JP5185624B2 - 血清アルブミンおよびｇｌｐ−１またはｐｙｙを標的とする二重特異性抗体 - Google Patents

血清アルブミンおよびｇｌｐ−１またはｐｙｙを標的とする二重特異性抗体 Download PDF

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Description

本出願は、２００４年１２月２日出願の米国仮特許出願第60/632,361号の利益および英国特許出願第0511019.2号の利益を主張している。上記の出願の教示全体が、参照によって本明細書に組み込むものとする。
治療用および／または診断用として有用であると思われる活性を有する多くの薬剤は、投与した際に体から急速に排出されるので、それらの薬剤には限定された価値しかない。例えば、治療的に有用な活性を有する多くのポリペプチドは、腎臓を介して循環から急速に排除される。したがって、所望の治療効果を達成するためには、大用量を投与する必要がある。薬物動態学的特長が向上した、改良された治療薬および診断薬が求められている。血清アルブミンに結合するポリペプチドが、当技術分野では知られている。（例えば、EP0486525 B1（Cemu Bioteknik AB）；US6,267,964 B1（Nygrenら）；WO04/001064 A2（Dyax, Corp）；WO02/076489 A1（Dyax, Corp）；WO01/45746（Genentech, Inc.）を参照。）
体内または体循環における半減期の短い、そのような薬剤の種類の１つとして、グルカゴン様ペプチド１またはペプチドＹＹ等のインクレチンホルモンがある。
グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）−１は、グルコース依存性の強力なインスリン分泌促進性およびグルカゴン分泌抑制性の作用、膵臓のβ細胞に対する栄養性の効果、ならびに胃腸管の分泌および運動に対する抑制性の効果を有するインクレチンホルモンであり、これらが組み合わさって、血糖値を低下させ、血糖値の逸脱を縮小させる。さらに、ＧＬＰ−１は、満腹感を高める能力により、食物摂取量を減少させ、それによって、体重増加を制限し、さらに体重を減少させることさえ可能である。総合すると、これらの作用により、ＧＬＰ−１は独特の特性を有することになり、特に、その抗高血糖効果はグルコース依存性であるので、極度の低血糖のいずれの危険も最小限に留めるはずであることから、抗糖尿病薬として非常に望ましいと思われる。しかし、薬物動態学的／薬物動力学的特性から、ネイティブなＧＬＰ−１は、治療的に有用ではない。したがって、ＧＬＰ−１は、持続的に投与した場合に最も効果的であるが、皮下からの単回投与では、効果が持続しない。ＧＬＰ−１は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいては、酵素による分解を非常に受けやすく、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断が、恐らく最も関連があると思われる。というのは、本酵素による分解は、急速に起こり、非インスリン分泌促進性の代謝物を生じさせるからである。したがって、ＧＬＰ−１の代謝安定性および薬物動態学的／薬物動力学的特性に影響を及ぼす要因の理解に基づき、ＧＬＰ−１の治療的可能性を活用する戦略に焦点を合わせて、熱心な研究がなされてきている。
ペプチダーゼを阻害して、またはＧＬＰ−１を改変して、生物学的活性を依然として維持しながら、分解速度を落とすようにすることを試みて、広範な研究がなされてきている。WO05/027978は、遅延性の作用を有するＧＬＰ−１の誘導体を開示している（これは、本発明において使用できるＧＬＰ−１の誘導体および類似体の例として、参照によって本明細書に組み込むものとする）。WO02/46227は、ＧＬＰ−１または類似体（これらの類似体の開示は、本発明において使用できるＧＬＰ−１の類似体の例として、参照によって本明細書に組み込むものとする）に融合したポリペプチド（例えば、アルブミン）を含む異種の融合タンパク質を開示している。WO05/003296、WO03/060071、WO03/059934は、本ホルモンの半減期を延長させることを試みて、ＧＬＰ−１をアルブミンと融合させたアミノ融合タンパク質を開示している。
しかし、これらの努力にもかかわらず、持続的な活性を有するＧＬＰ−１の生成には至っていない。
したがって、とりわけ糖尿病および肥満の分野においては、糖尿病および肥満の治療に特に受け入れられるインスリン分泌促進性の同様な効果を有する改良されたＧＬＰ−１ペプチドまたはその他の薬剤が、非常に強く求められている。したがって、低い毒性および治療上の利点を維持しながら、ｉｎ ｖｉｖｏにおける作用を持続させるために、ＧＬＰ−１およびその他のインスリン分泌促進性のペプチドを改変する必要がある。
本発明は、血清半減期を改良した薬剤融合体および薬剤複合体に関するものである。ある態様では、薬剤融合体は、式：
ａ−（Ｘ）ｎ１−ｂ−（Ｙ）ｎ２−ｃ−（Ｚ）ｎ３−ｄまたはａ−（Ｚ）ｎ３−ｂ−（Ｙ）ｎ２−ｃ−（Ｘ）ｎ１−ｄ
（式中、
Ｘは、第１の標的に対して結合特異性を有するポリペプチド薬剤であり；
Ｙは、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）であり；
Ｚは、第２の標的に対して結合特異性を有するポリペプチド薬剤であり；
ａ、ｂ、ｃおよびｄは、それぞれ独立に、存在しないか、または１〜約１００個のアミノ酸残基であり；
ｎ１は、１から約１０であり；
ｎ２は、１から約１０であり；かつ
ｎ３は、０から約１０であるが、
ｎ１およびｎ２が共に１であり、かつｎ３が０である場合には、Ｘは、抗体鎖または抗体鎖の断片を含まない）
を有する連続したポリペプチド鎖である。
いくつかの実施形態では、Ｙは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択されたアミノ酸配列、または配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｘは、ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１の類似体である。
別の態様では、薬剤融合体は連続したポリペプチド鎖を含み、前記鎖は部分Ｘ'およびＹ'を含み、ただし、
Ｘ'が抗体鎖または抗体鎖の断片を含まない場合には、Ｘ'はポリペプチド薬剤であり、
Ｙ'は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）である。いくつかの実施形態では、Ｙ'は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択されたアミノ酸配列、または配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｘ'は、ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１の類似体である。
別の態様では、本発明は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と；前記ＶＨまたはＶＬに共有結合している薬剤とを含む薬剤複合体である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択されたアミノ酸配列、または配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、薬剤は、ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１の類似体である。
また、本発明は、本明細書に記載されている薬剤融合体をコードする組換え核酸および構築物、ならびに組換え核酸および／または構築物を含む宿主細胞も提供する。さらに、本発明は、本明細書に記載されている薬剤融合体をコードする組換え核酸および／または構築物を含む宿主細胞を、前記組換え核酸の発現に適切な条件下で維持することを含み、それによって、薬剤融合体を生成する、薬剤融合体を生成する方法も提供する。
また、本発明は、本発明の薬剤融合体または薬剤複合体を含む組成物（例えば、薬学的組成物）も提供する。また、本発明は、治療的に有効な量の本発明の薬剤複合体または薬剤融合体を個体に投与することを含む、本明細書に記載されているような疾患または障害を有する前記個体を治療するための方法も提供する。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、関節炎（例えば、関節リウマチ）等の炎症性疾患である。別の実施形態では、疾患または障害は、糖尿病または肥満等の代謝性疾患である。また、本発明は、炎症性疾患（例えば、関節炎（具体的には、関節リウマチ））または糖尿病もしくは肥満等の疾患または障害の治療に用いる医薬品の製造のための、本発明の薬剤複合体または薬剤融合体の使用も提供する。また、本発明は、治療、診断または予防に使用するための、本発明に記載されている薬剤融合体または薬剤複合体の使用にも関する。
別の態様では、本発明は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と、前記ＶＨまたはＶＬに非共有結合している薬剤とを含む非共有結合性の薬剤複合体である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択されたアミノ酸配列、または配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、本発明は、研究の道具として使用される血清アルブミンに結合せず、活性のある血清に結合するＤｏｍ７ｈ−８を予測する、Ｄｏｍ７ｈ−８の不活性型であるｉＤｏｍ７ｈ−８も提供する。
本明細書内では、実施形態を、明確かつ簡潔に記述可能なように記載してきたが、実施形態は、本発明から逸脱することなく、多様に組み合わせたり、または分離できることを意図しており、そのように理解されたい。
本明細書で使用する場合、「薬剤」とは、個体に投与して、個体中の生物学的標的分子に結合する、および／またはその機能を変化させることによって、治療または診断に有益な効果をもたらすことができる、任意の化合物（例えば、有機小分子、核酸、ポリペプチド）を指す。標的分子は、個体のゲノムによってコードされる内因性の標的分子（例えば、個体のゲノムによってコードされる酵素、受容体、増殖因子、サイトカイン）、または病原体のゲノムによってコードされる外因性の標的分子（例えば、ウイルス、細菌、真菌、線虫またはその他の病原体のゲノムによってコードされる酵素）でありうる。
本明細書で使用する場合、「薬剤ベース」とは、活性を評価、計測または測定するために使用した薬剤（または薬剤の部分）の量に基づいて標準化された薬剤組成物および薬剤の活性を指す。一般に、本発明の薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、それらが含有する薬剤よりも大きな分子量を有する。したがって、薬剤組成物の量と薬剤の量が、重量に関して、等価である場合、分子またはモルのベースでは、異なる量の薬剤を含有しているはずである。例えば、本発明の薬剤組成物が、その組成物が含む薬剤の分子量の２倍の分子量を有する場合、２μｇの薬剤組成物および１μｇの薬剤を使用する「薬剤ベース」で、活性を測定できる。なぜなら、これらの数量は、同一の量（遊離の薬剤として、または薬剤組成物の一部として）の薬剤を含有しているはずであろうからである。適切な計算方法を使用して、「薬剤ベース」で、例えば、各標的結合部位ベースで、または酵素薬剤では各活性部位ベースで、活性を表現することによって、活性を標準化して表現できる。
本明細書で使用する場合、「薬剤組成物」とは、ポリペプチド結合部分に共有結合または非共有結合している薬剤を含む組成物を指し、前記ポリペプチド結合部分は、ポリペプチドに対する結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含有しており、前記ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させる。薬剤組成物は、薬剤がポリペプチド結合部分に共有結合または非共有結合している複合体でありうる。薬剤は、ポリペプチド結合部分に、直接的にあるいは間接的に（例えば、適切なリンカーおよび／または相補的な結合相手（具体的には、ビオチンとアビジン）の非共有結合を介して）、共有結合または非共有結合することができる。相補的な結合相手を利用する場合、結合相手の１つは、直接的にまたは適切なリンカー部分を介して、薬剤に共有結合することができ、相補的な結合相手は、直接的にまたは適切なリンカー部分を介して、ポリペプチド結合部分に共有結合することができる。薬剤が、ポリペプチドまたはペプチドである場合、薬剤組成物は、融合タンパク質であってもよく、ポリペプチドまたはペプチドである薬剤と、ポリペプチド結合部位とは、連続したポリペプチドの鎖の別々の部（部分）をなしている。
本明細書で使用する場合、「複合体」とは、薬剤に結合している、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片を含む組成物を指す。そのような複合体には、「薬剤複合体」が含まれ、これは、薬剤が共有結合している、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片を含んでおり、かつ「非共有結合性の薬剤複合体」も含まれ、これは、薬剤が非共有結合している、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片を含んでいる。
本明細書で使用する場合、「薬剤複合体」とは、薬剤が共有結合している、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片を含む組成物を指す。薬剤は、抗原結合断片に、直接的にまたは適切なリンカー部分を介して間接的に、共有結合することができる。薬剤は、抗原結合断片に、アミノ末端、カルボキシル末端または適切なアミノ酸の側鎖（例えば、リジンのεアミノ基またはシステインのチオール基）を介して等、任意の適切な位置で結合することができる。
本明細書で使用する場合、「非共有結合性の薬剤複合体」とは、薬剤が非共有結合している、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片を含む組成物を指す。薬剤は、抗原結合断片に、直接的に（例えば、静電的な相互作用、疎水性の相互作用）または間接的に（例えば、相補的な結合相手（具体的には、ビオチンとアビジン）の非共有結合を介して）非共有結合することができ、その場合、１つの結合相手は薬剤に共有結合しており、相補的な結合相手は抗原結合断片に共有結合している。相補的な結合相手を利用する場合、結合相手の１つは、直接的にまたは適切なリンカー部分を介して、薬剤に共有結合することができ、相補的な結合相手は、直接的にまたは適切なリンカー部分を介して、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片に共有結合することができる。
本明細書で使用する場合、「薬剤融合体」とは、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片と、ポリペプチド薬剤とを含む融合タンパク質を指す。血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片と、ポリペプチド薬剤とは、一本の連続したポリペプチドの鎖の別々の部（部分）として存在している。
本明細書で使用する場合、「アルブミン結合残基」という用語は、ヒト血清アルブミンに非共有結合する残基を意味する。通常、治療的ポリペプチドに付着するアルブミン結合残基は、ヒト血清アルブミンに対して、１０μＭ未満、好ましくは１ｐＭ未満の親和性を有する。ある実施形態では、アルブミン結合残基は、４〜４０個の炭素原子を含有する直鎖状または分枝の親油性の部分、シクロペンタノフェナントレン骨格を有する化合物、１０〜３０個のアミノ酸残基を有するペプチド等のいずれかであると知られている。
本明細書で使用する場合、「インターロイキン１受容体アンタゴニスト」（ＩＬ−１ｒａ）とは、自然に存在するまたは内因性の哺乳類ＩＬ−１ｒａタンパク質、および自然に存在するまたは内因性の対応する哺乳類ＩＬ−１ｒａタンパク質のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質（例えば、組換えタンパク質、合成（すなわち、合成有機化学の方法を使用して生成した）タンパク質）を指す。したがって、本明細書で定義するように、この用語には、成熟タンパク質、多型性または対立遺伝子の変異体、およびＩＬ−１ｒａのその他の（例えば、別のスプライシングまたはその他の細胞の過程によって生成した）アイソフォーム、ならびに上記のものの改変体または未改変体（例えば、脂質付加、グリコシル化、ペグ化されたもの）が含まれる。自然に存在するまたは内因性のＩＬ−１ｒａには、成熟ＩＬ−１ｒａ、多型性または対立遺伝子の変異体、および哺乳類（例えば、ヒト、非ヒト霊長類）において自然に存在するその他アイソフォーム等の野生型タンパク質が含まれる。そのようなタンパク質は、例えば、ＩＬ−１ｒａを自然に生成するソースから回収または単離できる。自然に存在するまたは内因性の対応するＩＬ−１ｒａと同一のアミノ酸配列を有するこれらのタンパク質およびＩＬ−１ｒａタンパク質には、対応する哺乳類の名前が示される。例えば、対応する哺乳類がヒトである場合、タンパク質は、ヒトＩＬ−１ｒａと呼ばれる。
ＩＬ−１ｒａの「機能性変異体」には、適切な方法（例えば、突然変異誘発法（具体的には、化学的突然変異誘発法、放射線突然変異誘発法）、組換えＤＮＡ技術）を使用して生成できる機能性の断片、機能性の変異タンパク質および／または機能性の融合タンパク質が含まれる。「機能性変異体」は、インターロイキン−１の１型受容体に拮抗する。一般に、ＩＬ−１ｒａの断片または一部には、成熟ＩＬ−１ｒａに関して、（Ｎ末端、Ｃ末端または内部での欠失等の）アミノ酸（すなわち、１個または複数のアミノ酸）の欠失および／または付加（すなわち、１個または複数のアミノ酸の欠失または／付加）を有するものが含まれる。成熟ＩＬ−１ｒａに関して、近接のアミノ酸のみが欠失している、または非近接のアミノ酸が欠失している断片または一部も意図されている。ヒトＩＬ−１ｒａの機能性変異体は、ヒトＩＬ−１ｒａの成熟した１５２個のアミノ酸体に対して、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有し、インターロイキン−１の１型受容体に拮抗しうる。（Eisenbergら、Nature 343: 341-346 1990を参照）。変異体は、１個または複数の追加のアミノ酸を含む（例えば、１５３個または１５４個またはそれ以上のアミノ酸を含む）ことができる。例えば、変異体ＩＬ−１ｒａは、配列番号３３（ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）（アナキンラ）、Ａｍｇｅｎ製）の残基２６〜１７７が続くアミノ末端のメチオニン残基からなるアミノ酸配列を有しうる。
本明細書で示す場合、「約」という用語は、随意であるが、好ましくはプラスまたはマイナス２０％、より好ましくはプラスまたはマイナス１０％、さらにより好ましくはプラスまたはマイナス５％、さらにより好ましくはプラスまたはマイナス２％、最も好ましくはプラスまたはマイナス１％を意味すると解釈される。
ポリペプチドを指して本明細書で使用する場合、「類似体」という用語は、ペプチドの１個または複数のアミノ酸残基がその他のアミノ酸残基で置換されている、および／または１個または複数のアミノ酸残基がペプチドから欠失している、および／または１個または複数のアミノ酸残基がペプチドから欠失している、および／または１個または複数のアミノ酸残基がペプチドに付加している改変ペプチドを意味する。そのようなアミノ酸残基の付加または欠失は、ペプチドのＮ末端および／またはペプチドのＣ末端で起きることができ、あるいはペプチドの内部に存在できる。簡単な体系を使用してＧＬＰ−１の類似体を描写する。例えば、［Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１（７−３７）Ｌｙｓは、３４位において自然に存在するリジンがアルギニンで置換されており、かつリジン残基がＣ末端（３８位）に付加しているＧＬＰ−１類似体を示す。ペプチド類似体およびその誘導体の式は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ命名法にしたがって使用されるアミノ酸に関する標準的な１文字略語を使用して表記される。
本明細書で使用する場合、「ＧＬＰ−１ペプチド」という用語は、ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号１５８）もしくはＧＬＰ−１（７−３６）（配列番号１５９）、ＧＬＰ−１類似体、ＧＬＰ−１誘導体またはＧＬＰ−１類似体の誘導体を意味する。そのようなペプチド、類似体および誘導体は、インスリン分泌促進性の薬剤である。
本明細書で使用する場合、「インスリン分泌促進性の薬剤」という用語は、ホルモンであるインスリンを刺激することを、その刺激を誘発することを、その合成もしくは発現を、またはその活性を起こすことを可能にしうる化合物を意味する。インスリン分泌促進性の薬剤の既知の例として、グルコース、ＧＩＰ、ＧＬＰ、エキセンディンおよびＯＸＭがあげられるが、これらに限定されるわけではない。
本明細書で使用する場合、「インクレチン」という用語は、グルコース濃度が正常な場合またはグルコース濃度が増加した場合にはなおさら、放出されるインスリンの量を増加させる胃腸管のホルモンの１種を意味する。一例として、それらには、ＧＬＰ−１、ＧＩＰおよびＯＸＭが含まれる。
本明細書で使用する場合、「エキセンディン−４ペプチド」という用語は、エキセンディン−４（１−３９）、エキセンディン−４類似体、エキセンディン−４誘導体またはエキセンディン−４類似体の誘導体を意味する。ある実施形態では、エキセンディン−４ペプチドは、インスリン分泌促進性の薬剤である。そのようなペプチド、類似体および誘導体は、インスリン分泌促進性の薬剤である。
ポリペプチドを指して本明細書で使用する場合、「ＤＰＰ−IV保護」という用語は、前記化合物に、血漿ペプチダーゼであるジペプチジルアミノペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−IV）に対する抵抗性を付与するために改変（例えば、化学的に改変）されているポリペプチドを意味する。血漿中のＤＰＰ−IV酵素は、いくつかのペプチドホルモン、例えば、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２等の分解に関与すると知られている。したがって、ＤＰＰ−IVによる分解の速度および／程度を減少させるために、ＤＰＰ−IVが仲介する加水分解を受けやすいポリペプチドの類似体および誘導体の開発に相当な努力がなされている。
本明細書で使用する場合、「サポリン」は、植物である宿根草（Saponaria officinalis）が産生する一本鎖のリボソーム不活性化ポリペプチドのファミリーを指す。(Stirpe, F.ら、Biochem. J. 216: 617−625 (1983); Bagga, S.ら、J. Biol. Chem. 278: 4813−4820 (2003))存在するサポリンポリペプチドには、長さおよび／またはアミノ酸配列の異なるいくつかの形態がある。（例えば、同上およびBarthelemy, I.ら、J. Biol. Chem. 268: 6541−6548 (1993)を参照）サポリン−６が、サポリンの最も活性な形態をとっている。（Bagga, S.ら、J. Biol. Chem. 278: 4813−4820 (2003)）成熟ポリペプチド（配列番号６５）の４８位のアミノ酸が、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、成熟ポリペプチド（配列番号６５）の９１位のアミノ酸が、ＡｒｇまたはＬｙｓである、サポリン−６の少なくとも４種の自然に存在するアイソフォームが記載されている。（Barthelemy, I.ら、J. Biol. Chem. 268: 6541−6548 (1993)）サポリン−６の別の形態には、成熟ポリペプチド（配列番号６５）の９９位のアミノ酸が、ＳｅｒまたはＬｅｕであり、成熟ポリペプチド（配列番号６５）の１３４位のアミノ酸が、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、成熟ポリペプチド（配列番号６５）の１４７位のアミノ酸が、ＳｅｒまたはＬｅｕであり、成熟ポリペプチド（配列番号６５）の１４９位のアミノ酸が、ＳｅｒまたはＰｈｅであり、成熟ポリペプチド（配列番号６５）の１６２位のアミノ酸が、ＡｓｐまたはＡｓｎであり、成熟ポリペプチド（配列番号６５）の１７７位のアミノ酸が、ＡｌａまたはＶａｌであり、成熟ポリペプチド（配列番号６５）の１８８位のアミノ酸が、ＩｌｅまたはＴｈｒであり、成熟ポリペプチド（配列番号６５）の１９６位のアミノ酸が、ＡｓｎまたはＡｓｐであり、成熟ポリペプチド（配列番号６５）の１９８位のアミノ酸が、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、成熟ポリペプチド（配列番号６５）の２３１位のアミノ酸が、ＡｓｎまたはＳｅｒであるポリペプチド、および成熟ポリペプチド（配列番号６５）の２３３位のアミノ酸が
、ＬｙｓまたはＡｒｇであるポリペプチドが含まれる（同上）。これらのアイソフォームおよび変異体に広がる共通配列を、図１４Ｇ（配列番号６７）に示す。
したがって、「サポリン」という用語には、前駆体タンパク質、成熟ポリペプチド、ネイティブなタンパク質、多型性または対立遺伝子の変異体、およびその他の（例えば、別のスプライシングまたはその他の細胞の過程によって生成した）アイソフォーム、ならびに上記のものの改変体または未改変体（例えば、脂質付加、グリコシル化、ペグ化されたもの）が含まれる。自然に存在するまたは内因性のサポリンには、成熟サポリン（例えば、サポリン−６）多型性または対立遺伝子の変異体、および宿根草に自然に存在するその他アイソフォーム等の野生型タンパク質が含まれる。そのようなタンパク質は、宿根草から、任意の適切な方法を使用して回収または単離できる。サポリンの「機能性変異体」には、適切な方法（例えば、突然変異誘発法（具体的には、化学的突然変異誘発法、放射線突然変異誘発法）、組換えＤＮＡ技術）を使用して生成できる機能性の断片、機能性の変異タンパク質および／または機能性の融合タンパク質が含まれる。一般に、サポリン（例えば、サポリン−６）の断片または一部には、成熟サポリンに関して、（Ｎ末端、Ｃ末端または内部での欠失等の）アミノ酸（すなわち、１個または複数のアミノ酸）の欠失および／または付加（すなわち、１個または複数のアミノ酸の欠失または／付加）を有するものが含まれる。成熟サポリンに関して、近接のアミノ酸のみが欠失している、または非近接のアミノ酸が欠失している断片または一部も意図されている。多様なサポリンの活性のある変異体を調製できる。例えば、アミノ末端の延長を含有するサポリン−６の融合タンパク質が調製されており、ウサギの網状赤血球可溶化液のアッセイにおいて完全なリボソーム阻害活性が保持されることが示されている。（Barthelemy, I.ら、J. Biol. Chem. 268: 6541−6548 (1993)）変異体、あるいは活性部位の残基、Ｔｙｒ７２、Ｔｙｒ１２０、Ｇｌｕ１７６、Ａｒｇ１７９またはＴｒｐ２０８（配列番号６５のアミノ酸７２、１２０、１７６、１７９または２０８）を、アラニンで交換したサポリン−６は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるアッセイで、細胞障害活性が低下した。（Bagga, S.ら、J. Biol. Chem. 278: 4813-4820 (2003)）したがって、サポリンの別の機能性変異体の調製が所望される場合には、活性部位の残基の変異、置換、交換、欠失または改変を避ける必要がある。好ましくは、自然に存在する成熟ポリペプチドより少ないアミノ酸を含有するサポリンの機能性変異体は、少なくとも活性部位を含む。例えば、自然に存在する成熟サポリン−６より少ないアミノ酸を含有するサポリン−６の変異体は、成熟サポリン−６の活性部位の残基（Ｔｙｒ７２、Ｔｙｒ１２０、Ｇｌｕ１７６、Ａｒｇ１７９またはＴｒｐ２０８（配列番号６５のアミノ酸７２、１２０、１７６、１７９または２０８））を含み、少なくとも約１３７個のアミノ酸の長さ、少なくとも約１５０個のアミノ酸の長さ、少なくとも約１７５個のアミノ酸の長さ、少なくとも約２００個のアミノ酸の長さ、少なくとも約２２５個のアミノ酸の長さ、または少なくとも約２５０個のアミノ酸の長さでありうる。
サポリンの「機能性変異体」は、リボソームを不活性化する活性（例えば、ｒＲＮＡ Ｎ−グリコシダーゼ活性）および／または細胞障害活性を有する。そのような活性は、周知のウサギの網状赤血球可溶化液のアッセイを使用するタンパク質合成の阻害、または任意の癌化細胞株を利用する周知の細胞障害性試験等、適切な方法を使用して、容易に評価できる。（例えば、Bagga, S.ら、J. Biol. Chem. 278: 4813-4820 (2003)およびBarthelemy, I.ら、J. Biol. Chem. 268: 6541−6548 (1993)を参照）
いくつかの実施形態では、サポリンの機能性変異体が、成熟サポリン−６（配列番号６５）に対して、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
本発明は、薬剤と、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する抗原結合部位を含有するポリペプチド結合部分とを含む組成物に関する。血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片を含む組成物に関して詳細に本明細書に記載するように、薬剤および結合ポリペプチドは、共有結合性または非共有結合性の複合体を形成できる。いくつかの実施形態では、組成物は、ポリペプチド薬剤と、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する抗原結合部位を含有するポリペプチド結合部分とを含む融合タンパク質である。その他の実施形態では、組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する抗原結合部位を含有するポリペプチド結合部分に共有結合または非共有結合している薬剤を含む。
本発明は、薬剤と、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含有するポリペプチド結合部分とを含む薬剤組成物に関する。血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片を含む薬剤組成物に関して詳細に本明細書に記載するように、薬剤およびポリペプチド結合部分は、互いに共有結合または非共有結合することができる。いくつかの実施形態では、薬剤組成物は、ポリペプチド薬剤と、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する抗原結合部位を含有するポリペプチド結合部分とを含む融合タンパク質である。その他の実施形態では、薬剤組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する抗原結合部位を含有するポリペプチド結合部分に共有結合または非共有結合している薬剤を含む。
通常、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて自然に存在し、かつ望まれない物質を生物体（例えば、ヒト）から除去する内因性の機構による分解または除去に抵抗するポリペプチドである。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドは、細胞外基質由来のタンパク質、血中に存在するタンパク質、血液脳関門もしくは神経組織に存在するタンパク質、腎臓、肝臓、肺、心臓、皮膚もしくは骨に局在するタンパク質、ストレスタンパク質、疾患に特異的なタンパク質またはＦｃの輸送に関わるタンパク質から選択できる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させる適切なポリペプチドとして、例えば、トランスフェリン受容体特異的リガンド−神経薬剤融合タンパク質（その教示するところが、参照によって本明細書に組み込むものとする米国特許第5,977,307号を参照）、脳毛細血管内皮膚細胞受容体、トランスフェリン、トランスフェリン受容体（例えば、可溶性トランスフェリン受容体）、インスリン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）受容体、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ２）受容体、インスリン受容体、血液凝固因子Ｘ、α１−抗トリプシンおよびＨＮＦ１αがあげられる。血清半減期を向上させる適切なポリペプチドとして、α−１糖タンパク質（オロソムコイド；ＡＡＧ）、α−１抗キモトリプシン（ＡＣＴ）、α−１ミクログロブリン（タンパク質ＨＣ；ＡＩＭ）、抗トロンビンIII（ＡＴ III）、アポリポタンパク質Ａ−１（Ａｐｏ Ａ−１）、アポリポタンパク質Ｂ（Ａｐｏ Ｂ）、セルロプラスミン（Ｃｐ）、補体成分Ｃ３（Ｃ３）、補体成分Ｃ４（Ｃ４）、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１ ＩＮＨ）、Ｃ-反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フェリチン（ＦＥＲ）、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ミオグロビン（Ｍｙｏ）、プレアルブミン（トランスサイレチン；ＰＡＬ）、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）およびリウマチ因子（ＲＦ）もあげられる。
細胞外基質由来の適切なタンパク質として、例えば、コラーゲン、ラミニン、インテグリンおよびフィブロネクチンがあげられる。コラーゲンは、細胞外基質の主要なタンパク質である。現在、約１５種類のコラーゲン分子が知られており、体の異なる部分に存在し、例えば、Ｉ型コラーゲン（生体コラーゲンの９０％を占める）は、骨、皮膚、腱、靭帯、角膜、内臓に存在し、II型コラーゲンは、軟骨組織、椎間板、脊索および眼の硝子体液に存在する。
血液由来の適切なタンパク質として、例えば、血漿タンパク質（具体的には、フィブリン、α−２マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノーゲン（例として、フィブリノーゲンＡ、フィブリノーゲンＢ）、血清アミロイドタンパク質Ａ、ヘプトグロビン、プロフィリン、ユビキチン、ウテログロブリンおよびα−２−ミクログロブリン）、酵素および酵素阻害剤（具体的には、プラスミノーゲン、リゾチーム、シスタチンＣ、α−１−抗トリプシンおよび膵臓トリプシン阻害剤）、免疫グロブリンタンパク質（具体的には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、免疫グロブリン軽鎖（κ／λ））等の免疫系のタンパク質、輸送タンパク質（具体的には、レチノール結合タンパク質、α−１ミクログロブリン）、デフェンシン（具体的には、β−デフェンシン１、好中球デフェンシン１、好中球デフェンシン２および好中球デフェンシン３）等があげられる。
血液脳関門もしくは神経組織に存在する適切なタンパク質として、例えば、メラノコルチン受容体、ミエリン、アスコルビン酸輸送体等があげられる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させる適切なポリペプチドとして、腎臓に局在するタンパク質（例えば、ポリシスチン、IV型コラーゲン、有機アニオン輸送体Ｋ１、ヘイマン抗原）、肝臓に局在するタンパク質（例えば、アルコール脱水素酵素、Ｇ２５０）、肺に局在するタンパク質（例えば、ＩｇＡに結合する分泌成分）、心臓に局在するタンパク質（例えば、拡張型心筋症に関与するＨＳＰ２７）、皮膚に局在するタンパク質（例えば、ケラチン）、骨形成活性を示す、トランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリータンパク質のサブセットである骨形成因子（ＢＭＰ）（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８）等の骨に特異的なタンパク質、腫瘍に特異的なタンパク質（例えば、栄養細胞抗原、ハーセプチン受容体、エストロゲン受容体、カテプシン（具体的には、肝臓および脾臓で認めることができるカテプシンＢ））もあげられる。
疾患に特異的な適切なタンパク質として、例えば、活性化されたＴ細胞上においてのみ発現する抗原があげられ、それらには、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子）、破骨細胞分化抑制因子リガンド（ＯＰＧＬ；Nature 402, 304-309 (1999)を参照）、ＯＸ４０（活性化されたＴ細胞上で発現し、ヒトＴ細胞白血病ウイルスI型（ＨＴＬＶ−Ｉ）産生細胞内で特異的に発現が増加するＴＮＦ受容体ファミリーのメンバー；Immunol. 165(1): 263-70 (2000)を参照）が含まれる。疾患に特異的な適切なタンパク質として、例えば、（関節炎／癌に関与する）メタロプロテアーゼ、具体的には、ＣＧ６５１２ショウジョウバエ、ヒトのパラプレギン（ｐａｒａｐｌｅｇｉｎ）、ヒトＦｔｓＨ、ヒトＡＦＧ３Ｌ２、マウスｆｔｓＨ；および血管新生増殖因子、具体的には、酸性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、血管内皮増殖因子／血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、アンジオゲニン、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血小板由来血管内皮膚増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ミッドカイン血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ）およびフラクタルカインもあげられる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させる適切なポリペプチドとして、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）等のストレスタンパク質もあげられる。ＨＳＰは、正常であれば、細胞内に存在する。ＨＳＰが細胞外に存在する場合、細胞が死に至り、細胞の内容物が漏れ出ていることの指標となる。このような非プログラム細胞死（壊死）は、外傷、疾患または損傷の結果として、細胞外ＨＳＰが、免疫系の応答を引き起こす場合に発生する。細胞外ＨＳＰへの結合によって、本発明の組成物を疾患部位へ局在させることが可能となる。
Ｆｃの輸送に関わる適切なタンパク質として、例えば、ブラムベル（Ｂｒａｍｂｅｌｌ）受容体（ＦｃＲＢとしても知られている）があげられる。このＦｃ受容体は、２つの機能を有し、その両方が、送達に有用である可能性がある。それらの機能とは、（１）ＩｇＧの母体から子への胎盤を超えた輸送、（２）ＩｇＧの分解からの保護であり、それによって血清半減期が延長される。この受容体は、ＩｇＧをエンドソームから再利用すると考えられている。（Holligerら、Nat Biotechnol 15(7): 632-6 (1997)を参照）
本発明の薬剤組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含有するポリペプチド結合部分のいずれかを含むことができる。好ましくは、ポリペプチド結合部分は、少なくとも３１個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、少なくとも約６０個、少なくとも約７０個、少なくとも約８０個、少なくとも約９０個、少なくとも約１００個、または少なくとも約１１０個のアミノ酸を、独立の実体として含む。好ましくは、ポリペプチド結合部分は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに、少なくとも約５ｍＭのＫＤ（ＫＤ＝Ｋｏｆｆ（ｋｄ）／Ｋｏｎ（ｋa））で結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合部分は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに、表面プラズモン共鳴法で（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ製の装置を使用して）測定した場合、約１０〜約１００ｎＭ、または約１００ｎＭ〜約５００ｎＭ、または約５００ｎＭ〜約５ｍＭのＫＤで結合する。特定の実施形態では、ポリペプチド結合部分は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに、約５０ｎＭ、または約７０ｎＭ、または約１００ｎＭ、または約１５０ｎＭ、または約２００ｎＭのＫＤで結合する。
好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含有するポリペプチド結合部分は、原核生物または細菌のポリペプチドおよびペプチドではない。好ましくは、ポリペプチド結合部分は、真核生物、哺乳類またはヒトのポリペプチドまたはペプチドである。
特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含有するポリペプチド結合部分は、折り畳みタンパク質ドメインである。その他の実施形態では、ポリペプチド結合部分は、独立の実体として、少なくとも約４ＫＤａ、少なくとも約４．５ＫＤａ、少なくとも約５ＫＤａ、少なくとも約５．５ＫＤａ、少なくとも約６ＫＤａ、少なくとも約６．５ＫＤａ、少なくとも約７ＫＤａ、少なくとも約７．５ＫＤａ、または少なくとも約８ＫＤａの分子量を有する。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含有する、適切なポリペプチド結合部分を、適切な付着アッセイにおいて自然に存在するポリペプチドまたは自然に存在しないポリペプチドをスクリーニングする方法等、任意の適切な方法を使用して、同定できる。本明細書に記載するように、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して抗原結合部位を有する、好ましいポリペプチド結合部分は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片である。しかし、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させる、その他のポリペプチドに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片を、本発明において使用できる。
所望により、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに結合する抗体または抗体の抗原結合部位の、１種または複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、抗体または抗原結合断片の抗原結合特異性を保持する、非免疫グロブリン構造内にフォーマットできる。本発明の薬剤組成物は、そのような非免疫グロブリン結合部分を含むことができる。そのような非免疫グロブリン結合部分を、任意の適切な方法を使用して調製でき、例えば、ＳｐＡ等の自然の細菌の受容体を、ＣＤＲをグラフトするために骨格として使用して、エピトープに特異的に結合するポリペプチド結合部分が生成されている。この手順の詳細が、米国特許出願第5,831,012号に記載されており、その教示するところが、参照によって本明細書に組み込むものとする。その他の適切な骨格として、フィブロネクチンおよびアフィボディに基づくものがあげられる。適切な手順が、WO98/58965に記載されている。その他の適切な骨格として、van den Beukenら、J. Mol. Biol. 310: 591-601 (2001)に記載されているようなリポカリンおよびＣＴＬＡ４、ならびにWO00/69907（Medical Research Council）に記載されているもののような骨格があげられる。後者は、例えば、細菌のＧｒｏＥＬまたはその他のシャペロンポリペプチドの環構造に基づいている。
