기 이중 효능제는 GLP-1 및 GLP-2 수용체, 예컨대 인간 GLP-1 및 GLP-2 수용체에서 효능제 활성을 갖는다. 인 비트로 수용체 효능제 활성에 대한 EC₅₀ 값은 고려된 수용체에서 효능제 역가의 수치적 측정값으로 사용될 수 있다. EC₅₀ 값은 특정 분석에서 화합물의 최대 활성의 반치를 달성하는데 필요로 하는 화합물의 농도 (예컨대 mol/L)의 측정값이다. 특정 수용체에서 수치적 EC₅₀이 동일한 분석에서 참조 화합물의 EC₅₀보다 낮은 화합물은 상기 수용체에서 참조 화합물보다 더 높은 역가를 갖는 것으로 간주될 수 있다.

GLP-1 활성

일부 구체예에서, 상기 이중 효능제는 예컨대 하기 실시예에 기재된 GLP-1 수용체 역가 분석을 사용하여 평가될 때, GLP-1 수용체 (예컨대 인간 GLP-1 수용체)에서 2.0 nM 이하, 1.5 nM 이하, 1.0 nM 이하, 0.9 nM 이하, 0.8 nM 이하, 0.7 nM 이하, 0.6 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.09 nM 이하, 0.08 nM 이하, 0.07 nM 이하, 0.06 nM 이하, 0.05 nM 이하, 0.04 nM 이하인 EC₅₀을 갖는다.

일부 구체예에서, 상기 이중 효능제는 예컨대 하기 실시예에 기재된 GLP-1 수용체 역가 분석을 사용하여 평가될 때, GLP-1 수용체에서 0.001 nM 내지 1.0 nM, 0.001 nM 내지 0.5 nM 또는 0.001 nM 내지 0.1nM의 EC₅₀을 갖는다.

GLP-1 효능제 활성의 대체 측정값으로는 이중 효능제의 역가와 알려져 있는 (또는 참조) GLP-1 효능제의 역가를 동일한 분석으로 측정하여 이들을 비교하여 유도될 수 있다. 그러므로 GLP-1 수용체에서 상대 역가는 하기와 같이 정의될 수 있다:

[EC₅₀(참조 효능제)] / [EC₅₀(이중 효능제)].

그러므로 값이 1이면 이중 효능제와 참조 효능제는 동일한 역가를 갖는 것을 나타내고, 값이 >1이면 이중 효능제가 참조 효능제보다 더 높은 역가 (즉 더 낮은 EC₅₀)을 갖는 것을 나타내고, 값이 <1이면 이중 효능제가 참조 효능제보다 더 낮은 역가 (즉 더 높은 EC₅₀)을 갖는 것을 나타낸다.

상기 참조 GLP-1 효능제는, 예를 들어 인간 GLP-1(7-37), 리라글루티드 (liraglutide) (NN2211; Victoza), 또는 엑센딘-4 (Exendin-4)일 수 있지만, 바람직하게는 리라글루티드이다.

통상적으로 상대 역가는 0.001 내지 100, 예컨대

0.001 내지 10, 0.001 내지 5, 0.001 내지 1, 0.001 내지 0.5, 0.001 내지 0.1, 0.001 내지 0.05 또는 0.001 내지 0.01;

0.01 내지 10, 0.01 내지 5, 0.01 내지 1, 0.01 내지 0.5, 0.01 내지 0.1 또는 0.01 내지 0.05;

0.05 내지 10, 0.05 내지 5, 0.05 내지 1, 0.05 내지 0.5 또는 0.05 내지 0.1;

0.1 내지 10, 0.1 내지 5, 0.1 내지 1 또는 0.1 내지 0.5;

0.5 내지 10, 0.5 내지 5 또는 0.5 내지 1;

1 내지 10 또는 1 내지 5;

또는 5 내지 10일 것이다.

본 이중 효능제는 리라글루티드에 대해 상응하는 GLP-1 역가를 갖는다. 그러므로 상대 역가는 구체적으로 0.5 내지 10, 0.5 내지 5, 0.5 내지 1, 1 내지 10 또는 1 내지 5일 수 있다.

대조적으로, 본 발명의 이중 효능제는 GLP-1 수용체 (예컨대 인간 GLP-1 수용체)에서 야생형 인간 GLP-2 (hGLP-2 (1-33)) 또는 [Gly2]-hGLP-2 (1-33) (즉 위치 2에서 글리신을 갖는 인간 GLP-2, 또한 테두글루티드 (teduglutide)로 알려져 있음)보다 더 높은 역가를 갖는다. 그러므로, 상기 GLP-1 수용체에서 hGLP-2 (1-33) 또는 테두글루티드와 비교되는 이중 효능제의 상대 역가는 1 초과, 통상적으로 5 초과 또는 10 초과이고, 100 미만, 500 미만, 또는 심지어 더 높을 수도 있다.

GLP-2 활성

일부 구체예에서, 상기 이중 효능제는 예컨대 하기 실시예에 기재된 GLP-1 수용체 역가 분석을 사용하여 평가될 때, GLP-2 수용체 (예컨대 인간 GLP-2 수용체)에서 2.0 nM 이하, 1.5 nM 이하, 1.0 nM 이하, 0.9 nM 이하, 0.8 nM 이하, 0.7 nM 이하, 0.6 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.09 nM 이하, 0.08 nM 이하, 0.07 nM 이하, 0.06 nM 이하, 0.05 nM 이하, 0.04 nM 이하, 0.03 nM 이하, 0.02 nM 이하 또는 0.01 nM 이하인 EC₅₀을 갖는다.

일부 구체예에서, 상기 이중 효능제는 예컨대 하기 실시예에 기재된 GLP-2 수용체 역가 분석을 사용하여 평가될 때, GLP-2 수용체에서 0.001 nM 내지 1.0 nM, 0.001 nM 내지 0.5 nM 또는 0.001 nM 내지 0.25 nM,

예컨대 0.01 nM 내지 1.0 nM, 0.01 nM 내지 0.5 nM 또는 0.01 nM 내지 0.25 nM의 EC₅₀을 갖는다.

GLP-2 효능제 활성의 대체 측정값으로는 이중 효능제의 역가와 알려져 있는 (또는 참조) GLP-2 효능제의 역가를 동일한 분석으로 측정하여 이들을 비교하여 유도될 수 있다. 그러므로 GLP-2 수용체에서 상대 역가는 하기와 같이 정의될 수 있다:

[EC₅₀(참조 효능제)] / [EC₅₀(이중 효능제)].

상기 참조 GLP-2 효능제는, 예를 들어 인간 GLP-2(1-33) 또는 테두글루티드 ([Gly2]-hGLP-2 (1-33))일 수 있지만, 바람직하게는 테두글루티드이다. 통상적으로 상대 역가는 0.001 내지 100, 예컨대

0.001 내지 10, 0.001 내지 5, 0.001 내지 1, 0.001 내지 0.5, 0.001 내지 0.25, 0.001 내지 0.1, 0.001 내지 0.05 또는 0.001 내지 0.01;

0.01 내지 10, 0.01 내지 5, 0.01 내지 1, 0.01 내지 0.5, 0.01 내지 0.25, 0.01 내지 0.1 또는 0.01 내지 0.05;

0.05 내지 10, 0.05 내지 5, 0.05 내지 1, 0.05 내지 0.5, 0.05 내지 0.25 또는 0.05 내지 0.1;

0.1 내지 10, 0.1 내지 5, 0.1 내지 1, 0.1 내지 0.5 또는 0.1 내지 0.25;

0.25 내지 10, 0.25 내지 5, 0.25 내지 1 또는 0.25 내지 0.5;

0.5 내지 10, 0.5 내지 5 또는 0.5 내지 1;

1 내지 10 또는 1 내지 5;

또는 5 내지 10일 것이다.

본 이중 효능제의 GLP-2 역가는 테두글루티드에 상응하거나, 또는 약간 더 낮다. 그러므로, 상대 역가는 구체적으로 0.1 내지 1, 0.1 내지 0.5 또는 0.1 내지 0.25, 0.25 내지 1 또는 0.25 내지 0.5일 수 있다.

