ES2291017T3 - Efectos inotropicos y diureticos de la exendina y glp-1. - Google Patents

Efectos inotropicos y diureticos de la exendina y glp-1. Download PDF

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Abstract

Un uso de un compuesto para fabricar un medicamento para tratar, prevenir o aliviar una afección o trastorno asociados con la hipervolemia tóxica en un individuo, en el que dicho compuesto se selecciona del grupo constituido por: (a) una exendina o un agonista de exendina, y (b) un GLP-1 o un agonista de GLP-1.

Description

Efectos inotrópicos y diuréticos de la exendina y GLP-1.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos para aumentar el flujo de orina, que comprenden administrar una cantidad eficaz del péptido similar a glucagón de tipo 1[7-36]amida (abreviado "GLP-[7-36]NH_{2}" o simplemente "GLP-1"), una exendina, o un agonista de exendina o GLP-1. También se describen procedimientos para aumentar la excreción urinaria de sodio y disminuir la concentración de potasio en la orina. Los procedimientos son útiles para tratar afecciones o trastornos asociados con la hipervolemia tóxica, tales como la insuficiencia renal, insuficiencia cardíaca congestiva, síndrome nefropático, cirrosis, edema pulmonar e hipertensión. También se describen composiciones farmacéuticas para usar en los procedimientos de la invención.
La presente invención también se refiere a procedimientos para inducir una respuesta inotrópica que comprende administrar una cantidad eficaz de una exendina, GLP-1, o un agonista de exendina o GLP-1. Los procedimientos son útiles para tratar afecciones o trastornos que se pueden aliviar mediante un aumento de la contractilidad cardíaca, tales como la insuficiencia cardíaca congestiva.
La siguiente descripción resume la información relevante de la presente invención. No se admite que cualquier información proporcionada en el presente documento sea una técnica anterior a la invención ahora reivindicada, ni que cualquiera de las publicaciones a las que se hace referencia específica o implícitamente sean una técnica anterior a esta invención.
GLP-1
El péptido similar a glucagón de tipo 1[7-36]amida (también denominado GLP-[7-36]NH_{2} o GLP-1) es un producto del gen del proglucagón. Es secretado al plasma principalmente desde el intestino y produce una variedad de efectos biológicos relacionados con la función pancreática y gastrointestinal. El péptido original, el proglucagón (PG), tiene numerosos sitios de escisión que producen otros productos peptídicos dependiendo del tejido de origen, que incluye el glucagón (PG[32-62]) y GLP-1[7-36]NH_{2} (PG[72-107]) en el páncreas, y GLP-1[7-37] (PG[78-108]) y GLP-1[7-36]NH_{2} (PG[78-107]) en las células L del intestino donde GLP-1[7-36]NH_{2} (78-107 PG) es el producto principal.
El GLP-1[7-36]NH_{2}, conocido también como proglucagón [78-107], o normalmente simplemente como GLP-1, como se usa en el presente documento, tiene un efecto insulinotrópico, que estimula la secreción de insulina de las células pancreáticas; el GLP-1 también inhibe la secreción de glucagón de las células pancreáticas (Orskov, y col., Diabetes, 42:658-61. 1993: D'Alessio. y col., J. Clin. Invest. 97:133-38, 1996). Se describe que GLP-1 inhibe el vaciado gástrico (Williams B, y col., J Clin. Endocrinol. Metab. 81 (1): 327-32, 1996; Wettergren A, y col., Dig. Dis. Sci. 38 (4): 665-73, 1993), y la secreción de ácido gástrico. (Schjoldager BT, y col., Dig. Dis. Sci. 34 (5): 703-8,1989; O'Halloran DJ, y col., J. Endocrinol. 126 (1):169-73, 1990: Wettergren A. y col., Dig. Dis. Sci. 38 (4): 665-73, 1993). Se ha publicado un efecto diurético, antidipsogénico de la administración intracerebroventricular de GLP-1, sin embargo, esta publicación reivindica que una inyección periférica intraperitoneal de GLP-1 no tiene este efecto (Tand-Christensen y col., Am. J. Physiol. 271:R848-56, 1996). GLP-1[7-37], que tiene un resto de glicina adicional en su extremo carboxilo terminal, también estimula la secreción de insulina en seres humanos (Orskov, y col., Diabetes, 42:658-61, 1993). Un receptor de acoplado a proteína G adenilato-ciclasa de transmembrana que se cree que es responsable del efecto insulinotrópico de GLP-1 se ha clonado a partir de una línea celular (Thorens, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:8641-45, 1992).
Se ha encontrado que el glucagón y los péptidos similares a glucagón tienen diferentes efectos cardiovasculares. Se ha publicado que el glucagón tiene efectos cronotrópicos e inotrópicos positivos, produce un ligero aumento de la tensión arterial en individuos normales, y afecta a la circulación sanguínea regional. Se ha encontrado que GLP-1 produce un aumento moderado de la tensión arterial tanto sistólica como diastólica, mientras que GLP-2 no tiene efecto en estos parámetros. Se ha publicado que GLP-1 administrado por la vena yugular induce un aumento de la tensión arterial sistólica y diastólica y del ritmo cardíaco (Revisado en Barragán, J.M. y col., Regul. Peptides, 67:63-68, 1996).
Exendina
Las exendinas son péptidos que se encuentran en el veneno del monstruo de Gila, un lagarto endógeno de Arizona, y en el lagarto escorpión de Méjico. La exendina-3 está presente en el veneno de Heloderma horridum y la exendina-4 está presente en el veneno de Heloderma suspectum (Eng, J., y col., J. Biol. Chem. 265:20259-62, 1990; Eng., J., y col., J. Biol. Chem., 267:7402-05,1992). Las exendinas tienen alguna similitud de secuencia con varios miembros de la familia de péptidos similares a glucagón, con la homología más alta, 53%, con GLP-1 (Goke, y col., J. Biol. Chem., 268:19650-55, 1993).
La exendina-4 es un potente agonista en los receptores de GLP-1 en las células TC1 secretoras de insulina, en células acinares dispersas del páncreas de cobayas, y en células parietales del estómago; el péptido también estimula la liberación de somatostatina e inhibe la liberación de gastrina en estómagos aislados (Goke, y col., J. Biol. Chem. 268:19650-55, 1993; Schepp, y col., Eur. J. Pharmacol., 69:183-91, 1994; Eissele, y col., Life Sci., 55:629-34, 1994). Se encontró que la exendina-3 y exendina-4 eran agonistas de GLP-1 en la estimulación de producción de AMPc, y en la liberación de amilasa de células acinares pancreáticas (Malhotra, R., y col., Regulatory Peptides. 41:149-56, 1992; Raufman, y col., J. Biol. Chem. 267:21432-37, 1992; Singh, y col., Regul. Pept. 53:47-59, 1994). Se ha propuesto el uso de actividades insulinotrópicas de la exendina-3 y exendina-4 para el tratamiento de la diabetes mellitus y la prevención de la hiperglucemia (Eng, patente de EE.UU. nº 5.424.286).
Se ha publicado que los péptidos de exendina truncados como la exendina[9-39], una molécula carboxiamidada, y los fragmentos 3-39 a 9-39 son agonistas potentes y selectivos de GLP-1 (Goke, y col., J. Biol. Chem., 268:19650-55, 1993; Raufman, J.P., y col., J. Biol. Chem. 266:2897-902,1991; Schepp, W., y col., Eur. J. Pharm. 269:183-91, 1994; Montrose-Rafizadeh, y col., Diabetes. 45(Suppl. 2):152A, 1996). La exendina[9-39] bloquea el GLP-1 endógeno in vivo, dando como resultado una menor secreción de insulina. (Wang, y col., J. Clin. Invest., 95:417-21, 1995; D'Alessio, y col., J. Clin. Invest. 97:133-38, 1996). Se ha clonado el receptor aparentemente responsable del efecto insulinotrópico de GLP-1 a partir de células de islotes pancreáticos de rata (Thorens, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8641-8645, 1992). Las exendinas y la exendina[9-39] se unen al receptor de GLP-1 clonado (receptor de GLP-1 de células pancreáticas de rata: Fehmann HC, y col., Peptides 15 (3): 453-6,1994; receptor de GLP-1 humano: Thorens B, y col., Diabetes 42 (11): 1678-82, 1993). En células transfectadas con el receptor de GLP-1 clonado, la exendina-4 es un agonista, es decir, aumenta el AMPc, mientras que la exendina[9-39] es un antagonista, es decir, bloquea las acciones estimuladoras de la exendina-4 y GLP-1. Citado antes.
La exendina[9-39] también actúa como un antagonista de las exendinas de longitud completa, inhibiendo la estimulación de células acinares pancreáticas por la exendina-3 y exendina-4 (Raufman, y col., J. Biol. Chem. 266:2897-902, 1991; Raufman. y col., J. Biol. Chem., 266:21432-37, 1992). La exendina[9-39] inhibe la estimulación de los niveles de insulina en el plasma por la exendina-4, e inhibe las actividades de estimulación de liberación de somatostatina y de inhibición de la liberación de gastrina de la exendina-4 y GLP-1 (Kolligs, F., y col., Diabetes, 44:16-19, 1995; Eissele, y col., Life Sciences. 55:629-34, 1994). Se ha publicado que la exendina-4, administrada por la vena yugular induce un aumento de la tensión arterial sistólica, diastólica y media, y del ritmo cardíaco (Barragán, y col., Regul. Pep. 67:63-68, 1996).
Recientemente se ha descubierto que las exendinas inhiben el vaciado gástrico (solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 08/694.954, presentada el 8 de agosto, 1996. La exendina[9-39] se ha usado para investigar la importancia fisiológica del GLP-1 central en el control de la ingestión de alimento (Turton, M.D., Nature 379:69-72, 1996). El GLP-1 administrado por inyección intracerebroventricular (ICV) inhibe la ingestión de alimento en ratas. Se ha publicado que este efecto de inducción de saciedad de GLP-1 suministrado por inyección intracerebroventricular es inhibido por inyección ICV de exendina[9-39] (Turton, véase antes). Sin embargo, se ha publicado que GLP-1 no inhibe la ingestión de alimento en ratones cuando se administra por inyección periférica (Turton, M.D., Nature 379:69-72, 1996; Bhavsar, S.P., Soc. Neurosci. Abstr. 21:460 (188.8), 1995). También se ha descubierto recientemente que la administración de exendinas y agonistas de exendinas reduce la ingestión de alimento (solicitud de patente provisional de EE.UU. nº 60/034.905, presentada el 7 de enero, 1997).
Diuréticos
Los agentes que aumentan el flujo de orina, o diuréticos, son útiles para tratar afecciones o trastornos que están asociados con estados hipervolémicos tóxicos. Dichas afecciones o trastornos incluyen la insuficiencia renal, insuficiencia cardíaca congestiva, síndrome nefrótico, cirrosis, edema pulmonar e hipertensión. Los diuréticos también se usan para tratar afecciones en el embarazo, tales como la preeclampsia y eclampsia. Otros usos de los diuréticos incluyen su uso para reducir volumen antes de algunos procedimientos quirúrgicos tales como la cirugía ocular o neurocirugía.
