BR112020006999A2

BR112020006999A2 - anticorpo multiespecífico, composição farmacêutica e método de produção

Info

Publication number: BR112020006999A2
Application number: BR112020006999-0A
Authority: BR
Inventors: David Urech; Tea Gunde; Sebastian Meyer; Matthias BROCK; Christian Hess; Alexandre Simonin; Stefan Warmuth
Original assignee: Numab Therapeutics AG
Priority date: 2017-10-10
Filing date: 2018-10-09
Publication date: 2020-10-06
Also published as: CL2020000937A1; MA50352A; EP3694873A1; JP2021501744A; AU2018348429A1; WO2019072868A1; CL2021000028A1; JP7442443B2; IL273576A; US20230192897A1; MX2020003562A; CA3075969A1; KR20200063155A; CO2020003882A2; CN111194323A; SG11202002982YA

Abstract

A presente invenção refere-se a um anticorpo multiespecífico compreendendo pelo menos um domínio de ligação a CD137 e pelo menos um domínio de ligação a PDL1 e composições farmacêuticas e métodos de uso dos mesmos. A presente invenção refere-se ainda a um ácido nucleico que codifica o referido anticorpo multiespecífico, um vetor compreendendo o referido ácido nucleico, uma célula hospedeira compreendendo o referido ácido nucleico ou o referido vetor e um método de produção do referido anticorpo multiespecífico.

Description

ANTICORPO MULTIESPECÍFICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO DE PRODUÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a um anticorpo multiespecífico compreendendo pelo menos um domínio de ligação a CD137 e pelo menos um domínio de ligação a PDL1 e composições farmacêuticas e métodos de uso destes. A presente invenção refere-se ainda a um ácido nucleico que codifica o referido anticorpo multiespecífico, um vetor compreendendo o referido ácido nucleico, uma célula hospedeira compreendendo o referido ácido nucleico ou o referido vetor e um método de produção do referido anticorpo multiespecífico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A superfamília de receptores do fator de necrose tumoral (TNFRSF) é uma superfamília proteica de receptores caracterizada pela sua capacidade de ligar fatores de necrose tumoral (TNFs) via pseudo-repetições ricas em cisteína no domínio extracelular (Locksley et al., 2001, Cell. 104: 487- 501). Atualmente, 27 membros da família TNF foram identificados. Os membros da TNFRSF e seus ligantes são expressos principalmente nas células imunes, onde desempenham um papel de imunomoduladores nas respostas imunes mediadas por células T. Membros TNFRSF desempenham um papel na melhoria da sobrevivência de células dendríticas e capacidade de priming de células T, geração ótima de células T efetoras, respostas ótimas de anticorpos e amplificação de reações inflamatórias.

[0003] A CD137 (4-1BB, superfamília 9 do receptor de TNF, TNFRSF9) é uma glicoproteína de superfície da super família TNFR. Ela é um receptor de células T de co-estimulação induzível. A expressão de CD137 é dependente da ativação, e abrange um amplo subconjunto de células imunitárias, incluindo células ativadas NK e NKT, células T reguladoras, células dendríticas (DC), incluindo DC folicular, mastócitos estimulados, mieloides diferenciadores, monócitos, neutrófilos, eosinófilos (Wang et al., Immunol Rev. 229 (1): 192-215 (2009)) e células B ativadas (Zhang et al., J. Immunol. 184 (2): 787-795 (2010)). Além disso, a expressão de CD137 também foi demonstrada na vasculatura do tumor (Broil K et al., Am J Clin Pathol. 115 (4): 543-549 (2001); Seaman et al, Cancer Cell 11 (6): 539- 554 (2007)) e endotélio aterosclerótico (Olofsson et al., Circulation 117 (10): 1292 1301 (2008)).

[0004] O ligante a CD137 (CD137L, 4-1BBL ou tnfsf9), uma molécula da família TNF, é um ligante natural intercelular conhecido por CD137 (Alderson, MR, et al., Eur. J. Immunol. 24: 2219–2227 (1994); Pollok K., et al., Eur. J. Immunol. 24: 367- 374 (1994); Goodwin, RG, et al., Eur. J. Immunol. 23: 2631- 2641 (1993)). O ligante para CD137 forma um homotrímero, e a sinalização via CD137 procede de moléculas ligadas na superfície da célula, que se tornam reticuladas pelo ligante trimerizado (Won, EY, et al., J. Biol. Chem. 285: 9202-9210 (2010)). O agrupamento (clustering) de ordem superior de CD137 foi, portanto, sugerido como sendo necessário para mediar a sinalização. A CD137 se associa aos adaptadores TRAF-2 e TRAF-1 em sua cauda citoplasmática, resultando em coimunoprecipitação, que é aprimorada com a ativação de CD137 nas células T (Saoulli,

K., et al., J. Exp. Med. 187: 1849– 1862 (1998); Sabbagh, L., et al., J. Immunol. 180: 8093–8101 (2008)). O recrutamento de TRAF- 1 e TRAF-2 por CD137 resulta na ativação a jusante de NFKB e da cascata de quinase de proteínas ativadas por mitógenos (MAP), incluindo as quinases de ERK, JNK e p38 MAP. A ativação de NFkB leva à regulação positiva de Bfl-1 e Bcl-XL, membros pró- sobrevivência da família Bcl-2. A proteína pró-apoptótica Bim é regulada negativamente de maneira dependente de TRAF-1 e ERK (Sabbagh et al., J. Immunol. 180 (12): 8093-8101 (2008)). Foi sugerido que a principal ação da CD137 é colocar duas ou mais moléculas de TRAF-2 em estreita proximidade molecular entre si (Sanchez-Paulete, AR, et al., Eur. J. Immunology 46 (3): 513- 522 (2016)). Com base nisso, postulou-se que o principal fator que impulsiona a sinalização de CD137 é a densidade relativa de porções CD137 montadas em TRAF-2 em micropacotes de membrana plasmática (Sanchez-Paulete, AR, et al., Eur. J. Immunology 46 (3): 513-522 (2016)). Globalmente, a sinalização de CD137 é promovida por multimerização, e foi proposto que a reticulação de moléculas de CD137 é o fator chave na atividade co- estimuladora de CD137.