대조적으로, 본 발명의 이중 효능제는 GLP-2 수용체 (예컨대 인간 GLP-2 수용체)에서 인간 GLP-1(7-37), 리라글루티드 (NN2211; Victoza), 또는 엑센딘-4보다 더 높은 역가를 갖는다. 그러므로, GLP-2 수용체에서 인간 GLP-1(7-37), 리라글루티드 (NN2211; Victoza), 또는 엑센딘-4와 비교되는 이중 효능제의 상대 역가는 1 초과, 통상적으로 5 초과 또는 10 초과이고, 100 미만, 500 미만, 또는 심지어 그 보다 더 높을 수 있다 (상기 참조 GLP-1 효능제가 GLP-2 수용체에서 검출가능한 활성을 나타내는 경우).

각 수용체에서 이중 효능제의 절대 역가는 GLP-1 효능제 활성과 GLP-2 효능제 활성 사이의 균형보다 훨씬 덜 중요하다는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 상기 이중 효능제 화합물이 두 수용체에서 허용가능한 상대적 역가 수준을 나타내는 한, 절대 GLP-1 또는 GLP-2 역가가 상기 수용체들에서 알려져 있는 효능제의 역가 보다 더 낮다는 것은 완벽하게 허용가능하다. 절대 역가의 어떤 명백한 부족도 필요하다면 용량을 증가시켜서 보충할 수 있다.

이중 효능제의 합성

고체상 또는 액체상 펩티드 합성 방법에 의해 본 발명의 이중 효능제를 합성하는 것이 바람직하다. 본 문맥에서, WO 98/11125, 및 다른 많은 것들 중에서도 Fields, G.B. et al., 2002, "Principles and practice of solid-phase peptide synthesis". In: Synthetic Peptides (2nd Edition), 및 본원의 실시예를 참조할 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 이중 효능제는 수 많은 방법으로 합성 또는 생산될 수 있고, 예를 들어, 상기 방법은 하기를 포함한다:

(a) 고체상 또는 액체상 펩티드 합성 방법에 의해 이중 효능제를 합성하고, 합성된 이중 효능제를 회수하여, 수득하는 단계; 또는

(b) 전구체 펩티드를 코딩하는 핵산 구조물로부터 전구체 펩티드 서열을 발현시키고, 발현 산물을 회수하고, 상기 전구체 펩티드를 변형하여 본 발명의 화합물을 수득하는 단계.

상기 전구체 펩티드는 하나 이상의 비-단백질성 아미노산 (예컨대 Aib)의 도입, 적당한 말단 기 R¹ 및 R²의 도입 등에 의해 변형될 수 있다.

발현은 통상적으로 전구체 펩티드를 코딩하는 핵산으로부터 수행되고, 이는 상기 핵산을 포함하는 세포 또는 무-세포 발현 시스템에서 수행될 수 있다.

고체상 또는 액체상 펩티드 합성에 의해 본 발명의 유사체를 합성하는 것이 바람직하다. 본 문맥에서, WO 98/11125, 및 다른 많은 것들 중에서도 Fields, GB et al., 2002, "Principles and practice of solid-phase peptide synthesis". In: Synthetic Peptides (2nd Edition), 및 본원의 실시예를 참조할 수 있다.

재조합 발현을 위해, 전구체 펩티드를 코딩하는 핵산 단편을 통상적으로 적절한 벡터로 삽입하여 클로닝 또는 발현 벡터를 형성할 것이다. 상기 벡터는 적용 목적 및 타입에 따라 플라스미드, 파지, 코스미드 (cosmid), 미니-크로모좀 (mini-chromosome), 또는 바이러스의 형태일 수 있고, 소정의 세포에서 일시적으로만 발현되는 네이키드 (naked) DNA는 중요한 벡터이다. 바람직한 클로닝 및 발현 벡터 (플라스미드 벡터)는 자율 복제가 가능하여, 이로 인해 후속하는 클로닝을 위한 높은 수준의 발현 또는 높은 수준의 복제를 목적으로 높은 카피 수를 가능하게 한다.

일반적인 개요에서, 발현 벡터는 5'→3' 방향 및 작동가능한 연결에서 하기 특징을 포함한다: 핵산 단편의 발현을 유도하기 위한 프로모터, 선택적으로 (세포외 단계로, 또는 적용가능한 경우, 주변세포질 (periplasma)로) 분비를 가능하게 하는 선두 (leader) 펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 전구체 펩티드를 코딩하는 핵산 단편, 및 선택적으로 종결인자를 코딩하는 핵산 서열. 이들은 부가의 특성들 예컨대 선택가능한 마커 및 복제 기원을 포함할 수 있다. 생산 균주 또는 세포주에서 발현 벡터로 작동할 때, 상기 벡터는 숙주 세포 게놈으로 통합될 수 있는 것이 바람직할 수 있다. 당업자는 적합한 벡터에 매우 익숙하고, 그의 특정 요건에 따라 이를 설계할 수 있다.

본 발명의 벡터는 숙주 세포를 형질전환시켜서 전구체 펩티드를 생산하는데 사용된다. 이러한 형질전환된 세포는 핵산 단편 및 벡터의 증식에 사용되고, 및/또는 전구체 펩티드의 재조합체 생산에 사용되는 배양된 세포 또는 세포주일 수 있다.

바람직한 형질전환된 세포는 미생물 예컨대 박테리아 [예컨대 종 에스케리치아 (Escherichia) (예컨대 이. 콜리 (E. coli)), 바실루스 (Bacillus) (예컨대 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)), 살모넬라 (Salmonella), 또는 미코박테리움 (Mycobacterium) (바람직하게는 비-병원체, 예컨대 엠. 보비스 BCG (M. bovis BCG)), 효모 (예컨대, 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)), 및 원생생물 (protozoans)이 있다. 대안으로서, 상기 형질전환된 세포는 다세포 생물체로부터 유래될 수 있고, 즉 이는 진균 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 식물 세포 또는 동물 세포 예컨대 포유동물 세포일 수 있다. 클로닝 및/또는 최적화된 발현을 위해, 상기 형질전환된 세포는 본 발명의 핵산 단편을 복제할 수 있는 것이 바람직하다. 핵산 단편을 발현하는 세포는 본 발명의 펩티드의 소규모 또는 대규모 제조에 사용될 수 있다.

형질전환된 세포에 의해 전구체 펩티드를 생산할 때, 필수적이지는 않지만, 발현 산물을 배양 배지로 분비시키는 것이 편리하다.

약학적 조성물 및 투여

본 발명의 양상은 본 발명에 따른 이중 효능제, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 담체와 함께 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 약학적 조성물이고, 상기 담체는 약학적으로 허용가능한 담체이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 이중 효능제, 또는 그의 염 또는 용매화물을 담체, 부형제 또는 비히클과 함께 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 이중 효능제, 또는 그의 염 또는 용매화물, 구체적으로 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물은 보관 또는 투여를 위해 제조된 조성물 또는 약학적 조성물로 제제화될 수 있고, 이는 본 발명의 이중 효능제, 또는 그의 염 또는 용매화물의 치료적으로 유효한 양을 포함한다.

염기로 형성된 적합한 염은 금속 염, 예컨대 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염, 예를 들어 나트륨, 칼륨 또는 마그네슘 염; 암모니아 염 및 유기 아민 염, 예컨대 모르폴린, 티오모르폴린, 피페리딘, 피롤리딘, 저급 모노-, 디- 또는 트리-알킬아민 (예컨대, 에틸-tert-부틸-, 디에틸-, 디이소프로필-, 트리에틸-, 트리부틸- 또는 디메틸프로필아민), 또는 저급 모노-, 디- 또는 트리-(히드록시알킬)아민 (예컨대, 모노-, 디- 또는 트리에탄올아민)으로 형성된 염을 포함한다. 내부 염 (internal salt)이 또한 형성될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 화합물이 염기성 모이어티를 포함할 때, 염은 유기산 또는 무기산을 사용하여 형성될 수 있다. 예를 들어, 염은 하기 산으로부터 형성될 수 있다: 포름산, 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 카프로산, 옥살산, 락트산, 시트르산, 타르타르산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 말론산, 만델산, 말산, 프탈산, 염산, 히드로브롬산, 인산, 질산, 황산, 벤조산, 탄산, 요산, 메탄술폰산, 나프탈렌술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, p-톨루엔술폰산 (즉 4-메틸벤젠-술폰산), 캄포르술폰산, 2-아미노에탄술폰산, 아미노메틸포스폰산 및 트리플루오로메탄술폰산 (후자는 또한 트리플릭산 (triflic acid)이라 함)뿐만 아니라 다른 알려져 있는 약학적으로 허용가능한 산. 아미노산 부가 염은 또한 아미노산, 예컨대 리신, 글리신, 또는 페닐알라닌으로 형성될 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 이중 효능제가 약학적으로 허용가능한 산 부가 염의 형태인 것이다.