Una dificultad que se encuentra con muchos diuréticos tales como las tiazidas, diuréticos de asa, inhibidores de la anhidrasa carbónica y diuréticos osmóticos, es que aunque se pueden usar para aumentar la excreción de sodio, también producen un aumento de la pérdida de potasio urinario. Los ejemplos de los efectos de la pérdida de potasio incluyen debilidad muscular, parálisis (incluida la parálisis de músculos respiratorios), anomalías electrocardiográficas, disritmia cardíaca y paro cardíaco.
Otra dificultad que se encuentra con algunos diuréticos es su velocidad de acción lenta, que no es propicia para su uso en una situación de urgencia.
Por lo tanto, es necesario un procedimiento para aumentar el flujo de orina que no disminuya la concentración de potasio en el paciente y que tenga un modo de acción rápido. Dichos procedimientos y compuestos y composiciones que son útiles para esto, se han inventado y se describen y reivindican en el presente documento.
Compuestos inotrópicos
Se ha reconocido que los compuestos que inducen efectos inotrópicos (p. ej., aumento de la fuerza de contracción del corazón) son útiles para el tratamiento, por ejemplo, de la insuficiencia cardíaca congestiva. La insuficiencia cardíaca congestiva, que es una de las causas de muerte y discapacidad más comunes en los países industrializados, tiene una tasa de mortalidad de aproximadamente 50% en cinco años (Goodman and Gilman The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed. McGraw Hill, Nueva York, pp. 809-838). Los agentes inotrópicos actualmente usados en clínica incluyen digital, aminas simpatomiméticas y amrinona (Harrison Principles of Internal Medicine, 12th Edition, 1991, McGraw Hill, Nueva York, pp. 894-899).
La digotoxina, un glucósido cardíaco, que es una terapia antigua pero eficaz para la insuficiencia cardíaca, inicialmente se obtuvo de la hoja de la dedalera, Digitalis purpurea y Digitalis lanata. Los glucósidos cardíacos son inhibidores muy selectivos y potentes del transporte activo de iones sodio y potasio a través de las membranas celulares (Goodman and Gilman, véase antes). Se ha publicado que los glucósidos cardíacos aumentan la velocidad de acortamiento del músculo cardíaco, produciendo una mejora de la función ventricular; se ha publicado que este efecto se debe a un aumento de la disponibilidad del Ca^{2+} citosólico durante la sístole para interaccionar con proteínas contráctiles para aumentar la velocidad y extensión del acortamiento del sarcómero (Goodman and Gilman, véase antes).
La digotoxina y los glucósidos cardíacos relacionados (p. ej., digitoxina) tienen duraciones de la acción útiles, porque su excreción, principalmente por los riñones, da un tiempo en el plasma de 1,5-5 días. Pero el índice terapéutico de este fármaco es muy bajo con una relación de dosis ligeramente tóxica:mínimamente eficaz de 2:1 y una relación de dosis letal:mínimamente eficaz entre 5:1 y 10:1. La pérdida de potasio urinario debido al uso de tiazida y diuréticos de asa puede potenciar gravemente los peligros de la intoxicación con digital, incluyendo la susceptibilidad a la arritmia cardíaca y a menudo son necesarios los diuréticos ahorradores de potasio. La eliminación lenta de los glucósidos cardíacos puede prolongar el periodo de peligro durante la intoxicación con digital, que se ha publicado que se produce en el 20% de los pacientes de hospital que toman estos fármacos. La absorción y el inicio de la acción para todos los glucósidos cardíacos excepto la ouabaina, es algo prolongado y esto puede ser una desventaja en las afecciones cardíacas de urgencias.
Las aminas simpatomiméticas, que en general incluyen epinefrina, isoproterenol, dopamina y dobutamina, pueden ser útiles en un cuadro agudo para estimular la contractilidad miocárdica, pero normalmente requieren la infusión intravenosa constante y el seguimiento intensivo continuo del paciente. Normalmente pierden su eficacia después de 8 horas, aparentemente debido a la regulación negativa del receptor.
La amrinona, un agente no glucósido, no catecolamina, también requiere la administración intravenosa continua.
Esta descripción de agentes inotrópicos disponibles ilustra la necesidad, y la conveniencia, de terapias que sean (1) inotrópicas, con (2) inicio rápido de la acción, con (3) duración prolongada de la acción (incluyendo un efecto persistente, con ausencia de taquifilaxia), con (4) baja toxicidad (una relación alta de dosis tóxica a terapéutica), con (5) efecto diurético rápido y profundo, con (6) un ahorro de la pérdida de potasio urinario, y con (7) una vía (no intravenosa) de administración conveniente. Los autores de la invención han descubierto que la exendina y el GLP-1 cumplen estos criterios.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere al descubrimiento sorprendente de que las exendinas, GLP-1 y agonistas de estos compuestos tienen efectos inotrópicos y diuréticos rápidos. Aunque se ha publicado que GLP-1 no tiene un efecto diurético cuando se administra de forma periférica, los autores de la invención han descubierto, sorprendentemente, que GLP-1 de hecho tiene un efecto diurético después de la administración periférica. Este efecto diurético de las exendinas, GLP-1 y agonistas de exendina y GLP-1, va acompañado de un aumento de la concentración de sodio urinario. Este efecto diurético también va acompañado de una disminución de la concentración de potasio urinario, lo cual no se preveía puesto que se ha encontrado que muchos diuréticos producen un aumento profundo de la concentración de potasio urinario.
La presente invención se dirige a nuevos usos terapéuticos para aumentar el flujo de orina, que comprenden la administración de una exendina, por ejemplo, la exendina-3
1
o exendina-4
2
u otros compuestos que se unen de forma eficaz al receptor en el que la exendina ejerce su acción de aumento del flujo de orina (agonistas de exendina). La presente invención también se dirige a nuevos usos terapéuticos para aumentar el flujo de orina que comprenden la administración de GLP-1
3
u otros compuestos que se unen de forma eficaz al receptor en el que GLP-1 ejerce su acción de aumento del flujo de orina (agonistas de GLP-1).
En un primer aspecto, la invención presenta un uso para aumentar el flujo de orina en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de una exendina o un agonista de exendina. En un aspecto preferido, dicha exendina es la exendina-3. Más preferiblemente, dicha exendina es la exendina-4. Por un agonista de exendina se entiende un compuesto que mimetiza los efectos de la exendina de aumento de flujo de orina, aumento de la excreción de sodio y/o disminución de la concentración de potasio urinario (la concentración de potasio en la orina excretada) por unión al receptor o receptores en los que la exendina produce este efecto. Se describen algunos compuestos agonistas de exendina nuevos en la solicitud de patente provisional de EE.UU. nº de serie 60/055.404, presentada el 8 de agosto, 1977. Se describen algunos otros compuestos agonistas de exendina nuevos en las solicitudes de patente provisional de EE.UU. nº de serie 60/066.029 y 60/065,442, ambas presentadas en 14 de noviembre, 1997. Los compuestos agonistas de exendina preferidos incluyen los descritos en las solicitudes de patente provisional de EE.UU. nº de serie 60/055.404 y 60/065.442.
En un aspecto preferido, la exendina o agonista de exendina usados en los procedimientos de la presente invención es la exendina-4. En otro aspecto preferido, la exendina es la exendina-3. En otros aspectos preferidos, la exendina o el agonista de exendina es un compuesto de fórmula (I)
[ID SEC Nº 4]
4
en la que
Xaa_{1} es His, Arg o Tyr;
Xaa_{2} es Ser, Gly, Ala o Thr;
Xaa_{3} es Asp o Glu;
Xaa_{5} es Ala o Thr;
Xaa_{6} es Ala, Phe, Tyr o naftilalanina;
Xaa_{7} es Thr o Ser;
Xaa_{8} es Ala, Ser o Thr;
Xaa_{9} es Asp o Glu;
Xaa_{10} es Ala, Leu, Ile, Val, pentilglicina o Met;
Xaa_{11} es Ala o Ser;
Xaa_{12} es Ala o Lys;
Xaa_{13} es Ala o Gln;
Xaa_{14} es Ala, Leu, Ile, pentilglicina, Val o Met;
Xaa_{15} es Ala o Glu;
Xaa_{16} es Ala o Glu;
Xaa_{17} es Ala o Glu;
Xaa_{19} es Ala o Val;
Xaa_{20} es Ala o Arg;
Xaa_{2l} es Ala o Leu;
Xaa_{22} es Phe, Tyr o naftilalanina;
Xaa_{23} es Ile, Val, Leu, pentilglicina, terc-butilglicina o Met;
Xaa_{24} es Ala, Glu o Asp;
Xaa_{25} es Ala, Trp, Phe, Tyr o naftilalanina;
Xaa_{26} es Ala o Leu;
Xaa_{27} es Ala o Lys;
Xaa_{28} es Ala o Asn;
Z_{1} es -OH,
5
en los que Xaa_{31}, Xaa_{36}, Xaa_{37} y Xaa_{38} se seleccionan independientemente del grupo constituido por Pro, homoprolina, 3Hyp, 4Hyp, tioprolina, N-alquilglicina, N-alquilpentilglicina y N-alquilalanina; Xaa_{39} es Ser, Thr o Tyr; y
Z_{2} es -OH o -NH_{2}; y sales del mismo farmacéuticamente aceptables;
con la condición de que no más de tres de Xaa_{3}, Xaa_{5}, Xaa_{6}, Xaa_{8}, Xaa_{10}, Xaa_{11}, Xaa_{12}, Xaa_{13}, Xaa_{14}, Xaa_{l5}, Xaa_{16}, Xaa_{17}, Xaa_{19}, Xaa_{20}, Xaa_{2l}, Xaa_{24}, Xaa_{25}, Xaa_{26}, Xaa_{27}, y Xaa_{28} sean Ala; y también con la condición de que el compuesto no sea la exendina-3 [ID SEC Nº 1] o exendina-4 [ID SEC Nº 2]. En otros aspectos de la invención, el aumento de flujo de orina va a acompañado de un aumento de la excreción de sodio en dicho individuo. En los aspectos más preferidos, el aumento de flujo de orina no aumenta la concentración de potasio urinario en dicho individuo.
En otras realizaciones de la invención, se proporciona un uso terapéutico para disminuir la concentración de potasio en la orina de un individuo, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de una exendina o un agonista de exendina.
Todavía en otro aspecto de la invención, se proporciona un uso terapéutico para prevenir o aliviar una afección o trastorno asociado con la hipervolemia tóxica en un individuo, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de una exendina o un agonista de exendina.
Por afección o trastorno asociado con la hipervolemia tóxica se entiende cualquier afección o trastorno en un sujeto que es causado por, complicado por o agravado por un volumen extracelular relativamente alto. Dichas afecciones o trastornos incluyen, pero no se limitan a ellos, insuficiencia renal, insuficiencia cardíaca congestiva, síndrome nefrótico, edema pulmonar, cirrosis e hipertensión.
La presente invención también proporciona un uso para inducir la diuresis rápida en un individuo, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de una exendina o un agonista de exendina. Un uso preferido es en la preparación de un paciente para una intervención quirúrgica en la que se desea una reducción del volumen extracelular, tal como en algunas intervenciones quirúrgicas oculares o en algunas intervenciones neuroquirúrgicas. Preferiblemente, dicha exendina o agonista de exendina se administra a dicho individuo antes de dicha intervención quirúrgica.