いくつかの実施形態では、本発明の薬剤組成物は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する非免疫グロブリン結合部分を含み、非免疫グロブリン結合部分は、本明細書に記載されているＶＨ、ＶκまたはＶＨＨのＣＤＲを１、２または３種と、適切な骨格とを含む。特定の実施形態では、非免疫グロブリン結合部分は、本明細書に記載されているＶＨ、ＶκまたはＶＨＨのＣＤＲ１およびＣＤＲ２ではなくＣＤＲ３と、適切な骨格とを含む。その他の実施形態では、非免疫グロブリン結合部分は、本明細書に記載されているＶＨ、ＶκまたはＶＨＨのＣＤＲ３ではなくＣＤＲ１およびＣＤＲ２と、適切な骨格とを含む。その他の実施形態では、非免疫グロブリン結合部分は、本明細書に記載されているＶＨ、ＶκまたはＶＨＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、適切な骨格とを含む。その他の実施形態では、薬剤組成物は、本明細書に記載されているＶＨ、ＶκまたはＶＨＨのＣＤＲ３と、薬剤とだけを含む。
本発明の薬剤組成物は、薬剤融合体、薬剤複合体および非共有結合性の薬剤複合体を調製するための本明細書に記載されている方法等の適切な方法を使用して調製できる。さらに、本発明の薬剤組成物は、薬剤融合体、薬剤複合体および非共有結合性の薬剤複合体に関して、本明細書に詳細に記載されている優位性および有用性も有する。
本発明は、薬剤単独（非複合体化薬剤、非融合体化薬剤）に比べ、改善された薬物動態学的特長（例えば、向上した血清半減期）およびその他の優位性を有する薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）を提供する。薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体および薬剤融合体は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片と、１種または複数の所望の薬剤とを含む。
本明細書に記載するように、本発明の薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、薬剤単独に比べ、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期が劇的に延長され、および／またはＡＵＣが増加する。さらに、一般に、薬剤の活性は、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）中で、実質的に変化することはない。しかし、薬剤単独に比べ、薬剤組成物の活性のいくらかの変化は許容され、通常、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）の改善された薬物動態学的特長が、そのような変化を補う。例えば、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）が、薬剤単独より低い親和性で薬剤標的に結合するが、薬剤組成物の改善された薬物動態学的特長（例えば、延長されたｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期、増加したＡＵＣ）により、薬剤単独とほとんど同等またはそれより優れた効果を有しうる。さらに、より少ない量の薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）を投与して、所望の治療効果または診断効果を達成することもできる。好ましくは、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）の活性は、薬剤単独の活性の約１００倍、または約５０倍、または約１０倍、または約５倍、または約４倍、または約３倍、または約２倍である。例えば、薬剤は、１ｎＭのＫＤ、Ｋｉまたは中和用量５０（ＮＤ５０）を有することができ、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、約２ｎＭ、または約３ｎＭ、または約４ｎＭ、または約５ｎＭ、または約１０ｎＭのＫＤ、ＫｉまたはＮＤ５０を有しうる。
好ましくは、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）の活性は、薬剤の活性に比べ、実質的に減弱しない。特定の実施形態では、薬剤組成物の活性の、薬剤の活性に対する減弱が、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下であるか、または実質的に変化していない。換言すると、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の薬剤の活性を保持するか、または薬剤と実質的に同一の活性を保持する。好ましくは、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）および薬剤の活性は、「薬剤ベース」で、測定および／比較する。
本明細書に記載および示されているように、本発明の薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、薬剤単独より高い活性（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにおける活性）を有しうる。例えば、実施例６に示すように、マウスモデルにおける関節炎の治療において、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａは、ＩＬ−１ｒａよりも、これらの薬剤を重量に関して同一の用量で投与した場合（１０ｍｇ／Ｋｇまたは１ｍｇ／Ｋｇ）、より効果が高かった。ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａの分子量は、ＩＬ−１ｒａの分子量の約２倍であるにもかかわらず、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａは、より高い効果を示した。したがって、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａを投与されたマウスは、ＩＬ−１ｒａを投与されたマウスの約半分のＩＬ−１ｒａ（ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａ中の部分として）しか投与されなかった。
特定の実施形態では、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、薬剤より高い活性（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにおける活性）を有し、例えば、薬剤組成物は、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、または少なくとも約５００％の薬剤の活性を有しうる。好ましくは、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）および薬剤の活性は、「薬剤ベース」で、測定および／比較する。薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）および薬剤の活性は、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける系を使用して測定できる。特定の実施形態では、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて測定した場合、薬剤組成物が含む薬剤より高い活性を有する。その他の実施形態では、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて測定した場合、薬剤組成物が含む薬剤より高い活性を有する。
血清アルブミンに対して結合特異性を有するドメイン抗体（ｄＡｂ）を含む薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、さらなる優位性をもたらす。ドメイン抗体は、非常に安定であり、抗体およびその他の抗体の抗原結合断片より小さく、大腸菌（Escherichia coli）または酵母（例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris））内で発現させることによって高収率で産生させることができ、本明細書に記載するように、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片は、ヒト起源のまたは任意の所望の種に由来するライブラリーから、容易に選択できる。したがって、血清アルブミンに結合するｄＡｂを含む薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、哺乳類の細胞内で通常産生させる治療薬（例えば、ヒトの、ヒト化またはキメラ抗体）より容易に調製でき、免疫原性ではないｄＡｂを使用できる（例えば、ヒトのｄＡｂを、ヒトの疾患を治療または診断するために、薬剤融合体または薬剤複合体に使用できる）。
薬剤が、血清アルブミンに結合するポリペプチド結合部分（例えば、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片）を含有する薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）の一部である場合には、薬剤の免疫原性を減弱させることができる。したがって、血清アルブミンに結合するポリペプチド結合部分を含有する薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）に関しては、薬剤は、（薬剤単独と比較して）免疫原性を低下させることができ、または実質的に非免疫原性でありうる。したがって、そのような薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）を、一定期間に繰り返し対象に投与しても、対象の免疫系の抗薬剤抗体生成による効果の損失を最低限とすることができる。
さらに、本明細書に記載されている薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、薬剤単独より向上した安全性特性および少ない副作用を有することもできる。例えば、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片の血清アルブミン結合活性の結果として、薬剤の融合体および複合体（薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体）は、向上した血管循環内存在時間を有する。さらに、複合体および薬剤融合体は、全身投与（例えば、静脈内投与）後に、血液脳関門を越えること、および中枢神経系内に蓄積することが実質的にできない。したがって、神経毒性または望ましくない向神経効果を有する薬剤を含有する複合体（薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体）および薬剤融合体を、薬剤単独より高い安全性および少ない副作用で投与できる。同様に、複合体（薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体）および薬剤融合体は、特定の臓器（例えば、腎臓または肝臓）に対して、薬剤単独より低い毒性を有しうる。また、本明細書に記載されている複合体および薬剤融合体を使用して、所与の薬剤または所与の薬剤に結合する標的（例えば、毒素）を、血管循環内で捕捉し、それによって、組織への前記薬剤または標的の効果を低下させる（例えば、毒素の効果を阻害する）ことができる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を薬物動態学的に解析および測定する適切な方法は、当技術分野で周知である。そのような方法は、例えば、Kenneth, Aら、Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists、およびPetersら、Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)に記載されている。ｔαおよびｔβ半減期（ｔ1/2α、ｔ1/2β）等の薬物動態学的パラメーターおよび曲線下面積（ＡＵＣ）が記載されている、"Pharmacokinetics", M GibaldiおよびD Perron、Marcel Dekker出版、2nd Rev. edition (1982)も参照されたい。
半減期（ｔ1/2αおよびｔ1/2β）ならびにＡＵＣは、複合体または融合体の血清濃度の時間に対する曲線から決定できる。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ解析パッケージ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州 ９４０４０、米国)から入手可能）を使用して、例えば、曲線を作成できる。第１相（α相）では、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）が、主に患者内に分布し、一部は排出される。第２相（β相）は、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）はすでに分布しており、薬剤組成物が患者から排除されるにつれ、血清濃度が減少する終わりの相である。ｔα半減期は、第１相の半減期であり、ｔβ半減期は、第２相の半減期である。したがって、本発明は、１５分またはそれを上回る範囲のｔα半減期を有する、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）または本発明による薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）を含む組成物を提供する。ある実施形態では、範囲の下限は、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間または１２時間である。さらに、または換言すると、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）または本発明による組成物は、１２時間以下の範囲のｔα半減期を有することになる。ある実施形態では、範囲の上限は、１１、１０、９、８、７、６または５時間である。適切な範囲の例として、１〜６時間、２〜５時間または３〜４時間があげられる。
好都合なことに、本発明は、２．５時間またはそれを上回る範囲のｔβ半減期を有する薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）を提供する。ある実施形態では、範囲の下限は、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間または１２時間である。いくつかの実施形態では、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、２１日間以下の範囲のｔβ半減期を有する。ある実施形態では、範囲の上限は、１２時間、２４時間、２日間、３日間、５日間、１０日間、１５日間または２０日間である。特定の実施形態では、本発明による薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、１２〜６０時間の範囲のｔβ半減期を有する。別の実施形態では、ｔβ半減期は、１２〜４８時間の範囲である。さらに別の実施形態では、ｔβ半減期は、１２〜２６時間の範囲である。
さらに、または上記の基準の代わりに、本発明は、０．０１ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬまたはそれを上回る、あるいは１ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬまたはそれを上回る範囲のＡＵＣ値（曲線下面積）を有する薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）を提供する。ある実施形態では、範囲の下限は、０．０１、０．１、１、５、１０、１５、２０、３０、１００、２００または３００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬである。特定の実施形態では、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、６００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ以下の範囲のＡＵＣを有する。ある実施形態では、範囲の上限は、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５または５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬである。その他の実施形態では、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、以下からなる群から選択された範囲のＡＵＣを有する：１５〜１５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、１５〜１００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、１５〜７５ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、１５〜５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、０．０１〜５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、０．１〜５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、１〜５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ、５〜５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬおよび１０〜５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍＬ。
本発明は、薬剤と、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含有するポリペプチド結合部分とを含む薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）に関する。薬剤組成物の好ましい実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含有するポリペプチド結合部分が、血清アルブミンに対して結合特異性を有する。
いくつかの実施形態では、薬剤組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含有するポリペプチド結合部分に共有結合している薬剤を含む。これらの実施形態では、薬剤は、ポリペプチド結合ドメインに、アミノ末端、カルボキシル末端または適切なアミノ酸の側鎖（例えば、リジンのεアミノ基またはシステインのチオール基）を介して等、任意の適切な位置で結合することができる。
その他の実施形態では、薬剤組成物はiｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含有するポリペプチド結合部分に非共有結合している薬剤を含む。そのような実施形態では、薬剤は、抗原結合断片に、直接的に（例えば、静電的な相互作用、疎水性の相互作用）、または間接的に（例えば、相補的な結合相手（具体的には、ビオチンとアビジン）の非共有結合を介して）非共有結合することができる（後者の場合、１つの結合相手は薬剤に共有結合しており、相補的な結合相手は抗原結合断片に共有結合している）。相補的な結合相手を利用する場合、結合相手の１つは、直接的にまたは適切なリンカー部分を介して、薬剤に共有結合することができ、相補的な結合相手は、直接的にまたは適切なリンカー部分を介して、ポリペプチド結合ドメインに共有結合することができる。
その他の実施形態では、薬剤組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含有するポリペプチド結合部分と、ポリペプチド薬剤とを含む融合タンパク質である。融合タンパク質は、連続したポリペプチド鎖を含み、前記鎖は、第１の部分として、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含有するポリペプチド結合部分と、第２の部分として、ポリペプチド薬剤とを含み、それらは、ポリペプチドの鎖の別々の部（部分）として存在している。第１および第２の部分は、ペプチド結合を介して互いに直接的に結合している、あるいは適切なアミノ酸またはペプチドもしくはポリペプチドのリンカーを介して連結することができる。追加の（例えば、第３の、第４の）部分および／またはリンカー配列が、適切であれば、存在してもよい。第１の部分は、Ｎ末端の位置、Ｃ末端の位置、または第２の部分（すなわち、ポリペプチド薬剤）に関する内部に存在できる。特定の実施形態では、融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含有するポリペプチド結合部分の１個または複数と、ポリペプチド薬剤部分の１個または複数とを含む。これらの実施形態では、融合タンパク質は、同一であってもよいし、また異なっていてもよい、ポリペプチド薬剤部分の１〜約１０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）と、同一であってもよいし、また異なっていてもよい、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含有するポリペプチド結合部分の１〜約２０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個）とを含むことができる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含有するポリペプチド結合部分、およびポリペプチド薬剤部分は、任意の所望の位置に存在できる。例えば、アミノ末端からカルボキシル末端に向けて、それらの部分は、以下の順に存在できる：１個または複数のポリペプチド結合部分、１個または複数のポリペプチド薬剤部分、１個または複数のポリペプチド結合部分。別の例では、アミノ末端からカルボキシル末端に向けて、それらの部分は、以下の順に存在できる：１個または複数のポリペプチド結合部分、１個または複数のポリペプチド薬剤部分、１個または複数のポリペプチド結合部分、１個または複数のポリペプチド薬剤部分、１個または複数のポリペプチド結合部分。本明細書に記載するように、ポリペプチド結合部分とポリペプチド薬剤部分とは、ペプチド結合を介して互いに直接的に結合している、あるいは適切なアミノ酸またはペプチドもしくはポリペプチドのリンカーを介して連結することができる。
特定の実施形態では、融合タンパク質は、式（アミノ末端からカルボキシ末端へ）：
ａ−（Ｐ）ｎ２−ｂ−（Ｘ）ｎ１−ｃ−（Ｑ）ｎ３−ｄまたはａ−（Ｑ）ｎ３−ｂ−（Ｘ）ｎ１−ｃ−（Ｐ）ｎ２−ｄ
（式中、
Ｘは、ポリペプチド薬剤であり；
ＰおよびＱは、それぞれ独立に、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含有するポリペプチド結合部分であり；
ａ、ｂ、ｃおよびｄは、それぞれ独立に、存在しないか、または１〜約１００個のアミノ酸残基であり；
ｎ１、ｎ２およびｎ３は、存在するＸ、ＰまたはＱの部分のそれぞれの数であり；
ｎ１は、１から約１０であり；
ｎ２は、０から約１０であり；かつ
ｎ３は、０から約１０であるが、
ｎ２およびｎ３が共に０ではなく；かつ
ｎ１およびｎ２が共に１であり、ｎ３が０である場合には、Ｘは、抗体鎖または抗体鎖の断片を含まない）
を有する連続したポリペプチド鎖である。
いくつかの実施形態では、ｎ２が、１、２、３、４、５または６であり、ｎ３が、０である。その他の実施形態では、ｎ３が、１、２、３、４、５または６であり、ｎ２が、０である。その他の実施形態では、ｎ１、ｎ２およびｎ３が、それぞれ１である。
特定の実施形態では、Ｘは、抗体鎖または抗体鎖の断片を含まない。
好ましい実施形態では、ＰおよびＱは、それぞれ独立に、血清アルブミン対して結合特異性を有するポリペプチド結合部分である。
特に好ましい実施形態では、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位（例えば、抗原結合部位）を含有するポリペプチド結合部分を含み、ポリペプチド結合ドメインは、血清アルブミン対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片である。
血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片
本発明の薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体および薬剤融合体は、所与の（すなわち、１個または複数の）、血清アルブミンに結合する、抗体の抗原結合断片を含む。抗原結合断片は、薬剤複合体または薬剤融合体が投与されることになる動物の血清アルブミンに対して結合特異性を有しうる。好ましくは、抗原結合断片は、ヒトの血清アルブミンに対して結合特異性を有する。しかし、獣医用も意図されており、抗原結合断片は、所望の動物由来の血清アルブミン、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、シカ、ミンク等の血清アルブミンに対して結合特異性を有しうる。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、２つ以上の種由来の血清アルブミンに対して結合特異性を有する。例えば、本明細書に記載するように、ラットの血清アルブミンおよびマウスの血清アルブミンに対して結合特異性を有するヒトのｄＡｂ、ならびにラット、マウスおよびヒトの血清アルブミンに対して結合特異性を有するｄＡｂが生成されている（表１および図７）。そのようなｄＡｂは、同一の薬剤複合体または薬剤融合体を使用する前臨床および臨床試験を可能にし、適切な代用の薬剤複合体または薬剤融合体を用いた前臨床試験の実施を不必要にするという優位性をもたらす。
本発明において使用するのに適した抗原結合断片として、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）およびジスルフィド結合Ｆｖを含む）、単一の可変領域およびｄＡｂ（ＶＨ、ＶＬ）があげられる。そのような抗原結合断片を、ペプシン、パパインまたは要求されている切断特異性を有するその他のプロテアーゼを使用する抗体のタンパク質分解等、任意の適切な方法を使用して、あるいは組換え手法を使用して生成できる。例えば、Ｆｖ断片を、適切なプロテアーゼを用いて抗体を消化することによって、または組換えＤＮＡ技術を使用することによって調製できる。例えば、２〜約２０個のグリシル残基の鎖等の適切なペプチドリンカーによって連結されている軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードする核酸を調製できる。核酸を、適切な宿主（例えば、大腸菌（E. coli））内に、任意の適切な手法（例えば、形質移入、形質転換、感染）を使用して導入でき、宿主を、一本鎖Ｆｖ断片の発現に適した条件下で維持できる。多様な抗体の抗原結合断片を、１つまたは複数の停止コドンが、自然の停止部位の上流に導入されている抗体の遺伝子を使用して調製できる。例えば、免疫グロブリン重鎖のＦ（ａｂ’）２部をコードする発現構築物を、翻訳停止コドンを、重鎖のヒンジ領域をコードする配列の３’末端に導入することによって設計できる。本発明の薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体および薬剤融合体は、血清アルブミンに結合する抗体の個別の重鎖および軽鎖、または血清アルブミンに結合する個別の鎖の一部を含むことができる（例えば、ＶＨ、ＶκもしくはＶλ）。
所望の血清アルブミン（例えば、ヒトの血清アルブミン）に結合する抗体および抗体の抗原結合断片を、自然もしくは人工の抗体の適切なコレクションから選択する、または適切な宿主内で適切な免疫原に対して産生させることができる。例えば、適切な宿主（例えば、マウス、ヒト抗体を作るトランスジェニックマウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、非ヒト霊長類（具体的には、サル））を、血清アルブミン（例えば、単離または精製したヒト血清アルブミン）または血清アルブミンのペプチド（例えば、少なくとも約８、９、１０、１１、１２、１５、２０、２５、３０、３３、３５、３７または４０個のアミノ残基を含むペプチド）で免疫することによって、抗体を産生させることができる。血清アルブミンに結合する抗体および抗原結合断片は、ファージディスプレイライブラリー等の組換えによる抗体または抗原結合断片のライブラリーから選択することもできる。そのようなライブラリーは、自然または人工のアミノ酸配列を含有する抗体または抗体の抗原結合断片を含有しうる。例えば、ライブラリーは、人工のＣＤＲ（例えば、ランダムアミノ酸配列）およびヒトのフレームワーク領域を含有するＦａｂ断片を含有しうる。（例えば、米国特許第6,300,064（Knappikら）を参照）その他の例では、ライブラリーは、１種または複数のＣＤＲに配列多様性を有するｓｃＦｖ断片またはｄＡｂ（単一のＶＨ、単一のＶκまたは単一のＶλ）を含有する。（例えば、WO99/20749（TomlinsonおよびWinter）、WO03/002609 A2（Winterら）、WO2004/003019 A2（Winterら）を参照）
適切な、血清アルブミンに結合する抗体または抗体の抗原結合断片として、例えば、ヒトの抗体または抗体の抗原結合断片、ヒト化した抗体または抗体の抗原結合断片、キメラの抗体または抗体の抗原結合断片、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）の抗体または抗体の抗原結合断片、およびラクダ科（Camelid）の抗体または抗体の抗原結合断片があげられる。特定の実施形態では、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体および薬剤融合体は、血清アルブミンに結合するラクダ科のＶＨＨを含む。ラクダ科のＶＨＨは、元々軽鎖がない、重鎖抗体に由来する免疫グロブリンの単一の可変領域のポリペプチドである。そのような抗体が、ラクダ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコを含むラクダ科の種に存在する。ＶＨＨ分子は、ＩｇＧ分子に比べ約１０分の１の大きさであり、単一のポリペプチドとして、安定性が非常に高く、極端なｐＨおよび温度の条件に抵抗性がある。適切な、血清アルブミンに結合するラクダ科のＶＨＨとして、WO2004/041862（Ablynx N. V.）および本明細書(図１５および配列番号７７〜８８)に開示されているものがあげられる。特定の実施形態では、ラクダ科のＶＨＨは、ヒトの血清アルブミンに結合し、かつ配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７または配列番号８８に対して、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列同一性は、好ましくは、ＢＬＡＳＴ Ｐ等の適切なアラインメントアルゴリズムおよびデフォルトパラメーターを使用して決定する（KarlinおよびAltschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6): 2264-2268 (1990)）。
免疫抗原の調製、ならびにポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生成は、任意の適切な手法を使用して実施できる。各種の方法が記載されている。（例えば、Kohlerら、Nature, 256: 495-497 (1975)およびEur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976)；Milsteinら、Nature 266: 550-552 (1977)；Koprowskiら、米国特許第4,172,124号；Harlow, E.およびD. Lane、1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY)；Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 2 (Supplement 27, Summer '94), Ausubel, F. M.ら編、(John Wiley & Sons: New York, NY), Chapter 11, (1991)を参照）一般に、モノクローナル抗体が所望される場合、不死の細胞株（例えば、ＳＰ２／０、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３等のミエローマ細胞株またはヘテロミエローマ）由来の適切な細胞を、抗体産生細胞と融合させることによって、ハイブリドーマを生成する。目的の抗原で免疫したヒト、ヒト抗体を作るトランスジェニック動物またはその他の適切な動物の末梢血液、または好ましくは、脾臓もしくはリンパ節から、抗体産生細胞を得ることができる。適切な方法、例えば、ヒトの抗体産生細胞とヘテロミエローマもしくはトリオーマとの融合、またはエプスタイン・バーウイルス（Epstein Barr virus）に感染させて活性化したヒトのＢ細胞の不死化を使用して、ヒト由来の抗体（例えば、ヒトの抗体）を産生する細胞を生成できる。（例えば、米国特許第6,197,582（Trakht）；Niedbalaら、Hybridoma, 17: 299-304 (1998)；Zanellaら、J Immunol Methods, 156: 205-215 (1992)；Gustafssonら、Hum Antibodies Hybridomas, 2: 26-32 (1991)を参照）融合させた、または不死化した抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を、選択的な培養条件を使用して単離し、限界希釈法によってクローン化できる。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞を、適切なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ法）を使用して同定できる。
目的の抗原で免疫したヒト、ヒト抗体を作るトランスジェニック動物またはその他の適切な動物の単離した抗原特異的な抗体産生細胞（例えば、所望の特異性を有する抗体を産生することが決定された、末梢血液、または好ましくは、脾臓もしくはリンパ節由来の細胞）から、抗体を直接的に調製（例えば、合成またはクローン化）することもできる。（例えば、米国特許第5,627,052号（Schrader）を参照）
薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体または薬剤融合体が、ヒトに投与するためのものである場合、血清アルブミン（例えば、ヒトの血清アルブミン）に結合する抗体または抗体の抗原結合断片は、ヒトの、ヒト化したもしくはキメラの抗体、またはそのような抗体の抗原結合断片でありうる。このような種類の抗体および抗原結合断片は、ヒトにおいて、低免疫原性または無免疫原性であり、周知の優位性を提供する。例えば、ヒトの、ヒト化したもしくはキメラの抗体の抗原結合断片を含有する薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体または薬剤融合体は、ヒトに繰り返し投与しても、（その他の完全に免疫原性である抗体に比較して）薬剤複合体または薬剤融合体に結合するヒト抗体の生成による効果の損失が少ないか、または効果の損失が全くない状態で投与できる。薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体または薬剤融合体が、動物への投与を意図するものである場合、類似の抗体または抗原結合断片を使用できる。例えば、マウスまたはヒトの抗体由来のＣＤＲを、ウマまたはウシ等の所望の動物由来のフレームワーク領域上にグラフトしうる。
ヒトの抗体およびそれをコードする核酸を、例えば、ヒトからまたはヒト抗体を作るトランスジェニック動物から得ることができる。ヒト抗体を作るトランスジェニック動物（例えば、マウス）は、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（Ａｂｇｅｎｉｘ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、カリフォルニア州）、ＨＵＭＡＢ−ＭＯＵＳＥ、ＫＩＲＩＮ ＴＣ ＭＯＵＳＥまたはＫＭ−ＭＯＵＳＥ（ＭＥＤＡＲＥＸ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ニュージャージー州）等、ヒトの抗体のレパートリーを産生できる動物である。一般に、ヒト抗体を作るトランスジェニック動物のゲノムは、機能的な再配列を受けることができるヒトの免疫グロブリンの遺伝子座のＤＮＡを含む導入遺伝子を含むように変化させられている。内因性の遺伝子によってコードされる抗体を産生する動物の能力を除去するために、ヒト抗体を作るトランスジェニック動物の内因性の免疫グロブリンの遺伝子座を破壊または削除できる。ヒト抗体を作るトランスジェニック動物を生成するための適切な方法は、当技術分野では周知である。（例えば、米国特許第5,939,598号および第6,075,181号（Kucherlapatiら）、米国特許第5,569,825号、第5,545,806号、第5,625,126号、第5,633、425号、第5,661,016号および第5,789,650号（Lonbergら）、Jakobovitsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551-2555 (1993)、Jakobovitsら、Nature, 362: 255-258 (1993)、Jakobovitsら、WO98/50433、Jakobovitsら、WO98/24893、Lonbergら、WO98/24884、Lonbergら、WO97/13852、Lonbergら、WO94/25585、Lonbergら、EP0814259 A2、Lonbergら、GB2272440 A、Lonbergら、Nature 368:856-859 (1994)、Lonbergら、Int Rev Immunol 13(1): 65-93 (1995)、Kucherlapatiら、WO96/34096、Kucherlapatiら、EP0463151 B1、Kucherlapatiら、EP0710719 A1、Suraniら、米国特許第5,545,807号、Bruggemannら、WO90/04036、Bruggemannら、EP0438474 B1、Taylorら、Int. Immunol. 6(4)579-591 (1994)、Taylorら、Nucleic Acids Research 20(23): 6287-6925 (1992)、Greenら、Nature Genetics 7:13-21 (1994)、Mendezら、Nature Genetics 15: 146-156 (1997)、Tuaillonら、Proc Natl Acad Sci USA, 90(8): 3720-3724 (1993)およびFishwildら、Nat Biotechnol 14(7): 845-851 (1996)を参照。上記のそれぞれの教示全体が、参照によって本明細書に組み込むものとする）
ヒト抗体を作るトランスジェニック動物を、適切な抗原（例えば、ヒトの血清アルブミン）を用いて免疫でき、抗体産生細胞を単離し、従来法を使用して融合させて、ハイブリドーマを形成できる。所望の特徴（例えば、特異性、親和性）を有するヒトの抗体を産生するハイブリドーマを、任意の適切なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ法）を使用して同定し、所望により、選択し、適切な培養手法を使用してサブクローン化できる。
ヒト化抗体およびその他のＣＤＲグラフト抗体を、任意の適切な方法を使用して調製できる。ＣＤＲグラフト抗体のＣＤＲは、血清アルブミンに結合する、適切な抗体（ドナー抗体と呼ばれる）から引き出すことができる。適切なＣＤＲのその他の起源として、ヒト、またはげっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ）、ニワトリ、ブタ、ヤギ、非ヒト霊長類（例えば、サル）等の非ヒトの起源から、あるいはライブラリーから得られる自然および人工の血清アルブミン特異的抗体があげられる。
ヒト化抗体のフレームワーク領域は、好ましくは、ヒト由来であり、ドナー抗体の抗原結合領域に類似する、またはそれと同等である領域（例えば、重鎖可変領域または軽鎖可変領域）に類似する配列を有する、任意のヒトの抗体の可変領域から引き出すことができる。ヒト由来のフレームワーク領域のその他の起源として、ヒトの可変領域の共通配列があげられる。（例えば、Kettleborough, C. A.ら、Protein Engineering 4: 773-783 (1991)；Carterら、WO94/04679；Kabat, E. A. ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)を参照）ＣＤＲグラフト抗体のその他の種類は、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ等の生殖系列の抗体の遺伝子セグメントによってコードされているフレームワーク領域等、適切な起源のフレームワーク領域を含有しうる。
ヒト由来のフレームワーク領域は、ヒトまたは動物由来のフレームワーク領域中のアミノ酸残基をドナー抗体の対応する位置の残基で交換する「逆突然変異」等、アミノ酸の置換または交換を含んでいてもよい。フレームワーク領域において、１つまたは複数のアミノ酸の欠失、挿入および置換を含む、１つまたは複数の変異を起こすことがでる。変異体は、非ヒトのドナーまたはアクセプターであるヒトの鎖の突然変異誘発を含む、多様な適切な方法によって生成できる。（例えば、教示全体が、参照によって本明細書に組み込むものとする、米国特許第5,693,762号（Queenら）および第5,859,205号（Adairら）参照）