의약 분야의 당업자에게 알려져 있는 바와 같이, 본 발명의 이중 효능제 화합물 또는 그의 약학적 조성물의 "치료적으로 유효한 양"은 특히 치료되는 피험체 (환자)의 연령, 체중 및/또는 성별에 따라 가변할 것이다. 관련성이 있을 수 있는 다른 요인으로는 고려되는 특정 환자의 신체적 특성, 환자 식이 요법, 병용 투약의 특성, 사용된 특정 화합물(들), 특정 투여 방식, 원하는 약리학적 효과(들) 및 특정 치료적 표시 (therapeutic indication)를 포함한다. 상기 양을 결정할 때 상기 요인들 및 이들의 상관관계는 의약계에 잘 알려져 있기 때문에, 본원에 개시된 흡수장애 및/또는 저등급 염증뿐만 아니라 본원에 개시된 다른 의학적 적응증의 치료 및/또는 예방 및/또는 치유에서 원하는 결과를 달성하는데 필요한 양인 치료적으로 유효한 투여량 수준의 결정은 당업자의 범위 내에 있다.

본원에서 사용되는, 용어 "치료적으로 유효한 양"은 고려된 병태 또는 병리의 증상을 감소시키고, 바람직하게는 상기 병태 또는 병리를 갖는 개체에서 생리학적 반응을 정상화시키는 양을 나타낸다. 증상의 감소 또는 생리학적 반응의 정상화는 당 분야의 통상적인 방법을 사용하여 결정될 수 있고, 고려된 병태 또는 병리에 따라 다양할 수 있다. 일 양상에서, 하나 이상의 이중 효능제, 또는 그의 약학적 조성물의 치료적으로 유효한 양은 측정가능한 생리학적 파라미터를 문제의 병태 또는 병리가 없는 개체에서 파라미터의 실질적으로 동일한 값 (바람직하게는 상기 값의 30% 이내, 더 바람직하게는 20% 이내, 더욱 바람직하게는 10% 이내)으로 회복시키는 양이다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 화합물 또는 약학적 조성물의 투여는 더 낮은 투여량 수준에서 시작하여, 관련 의학적 적응증의 예방/치료에서 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량 수준을 증가시킨다. 이는 치료적으로 유효한 양을 정의할 것이다. 본 발명의 이중 효능제에 있어서, 약학적 조성물 단독 또는 그의 일부로서, 상기 활성 이중 효능제의 인간 투여량은 약 0.01 pmol/kg 내지 500 μmol/kg 체중, 약 0.01 pmol/kg 내지 300 μmol/kg 체중, 0.01 pmol/kg 내지 100 μmol/kg 체중, 0.1 pmol/kg 내지 50 μmol/kg 체중, 1 pmol/kg 내지 10 μmol/kg 체중, 5 pmol/kg 내지 5 μmol/kg 체중, 10 pmol/kg 내지 1 μmol/kg 체중, 50 pmol/kg 내지 0.1 μmol/kg 체중, 100 pmol/kg 내지 0.01 μmol/kg 체중, 0.001 μmol/kg 내지 0.5 μmol/kg 체중, 0.05 μmol/kg 내지 0.1 μmol/kg 체중일 수 있다.

환자 치료를 위해 가장 적합한 치료 용량 및 용법은 치료될 질환 또는 병태, 및 환자의 체중 및 다른 파라미터에 따라 가변될 것이다. 임의의 특정 이론에 국한되지 않고, μg/kg 범위의 용량, 및 기간의 단축 및 연장 또는 치료 빈도는 치료적으로 유용한 결과, 예컨대 특히 소장 질량의 통계적으로 유의한 증가를 산출할 것으로 기대된다. 일부 예에서, 치료 용법은 초기 치료 중단 후에 발생하는 조직 퇴행을 방지하기에 적합한 유지 용량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 인간 사용에 가장 적합한 투여량 크기 및 용량 용법은 본 발명에 의해 수득된 결과에 의해 유도될 수 있고, 적절하게 설계된 임상 시험에서 확인될 수 있다.

효과적인 투여량 및 치료 프로토콜은, 실험실 동물에서 낮은 용량으로 시작하여 그 다음에 효과를 모니터링하면서 투여량을 증가시키고, 또한 용량 용법을 체계적으로 변화시키는 기존의 수단에 의해 결정될 수 있다. 고려된 피험체에 대해 최적의 투여량을 결정할 때 임상의는 수 많은 요인을 고려할 수 있다. 이러한 고려 사항은 당업자에게 알려져 있다.

의학적 병태

광범위한 양상에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위해 본 발명의 이중 효능제를 제공한다.

부가적 양상에서, 본 발명은 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 이중 효능제에 관한 것이다.

본 명세서에 개시된 이중 효능제는 GLP-1 및 GLP-2 모두의 생물학적 활성을 갖는다.

GLP-2는 창자샘에서 줄기세포 증식의 자극, 및 융모에서 아폽토시스의 저해를 통해 소장 점막 상피의 유의한 성장을 유도한다 (Drucker et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996, 93:7911-6). GLP-2는 또한 결장에서 성장 효과를 갖는다. GLP-2는 또한 위 배출 및 위산 분비를 저해하고 (Wojdemann et al. J Clin Endocrinol Metab. 1999, 84:2513-7), 장 장벽 기능을 향상시키며 (Benjamin et al.Gut. 2000, 47:112-9), 글루코스 수송체의 상향조절을 통한 장의 헥소스 수송을 자극하고 (Cheeseman, Am J Physiol. 1997, R1965-71), 장 혈류량을 증가시킨다 (Guan et al. Gastroenterology. 2003, 125, 136-47).

소장에서 GLP-2의 유익한 효과는 장 질환 또는 손상의 치료에서 GLP-2의 사용에 대한 상당한 관심을 불러 일으켰다 (Sinclair and Drucker, Physiology 2005: 357-65). 또한, 화학요법에 의해 유발된 장염, 허혈-재관류 손상 (ischemia-reperfusion injury), 덱스트란 술페이트-유발된 대장염을 포함하는 장 손상의 전임상 모델 및 염증성 장 질환의 유전적 모델에서 GLP-2는 점막 상피 손상을 예방 또는 감소시키는 것으로 나타났다 (Sinclair and Drucker Physiology 2005: 357-65). 상기 GLP-2 유사체 테두글루티드 (Gly2-hGLP-2)는 짧은 창자 증후군 치료에 대해 상표명 Gattex 및 Revestive로 승인되었다.

GLP-1은 글루코스 항상성에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 펩티드 호르몬이다. 영양소 섭취에 반응하여 위장관으로부터 분비될 때, GLP-1은 β-세포로부터 글루코스-자극된 인슐린 분비를 강화한다 (Kim and Egan, 2008, Pharmacol.Rev. 470-512). 또한, GLP-1 또는 그의 유사체는 소마토스타틴 (somatostatin) 분비를 증가시키고 글루카곤 분비를 억제하는 것으로 나타났다 (Holst JJ, 2007, Physiol Rev. 1409-1439).

글루코스-자극된 인슐린 분비에서 GLP-1의 1차적 작용 이외에, GLP-1은 또한 식욕, 음식 섭취, 및 체중의 중요한 조절인자로서 알려져 있다. 더욱이, 위장관에 존재하는 GLP-1 수용체를 통해, GLP-1은 설치류 및 인간 모두에서 위 배출 및 위장관 운동을 억제할 수 있다 (Holst JJ, 2007, Physiol Rev. 1409-1439; Hellstrom et al., 2008, Neurogastroenterol Motil. Jun; 20(6):649-659). 또한, GLP-1은 근육, 간 및 지방 조직과 같은 조직에서 글루코스 항상성 및 지질 대사작용에 참여하는, 주요 췌장외 조직 (extrapancreatic tissue)에서 인슐린-유사 효과를 갖는 것으로 보인다 (Kim and Egan, 2008, Pharmacol.Rev. 470-512).