En otros aspectos preferidos, se proporciona un uso terapéutico para aumentar el flujo de plasma renal y la velocidad de filtración glomerular en un individuo, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de una exendina o un agonista de exendina.
En otros aspectos preferidos más, se proporciona el uso de exendina para la fabricación de un medicamento para tratar la preeclampsia o eclampsia del embarazo en un individuo, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de una exendina o un agonista de exendina.
El modo de administración preferido de dicha exendina o agonista de exendina es por administración periférica (subcutánea o intravenosa). Preferiblemente, dicha exendina o agonista de exendina se administra por vía subcutánea. Preferiblemente, se administra de aproximadamente 1 g - 30 g a aproximadamente 10 - 20 mg de exendina o agonista de exendina por dosis. Más preferiblemente, se administra de aproximadamente 30 g a aproximadamente 10 mg, o de aproximadamente 300 g a aproximadamente 5 mg de exendina o agonista de exendina por dosis. Lo más preferiblemente, se administra de aproximadamente 30 g a aproximadamente 1 mg de exendina o agonista de exendina por dosis.
En otros aspectos preferidos, dicha administración periférica se selecciona del grupo constituido por administración bucal, nasal, pulmonar, oral, intraocular, rectal y transdérmica.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas para usar en el tratamiento de afecciones o trastornos asociados con la hipervolemia, que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una exendina o agonista de exendina asociado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otros aspectos más, la invención proporciona composiciones farmacéuticas para usar para aumentar el flujo de orina en un individuo, que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una exendina o agonista de exendina asociado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En aspectos adicionales, la invención proporciona composiciones farmacéuticas para usar en el tratamiento de la preeclampsia y eclampsia del embarazo en un individuo, que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una exendina o agonista de exendina asociado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Preferiblemente, estas composiciones farmacéuticas comprenden exendina-3. Más preferiblemente, estas composiciones farmacéuticas comprenden exendina-4.
Preferiblemente, estas composiciones farmacéuticas comprenden un agonista de exendina de fórmula I [ID SEC Nº 4].
La presente invención también se dirige a nuevos procedimientos para aumentar el flujo de orina, que comprenden la administración de GLP-1.
En una realización la invención presenta un uso terapéutico para aumentar el flujo de orina en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de GLP-1 o un agonista de GLP-1. Por agonista de GLP-1 se entiende un compuesto que mimetiza los efectos de GLP-1 en el aumento de flujo de orina, aumento de la excreción de sodio y/o disminución de la concentración de potasio urinario, por unión al receptor o receptores en los que GLP-1 produce este efecto. Se describen algunos agonistas de GLP-1 en Chen y col., patente de EE.UU. nº 5.512.549, presentada el 30 de abril, 1996, titulada Glucagon-Like Insulinotropic Peptide Analogs, Compositions and Methods of Use. Se describen otros agonistas de GLP-1 en Johnson y col., patente de EE.UU. nº 5.574.008, presentada el 12 de noviembre, 1996, titulada, Biologically Active Fragments of Glucagon-Like Insulinotropic Peptide. Otros agonistas más de GLP-1 se describen en Buckley y col., patente de EE.UU. nº 5.545,618, presentada el 13 de agosto, 1996, titulada GLP-1 Analogs Useful for Diabetes Treatment.
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En otros aspectos de la invención, el aumento de flujo de orina va a acompañado de un aumento de la excreción de sodio en dicho individuo. En aspectos más preferidos, el aumento de flujo de orina no aumenta la concentración de potasio urinario en dicho individuo.
En otras realizaciones de la invención, se proporciona un uso terapéutico para disminuir la concentración de potasio en la orina de un individuo, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de GLP-1 o un agonista de GLP-1.
En otro aspecto más de la invención, se proporciona un uso terapéutico para prevenir o aliviar una afección o trastorno asociado con la hipervolemia tóxica en un individuo, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de GLP-1 o un agonista de GLP-1.
La presente invención también proporciona el uso para inducir la diuresis rápida en un individuo, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de GLP-1 o un agonista de GLP-1. Un uso preferido es en la preparación de un paciente para una intervención quirúrgica en la que se desea una reducción del volumen extracelular, tal como en algunas intervenciones quirúrgicas oculares y en algunas intervenciones neuroquirúrgicas. Preferiblemente, dicho GLP-1 o agonista de GLP-1 se va a administrar a dicho individuo antes de dicha intervención quirúrgica.
En otros aspectos preferidos, se proporciona un uso terapéutico para aumentar el flujo de plasma renal y la velocidad de filtración glomerular en un individuo, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de GLP-1 o un agonista de GLP-1.
En otros aspectos aún preferidos, se proporciona un uso terapéutico para tratar la preeclampsia o eclampsia del embarazo en un individuo, que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de GLP-1 o un agonista de GLP-1.
El modo de administración preferido de dicho GLP-1 o agonista de GLP-1 es por administración periférica. Preferiblemente, dicho GLP-1 o agonista de GLP-1 se administra por vía subcutánea o intravenosa. Preferiblemente, se administra de aproximadamente 1 g - 30 g a aproximadamente 10 - 20 mg de GLP-1 o agonista de GLP-1 por dosis. Más preferiblemente, se administra de aproximadamente 30 g a aproximadamente 10 mg, o de aproximadamente 300 g a aproximadamente 5 mg de GLP-1 o agonista de GLP-1 por dosis. Lo más preferiblemente, se administra de aproximadamente 30 g a aproximadamente 1 mg de GLP-1 o agonista de GLP-1 por dosis.
En otros aspectos preferidos, dicha administración periférica se selecciona del grupo constituido por administración bucal, nasal, pulmonar, oral, intraocular, rectal y transdérmica.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas para usar en el tratamiento de afecciones o trastornos asociados con la hipervolemia, que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de GLP-1 o un agonista de GLP-1 asociado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otros aspectos más, la invención proporciona composiciones farmacéuticas para usar en el aumento de flujo de orina en un individuo, que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de GLP-1 o un agonista de GLP-1 asociado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En aspectos adicionales, la invención proporciona composiciones farmacéuticas para usar en el tratamiento de la preeclampsia o eclampsia del embarazo en un individuo, que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de GLP-1 o un agonista de GLP-1 asociado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también presenta usos terapéuticos para inducir un efecto inotrópico en un individuo, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una exendina o agonista de exendina, o GLP-1 o un agonista de GLP-1. Por lo tanto, en un aspecto se proporciona un uso de GLP-1 para fabricar un medicamento para aumentar la contractilidad cardíaca en un individuo, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una exendina, un agonista de exendina, GLP-1 o un agonista de GLP-1.
En un aspecto relacionado, se proporciona un uso terapéutico para tratar una afección o trastorno que se puede aliviar aumentando la contractilidad cardíaca en un individuo, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una exendina, un agonista de exendina, GLP-1 o un agonista de GLP-1. Dichas afecciones o trastornos incluyen insuficiencia cardíaca congestiva, edema pulmonar y sistémico, e insuficiencia renal. Preferiblemente dicha afección o trastorno es la insuficiencia cardíaca congestiva.
Preferiblemente, dicha exendina para usar en estos procedimientos es la exendina-3. Más preferiblemente, dicha exendina es la exendina-4.
Preferiblemente, el agonista de exendina para usar en esos procedimientos es un agonista de exendina fórmula I [ID SEC Nº 4].
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En aspectos preferidos, dichos exendina, agonista de exendina, GLP-1 o un agonista de GLP-1 para usar en dichos procedimientos, se administran por vía periférica usando las dosis descritas en el presente documento.
Preferiblemente, dicha administración periférica se selecciona del grupo constituido por administración bucal, nasal, pulmonar, oral, intraocular, rectal y transdérmica.
En otro aspecto preferido, dichos exendina, agonista de exendina, GLP-1 o un agonista de GLP-1, se administran por vía subcutánea o intravenosa.
También se proporcionan en la presente invención composiciones farmacéuticas para usar en el tratamiento de una afección o trastorno que se puede aliviar aumentando la contractilidad cardíaca, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una exendina, un agonista de exendina, GLP-1 o un agonista de GLP-1, asociado con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, dicha exendina es la exendina-3. Más preferiblemente, dicha exendina es la exendina-4. Preferiblemente, estas composiciones farmacéuticas comprenden un agonista de exendina de fórmula I [ID SEC Nº 4].
Breve descripción de los dibujos
la fig. 1(A-B) es una representación gráfica de la respuesta de la presión arterial media (PAM) a GLP-1. (A) La PAM se presenta como el % de los valores de predosis medidos a lo largo de 30 minutos antes de la administración de fármaco; (B) Curva de dosis-respuesta para los efectos de GLP-1 en la PAM. La respuesta representada gráficamente es el área bajo la curva creciente de 0 a 2 horas después de la dosis de bolo.
la fig. 2 es una representación gráfica de la respuesta inotrópica a GLP-1. La velocidad de cambio de la presión arterial (dP/dt) indica la contractilidad cardíaca, que aumenta en respuesta a una inyección subcutánea de GLP-1 dada a ratas conscientes.
la fig. 3(A-B) es una representación gráfica de la respuesta del flujo de orina a las dosis de bolo intravenoso de GLP-1. (A) El flujo de orina se midió a intervalos de 15 minutos y se presentó como % de los valores predosis medidos a lo largo de 30 minutos antes de la administración de fármaco; (B) Curva de dosis -respuesta para los efectos de GLP-1 en el flujo de orina. La respuesta representada gráficamente es el porcentaje de cambio del flujo de 0 a 15 minutos después de la dosis de bolo respecto al flujo a lo largo de los 30 minutos previos.
la fig. 4(A-B) es una representación gráfica de la respuesta de la excreción de sodio a las dosis de bolo intravenoso de GLP-1. (A) La excreción de sodio se midió a intervalos de 15 minutos y se presentó como el % de los valores predosis medidos a lo largo de 30 minutos antes de la administración de fármaco; (B) Curva de dosis-respuesta para los efectos de GLP-1 en la excreción de sodio. La respuesta representada gráficamente es el porcentaje de cambio de la excreción de sodio de 0 a 15 minutos después de la dosis de bolo respecto a la excreción a lo largo de los 30 minutos previos.
la fig. 5 (A-B) es una representación gráfica de la respuesta de la concentración de potasio urinario a las dosis de bolo intravenoso de GLP-1. (A) La concentración de potasio urinario se midió a intervalos de 15 minutos y se presentó como el % de los valores predosis medidos a lo largo de 30 minutos antes de la administración de fármaco; (B) Curva de dosis-respuesta para los efectos de GLP-1 en la concentración de potasio urinario. La respuesta representada gráficamente es el porcentaje de cambio de la concentración de potasio urinario de 0 a 15 minutos después de la dosis de bolo respecto a la concentración de potasio urinario a lo largo de los 30 minutos previos.
la fig. 6(A-B) es una representación gráfica de la respuesta de la presión arterial media (PAM) a la exendina 4. (A) La MAP se presenta como el % de valores predosis medidos a lo largo de 30 minutos antes de la administración de fármaco; (B) Curva de dosis-respuesta para los efectos de la exendina en la PAM. La respuesta representada gráficamente es el área bajo la curva creciente de 0 a 2 horas después de la dosis de bolo.
la fig. 7 es una representación gráfica de la respuesta inotrópica a la exendina-4. La velocidad de cambio de la presión arterial (dP/dt) indica la contractilidad cardíaca, que aumenta en respuesta a una inyección subcutánea de exendina-4 dada a ratas conscientes.
la fig. 8(A-B) es una representación gráfica de la respuesta del flujo de orina a las dosis de bolo intravenoso de exendina-4. (A) El flujo de orina se midió a intervalos de 15 minutos; (B) Curva de dosis-respuesta para los efectos de la exendina-4 en el flujo de orina. La respuesta representada gráficamente es flujo de orina de 0 a 15 minutos después de la dosis de bolo.
la fig. 9(A-B) es una representación gráfica de la respuesta de la excreción de sodio a las dosis de bolo intravenoso de exendina-4. (A) La excreción de sodio se midió a intervalos de 15 minutos y se presentó como el % de los valores predosis medidos a lo largo de 30 minutos antes de la administración de fármaco; (B) Curva de dosis-respuesta para los efectos de exendina-4 en la excreción de sodio. La respuesta representada gráficamente es el porcentaje de cambio de la excreción de sodio de 0 a 15 minutos después de la dosis de bolo respecto a la excreción a lo largo de los 30 minutos previos.
la fig. 10(A-B) es una representación gráfica de la respuesta de la concentración de potasio urinario a las dosis de bolo intravenoso de exendina-4. (A) La concentración de potasio urinario se midió a intervalos de 15 minutos y se presentó como el % de los valores predosis medidos a lo largo de 30 minutos antes de la administración de exendina-4; (B) Curva de dosis-respuesta para los efectos de exendina-4 en la concentración de potasio urinario. La respuesta representada gráficamente es el área bajo la curva de 0 a 2 horas después de la dosis de bolo.