抗体、抗体の鎖（例えば、重鎖、軽鎖）またはそれらの断片もしくは一部の定常部が存在する場合には、それらを、任意の適切な起源から引き出すことができる。例えば、ヒトの、ヒト化したおよび特定のキメラの抗体、抗体の鎖（例えば、重鎖、軽鎖）またはそれらの断片もしくは一部の定常部が存在する場合には、それらは、ヒト由来であってもよく、それらを、任意の適切なヒトの抗体またはヒトの抗体の鎖から引き出すことができる。例えば、ヒト由来の定常部またはその一部を、対立遺伝子の変異体を含む、ヒトのκもしくはλ軽鎖および／またはヒトγ（例えば、γ１、γ２、γ３、γ４）、μ、α（例えば、α１、α２）、δもしくはε重鎖から引き出すことができる。特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片（例えば、ヒト由来の抗体、ヒトの抗体）は、機能（例えば、エフェクター機能）を変化させる、または目的に合わせるアミノ酸の置換または交換を含むことができる。例えば、補体活性化および／またはＦｃ受容体結合を低下させるように、ヒト由来の定常部（例えば、γ１定常部、γ２定常部）を設計できる。（例えば、教示全体が、参照によって本明細書に組み込むものとする、米国特許第5,648,260号（Winterら）、第5,624,821号（Winterら）および第5,834,597号（Tsoら）を参照）そのようなアミノ酸の置換または交換を含有するヒト由来の定常部のアミノ酸配列は、好ましくは、変化させていないヒト由来の定常部のアミノ酸配列の全長に対して少なくとも９５％同一であり、より好ましくは、変化させていないヒト由来の定常部のアミノ酸配列の全長に対して少なくとも９９％同一である。
ヒト化抗体、ＣＤＲグラフト抗体またはヒト化抗体もしくはＣＤＲグラフト抗体の抗原結合断片を、任意の適切な方法を使用して調製できる。いくつかのそのような方法が、当技術分野では周知である。（例えば、米国特許第5,225,539号（Winter）、米国特許第5,530,101号（Queenら）を参照）ヒト化抗体またはＣＤＲグラフト抗体の一部（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、定常部）を、適切な抗体から（例えば、部分の新規合成によって）直接的に得る、または引き出すことができ、あるいは所望の（例えば、血清に結合する）特長を有する抗体または抗体の鎖をコードする核酸を生成し、発現させることができる。鎖の一部を調製するために、１つまたは複数の停止コドンを、所望の位置に導入できる。例えば、現存するＤＮＡ配列を変化させるＰＣＲ突然変異誘発法を使用して、ヒト化またはＣＤＲをグラフトした可変領域をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を構築できる。（例えば、Kamman, M.ら、Nucl. Acids Res. 17: 5404 (1989)を参照）新しいＣＤＲをコードするＰＣＲプライマーは、あらかじめヒト化された可変領域のＤＮＡの鋳型にハイブリダイズでき、この可変領域は、同一または非常に類似のヒトの可変領域に基づくものである（Sato, K.ら、Cancer Research 53: 851-856 (1993)）。鋳型として使用するための類似のＤＮＡ配列が入手できない場合には、可変領域の配列をコードする配列を含む核酸を、合成オリゴヌクレオチドから構築できる（例えば、Kolbinger, F.、Protein Engineering 8: 971-980 (1993)）。シグナルペプチドをコードする配列を（例えば、合成により、ベクターへの挿入により）、核酸に組み込むこともできる。アクセプターの抗体由来の自然のシグナルペプチド配列、別の抗体由来のシグナルペプチド配列、またはその他の適切な配列を使用できる（例えば、Kettleborough, C. A.、Protein Engineering 4: 773-783 (1991)を参照）。これらの方法またはその他の適切な方法を使用して、変異体を容易に生成できる。ある実施形態では、クローン化した可変領域を変異させることができ、所望の特異性を有する
変異体をコードする配列を（例えば、ファージライブラリーから；例えば、米国特許第5,514,548号（Krebberら）およびWO93/06213（Hoogenboomら）を参照）選択できる。
血清アルブミンに結合する抗体または抗原結合断片は、キメラ抗体またはキメラ抗体の抗原結合断片でありうる。キメラ抗体またはキメラ抗体の抗原結合断片は、１つの種（例えば、マウス）由来の可変領域と、別の種（例えば、ヒト）由来の定常部の少なくとも一部とを含む。キメラ抗体またはキメラ抗体の抗原結合断片を、任意の適切な方法を使用して調製できる。いくつかの適切な方法が、当技術分野では周知である。（例えば、米国特許第4,816,567号（Cabillyら）、米国特許第5,116,946号（Caponら）を参照）
血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片を得るための好ましい方法は、抗原結合断片のレパートリーから所望の血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ）を選択することを含む。例えば、本明細書に記載するように、血清アルブミンに結合するｄＡｂを、適切なファージディスプレイライブラリーから選択できる。多くの適切なバクテリオファージディスプレイライブラリーおよび選択方法（例えば、一価のディスプレイ系および多価のディスプレイ系）が記載されている。（例えば、Griffithsら、米国特許第6,555,313 B1号（参照によって本明細書に組み込むものとする）；Johnsonら、米国特許第5,733,743号（参照によって本明細書に組み込むものとする）；McCaffertyら、米国特許第5,969,108号（参照によって本明細書に組み込むものとする）；Mulligan-Kehoe、米国特許第5,702,892号参照によって本明細書に組み込むものとする）；Winter, G.ら、Annu. Rev. Immunol. 12： 433-455 (1994)；Soumillion, P.ら、Appl. Biochem, Biotechnol. 47(2-3): 175-189 (1994)；Castagnoli, L.ら、Comb. Chem. High Throughput Screen,4(2): 121-133 (2001)；WO99/20749（TomlinsonおよびWinter）；WO03/002609 A2（Winterら）；WO2004/003019 A2（Winterら）を参照）バクテリオファージライブラリーに提示されるポリペプチドは、例えば、繊維状ファージ（具体的には、ｆｄ、Ｍ１３、Ｆ１）、溶菌ファージ（具体的には、Ｔ４、Ｔ７、λ）またはＲＮＡファージ（具体的には、ＭＳ２）等の任意の適切なバクテリオファージ上に提示させ、血清アルブミン（例えば、ヒトの血清アルブミン）への結合に関して選択できる。
一般に、ポリペプチドのレパートリーを適切なファージのコートタンパク質と共に融合タンパク質として提示するファージのライブラリーが使用される。提示される抗体または抗体の抗原結合断片をコードするファージベクターまたはファージミドベクターのライブラリーを、適切な宿主細菌内に導入し、生成した細菌を培養して（例えば、所望により、適切なヘルパーファージまたは補助的なプラスミドを使用して）ファージを産生させる等、任意の適切な方法を使用して、そのようなライブラリーを生成できる。ファージのライブラリーを、そのような培養液から、沈殿法および遠心分離法等の任意の適切な方法を使用して回収できる。
ライブラリーは、任意の所望の量の多様なアミノ酸配列を含有する抗体または抗体の抗原結合断片のレパートリーを含むことができる。例えば、レパートリーは、所望の生物体由来の自然に存在する抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体または抗体の抗原結合断片を含有でき、および／またはランダムな、もしくはランダム化されたアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ配列）の1つまたは複数の領域を含有しうる。そのようなレパートリーまたはライブラリー中の抗体または抗体の抗原結合断片は、ランダムな、またはランダム化されたアミノ酸配列の規定された領域と、共通のアミノ酸配列の領域とを含むことができる。特定の実施形態では、レパートリーのすべてまたは実質的にすべてのポリペプチドが、所望の種類の、抗体の抗原結合断片（例えば、ヒトＶＨまたはヒトＶＬ）である。例えば、レパートリー中の各ポリペプチドが、ＶＨ、ＶＬまたはＦｖ（例えば、一本鎖Ｆｖ）を含有しうる。
多様なアミノ酸配列を、抗体または抗体の抗原結合断片の任意の所望の領域内に、任意の適切な方法を使用して導入できる。例えば、多様なアミノ酸配列を、抗体の可変領域の相補性決定領域等の標的領域内に、多様な抗体または抗体の抗原結合断片をコードする核酸のライブラリーを任意の適切な突然変異誘発法（例えば、低フィデリティーＰＣＲ、オリゴヌクレオチド仲介変異誘発、部位特異的変異誘発、ＮＮＫコドンを使用する多様化）、または任意のその他の適切な方法を使用して調製することによって、導入できる。所望により、多様化しようとする抗体または抗体の抗原結合断片の領域を、ランダム化できる。
適切なファージディスプレイライブラリーを使用して、血清アルブミンに結合し、かつその他の有益な特長を有する抗体または抗体の抗原結合断片を選択できる。例えば、折り畳み構造がほどけるときの凝集に抵抗する抗体または抗体の抗原結合断片を選択できる。凝集は、ポリペプチドの濃度に影響され、多くの場合、部分的に折り畳まれている中間体または部分的に折り畳み構造がほどけている中間体から生じると考えられている。高温および高いポリペプチド濃度等の部分的に折り畳まれている中間体を好む要因および条件が、不可逆的な凝集を促進する。（Fink, A. L.、Folding & Design 3: R1-R23 (1998)）例えば、凍結乾燥製剤等の濃縮した形態で精製したポリペプチドを保存すると、少なくとも一部のポリペプチドが不可逆的に凝集することが頻繁に発生する。また、大腸菌（E. coli）等の生物学的な系で発現させることによってポリペプチドを生成すると、凝集したポリペプチドを含有する封入体の形成にしばしば至る。封入体からの活性のあるポリペプチドの回収は、非常に困難である場合があり、再折り畳みステップ等、生物学的な生成系にステップを追加することが必要となる。
加熱したときに凝集に抵抗し、可逆的に折り畳み構造がほどける抗体または抗原結合断片を、適切なファージディスプレイライブラリーから選択できる。一般に、提示された抗体または抗体の抗原結合断片のレパートリーを含むファージディスプレイライブラリーを、少なくとも一部の提示された抗体または抗体の抗原結合断片の折り畳み構造がほどける温度（Ｔｓ）まで加熱し、次いで、Ｔｓ＞Ｔｃである温度（Ｔｃ）まで冷却すると、それによって、少なくとも一部の抗体または抗体の抗原結合断片に再折り畳みが生じ、一部のポリペプチドが凝集する。次いで、可逆的に折り畳み構造がほどけ、かつ血清アルブミンに結合する抗体または抗体の抗原結合断片を温度（Ｔｒ）で回収する。可逆的に折り畳み構造がほどける、回収した抗体または抗体の抗原結合断片は、融解温度（Ｔｍ）を有し、好ましくは、レパートリーをＴｓまで加熱、Ｔｃまで冷却後、可逆的に折り畳み構造がほどける抗体または抗体の抗原結合断片をＴｒで単離した場合、Ｔｓ＞Ｔｍ＞ＴｃおよびＴｓ＞Ｔｍ＞Ｔｒである。一般に、選択に先立って、ファージディスプレイライブラリーを約８０℃まで加熱後、ほぼ室温または約４℃まで冷却する。特定のアミノ酸残基を可逆的に折り畳み構造がほどけることを可能にする残基で交換することによって、可逆的に折り畳み構造がほどけ、かつ凝集に抵抗する抗体または抗体の抗原結合断片を設計または操作することもできる。（可逆的に折り畳み構造がほどける抗体または抗体の抗原結合断片を設計または操作する方法についての詳細な議論は、WO2004/101790（Jespersら）、ならびに米国仮特許出願第60/470,340号（２００３年５月１４日出願）および第60/554,021号（２００４年３月１７日出願）を参照。WO2004/101790および上記の米国仮特許出願の両方の教示するところは、参照によって本明細書に組み込むものとする）。
可逆的に折り畳み構造がほどけ、かつ凝集に抵抗する抗体または抗体の抗原結合断片は、いくつかの優位性をもたらす。例えば、凝集に対する抵抗性により、可逆的に折り畳み構造がほどける抗体または抗体の抗原結合断片を、大腸菌（E. coli）等の適切な生物学的な生成系を使用して発現させることによって、可溶性タンパク質として高収率で生成できる。さらに、可逆的に折り畳み構造がほどける抗体または抗体の抗原結合断片は、従来のポリペプチドより高い濃度で、製剤化および／または保存でき、凝集および活性の損失も少ない。ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号２０）は、可逆的に折り畳み構造がほどけるヒトのＶＨである。
好ましくは、血清アルブミンに結合する抗体または抗体の抗原結合断片は、可変領域（ＶＨ、Ｖκ、Ｖλ）を含み、この可変領域においては、１つまたは複数のフレームワーク領域（ＦＲ）が、（ａ）ヒトのフレームワーク領域のアミノ酸配列、（ｂ）ヒトのフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも８個の近接するアミノ酸、または（ｃ）ヒトの生殖系列の抗体の遺伝子セグメントによってコードされるアミノ酸配列を含む。ただし、前記フレームワーク領域は、Ｋａｂａｔにより定義されるものである。特定の実施形態では、１つまたは複数のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒトの生殖系列の抗体の遺伝子セグメントによってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である、または、１つまたは複数の前記フレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒトの生殖系列の抗体の遺伝子セグメントによってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列に関して、全体で５個までの異なるアミノ酸を含む。
その他の実施形態では、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４のアミノ酸配列は、ヒトの生殖系列の抗体の遺伝子セグメントによってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である、またはＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４のアミノ酸配列は、前記ヒトの生殖系列の抗体の遺伝子セグメントによってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列に関して、全体で１０個までの異なるアミノ酸を含有する。その他の実施形態では、前記ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３アミノ酸配列は、前記ヒトの生殖系列の抗体の遺伝子セグメントによってコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一である。
特定の実施形態では、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片は、ヒトの生殖系列の配列に基づく免疫グロブリンの可変領域（例えば、ＶＨ、ＶＬ）を含み、所望により、相補性決定領域等の１つまたは複数の多様化した領域を有しうる。適切な、ＶＨのヒトの生殖系列の配列として、例えば、ＶＨ遺伝子セグメントであるＤＰ４、ＤＰ７、ＤＰ８、ＤＰ９、ＤＰ１０、ＤＰ３１、ＤＰ３３、ＤＰ４５、ＤＰ４６、ＤＰ４７、ＤＰ４９、ＤＰ５０、ＤＰ５１、ＤＰ５３、ＤＰ５４、ＤＰ６５、ＤＰ６６、ＤＰ６７、ＤＰ６８およびＤＰ６９、ならびにＪＨセグメントであるＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ４ｂ、ＪＨ５およびＪＨ６によってコードされる配列があげられる。適切な、ＶＬのヒトの生殖系列の配列として、例えば、Ｖκ遺伝子セグメントであるＤＰＫ１、ＤＰＫ２、ＤＰＫ３、ＤＰＫ４、ＤＰＫ５、ＤＰＫ６、ＤＰＫ７、ＤＰＫ８、ＤＰＫ９、ＤＰＫ１０、ＤＰＫ１２、ＤＰＫ１３、ＤＰＫ１５、ＤＰＫ１６、ＤＰＫ１８、ＤＰＫ１９、ＤＰＫ２０、ＤＰＫ２１、ＤＰＫ２２、ＤＰＫ２３、ＤＰＫ２４、ＤＰＫ２５、ＤＰＫ２６およびＤＰＫ２８、ならびにＪκセグメントであるＪκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４およびＪκ５によってコードされる配列があげられる。
特定の実施形態では、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体または薬剤融合体は、血清アルブミンに結合するマウス、ラットおよび／またはウサギの抗体、またはそのような抗体の抗原結合断片を含有しない。
抗原結合断片は、血清アルブミンに、任意の所望の親和性、結合速度および解離速度で結合できる。親和性（ＫＤ）、結合速度（Ｋｏｎまたはｋａ）および解離速度（ＫｏｆｆまたはｋｄまたはＫｄ）を、特定の薬剤に関して所望の血清半減期を得るように選択できる。例えば、慢性炎症性障害の炎症性のメディエーターを中和する薬剤（例えば、炎症性サイトカインに結合し、それを中和するｄＡｂ）に関しては、最大の血清半減期を得るのが望ましい場合があり、何らかの毒性を有する薬剤（例えば、化学療法剤）に関しては、より短い半減期が望ましい場合がある。一般に、血清アルブミンへの結合に関して、速い結合速度、および速い、または中等度の解離速度が好ましい。これらの特徴を有する抗原結合断片を含む薬剤複合体および薬剤融合体は、投与後、血清アルブミンに素早く結合し、解離しても、血清アルブミンに迅速に再結合する。これらの特徴によって、薬剤の迅速な（例えば、腎臓を介する）排除が抑制される一方で、薬剤標的への効率的な送達および到達がもたらされる。
血清アルブミンに結合する抗原結合断片（例えば、ｄＡｂ）は、通常、約１ｎＭ〜約５００μＭのＫＤで結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、血清アルブミンに、表面プラズモン共鳴法で（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ製の装置を使用して）測定した場合、約１０〜約１００ｎＭ、または約１００ｎＭ〜約５００ｎＭ、または約５００ｎＭ〜約５ｍＭのＫＤ（ＫＤ＝Ｋｏｆｆ（ｋｄ）／Ｋｏｎ（ｋａ）で結合する。特定の実施形態では、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体または薬剤融合体は、約５０ｎＭ、または約７０ｎＭ、または約１００ｎＭ、または約１５０ｎＭ、または約２００ｎＭのＫＤで、血清アルブミン（例えば、ヒトの血清アルブミン）に結合する抗体の抗原結合断片（例えば、ｄＡｂ）を含む。本明細書に記載する、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体および薬剤融合体の改善された薬物動態学的特長（例えば、延長されたｔ1/2β、増加したＡＵＣ）は、血清アルブミンに結合する抗原結合断片の親和性に相関させることができる。したがって、改善された薬物動態学的特長を有する薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体および薬剤融合体を、通常、高い親和性（例えば、約５００ｎＭ以下、または約２５０ｎＭ以下、または約１００ｎＭ以下、または約５０ｎＭ以下、または約１０ｎＭ以下、または約１ｎＭ以下、または約１００ｐＭ以下のＫＤ）で、血清アルブミン（例えば、ヒトの血清アルブミン）に結合する抗原結合断片を使用して調製できる。
好ましくは、血清アルブミンに結合する抗原結合断片と複合体または融合体を形成する薬剤は、表面プラズモン共鳴法で（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ製の装置を使用して）測定した場合、抗原結合断片の血清アルブミンに対する親和性より強い親和性（ＫＤ）、および／または抗原結合断片の血清アルブミンに対するＫｏｆｆより速いＫｏｆｆ（ｋｄ）で、その標的（薬剤標的）に結合する。例えば、薬剤は、ＳＡに結合する抗原結合断片のＳＡに対する親和性より、約１〜約１０００００、または約１００〜約１０００００、または約１０００〜約１０００００、または約１００００〜約１０００００倍強い親和性で、その標的に結合できる。例えば、ＳＡに結合する抗体の抗原結合断片は、約１０μＭの親和性で結合でき、薬剤は、約１００ｐＭの親和性で、その標的に結合する。
特定の実施形態では、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片は、ヒトの血清アルブミンに結合するｄＡｂである。例えば、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するＶκｄＡｂ、または配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するＶＨｄＡｂ。その他の実施形態では、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片は、ヒトの血清アルブミンに結合し、かつ上記のアミノ酸配列のいずれかのＣＤＲを含むｄＡｂである。その他の実施形態では、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片は、ヒトの血清アルブミンに結合し、かつ配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３に対して、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｄＡｂである。アミノ酸配列同一性は、好ましくは、ＢＬＡＳＴ Ｐ等の適切なアラインメントアルゴリズムおよびデフォルトパラメーターを使用して決定する（KarlinおよびAltschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6): 2264-2268 (1990)）。
薬剤
本発明の特定の薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、個体に投与して、例えば、個体中の生物学的標的分子に結合する、および／またはその機能を変化させることによって、治療または診断に有益な効果をもたらすことができる、任意の薬剤（例えば、有機小分子、核酸、ポリペプチド）を含むことができる。本発明のその他の薬剤組成物（例えば、薬剤融合体）は、ポリペプチドまたはポリペプチド薬剤を含むことができる。薬剤融合体の好ましい実施形態では、薬剤は、抗体の鎖および抗体の鎖の断片（例えば、ＶＨ、Ｖκ、Ｖλ）を含まない。特定の実施例では、薬剤は、インスリン分泌促進性の薬剤、インクレチン、グルカゴン様１ペプチド、ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−１類似体、ＧＬＰ−１誘導体、ＰＹＹ、ＰＹＹペプチド、ＰＹＹ類似体、ＰＹＹ誘導体、エキセンディン−３、エキセンディン−３ペプチド、エキセンディン−３類似体、エキセンディン−３誘導体、エキセンディン−４、エキセンディン−４ペプチド、エキセンディン−４類似体、エキセンディン−４誘導体、またはこれらの２種以上の組合せ（例えば、ＧＬＰ−１ペプチドとＰＹＹペプチド）から選択される。
本発明において使用するのに適した薬剤として、例えば、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリンＡ、ラパマイシン、ＦＫ５０６、プレドニゾン）、抗ウイルス剤（アシクロビル、ガンシクロビル、インジナビル）、抗生物質（ペニシリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン）、抗炎症剤（アスピリン、イブプロフェン、プレドニゾン）、細胞毒または細胞傷害性薬剤（例えば、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシンＣ、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−ジヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、および上記の薬剤の任意の類似体または同族体があげられる。適切な薬剤として、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロルラムブシル（ｔｈｉｏｅｐａｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ＣＣ−１０６５、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（II）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、放射性核種（例えば、ヨウ素−１２５、−１２６）、イットリウム（例えば、イットリウム−９０、−９１）、およびプラセオジム（例えば、プラセオジム−１４４、−１４５）、ならびにプロテアーゼ阻害剤（例えば、マトリックスメタロプロテアーゼの阻害剤）もあげられる。その他の適切な薬剤は、アンチセンス核酸およびＲＮＡｉ等の核酸である。カリチアマイシンも、本発明において使用するのに適している。
適切な薬剤として、麻薬（例えば、コデイン、ナルメフェン、ナロキソン、フェンタニル、メペリジン、モルヒネ、トラマドール、プロポキシフェン、オキシコドン、メサドン、ナルブフィン）をはじめとする鎮痛剤、非ステロイド性抗炎症剤（例えば、インドメタシン、ケトロラック、アルスロテック、イブプロフェン、ナプロキセン、サリチル酸、セレコキシブ、ロフェコキシブ）、アセトアミノフェン、カプサイシン、ジコノチド等もあげられる。
特定の実施形態では、薬剤は、ポリペプチド毒素、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌菌体外毒素またはジフテリア毒素等の毒素がある。その他のポリペプチド薬剤として、抗体または抗体の抗原結合断片（例えば、ｄＡｂ）、ポリペプチドからなるアゴニスト、活性化因子、分泌促進物質、アンタゴニストまたは阻害剤があげられる。例えば、ポリペプチドまたはペプチド薬剤は、ＣＤ抗原、サイトカイン受容体（例えば、インターロイキン受容体、ケモカイン受容体）、接着分子または共刺激分子等の細胞表面タンパク質に結合して、作用または拮抗しうる。例えば、ポリペプチド薬剤は、サイトカイン、増殖因子、サイトカイン受容体、増殖因子受容体およびその他の標的リガンドに結合でき、これらとして、アポＥ、Ａｐｏ−ＳＡＡ、ＢＤＮＦ、カルジオトロフィン−１、ＣＥＡ、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ５６、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＥＮＡ−７８、エオタキシン、エオタキシン−２、エキソダス−２、ＦＡＰα、酸性ＦＧＦ、アルカリ性ＦＧＦ、線維芽細胞増殖因子−１０、ＦＬＴ３リガンド、フラクタルカイン（ＣＸ３Ｃ）、ＧＤＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＦ−β１、ヒト血清アルブミン、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−II、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（７２個のアミノ酸）、ＩＬ−８（７７個のアミノ酸）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８（ＩＧＩＦ）、インヒビンα、インヒビンβ、ＩＰ−１０、ケラチノサイト増殖因子−２（ＫＧＦ−２）、ＫＧＦ、レプチン、ＬＩＦ、リンホタクチン、ミューラー阻害因子、単核球コロニー抑制因子、単核球誘引タンパク質、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ（６７個のアミノ酸）、ＭＤＣ（６９個のアミノ酸）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ（６７個のアミノ酸）、ＭＤＣ（６９個のアミノ酸）、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＩＰ−４、骨髄系前駆細胞抑制因子−１（ＭＰＩＦ−１）、ＮＡＰ−２、ニューチュリン、神経発育因子、β−ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、オンコスタチンＭ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ１α、ＳＤＦ１β、ＳＣＦ、ＳＣＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＡＲＣ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ受容体Ｉ、ＴＮＦ受容体II、ＴＮＩＬ−１、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ Ａ、ＶＥＧＦ Ｂ、ＶＥＧＦ Ｃ、ＶＥＧＦ Ｄ、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２、ＶＥＧＦ受容体３、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、ＨＣＣ１、1−３０９、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４があげられるが、これらに限定されるわけではない。このリストは、完全なものではないことを理解されたい。
適切な薬剤として、下垂体ホルモン（ＰＴＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、レニン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、アルドステロン等をはじめとするホルモンもあげられる。適切な薬剤として、ケラチノサイト増殖因子、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、プロテアーゼ、エラスターゼ、ＬＨＲＨの類似体、アゴニストおよびアンタゴニスト、κオピオイド受容体アゴニスト（例えば、ダイノルフィンＡ）等のオピオイド受容体アゴニスト、カルシトニンおよびカルシトニン類似体、抗利尿ホルモン（バソプレッシン）、オキシトシンアンタゴニスト、血管作用性小腸ペプチド、トロンビン抑制剤、フォンウィルブランド因子、界面活性剤、ならびに巻貝の毒液（ジコノチド）もあげられる。
適切な薬剤として、抗癌活性（例えば、増殖抑制、成長抑制、アポトーシスの誘導、転移抑制、接着抑制、血管新生抑制）を有するペプチドおよびポリペプチドもあげられる。いくつかのそのようなペプチドおよびポリペプチドが、当技術分野で知られている（例えば、Janin Y. L.、Amino Acids, 25: 1-40 (2003)を参照。この参照文献の教示全体、特に、そこで開示されているペプチドおよびポリペプチドは、参照によって本明細書に組み込むものとする）。いくつかのそのようなペプチドのアミノ酸配列を、表８に示す。
その他の適切な薬剤として、抗ウイルス活性を有するペプチドおよびポリペプチドがあげられる。いくつかのそのようなペプチドおよびポリペプチドが、当技術分野で知られており、例えば、Giannecchiniら、J Viro., 77(6): 3724-33 (2003)；Wang, J.ら、Clin Chem (2003)；Hilleman, M. R.、Vaccine, 21(32): 4626-49 (2003)；Tziveleka, L. A.ら、Curr Top Med Chem, 3(13): 1512-35 (2003)；Poritz, M. A.ら、Virology, 313(1): 170-83 (2003)；Oevermann A.ら、Antiviral Res, 59(1): 23-33 (2003)； Cole, A. M.ら、Curr Pharm Des, 9(18): 1463-73 (2003)；Pinon, J. D.ら、Virol, 77(5): 3281-90 (2003)；Sia, S. K.ら、Proc Natl Acad Sci USA, 99(23): 14664-9 (2003)；Bahbouhi, B.ら、Biochem J, 66(Pt 3): 863-72 (2002)；de Soultrait, V. R.ら、J Mol Biol, 18(1): 45-58 (2002)；Witherell, G.、Curr Opin Investig Drugs, 2(3): 340-7 (2001)；Ruff, M. R.ら、Antiviral Res, 52(1): 63-75 (2001)；Bultmann, H.ら、J. Virol, 75(6): 2634-45 (2001)；Egal, M.ら、Int J Antimicrob AGents,13(1): 57-60 (1999)；およびRobinson, W. E., Jr.、J Leukoc Biol, 63(1): 94-100 (1998)に開示されているペプチドおよびポリペプチドがある。これらの参照文献の教示全体、特に、そこで開示されているペプチドおよびポリペプチドは、参照によって本明細書に組み込むものとする。これらのペプチドおよびポリペプチドは、本発明の組成物、薬剤融合体、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体において使用できる薬剤の例である。
ポリペプチド薬剤は、サイトカイン、または増殖因子、または受容体（例えば、サイトカイン受容体、増殖因子受容体、ホルモン受容体）の可溶性部分、あるいは上記のポリペプチド等のその他のポリペプチドであってもよい。例えば、適切なポリペプチド薬剤として、インターロイキン１受容体アンタゴニスト（Eisenbergら、Nature 343: 341-346 (1990)）、トロンボポエチン受容体アゴニスト（例えば、GW395058（de Serresら、Stem Cells 17: 316-326 (1999)））、メラノコルチン受容体アンタゴニスト（例えば、ＭＣＲ−４アンタゴニスト（Cepoiら、Brain Res. 1000: 64-71 (2004)））、アンジネックス、６ＤＢＦ７（Mayoら、J. Biol. Chem. 278: 45746-45752 (2003)）、ケモカイン様物質（例えば、ＲＡＮＴＥＳ様物質（Nardeseら、Nat. Struct. Biol. 8: 611-615 (2001)））、成長ホルモン（例えば、ヒトの成長ホルモン）、成長ホルモン類似体および成長ホルモン分泌促進物質（例えば、ＣＰ−４２４，３９１（MacAndrewら、Eur. J. Pharmacol. 432: 195-202 (2001)））、成長ホルモン放出ホルモン様物質（例えば、ＭＫ−６７７（Chapmanら、J. Clin. Endocrinol. Metab. 82: 3455-3463 (1997)））、細胞接着分子相互作用抑制剤（例えば、ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１、ＶＬＡ−１／ＶＣＡＭ−１（Yusuf-Makagiansarら、Med. Res. Rev. 22: 146-167 (2002)））、インターフェロン様物質（例えば、ＳＹＲ６（Satoら、Biochem. J. 371(Pt. 2): 603-608 (2003)））、ハーセプチン様物質（Nature Biotechnol. 18: 137 (2000)）、抗原提示抑制剤（Bolinら、J. Med. Chem. 43: 2135-2148 (2000)）、ＧＰIIＢ／IIIＡアンタゴニスト（例えば、ＦＫ６３３（Aokiら、Thromb. Res. 81: 439-450 (1996)））、ａｌｐｈａｖｂｅｔａ３アンタゴニスト（例えば、ＳＣ５６６３１（Englemanら、J. Clin. Invest. 99: 2284-2292 (1997)））、エリスロポエチン様物質（例えば、ＥＭＰ１（Johnsonら、Biochemstry 37: 3699-3710 (1998)））、オピオイド受容体アンタゴニスト（例えば、［（２Ｓ，３Ｒ）−ＴＭＴ１］ＤＰＤＰＥ（Liaoら、J. Med. Chem. 41: 4767-4776 (1998)））、造血因子（例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））等、受容体（例えば、増殖因子受容体、サイトカイン受容体、ホルモン受容体）のアゴニストおよびアンタゴニストもあげられる。
さらに、適切なペプチドまたはポリペプチド薬剤として、ヒトの１型ＩＬ−１受容体（例えば、ＡＦ１１３７７（ＦＥＷＴＰＧＹＷＱＰＹＡＬＰＬ、配列番号５６）、ＡＦ１１８６９（ＦＥＷＴＰＧＹＷＱＪＹＡＬＰＬ、配列番号５７（Ｊ＝１−アゼチジン−２−カルボン酸）、ＦＥＷＴＰＧＹＷＱＪＹ（配列番号５８）、ＦＥＷＴＰＧＷＹＱＪＹ（配列番号５９）、ＦＥＷＴＰＧＷＹＱＪＹＡＬＰＬ（配列番号６０））に結合するペプチドアンタゴニスト、あるいは場合によってはアセチル化されたアミノ末端および／またはアミノ化されたカルボキシル末端を含有する上記の配列のいずれか（Akesonら、J. Biol. Chem. 271: 30517-305123 (1996)）、ＴＮＦ−α仲介細胞障害性のペプチドアンタゴニスト（例えば、Chirinos-Rojasら、J. Immunol. 161: 5621-5626 (1998)に開示されているもの）、エリスロポエチン受容体のペプチドアゴニスト（例えば、McConnelら、Biol. Chem. 379: 1279-1286 (1998)またはWrightonら、Science 273: 458-464 (1996) に開示されているもの）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）アミドおよびそれらの類似体（例えば、Ritzel U.ら、J. Endocrinology 159: 93-102 (1998)を参照））、ならびにインターフェロン（例えば、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ）もあげられる。さらに、適切なペプチドまたはポリペプチド薬剤として、インテグリン阻害剤（例えば、Ｈ−Ｇｌｕ［シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）］２（Janssen, M. L. ら、Cancer Research 62: 6146-6151 (2002)）、シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）（Kantlehner M.ら、Agnew. Chem. Int. Ed. 38: 560 (1999)）、シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ）（Haubner, R.ら、J. Nucl. Med. 42: 326-336 (2001)）等のＲＧＤペプチド）、サポリン（例えば、配列番号６７）等のリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）、細胞外基質分解酵素阻害剤（例えば、米国特許第5,616,605号）、ならびにＨＩＶ融合阻害剤（例えば、Ｔ−１２４９およびＴ−２０（フューゼオン（ＦＵＺＥＯＮ（登録商標））（エンフビルチド）；Ｔｒｉｍｅｒｉｓ Ｉｎｃ．製）等の抗ウイルスペプチドおよびポリペプチド、ならびにイムノアドヘシン（例えば、ＬＦＡ３−Ｉｇ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）等の可溶性の受容体アンタゴニストもあげられる。
抗菌性のポリペプチドおよびペプチド薬剤も、本発明において使用するのに適している。適切な抗菌性のポリペプチドおよびペプチド薬剤の例として、アデノレグリン（ａｄｅｎｏｒｅｇｕｌｉｎ）、ダームシジン−１Ｌ、カテリシジン（例えば、カテリシジン様ペプチド、ヒトＬＬ−３７／ｈＣＡＰ−１８）、α−デフェンシン（例えば、ヒト好中球ペプチド１（ＨＮＰ−１）、ＨＮＰ−２、ＨＮＰ−３、ＨＮＰ−４、ヒトデフェンシン５、ヒトデフェンシン６）、β−デフェンシン（例えば、ヒトβ−デフェンシン−１、ヒトβ−デフェンシン−２）、およびθ−デフェンシン（例えば、θ−デフェンシン−１）をはじめとするデフェンシン、ヒスタミン（例えば、ヒスタミン１、ヒスタミン３、ヒスタミン５）、ラクトフェリシン由来ペプチドおよび関連のペプチド（Tomita M.ら、Acta Paediatr. Jpn. 36: 585-591 (1994)およびStrom, M. B. ら、Biochem Cell Biol. 80: 65-74 (2002)を参照）があげられる。
本発明の好ましい実施形態では、薬剤は、インスリン分泌促進性の薬剤である。適切なインスリン分泌促進性の薬剤の例として、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体の誘導体があげられる。さらに、適切なインスリン分泌促進性の薬剤として、エキセンディン−４、エキセンディン−４類似体およびエキセンディン−４誘導体、ならびにエキセンディン−３、エキセンディン−３誘導体、エキセンディン−３類似体もあげられる。
その他の適切な薬剤として、ペプチドＹＹ（３−３６）または類似体があげられる。ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）は、元来ブタの腸から単離され、胃腸管および膵臓の内分泌細胞に局在する３６残基のペプチドアミドである（Tatemotoら、Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 2514, 1982）。ペプチドＹＹは、Ｎ末端およびＣ末端にチロシン残基を有し、したがって、これらの２個のチロシンからＰＹＹという名前がつけられた（ペプチドの命名法では、Ｙは、アミノ酸チロシンを指す）。さらに、ＰＹＹは、いくつかの中枢および末梢における調節機能を、相同ペプチドである神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）と共有し、この神経ペプチドＹは、元来ブタの脳から単離された（Tatemoto、Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 5485, 1982）。ＰＹＹが細胞に局在するのとは対照的に、ＮＰＹは、粘膜下および筋層間の神経に存在し、それらの神経は、それぞれ粘膜および平滑筋の層を神経支配している（Ekbladら、Neuroscience 20: 169, 1987）。ＰＹＹおよびＮＰＹは、いずれも腸の運動および血流を抑制すると考えられており（Laburthe、Trends Endocrinol. Metab. 1: 168, 1990）、ラットの腸において、基礎分泌（Coxら、Br. J. Pharmacol. 101: 247, 1990）および分泌促進物質誘導性の分泌（Lundbergら、Proc. Natl. Acad. Sci USA 79: 4471, 1982）を減弱させると共に、正味の吸収を刺激する（MacFadyenら、Neuropeptides 7; 219, 1986）とも考えられている。総合すると、これらの観察から、ＰＹＹおよびＮＰＹは、食事の後に循環に放出され（Adrianら、Gastroenterology 89: 1070, 1985；Balasubramaniamら、Neuropeptides 14: 209, 1989）、したがって、腸の分泌および吸収の調節における生理的な機能を果たしていることが示唆される。
ＮＰＹに対してよりもＰＹＹに対して若干高い親和性を示す高親和性のＰＹＹ受容体の系が、ラットの腸管上皮において特徴付けられており（Laburtheら、Endocrinology 118: 1910, 1986）、この系は、アデニル酸環化酵素と負に共役することが示されている（Servinら、Endocrinology 124: 692, 1989）。いくつかの部分的な配列を使用した構造活性の研究から、ＰＹＹ（２２−３６）は、腸のＰＹＹ受容体と相互作用する活性部位と同定されている（Balasubramaniamら、Pept. Res. 1:32, 1988）。