그러므로, 본 발명의 이중 효능제 화합물은 장 질량을 증가시키고, 장 기능 (구체적으로 장 장벽 기능)을 향상시키며, 장 혈류량을 증가시키거나, 또는 장 손상 또는 기능이상 (구조적 또는 기능적), 예컨대 장 상피 손상을 치유하는데 사용될 수 있다. 이들은 또한 상기 효과에 의해 개선될 수 있는 병태의 예방 또는 치료, 및 위장관 손상과 관련된 이환율을 감소시키는데 사용될 수 있다.

그러므로 상기 이중 효능제는 많은 위장관 장애에서 유용하다. 용어 "위장관"은 본원에서 식도, 위, 소장 (십이지장, 공장, 회장) 및 대장 (맹장, 결장, 직장), 특히 소장 및 결장을 포함하는, 전체 위장관을 포함하는데 사용된다.

그러므로, 상기 이중 효능제가 유익할 수 있는 병태는 흡수장애, 궤양 (임의의 병인, 예컨대, 소화 궤양, 졸링거-엘리슨 증후군, 약제성 궤양, 및 감염 또는 기타 병원체와 관련된 궤양일 수 있음), 짧은-창자 증후군, 컬-드-삭 증후군, 염증성 장 질환 (크론병 및 궤양성 대장염), 과민성 대장 증후군, 낭염, 복강 스프루 (예를 들어 글루텐 유발된 창자병증 또는 복강병으로부터 발생함), 열대 스프루, 저감마글로불린혈증 스프루, 및 화학요법 또는 방사선요법에 의해 유발된 점막염 또는 설사를 포함한다.

상기 이중 효능제는 또한 주로 위장관 조직에 영향을 주지 않지만 장 기능이상으로부터 발생되는 요인에 의해 유발 또는 악화될 수 있는 소정의 병태에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 손상된 장 장벽 기능 (창자 또는 장의 "누출 (leakiness)"로 언급될 수 있음)은 장의 내강으로부터 직접 혈류로, 그러므로 신장, 폐 및/또는 간으로 물질의 통과를 유도할 수 있다. 상기 물질은 지방과 같은 식품 분자를 포함할 수 있고, 이는 비경구적 영양 관련 장 위축, PNALD (비경구적 영양-관련 간 질환), NAFLD (비알콜성 지방간 질환) 및 NASH (비알콜성 지방간염)를 포함하는 간염 및/또는 지방간 질환에 기여한다. 혈류를 통과하는 물질은 또한 전신 염증 (예컨대 혈관 염증)을 일으킬 수 있는 박테리아와 같은 병원체, 및 박테리아성 리포폴리사카리드 (lipopolysaccharide: LPS)와 같은 독소를 포함할 수 있다. 이러한 염증을 종종 "저등급 염증"이라 하고, 대사성 내독소혈증 (하기에 추가로 토의되는, 당뇨병 및 비만 모두에서 발견되는 병태), 원발 쓸개관 간경화증 및 간염의 발병기전에 대한 기여 인자이다. 또한 상기 혈류로 병원체의 진입으로 괴사 소장대장염과 같은 병태를 초래할 수 있다.

저등급 염증은 통증, 열 및 발적 (redness)과 같은 통상의 급성 염증 증상을 특징으로 하지 않지만, 혈액 중 염증 마커, 예컨대 C-반응성 단백질 및 TNF-알파 (종양 괴사 인자 알파)를 포함하는 전-염증성 시토킨의 존재를 통해 검출될 수 있다.

상기 이중 효능제는 또한 주로 다른 조직에 영향을 주지만 위장관 부작용을 갖는 병태에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 췌장염과 같은 염증 병태는 순환하는 염증 매개체의 수준을 증가시켜서, 장 손상 또는 장 기능이상, 예컨대 장벽 기능의 손상을 유발할 수 있다. 일부 상황에서, 이는 보다 심각한 전신 염증 병태 예컨대 패혈증, 또는 장으로 혈액 공급이 중단되는 외과적 절차 또는 기계적 손상 (창자꼬임)을 일으켜서, 최종적으로 허혈-재관류 손상을 일으킬 수 있다.

유사하게, 이식편대 숙주 질환 (GVHD)은 위장관에 실질적인 조직 손상을 일으켜서, 손상된 장벽 기능 및 다른 부작용 예컨대 설사를 일으킬 수 있다. 그러므로, 개시된 이중 효능제는 GVHD에 의해 유발 또는 관련된 장 기능이상 또는 손상의 예방 또는 치료뿐만 아니라, GVHD에 의해 유발 또는 관련된 설사와 같은 부작용의 예방 또는 치료에서 유용할 수 있다.

본원에 개시된 이중 효능제 화합물은 특히 체중 증가의 감소 또는 억제, 위 배출 또는 장 통과 속도의 감소, 음식 섭취의 감소, 식욕의 감소, 또는 체중 감소의 촉진에 유용하다. 체중에서의 효과는 음식 섭취, 식욕 또는 장 통과의 감소를 통해 일부 또는 전부 매개될 수 있다.

그러므로, 본 발명의 이중 효능제는 비만, 병적 비만, 비만-관련 담낭 질환 및 비만-유발된 수면 무호흡의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

체중에서 그의 효과와 무관하게, 본 발명의 이중 효능제는 글루코스 내성 및/또는 글루코스 조절에서 유익한 효과를 가질 수 있다. 상기는 또한 순환하는 콜레스테롤 수준을 조절 (예컨대 향상)하는데 사용되어, 순환하는 트리글리세리드 또는 LDL 수준을 낮추고, HDL/LDL 비율을 증가시킬 수 있다.

그러므로, 이는 당뇨병 (예컨대 제2형 당뇨병, 임신성 당뇨병), 당뇨병전기, 대사 증후군 및 고혈압을 포함하는, 불충분한 글루코스 조절, 글루코스 내성 또는 이상지질혈증 (예컨대 증가된 LDL 수준 또는 감소된 HDL/LDL 비율) 및 관련된 병태의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

상기 많은 병태는 또한 비만 또는 과체중과 관련이 있다. 그러므로 상기 병태에서 이중 효능제의 효과는 전체 또는 부분적으로 체중에서 그의 효과로부터 나올 수 있거나, 또는 이와 무관할 수 있다.

체중에서의 효과는 치료적 또는 미용적일 수 있다.

본원에 개시된 화합물의 이중 효능제 활성은, 상기 2개의 활성이 서로 보완될 수 있기 때문에 개시된 많은 병태에서 특히 유익할 수 있다.

예를 들어, 흡수장애는 위장관 (GI)을 통한 아미노산, 당, 지방, 비타민 또는 미네랄과 같은 수분 및/또는 식품 영양물질의 흡수에서의 비정상으로 인해, 영양실조 및/또는 탈수를 일으키는 병태이다. 흡수장애는 장관 (intestinal tract)에 대한 물리적 (예컨대 외상적) 또는 화학적 손상의 결과일 수 있다. 본 명세서에 개시되는 이중 효능제는 장 장벽 기능의 향상, 위 배출의 감소 및 장 흡수를 증가시키면서, 동시에 장 통과 시간을 정상화시킬 수 있다. 이는 영양물질 및 액체의 흡수를 증가시키도록 환자를 도울 뿐만 아니라, 식사-자극된 대장 운동과 관련된 환자의 사회적 문제를 완화시킬 수 있다.

또한, 장 기능 및 대사 장애는 밀접하게 상관 관계가 있어 서로의 발병 또는 증상에 기여할 수 있다.

전술한 바와 같이, 비만은 저등급 염증과 관련이 있다 (때로는 "비만-관련된 염증"을 나타냄). 또한 일반적으로 비만 (다른 증후군과 함께)은 혈관 투과성을 증가시켜서 병원체 및 LPS와 같은 독소를 장관의 세포벽으로 진입하게 하여 염증을 일으키는 것으로 알려져 있다. 염증 반응으로 인한 변화는 원인과 관계없이 또한 손상이 일어나는 장소와 관계 없이 본질적으로 동일하다. 상기 염증 반응은 급성 (단기 수명) 또는 만성 (장기 지속)일 수 있다.

예를 들어 비만인 마우스 (ob/ob 및 db/db 마우스)는 점막 장벽 기능이 손상되어 증가된 저등급 염증을 나타낸다고 입증되었다 (Brun et al., 2007, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 292: G518-G525, Epub 5 Oct 2006). 이러한 관찰은 고지방식으로 유지하는 C57BL6/J 마우스 (Cani et al., 2008, Diabetes, vol. 57, 1470-1481) 및 비만이 아닌 당뇨병 마우스 (non-obese diabetic mice) (Hadjiyanni et al., 2009, Endocrinology, 150(2): 592-599)로 더 확대하였다.