[0005] A CD137 co-estimula as células T a realizar funções efetoras, como erradicação de tumores estabelecidos, ampliando as respostas primárias das células T CD8+ e aumentando o pool de memória das células T CD8+ específicas do antígeno, indução da síntese de interferon-gama (IFN-γ). O papel crítico da estimulação de CD137 na função e sobrevivência das células T CD8+ pode ser potencialmente utilizado para o tratamento de tumores através da manipulação da função de CD137/CD137L. De fato, estudos de eficácia in vivo em camundongos demonstraram que o tratamento com anticorpos anti-CD137 levou a regressões tumorais em vários modelos tumorais. Por exemplo, demonstrou-se que o anticorpo agonístico anti-CD137 de camundongo induz uma resposta imune contra tumores de mastocitoma P815, e modelo de tumor imunogênico baixo Ag104 (I. Melero et al., Nat. Med., 3 (6): 682-5 (1997)). A eficácia de agonistas mAbs de CD137 em ambientes profiláticos e terapêuticos para ambas as respostas de memória de células T protetoras anti-tumor de monoterapia e de combinação de terapia tem sido relatada em vários estudos (Lynch et ai, Immunol Rev. 222:. 277-286 (2008)). Os agonistas de CD137 também inibem reações autoimunes em uma variedade de modelos de autoimunidade (Vinay et al., J Mol Med 84 (9): 726-736 (2006)).

[0006] Dois anticorpos anti-CD 137 atualmente disponíveis na clínica são o urelumab (Bristol-Myers Squibb), um mAb IgG4 totalmente humanizado e o utomilumab (PF-05082566, Pfizer), um mAb IgG2 totalmente humano (Chester C., et al., Cancer Immunol Immunother Oct; 65 (10): 1243-8 (2016)). Embora a utilização de anticorpos terapêuticos que agonizam CD137 seja uma estratégia de tratamento muito promissora, ela está associada a dificuldades tais como baixa eficácia de anticorpos agonistas anti-CD137, altas toxicidades e eventos adversos.

[0007] Os anticorpos agonistas de CD137 demonstraram levar a alterações no sistema imunológico e na função dos órgãos, aumentando os riscos de toxicidade. Foi relatado que altas doses de anticorpos agonistas de CD137 em camundongos ingênuos e portadores de tumor induzem a infiltração de células T no fígado e elevações de aspartato aminotransferase e alanina aminotransferase consistentes com inflamação hepática (Niu L, et al., J Immunol 178 (7): 4194- 4213 (2007); Dubrot J, et al., Int

J Cancer 128 (1): 105-118 (2011)). Estudos clínicos iniciais sobre o uso terapêutico humano do anticorpo agonista CD137 também demonstraram elevações das enzimas hepáticas e aumento da incidência de hepatite (Sznol M., et al., J Clin Oncol 26 (115S): 3007 (2008); Ascierto PA, et. al., Semin Oncol 37 (5): 508-516 (2010); Chester C., et al., Cancer Immunol Immunother Oct; 65 (10): 1243-8 (2016)). Hepatite potencialmente fatal foi observada em um estudo de fase II da Bristol-Myers Squibb (BMS) anti-CD137 para melanoma de estágio III/IV anteriormente tratado, National Clinical Trial (NCT) 00612664. Este estudo e vários outros (NCT00803374, NCT00309023, NCT00461110, NCT00461110, NCT00461110, NCT00461110, NCT00461110, NCT00461110,) foram encerrados devido a eventos adversos (Chester C., et al., Cancer Immunol Immunother Oct; 65 (10): 1243-8 (2016)). Tais eventos adversos são provavelmente devidos à super-estimulação sistêmica das células T.

[0008] Além do acima, os anticorpos CD137 bivalentes mostraram in vitro serem geralmente fracos em sua capacidade de induzir a sinalização na ausência de um agrupamento exógeno. Para ilustrar, o anticorpo anti-CD137 utomilumabe só é capaz de ativar a sinalização CD137 quando reticulado ao anticorpo secundário anti-humano F(ab')2 ou imobilizado ao plástico da cultura de tecidos (Fisher, et al., Cancer Immunol Immunother 61: 1721-1733 (2012)). Estudos em anticorpos agonistas de roedores contra CD40 (TNFRSF5), outro membro da TNFRSF, sugeriram que o agrupamento exógeno pode ser parcialmente alcançado através da interação com Receptor Fcγ (Li F, Ravetch JV, Science 333 (6045): 1030-1010 (2011); White AL, et al., J Immunol 187 (4): 1754-1763 (2011)). A interação com receptor Fcγ pode, no entanto, esgotar as células que expressam CD137 através de mecanismos efetores. Os atuais anticorpos bivalentes direcionados ao CD137 têm as limitações de que: a) eles têm capacidade limitada de estimulação por CD137 na ausência de interação com o receptor Fcγ; b) essa interação com o receptor Fcγ pode induzir a depleção das células que expressam CD137, o que provavelmente afeta a atividade, c) sua atividade não se restringe ao tecido alvo, causando efeitos adversos sistêmicos.