Descripción detallada de la invención
Las exendinas, GLP-1 y los análogos y agonistas de los mismos de esta invención son útiles en vista de sus propiedades farmacológicas. La actividad como análogos o agonistas de exendina o GLP-1 se puede indicar por la actividad en los ensayos descritos a continuación. Los efectos de las exendinas o GLP-1 o agonistas de los mismos en la reducción de la ingestión de alimento se puede identificar, evaluar o seleccionar, usando los procedimientos descritos en los siguientes ejemplos, u otros procedimientos conocidos en la técnica para determinar los efectos en el flujo de orina o la excreción de sodio o potasio.
Aunque se encontró que la exendina-4 tiene un efecto hipertensivo cuando se administra junto con un agente que regula la presión arterial, el efecto diurético todavía era evidente, indicando un efecto diurético de la exendina-4 que no se podía atribuir enteramente a su efecto hipertensivo.
Compuestos agonistas de exendina
Los compuestos agonistas de exendina incluyen los descritos en las solicitudes de patente provisional de EE.UU. nº 60/055.404; 60/066.029; y 60/065.442. Los compuestos agonistas de exendina preferidos incluyen los compuestos peptídicos de fórmula (I) [ID SEC Nº 4]:
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en la que
Xaa_{1} es His, Arg o Tyr;
Xaa_{2} es Ser, Gly, Ala o Thr;
Xaa_{3} es Asp o Glu;
Xaa_{5} es Ala o Thr;
Xaa_{6} es Ala, Phe, Tyr o naftilalanina;
Xaa_{7} es Thr o Ser;
Xaa_{8} es Ala, Ser o Thr;
Xaa_{9} es Asp o Glu;
Xaa_{10} es Ala, Leu, Ile, Val, pentilglicina o Met;
Xaa_{11} es Ala o Ser;
Xaa_{12} es Ala o Lys;
Xaa_{13} es Ala o Gln;
Xaa_{14} es Ala, Leu, Ile, pentilglicina, Val o Met;
Xaa_{15} es Ala o Glu;
Xaa_{16} es Ala o Glu;
Xaa_{17} es Ala o Glu;
Xaa_{19} es Ala o Val;
Xaa_{20} es Ala o Arg;
Xaa_{2l} es Ala o Leu;
Xaa_{22} es Phe, Tyr o naftilalanina;
Xaa_{23} es Ile, Val, Leu, pentilglicina, terc-butilglicina o Met;
Xaa_{24} es Ala, Glu o Asp;
Xaa_{25} es Ala, Trp, Phe, Tyr o naftilalanina;
Xaa_{26} es Ala o Leu;
Xaa_{27} es Ala o Lys;
Xaa_{28} es Ala o Asn;
Z_{1} es -OH,
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7 
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en los que Xaa_{31}, Xaa_{36}, Xaa_{37} y Xaa_{38} se seleccionan independientemente del grupo constituido por Pro, homoprolina, 3Hyp, 4Hyp, tioprolina, N-alquilglicina, N-alquilpentilglicina y N-alquilalanina; Xaa_{39} es Ser, Thr o Tyr; y
Z_{2} es -OH o -NH_{2}; y sales del mismo farmacéuticamente aceptables;
con la condición de que no más de tres de Xaa_{3}, Xaa_{5}, Xaa_{6}, Xaa_{8}, Xaa_{10}, Xaa_{11}, Xaa_{12}, Xaa_{13}, Xaa_{14}, Xaa_{l5}, Xaa_{16}, Xaa_{17}, Xaa_{19}, Xaa_{20}, Xaa_{2l}, Xaa_{24}, Xaa_{25}, Xaa_{26}, Xaa_{27}, y Xaa_{28} sean Ala; y también con la condición de que el compuesto no sea la exendina-3 o exendina-4.
Los grupos N-alquilo preferidos para la N-alquilglicina, N-alquilpentilglicina y N-alquilalamina incluyen grupos alquilo inferiores preferiblemente de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono, más preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono. Los compuestos adecuados incluyen los identificados en los Ejemplos 4-64 [ID SEC Nº 5 a 65], así como los compuestos identificados en los ejemplos 65 y 66.
Los compuestos agonistas de exendina preferidos incluyen aquellos en los que Xaa_{1} es His o Tyr. Más preferiblemente, Xaa_{1} es His.
Se prefieren aquellos compuestos en los que Xaa_{2} es Gly.
Se prefieren aquellos compuestos en los que Xaa_{14} es Leu, pentilglicina o Met.
Se prefieren aquellos compuestos en los que Xaa_{25} es Trp o Phe.
Se prefieren aquellos compuestos en los que Xaa_{6} es Phe o naftilalanina; Xaa_{22} es Phe o naftilalanina y Xaa_{23} es Ile o Val.
Se prefieren los compuestos en los que Xaa_{31}, Xaa_{36}, Xaa_{37} y Xaa_{38} se seleccionan independientemente de Pro, homoprolina, tioprolina y N-alquilalanina.
Preferiblemente Z_{1} es -NH_{2}.
Preferiblemente Z_{2} es -NH_{2}.
De acuerdo con un aspecto, se prefieren los compuestos de fórmula (I) en la que Xaa_{1} es His o Tyr, más preferiblemente His; Xaa_{2} es Gly; Xaa_{6} es Phe o naftilalanina; Xaa_{l4} es Leu, pentilglicina o Met; Xaa_{22} es Phe o naftilalanina; Xaa_{23} es Ile o Val; Xaa_{31}, Xaa_{36}, Xaa_{37} y Xaa_{38} se seleccionan independientemente de Pro, homoprolina, tioprolina o N-alquilalanina. Más preferiblemente Z_{1} es -NH_{2}.
De acuerdo con un aspecto especialmente preferido, los compuestos especialmente preferidos incluyen los compuestos de fórmula (I) en la que: Xaa_{1} es His o Arg; Xaa_{2} es Gly o Ala; Xaa_{3} es Asp o Glu; Xaa_{5} es Ala o Thr; Xaa_{6} es Ala, Phe o naftilalanina; Xaa_{7} es Thr o Ser; Xaa_{8} es Ala, Ser o Thr; Xaa_{9} es Asp o Glu; Xaa_{10} es Ala, Leu o pentilglicina; Xaa_{11} es Ala o Ser; Xaa_{12} es Ala o Lys; Xaa_{13} es Ala o Gln; Xaa_{14} es Ala, Leu o pentilglicina; Xaa_{15} es Ala o Glu; Xaa_{16} es Ala o Glu; Xaa_{17} es Ala o Glu; Xaa_{19} es Ala o Val; Xaa_{20} es Ala o Arg; Xaa_{21} es Ala o Leu; Xaa_{22} es Phe o naftilalanina; Xaa_{23} es Ile, Val o terc-butilglicina; Xaa_{24} es Ala, Glu o Asp; Xaa_{25} es Ala, Trp o Phe; Xaa_{26} es Ala o Leu; Xaa_{27 }es_{ }Ala o Lys; Xaa_{28} es Ala o Asn; Z_{1} es -OH, -NH_{2}, Gly-Z_{2}, Gly Gly-Z_{2}, Gly Gly Xaa_{3l}-Z_{2}, Gly Gly Xaa_{3l} Ser-Z_{2}, Gly Gly Xaa_{31} Ser Ser-Z_{2}, Gly Gly Xaa_{31} Ser Ser Gly-Z_{2}, Gly Gly Xaa_{31} Ser Ser Gly Ala-Z_{2}, Gly Gly Xaa_{31} Ser Ser Gly Ala Xaa_{36}-Z_{2}, Gly Gly Xaa_{31} Ser Ser Gly Ala Xaa_{36} Xaa_{37}-Z_{2}, Gly Gly Xaa_{31} Ser Ser Gly Ala Xaa_{36} Xaa_{37} Xaa_{38}-Z_{2}; Xaa_{31}, Xaa_{36}, Xaa_{37} y Xaa_{38} son independientemente Pro, homoprolina, tioprolina o N-metilalanina; y Z_{2} es -OH o -NH_{2}; con la condición de que no más de tres de Xaa_{3}, Xaa_{5}, Xaa_{6}, Xaa_{8}, Xaa_{10}, Xaa_{11}, Xaa_{12}, Xaa_{13}, Xaa_{14}, Xaa_{15}, Xaa_{16}, Xaa_{17}, Xaa_{19}, Xaa_{20}, Xaa_{21}, Xaa_{24}, Xaa_{25}, Xaa_{26}, Xaa_{27} y Xaa_{28} sean Ala. Los compuestos especialmente preferidos incluyen los que tienen la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº 6-27.
De acuerdo con un aspecto especialmente preferido, se proporcionan compuestos en los que Xaa_{14} es Leu, Ile, Val o pentilglicina, más preferiblemente Leu o pentilglicina, y Xaa_{25} es Phe, Tyr o naftilalanina, más preferiblemente Phe o naftilalanina. Estos compuestos son menos susceptibles a la degradación oxidativa, tanto in vitro como in vivo, así como durante la síntesis del compuesto.
Definiciones
De acuerdo con la presente invención y tal como se usan en el presente documento, los siguientes términos se definen para tener los siguientes significados, salvo que se exponga explícitamente lo contrario.