Cani 및 그의 동료들 (Gut; 2009, 58:1091-1103)은 ob/ob 마우스에서 장 미생물총의 조절로 장 장벽 기능이상을 감소시키고 GLP-2 의존성 경로를 통한 전신 염증을 감소시킨다고 보고하였다. 또한 비만 및 당뇨병 환자에서 관찰되는 증가된 장 투과성은 질병 진행에 있어서 이전에 예상되었던 것보다 더 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 장 투과성이 증가하면 장 장벽을 통한 박테리아성 리포폴리사카리드 (LPS) 수송을 증가시킨다. 상기 증가된 LPS는 면역 세포, 예컨대 순환하는 마크로파지 및 신체 장기 중에 존재하는 마크로파지를 활성화시켜서, 많은 질병의 발병기전에 관여할 수 있는 저등급 만성 염증을 유발한다. 이러한 현상을 대사성 내독소혈증 (ME)이라 한다.

상기 염증 과정은 또한 인슐린 저항 및 다른 대사 장애와 같이, 비만인 개체에서 대사 기능이상을 일으키는 역할을 할 수 있다.

그러므로, 본 발명의 이중 효능제 화합물은 특히 비만 또는 과체중 개체에서 그의 활성 중 GLP-1 효능제 성분 및/또는 그의 활성 중 GLP-2 성분을 통한 유익한 효과를 발휘하여, 저등급 염증의 예방 또는 치료에 특히 유용할 수 있다.

본 발명의 이중 효능제에 의한 치료의 치료적 효능은 융모 형태를 검사하기 위한 장 생검 (enteric biopsy), 영양 흡수의 생화학적 평가, 장 투과성의 비-침습적 결정, 환자 체중 증가, 또는 상기 병태와 관련된 증상 개선에 의해 모니터될 수 있다.

부가적 양상에서, 본 발명의 이중 효능제, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 치료용 키트를 제공한다.

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 양상을 설명하기 위해 제공되며, 본 발명의 범위를 어떠한 방법으로도 제한하려는 것은 아니다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 양상을 설명하기 위해 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.

물질 및 방법

일반적인 펩티드 합성

약어 및 공급자에 대한 목록이 하기 표에 제공된다

장치 및 합성 전략

곁사슬 관능성을 위한 적합한 통상의 보호기 및 N-α-아미노 보호기로서 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc)을 사용하여 고체상 펩티드 합성 절차에 따라 CEM Liberty 펩티드 합성장치 또는 Symphony X 합성장치와 같은 펩티드 합성장치에서 회분식으로 펩티드를 합성하였다.

폴리머 지지체 기반 수지로서, 예컨대 TentaGel^TM을 사용하였다. 사용 전에 DMF에 팽윤시킨 수지를 상기 합성장치에 로딩하였다.

커플링

CEM Liberty 펩티드 합성장치

Fmoc-보호된 아미노산 용액 (4 당량)을 커플링 시약 용액 (4 당량) 및 염기 용액 (8 당량)과 함께 상기 수지에 첨가하였다. 상기 혼합물을 마이크로웨이브 장치에 의해 70-75℃로 가열시키고 5분 동안 커플링시키거나, 또는 열 없이 60분 동안 커플링시켰다. 상기 커플링 중에 상기 혼합물을 통해 질소를 버블링시켰다.

Symphony X 합성장치

상기 커플링 용액을 하기 순서로 반응용기로 옮겼다: 아미노산 (4 당량), HATU (4 당량) 및 DIPEA (8 당량). 상기 커플링 시간은 달리 명시하지 않는 한 실온 (RT)에서 10분이다. 상기 수지를 DMF (5 x 0,5 min)로 세척하였다. 반복된 커플링 경우에, 상기 커플링 시간은 모든 경우에 RT에서 45분이다.

탈보호화

CEM Liberty 펩티드 합성장치

상기 Fmoc 기를 DMF 중 피페리딘 또는 다른 적당한 용매를 사용하여 탈보호시켰다. 상기 탈보호화 용액을 상기 반응 용기에 첨가하였고, 혼합물을 30초 동안 가열하여, 대략 40℃에 도달하였다. 상기 반응 용기를 배수시켰고, 새로운 탈보호화 용액을 첨가하였고, 후속하여 70-75℃로 3분 동안 가열하였다. 상기 반응 용기를 배수시킨 후에, 상기 수지를 DMF 또는 다른 적당한 용매로 세척하였다.

Symphony X 합성장치

Fmoc 탈보호화는 2.5분 동안 DMF 중 40% 피페리딘을 사용하여 수행하였고, 동일한 조건을 사용하여 반복하였다. 상기 수지를 DMF (5 x 0,5 min)로 세척하였다.

절단

건조된 펩티드 수지를 TFA 및 적당한 스캐빈저 (scavenger)로 대략 2시간 동안 처리하였다. 상기 여과물의 부피를 감소시켰고, 조질의 펩티드를 디에틸에테르를 첨가하여 침전시켰다. 조질의 펩티드 침전물을 디에틸에테르로 수회 세척하였고, 마지막으로 건조시켰다.

조질 펩티드의 HPLC 정제

완충액 A (0.1% 포름산, aq.) 또는 A (0.1% TFA, aq.) 및 완충액 B (0.1% 포름산, 90% MeCN, aq.) 또는 B (0.1% TFA, 90% MeCN, aq.)의 적합한 구배를 갖는 유속 20-40 ml/분을 사용하여, 컬럼, 예컨대 5 x 25 cm Gemini NX 5u C18 110A 컬럼 및 분획물 수집장치가 구비된, 이중 구배 적용을 위해, 331/332 펌프 조합을 구비한 Gilson GX-281과 같은 기존의 HPLC 장치를 사용하는 분취용 (preparative) 역상 HPLC에 의해 조질의 펩티드를 정제하였다. 분획물을 분석용 HPLC 및 MS로 분석하였고, 선택된 분획물들을 모으고 (pooled), 동결건조하였다. 최종 산물은 HPLC 및 MS로 특성화하였다.

분석용 HPLC

오토 샘플러, 탈기장치, 20 μl 유 세포 및 Chromeleon 소프트웨어를 구비한 분석용 HPLC (Agilent 1100/1200 시리즈)에 의해 최종 순도를 결정하였다. 상기 HPLC는 분석용 컬럼, 예컨대 Kinetex 2.6 μm XB-C18 100A 100x4,6 mm 컬럼을 사용하여 40℃에서 유속 1.2 ml/분으로 작동하였다. 상기 화합물을 검출하였고 215 nm에서 정량화하였다. 완충액 A (0.1% TFA, aq.) 및 완충액 B (0.1% TFA, 90% MeCN, aq.).

질량 분광법

최종 MS 분석은, 록-매스 보정 (lock-mass calibration)을 갖춘 전기분무 검출장치 및 MassLynx 소프트웨어를 구비한, 기존의 질량 분광법, 예컨대 Waters Xevo G2 Tof에서 결정하였다. 이는 크로마토그램에 명시된 바와 같이 직접 주입 및 15V (1 TOF), 30 V (2 TOF) 또는 45 V (3 TOF)의 콘 전압 (cone voltage)을 사용하여 포지티브 모드로 작동하였다. 정밀도는 5 ppm이고, 통상적인 분해능은 15,000-20,000이었다.

GLP-1 및 GLP-2 수용체 효능 분석

본 발명의 펩티드는 GLP-1 및 GLP-2 효능제 모두로서 기능하여, GLP-1 수용체 및 GLP-2 수용체 각각을 활성화하였다. GLP-1 및 GLP-2 수용체 활성을 측정하기 위한 하나의 유용한 인 비트로 분석은, 많은 생물학적 과정에 필수적인 제2 전달인자이고, 세포 기능을 조절하는 가장 편재되어 있는 기전들 중 하나인 cAMP, 즉 3'-5'-고리형 아데노신 모노포스페이트의 정량화이다. 예로는 Perkin Elmer제의 cAMP AlphaScreen® 분석이 있고, 이는 GLP-1 R 또는 GLP-2 R을 안정하게 발현하는 HEK293 세포에서 GLP-1 및 GLP-2 수용체 활성화 시에 cAMP 반응을 정량화하는데 사용되었다. cAMP의 세포내 수준의 증가를 유도하는 시험 화합물이 상기 분석에서 시험될 수 있고, 반응을 포지티브 및 네가티브 대조군 (비히클)에 대해 정규화하여 곡선 피팅을 위한 4-파라미터 로지스틱 (4-parameter logistic: 4PL) 비선형 모델을 사용하는 농도 반응 곡선으로부터 EC50 및 최대 반응을 산출하였다.