[0009] Para obter a função de reticulação adicional e atingir certos níveis de TNRSF, em particular ativação de CD137, tem sido recentemente sugerido usar polipeptídeos multivalentes e de fusão multiespecíficos que se ligam a PDL1 e membros TNRSF, ou folato receptor alfa (FRα) e membros TNRSF, em que a ligação a PDL1 ou FRα é capaz de fornecer uma função de reticulação adicional (WO 2017/123650). Eckelman et al. demonstraram que o envolvimento bivalente de CD137, como no caso de INBRX-105, um polipeptídeo multiespecífico e multivalente com dois domínios de ligação a PDL1, dois domínios de ligação a CD137 e uma região Fc é insuficiente para agrupar e mediar efetivamente a sinalização de CD137 produtiva na ausência de um evento de agrupamento exógeno, usando um ensaio que isola os efeitos da molécula em uma linha de células T repórter. Por outro lado, o envolvimento de um segundo antígeno de superfície celular PDL1 na presença de células positivas para PDL1 permite maior agrupamento de CD137 e sinalização produtiva (WO 2017/123650).

[0010] A PDL1 (CD274, B7-H1) é uma proteína transmembrana de tipo I de 40 kDa. A PDL1 é um ligante de glicoproteína de superfície para PD-1, um importante receptor de ponto de verificação imune expresso por células T e B ativadas e media a imunossupressão. PDL1 está implicada na supressão das respostas do sistema imunológico durante infecções crônicas, gravidez, aloenxertos de tecidos, doenças autoimunes e câncer. A PDL1 é encontrada tanto nas células apresentadoras de antígenos quanto nas células cancerígenas humanas, como carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, melanoma e tumor cerebral, tireoide, timo, esôfago, pulmão, mama, trato gastrointestinal, colorretal, fígado, pâncreas, rim, córtex adrenal, bexiga, urotélio, ovário e pele (Katsuya Y, et al., Lung Cancer.88 (2): 154-159 (2015); Nakanishi J, et al., Cancer Immunol Immunother. 8): 1173-1182 (2007); Nomi T, et al., Clin Cancer Res. 13 (7): 2151-2157 (2007); Fay AP, et al., J. Immunother Cancer. 3: 3 (2015); Strome SE, et al., Cancer Res. 63 (19): 6501–6505 (2003); Jacobs JF, et al. Neuro Onc ol.11 (4): 394–402 (2009); Wilmotte R, et al. Neuroreport.16 (10): 1081-1085 (2005)). A PDL1 raramente é expressa em tecidos normais, mas é induzível no local do tumor (Dong H, et al., Nat Med. 8 (8): 793-800 (2002); Wang et al., Onco Targets Ther. 9: 5023-5039 (2016)). A PDL1 regula negativamente a ativação de células T e a secreção de citocinas pela ligação a PD-1 (Freeman et al., 2000; Latchman et al, 2001). A PD-1, ativada pela PDL1, fornece potencialmente um ambiente tolerante ao sistema imunológico para o desenvolvimento e crescimento de tumores. A PDL1 também regula negativamente a função das células T através da interação com outro receptor, B7.1 (B7-1, CD80).

[0011] A inibição da interação PDL 1/PD-1 permite uma atividade antitumoral potente. Uma série de anticorpos que perturbam a sinalização de PD-1 tem entrado em desenvolvimento clínico. Esses anticorpos pertencem às duas categorias principais a seguir: aqueles que têm como alvo PD-1 (nivolumabe, Bristol-Myers Squibb; pembrolizumabe, Merck, Whitehouse Station, NJ; pidilizumabe, CureTech, Yavne, Israel) e aqueles que têm como alvo PD L1 (MPDL3280A, Genentech, South San Francisco, CA; MEDI4736, MedImmune/AstraZeneca; BMS-936559, Bristol-Myers Squibb; MSB00107 18C, EMD Serono, Rockland, MA) (para revisão, ver Postow MA et al., J Clin Oncol. 10 de junho; 33 (17): 1974- 82 (2015)). Direcionar PDL1 contra PD-1 pode resultar em diferentes efeitos biológicos. Os anticorpos PD-1 impedem a interação da PD-1 com seus ligantes, PDL1 e PDL2. Os anticorpos PDL1 não impedem que PD-1 interaja com PDL2, embora o efeito dessa interação permaneça desconhecido. Contudo, os anticorpos PDL1 impedem a interação de PDL1 não apenas com PD-1, mas também com B7-1 (Butte MJ, et al., Immunity 27: 111-122, (2007)), que se acredita exercer sinais negativos nas células T. O bloqueio de PDL1 demonstrou dados iniciais promissores e, atualmente, quatro mAbs clínicos anti-PDL1 estão em teste: atezolizumab e MEDI4736 (ambos são variantes nulas Fc da IgG1 humana), MSB001078C (IgG1) e BMS-936559 (IgG4) (Chester C., et al., Cancer Immunol Immunother Oct; 65 (10): 1243-8 (2016)).

[0012] A combinação de anticorpos anti-PDL1 e anti-CD137 aumentou a sobrevivência global e a função efetora das células T no modelo de adenocarcinoma ovariano ID-8 (Duraiswamy J, et al., Cancer Res 73: 6900–6912 (2013)). A combinação de urelumab (anti-CD137) com nivolumabe (anti-PD-1) em tumores sólidos e linfoma não-Hodgkin de células B está sendo testada em um estudo de fase I/II (NCT02253992), enquanto PF-05082566 (anti-CD137) está sendo testado em um estudo de fase Ib com pembrolizumabe (anti-PD-1) em pacientes com tumores sólidos (NCT02179918)

(Chester C., et al., Cancer Immunol Immunother Oct; 65 (10): 1243-8 (2016)).