さらに、ＰＹＹには、栄養分の取込み（Bilcheikら、Digestive Disease Week 506: 623, 1993）、細胞増殖（Laburthe、Trends Endcrinol. Metab. 1: 168, 1990；Voisinら、J. Biol. Chem, 1993）、脂肪分解（Valetら、J. Clin. Invest. 291, 1990）、および血管収縮（Lundbergら、Proc. Natl. Acad. Sci USA 79: 4471, 1982）をはじめとして、多くの生理的な活性があるとも考えられている。
WO03/057235およびWO03/026591は、ＰＹＹまたはアゴニストおよびＧＬＰ−１を投与することによって、カロリー摂取量、食物の摂取量および食欲を減少させる方法を開示している。これらの公報の全体が、特に、本発明において使用できるＰＹＹおよびＧＬＰ−１の薬剤ならびに方法の例を提供するために、参照によって本明細書に組み込むものとする。
さらにその他の本発明において使用するのに適した薬剤として、インスリン、レジスチン、レプチン、ＭＣ３Ｒ／ＭＣ４Ｒアンタゴニスト、ＡｇＲＰアンタゴニスト、アポリポタンパク質Ａ−IV、エンテロスタチン、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、ＩＧＦ１、ＢＭＰ−９、ＩＬ−２２、ＲｅｇIV、インターフェロンα、ＩＮＧＡＰペプチド、ソマトスタチン、アミリン、ニュールリン（ｎｅｕｒｕｌｉｎ）、インターフェロンβ、インターフェロンハイブリッド、アディポネクチン、内在性カンナビノイド、Ｃペプチド、ＷＮＴ１０ｂ、オレキシン−Ａ、副腎皮質刺激ホルモン、エンテロスタチン、コレシストキニン、オキシントモジュリン、メラニン細胞刺激ホルモン、メラノコルチン、メラニン凝集ホルモン、ＢＢ−２、ＮＰＹ Ｙ２アゴニスト、ＮＰＹ Ｙ５／Ｙ１アンタゴニスト、ＯＸＭ、Ｇａｌ−１Ｒアンタゴニスト、ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニスト、ＭＣ−３／４アゴニスト、ＢＲＳ−３アゴニスト、膵臓ポリペプチド、抗グレリン抗体断片、脳由来の向神経因子、ヒト成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、卵胞刺激ホルモン、胃酸分泌抑制ペプチド、またはそれらの類似体があげられる。
薬剤融合体
本発明の薬剤融合体は、連続したポリペプチド鎖を含む融合タンパク質であり、前記鎖は、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片を第１の部分として含み、これはポリペプチド薬剤である第２の部分に連結している。第１および第２の部分は、ペプチド結合を介して互いに直接的に結合している、あるいは適切なアミノ酸またはペプチドもしくはポリペプチドのリンカーを介して連結することができる。追加の（例えば、第３の、第４の）部分および／またはリンカー配列が、適切であれば、存在してもよい。第１の部分は、Ｎ末端の位置、Ｃ末端の位置、または第２の部分（すなわち、ポリペプチド薬剤）に関する内部に存在しうる。特定の実施形態では、各部分が、２個以上の複製物で存在しうる。例えば、薬剤融合体は、第１の部分を２個以上含むことができ、そのそれぞれが血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片を含む（例えば、ヒトの血清アルブミンに結合するＶＨとヒトの血清アルブミンに結合するＶＬ、または２個以上のヒトの血清アルブミンに結合するＶＨまたはＶＬ）。
いくつかの実施形態では、薬剤融合体は、式：
ａ−（Ｘ）ｎ１−ｂ−（Ｙ）ｎ２−ｃ−（Ｚ）ｎ３−ｄまたはａ−（Ｚ）ｎ３−ｂ−（Ｙ）ｎ２−ｃ−（Ｘ）ｎ１−ｄ
（式中、
Ｘは、第１の標的に対して結合特異性を有するポリペプチド薬剤であり；
Ｙは、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の単一の鎖である抗原結合断片
であり；
Ｚは、第２の標的に対して結合特異性を有するポリペプチド薬剤であり；
ａ、ｂ、ｃおよびｄは、それぞれ独立に、存在しないか、または１〜約１００個のアミノ酸残基であり；
ｎ１は、１から約１０であり；
ｎ２は、１から約１０であり；かつ
ｎ３は、０から約１０であるが、
ｎ１およびｎ２が共に１であり、かつｎ３が０である場合には、Ｘは、抗体鎖または抗体鎖の断片を含まない）
を有する連続したポリペプチド鎖である。
ある実施形態では、ＸもＺも、抗体鎖または抗体鎖の断片を含まない。ある実施形態では、ｎ１は、１であり、ｎ３が、１であり、ｎ２が、２、３、４、５、６、７、８または９である。好ましくは、Ｙが、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）である。より好ましくは、Ｙが、ヒトの血清アルブミンに結合するｄＡｂ（例えば、ＶＨ、Ｖκ、Ｖλ）である。特定の実施形態では、ＸまたはＺが、ヒトのＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１誘導体またはそれらの類似体である。
特定の実施形態では、Ｙは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。その他の実施形態では、Ｙは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。
その他の実施形態では、薬剤融合体は、部分Ｘ’およびＹ’を含み、ただし、Ｘ’が、抗体鎖または抗体鎖の断片を含まない場合には、Ｘ’は、ポリペプチド薬剤であり；Ｙ’は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の単一の鎖である抗原結合断片である。好ましくは、Ｙ’が、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）である。より好ましくは、Ｙ’が、ヒトの血清アルブミンに結合するｄＡｂ（例えば、ＶＨ、Ｖκ、Ｖλ）である。Ｘ’は、Ｙ’のアミノ末端側に位置でき、またはＹ’は、Ｘ’のアミノ末端側に位置しうる。いくつかの実施形態では、Ｘ’とＹ’との間には、アミノ酸、または２〜約１００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはポリペプチドのリンカーが存在する。特定の実施形態では、Ｘ’が、ヒトのＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１誘導体またはそれらの類似体である。
特定の実施形態では、Ｙ’が、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。その他の実施形態では、Ｙ’は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、薬剤融合体は、血清アルブミンおよびヒトのＩＬ−１ｒａ（例えば、配列番号２８）に結合するｄＡｂを含む。好ましくは、ｄＡｂは、ヒトの血清アルブミンに結合し、ヒトのフレームワーク領域を含む。
その他の実施形態では、薬剤融合体または薬剤複合体は、ヒトＩＬ−１ｒａの成熟１５２アミノ酸体に対して、少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有し、かつヒトのインターロイキン−１の１型受容体に拮抗する、ヒトＩＬ−１ｒａの機能性変異体を含む（Eisenbergら、Nature 343: 341-346 (1990)を参照）。変異体は、１個または複数の追加のアミノ酸を含む（例えば、１５３個または１５４個またはそれ以上のアミノ酸を含む）ことができる。本発明の薬剤融合体を、任意の適切な方法を使用して生成できる。例えば、いくつかの実施形態は、薬剤融合体をコードする核酸を、適切な発現ベクター内に挿入することによって生成できる。次いで、得られた構築物を発現に適した宿主細胞内に導入する。発現したら、融合タンパク質を、細胞溶解液から、好ましくは、培養液またはぺリプラズムから、任意の適切な方法を使用して単離または精製しうる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M.ら編、Vol. 2, Suppl. 26, pp. 16.4.1-16.7.8 (1991))を参照）。
別の実施形態では、薬剤融合体または薬剤複合体は、インスリン分泌促進性の薬剤を含む。好ましい実施形態では、薬剤融合体または薬剤複合体は、ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１の類似体もしくはペプチドを含む。より好ましい実施形態では、薬剤融合体または薬剤複合体は、Ｓｅｒ８ＧＬＰ−１（７−３６）アミドを含む。
別の実施形態では、薬剤融合体または薬剤複合体は、以下の置換基の１つまたは複数を有するＧＬＰ−１類似体を含む：Ｖａｌ８またはＰｒｏ９。
好ましくは、ＧＬＰ−１類似体は、Ｐｒｏ９ＧＬＰ−１（７−３６）またはＰｒｏ９ＧＬＰ−１（７−３７）である。さらに、ＧＬＰ−１の類似体またはペプチドは、以下のＣ末端の延長部のいずれか１つを含むことができる：ＰＳＳ、ＰＳＳＧＡＰまたはＰＳＳＧＡＰＰＰＳ。
ある実施形態では、薬剤融合体または薬剤複合体は、式Ｉ：
Ｈｉｓ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｇｌｙ１０−Ｘａａ１１−Ｐｈｅ１２−Ｔｈｒ１３−Ｘａａ１４−Ａｓｐ１５−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｘａａ２１−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ｘａａ２４−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ２８−Ｉｌｅ２９−Ｘａａ３０−Ｘａａ３１−Ｘａａ３２−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｘａａ３８−Ｘａａ３９−Ｘａａ４０−Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５
式Ｉ−配列番号１７２
（ただし、
８位のＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
９位のＸａａは、ＧｌｕまたはＡｓｐであり；
１１位のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
１４位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
１６位のＸａａは、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＴｒｐまたはＬｙｓであり；
１７位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
１８位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＬｙｓであり；
１９位のＸａａは、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＬｙｓであり；
２０位のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＬｙｓであり；
２１位のＸａａは、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
２２位のＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
２３位のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
２４位のＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
２５位のＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
２６位のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＨｉｓであり；
２７位のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
３０位のＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
３１位のＸａａは、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
３２位のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり、
３３位のＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
３４位のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＨｉｓであり；
３５位のＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり；
３６位のＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＨｉｓであり；
３７位のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓである、あるいは欠失しており；
３８位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＨｉｓである、あるいは欠失しており；
３９位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＨｉｓである、あるいは欠失しており；
４０位のＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＬｙｓである、あるいは欠失しており；
４１位のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓである、あるいは欠失しており；
４２位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、ＧｌｕまたはＡｓｐである、あるいは欠失しており；
４３位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓである、あるいは欠失しており；
４４位のＸａａは、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓである、あるいは欠失しており；
および４５位のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＬｙｓである、あるいは欠失しているが；
３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４位のアミノ酸が欠失している場合には、そのアミノ酸の下流の各アミノ酸も欠失している）
の配列を含むＧＬＰ−１類似体を含む。
別の実施形態では、薬剤融合体または薬剤複合体は、式（II）：
Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｘａａ３８−Ｘａａ３９−Ｘａａ４０−Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５−Ｘａａ４６
式（II）−配列番号１７３
（ただし、
Ｘａａ７は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、脱アミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、（３−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎα−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニンまたは４−ピリジルアラニンであり；
Ｘａａ８は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロへキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロへプチル）カルボン酸または（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸であり；
Ｘａａ１６は、ＶａｌまたはＬｅｕであり；
Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、ＬｙｓまたはＡｒｇであり；
Ｘａａ１９は、ＴｙｒまたはＧｌｎであり；
Ｘａａ２０は、ＬｅｕまたはＭｅｔであり；
Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ、ＧｌｕまたはＡｉｂであり；
Ｘａａ２３は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＬｙｓまたはＡｒｇであり；
Ｘａａ２５は、ＡｌａまたはＶａｌであり；
Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、ＧｌｕまたはＡｒｇであり；
Ｘａａ２７は、ＧｌｕまたはＬｅｕであり；
Ｘａａ３０は、Ａｌａ、ＧｌｕまたはＡｒｇであり；
Ｘａａ３３は、ＶａｌまたはＬｙｓであり；
Ｘａａ３４は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＡｒｇであり；
Ｘａａ３５は、ＧｌｙまたはＡｉｂであり；
Ｘａａ３６は、Ａｒｇ、ＧｌｙまたはＬｙｓであり；
Ｘａａ３７は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、アミドであるか、または存在せず；
Ｘａａ３８は、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、アミドであるか、または存在せず；
Ｘａａ３９は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、アミドであるか、または存在せず；
Ｘａａ４０は、Ｇｌｙ、アミドであるか、または存在せず；
Ｘａａ４１は、Ａｌａ、アミドであるか、または存在せず；
Ｘａａ４２は、Ｐｒｏ、アミドであるか、または存在せず；
Ｘａａ４３は、Ｐｒｏ、アミドであるか、または存在せず；
Ｘａａ４４は、Ｐｒｏ、アミドであるか、または存在せず；
Ｘａａ４５は、Ｓｅｒ、アミドであるか、または存在せず；
Ｘａａ４６は、アミドであるか、または存在しないが；Ｘａａ３８、Ｘａａ３９、Ｘａａ４０、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４３、Ｘａａ４４、Ｘａａ４５またはＸａａ４６が存在しない場合には、下流の各アミノ酸残基も存在しない）
のアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１類似体を含む。
本発明の別の実施形態では、薬剤融合体または薬剤複合体は、式（III）：
Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ２６−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ｌｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｘａａ３８
式（III）−配列番号１７４
（ただし、
Ｘａａ７は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、脱アミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ’１−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニンまたは４−ピリジルアラニンであり；
Ｘａａ８は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロへキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロへプチル）カルボン酸または（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸であり；
Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、ＬｙｓまたはＡｒｇであり；
Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ、ＧｌｕまたはＡｉｂであり；
Ｘａａ２３は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＬｙｓまたはＡｒｇであり；
Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、ＧｌｕまたはＡｒｇであり；
Ｘａａ３０は、Ａｌａ、ＧｌｕまたはＡｒｇであり；
Ｘａａ３４は、Ｌｙｓ、ＧｌｕまたはＡｒｇであり；
Ｘａａ３５は、ＧｌｙまたはＡｉｂであり；
Ｘａａ３６は、ＡｒｇまたはＬｙｓであり；
Ｘａａ３７は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＧｌｕまたはＬｙｓであり；
Ｘａａ３８は、Ｌｙｓ、アミドであるか、または存在しない）
のアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１ペプチドを含む。
本発明のさらに別の実施形態では、ＧＬＰ−１ペプチドは、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３６）−アミド、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３８）、ＧＬＰ−１（７−３９）、ＧＬＰ−１（７−４０）、ＧＬＰ−１（７−４１）、またはそれらの類似体もしくはペプチドからなる群から選択される。
本発明の別の実施形態では、ＧＬＰ−１ペプチドは、ＧＬＰ−１（Ａ−Ｂ）（ただし、Ａは１〜７の整数であり、Ｂは３７〜４５の整数である）、またはそれらの類似体であり、このペプチドは、親水性のスペーサー介してＣ末端のアミノ酸残基に付加しているアルブミン結合残基を１個と、場合によっては、その他のアミノ酸残基の１個に付加している第２のアルブミン結合残基とを含む。
別の実施形態では、ＧＬＰ−１ペプチドは、ＧＬＰ−１（７−３７）と比較して、交換、付加または欠失している、１５個以下のアミノ酸残基、あるいはＧＬＰ−１（７−３７）と比較して、交換、付加または欠失している、１０個以下のアミノ酸残基を含む。
別の実施形態では、ＧＬＰ−１ペプチドは、ＧＬＰ−１（７−３７）と比較して、交換、付加または欠失している、６個以下（好ましくは、５、４、３、２または１個以下）のアミノ酸残基を含む。
別の実施形態では、ＧＬＰ−１ペプチドは、遺伝暗号によってコードされない４個以下（好ましくは、３、２または1個以下）のアミノ酸残基を含む。
別の実施形態では、ＧＬＰ−１ペプチドは、ＤＰＰIV保護ＧＬＰ−１ペプチドである。
別の実施形態では、インスリン分泌促進性の薬剤は、ＤＰＰIVに対して安定である。
別の実施形態では、ＧＬＰ−１ペプチドは、８位にα−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）残基を含む。
別の実施形態では、前記ＧＬＰ−１ペプチドの７位のアミノ酸残基は、Ｄ−ヒスチジン、脱アミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎα−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニンまたは４−ピリジルアラニンからなる群から選択される。
別の実施形態では、ＧＬＰ−１ペプチドは、Ａｒｇ３４ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）−ＯＨ、Ｌｙｓ３６Ａｒｇ２６，３４ＧＬＰ−１（７−３６）、Ａｉｂ８，２２，３５ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｉｂ８，３５ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｉｂ８，２２ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｉｂ８，２２，３５Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，３５Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，２２Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，２２，３５Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，３５Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，２２，３５Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，３５Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，２２Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，２２，３５Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，．３５Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，２２Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，２２，３５Ａｌａ３７Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，３５Ａｌａ３７Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，２２Ａｌａ３７Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，２２，３５Ｌｙｓ３７ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｉｂ８，３５Ｌｙｓ３７ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｉｂ８Ａｒｇ２６，３４Ｇｌｕ２２，２３，３０Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｉｂ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、ＧＬＰ−１（７−３７）アミド、ＧＬＰ−１（７−３７）アミド、Ａｉｂ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｉｂ８，３５Ｌｙｓ３７ＧＬＰ−１（７−３７）−ＯＨ、Ａｌａ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，２２，３５Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３６ＧＬＰ−１（７−３７）−ＯＨ、Ａｉｂ８，２２，３５Ｌｙｓ３７ＧＬＰ−１（７−３７）−ＮＨ２、Ａｉｂ８Ａｒｇ３４ＧＬＰ−１（７−３７）−ＯＨ、Ｇｌｙ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｒｇ３４ＧＬＰ−１（７−３７）−ＯＨ、Ｇｌｙ８Ｇｌｕ２２，２３，３０Ａｒｇ１８，２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、イミダゾリルプロピオン酸７Ａｓｐ１８Ａｉｂ２２，３５Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、イミダゾリルプロピオン酸７Ａｉｂ２２，３５Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、［３−（５−イミダゾイル）プロピオニル７Ａｉｂ８Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、およびＡｉｂ８，２２Ｌｙｓ３７ＧＬＰ−１（７−３８）からなる群から選択される。
別の実施形態では、ＧＬＰ−１ペプチドは、ネイティブなＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１類似体の２３、２６、３４、３６または３８位のアミノ酸残基を介して親水性のスペーサーに付加している。
別の実施形態では、インスリン分泌促進性の薬剤は、Ｌｙｓ２０エキセンディン−４（１−３９）−ＮＨ２である。
別の実施形態では、ＧＬＰ−１ペプチドは、ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＳＫＫＫＫＫＫ−アミド−配列番号１７５である。
別の実施形態では、ＧＬＰ−１ペプチドは、ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＸ−配列番号１７６（ただし、Ｘ＝ＰもしくはＹ、またはそれらの断片もしくは類似体）である。
本発明の別の実施形態では、ＧＬＰ−１ペプチドは、Ａｒｇ１８、Ｌｅｕ２０、Ｇｌｎ３４、Ｌｙｓ３３（Ｎε−（γ−アミノブチロイル（Ｎα−ヘキサデカノイル）））エキセンディン−４（７−４５）−アミド、またはＡｒｇ３３、Ｌｅｕ２０、Ｇｌｎ３４、Ｌｙｓ１８（Ｎε−（＆ガンマ；−アミノブチロイル（Ｎα−ヘキサデカノイル）））エキセンディン−４（７−４５）−アミドである。
本発明によるＧＬＰ−１類似体もしくは誘導体またはＧＬＰ−１様薬剤として有用でありうるインスリン分泌促進性の薬剤の例が、国際特許出願第WO87/06941号（The General Hospital Corporation）に記載されている。これは、ＧＬＰ−１（７−３７）を含むペプチド断片およびその機能性の誘導体、ならびにインスリン分泌促進性の薬剤としてのそれらの使用に関するものである（参照によって本明細書に、特に、本発明において使用する薬剤の例を示すものとして、組み込むものとする）。
さらに、ＧＬＰ−１類似体は、国際特許出願第WO90/11296号（The General Hospital Corporation）にも記載されている。これは、ＧＬＰ−１（７−３６）およびその機能性の誘導体を含み、ＧＬＰ−１（１−３６）またはＧＬＰ−１（１−３７）のインスリン分泌促進活性を上回るインスリン分泌促進活性を有するペプチド断片、ならびにインスリン分泌促進性の薬剤としてのその使用に関するものである（参照によって本明細書に、特に、本発明において使用する薬剤の例を示すものとして、組み込むものとする）。
国際特許出願第WO91/11457号（Buckleyら）は、活性のあるＧＬＰ−１ペプチド７−３４、７−３５、７−３６および７−３７類似体を開示している。これらも、本発明によるＧＬＰ−１薬剤として有用でありうる（参照によって本明細書に、特に、本発明において使用する薬剤の例を示すものとして、組み込むものとする）。
さらに、本発明に有用であるエキセンディン類似体が、ＰＣＴ特許公報WO99/25728（Beeleyら）、WO99/25727（Beeleyら）、WO98/05351（Youngら）、WO99/40788（Youngら）、WO99/07404（Beeleyら）、およびWO99/43708（Knudsenら）に記載されている（いずれも、参照によって本明細書に、特に、本発明において使用する薬剤の例を示すものとして、組み込むものとする）。
適切な発現ベクターは、いくつかの構成成分、例えば、複製開始点、選択標識遺伝子、転写調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）等の１個もしくは複数の発現調節領域、および／あるいは１個もしくは複数の翻訳シグナル、シグナル配列またはリーダー配列等を含有しうる。発現調節領域およびシグナル配列が存在する場合には、ベクターまたはその他のソースから供給できる。例えば、抗体の鎖をコードするクローン化された核酸の転写および／または翻訳調節配列を使用して、発現に導くことができる。
プロモーターを供給して、所望の宿主細胞で発現させることができる。プロモーターは、恒常的であってもよいし、または誘導性であってもよい。例えば、プロモーターは、操作して、抗体、抗体の鎖またはそれらの一部をコードする核酸に連結でき、それによって、核酸の転写を導く。種々の適切なプロモーターが入手可能であり、原核（例えば、大腸菌（E. coli）に用いるｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモーター）および真核（例えば、サルウイルス４０の初期または後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター）の宿主に用いる。
さらに、発現ベクターは、通常、ベクターを保有する宿主細胞を選択するための選択標識と、さらに複製可能なベクターの場合には、複製開始点とを含む。抗生物質または薬物への耐性をもたらす産物をコードする遺伝子が、一般的な選択標識となり、原核細胞（例えば、ラクタム分解酵素（アンピシリン耐性）、テトラサイクリン耐性をもたらすＴｅｔ遺伝子）および真核細胞（例えば、ネオマイシン（Ｇ４１８もしくはジェネテシン）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、アンピシリンまたはハイグロマイシン耐性遺伝子）に使用できる。ジヒドロ葉酸還元酵素標識遺伝子により、種々の宿主において、メトトレキサートによる選択が可能である。宿主の独立栄養性の標識の遺伝子産物をコードする遺伝子（例えば、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）が、しばしば酵母における選択標識として使用される。ウイルス（例えば、バキュロウイルス）またはファージベクター、およびレトロウイルスベクター等の宿主細胞内に組み込むことが可能なベクターも意図されている。哺乳類の細胞および原核細胞（大腸菌（E. coli））、昆虫の細胞（ショウジョウバエのシュナイダーＳ２細胞、Ｓｆ９）および酵母（ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae））における発現に適した発現ベクターが、当技術分野では周知である。
本明細書に記載するように、薬剤融合体を発現する組換え宿主細胞および薬剤融合体を調製する方法を提供する。組換え宿主細胞は、薬剤融合体をコードする組換え核酸を含む。薬剤融合体を、適切な宿主内で、タンパク質をコードする組換え核酸を発現させることによって、またはその他の適切な方法によって生成できる。例えば、本明細書に記載する発現構築物を、適切な宿主細胞内に導入でき、得られた細胞を、（例えば、培養液中、動物中で）構築物の発現に適した条件下で維持できる。適切な宿主細胞は、大腸菌（E. coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）およびその他の適切な細菌をはじめとする、原核細胞、真菌もしくは酵母の細胞（例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、アスペルギルス属、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、アカパンカビ（Neurospora crassa））等の真核細胞またはその他の下等真核細胞、ならびに昆虫（例えば、Ｓｆ９昆虫細胞（WO94/26087（O'Connor）））または哺乳類（例えば、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１６５０）およびＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１６５１）等のＣＯＳ細胞、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−９０９６）、２９３（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−２）、ＣＶ１（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−７０）、ＷＯＰ（Daileyら、J. Virol. 54: 739-749 (1985)）、３Ｔ３、２９３Ｔ（Pearら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 8392-8396 (1993)）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、ＨｕＴ７８細胞等）由来のもの等の高等真核生物でありうる(例えば、Ausubel, F. M.ら編、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc., (1993)を参照)。
本発明は、本発明の組換え宿主細胞を、薬剤融合体の発現に適した条件下で維持することを含む薬剤融合体を生成する方法も含む。さらに、本方法は、所望により、薬剤融合体を単離または回収することを含むこともできる。別の実施形態では、薬剤融合体（例えば、ヒトの血清アルブミンおよびＩＬ−１ｒａに結合するｄＡｂ）の構成成分が、化学的に組み立てられて、連続したポリペプチド鎖を形成している。
複合体
別の態様では、本発明は、薬剤に結合している、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片を含む複合体を提供する。そのような複合体には、「薬剤複合体」が含まれ、これは、薬剤が共有結合している、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片を含んでおり、さらに「非共有結合性の薬剤複合体」も含まれ、これは、薬剤が非共有結合している、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片を含んでいる。好ましくは、複合体は、十分に安定であり、したがって、ｉｎ ｖｉｖｏの条件下（例えば、ヒトに投与した場合）で、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片と薬剤とが、実質的に互いに結合している状態を維持する。好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏの条件下で、複合体の約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下が解離または分解して、薬剤と抗原結合断片とを放出する、あるいは複合体の解離または分解は、実質的に起こらない。例えば、「ｉｎ ｖｉｖｏ」の条件下での安定性を、薬剤複合体または非共有結合性の薬剤複合体を、血清（例えば、ヒトの血清）中で、３７℃にて、２４時間インキュベートすることによって、好都合に評価できる。そのような方法の一実施例では、等量の薬剤複合体と複合体を形成していない薬剤とを血清の２本の異なるバイアルに希釈する。各バイアルの内容物の半分を、直ちに−２０℃にて凍結し、残りの半分を３７℃にて、２４時間インキュベートする。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法および／またはウエスタンブロット法等の任意の適切な方法を使用して、４個の試料全部を分析できる。ウエスタンブロットを、薬剤に結合する抗体を使用して探索できる。薬剤複合体のレーンにある薬剤はいずれも、解離していなければ、薬剤複合体の大きさへ移動するであろう。多くのその他の適切な方法を使用して、例えば、上記のように調製した試料を、クロマトグラフィー（例えば、ゲルろ過、イオン交換および逆相）、ＥＬＩＳＡ法、質量分析等の適切な分析方法を使用して分析することによって、「ｉｎ ｖｉｖｏ」の条件下での安定性を評価できる。
薬剤複合体
別の態様では、本発明は、薬剤複合体が単一の連続したペプチド鎖ではない場合に、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片と、前記抗原結合断片に共有結合している薬剤とを含む薬剤複合体を提供する。
いくつかの実施形態では、薬剤複合体が単一の連続したペプチド鎖ではない場合に、薬剤複合体は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と、前記ＶＨまたはＶＬに共有結合している薬剤とを含む。好ましくは、薬剤複合体は、血清アルブミンに結合する単一のＶＨまたは血清アルブミンに結合する単一のＶＬを含む。特定の実施形態では、薬剤複合体は、ヒトの血清アルブミンに結合するＶｋｄＡｂを含み、かつ配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。その他の実施形態では、薬剤複合体は、ヒトの血清アルブミンに結合するＶＨｄＡｂを含み、かつ配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。
薬剤複合体は、任意の所望の薬剤を含むことができ、任意の適切な方法を使用して調製できる。例えば、薬剤は、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片に、直接的に、あるいはアミノ末端、カルボキシル末端またはアミノ酸の側鎖を介して等、１つまたは複数の位置で適切なリンカー部分を介して間接的に結合することができる。ある実施形態では、薬剤複合体は、ヒト血清アルブミンに結合するｄＡｂと、ポリペプチド薬剤（例えば、ヒトＩＬ−１ｒａまたはヒトＩＬ−１ｒａの機能性変異体）とを含み、ポリペプチド薬剤（例えば、ヒトＩＬ−１ｒａまたはヒトＩＬ−１ｒａの機能性変異体）のアミノ末端は、ｄＡｂのカルボキシル末端に直接的にまたは適切なリンカー部分を介して結合している。別の実施形態では、薬剤複合体は、ヒト血清アルブミンに結合するｄＡｂと、インスリン分泌促進性の薬剤（例えば、ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１類似体）とを含み、インスリン分泌促進性の薬剤のアミノ末端は、遊離であり（すなわち、複合体内で共役または結合しておらず）、カルボキシル末端は、ｄＡｂのアミノ末端に直接的にまたは適切なリンカー部分を介して結合している。その他の実施形態では、薬剤複合体は、ヒト血清アルブミンに結合するｄＡｂと、ｄＡｂに共有結合している２種以上の異なる薬剤を含む。例えば、第１の薬剤は、ｄＡｂのカルボキシル末端に（直接的または間接的に）共有結合することができ、第２の薬剤は、アミノ末端に、もしくは側鎖のアミノ基（例えば、リジンのεアミノ基）を介して、共有結合することができる。好ましい実施形態では、インスリン分泌促進性の薬剤（例えば、ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１類似体）のアミノ末端は、遊離である。そのような薬剤複合体を、選択的カップリング反応の周知の方法を使用して調製できる（例えば、Hermanson, G. T.、Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)を参照）。