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales y análogos de aminoácidos, todos en sus estereoisómeros D y L si la estructura permite dichas formas estereoisómeras. Los aminoácidos naturales incluyen alanina (Ala), arginina (Arg), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), cisteína (Cys), glutamina (Gln), ácido glutámico (Glu), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile), leucina (Leu), Lisina (Lys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptófano (Trp), tirosina (Tyr) y valina (Val). Los aminoácidos no naturales incluyen, pero no se limitan a ácido azetidinacarboxílico, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, ácido aminopropiónico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisbutírico, ácido 2-aminopimélico, terc-butilglicina, ácido 2,4-diaminoisobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, homoprolina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilalanina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, N-metilpentilglicina, N-metilvalina, naftalanina, norvalina, norleucina, ornitina, pentilglicina, ácido pipecólico y tioprolina. Los análogos de aminoácidos incluyen los aminoácidos naturales y no naturales que están químicamente bloqueados, de forma reversible o irreversible, o modificados en su grupo amino N-terminal o sus grupos de las cadenas laterales, como por ejemplo, metionina-sulfóxido, metionina-sulfona, S-(carboximetil)-cisteína, S-(carboximetil)cisteína-sulfóxido y S-(carboximetil)-cisteína-
sulfona.
La expresión "análogo de aminoácido" se refiere a un aminoácido en el que el grupo carboxi C-terminal, el grupo amino N-terminal o un grupo funcional de la cadena lateral se ha modificado químicamente en otro grupo funcional. Por ejemplo, el éster beta-metílico del ácido aspártico es un análogo de aminoácido del ácido aspártico; la N-etilglicina es un análogo de aminoácido de la glicina; o la alanina-carboxamida es un análogo de aminoácido de la
alanina.
La expresión "resto de aminoácido" se refiere a los radicales que tienen la estructura: (1)-C(O)-R-NH-, en la que R normalmente es -CH(R)-, en el que R es una cadena lateral del aminoácido, normalmente H o un sustituyente que contiene carbono; o (2)
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en el que p es 1, 2 ó 3 que representa el ácido azetidinacarboxílico, prolina o ácido pipecólico, respectivamente.
El término "inferior" usado en el presente documento en relación con radicales orgánicos tales como grupos alquilo, define dichos grupos con hasta, e incluidos aproximadamente 6, preferiblemente hasta, e incluidos 4 y ventajosamente uno o dos átomos de carbono. Dichos grupos pueden ser de cadena lineal o cadena ramificada.
"Sal farmacéuticamente aceptable" incluye sales de los compuestos descritos en el presente documento, obtenidas de la combinación de dichos compuestos y un ácido orgánico o inorgánico. En la práctica el uso de la forma salina equivale al uso de la forma básica. Los compuestos son útiles tanto en forma de base libre como en forma de sal.
Además, las siguientes abreviaturas tienen los siguientes significados:
"ACN" o "CH_{3}CN" se refiere a acetonitrilo.
"Boc", "tBoc" o "Tboc" se refiere a t-butoxi-carbonilo.
"DCC" se refiere a N,N'-diciclohexilcarbodiimida.
"Fmoc" se refiere a fluorenilmetoxicarbonilo.
"HBTU" se refiere a hexaflurofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3,-tetrametiluronio.
"HOBt" se refiere a monohidrato de 1-hidroxibenzotriazol.
"homoP" o "hPro" se refiere a homoprolina.
"MeAla" o "Nme" se refiere a N-metilalanina.
"naph" se refiere a naftilalanina.
"pG" o "pGly" se refiere a pentilglicina.
"tBuG" se refiere a terc-butilglicina.
"ThioP" o "tPro" se refiere a tioprolina.
"3Hyp" se refiere a 3-hidroxiprolina
"4Hyp" se refiere a 4-hidroxiprolina
"NAG" se refiere a N-alquilglicina
"NAPG" se refiere a N-alquilpentilglicina
"Norval" se refiere a norvalina
"Norleu" se refiere a norleucina
Preparación de compuestos
Los compuestos tales como las exendinas y los agonistas de exendina descritos en el presente documento se pueden preparar usando técnicas estándar de síntesis de péptidos en fase sólida y preferiblemente usando un sintetizador de péptidos automático o semiautomático. Normalmente, usando dichas técnicas, un aminoácido protegido con N-carbamoilo y un aminoácido unido a la cadena de péptido en crecimiento sobre una resina se acoplan a temperatura ambiente en un disolvente inerte tal como dimetilformamida, N-metilpirrolidinona o cloruro de metileno en presencia de agentes de acoplamiento tales como diciclohexilcarbodiimida y 1-hidroxibenzotriazol en presencia de una base tal como diisopropiletilamina. El grupo protector de N-carbamoilo se elimina del péptido-resina resultante usando un reactivo tal como ácido trifluoroacético o piperidina, y la reacción de acoplamiento se repite con el siguiente aminoácido N-protegido que se desea añadir a la cadena de péptido. Los grupos N-protectores adecuados son conocidos en la técnica, y en el presente documento se prefieren el t-butiloxicarbonilo (tBoc) y el fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc).
Los disolventes, derivados de aminoácidos y la resina de 4-metilbencidril-amina usados en el sintetizador de péptidos se pueden adquirir en Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA). Se pueden adquirir los siguientes aminoácidos con cadenas laterales protegidos en Applied Biosystems, Inc.: Boc-Arg(Mts), Fmoc-Arg(Pmc), Boc-Thr(Bzl), Fmoc-Thr(t-Bu), Boc-Ser(Bzl), Fmoc-Ser(t-Bu), Boc-Tyr(BrZ), Fmoc-Tyr(t-Bu), Boc-Lys(Cl-Z), Fmoc-Lys(Boc), Boc-Glu(Bzl), Fmoc-Glu(t-Bu), Fmoc-His(Trt), Fmoc-Asn(Trt), y Fmoc-Gln(Trt). Boc-His(BOM) se puede adquirir en Applied Biosystems, Inc. o Bachem Inc. (Torrance, CA). El anisol, sulfuro de dimetilo, fenol, etanoditiol y tioanisol se pueden obtener en Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI). Air Products and Chemicals (Allentown, PA) suministran el HF. El éter etílico, ácido acético y metanol se pueden adquirir en Fisher Scientific (Pittsburgh, PA).
La síntesis de péptidos en fase sólida se puede llevar a cabo con un sintetizador de péptidos automático (Modelo 430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) usando el sistema de NMP/HOBt (Opción 1) y los procedimientos químicos con tBoc o Fmoc (véase el manual de usuario de Applied Biosystems para el sintetizador ABI 430A Peptide Synthesizer, Versión 1.3B 1 de julio de 1988, sección 6, pág. 49-70, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) con grupos terminales. Las Boc-péptido-resinas se pueden escindir con HF (-5ºC a 0ºC, 1 hora). El péptido se puede extraer de la resina alternando agua y ácido acético, y liofilizar los filtrados. Las Fmoc-péptido-resinas se pueden escindir de acuerdo con procedimientos estándar (Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc., 1990, pág. 6-12). Los péptidos también se pueden acoplar usando un sintetizador Advanced Chem Tech Synthesizer (Modelo MPS 350, Louisville, Kentucky).
Los péptidos se pueden purificar por RP-HPLC (preparativa y analítica) usando un sistema Waters Delta Prep 3000. Se puede usar una columna preparativa C4, C8 o C18 (10 \mu, 2,2 x 25 cm; Vydac, Hesperia, CA) para aislar los péptidos, y la pureza se puede determinar usando columnas analíticas C4, C8 o C18 (5 \mu, 0,46 x 25 cm; Vydac). Los disolventes (A= TFA al 0,1%/agua y B= TFA al 0,1%/CH_{3}CN) se pueden suministrar a la columna analítica con un caudal de 1,0 ml/min y a la columna preparativa a 15 ml/min. El análisis de aminoácidos se puede realizar en un sistema Waters Pico Tag y se puede procesar usando el programa Maxima. Los péptidos se pueden hidrolizar por hidrólisis ácida en fase de vapor (115ºC, 20-24 h). Los hidrolisatos se pueden obtener y analizar por procedimientos estándar (Cohen, y col., The Pico Tag Method: A Manual of Advanced Techniques for Amino Acid Analysis, pág. 11-52, Millipore Corporation, Milford, MA (1989)). El análisis por bombardeo de átomos rápidos se puede llevar a cabo por M-Scan, Incorporated (West Chester, PA). La calibración de masas se puede realizar usando yoduro de cesio/glicerol. Los análisis por ionización y desorción por plasma usando detección por tiempo de vuelo se pueden llevar a cabo en un espectrómetro de masas Applied Biosystems Bio-Ion 20. La espectrometría de masas por electropulverización se puede llevar a cabo en una máquina VG-Trio.
Los compuestos peptídicos útiles en la invención también se pueden preparar usando técnicas de ADN recombinante, usando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2d Ed., Cold Spring Harbor (1989). Los compuestos no peptídicos útiles en la presente invención se pueden preparar por procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los aminoácidos que contienen fosfato y los péptidos que contienen dichos aminoácidos se pueden preparar usando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Bartlett and Landen. Biorg. Chem. 14:356-377 (1986).
La exendina o los análogos o derivados de agonistas de GLP-1 están incluidos en los procedimientos de la presente invención. Los análogos o derivados son variantes funcionales de una exendina o de GLP-1 que tienen una secuencia de aminoácidos similar y retienen, en cierta medida, el aumento del flujo de orina, aumento de la excreción de sodio y/o disminución de la excreción de potasio, actividades de la exendina o GLP-1 de origen o agonistas de los mismos. Por una variante funcional se entiende que el derivado tiene una actividad que se puede sustituir por una o más actividades de una exendina o GLP-1 particular o un agonista del mismo. Las variantes funcionales preferidas retienen todas las actividades de una exendina particular o GLP-1 o un agonista de los mismos, sin embargo, la variante funcional puede tener una actividad que cuando se mide cuantitativamente, es más fuerte o más débil, medido en ensayos funcionales, por ejemplo, como los descritos en el presente documento. Las variantes funcionales preferidas tienen actividades que están dentro de aproximadamente 1% a aproximadamente 10.000% de la actividad de la exendina relacionada, GLP-1 o agonista de los mismos, más preferiblemente entre aproximadamente 10% y aproximadamente 1000%, y más preferiblemente dentro de aproximadamente 50% a aproximadamente 500%. Los derivados tienen al menos aproximadamente 50% de similitud de secuencia, preferiblemente aproximadamente 70%, más preferiblemente aproximadamente 90%, e incluso más preferiblemente aproximadamente 95% de similitud de secuencia con la exendina relacionada o GLP-1 o un agonista de los mismos. "Similitud de secuencia" se refiere a "homología" observada entre las secuencias de aminoácidos en dos polipéptidos diferentes, independientemente del origen del polipéptido.
La capacidad del derivado para retener alguna actividad se puede medir usando técnicas descritas en el presente documento. Los derivados incluyen modificaciones que se producen durante o después de la traducción, por ejemplo, por fosforilación, glicosilación, reticulación, acilación, escisión proteolítica, unión a una molécula de anticuerpo, molécula de membrana u otro ligando (véase, Ferguson y col., Annu. Rev. Biochem. 57:285-320, 1988).