[0013] Recentemente, o efeito dos polipeptídeos de fusão multivalentes e multiespecíficos que se ligam a PDL1 e CD137 foi avaliado in vitro sobre a ativação das células T e a proliferação. Utilizando um sistema de co-cultura autóloga in vitro que implementa DC imaturas e células T correspondentes a doadores, foi demonstrado que o INBRX-105, um polipeptídeo multiespecífico e multivalente com dois domínios de ligação a PDL1, dois domínios de ligação a CD137 e uma região Fc, é superior em estimular a produção de interferon-gamma, quando comparado à proteína de fusão monoespecífica PDL1 sd-Ab-Fc, a proteína de fusão CD137 sdAb-Fc, a combinação das duas, o anticorpo anti-PDL1 atezolizumabe, o anticorpo anti-CD137 utomilumabe (PF-05082566), ou o anticorpo anti-PDL1 prembrolizumab, e suas combinações, em induzir INFγ ou mediar a proliferação de células T CD8+ e a ativação (WO 2017/123650). Adicionalmente, WO 2016/149201 divulga certos anticorpos direcionados contra PDL1 e sugere a criação de construções de anticorpos biespecíficos compreendendo ainda um anticorpo que envolve células T, com CD137 sendo contido em uma lista não exclusiva de mais de 20 potenciais alvos de células T.

[0014] Apesar das inúmeras opções de tratamento para pacientes que sofrem de câncer, ainda há a necessidade de agentes terapêuticos eficazes e seguros e a necessidade de seu uso preferencial de maneira mais direcionada. Imunomoduladores biológicos oferecem abordagens promissoras no tratamento de cânceres devido aos seus modos de ação; no entanto, a imunoestimulação global e a falta de qualquer restrição dessa imunomodulação de células e locais patologicamente relevantes provoca vários efeitos colaterais e toxicidades significativas, o que, potencialmente, podem conduzir a um aumento da morbilidade e mortalidade dos pacientes. Portanto, é um objetivo da presente invenção fornecer um medicamento para melhorar o tratamento de uma doença proliferativa, particularmente um câncer.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[0015] É um objetivo da presente invenção fornecer um medicamento para melhorar o tratamento de uma doença proliferativa, particularmente um câncer. A presente invenção aborda a necessidade de terapias de precisão para imuno- oncologia que visam apenas a regulação positiva das células T colocalizadas pela doença.

[0016] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpo multiespecífico que compreende pelo menos um domínio de ligação a CD137 e pelo menos um domínio de ligação a PDL1. A presente invenção refere-se ainda a um anticorpo multiespecífico compreendendo pelo menos um domínio de ligação a CD137, pelo menos um domínio de ligação a PDL1 e pelo menos um domínio de albumina sérica humana.

[0017] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo multiespecífico da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0018] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece o anticorpo multiespecífico da invenção ou a composição farmacêutica da invenção para uso como medicamento.

[0019] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece o anticorpo multiespecífico da invenção ou a composição farmacêutica da invenção para uso no tratamento de câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo. Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso do anticorpo multiespecífico da invenção ou a composição farmacêutica da invenção para o tratamento de câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo.

[0020] Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso do anticorpo multiespecífico da invenção ou a composição farmacêutica da invenção na fabricação de um medicamento para tratamento de um câncer, em um indivíduo em necessidade do mesmo.

[0021] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento de um câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo multiespecífico da invenção ou da composição farmacêutica da invenção.

[0022] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica o anticorpo multiespecífico da invenção. Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um vetor compreendendo o referido ácido nucleico. Num aspecto adicional, a presente invenção fornece uma célula hospedeira compreendendo o referido ácido nucleico ou o referido vetor.

[0023] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir o anticorpo multiespecífico da invenção ou um domínio de ligação seu ou um fragmento seu, o método compreendendo a etapa de cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico ou um vetor que codifica o anticorpo multiespecífico da invenção ou um domínio de ligação seu ou um fragmento seu.

[0024] Os aspectos, características vantajosas e concretizações preferidas da presente invenção resumidos nos itens a seguir, respectivamente sozinhos ou em combinação, adicionalmente contribuem para resolver o objeto da invenção:

1. Um anticorpo multiespecífico compreendendo: a) pelo menos um domínio de ligação a CD137 (CD137-BD); e b) pelo menos um domínio de ligação a PDL1 (PDL1-BD).

2. O anticorpo multiespecífico do item 1, em que o referido anticorpo é monovalente, bivalente ou multivalente para a especificidade de CD137, preferencialmente monovalente.

3. O anticorpo multiespecífico do item 1 ou 2, em que o referido anticorpo é monovalente, bivalente ou multivalente para a especificidade de PDL1, preferencialmente monovalente.

4. O anticorpo multiespecífico do item 1, em que o referido anticorpo compreende um CD137-BD e um PDL1-BD.

5. O anticorpo multiespecífico do item 1, em que o referido anticorpo consiste em um CD137-BD e um PDL1-BD.

6. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos itens 1 a 4, em que o referido anticorpo é triespecífico.

7. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos itens 1 a 4, em que o referido anticorpo compreende ainda pelo menos um domínio de ligação à albumina sérica humana, preferencialmente um domínio de ligação à albumina sérica humana.

8. O anticorpo multiespecífico do item 7, em que o referido anticorpo compreende um CD137-BD, um PDL1-BD e um HSA- BD.

9. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos itens anteriores, em que o referido anticorpo não compreende um polipeptídeo da região Fc de imunoglobulina.

10. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos itens anteriores, em que os referidos domínios de ligação são capazes de se ligar ao seu antígeno ou receptor respectivo simultaneamente.

11. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos itens anteriores, em que cada um dos referidos domínios de ligação, por exemplo, PDL1-BD, CD137-BD ou HSA-BD, é selecionado independentemente do grupo que consiste em um Fab, um Fv, um scFv, dsFv, um scAb, STAB, um anticorpo de domínio único (sdAb ou dAb), um anticorpo de cadeia pesada de domínio único e um anticorpo de cadeia leve de domínio único, um VHH, um VNAR, anticorpos de domínio único com base na estrutura VNAR de tubarão, e domínios de ligação baseados em scaffolds alternativos, incluindo, mas limitados a, domínios à base de anquirina, finômeros, avímeros, anticalinas, fibronectinas, e locais de ligação sendo construídos em regiões constantes de anticorpos (por exemplo, tecnologia f-star (Tecnologia de Anticorpo Modular F-starTM).

12. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos itens anteriores, em que o referido PDL1-BD e/ou o referido CD137-BD e/ou o referido HSA-BD é/são selecionados independentemente a partir de Fv e scFv.

13. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos itens anteriores, em que o referido CD137-BD pode agonizar o CD137 após o agrupamento.

14. O anticorpo multiespecífico do item 13, em que o referido CD137-BD: a) se liga ao CD137 humano com uma constante de dissociação (KD) menor que 50 nM, particularmente menor que 10 nM, particularmente menor que 5 nM, particularmente menor que 1 nM, particularmente menor que 500 pM, mais particularmente menor que 100 pM, mais particularmente inferior a 50 pM, em particular como medido por SPR), particularmente em que o referido anticorpo é um scFv (afinidade monovalente); b) liga-se ao CD137 humano com uma taxa de Koff de 10-3 s-1 ou menos, ou 10-4 s-1 ou menos, ou 10-5 s-1 ou menos, conforme medido por SPR, particularmente em que o referido anticorpo é um scFv; c) liga-se ao CD137 humano com uma taxa de Kon de pelo menos 104 M-1s-1 ou superior, pelo menos 105 M-1s-1 ou superior, pelo menos 106 M-1s-1 ou superior, como medido por SPR, particularmente em que o referido anticorpo é um scFv; d) opcionalmente, não concorre com o urelumab; e) opcionalmente, não concorre com o utomilumab; e/ou f) é reativo cruzado com CD137 de Macaca fascicularis (Cynomolgus); e/ou g) quando no formato scFv, tem uma temperatura de fusão (Tm), determinada por fluorimetria de varredura diferencial, de pelo menos 50° C, preferencialmente de pelo menos 55° C, mais preferencialmente de pelo menos 60° C, em particular em que o referido anticorpo ou o seu fragmento de ligação ao antígeno é formulado em tampão fosfato-citrato a pH 6,4, NaCl 150 mM, em particular em que o referido anticorpo é formulado em tampão citrato fosfato 50 mM com NaCl 150 mM a pH 6,4; h) quando no formato scFv, possui uma perda no teor de monômeros, após armazenamento por pelo menos duas semanas, particularmente por pelo menos quatro semanas, a 4° C, menor que 7%, por exemplo, menor que 6%, menor que 5%, menor que 4%, menor que 3%, menor que 2%, preferencialmente menor que 1%, quando o anticorpo da invenção está em uma concentração inicial de 10 mg/ml, e em particular em que o anticorpo da invenção é formulado em tampão de citrato de fosfato 50 mM com NaCl 150 mM a pH 6,4; e/ou i) quando no formato scFv, possui uma perda no teor de monômero, após armazenamento por pelo menos duas semanas, particularmente por pelo menos quatro semanas, a 40° C, menor que 5%, por exemplo, menor que 4%, menor que 3%, menor que 2%, preferencialmente menor que 1%, quando o anticorpo da invenção está em uma concentração inicial de 10 mg/ml, e em particular em que o anticorpo da invenção é formulado em tampão de citrato de fosfato 50 mM com 150 mM NaCl a pH 6,4.

15. O anticorpo multiespecífico do item 13 ou item 14, em que o referido CD137-BD compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR possuindo a sequência da SEQ ID NO: 1 para HCDR1, SEQ ID NO: 2 para HCDR2 e SEQ ID NO: 3 para HCDR3, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR possuindo a sequência SEQ ID NO: 18 para LCDR1, SEQ ID NO: 19 para LCDR2 e SEQ ID NO: 20 para LCDR3.

16. O anticorpo multiespecífico do item 15, em que o referido CD137-BD compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 14, 15, 16 e 17; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 27, 28, 29 e 30.

17. O anticorpo multiespecífico do item 16, em que o referido CD137-BD compreende: uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 15, 16 e 17; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 27, 28, 29 e 30.

18. O anticorpo multiespecífico do item 16, em que o referido CD137-BD compreende (a) uma sequência VH da SEQ ID NO: 14 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 27; (b) uma sequência VH da SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 28; (c) uma sequência VH da SEQ ID NO: 16 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 29; ou (d) uma sequência VH da SEQ ID NO: 17 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 30.

19. O anticorpo multiespecífico do item 15, em que o referido CD137-BD é uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 17; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 30, em que a referida região variável de cadeia pesada compreende uma mutação G51C (numeração AHo) e a referida região variável de cadeia leve compreende es mutação T141C (numeração AHo).

20. O anticorpo multiespecífico do item 13 ou item 14, em que o referido CD137-BD compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR com a sequência da SEQ ID NO: 59 para HCDR1, SEQ ID NO: 60 para HCDR2 e SEQ ID NO: 61 para HCDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR com a sequência SEQ ID NO: 74 para LCDR1, SEQ ID NO: 75 para LCDR2 e SEQ ID NO: 76 para LCDR3.

21. O anticorpo multiespecífico do item 20, em que o referido CD137-BD compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 71, 72 e 73; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 83, 84 e 85.

22. O anticorpo multiespecífico do item 21, em que o referido CD137-BD compreende: uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 71, 72 e 73; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 83, 84 e 85.

23. O anticorpo multiespecífico do item 21, em que o referido CD137-BD compreende (a) uma sequência VH da SEQ ID NO: 71 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 83; (b) uma sequência VH da SEQ ID NO: 72 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 84; ou (c) uma sequência VH da SEQ ID NO: 73 e uma sequência VL da SEQ ID NO:

85.