種々の方法を使用して、薬剤と血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片とから複合体を形成させることができる。複合体を形成させようとする薬剤によって、選択する特定の方法が異なるであろう。所望により、末端官能基を含有するリンカーを使用して、抗原結合断片と薬剤とを連結させることができる。一般に、複合体形成は、反応性の官能基を含有する（または反応性の官能基を含有するように修飾した）薬剤を、リンカーと反応、または血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片と直接反応させることによって達成される。適切な条件下で、第２の化学基と反応しうる化学的な部分または官能基を含有する（または含有するように修飾した）薬剤を反応させることによって、共有結合が形成するので、このようにして、共有結合を形成させる。所望により、適切な反応性の化学基を、任意の適切な方法を使用して、抗原結合断片またはリンカーに付加できる（例えば、Hermanson, G. T.、Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)を参照）。多くの適切な反応性の化学基の組合せが、当技術分野では知られており、例えば、アミン基は、トシル化物、メシル酸、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルエステル（ＮＨＳ）等の求電子基と反応しうる。チオールは、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロイル、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロ安息香酸チオール（ＴＮＢ−チオール）等と反応しうる。アルデヒド官能基は、アミンまたはヒドラジド含有分子と共役でき、アジド基は、３価の亜リン酸基と反応して、ホスホルアミドまたはホスホルイミド結合を形成できる。活性な基を分子内に導入する適切な方法が、当技術分野では知られている（例えば、Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)を参照）。
いくつかの実施形態では、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片は、ジスルフィド結合を形成する２個のチオールの反応によって、薬剤に結合している。その他の実施形態では、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片は、イソチオ尿素結合を生成するイソチオシアネート基と第一級アミンとの反応によって、薬剤に結合している。
適切なリンカー部分は、直鎖であってもよいし、また分枝していてもよく、例えば、テトラエチレングリコール、Ｃ２〜Ｃ１２アルキレン、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−または−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−（ただし、ｐは１〜１２である）、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−、１〜約１００個（好ましくは、１〜約１２個）のアミノ酸を含むポリペプチド鎖等があげられる。
非共有結合性の薬剤複合体
一部の非共有結合（例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用）は、安定で、特異性の高い分子間結合を形成できる。例えば、相補的な結合相手間の複数の非共有結合によって達成される分子認識反応は、酵素の基質への結合、抗体の抗原認識、リガンドの受容体への結合等の多くの重要な生物学的相互作用、ならびにタンパク質およびペプチドの三次元構造の安定化の基礎をなす。したがって、そのような弱い非共有結合性の相互作用（例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、静電気的な相互作用、親水性相互作用等）を利用して、薬剤を血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片に結合させることができる。
好ましくは、抗原結合断片と薬剤とを連結する非共有結合は、抗原結合断片と薬剤とが、ｉｎ ｖｉｖｏの条件下（例えば、ヒトに投与した場合）で、実質的に互いに結合している状態を維持するのに、十分強力である。一般に、抗原結合断片と薬剤とを連結する非共有結合は、少なくとも約１０１０Ｍ-1の強度を有する。好ましい実施形態では、非共有結合の強度は、少なくとも約１０１１Ｍ-1、少なくとも約１０１２Ｍ-1、少なくとも約１０１３Ｍ-1、少なくとも約１０１４Ｍ-1、または少なくとも約１０１５Ｍ-1である。ビオチンとアビジンとの、ならびにビオチンとストレプトアビジンとの間の相互作用は、多くの条件下で、非常に効率的で、かつ安定であると知られており、本明細書に記載するように、ビオチンとアビジンとの、ならびにビオチンとストレプトアビジンとの間の非共有結合を使用して、本発明の非共有結合性の薬剤複合体を調製できる。
非共有結合を、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片と薬剤との間で、直接形成してもよく、または適切な相補的な結合相手（例えば、ビオチンとアビジンもしくはストレプトアビジン）との間で形成してもよく、その場合には、１つの結合相手は、薬剤に共有結合しており、相補的な結合相手は、抗原結合断片に共有結合している。相補的な結合相手を利用する場合、結合相手の１つは、直接的にまたは適切なリンカー部分を介して、薬剤に共有結合することができ、相補的な結合相手は、直接的にまたは適切なリンカー部分を介して、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片に共有結合することができる。
相補的な結合相手は、選択的に互いに結合する分子からなる対である。多くの相補的な結合相手、例えば、抗体（または抗体の抗原結合断片）と同族の抗原またはエピトープ、酵素と基質、および受容体とリガンドが、当技術分野で知られている。好ましい相補的な結合相手は、ビオチンとアビジン、ならびにビオチンとストレプトアビジンである。
血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片または薬剤への、相補的な結合相手からなる対の一方の直接的または間接的な共有結合は、上記したように、例えば、反応性の官能基を含有する（または反応性の官能基を含有するように修飾した）相補的な結合相手を、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片と、リンカーを使用して、またはリンカーを使用せずに結合させるによって達成できる。複合体を形成させようとする化合物（例えば、薬剤、相補的な結合相手、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片）によって、選択する特定の方法が異なるであろう。所望により、末端反応性官能基を含有するリンカー（例えば、ホモ二官能性リンカー、ヘテロ二官能性リンカー）を使用して、抗原結合断片および／または薬剤を、相補的な結合相手に連結させることができる。ある実施形態では、２個の異なる反応性の部分を含有するヘテロ二官能性リンカーを使用できる。ヘテロ二官能性リンカーを、反応性の部分の一方が、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片または薬剤と反応し、他方の反応性の部分が、相補的な結合相手と反応するように選択できる。任意の適切なリンカー（例えば、ヘテロ二官能性リンカー）を使用でき、多くのそのようなリンカーが、当技術分野では知られており、市販されており（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、イリノイ州）入手可能である。
組成物ならびに治療および診断方法
本発明の薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）を含む組成物を提供し、これには、（例えば、ヒトおよび／または動物に投与するための）薬学的または生理学的組成物が含まれる。薬学的または生理学的組成物は、１種または複数の薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）と、薬学的または生理学的に許容される担体とを含む。通常、これらの担体として、食塩水および／または緩衝溶媒をはじめとする、水溶液またはアルコール／水溶液、乳濁液または懸濁液があげられる。非経口溶媒として、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロース、ならびに塩化ナトリウムおよび乳酸添加リンゲル液があげられる。適切な生理学的に許容されるアジュバントを、懸濁液中にポリペプチドの複合物を維持するために必要であれば、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギン酸等の増粘剤から選ぶことができる。静脈内溶媒として、リンゲルのデキストロースを基剤としたもの等、体液および栄養分の補充物、ならびに電解質の補充物があげられる。抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガス等、保存剤およびその他の添加剤も存在しうる（Mark. (1982) Remington's Pharmaceutical Science, 16th Edition）。
本組成物は、所望の量の薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）を含むことができる。例えば、本組成物は、重量に関して、約５〜約９９％の薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体または薬剤融合体を含むことができる。特定の実施形態では、本組成物は、重量に関して、約１０〜約９９％、約２０〜約９９％、約３０〜約９９％、約４０〜約９９％、約５０〜約９９％、約６０〜約９９％、約７０〜約９９％、約８０〜約９９％、約９０〜約９９％、または約９５〜約９９％の薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）を含むことができる。一実施例では、本組成物は、凍結により乾燥（凍結乾燥）されている。
本明細書に記載する薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、通常、慢性閉塞性肺疾患（例えば、慢性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎、肺気腫）等の炎症の状態（例えば、急性および／または慢性の炎症性疾患）、アレルギー性過敏症、癌、細菌またはウイルス性の感染症、細菌性肺炎（例えば、ブドウ球菌性肺炎）等の肺炎、自己免疫疾患（これには、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、関節炎（例えば、変形性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、ループス関節炎、脊椎関節症（例えば、強直性脊椎炎））、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、ベーチェット病および重症筋無力症が含まれるが、それらに限定されない）、子宮内膜症、乾癬、（例えば、腹部の手術後の）腹部の癒着、喘息、ならびに敗血症ショックの予防、抑制または治療に使用されるであろう。本明細書に記載する薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、慢性または急性の外傷の痛み、慢性または急性の神経因性の痛み、急性または慢性の骨格筋の痛み、あるいは慢性または急性の癌の痛み等の疼痛の予防、抑制または治療に使用できる。本明細書に記載する薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、診断の目的で投与することもできる。
癌を、本明細書に記載する薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）を使用して、予防、抑制または治療でき、癌として、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫）、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌）、結腸直腸癌、頭頚部癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病）、腺癌、腎臓癌、造血性の癌（例えば、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患（例えば、真性多血症、本態性（原発性）血小板血症、持発性骨髄線維症））等があげられる。
本明細書に記載する薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、子宮内膜症、線維症、不妊症、早産、勃起不全、骨粗鬆症、糖尿病（例えば、II型糖尿病）、成長障害、ＨＩＶ感染症、呼吸促迫症候群、腫瘍および夜尿症の予防、抑制または治療における使用にも適している。
好ましい実施形態では、本発明は、高血糖、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病、肥満、高血圧、シンドロームＸ、脂質代謝異常、（β細胞アポトーシス、ｊ３−ｃｅ）ｉ欠損症、心筋梗塞、炎症性腸疾患、消化不良、認知障害、例えば、認知改善、神経保護、アテローム性動脈硬化、冠状心疾患およびその他の心血管障害を治療する目的で、医薬品を調製するための、本発明による化合物の使用に関する。これらの適応症のための特定の実施形態では、薬剤は、インスリン分泌促進性の薬剤、およびインクレチン、グルカゴン様1ペプチド、ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−１類似体、ＧＬＰ−１誘導体、ＰＹＹ、ＰＹＹペプチド、ＰＹＹ類似体、ＰＹＹ誘導体、エキセンディン−３、エキセンディン−３ペプチド、エキセンディン−３類似体、エキセンディン−３誘導体、エキセンディン−４、エキセンディン−４ペプチド、エキセンディン−４類似体、エキセンディン−４誘導体、またはこれらの２種以上の組合せ（例えば、ＧＬＰ−１ペプチドとＰＹＹペプチド）から選択される。
別の実施形態では、本発明は、小腸症候群、炎症性腸疾患またはクローン病を治療する目的で、医薬品を調製するための、本発明による化合物の使用に関する。これらの適応症のための特定の実施形態では、薬剤は、インスリン分泌促進性の薬剤、およびインクレチン、グルカゴン様1ペプチド、ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−１類似体、ＧＬＰ−１誘導体、ＰＹＹ、ＰＹＹペプチド、ＰＹＹ類似体、ＰＹＹ誘導体、エキセンディン−３、エキセンディン−３ペプチド、エキセンディン−３類似体、エキセンディン−３誘導体、エキセンディン−４、エキセンディン−４ペプチド、エキセンディン−４類似体、エキセンディン−４誘導体、またはこれらの２種以上の組合せ（例えば、ＧＬＰ−１ペプチドとＰＹＹペプチド）から選択される。
別の実施形態では、高血糖、１型糖尿病、２型糖尿病またはβ細胞欠損症を治療する目的で、医薬品を調製するための、本発明による化合物の使用に関する。これらの適応症のための特定の実施形態では、薬剤は、インスリン分泌促進性の薬剤、およびインクレチン、グルカゴン様1ペプチド、ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−１類似体、ＧＬＰ−１誘導体、ＰＹＹ、ＰＹＹペプチド、ＰＹＹ類似体、ＰＹＹ誘導体、エキセンディン−３、エキセンディン−３ペプチド、エキセンディン−３類似体、エキセンディン−３誘導体、エキセンディン−４、エキセンディン−４ペプチド、エキセンディン−４類似体、エキセンディン−４誘導体、またはこれらの２種以上の組合せ（例えば、ＧＬＰ−１ペプチドとＰＹＹペプチド）から選択される。
本発明による化合物を用いた治療は、薬剤の複合体または融合体の一部であってもよいしまたはそうでなくてもよい、第２またはそれ以外の薬学的に活性な物質と組み合わせることもできる。例えば、活性な物質は、抗糖尿病薬、抗肥満薬、食欲調節薬、抗高血圧薬、糖尿病が原因である、またはそれに関連する合併症を治療および／または予防するための薬剤、ならびに肥満が原因である、またはそれに関連する合併症および障害を治療および／または予防するための薬剤から選択される。本文脈では、「抗糖尿病薬」という表現は、インスリン抵抗性およびインスリン抵抗性が病態生理学的な機構である疾患の治療および／または予防のための化合物を含む。
これらの薬学的に活性な物質の例として、インスリン、ＧＬＰ−１アゴニスト、スルホニル尿素（例えば、トルブタミド、グリベンクラミド、グリピジドおよびグリクラジド）、ビグアナイド、例えば、メトホルミン、メグリチナイド、グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アクロボース）、グルカゴンアンタゴニスト、ＤＰＰ−IV（ジペプチジルペプチダーゼIV）阻害剤、糖新生および／またはグリコーゲン分解の刺激に関与する肝臓の酵素の阻害剤、グルコースの取込みの調節薬、トログリタゾンおよびシグリタゾン等のチアゾリジンジオン、ＨＭＧ ＣｏＡ阻害剤（スタチン）としての抗高脂血症薬等の脂質代謝を改善する化合物、食物摂取を低下させる化合物、ＲＸＲアゴニストおよびβ細胞のｐＡＴＰ依存性カリウムチャネルに作用する薬剤（例えば、グリベンクラミド、グリピジド、グリクラジドおよびレパグリニド）；コレスチラミン、コレスチポール、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、プロブコール、デキストロチロキシン、ナテグリニド、レパグリニド；アルプレノロール、アテノロール、チモロール、ピンドロール、プロプラノロールおよびメトプロロール等のβ遮断薬、ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、アラトリオプリル（ａｌａｔｒｉｏｐｒｉｌ）、キナプリルおよびラミプリル等のＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）阻害剤、ニフェジピン、フェロジピン、ニカルジピン、イスラジピン、ニモジピン、ジルチアゼムおよびベラパミル等のカルシウムチャネル遮断薬、ならびにドキサゾシン、ウラピジル、プラゾシンおよびテラゾシン等のａ遮断薬；ＣＡＲＴ（コカインおよびアンフェタミン制御転写物）アゴニスト、ＮＰＹ（神経ペプチドＹ）アンタゴニスト、ＭＣ４（メラノコルチン４）アゴニスト、オレキシンアンタゴニスト、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）アゴニスト、ＣＲＦ（副腎皮質刺激ホルモン放出因子）アゴニスト、ＣＲＦ ＢＰ（副腎皮質刺激ホルモン放出因子結合タンパク質）アンタゴニスト、ウロコルチンアゴニスト、β３アゴニスト、ＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホルモン）アゴニスト、ＭＣＨ（メラニン凝集ホルモン）アンタゴニスト、ＣＣＫ（コレシストキニン）、セロトニン再取り込み阻害剤、セロトニンおよびノルアドレナリン再取り込み阻害剤、混合セロトニンおよびノルアドレナリン作動性化合物、５ＨＴ（セロトニン）アゴニスト、ボンベシンアゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、成長ホルモン、成長ホルモン放出化合物、ＴＲＨ（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）アゴニスト、ＵＣＰ２または３（脱共役タンパク質２または３）調節薬、レプチンアゴニスト、ＤＡアゴニスト（ブロモクリプチン、ドプレキシン（ｄｏｐｒｅｘｉｎ））、リパーゼ／アミラーゼ阻害剤、ＲＸＲ（レチノイドＸ受容体）調節薬、ＴＲβアゴニスト；ヒスタミンＨ３アンタゴニストがあげられる。
さらに、インスリンは、以下の類似体の１つの形態でありうる：Ａｓｐ２８−ヒトインスリン、ＬｙｓＢ２８、ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＬｙｓＢ３ ＧｌｕＢ２９−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１、ＡｒｇＢ３１、ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンおよびｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン。
さらに、その他の活性な薬剤として、ヒト成長ホルモンまたはその類似体、副甲状腺ホルモンまたはその類似体、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）等の増殖因子、インスリン増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン増殖因子II（ＩＧＦ−II）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）またはアンジオポエチン等のソマトメジン、インターフェロン、プロウロキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤２、フォンウィルブランド因子、サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ）１、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２０またはＩＬ−２１等のインターロイキン、ＧＭ−ＣＳＦ等のコロニー刺激因子（ＣＦＳ）、幹細胞因子、ＴＮＦ−α、リンホトキシン−α、リンホトキシン−β、ＣＤ４０ＬまたはＣＤ３０Ｌ等の腫瘍壊死因子、プロテアーゼ阻害剤、例えば、アプロチニン、ヒト卵胞刺激ホルモンまたはその類似体、スーパーオキシドジスムターゼ、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ＲＮＡ分解酵素、カタラーゼ、ウリカーゼ、ビリルビン酸化酵素、トリプシン、パパイン、アルカリホスファターゼ、（３−グルクロニダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはバトロキソビン等の酵素、オピオイド、例えば、エンドルフィン、エンケファリンまたは非天然オピオイド、ホルモンまたは神経ペプチド、例えば、カルシトニン、グルカゴン、ガストリン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、コレシストキニン、黄体形成ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、バソプレッシン、オキシトシン、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、リラキシン、乳腺刺激ホルモン、ペプチドＹＹ、神経ペプチドＹ、膵臓ポリペプチド、レプチン、ＣＡＲＴ（コカインおよびアンフェタミン制御転写物）、ＣＡＲＴ関連ペプチド、ペリリピン、ＭＣ−４等のメラノコルチン（メラニン細胞刺激ホルモン）、メラニン凝集ホルモン、ナトリウム利尿ペプチド、アドレノメデュリン、エンドセリン、セクレチン、アミリン、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、脳下垂体アデニル酸環化酵素活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、ボンベシン、ボンベシン様ペプチド、チモシン、へパリン結合タンパク質、可溶性ＣＤ４、視床下部性放出因子、メラトニンおよびその類似体があげられる。
本明細書に記載する薬剤複合体または薬剤融合体を、診断の目的または造影剤として投与することもできる。
本出願では、「予防」という用語は、保護的な組成物を、発病前に投与することを指す。「抑制」とは、組成物を、発病後であるが、疾患が臨床的に明らかになる前に投与することを指す。「治療」とは、保護的な組成物を、疾患の症状が出現した後に投与することを指す。
薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）の疾患からの保護または疾患の治療における効果をスクリーニングするために使用できる動物モデルの系が用意されている。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を感受性のマウスで試験する方法が、当技術分野で知られている（Knightら、(1978) J. Exp. Med., 147: 1653；Reinerstenら、(1978) New Eng. J. Med., 299: 515）。重症筋無力症（ＭＧ）は、ＳＪＬ／Ｊマウス、雌、において、別の種由来の可溶性ＡｃｈＲタンパク質を用いて本疾患を誘導することによって、試験される（Lindstromら、(1988) Adv. Immunol., 42: 233）。関節炎は、感受性の系統のマウスに、II型コラーゲンを注射することによって誘導される（Stuartら、(1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233）。感受性のラットにマイコバクテリアの熱ショックタンパク質を注射することによって、アジュバント関節炎が誘導されるモデルが記載されている（Van Edenら、(1988) Nature, 331:171）。変形性関節炎を治療する効果を、関節炎がコラゲナーゼの関節内注射によって誘導されるマウスモデルにおいて評価できる（Blom, A. B.ら、Osteoarthritis Cartilage 12: 627-635 (2004)）。記載されているように、甲状腺炎は、マウスにおいて、チログロブリンを投与することによって誘導される（Maronら、(1980) J. Exp. Med., 152: 1115）。インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、自然に発症する、またはKanasawaら、(1984) Diabetologia, 27: 113によって記載されているもの等、特定の系統のマウスにおいて誘導できる。マウスおよびラットにおけるＥＡＥは、ヒトのＭＳのモデルとして役立つ。このモデルにおいては、脱髄性疾患が、ミエリン塩基性タンパク質の投与によって誘導される（Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischerら編、Grune and Stratton, New York, pp. 179-213；McFarlinら、(1973) Science, 179: 478；およびSatohら、(1987) J. Immunol., 138: 179を参照）。
本発明の薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）は、別に投与する組成物として使用してもよいし、またはその他の薬剤と組み合わせて使用してもよい。これらとして、シクロスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチン等、種々の免疫療法薬剤、免疫毒素等があげられる。薬学的組成物は、本発明の薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）と組み合わせた、種々の細胞毒性またはその他の薬剤の「カクテル」を含んでもよいし、または異なる薬剤を含む、本発明による薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）の組合せを含んでもよい。
薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）を、任意の適切な手法にしたがって、任意の個体または対象に投与できる。例えば、経口、食餌、外用、経皮、直腸、非経口（具体的には、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、くも膜下腔内、関節内注射）および吸入（具体的には、気管支内、鼻腔内または経口吸入、鼻腔内滴下）の投与経路をはじめとする、種々の投与経路が可能であり、投与経路は、薬剤組成物および治療しようとする疾患または状態によって異なる。指示にしたがって、局所投与または全身投与できる。好ましい投与形態は、選ばれた薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）および治療する状態（例えば、疾患）によって変化させることができる。投与の用量および頻度は、患者の年齢、性別および状態、同時に投与するその他の薬剤、対抗する徴候ならびに臨床医が考慮に入れるその他のパラメーターによって異なるであろう。治療に有効な量の薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）を投与する。治療に有効な量とは、投与条件下で、所望の治療効果を達成するのに十分な量である。
本発明の好ましい実施形態では、本発明によるＧＬＰ−１薬剤またはＧＬＰ−１の類似体もしくは誘導体を含有する薬学的組成物を、そのような治療を必要とする患者に非経口投与できる。非経口投与は、注射器、場合によっては、ペン様注射器による、皮下、筋肉内または静脈内注射によって行なうことができる。別法として、非経口投与は、注入ポンプによって行なうこともできる。さらに、別法は、点鼻薬または肺スプレーの形態のＧＬＰ−１薬剤またはＧＬＰ−１の類似体もしくは誘導体を投与するための粉末または液体でありうる組成物である。その上さらに、別法として、本発明のＧＬＰ−１薬剤またはＧＬＰ−１の類似体もしくは誘導体を、経皮膚的に、例えば、パッチから、場合によっては、イオン泳動的なパッチ、または粘膜を介して、例えば、頬側から投与することもできる。その他の実施形態では、組成物を、経口的に、例えば、丸剤、カプセル、（例えば、肥満治療のための体重減少飲料として販売される）飲料として投与する。
ＧＬＰ−１化合物の非経口投与のための組成物を、例えば、WO03/002136（参照によって本明細書に組み込むものとする）に記載されているように調製できる。
特定のペプチドの経鼻投与のための組成物を、例えば、欧州特許第272097号（Novo Nordisk A/Sへ）またはWO93/18785（いずれも、参照によって本明細書に組み込むものとする）に記載されているように調製できる。
「対象」または「個体」という用語は、本明細書では、これらに限定されないが、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたはその他のウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、げっ歯類もしくはマウスの種をはじめとする、哺乳類等の動物を含むと定義される。
薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）を、中性の化合物または塩として投与できる。アミンまたはその他の塩基性の基を含有する化合物（例えば、薬剤組成物、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）の塩を、例えば、塩化水素、臭化水素酸、酢酸、過塩素酸等の適切な有機または無機の酸と反応させることによって得ることができる。第四級アンモニウム基を有する化合物は、塩素、臭素、ヨウ素、酢酸、過塩素酸等の対アニオンも含有する。カルボン酸またはその他の酸性の官能基を含有する化合物の塩を、適切な塩基、例えば、水酸化物塩基と反応させることによって調製できる。酸性の官能基の塩は、ナトリウム、カリウム等の対カチオンを含有する。
本発明は、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）の対象（例えば、患者）への投与において使用するためのキットも提供し、このキットは、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）と、薬剤送達用具と、場合によっては、使用説明書とを含む。薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）を、凍結乾燥製剤等の製剤として提供できる。特定の実施形態では、薬剤送達用具を、注射器、吸入器、鼻腔内または眼投与装置（例えば、噴霧器、眼または鼻用の滴下器）からなる群から選択する。
本発明の薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）を、保存するために凍結乾燥し、適切な担体中に用時溶解できる。任意の適切な凍結乾燥方法（例えば、噴霧乾燥、固体乾燥）および／または元に戻す手法を利用できる。当業者には、凍結乾燥および元に戻す作業によって、抗体の活性がさまざまな程度で損失すること（例えば、従来の免疫グロブリンの場合、ＩｇＭ抗体は、ＩｇＧ抗体よりも活性の損失の程度が大きくなりやすい）、ならびに使用濃度を調節して活性の損失を補う必要があることが理解されよう。特定の実施形態では、本発明は、凍結乾燥（凍結により乾燥）された本明細書に記載する薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）を含む組成物を提供する。好ましくは、凍結乾燥（凍結により乾燥）された薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）の再水和後の活性（例えば、血清アルブミンに対する結合活性）の損失が、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下または約５０％以下である。活性は、凍結乾燥される前の薬剤組成物の効果をもたらすのに必要とする薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）の量である。例えば、所望の時間にわたり、所望の血清濃度を達成および維持するのに必要とする薬剤複合体または薬剤融合体の量。薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）の活性を、任意の適切な方法を使用して、凍結乾燥前に測定でき、活性を同一の方法を使用して、再水和後に測定して、損失した活性の量を決定できる。
薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）またはそれらのカクテルを含有する組成物を、予防および／または治療の処置のために投与できる。特定の治療応用例では、投与条件下において、選択された細胞集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、死滅または何らかのその他の測定可能なパラメーター等、所望の治療または予防効果を達成するのに十分な量を、「治療的に有効な量または用量」と定義する。この用量を達成するのに必要な量は、疾患の重症度ならびに患者自身の免疫系の全般状態および全般的な健康によって異なるであろうが、通常、約１０μｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、または体重１ｋｇあたり、約０．００５〜５．０ｍｇの薬剤複合体または薬剤融合体の範囲であり、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／回がより一般的に使用される。例えば、本発明の薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）を、１日あたり（例えば、１日あたり最大４回の投与）、２日に１回、３日に１回、週２回、週１回、２週に１回、月１回または２ヵ月に１回、例えば、約１０μｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇまたは約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与できる。
予防的利用としては、薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）またはそれらのカクテルを含有する組成物を、類似のまたは若干低い用量で投与できる。本発明による薬剤組成物（例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体）を含有する組成物を予防または治療の状況で利用して、哺乳類において選択された標的細胞集団の変化、不活性化、死滅または除去を促進できる。
実施例
インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ１−ｒａ）は、ＩＬ−１の、インターロイキン−１タイプ１受容体（ＩＬ−１Ｒ１）との結合を競合的に阻害することによって、ＩＬ−１の生物活性を遮断するアンタゴニストである。ＩＬ−１産生は、炎症刺激に応じて誘導され、種々の生理学的反応、例えば、炎症および免疫応答を媒介する。ＩＬ−１はさまざまな活性、例えば、軟骨組織分解および骨吸収の刺激を有する。関節リウマチ患者では、局所的に産生されるＩＬ−１の量が増大し、天然に存在するＩＬ１−ｒａのレベルがこれらの異常に増大した量と競合するには不十分となっている。疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤＳ）、例えば、メトトレキサートおよび生物製剤、例えば、ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）（ａｎａｋｉｎｒａ，Ａｍｇｅｎ）をはじめ、ＲＡに利用可能ないくつかの治療がある。
ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）（ａｎａｋｉｎｒａ，Ａｍｇｅｎ）は、組換え、非グリコシル化型のヒトインターロイキン−１受容体アンタゴニストであり、１５３個のアミノ酸からなり、分子量は１７．３キロダルトンである。（ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）（ａｎａｋｉｎｒａ，Ａｍｇｅｎ）のアミノ酸配列は、天然に存在するＩＬ−１ｒａ中の１５２個のアミノ酸とさらなるＮ末端メチオニンに相当する。）ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標）（ａｎａｋｉｎｒａ，Ａｍｇｅｎ）は、１種または複数のＤＭＡＲＤに失敗した１８歳以上の患者において中等度〜重篤な関節リウマチの徴候および症状の低減のために適応される。投与量は１００ｍｇの薬剤の１日１回使用皮下注射である。Ｔβ１／２は４〜６時間であり、患者の７１％が１４〜２８日に注射部位反応を起こす。
以下、本発明者らは、治療用ポリペプチドと血清アルブミン結合性ｄＡｂとを連結させることが、（i）治療用ポリペプチド単独と同様の活性を有し、（ii）血清アルブミンとも結合する化合物をもたらすことを実証する。さらに、本発明は、長い血清半減期型の治療用ポリペプチドを作製する方法を提供する。例えば、本発明者らは、血清アルブミン結合性ｄＡｂをＩＬ１−ｒａと連結させ、これによって、ＩＬ１−ｒａ単独よりもより長い血清半減期を有する化合物をもたらした。
マウス、ラットおよびヒト血清アルブミンと結合するドメイン抗体の選択
この実施例では、血清アルブミンに対する単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）を作製する方法を説明する。マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびラット血清アルブミン（ＲＳＡ）に対するｄＡｂの選択を記載する。
マウス血清アルブミンに対するｄＡｂは、ＷＯ２００４／００３０１９Ａ２に記載のとおりに選択した。３種のヒトファージディスプレイ抗体ライブラリーを用いた。各ライブラリーは、ＶＨ（Ｖ３−２３／ＤＰ４７およびＪＨ４ｂ）またはＶκ（ｏ１２／ｏ２／ＤＰＫ９およびＪκｌ）の単一のヒトフレームワークに基づいており、相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）に組み込むものとするＮＮＫコドンによってコードされる側鎖多様性を有していた。
ライブラリー１（ＶＨ）：
多様性位置：Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２ａ、Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９７、Ｈ９８。
ライブラリーサイズ：６．２×１０９
ライブラリー２（ＶＨ）：
多様性位置：Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２ａ、Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ９９、Ｈ１００、Ｈ１００Ａ、Ｈ１００Ｂ。
ライブラリーサイズ：４．３×１０９
ライブラリー３（Ｖκ）：
多様性位置：Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、Ｌ９６
ライブラリーサイズ：２×１０９
ＶＨおよびＶκライブラリーは、選択されるライブラリー中のクローンの大部分が機能的であるよう、一般的なリガンドプロテインＡおよびプロテインＬそれぞれとの結合について予備選択しておいた。上記で示されるライブラリーのサイズは、予備選択サイズに相当している。
ライブラリーの各々を別個に用い、血清アルブミンで２ラウンドの選択を実施した。各選択のために、抗原を、４ｍＬのＰＢＳ中、濃度１００μｇ／ｍｌでイムノチューブ（ｎｕｎｃ）上にコーティングした。第１の選択ラウンドでは、ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ）またはＭＳＡ（Ｓｉｇｍａ）に対して３種のライブラリーの各々から別個に抽出した。第２の選択ラウンドでは、６種の第１ラウンド選択の各々に由来するファージから、（i）再度同一抗原に対して（例えば、第１ラウンドＭＳＡ、第２ラウンドＭＳＡ）および（ii）相反する抗原に対して（例えば、第１ラウンドＭＳＡ、第２ラウンドＨＳＡ）抽出し、その結果、全部で１２種の第２ラウンド選択を行なった。各場合において、第２ラウンドの選択後、４８クローンをＨＳＡおよびＭＳＡとの結合について試験した。可溶性ｄＡｂ断片は、Harrison et al, Methods Enzymol. 1996; 267: 83-109によってｓｃＦｖ断片について記載されるとおりに製造し、２％ｔｗｅｅｎ ＰＢＳをブロッキングバッファーとして用い、結合しているｄＡｂを、プロテインＬ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）（Ｖκに対して）およびプロテインＡ−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）（ＶＨに対して）のいずれかを用いて検出した点を除き、標準ＥＬＩＳＡプロトコールに従った（Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133）。
ＭＳＡ、ＨＳＡまたは双方との結合を示す、バックグラウンドより高いシグナルを示したｄＡｂを、プラスチック単独との結合について、ＥＬＩＳＡ不溶性型において試験したが、すべて血清アルブミンに特異的であった。次いで、クローンを配列決定したところ（表１参照のこと）、２１の独特なｄＡｂ配列が同定されたことが示された。選択されたＶκ ｄＡｂクローン間の最小類似性（アミノ酸レベルで）は８６．２５％（（６９／８０）×１００；多様化した残基すべてが異なっている場合の結果、クローン２４および３４）であった。選択されたＶＨ ｄＡｂクローン間の最小類似性は９４％（（１２７／１３６）×１００）であった。
次いで、血清アルブミン結合性ｄＡｂを、溶液からビオチン化抗原を捕捉するその能力について試験した。ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌのプロテインＬ（Ｖκクローンに対して）および１μｇ／ｍｌのプロテインＡ（ＶＨクローンに対して）でコーティングした点以外は、ＥＬＩＳＡプロトコール（上記のとおり）に従った。プロトコールにあるように、可溶性ｄＡｂを溶液から捕捉し、検出はビオチン化ＭＳＡまたはＨＳＡとストレプトアビジンＨＲＰとを用いて行なった。ビオチン化ＭＳＡおよびＨＳＡは、血清アルブミン分子あたり２ビオチンという平均を達成することを目的として、製造業者の使用説明書に従って調製しておいた。ＥＬＩＳＡにおいて溶液からビオチン化ＭＳＡを捕捉する２４クローンを同定した。これらのうち２つ（以下のクローン２および３８）はビオチン化ＨＳＡも捕捉した。次いで、ｄＡｂを、ＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅチップ上にコーティングされたＭＳＡと結合するその能力について試験した。Ｂｉａｃｏｒｅ上のＭＳＡと結合する８クローンを見い出した。