실시예 1: 화합물의 합성

합성된 화합물

하기 표 1의 화합물을 상기 기술을 사용하여 합성하였다.

단지 예시를 위해, 2개의 선택된 화합물들의 합성을 하기에 상세하게 설명하였다.

화합물 2의 합성

Hy-H[Aib]EGTFSSELATILDEQAARDFIAWLIAHKITD-OH

고체상 펩티드 합성을 표준 Fmoc 화학을 사용하여 Symphony X 합성장치에서 수행하였다. TentaGel S PHB Asp(tBu)Fmoc (1,22 g; 0.23 mmol/g)를 사용 전에 DMF (10 ml)에 팽윤시켰고, 상기 Fmoc-기를 상기에 개시된 절차에 따라 탈보호하였다.

커플링

상기 순서에 따라 적절하게 보호된 Fmoc-아미노산을 커플링 시약으로서 HATU를 사용하여 상기에 개시된 바와 같이 커플링하였다. 모든 커플링은 R.T.에서 수행되었다. 합성을 촉진하기 위해서, 슈도프롤린 (pseudoproline)을 사용하였다: 위치 6 및 7에서 Fmoc-Phe-Ser(psi Me,Mepro)-OH. 상기 슈도프롤린은 Fmoc-아미노산에 대해 상기에 개시된 표준 절차에 따라 커플링되었다.

탈보호화

Fmoc 탈보호화를 전술한 절차에 따라 수행하였다.

고체 지지체로부터 펩티드의 절단

펩티드-수지를 EtOH (3 x 10 ml) 및 Et2O (3 x 10 ml)로 세척하였고, 실온 (r.t.)에서 일정 중량으로 건조시켰다. 상기 펩티드를 상기 수지로부터, TFA/TIS/H₂O (95/2,5/2,5; 40 ml, 2 h; r.t.)로 처리하여 절단하였다. 상기 여과물의 부피를 감소시켰고, 조질의 펩티드는 디에틸에테르를 첨가하여 침전시켰다. 조질의 펩티드 침전물을 디에틸에테르로 수회 세척하였고, 최종적으로 실온에서 일정 중량으로 건조시켜서 950 mg의 조질의 펩티드 산물 (순도 ~48%)을 수득하였다.

조질 펩티드의 HPLC 정제

5 x 25 cm Gemini NX 5u C18 110A, 컬럼 및 분획물 수집장치를 구비하고, 완충액 A (0.1% TFA, aq.) 및 완충액 B (0.1% TFA, 90% MeCN, aq.)의 구배가 47분내에 30%B에서 60%B의 구배로 30 ml/분으로 수행되는, 이중 구배 적용을 위해 331/332 펌프 조합을 구비한 Gilson GX-281을 사용하는 분취용 역상 HPLC에 의해 조질의 펩티드를 정제하였다. 분획물을 분석용 HPLC 및 MS에 의해 분석하였고, 관련 분획물들을 모았고, 동결건조하여 224 mg을 수득하였고, 전술한 바와 같이 HPLC 및 MS로 특성화하여 순도는 93%이다. 산출된 단일동위원소 (monoisotopic) MW = 3682.86, 실제값 3682.87.

화합물 7의 합성

Hy-H[Aib]EGSFTSELATILDEQAARDFIAWLIYHKITD-OH

고체상 펩티드 합성을 표준 Fmoc 화학을 사용하여 Symphony X 합성장치에서 수행하였다. TentaGel S PHB Asp(tBu)Fmoc (1.19 g; 0.23 mmol/g)를 사용 전에 DMF (10 ml)에 팽윤시켰고, 상기 Fmoc-기를 상기에 개시된 절차에 따라 탈보호하였다.

커플링

상기 순서에 따라 적절하게 보호된 Fmoc-아미노산을 커플링 시약으로서 HATU를 사용하여 상기에 개시된 바와 같이 커플링하였다. 모든 커플링은 R.T.에서 수행되었다. 합성을 촉진하기 위해서, 슈도프롤린을 사용하였다: 위치 6 및 7에서 Fmoc-Phe-Thr(psi Me,Mepro)-OH. 상기 슈도프롤린은 Fmoc-아미노산에 대해 상기에 개시된 표준 절차에 따라 커플링되었다.

탈보호화

Fmoc 탈보호화를 전술한 절차에 따라 수행하였다.

고체 지지체로부터 펩티드의 절단

펩티드-수지를 EtOH (3 x 10 ml) 및 Et2O (3 x 10 ml)로 세척하였고, 실온 (r.t.)에서 일정 중량으로 건조시켰다. 상기 펩티드를 상기 수지로부터, TFA/TIS/H₂O (95/2,5/2,5; 40 ml, 2 h; r.t.)로 처리하여 절단하였다. 상기 여과물의 부피를 감소시켰고, 조질의 펩티드는 디에틸에테르를 첨가하여 침전시켰다. 조질의 펩티드 침전물을 디에틸에테르로 수회 세척하였고, 최종적으로 실온에서 일정 중량으로 건조시켜서 750 mg의 조질의 펩티드 산물 (순도 ~30%)을 수득하였다.

조질 펩티드의 HPLC 정제

5 x 25 cm Gemini NX 5u C18 110A, 컬럼 및 분획물 수집장치를 구비하고, 완충액 A (0.1% TFA, aq.) 및 완충액 B (0.1% TFA, 90% MeCN, aq.)의 구배가 47분내에 30%B에서 60%B의 구배로 30 ml/분으로 수행되는, 이중 구배 적용을 위해 331/332 펌프 조합을 구비한 Gilson GX-281을 사용하는 분취용 역상 HPLC에 의해 조질의 펩티드를 정제하였다. 분획물을 분석용 HPLC 및 MS에 의해 분석하였고, 관련 분획물들을 모았고, 동결건조하여 53 mg을 수득하였고, 전술한 바와 같이 HPLC 및 MS로 특성화하여 순도는 84%이다. 산출된 단일동위원소 MW = 3774.89, 실제값 3774.87.

실시예 2: GLP-1R 및 GLP-2R EC ₅₀ 측정

인간 GLP-1 수용체를 발현하는 세포주의 생성

인간 글루카곤-유사 펩티드 1 수용체 (GLP-1R)를 코딩하는 cDNA (1차 기탁 번호 P43220)는 cDNA BC112126 (MGC:138331/IMAGE:8327594)으로부터 클로닝되었다. 상기 GLP-1-R을 코딩하는 DNA는 서브클로닝을 위해 말단 제한 부위를 코딩하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다. 5'-말단 프라이머는 효율적인 번역을 위해 근처의 Kozak 공통 서열을 추가로 코딩하였다. GLP-1-R을 코딩하는 DNA의 정확도는 DNA 시퀀싱으로 확인되었다. GLP-1-R을 코딩하는 PCR 산물은 네오마이신 (G418) 저항 마커를 포함하는 포유동물 발현 벡터로 서브클로닝되었다. GLP-1-R을 코딩하는 포유동물 발현 벡터를 HEK293 세포로 표준 칼슘 포스페이트 형질감염 방법에 의해 형질감염시켰다. 형질감염되고 48시간 후에, 세포를 제한된 희석 클로닝을 위해 시딩하였고, 배양 배지에서 1 mg/ml G418로 선택되었다. G418 선별에서 3주 후에, 클론을 하기에 개시된 바와 같이 선택하고, 기능적 GLP-1 수용체 역가 분석에서 시험하였다. 화합물 프로파일링에서 사용하기 위해 하나의 클론이 선택되었다.