24. O anticorpo multiespecífico do item 21, em que o referido CD137-BD é uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 73; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 85, em que a referida região variável de cadeia pesada compreende uma mutação G51C (numeração AHo) e a referida região variável de cadeia leve compreende es mutação T141C (numeração AHo).

25. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos itens anteriores, em que o referido PDL1-BD é um bloqueador de PDL1.

26. O anticorpo multiespecífico do item 25, em que o referido PDL1-BD: a) liga-se à PDL1 humana com uma constante de dissociação (KD) inferior a 50 nM, particularmente inferior a 10 nM, particularmente inferior a 5 nM, particularmente inferior a 1 nM, particularmente inferior a 500 pM, mais particularmente inferior a 100 pM, de preferência menos de 10 pM, mais preferencialmente 5 pM, em particular como medido por SPR, particularmente em que o referido anticorpo é um scFv (afinidade monovalente);

b) liga-se à PDL1 humana com uma taxa de Koff de 10−3 s-1 ou menos, ou 10−4 s-1 ou menos, ou 10−5 s−1 ou menos conforme medido por SPR, particularmente em que o referido anticorpo é um scFv;

c) liga-se à PDL1 humana com uma taxa de Kon de pelo menos 103 M- 1s-1 ou superior, pelo menos 104 M-1s-1 ou superior, pelo menos 10 5 M-1s-1 ou superior, pelo menos 106 M-1s-1 ou superior, conforme medido por SPR, particularmente em que o referido anticorpo é um scFv;

d) é reativo cruzado com PDL1 de Macaca fascicularis (Cynomolgus); e/ou e) não é reativo cruzado com PDL1 de Mus musculus; e/ou f) quando no formato scFv, tem uma temperatura de fusão (Tm), determinada por fluorimetria de varredura diferencial, de pelo menos 55° C, por exemplo, pelo menos 60° C, preferencialmente pelo menos 65° C, mais preferencialmente pelo menos 70° C, em particular em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação seu ao antígeno é formulado em tampão fosfato-citrato a pH 6,4, NaCl 150 mM, em particular em que o referido anticorpo é formulado em tampão citrato fosfato 50 mM com NaCl 150 mM a pH 6,4;

g) quando no formato scFv, tem uma perda no teor de monômeros, após cinco ciclos consecutivos de congelamento e descongelamento, inferior a 5%, preferencialmente inferior a 3%, mais preferencialmente inferior a 1%, quando o anticorpo da invenção está em uma concentração inicial de 10 mg/ml, em particular em que o referido anticorpo é formulado em tampão de citrato de fosfato 50 mM com NaCl 150 mM a pH 6,4; e/ou h) quando no formato scFv, tem uma perda no teor de monômeros, após armazenamento por pelo menos duas semanas, particularmente por pelo menos quatro semanas, a 4° C, menor que 15%, por exemplo, menor que 12%, menor que 10%, menor que 7%, menor que 5%, menor que 4%, menor que 3%, menor que 2%, preferencialmente menor que 1%, quando o anticorpo da invenção está em uma concentração inicial de 10 mg/ml, e em particular em que o anticorpo da invenção é formulado em tampão de citrato de fosfato 50 mM com NaCl 150 mM a pH 6,4.

27. O anticorpo multiespecífico do item 25 ou item 26, em que o referido PDL1-BD compreende: (a) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 89; (b) uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; (c) uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91; (d) uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105; (e) uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 106; e (f) uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107.

28. O anticorpo multiespecífico do item 25 ou item 26, em que o referido PDL1-BD compreende: (a) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 119; (b) uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 120; (c) uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; (d) uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 135; (e) uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 136; e (f) uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 137.

29. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos itens 25 a 28, em que o referido PDL1-BD compreende: uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90 porcento idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 102, 103, 104, 132, 133 e 134; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90 porcento idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 114, 115, 144 e 145.

30. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos itens 25 a 28, em que o referido PDL1-BD compreende: uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 102, 103, 104, 132, 133 e 134; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 114, 115, 144 e 145.

31. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos itens 25 a 28, em que o referido PDL1-BD compreende: (a) uma sequência VH da SEQ ID NO: 102 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 114; (b) uma sequência VH da SEQ ID NO: 103 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 114; (c) uma sequência VH da SEQ ID NO: 104 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 115; (d) uma sequência VH da SEQ ID NO: 132 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 144; (e) uma sequência VH da SEQ ID NO: 133 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 145; ou (f) uma sequência VH da SEQ ID NO: 134 e uma sequência VL da SEQ ID NO:

144.

32. O anticorpo multiespecífico do item 27, em que o referido PDL1-BD compreende: (a) uma sequência VH da SEQ ID NO: 102 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 114; ou (b) uma sequência VH da SEQ ID NO: 104 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 115.

33. O anticorpo multiespecífico do item 28, em que o referido PDL1-BD compreende: (a) uma sequência VH da SEQ ID NO: 133 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 145; ou (b) uma sequência VH da SEQ ID NO: 134 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 144.

34. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos itens anteriores, em que o referido CD137-BD se liga à CD137 humana com uma constante de dissociação (KD) de pelo menos 5 vezes, preferencialmente pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, mais preferencialmente pelo menos 500 vezes, por exemplo, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos 1000 vezes mais em relação a uma constante de dissociação (KD) de ligação à PDL1 humana do referido PDL1-BD.

35. Anticorpo multiespecífico, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o referido CD137-BD se liga à CD137 humana com uma constante de dissociação (KD) entre 10 nM e 10 pM, por exemplo, entre 10 nM e 0,1 nM, preferencialmente entre 5 nM e 0,1 nM, mais preferencialmente entre 5 nM e 1 nM.

36. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos itens 7 a 35, em que o referido HSA-BD compreende: (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma de SEQ ID NOs: 149 e 173; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 150 e 174; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 151 e 175; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 162 e 186; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 163 e 187; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 164 e 188.

37. O anticorpo multiespecífico do item 36, em que o referido HSA-BD compreende: uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 161 e 185; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 171 e 195.

38. O anticorpo multiespecífico do item 36, em que o referido HSA-BD compreende: uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 161 e 185; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 171 e 195.

39. O anticorpo multiespecífico do item 36, em que o referido HSA-BD compreende: (a) uma sequência VH da SEQ ID NO: 161 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 171; ou (b) uma sequência VH da SEQ ID NO: 185 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 195.

40. O anticorpo multiespecífico do item 36, em que o referido HSA-BD compreende: (a) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 149, 150 e 151, respectivamente, e sequências

LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 162, 163 e 164, respectivamente, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 161 e uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 171; ou (b) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 173, 174 e 175, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 186, 187 e 188, respectivamente, e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 185; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 195.

41. O anticorpo multiespecífico do item 1, em que o referido anticorpo está em um formato selecionado do grupo que consiste em um diacorpo de cadeia única (scDb), um scDb em tandem (Tandab), um scDb dimérico linear (LD-scDb), um scDb dimérico circular (CD-scDb), um ativador de células T biespecífico (BiTE; di-scFv em tandem), tri-scFv em tandem, tricorpo (Fab-(scFv)2) ou bicorpo (Fab-(scFv)1), Fab, Fab-Fv2, Morrison (fusão IgG CH3- scFv (Morrison L) ou fusão IgG CL-scFv (Morrison H)), triacorpo, scDb-scFv, Fab2 biespecífico, di-minianticorpo, tetracorpo, fusão scFv-Fc-scFv, fusão scFv-HSA-scFv, di-diacorpo, DVD-Ig, COVD, IgG-scFab, fusões scFab-dsscFv, Fv2-Fc, IgG-scFv, como bsAb (scFv ligado ao terminal C da cadeia leve), Bs1Ab (scFv ligado ao terminal N da cadeia leve), Bs2Ab (scFv ligado ao terminal N da cadeia pesada), Bs3Ab (scFv ligado ao terminal C da cadeia pesada), Ts1Ab (scFv ligado ao terminal N de ambas as cadeia pesada e cadeia leve), Ts2Ab (dsscFv ligado ao terminal C da cadeia pesada), anticorpos biespecíficos baseados em domínios Fc heterodiméricos, como anticorpos Knob-into-Hole (KiHs); um Fv, scFv, scDb, tandem-di-scFv, tri-scFv em tandem, Fab-(scFv)2, Fab-(scFv)1, Fab, Fab-Fv2, COVD fundido ao N- e/ou ao C- terminal de qualquer cadeia de um domínio Fc heterodimérico ou qualquer outro domínio de heterodimerização, um MATCH e DuoBodies.

42. O anticorpo multiespecífico do item 1, em que o referido anticorpo é um scDb compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 209, 210, 211, 212, 213, 214 e 215.

43. O anticorpo multiespecífico do item 1, em que o referido anticorpo é um scDb-scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230 e 231, de preferência em que o referido anticorpo é um scDb-scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 229 ou SEQ ID NO: 231, mais preferencialmente em que o referido anticorpo é um scDb-scFv compreendendo uma sequência de aminoácido SEQ ID NO: 231.

44. Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo multiespecífico de qualquer um dos itens anteriores e um veículo farmaceuticamente aceitável.

45. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos itens 1 a 43 ou a composição farmacêutica do item 44 para uso como medicamento.

46. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos itens 1 a 43 ou a composição farmacêutica do item 44 para uso no tratamento de um câncer em um indivíduo em necessidade.

47. Uso do anticorpo multiespecífico de qualquer um dos itens 1 a 43 ou a composição farmacêutica do item 44 para o tratamento de um câncer em um indivíduo em necessidade.

48. Uso do anticorpo multiespecífico de qualquer um dos itens 1 a 43 ou a composição farmacêutica do item 44 na fabricação de um medicamento para tratamento de um câncer, em um indivíduo em necessidade.

49. Método para tratar um câncer em um indivíduo em necessidade, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo multiespecífico de qualquer um dos itens 1 a 43 ou a composição farmacêutica do item 44.

50. O anticorpo multiespecífico de qualquer um dos itens 45 a 46 ou o uso de qualquer um dos itens 47 a 48 ou o método do item 49, em que o referido câncer é um câncer positivo para PDL1, de preferência em que o referido câncer expressa altos níveis de PDL1 em comparação com um tecido saudável.

51. Um ácido nucleico que codifica o anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer um dos itens 1 a 43 ou um domínio de ligação seu ou um fragmento seu.

52. Um vetor compreendendo o ácido nucleico do item 51.

53. Uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico do item 51 ou o vetor do item 52.

54. Método para produzir o anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer um dos itens 1 a 43, o método compreendendo a etapa cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico de acordo com o item 51 ou um vetor de acordo com o item 52.

55. Um kit compreendendo o anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer um dos itens 1 a 43, ou a composição do item

44.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0025] FIG. 1 Reticulação de receptores co-estimuladores de células T por, por exemplo, uma IgG bivalente de comprimento total suporta a estimulação global de células T, resultando em toxicidades limitantes pela dose (A). As moléculas monovalentes bi/trispecíficas estáveis da presente invenção não podem reticular (ou, por extensão, agonizar) receptores co- estimuladores em células T na ausência do tipo de célula alvo para depleção (B). As moléculas monovalentes bi-/tri-específicas estáveis da presente invenção reticulam (ou, por extensão, agonizam) receptores co-estimuladores em células T na presença do tipo de célula que é alvo de depleção (C).