Los derivados se pueden producir usando técnicas de química estándar y técnicas de moléculas de ácido nucleico recombinantes. Las modificaciones a un polipéptido específico pueden ser deliberadas, tal como por mutagénesis dirigida y sustitución de aminoácido durante la síntesis en fase sólida, o pueden ser accidentales tal como por mutaciones en huéspedes que producen el polipéptido. Los polipéptidos, incluidos los derivados, se pueden obtener usando técnicas estándar tales como las descritas por Sambrook, y col., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Los compuestos citados anteriormente forman sales con diferentes ácidos y bases inorgánicos y orgánicos. Dichas sales incluyen sales preparadas con ácidos orgánicos e inorgánicos, por ejemplo, HCl, HBr, H_{2}SO_{4}, H_{3}PO_{4}, ácido trifluoroacético, ácido acético, ácido fórmico, ácido metanosulfónico, ácido toluenosulfónico, ácido maleico, ácido fumárico y ácido canforsulfónico. Las sales preparadas con bases incluyen sales de amonio, sales de metal alcalino, p. ej., sales de sodio y potasio, y sales alcalinotérreas, p. ej., sales de calcio y magnesio. Las sales se pueden formar por medios convencionales, tal como haciendo reaccionar las formas de ácido o base libre del producto con uno o más equivalentes de la base o ácido adecuado en un disolvente o medio en el que la sal sea insoluble, o en un disolvente tal como agua que después se elimina a vacío o por liofilización o por intercambio de los iones de una sal existente por otro ion en una resina de intercambio iónico adecuada.
Las composiciones reivindicadas también se pueden formular en forma de sales farmacéuticamente aceptables (p. ej., sales de adición de ácido) y/o complejos de las mismas. Las sales farmacéuticamente aceptables son sales no tóxicas a la concentración a la cual se administran. La preparación de dichas sales puede facilitar el uso farmacológico alterando las características fisicoquímicas de la composición sin impedir que la composición ejerza su efecto fisiológico. Los ejemplos de alteraciones útiles en las propiedades físicas incluyen la disminución del punto de fusión para facilitar la administración transmucosa y aumento de la solubilidad para facilitar la administración de concentraciones mayores del fármaco.
Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición de ácido tales como las que contienen sulfato, clorhidrato, fosfato, sulfamato, acetato, citrato, lactato, tartrato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato, ciclohexilsulfamato y quinato. Las sales farmacéuticamente aceptables se pueden obtener a partir de ácidos tales como el ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido sulfámico, ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido malónico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido ciclohexilsulfámico y ácido quínico. Dichas sales se pueden preparar, por ejemplo, haciendo reaccionar las formas de ácido o base libre del producto con uno o más equivalentes de la base o ácido adecuado en un disolvente o medio, en el que la sal es insoluble o en un disolvente tal como agua que después se elimina a vacío o por liofilización o por intercambio de lo iones de una sal existente por otro ion en una resina de intercambio iónico adecuada.
Los compuestos descritos antes son útiles en vista de sus propiedades farmacológicas. En particular, los compuestos de la invención tienen actividad como agentes para aumentar el flujo de orina, aumentar la excreción de sodio y disminuir la excreción de potasio, y aliviar afecciones o enfermedades asociadas con la hipervolemia tóxica.
Las composiciones útiles en la invención se pueden proporcionar convenientemente en forma de formulaciones adecuadas para administración parenteral (incluida intravenosa, intramuscular y subcutánea) o nasal u oral. En algunos casos, será conveniente proporcionar una exendina o agonista de exendina y otro agente de reducción de la ingestión de alimento, disminución de la glucosa en el plasma o disminución de lípidos en el plasma, tales como amilina, un agonista de amilina, una CCK o una leptina, en una sola composición o solución para administrar juntos. En otros casos, puede ser más ventajoso administrar el agente adicional por separado de dicha exendina o agonista de exendina. Un formato de administración adecuado lo puede determinar mejor el médico para cada paciente de forma individual. Los vehículos farmacéuticamente adecuados y su formulación están descritos en tratados de formulación convencionales, p. ej., Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin. Véase también, Wang, Y.J. y Hanson, M.A. "Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers," Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42:2S (1988).
Los compuestos útiles en la invención se pueden proporcionar en forma de composiciones parenterales para inyección o infusión. Por ejemplo, se pueden suspender en un aceite inerte, de forma adecuada un aceite vegetal tal como aceite de sésamo, cacahuete, oliva u otro vehículo aceptable. Preferiblemente, se suspenden en un vehículo acuoso, por ejemplo, en una solución de tampón isotónica a un pH de aproximadamente 3,0 a 8,0, preferiblemente a un pH de aproximadamente 3,5 a 5,0. Estas composiciones se pueden esterilizar por técnicas de esterilización convencionales o se pueden esterilizar por filtración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sean necesarias para aproximar las condiciones fisiológicas, tales como agente de tamponamiento del pH. Los tampones útiles incluyen, por ejemplo, tampones de acetato sódico/ácido acético. Se puede usar una forma de preparación de liberación lenta de "depósito" o almacén de modo que se liberen cantidades terapéuticamente eficaces de la preparación en el torrente sanguíneo a lo largo de muchas horas o días después de la inyección o suministro transdérmico.
La isotonicidad deseada se puede lograr usando cloruro sódico u otros agentes farmacéuticamente aceptables tales como dextrosa, ácido bórico, tartrato sódico, propilenglicol, polioles (tales como manitol y sorbitol) u otros solutos inorgánicos u orgánicos. Se prefiere el cloruro sódico en particular para tampones que contienen iones sodio.
También se pueden usar vehículos o excipientes para facilitar la administración del compuesto. Los ejemplos de vehículos y excipientes incluyen carbonato cálcico, fosfato cálcico, diferentes azúcares tales como lactosa, glucosa o sacarosa u otros tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales, polietilenglicoles y disolventes fisiológicamente compatibles.
Si se desea, las soluciones de las composiciones anteriores se pueden espesar con un agente de espesamiento tal como metilcelulosa. Se pueden preparar en forma emulsionada, de agua en aceite o de aceite en agua. Se puede usar cualquiera de una amplia variedad de agentes emulsionantes farmacéuticamente aceptables, incluyendo, por ejemplo, polvo de goma de agar, un tensioactivo no iónico (tal como un Tween) o un tensioactivo iónico (tal como poliéter-alcohol-sulfatos o sulfonatos alcalinos, p. ej. un Triton).
Las composiciones útiles en la invención se preparan mezclando los ingredientes siguiendo procedimientos aceptados en general. Por ejemplo, los componentes seleccionados se pueden mezclar simplemente en un mezclador u otro dispositivo estándar para producir una mezcla concentrada, la cual después se puede ajustar a la concentración y viscosidad final por la adición de agua o agente espesante y posiblemente un tampón para controlar el pH o un soluto adicional para controlar la tonicidad.
Para uso médico, las composiciones se proporcionarán en forma de unidad de dosificación que contiene una cantidad de una exendina o agonista de exendina, por ejemplo, exendina-3 y/o exendina-4. Las cantidades terapéuticamente eficaces de una exendina o agonista de exendina para usar para aumentar el flujo de orina, son aquellas que aumentan el flujo de orina a una tasa y nivel deseados. Como reconocerán los expertos en la materia, una cantidad eficaz del agente terapéutico variará con muchos factores incluyendo la edad y peso del paciente, la afección física del paciente y otros factores.
La dosis eficaz de los compuestos normalmente estará en el intervalo de 1-30 \mug a aproximadamente 10-20 mg, preferiblemente aproximadamente de 30 \mug a 10 mg y más preferiblemente aproximadamente de 300 \mug a 5 mg, lo más preferiblemente de 30 \mug a aproximadamente 1 mg. La dosis exacta que se va a administrar la determinará el médico que atiende y dependerá, por ejemplo, de dónde cae el compuesto particular dentro del intervalo mencionado antes. La administración debe empezar cuando se desee el efecto diurético, por ejemplo, a la primera señal o síntomas o enseguida después del diagnóstico de insuficiencia renal, insuficiencia cardíaca congestiva, síndrome nefropático, edema pulmonar, cirrosis, hipertensión, eclampsia o preeclampsia. La administración puede ser por inyección, preferiblemente subcutánea o intramuscular. Los compuestos activos por vía oral se pueden tomar por vía oral, pero las dosificaciones deben aumentarse 5-10 veces.
La formulación óptima y el modo de administración de los compuestos de la presente solicitud a un paciente dependen de factores conocidos en la técnica tales como la enfermedad o trastorno particular, el efecto deseado y el tipo de paciente. Aunque los compuestos normalmente se usarán para tratar sujetos humanos, también se pueden usar para tratar enfermedades similares o idénticas en otros vertebrados tales como otros primates, animales de granja tales como cerdos, ganado y aves, y animales para deportes y mascotas tales como caballos, perros y gatos.
Para ayudar a entender la presente invención, se incluyen los siguientes ejemplos. Por supuesto, los experimentos relacionados con esta invención no se debe interpretar que limiten específicamente la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1
Efectos diuréticos de la administración de GLP-1 o exendina
Materiales: El GLP-1 y la exendina-4 se compraron en Bachem, Inc., Torrance, CA, o se sintetizaron en Amylin Pharmaceuticals, Inc., como se describe en el presente documento. Los transductores/transmisores de presión arterial se obtuvieron de Data Sciences, Inc.
Estudios in vivo en ratas anestesiadas: Ratas Sprague Dawley Harlan macho se albergaron a 23\pm1ºC en un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 horas (llevándose a cabo los experimentos durante el ciclo de luz) y se les dio alimento y agua a voluntad (Diet LM-485, Teklad, Madison, WI). Se hizo ayunar a los animales, que pesaban 325-375 g, durante \sim20 horas antes de la experimentación.
Preparación quirúrgica: La preparación usada aquí era como la descrita por Young y col., (Drug Dev Res. 37:231-248,1996), pero modificada por la adición de canulación uretral unilateral. La anestesia se indujo con halotano a 5%, se mantuvo con halotano al 2% durante la cirugía y después de 0,7 a 1%. Se llevaron a cabo la traqueotomía y canulación de una arteria femoral, la vena safena y un solo uréter. Se usó la vía arterial, perfundida con solución salina heparinizada (2 U/ml) para la toma de muestras de sangre y la medición de la presión (transductor Spectramed P23XL, amplificador Modelo 13-4615-58, Gould, Cleveland, OH). La vía venosa se usó para la administración de fármaco. La velocidad de infusión salina total se mantuvo a 4 ml/h. Se midió la temperatura colónica y se controló usando una sonda termistor/controlador (Modelo 73A, YSI, Yellow Springs, OH) y una mesa de operación calentada. Se tomaron muestras periódicamente de las señales de la presión arterial media a 1 Hz con una precisión de 12 bit (DataTranslation DT2801A) y se registraron (Labtech Notebook).
Procedimientos numéricos: Las curvas de dosis-respuesta se ajustaron a funciones logísticas de 4 parámetros y las CE_{50} se obtuvieron usando el programa Prism (v2.0, GraphPad Software, San Diego, CA). Las observaciones se expresan como el porcentaje del valor inicial, definido como la media de las mediciones hechas en los 30 min previos a empezar la infusión de péptido o vehículo. Los datos se expresan como media \pm ETM. n = 5-6.
Mediciones: Se recogieron muestras de sangre arterial (160 \mul) periódicamente y se recogieron muestras de orina cada 15 min. Las concentraciones de sodio y potasio en el plasma y la orina se midieron con electrodos selectivos de iones usando el analizador Ciba/Corning 614 Na/K (Ciba/Corning, Inc., Medfield, MA). Se midió el flujo de orina unilateral pesando la producción de 15 minutos del uréter canulado. El flujo de orina total se calculó como el doble de esta cantidad.