ヒト血清アルブミンおよびラット血清アルブミンに対するｄＡｂを、プロトコールに対する以下の改変を除いて抗ＭＳＡ ｄＡｂについて先に記載したとおりに選択した：合成ＶＨドメインのファージライブラリーは、ＤＰ４７生殖系列遺伝子およびＪＨ４セグメントを含むヒトＶＨ３に基づくライブラリー４Ｇとした。以下の指定の位置での多様性を、突然変異誘発（ＮＮＫコドンを用いる；Ｋａｂａｔに従ってナンバリング）によって導入した。ＣＤＲ１中：３０、３１、３３、３５、ＣＤＲ２中：５０、５２、５２ａ、５３、５５、５６およびＣＤＲ３中：４〜１２多様化残基：例えば、４ＧＨ１１におけるＨ９５、Ｈ９６、Ｈ９７およびＨ９８ならびに４ＧＨ１９におけるＨ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ９９、Ｈ１００、Ｈ１００ａ、Ｈ１００ｂ、Ｈ１００ｃ、Ｈ１００ｄ、Ｈ１００ｅおよびＨ１００ｆ。最後の３個のＣＤＲ３残基はＦＤＹであり、ＣＤＲ３の長さは７〜１５残基で異なる。ライブラリーは、＞１×１０１０個の個別クローンを含む。
ＶＨおよびＶκライブラリーのサブセットは、任意抽出のライブラリー中のクローンの大部分が機能的であるよう、一般的なリガンドプロテインＡおよびプロテインＬそれぞれとの結合について予備選択しておいた。上記で示されるライブラリーのサイズは、予備選択後のサイズに相当している。
ＶＨおよびＶκライブラリーのサブセットを別個に用い、ラットおよびヒト血清アルブミンで２ラウンドの選択を実施した。各選択のために、抗原を、（i）４ｍＬのＰＢＳ中、濃度１００μｇ／ｍｌでイムノチューブ（ｎｕｎｃ）上にコーティングしたか、（ii）ビオチン化し、次いで、可溶性選択とそれに続くストレプトアビジンビーズ（第１ラウンドにおいて）およびニュートラビジンビーズ（第２ラウンドにおいて）での捕捉に用いた。（各クローンを単離するために用いた選択戦略の詳細については表１参照のこと。）各場合において、第２ラウンドの選択後、２４ファージクローンを、ＨＳＡまたはＲＳＡとの結合について試験した。
選択の１つにおいて、クローンのうちの相当な割合がファージＥＬＩＳＡにおいて陽性であった場合には、この選択から得られたＤＮＡを、可溶性ｄＡｂの製造のために発現ベクターにクローニングし、個々のコロニーを選んだ。可溶性ｄＡｂ断片は、Harrison et al （Methods Enzymol. 1996;267:83-109）によってｓｃＦｖ断片について記載されたとおりに製造し、２％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳをブロッキングバッファーとして用い、結合しているｄＡｂを抗ｍｙｃＨＲＰを用いて検出した点を除き、標準ＥＬＩＳＡプロトコールに従った（Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133）。次いで、ＥＬＩＳＡにおいて陽性であったクローンを、ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴機器（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を用い、ＭＳＡ、ＲＳＡまたはＨＳＡとの結合についてスクリーニングした。ＭＳＡ、ＲＳＡまたはＨＳＡと結合したｄＡｂを、さらに分析した。次いで、クローンを配列決定し、独特のｄＡｂ配列を同定した。
Figure 0005185624
次いで、ＢＩＡＣＯＲＥチップ（ＢＩＡＣＯＲＥ ＡＢ）上の血清アルブミンと結合したｄＡｂを、親和性に関する情報を得るためにさらに分析した。分析は、血清アルブミンでコーティングされたＣＭ５チップ（カルボキシメチル化デキストランマトリックス）を用いて実施した。フローセル１は、コーティングしていないブロッキングされた陰性対照であり、フローセル２はＨＳＡでコーティングし、フローセル３はＲＳＡでコーティングし、フローセル４はＭＳＡでコーティングした。血清アルブミンは、酢酸塩バッファーｐＨ５．５中、コーティングされた物質の５００レゾナンスユニット（ＲＵ）を目的としてプログラムされたＢＩＡＣＯＲＥコーティングウィザードを用いて固定化した。２００ｍＬ〜５００ｍＬスケールで、注目する各ｄＡｂは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）のペリプラズムにおいて発現され、ＶＨについてはプロテインＡ流線型親和性樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）に対する、ＶκについてはプロテインＬアガロース親和性樹脂（Ａｆｆｉｔｅｃｈ，Ｎｏｒｗａｙ）に対するバッチ吸収と、それに続くグリシンｐＨ２．２での溶出およびＰＢＳへのバッファー交換を用いて上清から精製した。ｄＡｂの濃度範囲（５ｎＭ〜５μＭの範囲）は、ＢＩＡＣＯＲＥ ＨＭＳ−ＥＰバッファーで希釈することによって調製し、ＢＩＡＣＯＲＥチップを通して流した。
親和性（ＫＤ）は、ＢＩＡＣＯＲＥトレースから、オン速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）曲線およびオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）曲線を、ＫＤの領域においてｄＡｂの濃度によって作製したトレースに適合させることによって算出した。血清アルブミンに対して異なる親和性の範囲を有するｄＡｂが同定された。１０〜１００ｎＭの範囲には、ＨＳＡに対するＤＯＭ７ｈ−８、ＨＳＡに対するＤＯＭ７ｈ−２およびＲＳＡに対するＤＯＭ７ｒ−１の親和性が含まれた。１００ｎＭ〜５００ｎＭの範囲には、ＨＳＡに対するＤＯＭ７ｈ−７、ＲＳＡに対するＤＯＭ７ｈ−８およびＨＳＡに対するＤＯＭ７ｈ−２６の親和性が含まれた。５００ｎＭ〜５μＭの範囲には、ＨＳＡに対するＤＯＭ７ｈ−２３およびＨＳＡに対するＤＯＭ７ｈ−１の親和性が含まれた。トレースの例は図６Ａ〜６Ｃに含まれている。
抗血清アルブミン抗体をＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）との融合体として形式を整えること
この実施例では、ＩＬ−Ｉｒａと、血清アルブミンと結合するｄＡｂとを含む融合タンパク質を作製する方法を説明する。１種はＩＬ−１ｒａのｄＡｂ Ｎ末端を含み（ＭＳＡ１６ＩＬ１−ｒａ）、１種はＩＬ−１ｒａのｄＡｂ Ｃ末端を含む（ＩＬ１−ｒａＭＳＡ １６）、２種の融合体を作製した。融合体およびベクターの配列は図２Ｃおよび２Ｄに示されている。ＭＳＡと結合しなかった対照融合体も製造し、その配列は図２Ｅに示されている。
ＫＩＮＥＲＥＴ（ａｎａｋｉｎｒａ，Ａｍｇｅｎ）は４〜６時間という短い半減期を有し、推奨される投与計画は毎日の注射を要求する。この計画は７１％の症例において１４〜２８日に注射部位反応をもたらす。したがって、より長い血清半減期を有するヒトＩＬ−１ｒａの形は有益であり、有効性を高め、投与頻度を低下させることができる。これらは双方とも薬剤にとって望ましい特長である。
クローニング
手短に言えば、２つの多重クローニング部位（ＭＣＳ）を以下に詳述するように設計し、Ｔ７プロモーターを含む発現ベクターに挿入した。制限部位を、ＩＬ１−ｒａ、ｄＡｂ、ＧＡＳリーダーおよびリンカーを挿入するために設計した。一方（ＭＣＳ１＋３）は、ＩＬ−１ｒａのｄＡｂ Ｎ末端を含むタンパク質をコードし、もう一方（ＭＣＳ２＋４）は、ＩＬ−１ｒａのｄＡｂ Ｃ末端を含むタンパク質をコードする。
ｄＡｂＩＬ１−ｒａ融合体のクローニング部位１＋３
ＮｄｅＩ、スタッファー、ＳａｌＩ、ＮｏｔＩ、スタッファー、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ
ｇｃｇｃａｔａｔｇｔｔａｇｔｇｃｇｔｃｇａｃｇｔｃａａａａｇｇｃｃａｔａｇｃｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃｔｇｃａｇｇｔｃｔｃｇａｇｔｇｃｇａｔｇｇａｔｃｃ
（配列番号３５）
ＩＬ１−ｒａｄＡｂ融合体のクローニング部位２＋４
ＮｄｅＩ、スタッファー、ＳｔＵＩ、ＳａｃＩ、スタッファー、ＳａｌＩ、ＮｏｔＩ、ＴＡＡ ＴＡＡ ＢａｍＨＩ
ｇｃｇｃａｔａｔｇｔｔａａｇｃｇａｇｇｃｃｔｔｃｔｇｇａｇａｇａｇｃｔｃａｇｇａｇｔｇｔｃｇａｃｇｇａｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃｃｃａｇｇｃｇｇｃｃｇｃｔａａｔａａｇｇａｔｃｃａａｔｇｃ
（配列番号３６）
次いで、ＭＣＳを適当な制限酵素を用いて消化することと、アニーリングしている、リーダーをコードするプライマーをライゲーションすることとによってＧＡＳリーダーを各ベクター中に挿入した。次いで、リンカーをコードするリンカーＤＮＡを同様の方法で挿入した。ＩＬ−１ｒａをコードするＤＮＡは、ｃＤＮＡクローンからＰＣＲ（必要とされる制限部位を加えるよう設計されたプライマーを用いる）によって得、ＴＯＰＯクローニングベクターに挿入した。核酸配列決定によって正確な配列を確認した後、ＩＬ−１ｒａをコードするＤＮＡをＴＯＰＯベクターから切り出し、リーダーおよびリンカーを含むベクターにライゲーションした。最後に、ｄＡｂをコードするＤＮＡを、ｄＡｂ発現ベクターから切り出し、インサート（ゲル精製によって精製した）およびベクターのＳａｌＩ／ＮｏｔＩ消化によってベクターに挿入した。
発現および精製
ＭＳＡ１６ＩＬ１−ｒａ、ＩＬ１−ｒａＭＳＡ１６およびダミーＩＬ−１ｒａは、大腸菌のペリプラズムにおいて発現され、プロテインＬアガロース親和性樹脂（Ａｆｆｉｔｅｃｈ，Ｎｏｒｗａｙ）に対するバッチ吸収と、それに続くグリシンｐＨ２．２での溶出を用いて上清から精製した。次いで、精製したｄＡｂを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動とそれに続くクマシー染色とによって分析した。１種のタンパク質（ＩＬ−１ｒａＭＳＡ １６）については、＞９０％のタンパク質が期待された大きさであったので、さらなる精製は行なわずに活性について分析した。その他のタンパク質（ＭＳＡ１６ＩＬ１−ｒａおよびダミーＩＬ−１ｒａ）はより小さいバンドが混入していたので、ｐＨ９のＲＥＳＯＵＲＳＥＱイオン交換カラムでのＦＰＬＣイオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。タンパク質は、０〜５００ｍＭ ＮａＣｌの直線塩勾配を用いて溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって分析した後、期待された大きさのタンパク質を含む画分を合わせて、純度＞９０％の混合画分を得た。このタンパク質をさらなる分析に用いた。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＭＲＣ−５ ＩＬ−８アッセイにおけるｄＡｂ ＩＬｌ−ｒａ融合体の活性の測定
ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ融合体を、ＭＲＣ−５細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−１７１；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）におけるＩＬ−１によるＩＬ−８分泌の誘導を中和する能力について試験した。この方法は、ＨＵＶＥＣにおけるＩＬ−１によるＩＬ−８の誘導を記載するAkeson, L. et al (1996) Journal of Biological Chemistry 271, 30517-30523から適応させ、ＭＲＣ−５細胞をＨＵＶＥＣ細胞株の代わりに用いた。手短に言えば、マイクロタイタープレートにプレーティングされたＭＲＣ−５細胞を、ｄＡｂＩＬ−１ｒａ融合タンパク質またはＩＬ−１ｒａ対照およびＩＬ−１（１００ｐｇ／ｍＬ）とともに一晩インキュベートした。インキュベートした後、上清を細胞から吸引除去し、ＩＬ−８濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定した。
融合タンパク質中のＩＬ−Ｉｒａの活性が、ＩＬ−８分泌の低下をもたらした。ＭＳＡ１６ＩＬ１−ｒａ融合体の活性に起因する、およびＩＬ−ＩｒａＭＳＡ１６融合体の活性に起因するＩＬ−８分泌の低下を、ＩＬ−１ｒａ対照（組換えヒトＩＬ−１ｒａ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて見られる低下と比較した。試験したタンパク質各々の中和用量５０（ＮＤ５０）を求め、表２に示す。
Figure 0005185624
結果は、ＩＬ−１ｒａは、抗血清アルブミンｄＡｂとの融合構築物の一部として、依然として活性であったということを実証する。ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａタンパク質を、その薬物動態を評価するためにさらに研究した（ＰＫ研究）。
血清アルブミン、抗ＩＬ−１ｒａサンドイッチＥＬＩＳＡ
３種のｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ融合体を、血清アルブミンと結合し、モノクローナル抗ＩＬ１ｒａ抗体によって同時に検出される能力について試験した。試験した融合体はＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６およびダミーＩＬ−１ｒａであった。手短に言えば、ＥＬＩＳＡプレートを、１０μｇ／ｍｌのマウス血清アルブミンで一晩コーティングし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで５回洗浄し、次いで、４％ Ｍａｒｖｅｌ ＰＢＳで１時間ブロッキングした。ブロッキングした後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで５回洗浄し、次いで、４％ ＭＰＢＳで希釈した各ｄＡｂ、ＩＬ−１ｒａ融合体とともに１時間インキュベートした。各融合体は１μＭ濃度および７連続４倍希釈物（すなわち、６０ｐＭまで低下させた）でインキュベートした。インキュベートした後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで５回洗浄し、次いで、４％ＭＰＢＳで希釈した、ヒトＩＬ−１受容体アンタゴニストに対するウサギポリクローナル抗体（ａｂ−２５７３）（Ａｂｃａｍ，ＵＫ）の製造業者推奨希釈物とともに１時間インキュベートした。このインキュベーションの後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで５回洗浄し、次いで、４％ＭＰＢＳで希釈した、二次抗体（抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ）の１／２０００希釈物とともに１時間インキュベートした。二次抗体とともにインキュベートした後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで３回、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ウェルあたり５０μｌのＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ，ＭＡ）を用いて発現させ、この反応を、ウェルあたり５０μｌのＨＣＬで停止させた。吸収は４５０ｎＭで読み取った。
ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６の両タンパク質とも、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて１μＭ濃度で２×バックグラウンドよりも高いレベルで検出された。ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａタンパク質は３．９ｎＭまで下げた希釈物で２×バックグラウンド以上で検出されたのに対し、ＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６タンパク質は５００ｎＭへの低下だけで２×バックグラウンドで検出された。対照構築物（ダミーＩＬ−１ｒａ）は血清アルブミンと結合しなかったので、ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ融合体の血清アルブミンとの結合は血清アルブミンに特異的であるとわかった。
マウスＰＫ研究における薬剤融合体の血清半減期の測定
Ａ．ＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＨＡエピトープタグ融合タンパク質のマウスにおける血清半減期の測定
ＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＨＡエピトープタグ融合タンパク質は、大腸菌のペリプラズムにおいて発現され、プロテインＬアガロース親和性樹脂（Ａｆｆｉｔｅｃｈ，Ｎｏｒｗａｙ）に対するバッチ吸収と、それに続くグリシンｐＨ２．２での溶出を用いて精製した。融合タンパク質の血清半減期を、マウスにおいて、ＣＤ１系統雄動物への約１．５ｍｇ／ｋｇでの単回静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に測定した。血清レベルの分析は、４％Ｍａｒｖｅｌでブロッキングされた、ヤギ抗ＨＡ（Ａｂｃａｍ，ＵＫ）捕捉およびプロテインＬ−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）検出を用いるＥＬＩＳＡによって行なった。洗浄は０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳを用いて行なった。既知濃度のＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＨＡ融合体の標準曲線は、１×マウス血清の存在下で設定し、試験サンプルとの比較性を確実にした。１コンパートメントモデルでのモデリング（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）により、ＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＨＡエピトープタグ融合タンパク質は、最終相ｔｌ／２ ２９．１時間および曲線下面積５５９時間・μｇ／ｍ１を有するとわかった。このことは、わずか数分ほどの短いものであり得るＨＡエピトープタグペプチド単独の予測半減期を上回る大きな改善を実証する。
薬剤モデルとしてＨＡエピトープタグを用いるこの研究の結果は、薬剤のｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期は、薬剤が、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性断片（例えば、ｄＡｂ）との薬剤融合体または薬剤複合体として調製される場合には延長され得るということを実証する。
抗ＭＳＡ ｄＡｂ ＤＯＭ７ｍ−１６およびＤＯＭ７ｍ−２６ならびにＭＳＡと結合しない対照ｄＡｂのマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ半減期も評価した。再度、ＤＯＭ７ｍ−１６、ＤＯＭ７ｍ−２６および対照ｄＡｂには、薬剤（例えば、ペプチド薬）のモデルとして役立つＨＡエピトープタグを含めた。この研究では、ＭＳＡと結合しない対照ｄＡｂが２０分というｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有していたのに対し、ＤＯＭ７ｍ−１６およびＤＯＭ７ｍ−２６のｉｎ ｖｉｖｏ半減期は大幅に延長された。（図１２）さらなる研究においてＤＯＭ７ｍ−１６は、マウスにおいて２９．５時間というｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有するとわかった。
別の研究では、ＨＡエピトープタグを含むＤＯＭ７ｈ−８のｉｎ ｖｉｖｏ半減期（ｔ1/2β）をマウスにおいて評価した。２コンパートメントモデルでのモデリング（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）により、ＤＯＭ７ｈ−８は２９．１時間というｔ1/2βを有するとわかった。
薬剤（例えば、ペプチド薬）のモデルとしてＨＡエピトープタグを用いるこれらの研究各々の結果は、薬剤のｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期は、薬剤が、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性断片（例えば、ｄＡｂ）との薬剤融合体または薬剤複合体として調製される場合には著しく延長され得るということを実証する。
Ｂ．ＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ融合タンパク質のマウスにおける血清半減期の測定
ＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ融合タンパク質（ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ）は、大腸菌のペリプラズムにおいて発現され、プロテインＬアガロース親和性樹脂（Ａｆｆｉｔｅｃｈ，Ｎｏｒｗａｙ）に対するバッチ吸収と、それに続くグリシンｐＨ２．２での溶出を用いて精製した。ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ（ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａ）、ＭＳＡと結合しないｄＡｂとのＩＬ−Ｉｒａ融合体（ダミーｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ）およびＨＡエピトープタグと融合している抗ＭＳＡ ｄＡｂ（ＤＯＭ７ｍ−１６ＨＡタグ）の血清半減期を、マウスにおいてＣＤ１系統雄動物への約１．５ｍｇ／ｋｇでの単回ｉ．ｖ．注射後に調べた。
血清レベルの分析は、ＩＬ−１ｒａサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）によって行なった。既知濃度のｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ融合体の標準曲線は、１×マウス血清の存在下で設定し、試験サンプルとの比較性を確実にした。モデリングは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ薬物動退学ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）を用いて実施した。
抗ＭＳＡ ｄＡｂとのＩＬ−１ｒａ融合体は、非ＭＳＡ結合性ｄＡｂのＩＬ−１ｒａとの融合体である対照と比較した場合に、血清半減期が相当に増大することが予測された。対照非ＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ融合体は、短い血清半減期を有すると予測された。
研究の結果は表３に示されており、抗ＭＳＡ ｄＡｂとのＩＬ−１ｒａ融合体（ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａは、ＭＳＡと結合しないｄＡｂとのＩＬ−１ｒａ融合体（ダミーｄＡｂ／ｌＬ−１ｒａ）よりも約１０倍長い血清半減期を有していたことを示す。結果はまた、ダミー／ＩＬ−１ｒａ（ＡＵＣ：１．５時間・μｇ／ｍｌ）と比較したＤＯＭ７ｍ−ｌ６／ＩＬ−１ｒａの濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ：２６７時間・μｇ／ｍｌ）では＞２００倍改善（増大）されたことを示した。
Figure 0005185624
これらの研究の結果は、薬剤のｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期およびＡＵＣは、薬剤が、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性断片（例えば、ｄＡｂ）との薬剤融合体または薬剤複合体として調製される場合には大幅に延長され得るということを実証する。
ＲＳＡ結合性ｄＡｂ／ＨＡエピトープタグ融合タンパク質のラットにおける血清半減期の測定
抗ラット血清アルブミンｄＡｂは、Ｃ末端ＨＡタグとともに大腸菌のペリプラズムにおいて発現され、Ｖｋ ｄＡｂについてのプロテインＬアガロース親和性樹脂（Ａｆｆｉｔｅｃｈ，Ｎｏｒｗａｙ）に対するバッチ吸収およびＶＨ ｄＡｂについてのプロテインＡ親和性樹脂に対するバッチ吸収と、それに続くグリシンｐＨ２．２での溶出を用いて精製した。血清半減期を調べるために、４匹のラットからなる群に、１．５ｍｇ／ＫｇのＤＯＭ７ｒ−２７、ＤＯＭ７ｒ−３１、ＤＯＭ７ｒ−１６、ＤＯＭ７ｒ−３または無関係の抗原と結合する対照ｄＡｂ（ＨＥＬ４）で単回ｉ．ｖ．注射を行なった。７日間にわたる尾静脈からの連続出血によって血清サンプルを得、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされたヤギ抗ＨＡ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ）と、それに続く、プロテインＡ−ＨＲＰ（ＶＨ ｄＡｂに対して）またはプロテインＬ−ＨＲＰ（Ｖκ ｄＡｂに対して）を用いる検出とを用いるサンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。既知濃度のｄＡｂの標準曲線は１×ラット血清の存在下で設定し、試験サンプルとの比較性を確実にした。２コンパートメントモデルでのモデリング（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ薬物動退学ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）を用いる）を用いてｔ1/2βおよび曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した（表４）。
Figure 0005185624
薬剤（例えば、ペプチド薬）のモデルとしてＨＡエピトープタグを用いるこのラット研究の結果は、薬剤のｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期は、薬剤が、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性断片（例えば、ｄＡｂ）との薬剤融合体または薬剤複合体として調製される場合には著しく延長され得るということを実証する。
ヒトにおける半減期の予測
ヒトにおけるｄＡｂ、薬剤融合体または薬剤複合体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、動物において得られた半減期データから相対スケーリングを用いて推定できる。３匹の動物において求めたｉｎ ｖｉｖｏ半減期のｌｏｇを、動物の体重のｌｏｇに対してプロットする。プロットした点を通って直線を引き、直線の傾きおよびｙ切片を用い、式ｌｏｇＹ＝ｌｏｇ（ａ）＋ｂ ｌｏｇ（Ｗ）｛式中、Ｙはヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏ半減期であり、ｌｏｇ（ａ）はｙ切片であり、ｂは傾きであり、Ｗはヒトの体重である｝を用いてヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏ半減期を算出する。直線は、約３５グラム（例えば、マウス）、約２６０グラム（例えば、ラット）および約２，７１０グラムの重さの動物において得られたｉｎ ｖｉｖｏ半減期データを用いて作成できる。この算出には、ヒトの体重は７０，０００グラムであると考えることができる。
関節リウマチのマウスコラーゲン誘導関節炎モデルにおける抗ＳＡ ｄＡｂ／ＩＬ−１ｒａ薬剤融合体の有効性
関節リウマチの認識されたマウスモデル（ＤＢＡ／１マウスにおけるII型コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ））における融合体ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａの有効性およびＩＬ−１ｒａの有効性を評価した。研究を通じて、マウスは、２０〜２４℃、１２時間明、１２時間暗サイクルで、ＨＥＰＡフィルター処理したスカンテイナー（Ｓｃａｎｔａｉｎｅｒ）中に収納された標準２型ケージ中の試験設備中に維持した。食餌（Ｈａｒｌａｎ−Ｔｅｋｌａｄ普通食２０１６）およびＵＶ滅菌水を無制限に与えた。マウスは、適当な順化を確実にするために研究の開始の少なくとも７日前に試験設備に運び入れた。
７〜８週齢のＤＢＡ／１マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｍ ａｎｄ Ｂ，Ｄｏｍｈｏｌｔｖｅｇ，Ｄｅｎｍａｒｋから入手）に、１：１の割合でエマルジョンが安定となるまで乳化させたＡｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡアジュバントおよびＡｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡコラーゲン（両方ともＭＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のエマルジョンを１回注射した。このエマルジョンは、ビーカーの水に加えたエマルジョンの液滴が固体の塊を形成した場合に安定であると考えた。次いで、マウスにエマルジョンを注射した。
エマルジョンを注射した２１日後、最も進行した関節炎疾患を患う２０匹の動物を研究から排除し、残りのマウスを１０匹の動物からなる群に分割した（各群には、５匹の雄と５匹の雌を含めた）。マウスを表５に示されるように治療し、すべての治療は１０ｍｌ／ｋｇが投与されるよう算出された濃度で送達した。
Figure 0005185624
関節炎の重篤度についての臨床スコアを、２１日目〜４９日目まで１週間につき３回記録した。４９日目にマウスを安楽死させた。個々のマウスは、関節炎スコア１２以上を示す前に、または重篤な移動問題を有する前に安楽死させた。
臨床スコアリングのために、以下の判定基準にしたがって各肢をスコア化し、四肢すべてのスコアを加えてマウスの総スコアを得た。この方法により各マウスについて０〜１６のスコアが得られた。スコアリング判定基準は以下のとおりとした：０＝正常、１＝足首もしくは手首の軽度ではあるが明確な発赤および腫張、または冒された指の数にかかわらない、個々の指に限局された明らかな発赤および腫張、２＝足首もしくは手首の中等度の発赤および腫張、３＝指を含む足全体の重篤な発赤および腫張、４＝複数の関節が含まれる最大に炎症を起こした肢。
個々のマウスから得た臨床スコアを用いて、すべての治療日数で各治療群の群平均関節炎スコアを算出した。倫理的理由のために研究から除外した動物にはいずれも、最大スコア１６を割り当てた。群平均関節炎スコアを時間に対してプロットした（図１３）。
４９日目に、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を用いて群平均関節炎スコアの統計分析を行なった。この統計分析により、４９日目に、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａで治療した２群（１ｍｇ／Ｋｇまたは１０ｍｇ／Ｋｇで（群３および４））は、生理食塩水対照群（群６）と比較した場合に、有意に改善された関節炎スコアを有する（それぞれ、有意レベルＰ＜１％およびＰ＜０．０５％）ということが示された。対照的に、１ｍｇ／ＫｇのＩＬ−１ｒａでの治療（群１）は、４９日目に関節炎スコアの統計的に有意な改善をもたらさなかったが、１０ｍｇ／ＫｇのＩＬ−１ｒａでの治療（群２）は、Ｐ＜５％有意レベルで有意な改善をもたらした。エンブレル（登録商標）（ｅｎｔａｒｅｃｅｐｔ；Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）での治療（群５）は、４９日目に、Ｐ＜１０％有意レベルで関節炎スコアの有意な改善をもたらした。
１０ｍｇ／Ｋｇ用量のＤＯＭ７ｍ−ｌ６／ＩＬ−１ｒａでの治療（群４）は、５ｍｇ／Ｋｇ（群５）のエンブレル（登録商標）（ｅｎｔａｒｅｃｅｐｔ；Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）での標準治療と比較した場合に、４９日目の関節炎スコアの改善で有効であった（Ｐ＜０．５％レベルで有意）。さらに、より低い１ｍｇ／Ｋｇ用量のＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａでの治療（群３）は、同投与量のＩＬ−１ｒａ単独での治療（群１）よりも４９日目の関節炎スコアの改善においてより有効であった（Ｐ＜１０％レベルで有意）。
研究の結果は、この研究では、特定の用量のＤＯＭ７ｍ−ｌ６／ＩＬ−１ｒａは、ＩＬ−１ｒａまたはエンブレル（登録商標）（ｅｎｔａｒｅｃｅｐｔ；Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）よりもより有効であったということを示す。ＩＬ−１ｒａに対する反応は、予想通り用量依存的であり、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａに対する反応も用量依存的であった。１ｍｇ／ＫｇのＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａでの治療の平均スコアは、１０ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１ｒａでの治療によって得られた平均スコアよりも一貫して低かった。これらのプロットされた結果（図１３）は、この研究では、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａでの治療は、ＩＬ−１ｒａよりも約１０倍より有効であったということを示す。
ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａのこの優れた有効性は、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａ融合タンパク質が、重量ベースでＩＬ−１ｒａの約半数のＩＬ−１受容体結合性エピトープを含んでいる（例えば、１ｍｇのＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａ（分子量３１．２ｋＤ）は、１ｍｇのＩＬ−１ｒａの（分子量１７．１ｋＤ）の約半数のＩＬ−１受容体結合性エピトープを含む）にもかかわらず観察された。
この研究の結果は、血清アルブミンと結合するｄＡｂは、ＩＬ−１ｒａ（ＲＡの臨床上実績のある治療）と結合できることと、得られる薬剤融合体が長い血清半減期特長（ｄＡｂによって付与される）とＩＬ−１受容体結合特長（ＩＬ−１ｒａによって付与される）の双方を有することとを実証する。薬剤融合体の血清滞留時間のために、ＣＩＡを治療するために有効であるＤＯＭ７−１６／ＩＬ−１ｒａの用量は、ＩＬ−１ｒａと比較して著しく低下した。
この研究の結果は、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性断片（例えば、ｄＡｂ）との薬剤融合体または薬剤複合体として調製された薬剤は、半減期の延長およびＡＵＣの増大という利益に加え、薬剤単独を上回る利点を提供する高度に有効な治療薬であるということを実証する。例えば、マウスＣＩＡモデルにおいて実証されるように、より低用量の薬剤融合体が有効であり、ＩＬ−１によって引き起こされる関節炎症および関節損傷を、ＩＬ−１ｒａ単独と比較してより長期間にわたって阻害し、疾患進行からよりいっそう保護した。
抗ＳＡ ｄＡｂ／サポリン非共有結合性薬剤複合体
リボソーム不活性化タンパク質サポリン（抗癌剤）は、変性剤およびプロテアーゼに対して高度に安定であり、Ｔリンパ球を標的とする毒素として用いられている。ビオチン−ストレプトアビジン結合を介してサポリンとＤＯＭ７ｈ−８をカップリングさせることによって非共有結合性薬剤複合体を調製した。この非共有結合性薬剤複合体を用いて得られた結果は、ＤＯＭ７ｈ−８は、薬剤とカップリングされた場合に、その血清アルブミン結合特徴を保持するということを実証する。
位置１０８のＣ末端アルギニン（配列番号２４中アミノ酸１０８）がシステイン残基で置換されている、ＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓと呼ばれる変異体ＤＯＭ７ｈ−８を、ＨＢ２１５１細胞における組換え核酸の発現によって調製した。細胞を、３０℃で、オーバーナイトの発現自己誘導ＴＢレディミックス（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において７２時間増殖させ誘導し、その後、遠心分離によって上清を回収した。ＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓは、プロテインＬ−アガロースでの親和性捕捉を用いて上清から精製した。次いで、１０カラム容積の２×ＰＢＳで樹脂を洗浄し、０．１ＭグリシンｐＨ２を用いてＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓを溶出した。溶出したＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓを、０．２×容積のＴｒｉｓ ｐＨ８を用いて中性化し、１ｍｇ／ｍｌに濃縮した（ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ ２０ｍｌ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，ＭＡ）を用いて）。
濃縮したＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓを、ＮＡＰ５脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）を用いてＰＢＳにバッファー交換し、濃度を測定した、次いで、ＥＺ−ＬＩＮＫスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，ＩＬ）を用いてｄＡｂをビオチン化した（第一級アミンを介して）。ビオチン化ｄＡｂを、ストレプトアビジン−サポリンと１：１モル比で混合した。
ｄＡｂ／サポリン複合体が形成されたことを確認するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて原型のままの複合体を検出した。ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）を、１０μｇ／ｍｌ、ウェルあたり１００μｌの容量で、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ，ＮＹ）のウェルの半分に一晩コーティングした。一晩インキュベートした後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで、２％ＰＢＳを用いプレート全体を２時間ブロッキングした。ブロッキングした後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで、２％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで０．５μＭに希釈したＤＯＭ７ｈ−８／サポリン非共有結合性複合体とともに１時間インキュベートした。対照として、同様のＥＬＩＳＡプレートで、０．５μＭのカップリングしていないサポリンおよび０．５μＭのカップリングしていないＤＯＭ７ｈ８を、２％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳ中でインキュベートした。さらなる対照は、ＨＳＡでコーティングしていないが２％ＴｗｅｅｎでブロッキングされたＥＬＩＳＡプレートのウェルでインキュベートした、同様の３種の希釈したタンパク質とした。インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで、２％ＴｗｅｅｎＰＢＳで希釈したヤギ抗サポリンポリクローナル抗体（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の１／２０００希釈物とともに１時間インキュベートした。インキュベートした後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで、二次検出抗体（１／２０００の抗ヤギＩｇＨＲＰ複合体）とともに１時間インキュベートした。インキュベートした後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＰＢＳで１回洗浄し、ペーパー上で軽くたたいて乾燥させた。基質として１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを用いてＥＬＩＳＡを発現させ、５０μｌの１Ｍ塩酸を用いて反応を停止させた。ＤＯＭ７ｈ−８とサポリンからなる非共有結合性複合体の存在は、複合体のＯＤ６００を、複合体を形成していない部分の任意のＯＤ６００と比較することによって確認した。
Figure 0005185624
この研究の結果は、薬剤は、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性断片と複合体を形成できるということと、複合体を形成している抗原結合性断片が血清アルブミン結合活性を保持することとを実証する。さらに、これらの結果は、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用の安定性および強度のために、血清アルブミンと結合する抗体の抗原結合性断片の血清アルブミン結合性活性を保持する、共有結合している複合体および非共有結合によって結合している複合体を調製できるということを示す。
抗ＳＡ ｄＡｂ／フルオレセイン複合体
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は、タンパク質上のアミノ、スルフヒドリル、イミダゾリル、チロシルまたはカルボニル基と架橋できる。分子量は３８９Ｄａであり、大きさは多数の小分子薬と同程度である。この複合体を用いて得られた結果は、抗ｓａ ｄＡｂは、小さな化学物質とカップリングした場合に、その血清アルブミン結合特徴を維持するということを実証し、このことは、小分子薬を抗ＳＡ ｄＡｂと複合体を形成させることができるということを示す。
濃縮ＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓを、実施例７に記載のとおりに調製した。濃縮ｄＡｂを、ＮＡＰ５脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）を用いて５０ｍＭホウ酸塩ｐＨ８（カップリングバッファー）にバッファー交換し、次いで、２ｍｌ ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，ＭＡ）を用いて２．３ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＦＩＴＣ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）は、製造業者の使用説明書に従ってジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で１０ｍｇ／ｍｌに希釈し、次いで、カップリングバッファー中のｄＡｂと、２４：１ ＦＩＴＣ：ｄＡｂというモル比で混合した。この反応を３０分間進行させた。この時点で、ＰＢＳで予備平衡させたＰＤ１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）を用いて、過剰の反応していないＦＩＴＣを反応物から除去し、ＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓ／ＦＩＴＣ複合体をＰＢＳで溶出した。