인간 GLP-2 수용체를 발현하는 세포주의 생성

hGLP2-R을 이미지 클론 (Image clone): 5363415 (11924-I17)으로서 MRC-geneservice, Babraham, Cambridge로부터 구입하였다. 포유동물 발현 벡터로의 서브클로닝을 위해, 서브클로닝을 위한 프라이머는 DNA-Technology, Risskov, Denmark로부터 입수하였다. PCR 반응을 위해 사용된 5' 및 3' 프라이머는 클로닝을 위한 말단 제한 부위를 포함하고, 5' 프라이머의 상황은 ORF에 의해 코딩된 산물 서열의 변화 없이 Kozak 공통 서열로 변형되었다. 표준 PCR 반응은 전체 부피 50㎕의 전술한 프라이머 및 폴리머라제 헤르쿨라제 II 퓨전 (Polymerase Herculase II Fusion)과 주형으로서 이미지 클론 5363415 (11924-I17)를 사용하여 수행되었다. 생성된 PCR 산물은 GFX PCR 및 Gel 밴드 정제 키트를 사용하여 정제되었고, 제한 효소로 소화되었고, 신속 DNA 결찰 키트를 사용하여 포유동물 발현 벡터로 클로닝되었다. 결찰 반응으로 XL10 Gold Ultracompetent 세포로 형질전환되었고, Endofree Plasmid maxi 키트를 사용하여 DNA 생산을 위한 콜로니를 선택하였다. 후속하는 서열 분석은 MWG Eurofins, Germany에 의해 수행되었다. 상기 클론은 hGLP-2 (1-33) 수용체, 스플라이스 변이체 (splice variant) rs17681684인 것으로 확인되었다.

HEK293 세포는 리포펙타민 플러스 형질감염 방법 (Lipofectamine PLUS transfection method)을 사용하여 형질감염되었다. 형질감염 전날, HEK293 세포를 2개의 T75 플라스크에 항생제가 없는 세포 배양 배지 중에 2×10⁶ 세포 / T75 플라스크의 밀도로 시딩하였다. 형질감염 당일에, 세포를 1x DPBS로 세척하였고, 배지를 5 mL / T75 플라스크의 부피로 Optimem으로 대체시킨 후에 리포펙타민-플라스미드 복합체를 T75 플라스크 중에 세포로 온화하게 적상으로 첨가하였고, 3시간 후에 성장 배지로 대체하였고 다시 24시간 후에 500μg/mL G418이 보충된 성장 배지로 첨가하였다. G418 선별에서 4주 후에, 클론을 하기에 개시되는 바와 같이 선택하고, 기능적 GLP-2 수용체 역가 분석에서 시험하였다. 화합물 프로파일링에서 사용하기 위해 하나의 클론이 선택되었다.

GLP-1R 및 GLP-2 수용체 역가 분석

Perkin Elmer제 cAMP AlphaScreen® 분석을 사용하여 GLP1 및 GLP2 수용체 각각의 활성화에 대한 cAMP 반응을 정량화하였다. 엑센딘-4는 GLP1 수용체 활성화에 대한 참조 화합물로 사용되었고, 테두글루티드는 GLP2 수용체 활성에 대한 참조 화합물로 사용되었다. cAMP의 세포내 수준의 증가를 유도하는 시험 화합물로부터의 데이터를 포지티브 및 네가티브 대조군 (비히클)에 대해 정규화하여 농도 반응 곡선으로부터 EC₅₀ 및 최대 반응을 산출하였다. 결과를 하기 표 2에 개시하였다.

N/A = 검출가능한 활성 없음

실시예 3: 용해도 평가

HCl로 pH 2.5로 조정된 탈염수 중에 시험 펩티드 (2 mg/ml; 펩티드의 칭량된 양으로부터 결정됨)의 원료 용액을 제조하였고, 알리코트 (aliquot)를 100 mM 아세테이트 완충액 (pH 4.0 및 pH 5.0), 100 mM 히스티딘 완충액 (pH 6.0 및 pH 7.0) 및 100 mM 포스페이트 완충액 (pH 6.0, pH 7.0 및 pH 7.5) 각각 중에 1:1로 희석시켰고, 표준의 평면-바닥, 비-멸균된 96-웰 UV 마이크로플레이트에 로딩하였다. 280 및 325 nm에서 시료의 흡광도 (단일 시료, n=1)는 흡광도-기반 플레이트 판독기에서 측정되었고, 이는 주위 온도 (통상적으로 25℃)로 예열되었다. ≥1 mg/ml의 펩티드 용해도에 대한 탁도 흡광도 기준은 325 nm에서 ≤ 0.025 흡광도 유닛의 흡광도였다 (이는 플레이트에서 8개의 완충액 시료의 표준 편차의 5 내지 6배임). 본 발명의 펩티드에 대한 용해도 데이터는 하기 표 3에 나타내었다.

*SS는 용해도 ≥ 1mg/ml을 나타냄

**II는 용해도 < 1 mg/ml을 나타냄

실시예 4: 화학적 안정성

각 시험 펩티드의 시료를 MilliQ^TM 물에 용해시켰고, 상기 용액의 pH를 HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH 6, 7, 7.5 또는 9로 조정하였다. 최종 펩티드 농도는 0.2 mg/ml이었다. 시료를 유리 바이알에 넣었고, 40 ℃에서 인큐베이트하였다. 시료를 아세토니트릴/TFA/물 용출 시스템을 사용하는 구배 용출로 C18 컬럼에서 RP-HPLC에 의해 분석하였다. 인큐베이션 시간 T = t (시간 T = 0에 대해) 이후에 주 피크의 면적-퍼센트 (면적-%)를 220 nm에서 UV 분광법에 의해 결정하였다.

순도를 먼저 하기와 같이 결정하였다:

순도 (면적-%) = (주 피크의 면적/모든 피크의 총 면적) x 100.

그 다음에 순도는 하기와 같이 고려된 펩티드에 있어서 각 pH 값에 대해 시간 0 (T=0)에서 순도를 100으로 설정하여 시점들 사이에서 정규화되었다:

시간 t (T=t)에서 정규화된 면적-% = [면적-% (T=t)/면적-% (T=0)] x 100.

14일 인큐베이션 후에 화학적 안정성 평가 결과 (정규화된 순도 값의 형태)를 하기 표 4에 요약하였다.

설명: A ->90% 정규화된 안정성; B ->80% 안정성; C -<80% 정규화된 안정성.

실시예 5: 정상 마우스에서 공복시 글루코스 및 장 중량에서의 효과

정상적인 먹이를 먹인 (Normal chow-fed) C57BL/6J 수컷 마우스를 사용하였다. 상기 마우스를 표준 수용 조건, 광-, 온도-, 및 습도-조절된 방에 두었다 (12:12 h 명-암 주기, 광주기 06.00-18.00 h; 20-22℃; 50-80% 상대 습도). 각 투여 그룹은 6마리의 동물로 구성되었다. 마우스에게 1일 1회 시험 화합물 또는 비히클 250 nmol/kg을 4일 동안 피하 투여로 투여하였다.

0일에 마우스를 금식시켰고, 혈중 글루코스 수준은 펩티드를 단일 s.c. 주사 후에 측정하였다. 동물을 3일에 최종 투여하고 24시간 후에 희생시켰고, 소장 습윤 중량을 측정하였다.

결과

모든 시험 화합물 (250 nmol/kg)은 공복시 혈중 글루코스 수준이 비히클 그룹과 비교하여 감소되었다 (표 5).

시험 화합물은 소장 습윤 중량이 비히클-처리된 마우스와 비교하여 증가하였다 (표 5).