Tratamientos: Para obtener la dosis-respuesta, los péptidos se disolvieron en NaCl 0,15 M y se administraron como bolos de 0,1 ml. La administración de GLP-1 tenía un fuerte efecto en el aumento del flujo de orina (DE_{50} = 0,71 \mug \pm 0,26 unidades log). La respuesta máxima como porcentaje del flujo de orina predosis era 1764 \pm 281% a los 15 minutos para la dosis de 16,5 \mug (Figuras 3A-B). La administración de GLP-1 también aumento la excreción de sodio (Figuras 4A-B). Sin embargo, GLP-1 disminuyó significativamente la excreción de potasio (Figuras 5A-B) (DE_{50}>0,25 \mug \pm 34 unidades log con una caída máxima a 13,9 \pm 1,7% de las concentraciones predosis con una dosis de 1,65 \mug). La administración de exendina-4 también aumento el flujo de orina (Figuras 8A-B). La DE_{50} era 0,12 \mug \pm 0,18 unidades log y la respuesta máxima como porcentaje del flujo de orina predosis era 2160 \pm470% a los 15 minutos para la dosis de 21 \mug. La administración de exendina también aumentó la excreción de sodio (Figuras 9A-B). Sin embargo, la excreción de potasio disminuyó (Figuras 10A-B). La DE_{50} era 0,07 \mug \pm 0,26 unidades log con una disminución máxima a 9,6 \pm 1,4% de las concentraciones de predosis con una dosis de 21 \mug.
Ejemplo 2
Medición de la presión arterial y dP/dt en ratas conscientes por telemetría después de administración de GLP-1 o exendina-4
Inserción de transductores: Ratas Sprague Dawley Harlan macho se anestesiaron con halotano y después la aorta abdominal se expuso de laparotomía. De acuerdo con los procedimientos detallados en el manual "Pressure Telemetry" de Data Sciences Inc., los transductores/transmisores de presión se fijaron en su sitio en la pared abdominal con el extremo del catéter en la aorta abdominal \sim2 mm por encima de la bifurcación. Después del cierre, los animales se recuperaron para permitir al menos 7 días de registros estables. Los datos de los valores iniciales se recogieron durante los 7+ días después de la cirugía.
Medición de la presión arterial y dP/dt: Después de obtener unos valores iniciales estables, las ratas recibieron una inyección intraperitoneal (ip) de GLP-1, exendina o vehículo solo (NaCl). Las señales transmitidas se recogieron por telemetría y se almacenaron en un ordenador personal. La tasa de cambio de la presión dP/dt, se calculó con el software proporcionado por Data Sciences.
GLP-1: Los animales recibieron una sola inyección intraperitoneal (ip) de solución salina o GP-1 (100 \mul), n = 7-8. Las figuras 1A-B representan el aumento de la presión arterial media después de la administración de GLP-1. La figura 2 representa el aumento de la contractilidad cardíaca después de la administración de GLP-1.
Exendina-4: La exendina-4 o solución salina (250 \mul) se dieron dos veces al día (bid) por inyección ip durante cinco días. n = 8 para los grupos de solución salina y 5-6 para los de exendina. Las figuras 6A-B representan el aumento de la presión arterial media después de la administración de exendina-4. La figura 7 representa el aumento de la contractilidad cardíaca después de la administración de exendina-4.
Ejemplo 3
Acciones cardiovasculares de la exendina-4 y GLP-1 medida usando sondas de flujo transónico en ratas anestesiadas
Materiales, cría de animales y canulación con anestesia: Los materiales para la cría de animales y canulación con anestesia eran como se han descrito en el ejemplo 1. Ratas Sprague Dawley macho (350-450 g) anestesiadas con halotano, se canularon por la vena safena (para la inyección de péptido) y la arteria femoral (para la medición de la presión arterial).
Cirugía: Se puso una sonda de tiempo de tránsito del flujo (2 mm, 2SB, Transonic Systems Inc., Ithaca Nueva York) alrededor de la aorta abdominal, distal de las ramas de las arterias renal, mesentérica e iliaca.
Mediciones: La sonda de flujo se conectó a un medidor de flujo de doble canal Transonic TS-206 para la medición del flujo de sangre de la aorta abdominal. El ritmo cardíaco se registró usando electrodos de ECG estándar. Se inyectaron por vía intravenosa los péptidos o vehículo (solución salina) con un volumen total de 100 \mul a lo largo de 1-2 minutos. La presión arterial media (PAM), ritmo cardíaco (RC) y el flujo de sangre aórtico medio, se registraron cada segundo usando el software de adquisición de datos Labtek Notebook a lo largo del periodo experimental. Después se obtuvieron la conductancia aórtica (flujo/PAM; ml/min/mm de Hg) y el volumen de latido (flujo/RC; ml/min por latidos/min = ml).
Tratamientos: Se inyectó exendina-4 con dosis de 0,021, 0,21, 2,1 y 21 \mug, y GLP-1 se inyectó con dosis de 0,0165, 0,165, 1,65 y 16,5 \mug después de un periodo de control de 20 min.
Resultados
GLP-1: GLP-1 con una dosis de 16,5 \mug aumento la presión arterial media en 22 mm de Hg en los 5 minutos después de la administración. El flujo aórtico de sangre aumentó en 57% de 14 a 22 ml/min, el ritmo cardíaco en 17% de 360 a 420 latidos/min, el volumen de latido en 38% de 37 a 51 \mul, y la conductancia aórtica en 50% de 0,12 a 0,18 ml/min/mm de Hg dentro en los 2 minutos después de la administración de GLP-1. Los efectos duraron aproximadamente 10 min.
Exendina-4: Se observó un patrón de efectos similar con una dosis de 0,21 \mug de exendina-4 (aumento de \sim30 mm de Hg en la presión sanguínea; aumento de 60% en el flujo de sangre aórtico; aumento de 40% del ritmo cardíaco; aumento de 60% del volumen de latido; aumento de 35% de la conductancia aórtica), excepto que los efectos persistieron durante 30-60 min. Estas respuestas, en las que hay cambios grandes del flujo de sangre aórtico y cambios menores en la presión arterial, están de acuerdo con que GLP-1 y la exendina-4 tengan propiedades inotrópicas (estimulador cardíaco) y vasodilatadoras.
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Ejemplo 4
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 5
9
[ID SEC Nº 5]
El péptido amidado anterior se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.). En general, se usaron ciclos de un acoplamiento a lo largo de toda la síntesis y se usó la química de Fast Moc (activación con HBTU). La desprotección (eliminación del grupo Fmoc) de la cadena de péptido en crecimiento se logró usando piperidina. La desprotección final de la resina-péptido completado se logró usando una mezcla de trietilsilano (0,2 ml), etanoditiol (0,2 ml), anisol (0,2 ml), agua (0,2 ml) y ácido trifluoroacético (15 ml) de acuerdo con procedimientos estándar (Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc.). El péptido se hizo precipitar en éter/agua (50 ml) y se centrifugó. El precipitado se reconstituyó en ácido acético glacial y se liofilizó. El péptido liofilizado se disolvió en agua. La pureza en bruto era aproximadamente 75%.
En las etapas de purificación y el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN).
La solución que contenía el péptido se aplicó a una columna C-18 preparativa y se purificó (disolvente B en disolvente A de 10% a 40% a lo largo de 40 minutos). La pureza de las fracciones se determinó de forma isocrática usando una columna analítica C-18. Las fracciones puras se juntaron proporcionando el péptido identificado antes. La RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 50% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 18,9 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3408,0; encontrado 3408,9.
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Ejemplo 5
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 6
10
[ID SEC Nº 6]
El péptido amidado anterior se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 40% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 17,9 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3294,7; encontrado 3294,8.
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Ejemplo 6
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 7
11
[ID SEC Nº 7]
El péptido amidado anterior se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 29% a 36% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 20,7 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3237,6; encontrado 3240.
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Ejemplo 7
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 8
12
[ID SEC Nº 8]
El péptido amidado anterior se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 36% a 46% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 15,2 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3251,6; encontrado 3251,5.
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Ejemplo 8
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 9
13
[ID SEC Nº 9]
El péptido amidado anterior se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 36% a 46% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 13,1 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3207,6; encontrado 3208,3.
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Ejemplo 9
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 10 
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14 
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[ID SEC Nº 10]
El péptido amidado anterior se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 35% a 45% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 12,8 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3161,5; encontrado 3163.
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Ejemplo 10
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 11 
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15 
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[ID SEC Nº 11]
El péptido amidado identificado antes se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 36% a 46% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 15,2 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3221,6; encontrado 3222,7.
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Ejemplo 11
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 12 
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16 
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[ID SEC Nº 12]
El péptido amidado identificado antes se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 34% a 44% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 14,3 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3195,5; encontrado 3199,4.
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Ejemplo 12
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 13 
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17 
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[ID SEC Nº 13]
El péptido amidado identificado antes se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 38% a 48% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 15,7 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3221,6; encontrado 3221,6.
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Ejemplo 13
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 14 
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18 
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[ID SEC Nº 14]
El péptido amidado identificado antes se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 38% a 48% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 18,1 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3180,5; encontrado 3180,9.
Ejemplo 14
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 15 
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19 
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[ID SEC Nº 15]
El péptido amidado identificado antes se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 36% a 46% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 17,0 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3180,6; encontrado 3182,8.
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Ejemplo 15
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 16 
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20 
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[ID SEC Nº 16]
El péptido amidado identificado antes se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 32% a 42% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 14,9 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3195,5; encontrado 3195,9.
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Ejemplo 16
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 17 
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21 
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[ID SEC Nº 17]
El péptido amidado identificado antes se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 37% a 47% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 17,9 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3176,6; encontrado 3179,0.
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Ejemplo 17
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 18 
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22 
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[ID SEC Nº 18]
El péptido amidado identificado antes se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 37% a 47% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 14,3 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3179,6; encontrado 3180,0.
Ejemplo 18
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 19 
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23 
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[ID SEC Nº 19]
El péptido identificado antes se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 37% a 47% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 13,7 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3176,6; encontrado 3179,0.
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Ejemplo 19
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 20 
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24 
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[ID SEC Nº 20]
El péptido amidado identificado antes se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 35% a 45% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 14,0 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3209,6; encontrado 3212,8.
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Ejemplo 20
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 21 
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25 
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[ID SEC Nº 21]
El péptido amidado identificado antes se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 38% a 48% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 14,3 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3152,5; encontrado 3153,5.
Ejemplo 21
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 22 
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26 
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[ID SEC Nº 22]
El péptido amidado identificado antes se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 35% a 45% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 12,1 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3195,5; encontrado 3197,7.
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Ejemplo 22
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 23 
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27 
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[ID SEC Nº 23]
El péptido amidado identificado antes se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 38% a 48% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 10,9 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3179,6; encontrado 3180,5.
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Ejemplo 23
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 24 
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28 
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[ID SEC Nº 24]
El péptido amidado identificado antes se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 32% a 42% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 17,5 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3161,5; encontrado 3163,0.
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Ejemplo 24
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 25 
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29 
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[ID SEC Nº 25]
El péptido amidado identificado antes se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 32% a 42% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 19,5 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3195,5; encontrado 3199.