ＦＩＴＣ／ｄＡｂカップリング反応がうまくいったことを確認するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いてカップリングしているｄＡｂを検出した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を、１０μｇ／ｍｌ、ウェルあたり１００μｌの容量で、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ，ＮＹ）のウェルの半分に一晩コーティングした。一晩インキュベートした後、プレート全体をＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで、すべてのウェルを２％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳを用いて２時間ブロッキングした。ブロッキングした後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで、２％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで１μＭに希釈したＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓ／ＦＩＴＣとともに１時間インキュベートした。対照として、同様のＥＬＩＳＡプレートで、１μＭの対照ＦＩＴＣカップリング抗体および１μＭのカップリングしていないＤＯＭ７ｈ−８を２％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳ中でインキュベートした。さらなる対照は、ＨＳＡでコーティングしていないが２％ＴｗｅｅｎでブロッキングされたＥＬＩＳＡプレートのウェルでインキュベートした、同様の３種の希釈したタンパク質とした。インキュベートした後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで、２％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで希釈したラット抗ＦＩＴＣ抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ）の１／５００希釈物とともに１時間インキュベートした。インキュベートした後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで、２％Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで希釈した二次検出抗体（１／５０００抗ラットＩｇ ＨＲＰ複合体）とともに１時間インキュベートした。インキュベートした後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＰＢＳで１回洗浄し、ペーパー上で軽くたたいて乾燥させた。基質として、ウェルあたり１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを用いてＥＬＩＳＡを発現させ、ウェルあたり５０μｌの１Ｍ塩酸を用いて反応を停止させた。ＤＯＭ７ｈ−８とＦＩＴＣからなる複合体の存在は、複合体のＯＤ６００を、複合体を形成していない部分の任意のＯＤ６００と比較することによって確認した。
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抗ＳＡ ｄＡｂ／ペプチド複合体
多数のペプチドが治療効果を有する。ＮまたはＣ末端システインを含むモデルペプチドは抗血清アルブミンｄＡｂとカップリングできる。
この場合には、４種の異なるペプチドが用いられる：ペプチド１ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＫＫＫＫＫＫＣ（配列番号６８）、ペプチド２ＣＫＫＫＫＫＫＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号６９）、ペプチド３ＨＨＨＨＨＨＫＫＫＫＫＫＣ（配列番号７０）およびペプチド４ＣＫＫＫＫＫＫＨＨＨＨＨＨ（配列番号７１）。ペプチド１および２は、赤血球凝集素タグ（ＨＡタグ）の配列を含み、ペプチド３および４はＨｉｓタグの配列を含む。濃縮ＤＯＭ７ｈ−８ｃｙｓは実施例７に記載されるように調製する。
濃縮ｄＡｂを５ｍＭジチオトレイトールを用いて還元し、次いで、ＮＡＰ５脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）を用いてカップリングバッファー（２０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ ｐＨ６．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール）にバッファー交換する。ＤＭＳＯ中１００ｍＭのジチオジピリジンのストックからｄＡｂ溶液に添加される５ｍＭジチオジピリジンという最終濃度を用い、システインをブロッキングする（自身とのｄＡｂ二量体化を防ぐために）。ｄＡｂおよびジチオジピリジンを２０〜３０分間カップリングさせる。次いで、ＰＤ１０脱塩カラムを用いて未反応のジチオジピチジンを除去し、カップリングバッファー（２０ｍＭ ＢｉｓＴｒｉｓ ｐＨ６．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール）中にｄＡｂを溶出する。次いで、得られたタンパク質を必要とされるまで凍結する。
ペプチド１〜４を、２００μＭという濃度に水に個々に溶解し、５ｍＭ ＤＴＴを用いて還元し、次いで、ＮＡＰ５脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ）を用いて脱塩する。次いで、ペプチド−ｄＡｂカップリングが生じるよう、各ペプチドを、還元され、ブロッキングされたｄＡｂの溶液に、２０：１比で添加する。ペプチド、ｄＡｂカップリング反応の成功を確認するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて抗ＳＡ ｄＡｂ／ペプチド複合体を検出する。
ヒト血清アルブミンを、１０μｇ／ｍｌ、ウェルあたり１００μｌの容量で、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ，ＮＹ）上に一晩コーティングする。一晩インキュベートした後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで、４％Ｍａｒｖｅｌ ＰＢＳを用いて２時間ブロッキングする。ブロッキングした後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで、４％Ｍａｒｖｅｌ ＰＢＳで１μＭに希釈したＤＯＭ７ｈ−８／ペプチド複合体とともに１時間インキュベートする。対照として、同様のＥＬＩＳＡプレートで、２０μＭのカップリングしてないペプチドおよび１μＭのカップリングしていないＤＯＭ７ｈ−８を４％ＭＰＢＳ中でインキュベートする。インキュベートした後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いで、ペプチド１および２については、４％Ｍａｒｖｅｌ ＰＢＳで希釈した、ヤギ抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ）の１／２０００希釈物とともに、ＮｉＮＴＡ−ＨＲＰの１／２０００希釈物とともに（ペプチド３および４については）１時間インキュベートする。インキュベートした後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ヤギ抗ＨＡ抗体を含むウェルを、４％ＭＰＢＳで１／２０００に希釈した二次抗ヤギＨＲＰ抗体とともに１時間インキュベートする（その他のウェルは１時間ブロッキングした）。インキュベートした後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＰＢＳで１回洗浄し、次いで、ペーパー上で軽くたたいて乾燥させた。基質として３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを用いてＥＬＩＳＡを発現させ、１Ｍ塩酸を用いて反応を停止させる。ＤＯＭ７ｈ−８／ペプチド複合体の複合体の存在は、複合体のＯＤ６００を、複合体を形成していない部分の任意のＯＤ６００と比較することによって確認する。
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ＧＬＰ薬剤組成物の分析
インスリン分泌促進性薬剤の効力は、用量反応曲線からＥＣ５０値を算出することによって調べることができる。ヒトＧＬＰ−１受容体を発現する、安定にトランスフェクトされた細胞株、ＢＨＫ４６７−１２Ａ（ｔｋ−ｔｓ１３）に由来する精製した原形質膜を、ＧＬＰ−１およびペプチド類似体で刺激し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）ｃＡＭＰアッセイキットを用いてｃＡＭＰ産生の効力を測定する。
安定にトランスフェクトされた細胞株を調製し、スクリーニングのために高発現クローンを選択する。次いで、ＤＭＥＭ、５％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐおよび０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８中、５％ＣＯ２で細胞を増殖させる。
約８０％コンフルエンスの細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、ベルセンを用いて回収し、１０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を除去する。さらなるステップは氷上で行なう。細胞ペレットを１０ｍｉのバッファー１（２０ｍＭ Ｎａ−ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中、Ｕｌｔｒａｔｈｕｒａｘによって２０〜３０秒間ホモジナイズし、２０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ペレットを１０ｍｌのバッファー２（２０ｍＭ Ｎａ−ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に再懸濁する。懸濁液を２０〜３０秒間ホモジナイズし、２０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。バッファー２での懸濁、ホモジナイズおよび遠心分離をもう一度反復し、膜をバッファー２に再懸濁し、さらなる分析のための準備を整えるか、−８０℃で保存する。
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ技術によって、ペプチドによって誘導されたｃＡＭＰ産生を測定することによって機能的受容体アッセイを実施する。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ技術の基本原理は、内因性ｃＡＭＰと外因的に加えられたビオチン−ｃＡＭＰ間の競合である。ｃＡＭＰの捕捉は、アクセプタービーズと複合体を形成している特異的抗体を用いることによって達成する。形成されたｃＡＭＰをカウントし、ＡｌｐｈａＦｕｓｉｏｎマイクロプレートアナライザーを用いて測定する。ＥＣ５０値は、Ｇｒａｐｈ−Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍｅソフトウェアを用いて算出する。
ペプチドの、ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶによる分解に対する耐性は、以下の分解アッセイによって測定できる：ペプチドのアリコートを、ｐＨ７〜８の適当なバッファー（アルブミンではないバッファー）中、精製ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶのアリコートとともに３７℃で４〜２２時間インキュベートする。酵素反応はトリフルオロ酢酸を添加することによって終結させ、ペプチド分解産物を分離し、ＨＰＬＣまたはＬＣ−ＭＳ分析を用いて定量化する。混合物はＺｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ１８（３０ｎｍ孔、５ｕｍ粒子）１５０×２．１ｍｍカラム上にアプライし、０．１％トリフルオロ酢酸中アセトニトリルの直線勾配（３０分かけて０％〜１００％アセトニトリル）を用い０．５ｍｌ／分という流速で溶出する。ペプチドおよびその分解産物は、２１４ｎｍ（ペプチド結合）または２８０ｎｍ（芳香族アミノ酸）でのそれらの吸光度によってモニターでき、それらのピーク面積の積分によって定量化する。分離ピークのＭＳスペクトルを調べることができる場合は、分解パターンは、ＬＣ−ＭＳを用いて求めることができる。ペプチドＤＰＰＩＶ安定性の推定には、所与の時間での無傷／分解された化合物のパーセンテージを用いる。
ペプチドは、所与の時間での無傷の化合物のパーセンテージを基にして天然ペプチドよりも１０倍より安定である場合にＤＰＰＩＶ安定化と定義される。したがって、ＤＰＰＩＶ安定化されたＧＬＰ−１化合物は、ＧＬＰ−１（７−３７）よりも少なくとも１０倍より安定である。
アデニル酸シクラーゼの刺激
ＢＲＩＮ−ＢＤ１１細胞を、２４ウェルプレートに播種し（３×１０５個／ウェル）、４８時間培養し、次いで、トリチウム化アデニン（２ｍＣｉ）を補給した培地で１６時間プレインキュベートする。細胞を冷ハンクス緩衝塩類溶液（ＨＢＳ）で２回洗浄し、試験溶液（４００μｌ、３７℃）を加える。次いで、細胞を、１ｍＭ ＩＢＭＸおよび５．６ｍＭグルコースの存在下、ＨＢＳバッファー中、種々の濃度の（１０−１０〜１０−５Ｍ）ＧＬＰ−１化合物に曝露する（２０分、３７℃）。インキュベートした後、試験溶液を除去し、３００ｍｌの溶解溶液（５％ ＴＦＡ、３％ ＳＤＳ、未標識ＡＴＰ５ｍＭおよび未標識ｃＡＭＰ３００μＭ）を加える。ダウエックスおよびアルミナ交換樹脂を用い、記載されるとおりに（Miguel JC, et al. Biochem. Pharmacol. 2003, 65:283）、細胞用溶解物中のトリチウム化アデニンおよびＡＴＰからトリチウム化ｃＡＭＰを分離する。
インスリン分泌反応は、膵臓β細胞ＢＲＩＮ−ＢＤ１１細胞において測定できる。細胞を、２４マルチウェルプレートに１×１０５個／ウェルという密度で播種し、一晩の培養の間に接着させる。インスリン放出の急性研究には、１．０ｍｌの、１．１ｍＭグルコースを補給したクレブス−リンガー重炭酸塩バッファー（１１５ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、１．２８ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、１０ｍＭ ＮａＨＣＯおよび５ｇ／Ｌウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４）中、３７℃で、４０分のプレインキュベーションが先行する。試験インキュベーションは、５．６ｍＭグルコースおよびさまざまな濃度のＧＬＰ−１化合物（１０−１２〜１０−６Ｍ）の存在下、３７℃で実施する。２０分インキュベートした後、各ウェルからバッファーを除去し、インスリンの測定のためにアリコートを−２０℃で保存する。
肥満の糖尿病（ｏｂ／ｏｂ）マウスにおけるグルコース低下およびインスリン分泌活性
ＧＬＰ−１化合物のｉｎ ｖｉｖｏ生物活性は、１２〜１６週齢の肥満の糖尿病（ｏｂ／ｏｂ）マウスにおいて評価できる。動物を、２２±２℃、１２時間明：１２時間暗サイクルの空調管理された室内で個別に飼育する。動物には無制限に水を飲ませ、標準齧歯類維持食に連続アクセスさせる。マウスは１８時間絶食させ、生理食塩水（９ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）、グルコース（１８ｍＭ／体重１ｋｇ）を単独で、またはＧＬＰ−１化合物（２５ｎＭ／体重１ｋｇ）と組み合わせて、８ｍｌ／体重１ｋｇを腹膜内投与する。血液サンプルを、注射の直前、注射の１５分後、３０分後および６０分後に冷却したフッ化物／ヘパリン微量遠心管に採取し、得られた血漿を−２０℃で保存する。
その他のアッセイ
血漿グルコースレベルは、Ａｎａｌｏｘグルコースアナライザー（Ｈａｍｍｅｒｓｍｉｔｈ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）を用いて測定でき、これではグルコースオキシダーゼ法を用いる（Stevens JF, Clin. Chim. Acta 1971, 32:199）。インスリンレベルは、デキストランコーティングしたチャコールラジオイムノアッセイ（Flatt PR and Bailey CJ, Diabetologia 1981,20:573）によってアッセイできる。血漿グルコースおよびインスリン曲線下の増加面積（ＡＵＣ）は、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭバージョン３．０（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて算出できる。
ＧＬＰ−１化合物の活性は、ＧＬＰ−１薬剤が、ＧＬＰ−１受容体と結合し、ＧＬＰ−１受容体を介するシグナル伝達を誘導できる限り、本発明の薬剤組成物の一部であり得る。ＧＬＰ−１受容体結合およびシグナル伝達は、それぞれ、ＥＰ６１９，３２２の実施例２、３および４ならびに米国特許第5,120,712号の実施例１、２および３に記載されるものなどのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いて評価できる（参照により本明細書に組み込まれる）。
薬物動退学研究は、WO02/46227の実施例７に記載されるように実施できる（参照により本明細書に組み込まれる）。
ｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．投与後のＧＬＰ−１誘導体の半減期延長
ＧＬＰ−１類似体の半減期延長は、健常なブタにｓｃ投与した後の血漿中のその濃度をモニターすることによって測定できる。比較のために、ｓｃ．投与後のＧＬＰ−１（７−３７）（ＧＬＰ−１の天然活性型、対照として用いる）の血漿中の濃度を追跡できる。
試験物質を皮下または静脈内投与に適したビヒクルに溶解する。濃度を調整し、投与容量を約１ｍｌとする。研究は、Ｅｌｌｅｇａａｒｄ Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｉｇｓ ＡｐＳから得た１２頭の雄ゲッティンゲン（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ）ミニブタで実施する。約１０日の順化期間を認め、その後、動物を研究に参加させる。順化期間の開始時にミニブタは約５ヶ月齢であり、８〜１０ｋｇの体重範囲にある。
研究は、室温を２１〜２３℃、相対湿度を約５０％に設定した適した動物室において実施する。部屋は１２時間明および１２時間暗というサイクルを与えるよう照明をつける。明は６．００〜１８．００時とする。動物は、寝床として麦わらを入れた囲いの中で飼育し、各囲いの中に６頭一緒にする。動物は、研究の間、国内品質の飲料水に自由にアクセスするが、投与の前日の約１６．００時から投与の約１２時間後まで絶食させる。到着時および投与日に動物の体重を測る。
動物には単回静脈内注射または皮下注射を与える。皮下注射は首の右側の、耳から約５〜７ｃｍ、首の中央から７〜９ｃｍに与える。注射は、０．５ｃｍのニードルが導入されるのを可能にする、ニードル上のストッパーを用いて与える。各試験物質を、３頭の動物に与える。各動物に２ｎｍｏｌ／体重１ｋｇの用量を与えた。１週間につき６頭の動物に投与し、残りの６頭は回復させたままとする。
各動物から全血漿濃度−時間プロファイルを得る。血液サンプルは以下のスケジュールに従って回収する。静脈内投与後：投与前（０）、注射後０．１７（１０分）、０．５、１、２、４、６、８、１２、２４、４８、７２、９６および１２０時間。皮下投与後：投与前（０）、注射後０．５、１、２、４、６、８、１２、２４、４８、７２、９６および１２０時間。
各サンプリング時間に、各動物から２ｍｌの血液を採取する。血液サンプルは頸静脈から採る。血液サンプルは、ＧＬＰ−１類似体の酵素分解を防ぐために安定化用バッファーを含有する試験管中に採取する。血漿を直ちにマイクロニックチューブに移す。約２００μｌの血漿を各マイクロニックチューブに移す。血漿はアッセイされるまで−２０℃で保存した。血漿サンプルは、イムノアッセイを用いてＧＬＰ−１類似体含量についてアッセイする。
血漿濃度−時間プロファイルを、非コンパートメント薬物動退分析によって分析する。各場合において以下の薬物動退パラメーターを算出する：ＡＵＣ、ＡＵＣ／用量、ＡＵＣ％Ｅｘｔｒａｐ、Ｃｍａｘ、ｔｍａｘ、λｚ、ｔ１／２、ＣＬ、ＣＬ／ｆ、Ｖｚ、Ｖｚ／ｆおよびＭＲＴ。
本発明の組成物はまた、デンマーク・ランドレス（Ｄａｎｉｓｈ Ｌａｎｄｒａｃｅ）ブタにおいて試験できる
ブタ（５０％デュロック、２５％ヨークシャー、２５％デンマーク・ランドレス、約４０ｋｇ）を実験の開始から絶食させる。各ブタに、５０ｐＭ等張液（５ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４、０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０（Ｍｅｒｃｋ）、４５ｍｇ／ｍｌマンニトール（発熱物質不含、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ））中、体重１ｋｇあたり０．５ｎｍｏｌの試験組成物を投与する。血液サンプルは頸静脈中のカテーテルから採取する。５ｍｌの血液サンプルを、１７５μｌの以下の溶液を入れた冷却したガラス中に注ぎ入れる：０．１８Ｍ ＥＤＴＡ、１５０００ＫＩＥ／ｍｌアプロチニン（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）および０．３０ｍＭ バリン−ピロリジド（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、ｐＨ７．４。３０分以内に、サンプルを５〜６０００＊ｇで１０分間遠心分離する。温度は４℃で維持する。上清を異なるガラスにピペットで入れ、使用まで−２０℃で維持する。
ペプチドの血漿濃度は、種々のモノまたはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、またはＲＩＡによって調べる。抗体の選択はＧＬＰ−１類似体に応じて変わる。血漿のピーク濃度が達成される時間は、選択される個々のＧＬＰ−１類似体に応じて広い制限内で変わる。
９６ウェルマイクロタイタープレートにおけるサンドイッチＥＬＩＳＡの一般的なアッセイプロトコール
コーティングバッファー（ＰＢＳ）：リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２
洗浄バッファー（ＰＢＳ−洗浄）：リン酸緩衝生理食塩水、０．０５％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２
アッセイバッファー（ＢＳＡ−バッファー）：リン酸緩衝生理食塩水、１０ｇ／ｌ ウシ血清アルブミン（Ｆｌｕｋａ０５４７７）、０．０５％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２
ストレプトアビジンバッファー：リン酸緩衝生理食塩水、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．２
標準：血漿マトリックス中の個々の化合物
Ａ−ＴＮＰ：ナンセンス抗体
ＡＭＤＥＸ：ストレプトアビン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｎ）−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＲＰＮ４４０１Ｖ）
ＴＭＢ基質：３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（＜０．０２％）、過酸化水素
アッセイは以下のとおりに実施できる（容量／ウェル）：
１）１００μｌの、ＰＢＳバッファー中５μｇ／ｍｌの捕捉抗体を用いてコーティングし、４℃で一晩インキュベートし、５回ＰＢＳ洗浄し、最後の洗浄液で最小３０分間ブロッキングし、次いで、プレートを空にする◎
２）２０μｌのサンプル＋１００μｌの、１０ｕｇ／ｍｌのＡ−ＴＮＰを含むＢＳＡバッファー中、１μｇ／ｍｌのビオチン化検出抗体を、振盪機上で、室温で２時間インキュベートし、５回のＰＢＳ洗浄を行ない、次いで、プレートを空にする◎
３）１００μｌの、ストレプトアビジンバッファー中、ＡＭＤＥＸ１：８０００を、振盪機上、室温で４５〜６０分インキュベートし、５回のＰＢＳ洗浄を行ない、次いで、プレートを空にする◎
４）１００μｌのＴＭＢ基質を、振盪機上で、室温でインキュベートし、１００μｌの４Ｍ Ｈ３ＰＯ４を用いて反応を停止する。４５０ｎｍの吸光度を読み取り、参照として６２０ｎｍを用いる。サンプルの濃度は、標準曲線から算出できる。
ＲＩＡの一般的なアッセイプロトコール
ＤＢバッファー：８０ｍＭリン酸塩バッファー、０．１％ヒト血清アルブミン、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．６ｍＭ チオマーサル、ｐＨ７．５
ＦＡＭバッファー：４０ｍＭリン酸塩バッファー、０．１％ヒト血清アルブミン、０．６ｍＭチオマーサル、ｐＨ７．５
チャコール：４０ｍＭリン酸塩バッファー、０．６ｍＭチオマーサル、１６．７％ウシ血漿、１５ｇ／ｌ活性炭、ｐＨ７．５（懸濁液を最小１時間混合し、その後４℃で使用する）
標準：血漿マトリックス中の個々の化合物
アッセイはミニソープチューブ１２×７５ｍｍ（容量／チューブ）において以下のとおりに実施する：
Figure 0005185624
混合し、４℃で３０分インキュベートする。３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、直後に、上清を新規チューブに移し、ストッパーで閉じ、γカウンターで１分間カウントする。サンプルの濃度を、個々の標準曲線から算出する。
ＧＬＰ−１ラジオレセプターアッセイ（ＲＲＡ）
ＧＬＰ−１ラジオレセプターアッセイとは、ＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒイメージング粒子を用いる放射測定リガンド結合アッセイである。アッセイは、ＧＬＰ−１受容体、未標識ＧＬＰ−１類似体、１２５Ｉで標識したヒトＧＬＰ−１およびコムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）でコーティングしたＰＳ ＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒ粒子を含有する膜断片からなる。非放射性および１２５Ｉ−標識ＧＬＰ−１は、受容体との結合について競合する。ＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒ粒子を添加すると、それらはＷＧＡ−残基を介して膜断片上の炭水化物残基と結合する。１２５Ｉ−分子とＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒ粒子間の近接が、粒子からの光の放射を引き起こす。ＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒは放射された光をイメージングし、サンプル中に存在するＧＬＰ−１類似体の量と可逆的に相関がある。
試薬および材料：
動物血漿の前処理：動物血漿を５６℃で４時間熱処理し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。その後、Ｖａｌ−Ｐｙｒ（１０μＭ）およびアプロテニン（ａｐｒｏｔｅｎｉｎ）（５００ＫＩＥ／ｍｌ）を加え、使用まで−１８℃で保存する。
ＧＬＰ−１類似体標準：ＧＬＰ−１類似体を熱処理血漿にスパイクして約１μＭ〜１ｐＭの範囲の希釈系列を製造する。
ＧＬＰ−１ ＲＲＡアッセイバッファー：２５ｍＭ Ｎａ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％オボアルブミン、０．００３％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．００５％バシトラシン、０．０５％ ＮａＮ３。
ＧＬＰ−１受容体懸濁液：ＧＬＰ−１受容体膜断片は、ヒト膵臓ＧＬＰ−１受容体を発現する新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞から精製する。使用まで−８０℃で保存する。
ＷＧＡがカップリングしているポリスチレンＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒイメージングビーズ（ＲＰＮＱ０２６０，Ａｍｅｒｓｈａｍ）：ビーズは、ＧＬＰ−１ ＲＲＡアッセイバッファーで１３．３ｍｇ／ｍｌという濃度に再構成する。次いで、ＧＬＰ−１受容体膜懸濁液を加え、使用前に少なくとも１時間低温（２〜８℃）でインキュベートする。
材料
１２５Ｉ−ＧＬＰ−１（７−３６）アミド（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）。使用まで−１８℃で保存する。エタノール９９．９容積％（Ｄｅ Ｄａｎｓｋ Ｓｐｒｏｔｆａｂｒｉｋｋｅｒ Ａ／Ｓ）。使用まで−１８℃で保存する。ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｓｏｌｖｉｎｅｒｔ０．４５μｍ疎水性ＰＴＦＥプレート（ＭＳＲＰＮ０４５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）
ポリプロピレン３８４ウェルプレート（カタログ番号７８１０７５、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）。
装置：
水平プレート混合
標準スインギングバケット型マイクロタイタープレートローターアセンブリーを備える遠心機
ＵｌｔｒＶａｐ，ドライダウンサンプル濃縮機（Ｐｒｏｖａｉｒ）。
ＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒ（登録商標）多様式イメージングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）
手順：
サンプル調製：ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｓｏｌｖｉｎｅｒｔフィルタープレートを、化学的に適合するレシーバープレート（すなわち、ポリプロピレンプレート）に乗せて濾過液を回収する。
１５０μｌの氷冷エタノール９９．９％を、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ Ｓｏｌｖｉｎｅｒｔフィルタープレートの空のウェルに加え、続いて５０μｌの標準物質または血漿サンプルを加える。フィルタープレート上に保存蓋を置き、水平プレートミキサー上で、１８〜２２℃で１５分間インキュベートする。
蓋をつけた、組み立てたフィルターおよびレシーバープレートを標準スインギングバケット型マイクロタイタープレートローターアセンブリーに入れる。１５００ｒｐｍで２分間、濾過液をレシーバープレートの空のウェルに回収する。加熱Ｎ２（４０℃）を用いるＵｌｔｒａＶａｐを用いて濾過液を１５分間ドライダウンする。各ウェルに１００μｌのＧＬＰ−１ ＲＲＡアッセイバッファーを加えて乾燥材料を再構成する。これを水平ミキサー上で５分間インキュベートする。
ＧＬＰ−１ラジオレセプターアッセイ：以下のピペッティングスキームおよび白色ポリスチレン３８４ウェルプレートを用いる：
１．３５μｌのＧＬＰ−１ ＲＲＡアッセイバッファー
２．５μｌの再構成された濾過液
３．１０μｌの１２５Ｉ−ＧＬＰ−１（７−３６）アミド。保存用液は、使用前にＧＬＰ−１ ＲＲＡアッセイバッファーで２０，０００ｃｐｍ／ウェルに希釈した。
４．１５μｌの、ＷＧＡポリスチレンＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒイメージングビーズ（０．２ｍｇ／ウェル）にプレコーティングされるＧＬＰ−１受容体膜断片（０．５μｇ／ウェル）
プレートを密閉し、１８〜２２℃で一晩インキュベートする。各ウェルからの光の放射を、ＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒ多様式イメージングシステムを１０分間用いることによって検出する。
クローニングしたヒトＧＬＰ−１受容体を発現する細胞株におけるｃＡＭＰ形成の刺激
ヒトＧＬＰ−１受容体を発現する、安定にトランスフェクトされた細胞株、ＢＨＫ４６７−１２Ａ（ｔｋ−ｔｓ１３）に由来する精製した原形質膜を、ＧＬＰ−１およびペプチド類似体を用いて刺激し、ｃＡＭＰ産生の効力を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 製のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）ｃＡＭＰアッセイキットを用いて測定する。
安定にトランスフェクトされた細胞株を調製し、スクリーニングのために高発現クローンを選択する。ＤＭＥＭ、５％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐおよび０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８中、５％ＣＯ２で細胞を増殖させる。
約８０％コンフルエンスの細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、ベルセンを用いて回収し、１０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を除去する。さらなるステップはすべて氷上で行なう。細胞ペレットを１０ｍｌのバッファー１（２０ｍＭ Ｎａ−ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中、Ｕｌｔｒａｔｈｕｒａｘによって２０〜３０秒間ホモジナイズし、２０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ペレットを１０ｍｌのバッファー２（２０ｍＭ Ｎａ−ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に再懸濁する。懸濁液を２０〜３０秒間ホモジナイズし、２０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。バッファー２での懸濁、ホモジナイズおよび遠心分離をもう一度反復し、膜をバッファー２に再懸濁し、さらなる分析のための準備を整えるか、−８０℃で保存する。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ技術によって、ペプチドによって誘導されたｃＡＭＰ産生を測定することによって機能的受容体アッセイを実施する。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ技術の基本原理は、内因性ｃＡＭＰと外因的に加えられたビオチン−ｃＡＭＰ間の競合である。ｃＡＭＰの捕捉は、アクセプタービーズと複合体を形成している特異的抗体を用いることによって達成する。形成されたｃＡＭＰをカウントし、ＡｌｐｈａＦｕｓｉｏｎマイクロプレートアナライザーを用いて測定する。ＥＣ５０値は、Ｇｒａｐｈ−Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍｅソフトウェアを用いて算出する。
ＧＡＳリーダーを用いる、グルカゴン様ペプチド１とｉＤｏｍ７ｈ−８の遺伝子融合体の細菌発現
位置９のグルタミン酸がプロリンで置換されたＧＬＰ−１（７−３７）（［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１（７−３７））を、ｉＤＯＭ７ｈ−８（ＣＤＲ３におけるＫａｂａｔナンバリングによるＰ９６Ｅ突然変異）を含む融合体として、ＧＡＳリーダー（ＷＯ０５／０９３０７４参照のこと）とともにｐＥＴ １２ａベクターにクローニングした。ＧＬＰ−１グルタミン酸のプロリン９への置換は、融合体のＧＬＰ−１部分に、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）切断による分解に対する耐性を付与するために行なわれた(Brian D. Green et al. (2003) Metabolic Stability, Receptor Binding, cAMP Generation, Insulin secretion and Antihyperglycaemic Activity of Novel N-terminal Glu9-substituted Analogues of Glucagon-like-peptide-1: Biol. Chem. (384) 1543-1555)。全部で、３種の構築物を作製した。１種はリンカーのないもの、１種は［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１（７−３７）とｉＤＯＭ７ｈ−８の間にＰＳＳアミノ酸を含むもの、１種は［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１（７−３７）とｉＤＯＭ７ｈ−８の間にＰＳＳＧＡＰアミノ酸を含むものである（Ｄｏｍ７ｈ−８アルブミン結合形として図１６に示される）。発現は、オーバーナイトの発現自己誘導ＴＢレディミックス（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用い、３０℃で４８時間、ＢＬ２１ ＤＥ３ Ｐｌｙｓ Ｓ細胞において行ない、その後、遠心分離によって上清を回収した。プロテインＬ−アガロースでの親和性捕捉を用いて上清から［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１（７−３７）ｉＤｏｍ７ｈ−８融合体を精製した。次いで、１０カラム容積のＰＢＳで樹脂を洗浄し、０．１ＭグリシンｐＨ２を用いて、結合しているタンパク質を溶出した。次いで、グリシンバッファー中の［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１（７−３７）−ｉＤｏｍ７ｈ−８融合体を、２０ｍＭのクエン酸バッファー、ｐＨ６．２を用いて予備平衡させた陽イオン交換カラム（１ｍｌ Ｓ−カラム、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に載せた。溶出は、１Ｍ ＮａＣｌを補給した同バッファーの０〜５０％勾配を用いて行なった。ピーク
を回収し、ＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動によってタンパク質の大きさを調べた。予想される大きさのタンパク質のピークをプールし、ＰＢＳにバッファー交換した。質量分析およびＮ末端配列決定によってタンパク質の同一性を確認した。
［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＰＳＳＧＡＰ−ｉＤＯＭ７ｈ−８融合体のＧＬＰ−１活性測定
［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＰＳＳＧＡＰ−ｉＤＯＭ７ｈ−８融合体がＧＬＰ−１活性を示すことを確認するために、融合体を２種の異なる生物学的アッセイに付した。第１のアッセイでは、ＲＩＮｍ５ｆラットインスリノーマ細胞株（Ｇａｄｚａｒらによって、ラットのＸ線誘導移植可能インスリノーマから１９８０年に開発された）を、種々の濃度（１０ｐＭ〜０．１μＭ）のＧＬＰ−１および［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−ｌ（７−３７）−ＰＳＳＧＡＰ−ｉＤＯＭ７ｈ−８融合体とともに６０分間インキュベートした。さらに、エキセンディン−４、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる分解に対して耐性のＧＬＰ−１類似体の単一点アッセイと、対照としての単一点バッファーのみのアッセイを加えた。ＲＩＮｍ５ｆラット細胞はグルコースに対してあまり反応しなかったが、栄養素または非分泌促進物質に曝露された場合にはそれらはβ細胞と同様の分泌反応を示す。したがって、細胞増殖に対する化合物の作用は、細胞増殖ＥＬＩＳＡシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）を用いて増殖細胞におけるＤＮＡ合成の間の５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の組み込みレベルを測定することによって評価した、図１７参照のこと。ＤＮＡレベルを測定するためにＯＤ４５０を用いたところ、最大１００ｎＭという濃度の融合体まで［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＰＳＳＧＡＰ−ｉＤＯＭ７ｈ−８融合体のレベルが増大するにつれ、ＤＮＡレベルの用量依存性増加があった。ＧＬＰ−１はまた、予測された用量依存性反応を示した。
第２のアッセイでは、ＲＩＮｍ５ｆ細胞を、５．６ｍＭグルコース中、種々の濃度（１０ｐＭ〜０．１μＭ）のＧＬＰ−１および［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−ｌ（７−３７）−ＰＳＳＧＡＰ−ｉＤＯＭ７ｈ−８融合体とともに６０分間インキュベートした。さらに、エキセンディン−４、ＤＰＰＩＶによる分解に対して耐性のＧＬＰ−１類似体の単一点アッセイと、対照としての単一点クレブス−リンガー重炭酸塩バッファー（ＫＲＢ）のみのアッセイを加えた。ＧＬＰ−１、３Ａ２３またはエキセンディン−４を補給したＫＲＢバッファーを用いて３７℃で６０分間インキュベートした後、インスリン分泌をアッセイした。培地を回収し、遠心分離し、ラジオイムノアッセイを用いて上清をインスリン濃度についてアッセイした。インスリン濃度は各ウェル内の細胞数に対して標準化した。次いで、インスリン濃度（ｎｇ／ｍｌ／時で測定される）を化合物濃度に対してプロットした。最大１０ｎＭという融合体の濃度まで増大する用量の［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＰＳＳＧＡＰ−ｉＤＯＭ７ｈ−８融合体で、インスリン放出が用量依存性に増大した（図１８参照のこと）。これは、ＧＬＰ−１単独に関する公開されたデータとよく一致する。
ＯＭＰ−Ｔリーダーを用いる、グルカゴン様ペプチド１とｉＤｏｍ７ｈ−８の遺伝子融合体の細菌発現