SEQUENCE LISTING <110> Zealand Pharma A/S <120> GLP-1/GLP-2 DUAL AGONISTS <130> GRF/FP7327562 <140> PCT/EP2017/082289 <141> 2017-12-11 <150> DK PA201600756 <151> 2016-12-09 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens glucagon-like peptide 2 (GLP-2) <400> 1 His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens glucagon-like peptide 1 (GLP-1) <400> 2 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is S, E or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is L, M or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is A, N or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa is D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa is E, A or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa is Q, E, L or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa is A, V or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is R or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa is D, L or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa is A, N or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa is I, Y, Q, H or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa is A, E, H, Y, L, K, Q, R or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is H, Y, K or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa is D or E <400> 3 His Xaa Glu Gly Xaa Phe Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Thr Ile Leu Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Lys Ile Thr 20 25 30 Xaa <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <400> 4 Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile 1 5 10 15 Ala <210> 5 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <220> <221> misc <222> (5)..(5) <223> Xaa is S or T <220> <221> misc <222> (7)..(7) <223> Xaa is S or T <220> <221> misc <222> (28)..(28) <223> Xaa is A, E, H, Y or L <220> <221> misc <222> (29)..(29) <223> Xaa is H, Y or Q <400> 5 His Xaa Glu Gly Xaa Phe Xaa Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Xaa Xaa Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 6 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 6 His Xaa Glu Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 7 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 7 His Xaa Glu Gly Thr Phe Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 8 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 8 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 9 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 9 His Xaa Glu Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Glu His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 10 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 10 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Glu His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 11 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 11 His Xaa Glu Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile His His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 12 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 12 His Xaa Glu Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Tyr His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 13 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 13 His Xaa Glu Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Leu His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 14 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 14 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Asp Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 15 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 15 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 16 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 16 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Gly 1 5 10 15 Lys Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 17 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 17 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu His Ala His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 18 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 18 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Gln Ala His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 19 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 19 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Tyr Ala His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 20 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 20 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 21 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 21 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Lys His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 22 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 22 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Arg His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 23 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 23 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ser His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 24 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 24 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Gln Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 25 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 25 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Tyr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 26 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 26 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu His Gln His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 27 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 27 His Xaa Glu Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu His Ala His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 28 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 28 His Xaa Glu Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Tyr Glu His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 29 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 29 His Xaa Glu Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Gln Ala His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 30 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 30 His Xaa Glu Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Gln Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 31 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 31 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Gln Ala Gln Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 32 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 32 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ser Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu His Ala Gln Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 33 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 33 His Xaa Glu Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Tyr Ala His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 34 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 34 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Asp Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Gln Ala Gln Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 35 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 35 His Xaa Glu Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Tyr Arg His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 36 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 36 His Xaa Glu Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Gly 1 5 10 15 Lys Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 37 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 37 His Xaa Glu Gly Thr Phe Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Gly 1 5 10 15 Lys Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 38 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 38 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Ala His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 39 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 39 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ser Trp Leu Ile Ala His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 40 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 40 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Lys Ala His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 41 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 41 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Lys Ser Tyr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 42 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 42 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Lys Glu Gln Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 43 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <400> 43 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 44 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 44 His Xaa Glu Gly Thr Phe Ser Ser Glu Leu Ser Thr Ile Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ser Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala His Lys Ile Thr 20 25 30 Glu <210> 45 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <400> 45 His Gly Glu Gly Ser Phe Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 46 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GLP-2 Dual Agonist peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 46 His Xaa Glu Gly Ser Phe Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln His Lys Ile Thr 20 25 30 Asp

Claims

하기 화학식으로 표시되는 GLP-1/GLP-2 이중 효능제, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
R¹-X^*-U-R²
상기에서:
R¹은 수소 (Hy), C_1-4 알킬, 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸이고;
R²는 NH₂ 또는 OH이고;
X^*는 하기 화학식 I의 펩티드이고:
H-X2-EG-X5-F-X7-X8-E-X10-X11-TIL-X15-X16-X17-A-X19-X20-X21-FI-X24-WL-X27-X28-X29-KIT-X33 (I)
상기에서:
X2는 Aib이고;
X5는 S 또는 T이고;
X7은 S 또는 T이고;
X8은 S 또는 D이고;
X10은 L이고;
X11은 A 또는 S이고;
X15는 D 또는 E이고;
X16은 E 또는 G이고;
X17은 Q 또는 K이고;
X19는 A 또는 S이고;
X20은 R이고;
X21은 D 또는 E이고;
X24는 A, N 또는 S이고;
X27은 I, Y, Q, 또는 K이고;
X28은 A, E, H, Y, 또는 L이고;
X29는 H, Y, 또는 Q이고;
X33은 D이고;
U는 부재하거나 또는 K 및 k로부터 각각 독립적으로 선택되는 1-15개의 잔기의 서열이며;
상기 X5 및 X7 중 적어도 하나는 T이다.
청구항 1에 있어서,
X8은 S이고;
X7은 T이고;
X5는 T이고;
X29는 H이고; 및
X27은 I 인 것중 하나 이상인 것인 이중 효능제, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
청구항 1에 있어서,
X27은 Q이고 X29는 Q 이거나;
X28은 A이고 X29는 H 이거나; 또는
X28은 E이고 X29는 H인 것인 이중 효능제, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
청구항 1에 있어서,
X11은 A 이거나;
X16은 E이고, X17은 Q 이거나;
X16은 G이고 X17은 K 이거나;
X11은 A 이고, X16은 E이고, X17은 Q이거나; 또는
X11은 A 이고, X16은 G이고, X17은 K인 것인 이중 효능제, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
청구항 1에 있어서,
X11은 S이고, X15는 E이거나;
X11은 S이고, X19는 S이거나;
X11은 S이고, X21은 E이거나;
X15는 E이고, X19는 S이거나;
X15는 E이고, X21은 E이거나;
X11은 S이고, X15는 E이고, X19는 S이거나;
X11은 S이고, X15는 E이고, X21은 E이거나;
X11은 S이고, X19는 S이고, X21은 E이거나;
X15는 E이고, X19는 S이고, X21은 E이거나; 또는
X11은 S이고, X15는 E이고, X19는 S이고, X21은 E인 것인 이중 효능제, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
청구항 1에 있어서, 상기 잔기 X8-X24는 서열 SELATILDEQAARDFIA와 비교하여 최대 4개의 변경을 포함하고, 선택적으로 X27은 I이고, 추가로 선택적으로 X28은 A인 것인 이중 효능제, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
청구항 6에 있어서, 상기 X27-X29에서 잔기는 하기로부터 선택되는 서열을 갖는 것인 이중 효능제, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
IAH;
HAH;
QAH;
YAH;
IAQ;
IAY;
YEH;
IQH;
IKH;
IRH;
ISH;
HQH;
QAQ;
HAQ;
YAH;
YRH;
KAH;
KSY;
KEQ;
IEH; 및
ILH.
청구항 1에 있어서, 상기 X^*는 하기 화학식 II의 펩티드인 것인 이중 효능제, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
H[Aib]EG-X5-F-X7-SELATILDEQAARDFIAWLI-X28-X29-KITD (II)
상기에서
X5는 S 또는 T이고;
X7은 S 또는 T이고;
X28은 A, E, H, Y 또는 L이고;
X29는 H, Y 또는 Q이며;
상기 X5 및 X7 중 적어도 하나는 T이고,
선택적으로 상기 X5는 S이고 X7은 T이며;
X5는 T이고 X7은 S이며;
X5는 T이고 X7은 T인 것인 이중 효능제, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
청구항 1에 있어서, 상기 U는 부재하거나, 상기 U는 1-15개의 리신 잔기의 펩티드 서열이고,
상기 U는 선택적으로 K₃, K₄, K₅, K₆ , K₇, k₃, k₄, k₅, k₆ 또는 k₇인 것인 이중 효능제, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
청구항 1에 있어서,
상기 R¹은 Hy 이고;
R²는 OH 이고; 및
상기 X^*는 하기 서열을 갖는 것 중 하나 이상인 이중 효능제, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
청구항 10에 있어서, 하기인 것인 이중 효능제, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물:
활성성분으로서 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 이중 효능제, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 포함하는 약학적 조성물로서,
상기 약학적 조성물은
i) 흡수장애 (malabsorption), 궤양, 짧은-창자 증후군, 컬-드-삭 증후군 (cul-de-sac syndrome), 염증성 장 질환, 과민성 대장 증후군, 낭염 (pouchitis), 복강 스프루 (celiac sprue), 열대 스프루 (tropical sprue), 저감마글로불린혈증 스프루 (hypogammaglobulinemic sprue), 화학요법 또는 방사선요법에 의해 유발된 점막염 (mucositis), 화학요법 또는 방사선요법에 의해 유발된 설사, 저등급 염증 (low grade inflammation), 대사성 내독소혈증 (metabolic endotoxemia), 괴사 소장대장염 (necrotising enterocolitis), 원발 쓸개관 간경화증 (primary biliary cirrhosis), 간염, 지방간 질환, 또는 염증 병태의 위장관 부작용; 또는
ii) 비만, 병적 비만 (morbid obesity), 비만-관련 담낭 질환, 비만-유발된 수면 무호흡, 불충분한 글루코스 조절 (inadequate glucose control), 글루코스 내성 (glucose tolerance), 이상지질혈증, 당뇨병, 당뇨병전기 (pre-diabetes), 대사 증후군 또는 고혈압의
예방 또는 치료 방법에서 사용되는 것인 약학적 조성물.
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