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Ejemplo 25
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 26 
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30 
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[ID SEC Nº 26]
El péptido amidado identificado antes se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 38% a 48% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 14,5 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3180,5; encontrado 3183,7.
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Ejemplo 26
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 27 
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31 
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[ID SEC Nº 27]
El péptido amidado identificado antes se unió a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escindió de la resina, se desprotegió y se purificó de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usaron el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). La RP-HPLC analítica (gradiente de 34% a 44% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado dio el producto peptídico con un tiempo de retención observado de 22,8 minutos. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3194,6; encontrado 3197,6.
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Ejemplo 27
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 28 
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32 
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[ID SEC Nº 28]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 4099,6.
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Ejemplo 28
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 29 
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33 
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[ID SEC Nº 29]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 4042,5.
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Ejemplo 29
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 30 
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34 
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[ID SEC Nº 30]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 4002,4.
Ejemplo 30
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 31 
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35 
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[ID SEC Nº 31]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3945,4.
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Ejemplo 31
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 32 
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36 
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[ID SEC Nº 32]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3905,3.
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Ejemplo 32
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 33 
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37 
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[ID SEC Nº 33]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3848,2.
Ejemplo 33
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 34 
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38 
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[ID SEC Nº 34]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3808,2.
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Ejemplo 34
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 35 
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380 
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[ID SEC Nº 35]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3751,1.
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Ejemplo 35
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 36 
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39 
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[ID SEC Nº 36]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3737,1.
\newpage
Ejemplo 36
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 37 
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40 
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[ID SEC Nº 37]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3680,1.
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Ejemplo 37
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 38 
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41 
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[ID SEC Nº 38]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3680,1.
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Ejemplo 38
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 39 
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42 
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[ID SEC Nº 39]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3623,0.
\newpage
Ejemplo 39
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 40 
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43 
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[ID SEC Nº 40]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3593,0.
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Ejemplo 40
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 41 
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44 
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[ID SEC Nº 41]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3535,9.
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Ejemplo 41
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 42 
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45 
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[ID SEC Nº 42]
El péptido identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3505,9.
\newpage
Ejemplo 42
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 43 
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46 
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[ID SEC Nº 43]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3448,8.
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Ejemplo 43
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 44 
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47 
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[ID SEC Nº 44]
El péptido identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3351,7.
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Ejemplo 44
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 45 
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48 
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[ID SEC Nº 45]
El péptido identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3351,8.
\newpage
Ejemplo 45
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 46 
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49 
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[ID SEC Nº 46]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3294,7.
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Ejemplo 46
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 47 
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50 
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[ID SEC Nº 47]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. Se requieren acoplamientos dobles en los restos 37, 36 y 31. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 4197,1.
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Ejemplo 47
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 48 
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51 
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[ID SEC Nº 48]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. Se requieren acoplamientos dobles en los restos 37, 36 y 31. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 4179,1.
\newpage
Ejemplo 48
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 49 
\vskip1.000000\baselineskip
52 
\vskip1.000000\baselineskip
[ID SEC Nº 49]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. Se requieren acoplamientos dobles en los restos 36 y 31. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3948,3.
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Ejemplo 49
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 50 
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53 
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[ID SEC Nº 50]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. Se requieren acoplamientos dobles en los restos 36 y 31. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3840,1.
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Ejemplo 50
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 51 
\vskip1.000000\baselineskip
54 
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[ID SEC Nº 51]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. Se requieren acoplamientos dobles en los restos 36 y 31. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 4050,1.
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Ejemplo 51
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 52 
\vskip1.000000\baselineskip
55 
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[ID SEC Nº 52]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. Se requiere un acoplamiento doble en el resto 31. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3937,1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 52
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 53 
\vskip1.000000\baselineskip
56 
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[ID SEC Nº 53]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3827,2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 53
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 54
\vskip1.000000\baselineskip
57 
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[ID SEC Nº 54]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3394,8.
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Ejemplo 54
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 55 Naftilala 
\vskip1.000000\baselineskip
58 
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[ID SEC Nº 55]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3289,5.
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Ejemplo 55
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 56 
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59 
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[ID SEC Nº 56]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3280,7.
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Ejemplo 56
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 57 
\vskip1.000000\baselineskip
60 
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[ID SEC Nº 57]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3294,7.
Ejemplo 57
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 58
61
[ID SEC Nº 58]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3250,7.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 58
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 59 Pentilgly
62
[ID SEC Nº 59]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3253,5.
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Ejemplo 59
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 60 Naftilala
63
[ID SEC Nº 60]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3289,5.
\newpage
Ejemplo 60
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 61 tButilgly
64
[ID SEC Nº 61]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3183,4.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 61
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 62
65
[ID SEC Nº 62]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3237,6.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 62
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 63
66
[ID SEC Nº 63]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3637,9.
\newpage
Ejemplo 63
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 64
67
[ID SEC Nº 64]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3309,7.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 64
Preparación del péptido que tiene el ID SEC Nº 65
68
[ID SEC Nº 65]
El péptido amidado identificado antes se une a 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil-fenoxi-acetamida-norleucina-resina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmol/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinde de la resina, se desprotege y se purifica de una forma similar al ejemplo 4. Se requieren acoplamientos dobles en los restos 36 y 31. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. Espectrometría de masas por electropulverización (M): calculado 3711,1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 65
Preparación de los péptidos ácido carboxílico C-terminales correspondientes a las secuencias de amida C-terminales para los ID SEC Nº 5-27, 34-41, 44-46 y 53-64
Los péptidos que tienen las secuencias de los ID SEC Nº 5-27, 34-41, 44-46 y 53-64 se unen a la denominada resina de Wang (resina de p-alcoxi(alcohol bencílico) (Bachem, 0,54 mmol/g)) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinden de la resina, se desprotegen y se purifican de una forma similar al Compuesto 1. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. La espectrometría de masas por electropulverización proporciona una (M) determinada experimentalmente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 66
Preparación de los péptidos ácido carboxílico C-terminales correspondientes a las secuencias de amida C-terminales para los ID SEC Nº 28-33, 42, 43, 47-52 y 65
Los péptidos que tienen la secuencia de los ID SEC Nº 28-33, 42, 43, 47-52 y 65 se unen a la resina de cloruro de 2-clorotritilo (nº de malla 200-400), DVB al 2% (Novabiochem, 0,4-1,0 mmol/g)) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.), se escinden de la resina, se desprotegen y se purifican de una forma similar al Compuesto 1. En el análisis se usan el disolvente A (TFA al 0,1% en agua) y el disolvente B (TFA al 0,1% en ACN). Después se lleva a cabo la RP-HPLC analítica (gradiente de 30% a 60% de disolvente B en disolvente A a lo largo de 30 minutos) del péptido liofilizado para determinar el tiempo de retención del producto peptídico. La espectrometría de masas por electropulverización proporciona una (M) determinada experimentalmente.

Claims (10)

  1. \global\parskip0.960000\baselineskip
    1. Un uso de un compuesto para fabricar un medicamento para tratar, prevenir o aliviar una afección o trastorno asociados con la hipervolemia tóxica en un individuo, en el que 
    \hbox{dicho compuesto se selecciona del grupo constituido 
por:}
    (a)
    una exendina o un agonista de exendina, y
    (b)
    un GLP-1 o un agonista de GLP-1.
  2. 2. El uso de la reivindicación 1, en el que la medicación aumenta el flujo de orina en el individuo.
  3. 3. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que la medicación aumenta la excreción de sodio, disminuye la excreción de potasio o no aumenta la excreción de potasio en la orina en el individuo.
  4. 4. El uso de la reivindicación 1, en el que la medicación aumenta la contractilidad cardíaca en el individuo.
  5. 5. El uso de las reivindicaciones 1-4, en el que la afección o trastorno es una cualquiera o más de una insuficiencia renal, insuficiencia cardíaca congestiva, síndrome nefrótico, edema pulmonar, edema sistémico, cirrosis, hipertensión, preeclampsia o eclampsia del embarazo.
  6. 6. El uso de las reivindicaciones 1-4, en el que la prevención de una afección o trastorno asociado con la hipervolemia tóxica comprende tratar el individuo antes de una intervención quirúrgica.
  7. 7. El uso de la reivindicación 6, en el que la intervención quirúrgica es una intervención quirúrgica ocular o una intervención neuroquirúrgica.
  8. 8. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha exendina es la exendina-3 [ID SEC Nº 1] o la exendina 4 [ID SEC Nº 2].
  9. 9. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho agonista de exendina es un compuesto peptídico de fórmula [ID SEC Nº 4]:
    69
    en la que
    Xaa_{1} es His, Arg o Tyr;
    Xaa_{2} es Ser, Gly, Ala o Thr;
    Xaa_{3} es Asp o Glu;
    Xaa_{5} es Ala o Thr;
    Xaa_{6} es Ala, Phe, Tyr o naftilalanina;
    Xaa_{7} es Thr o Ser;
    Xaa_{8} es Ala, Ser o Thr;
    Xaa_{9} es Asp o Glu;
    Xaa_{10} es Ala, Leu, Ile, Val, pentilglicina o Met;
    Xaa_{11} es Ala o Ser;
    Xaa_{12} es Ala o Lys;
    Xaa_{13} es Ala o Gln;
    Xaa_{14} es Ala, Leu, Ile, pentilglicina, Val o Met;
    Xaa_{15} es Ala o Glu;
    Xaa_{16} es Ala o Glu;
    Xaa_{17} es Ala o Glu;
    Xaa_{19} es Ala o Val;
    Xaa_{20} es Ala o Arg;
    Xaa_{2l} es Ala o Leu;
    Xaa_{22} es Phe, Tyr o naftilalanina;
    Xaa_{23} es Ile, Val, Leu, pentilglicina, terc-butilglicina o Met;
    Xaa_{24} es Ala, Glu o Asp;
    Xaa_{25} es Ala, Trp, Phe, Tyr o naftilalanina;
    Xaa_{26} es Ala o Leu;
    Xaa_{27} es Ala o Lys;
    Xaa_{28} es Ala o Asn;
    Z_{1} es -OH,
    70
    en los que Xaa_{31}, Xaa_{36}, Xaa_{37} y Xaa_{38} se seleccionan independientemente del grupo constituido por Pro, homoprolina, 3Hyp, 4Hyp, tioprolina, N-alquilglicina, N-alquilpentilglicina y N-alquilalanina; Xaa_{39} es Ser, Thr o Tyr; y
    Z_{2} es -OH o -NH_{2}; y sales del mismo farmacéuticamente aceptables;
    con la condición de que no más de tres de Xaa_{3}, Xaa_{5}, Xaa_{6}, Xaa_{8}, Xaa_{10}, Xaa_{11}, Xaa_{12}, Xaa_{13}, Xaa_{14}, Xaa_{l5}, Xaa_{16}, Xaa_{17}, Xaa_{19}, Xaa_{20}, Xaa_{2l}, Xaa_{24}, Xaa_{25}, Xaa_{26}, Xaa_{27}, y Xaa_{28} sean Ala; y también con la condición de que el compuesto no sea la exendina-3 [ID SEC Nº 1] o exendina-4 [ID SEC Nº 2].
  10. 10. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho compuesto es adecuado para la administración periférica, preferiblemente subcutánea, bucal, nasal, pulmonar, oral, intravenosa, intraocular, rectal o transdérmica.
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