実施例１１において記載したものと同様の３種の構築物（１種はリンカーのないもの、１種は［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１（７−３７）とｉＤＯＭ７ｈ−８の間にＰＳＳアミノ酸を含むもの、１種は［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１（７−３７）とｉＤＯＭ７ｈ−８の間にＰＳＳＧＡＰアミノ酸を含むもの）を、ＯＭＰ−Ｔリーダーを用いて再度作製した。明確にするために、構築物中の要素の順序は、ＯＭＰ−Ｔリーダー、［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１、リンカー（適切な場合には）およびｉＤｏｍ７ｈ−８とした。発現は、ＯＤ１６で０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導されたＴＢ培地中、２５℃で４時間、ＢＬ２１ ＤＥ３ Ｐｌｙｓ Ｓ細胞において行い、その後、遠心分離によって細胞ペレットを回収した。次いで、分泌されたタンパク質をペリプラズム調製によって回収した。プロテインＬ−アガロースでの親和性捕捉を用いて、ペリプラズム画分からＧＬＰ−１ ｉＤｏｍ７ｈ−８融合体を精製した。次いで、１０カラム容積のＰＢＳで樹脂を洗浄し、結合しているタンパク質を０．１ＭグリシンｐＨ２で溶出した。次いで、グリシンバッファー中の［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１（７−３７）融合体を、２０ｍＭのクエン酸バッファー、ｐＨ６．２を用いて予め平衡化した陽イオン交換カラム（１ｍｌ Ｓ−カラム、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に載せた。溶出は、１Ｍ ＮａＣｌを補給した同バッファーの０〜５０％勾配を用いて行った。この場合には、２０ｍＭクエン酸バッファー、ｐＨ６．２（０％ＮａＣｌ）でカラムを洗浄した結果、予測されるサイズのバンドが流れてしまったので、５Ｋ ビバスピンカラム（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてこれを濃縮した。
グルカゴン様ペプチド−１とｉＤｏｍ７ｈ−８の遺伝子融合体のピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現
［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−Ｉ−ＰＳＳ−ｉＤＯＭ７ｈ−８融合構築物（図１６ｂに記載されるとおりであるがｉＤｏｍ７ｈ−８を用いるもの）を、単独およびＮ末端ＥＡＥＡ延長部分とともに、の双方でｐＰｌＣｚαベクターにクローニングし、ピキア・パストリスＫＭ７１ｈに形質転換する。（i）３０℃で４日かけてメタノール誘導を用いて、および（ii）２５℃で２日かけてメタノール誘導を用いてタンパク質を発現させる。上清を遠心分離によって回収し、タンパク質をＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上での大きさについて調べる。
実施例１０においておよび実施例１２において記載されるように、融合体はＳＤＳ Ｐａｇｅによって正しい大きさを有し、ＧＬＰ−１アッセイにおいて活性であると予測される。
ＢＬ２１ ＤＥ３封入体におけるグルカゴン様ペプチド−１とｉＤｏｍ７ｈ−８の大腸菌発現
実施例１１に記載されるものと同様の融合体を、細胞質におけるタンパク質発現のために設計されたｐＥＴ２１発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングする。場合により、プロテアーゼ切断部位を構築物中、［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１（７−３７）の犠牲的Ｎ末端とＨＡＰ．．．の間に含める。これにより、タンパク質が、完全に天然のＮ末端を確実に消化されるようにすることが可能となる。これに使用できる酵素としては、第Ｘａ因子、トロンビンまたはＤＰＰＩがあげられる。次いで、タンパク質は、ＩＰＴＧ誘導された際にＢＬ２１（ＤＥ３）細胞において高レベルで発現され、細胞内封入体に蓄積する。ＢＬ２１細胞から封入体を単離し、グアニジンＨＣｌに可溶化する。還元した後、封入体を酸化還元シャッフリングバッファーシステム中で再フォールディングさせる(Buchner, J., Pastan, I. and Brinkmann, U. (1992). A method for increasing the yield of properly folded recombinant fusion proteins. Anal. Biochem. 205, 263-270。再フォールディング後、タンパク質を透析し、５Ｋ ビバスピンカラム（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）において濃縮し、Ｓ−カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製する。
実施例１０においておよび実施例１２において記載されるように、融合体はＳＤＳ Ｐａｇｅによって正しい大きさを有し、ＧＬＰ−１アッセイにおいて活性であると予測される。
グルカゴン様ペプチド１およびＤｏｍ７ｈ−８の哺乳類発現
［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１−ＰＳＳ−ＤＯＭ７ｈ−８融合構築物（図１６ｂに記載されるとおり）を、翻訳されたタンパク質の培地への分泌を促進するためのマウス分泌シグナルペプチドを用いてＰｃＤＮＡ（−）ベクターにクローニングする。アルカリ溶解（ｍｅｇａ ｐｒｅｐ ｋｉｔ，ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を用い、大腸菌において１ｍｇのＤＮＡを調製し、一過性のタンパク質発現のために、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）
で増殖させた１．５ＬのＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトする。３７℃で５日間培養物をインキュベートすることによってタンパク質を発現させ、遠心分離によって上清（発現されたタンパク質を含む）を回収する。プロテインＬ−アガロースでの親和性捕捉を用いて、ペリプラズム画分から［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１−ＰＳＳ−ＤＯＭ７ｈ−８融合体を精製する。次いで、１０カラム容積のＰＢＳで樹脂を洗浄し、０．１ＭグリシンｐＨ２を用いて結合しているタンパク質を溶出する。次いで、グリシンバッファー中のタンパク質を、２０ｍＭのクエン酸バッファー、ｐＨ６．２を用いて予備平衡させた陽イオン交換カラム（１ｍｌ Ｓ−カラム、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に載せた。溶出は、１Ｍ ＮａＣｌを補給した同バッファーの０〜５０％勾配を用いて行なった。次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで正しい大きさのタンパク質を、５Ｋビバスピンカラム（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて濃縮し、生物学的アッセイのためにバッファーをＰＢＳに交換する。
Ｄｏｍ７ｈ−８と融合しているペプチドＹＹの大腸菌発現
ペプチドＹＹ（３−３６）（ＰＹＹ：アミノ酸配列番号１６７および核酸配列番号１６８ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ）は、ヒトにおいて食物摂取を阻害し、血漿において短い半減期を有する（１０〜３０分）。食事に応答して放出され、弓状核においてＹ２Ｒを介して作用し、食物摂取を生理学的に調節する。ＰＹＹを、ＤＯＭ７ｈ−８に隣接してｐＥＴ ＧＡＳベクター（ＷＯ０５０９３０７４）にクローニングする（ＤＯＭ７ｈ−８のペプチドＣ末端およびＮ末端をそれぞれ示す、図２０ａおよび２０ｂを参照のこと）。発現は、０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導されたＴＢ培地中、２５℃で４時間、ＢＬ２１ ＤＥ３ Ｐｌｙｓ Ｓ細胞において行ない、その後、遠心分離によって細胞ペレットを回収する。次いで、分泌されたタンパク質をペリプラズム調製によって回収する。プロテインＬ−アガロースでの親和性捕捉を用いて、ペリプラズム画分からＰＹＹ ＤＯＭ７ｈ−８融合体を精製する。次いで、１０カラム容積のＰＢＳで樹脂を洗浄し、結合しているタンパク質を０．１ＭグリシンｐＨ２で溶出し、イオン交換によってさらに精製する。次いで、精製タンパク質を、透析によってＰＢＳにバッファー交換し、５Ｋ ビバスピンカラム（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）において濃縮し、生物学的アッセイに付して、記載されるようにｃＡＭＰ放出の刺激を測定する(Goumain et al. (2001) The Peptide YY-Preferring Receptor Mediating Inhibition of Small Intestinal Secretion Is a Peripheral Y2 Receptor: Pharmacological Evidence and Molecular Cloning: Molecular Pharmacology: 60 124-134)。手短に言えば、記載されるように(Servin et al. (1989): Peptide-YY and neuropeptide-Y inhibit vasoactive intestinal peptide-stimulated adenosine 3',5'-monophosphate production in rat small intestine: structural requirements of peptides for interacting with PYY-preferring receptors. Endocrinology 124: 692-700)、２００μｇタンパク質／ｍｌの単離された腸の腺窩細胞を、連続攪拌下、１．４％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、０．１％バシトラシンおよび０．２ｍＭ ３−イソブチル−ｌ−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．０ ０．５ｍｌ中１５℃で４５分間インキュベートする。腸細胞（例えば、ＶＩＰ）に、ＰＹＹ単独またはＰＹＹ−Ｄｏｍ７ｈ−８融合体を、ｃＡＭＰ産生の強力な生理学的刺激薬とともに加える。反応は細胞を加えることによって開始し、５０μｌの１１Ｍ過塩素酸を添加することによって４５分後に停止する。４，０００ｇで１０分間遠心分離した後、上清中に存在するｃＡＭＰをコハク酸化し、記載されるように(Laburthe et al., (1982) Alpha-adrenergic inhibition of cyclic AMP accumulation in epithelial cells isolated from rat small intestine. Biochim Biophys Acta 721:101-108)ラジオイムノアッセイによってその濃度を測定する。
融合体は予測される大きさであり、非融合対照と同等のＰＹＹ活性を示すと予測される。
Ｄｏｍ７ｈ−８ペプチドＹＹ、ＧＬＰ−１融合体の大腸菌発現
［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＤＯＭ７ｈ−８−ＰＹＹ（図１９ｃ参照のこと）融合体を、ｐＥＴ ＧＡＳベクターにクローニングし、次いで、実施例１７に記載されるＤｏｍ７ｈ−８ ＰＹＹについて記載したように発現させる。精製した後、それぞれ実施例１７および実施例１２に記載されるアッセイに従って、融合体をＰＹＹとＧＬＰ−１双方の生物活性についてアッセイする。
融合体は予測される大きさであり、非融合対照と同等のＰＹＹ活性およびＧＬＰ−１活性を示すと予測される。
本発明は、その好ましい実施形態を参照して詳しく示され、説明されているが、当業者には、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形および詳細の種々の変更をそれになすことができるということは理解されよう。
図１Ａは、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）との結合によって選択された３種のＶκのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。アラインメントしたアミノ酸配列は、ＤＯＭ７ｍ−１６とも呼ばれるＭＳＡ１６（配列番号１）、ＤＯＭ７ｍ−１２とも呼ばれるＭＳＡ１２（配列番号２）およびＤＯＭ７ｍ−２６とも呼ばれるＭＳＡ２６（配列番号３）と表されるＶκに由来するものである。 図１Ｂは、ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）との結合によって選択された６種のＶκのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。アラインメントしたアミノ酸配列は、ＤＯＭ７ｒ−１（配列番号４）、ＤＯＭ７ｒ−３（配列番号５）、ＤＯＭ７ｒ−４（配列番号６）、ＤＯＭ７ｒ−５（配列番号７）、ＤＯＭ７ｒ−７（配列番号８）およびＤＯＭ７ｒ−８（配列番号９）と表されるＶκに由来するものである。 図１Ｃは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）との結合によって選択された６種のＶκのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。アラインメントしたアミノ酸配列は、ＤＯＭ７ｈ−２（配列番号１０）、ＤＯＭ７ｈ−３（配列番号１１）、ＤＯＭ７ｈ−４（配列番号１２）、ＤＯＭ７ｈ−６（配列番号１３）、ＤＯＭ７ｈ−１（配列番号１４）、ＤＯＭ７ｈ−７（配列番号１５）と表されるＶκ由来のものである。 図１Ｄは、ヒト血清アルブミンとの結合によって選択された７種のＶＨのアミノ酸配列およびコンセンサス配列（配列番号２３）のアラインメントを示す図である。アラインメントした配列は、ＤＯＭ７ｈ−２２（配列番号１６）、ＤＯＭ７ｈ−２３（配列番号１７）、ＤＯＭ７ｈ−２４（配列番号１８）、ＤＯＭ７ｈ−２５（配列番号１９）、ＤＯＭ７ｈ−２６（配列番号２０）、ＤＯＭ７ｈ−２１（配列番号２１）およびＤＯＭ７ｈ−２７（配列番号２２）と表されるＶκに由来するものである。 図１Ｅは、ヒト血清アルブミンおよびラット血清アルブミンとの結合によって選択される３種のＶκのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。アラインメントしたアミノ酸配列は、ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号２４）、ＤＯＭ７ｒ−１３（配列番号２５）およびＤＯＭ７ｒ−１４（配列番号２６）と表されるＶκに由来するものである。 図２Ａおよび２Ｂは、ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ（ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａとも呼ばれる）およびＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６（ＩＬ−ｌｒａ／ＤＯＭ７ｍ−１６とも呼ばれる）融合体をそれぞれ発現させるために用いられるベクターの概略マップを示す図である。 図２Ｃ〜２Ｄは、ＩＬ−ＩｒａＭＳＡ１６融合体（ＩＬ−Ｉｒａ／ＤＯＭ７ｍ−１６とも呼ばれる）をコードするヌクレオチド配列（配列番号２７）および融合体のアミノ酸配列（配列番号２８）を例示する図である。 図２Ｃ〜２Ｄは、ＩＬ−ＩｒａＭＳＡ１６融合体（ＩＬ−Ｉｒａ／ＤＯＭ７ｍ−１６とも呼ばれる）をコードするヌクレオチド配列（配列番号２７）および融合体のアミノ酸配列（配列番号２８）を例示する図である。 図２Ｅ〜２Ｆは、ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ融合体（ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａとも呼ばれる）をコードするヌクレオチド配列（配列番号２９）および融合体のアミノ酸配列（配列番号３０）を例示する図である。 図２Ｅ〜２Ｆは、ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ融合体（ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａとも呼ばれる）をコードするヌクレオチド配列（配列番号２９）および融合体のアミノ酸配列（配列番号３０）を例示する図である。 図２Ｇ〜２Ｈは、血清アルブミンと結合しなかったダミーＩＬ−１ｒａ融合体をコードするヌクレオチド配列（配列番号３１）および融合体のアミノ酸配列（配列番号３２）を例示する図である。 図２Ｇ〜２Ｈは、血清アルブミンと結合しなかったダミーＩＬ−１ｒａ融合体をコードするヌクレオチド配列（配列番号３１）および融合体のアミノ酸配列（配列番号３２）を例示する図である。 図３Ａは、ＩＬ−１が、ＨｅＬａ細胞によるＩＬ−８の産生を誘導することを示す、およびＥＬＩＳＡアッセイにおいてＩＬ−８が検出される機構を示す例を示す図である。図３Ｂは、ＩＬ−１ｒａ（◆）、ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ（■）およびＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６（△）が、ＩＬ−１によって誘導される、培養ＭＲＣ−５細胞によるＩＬ−８の分泌を各々阻害したことを示すグラフを示す図である。観察された阻害は、ＩＬ−１ｒａ、ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａおよびＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６について用量依存性であった。 図４Ａ〜４Ｃは、ＩＬ−１ｒａ（◆）、ＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａ（■）の双方とも、マウス血清アルブミンを含まない（４Ａ）、５％マウス血清アルブミンを含む（４Ｂ）または１０％マウス血清アルブミンを含む（４Ｃ）アッセイにおいて、ＩＬ−１によって誘導される、培養ＭＲＣ−５細胞によるＩＬ−８の分泌を阻害したということを示すグラフを示す図である。観察された阻害は、試験したすべての条件下で、ＩＬ−１ｒａおよびＭＳＡ１６ＩＬ−１ｒａについて用量依存性であった。 ＭＳＡ１６ＩＬ１−ｒａ融合体およびＩＬ−１ｒａＭＳＡ１６融合体は双方とも血清アルブミンと結合したが、ダミーＩＬ１−ｒａ融合体は結合しなかったということを実証するＥＬＩＳＡの結果の図式的提示を示す図である。 図６Ａはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とのクローンＤＯＭ７ｈ−１結合（６Ａ）の、ＢＩＡＣＯＲＥ親和性データを示すセンソグラムおよび表を示す図である。 図６Ａ−１の続き。 図６ＢはＨＳＡとのＤＯＭ７ｈ−７結合（６Ｂ）の、ＢＩＡＣＯＲＥ親和性データを示すセンソグラムおよび表を示す図である。 図６Ｂ−１の続き。 図６Ｃはラット血清アルブミン（ＲＳＡ）とのＤＯＭ７ｒ−１結合の、ＢＩＡＣＯＲＥ親和性データを示すセンソグラムおよび表を示す図である。 図６Ｃ−１の続き。 ＤＯＭ７ｈ−１、ＤＯＭ７ｒ−１、ＤＯＭ７ｈ−２、ＤＯＭ７ｒ−３、ＤＯＭ７ｈ−７、ＤＯＭ７ｈ−８、ＤＯＭ７ｒ−８、ＤＯＭ７ｒ−１３、ＤＯＭ７ｒ−１４、ＤＯＭ７ｍ−１６、ＤＯＭ７ｈ−２２、ＤＯＭ７ｈ−２３、ＤＯＭ７ｈ−２６、ＤＯＭ７ｒ−１６、ＤＯＭ７ｍ−２６、ＤＯＭ７ｒ−２７およびＤＯＭ７Ｒ−３１の、それらが結合する血清アルブミンに対する親和性を示す表を示す図である。 図８ＡはＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＮＭ＿１７３８４２として寄託されるヒトインターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）をコードする核酸のヌクレオチド配列（配列番号３３）を例示する図である。この核酸は、位置６５で始まるオープンリーディングフレームを有する。図８Ｂは、図８Ａ（配列番号３３）に示される核酸によってコードされるヒトＩＬ−１ｒａ（配列番号３４）のアミノ酸配列を例示する図である。成熟タンパク質は、１５２個のアミノ酸残基（配列番号３４のアミノ酸残基２６〜１７７）からなる。 ＣＤ１系統雄動物への単回の静脈内（ｉ．ｖ．）注射（用量は約１．５ｍｇ／ｋｇとした）後の、マウス血清におけるＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＨＡエピトープタグ融合タンパク質の濃度（μｇ／ｍＬ）を経時的に（日）示すグラフを示す図である。血清濃度は、ヤギ抗ＨＡ（Ａｂｃａｍ，ＵＫ）捕捉とプロテインＬ−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）検出試薬とを用い、ＥＬＩＳＡによって測定した。既知濃度のＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＨＡ融合体の標準曲線は、１×マウス血清の存在下で設定し、試験サンプルとの比較性を確実にした。１コンパートメントモデルでのモデリング（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）により、ＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＨＡエピトープタグ融合タンパク質は、最終相ｔ1/2 ２９．１時間および曲線下面積５５９時間・μｇ／ｍ１を有するとわかった。 ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）との結合によって選択したＶκのアミノ酸配列のアミノ酸配列を例示する図である。例示される配列は、ＤＯＭ７ｒ−１５（配列番号３７）、ＤＯＭ７ｒ−１６（配列番号３８）、ＤＯＭ７ｒ−１７（配列番号３９）、ＤＯＭ７ｒ−１８（配列番号４０）、ＤＯＭ７ｒ−１９（配列番号４１）と表されるＶκに由来するものである。 図１１Ａは、ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）と結合するＶκのアミノ酸配列のアミノ酸配列を例示する図である。例示される配列は、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号４２）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号４３）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号４４）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号４５）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号４６）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号４７）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号４８）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号４９）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号５０）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号５１）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号５２）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号５３）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号５４）、ＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号５５）と表されるＶκに由来するものである。 図１１Ａ−１の続き。 図１１Ａ−２の続き。 図１１Ｂは、ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）と結合するＶκのアミノ酸配列のアミノ酸配列を例示する図である。例示される配列は、ＤＯＭ７ｒ−２０（配列番号４２）、ＤＯＭ７ｒ−２１（配列番号４３）、ＤＯＭ７ｒ−２２（配列番号４４）、ＤＯＭ７ｒ−２３（配列番号４５）、ＤＯＭ７ｒ−２４（配列番号４６）、ＤＯＭ７ｒ−２５（配列番号４７）、ＤＯＭ７ｒ−２６（配列番号４８）、ＤＯＭ７ｒ−２７（配列番号４９）、ＤＯＭ７ｒ−２８（配列番号５０）、ＤＯＭ７ｒ−２９（配列番号５１）、ＤＯＭ７ｒ−３０（配列番号５２）、ＤＯＭ７ｒ−３１（配列番号５３）、ＤＯＭ７ｒ−３２（配列番号５４）、ＤＯＭ７ｒ−３３（配列番号５５）と表されるＶκに由来するものである。 ＣＤ１系統雄動物への単回の静脈内（ｉ．ｖ．）注射（用量は約１．５ｍｇ／ｋｇとした）後の、マウス血清中の、各々ＨＡエピトープタグを含む、ＤＯＭ７ｍ−１６、ＤＯＭ７ｍ−２６またはＭＳＡと結合しない対照ｄＡｂの濃度（初期用量の％）を経時的に示すグラフを示す図である。血清濃度は、ヤギ抗ＨＡ（Ａｂｃａｍ，ＵＫ）捕捉とプロテインＬ−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）検出試薬とを用い、ＥＬＩＳＡによって測定した。既知濃度のＭＳＡ結合性ｄＡｂ／ＨＡ融合体の標準曲線は、１×マウス血清の存在下で設定し、試験サンプルとの比較性を確実にした。１コンパートメントモデルでのモデリング（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）により、対照ｄＡｂは２０分という最終相ｔ1/2αを有していたのに対し、ＤＯＭ７ｍ−１６、ＤＯＭ７ｍ−２６は血清中で有意に長く持続した。 マウスコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおける関節炎の治療においてＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａは、ＩＬ−１ｒａまたはエンブレル（登録商標）（ｅｎｔａｒｅｃｅｐｔ；Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）よりもより有効であったということを示すグラフを示す図である。関節炎は、誘導し、２１日目に開始して、マウスを０．４ｍｇ／Ｋｇのデキサメタゾン（ステロイド）、１ｍｇ／ＫｇのＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａ（ＩＬ−１ｒａ／抗−ＳＡ １ｍｇ／ｋｇ）または１０ｍｇ／ＫｇのＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａ（ＩＬ−１ｒａ／抗−ＳＡ １０ｍｇ／ｋｇ）、１ｍｇ／ＫｇのＩＬ−１ｒａまたは１０ｍｇ／ＫｇのＩＬ−１ｒａ、５ｍｇ／Ｋｇのエンブレル（登録商標）（ｅｎｔａｒｅｃｅｐｔ；Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）または生理食塩水で治療した。結果は、この研究では、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａは、ＩＬ−１ｒａまたはエンブレル（登録商標）（ｅｎｔａｒｅｃｅｐｔ；Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）よりもより有効であったということを示す。ＩＬ−１ｒａに対する反応は、予想通り用量依存的であり、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａに対する反応も用量依存的であった。１ｍｇ／ＫｇのＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａでの治療の平均スコアは、１０ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１ｒａでの治療によって得られた平均スコアよりも一貫して低かった。これらの結果は、この研究では、ＤＯＭ７ｍ−１６／ＩＬ−１ｒａでの治療は、ＩＬ−１ｒａよりも１０倍より有効であったということを示す。 図１４Ａ〜１４Ｇは、サポリンポリペプチドのアミノ酸配列を例示する図である。図１４Ａは、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ２７５５９（配列番号６０）として寄託されるサポリン−２前駆体のアミノ酸配列を例示する。シグナルペプチドは、配列番号６０のアミノ酸１〜２４である。図１４Ｂは、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ２７５６０（配列番号６１）として寄託されるサポリン−３のアミノ酸配列を例示する。図１４Ｃは、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ２７５６１（配列番号６２）として寄託されるサポリン−４前駆体のアミノ酸配列を例示する。シグナルペプチドは、配列番号６２のアミノ酸１〜２４である。図１４Ｄは、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｑ４１３８９（配列番号６３）として寄託されるサポリン−５のアミノ酸配列を例示する。図１４Ｅは、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ２０６５６（配列番号６４）として寄託されるサポリン−６前駆体のアミノ酸配列を例示する。シグナルペプチドは、配列番号６４のアミノ酸１〜２４であり、可能性のあるプロペプチドは、配列番号６４のアミノ酸２７８〜２９９である。成熟ポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸２５〜２７７（配列番号６５）である。図１４Ｆは、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｑ４１３９１（配列番号６６）として寄託されるサポリン−７のアミノ酸配列を例示する。図１４Ｇは、サポリン−６のいくつかの変異体およびアイソフォームを包含するコンセンサスアミノ酸配列（配列番号６７）を例示する。 図１４Ｃは、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ２７５６１（配列番号６２）として寄託されるサポリン−４前駆体のアミノ酸配列を例示する。シグナルペプチドは、配列番号６２のアミノ酸１〜２４である。図１４Ｄは、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｑ４１３８９（配列番号６３）として寄託されるサポリン−５のアミノ酸配列を例示する。 図１４Ｅは、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｐ２０６５６（配列番号６４）として寄託されるサポリン−６前駆体のアミノ酸配列を例示する。シグナルペプチドは、配列番号６４のアミノ酸１〜２４であり、可能性のあるプロペプチドは、配列番号６４のアミノ酸２７８〜２９９である。成熟ポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸２５〜２７７（配列番号６５）である。図１４Ｆは、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ受託番号Ｑ４１３９１（配列番号６６）として寄託されるサポリン−７のアミノ酸配列を例示する。 図１４Ｇは、サポリン−６のいくつかの変異体およびアイソフォームを包含するコンセンサスアミノ酸配列（配列番号６７）を例示する。 ＷＯ２００４／０４１８６２に開示されている、マウス血清アルブミンと結合するいくつかのラクダ科動物ＶＨＨのアミノ酸配列を例示する図である。配列Ａ（配列番号７２）、配列Ｂ（配列番号７３）、配列Ｃ（配列番号７４）、配列Ｄ（配列番号７５）、配列Ｅ（配列番号７６）、配列Ｆ（配列番号７７）、配列Ｇ（配列番号７８）、配列Ｈ（配列番号７９）、配列Ｉ（配列番号８０）、配列Ｊ（配列番号８１）、配列Ｋ（配列番号８２）、配列Ｌ（配列番号８３）、配列Ｍ（配列番号８４）、配列Ｎ（配列番号８５）、配列Ｏ（配列番号８６）、配列Ｐ（配列番号８７）、配列Ｑ（配列番号８８）。 図１６(a)は、［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１−Ｄｏｍ７ｈ８融合体をコードするヌクレオチド配列（配列番号１７７）および融合体のアミノ酸配列（配列番号１７９）を例示する図である。 図１６(b)は、［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１−ＰＳＳ−Ｄｏｍ７ｈ８融合体をコードするヌクレオチド配列（配列番号１８０）および融合体のアミノ酸配列（配列番号１８２）を例示する図である。 図１６(c)は、［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１−ＰＳＳＧＡＰ−Ｄｏｍ７ｈ８融合体をコードするヌクレオチド配列（配列番号１８３）および融合体のアミノ酸配列（配列番号１８５）を例示する図である。 ［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−Ｉ−ＰＳＳＧＡＰ−Ｄｏｍ７ｈ８融合体（□）が、ＧＬＰ−１対照、（黒塗り三角）、エキセンディン−４（黒塗り逆三角）と同等の用量依存性細胞増殖活性を有していたことを示すグラフを示す図である。基礎のゼロ対照は（◆）で示されている。 ［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−Ｉ−ＰＳＳＧＡＰ−Ｄｏｍ７ｈ８融合体（□）が、ＧＬＰ−１対照、（黒塗り三角）、エキセンディン−４（黒塗り逆三角）と同等の用量依存性インスリン放出を有していたことを示すグラフを示す図である。基礎のゼロ対照は（◆）で示されている。 図１９(a)〜(c)は、Ｄｏｍ７ｈ−８ ＰＹＹ（３−３６）（配列番号１８６）、ＰＹＹ（３−３６）ＤＯＭ７ｈ−８（配列番号１８７）および［Ｐｒｏ９］ＧＬＰ−１（３−３７）−ＤＯＭ７ｈ−８ ＰＹＹ（３−３６）（配列番号１８８）融合体のアミノ酸配列をそれぞれ例示する図である。
配列表
Figure 0005185624
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Claims (31)

  1. インスリン分泌促進性の薬剤(IA)またはペプチドYY (PYY)、および血清アルブミンである抗原に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインである抗体の断片を含む薬剤複合体または融合体であって、
    該抗原はin vivoにおける該薬剤複合体または融合体の半減期を向上させるよう作用し、
    該インスリン分泌促進性の薬剤は、グルカゴン様ペプチド-1 (GLP-1)、エキセンディン−３、エキセンディン−４、胃酸分泌抑制ペプチド(GIP)、またはオキシントモジュリン(OXM)から選択されるペプチドである、前記薬剤複合体または融合体。
  2. 該抗体の断片と融合しているインスリン分泌促進剤ペプチドを含む融合タンパク質である、請求項１に記載の薬剤複合体または融合体。
  3. インスリン分泌促進性の薬剤が、ペプチドリンカー部分を介して該抗体の断片に融合している、請求項２に記載の薬剤複合体または融合体。
  4. 免疫グロブリン単一可変ドメインがVH、VLまたはVHHドメインから選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤複合体または融合体。
  5. 前記ペプチドがGLP-1であり、配列番号157および159からなる群より選択される配列と比較して、交換、付加または欠失している、１個以下のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、かつ前記ペプチドがインスリン分泌促進性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬剤複合体または融合体。
  6. GLP-1がGly10、Thr12、Asp14、Phe27およびIle29を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤複合体または融合体。
  7. GLP-1が、配列番号157または配列番号159と、アミノ酸が１個以下異なり、かつ前記GLP-1がインスリン分泌促進性である、請求項５または６に記載の薬剤複合体または融合体。
  8. 表面プラズモン共鳴で測定した場合、血清アルブミン(SA)に対して、1nMから500μMの解離定数(Kd)を有する、SAに対して特異的である単一の可変ドメインを有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬剤複合体または融合体。
  9. 該SA特異的ドメインがSAに、標準的なリガンド結合アッセイにおいて1nMから500μMのIC50で結合する、請求項８に記載の薬剤複合体または融合体。
  10. 2個、3個または4個のインスリン分泌促進性の薬剤(IA)部分を有する、請求項１に記載の薬剤複合体または融合体。
  11. IA-IA’-AFまたはIA-(AF)n-IA’を含み、IAおよびIA’は同一または異なるインスリン分泌促進性の薬剤であり、AFは請求項１で詳述した抗体の断片であり、nは1、2、3、4、または5に等しい、請求項１０に記載の薬剤複合体または融合体。
  12. [GLP-1]-[AF]-[GLP-1]または[GLP-1]-[GLP-1]-[AF]を含む、請求項１１に記載の薬剤複合体または融合体。
  13. 抗満腹感剤を含み、該抗満腹感剤がPYYおよびPYY (3-36)からなる群より選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の薬剤複合体または融合体。
  14. IA-(AF)n-(IA’)x-[抗満腹感剤]または[抗満腹感剤]-(IA’)x-(AF)n-IAを含み、nは1、2、3、4、または5に等しく、xは0、1、2、3、4、または5に等しい、請求項１３に記載の薬剤複合体または融合体。
  15. １から６時間の間のt 1/2 αを有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の薬剤複合体または融合体。
  16. 12から60時間の間のt 1/2 βを有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の薬剤複合体または融合体。
  17. インスリン、エキセンディン−４、エキセンディン−３、ＰＹＹ（３−３６）、レジスチン、レプチン、メラノコルチン３受容体／メラノコルチン４受容体アンタゴニスト、アグーチ関連ペプチド（ＡｇＲＰ）アンタゴニスト、アポリポタンパク質Ａ−IV、エンテロスタチン、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、インスリン様増殖因子(ＩＧＦ１)、骨形成タンパク質9(ＢＭＰ−９)、ＩＬ−２２、ＲｅｇIV、インターフェロンα、ＩＮＧＡＰペプチド、ソマトスタチン、アミリン、ニュールリン（ｎｅｕｒｕｌｉｎ）、インターフェロンβ、インターフェロンハイブリッド、アディポネクチン、内在性カンナビノイド、Ｃペプチド、ＷＮＴ１０ｂ、オレキシン−Ａ、副腎皮質刺激ホルモン、エンテロスタチン、コレシストキニン、オキシントモジュリン、メラニン細胞刺激ホルモン、メラノコルチン、メラニン凝集ホルモン、ＢＢ−２、ニューロペプチドy (ＮＰＹ) Ｙ２アゴニスト、ＮＰＹ Ｙ５／Ｙ１アンタゴニスト、ＯＸＭ、ガラニン1R (Ｇａｌ−１Ｒ)アンタゴニスト、メラニン凝集ホルモン1R (ＭＣＨ−１Ｒ)アンタゴニスト、ＭＣ−３／４アゴニスト、ボンベシン様受容体3(ＢＲＳ−３)アゴニスト、膵臓ポリペプチド、抗グレリン抗体断片、脳由来の向神経因子、ヒト成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、卵胞刺激ホルモン、または胃酸分泌抑制ペプチドからなる群から選択された薬剤をさらに含む、請求項１に記載の薬剤複合体または融合体。
  18. GLPがGLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)アミド、[Ser8]GLP-1(7-36)アミド、[Pro9]GLP-1(7-36)、または[Pro9]GLP-1(7-37)である、請求項１に記載の薬剤複合体または融合体。
  19. GLPが、PSS、PSSGAPおよびPSSGAPPPSからなる群より選択されるC末端ペプチドを有する、請求項１８に記載の薬剤複合体または融合体。
  20. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の薬剤複合体または融合体をコードする組換え核酸。
  21. 請求項２０に記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
  22. 請求項２１に記載の宿主細胞を、前記組換え核酸の発現に適した条件下で維持し、それによって、薬剤融合体を生成することを含む、薬剤融合体を生体外で生成する方法。
  23. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の薬剤複合体または融合体と、生理学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  24. 患者における症状を治療および／または予防するために用いる請求項１〜１９のいずれか１項に記載の薬剤であって、該症状が、高血糖、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病、肥満、高血圧、シンドロームＸ、脂質代謝異常、認知障害、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、冠状心疾患およびその他の心血管障害、脳卒中、炎症性腸疾患、消化不良、ならびに胃潰瘍からなる群より選択される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の薬剤複合体または融合体。
  25. 患者の２型糖尿病において、疾患の進行を遅らせる、または予防するために用いる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の薬剤複合体または融合体。
  26. 患者による食物摂取を減少させる、患者のβ細胞アポトーシスを減少させる、β細胞の機能を改善しβ細胞の質量の増大を増加させる、および／または患者のβ細胞のグルコース感受性を修復するために用いる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の薬剤複合体または融合体。
  27. 患者による食物摂取を減少させる、患者のβ細胞アポトーシスを減少させる、患者のβ細胞の機能を改善しβ細胞の質量を増加させる、および／または患者のβ細胞のグルコース感受性を修復するために用いる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の薬剤複合体または融合体。
  28. 患者において、高血糖、１型糖尿病、２型糖尿病またはβ細胞欠損症を治療および／または予防するために用いる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の薬剤複合体または融合体。
  29. 糖尿病の治療および／または予防に用いるための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の薬剤複合体または融合体。
  30. 肥満の治療および／または予防に用いるための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の薬剤複合体または融合体。
  31. 患者による食物摂取を減少させるために用いる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の薬剤複合体または融合体。
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