[0026] FIG. 2 Ligação concomitante às PDL1 e CD137 aciona a ativação seletiva das células T reativas ao tumor e bloqueia simultaneamente a sinalização de PD-1.

[0027] FIG. 3 Efeito do conjunto de CDR e seleção da estrutura na neutralização da interação PDL1/PD-1 no ensaio do gene repórter NFAT-Luciferase. A % de inibição proporcional ao sinal de luminescência obtido no ensaio é representada em função das concentrações das moléculas em ng/ml. O avelumabe foi usado como referência.

[0028] FIG. 4 Efeito da otimização de domínio na potência de neutralização da interação PDL1/PD-1 no ensaio do gene repórter NFAT-Luciferase. A % de inibição proporcional ao sinal de luminescência obtido no ensaio é representada em função das concentrações de scFvs em ng/ml. O avelumabe foi usado como referência.

[0029] FIG. 5 Potência de neutralização da interação PDL1/PD- 1 no ensaio do gene repórter por scDb-scFv PRO963 e PRO1057 (A), PRO1186 e PRO1430 (B), PRO1431 e PRO1432 (C), PRO1431 e PRO1432 (C), PRO1473 (D), PRO1476 (E), PRO1479 (F), PRO1482 (G), PRO1480 e PRO1481 (H) na presença de albumina sérica humana recombinante. A % de inibição proporcional ao sinal de luminescência obtido no ensaio é representada em função das concentrações de scFvs em ng/ml. O avelumabe foi usado como referência.

[0030] FIG. 6 Potência da molécula bivalente e influência da fusão de LC ou HC scFv nos formatos Morrison na potência de neutralização da interação PDL1/PD-1 no ensaio do gene repórter NFAT-Luciferase. A % de inibição proporcional ao sinal de luminescência obtido no ensaio é representada em função das concentrações das moléculas em ng/ml. O avelumabe foi usado como referência.

[0031] FIG. 7 ELISA de competição PD-1/PDL1. Todas as moléculas bloquearam potentemente a interação entre PD-1 e PDL1, com valores de IC50 semelhantes ou menores que a referência IgG avelumab.

[0032] FIG. 8 ELISA de competição B7.1/PDL1. De modo semelhante para avelumab, todas as moléculas potentemente bloquearam a interação entre B7.1 e PDL1.

[0033] FIG. 9 Nenhuma inibição da ligação de CD137 a CD137L no ELISA de competição. A absorbância medida no ELISA competitivo que avalia a ligação de CD137L a CD137 está representada em função do aumento das concentrações de PRO885 (A), PRO951 (B), PRO1359 e PRO1360 (C). O anticorpo inibitório anti-humano de cabra CD137 serviu de referência.

[0034] FIG. 10 Mapa de calor dos resultados do escaneamento de epítopos de PRO885, PRO951, IgG de coelho derivado do clone 38-27-A11 e urelumab e utomilumab. Nível de ligação normalizado para Rmax teórico em porcentagem (%) de moléculas de analito (coluna) para moléculas imobilizadas (linha). Nenhuma ligação (cinza escuro) significa o mesmo epítopo, cinza claro significa que a molécula secundária (analito) pode se ligar e possui outro epítopo que a molécula imobilizada.

[0035] FIG. 11 Sensograma de escaneamento de epítopos do PRO885. O PRO885 foi imobilizado no chip sensor e a CD137 foi capturada pelo PRO885 em uma primeira etapa (lado esquerdo), seguido de injeções dos 4 anticorpos diferentes (lado direito). O PRO951, assim como os concorrentes, foi capaz de se ligar ao CD137 capturado, enquanto uma injeção do PRO885 não mostrou nenhuma ligação.

[0036] FIG. 12 Sensograma de escaneamento de epítopos do PRO951. O PRO951 foi imobilizado no chip sensor e o CD137 foi capturado pelo PRO951 em uma primeira etapa (lado esquerdo), seguido de injeções dos 4 anticorpos diferentes (lado direito).

O PRO885, assim como o urelumab, foi capaz de se ligar ao CD137 capturado, enquanto uma injeção de utomilumab e PRO951 não mostrou ligação adicional.

[0037] FIG. 13 Ativação do CD137 por PRO885 e PRO951, conforme avaliado no ensaio do gene repórter NFkB-Luciferase. Na presença de células que expressam PDL1, PRO885 e PRO951 ativaram a sinalização de CD137 em células Jurkat, enquanto nenhuma ativação foi observada quando as células CHO WT foram testadas. O urelumab ativou a sinalização de CD137 independentemente da expressão de PDL1. A luminescência foi lida 6h após a adição das células repórteres Jurkat e os dados foram ajustados usando ajuste sigmoidal 4PL (GraphPad Prism).

[0038] FIG. 14 Ativação de CD137 no ensaio do gene repórter NFkB-Luciferase por scDb com diferentes afinidades para PDL1 e CD137. Na presença de células CHO que expressam PDL1, todos os scDb ativaram a sinalização de CD137 nas células Jurkat, enquanto nenhuma ativação foi observada quando as células CHO WT foram testadas. O urelumab ativou a sinalização de CD137 independentemente da expressão de PDL1. A luminescência foi lida 6h após a adição das células repórteres Jurkat e os dados foram ajustados usando ajuste sigmoidal 4PL (GraphPad Prism).

[0039] FIG. 15 Ativação de CD137 no ensaio do gene repórter NFkB-Luciferase por scDb com diferentes afinidades para PDL1 e CD137. Na presença de PDL1 expressando células HCC827, todos os scDb ativaram a sinalização de CD137 em células Jurkat. O urelumab serviu como molécula de referência para avaliar a ativação relativa da sinalização de CD137. A potência aumentou ligeiramente com o aumento da afinidade para CD137 e PDL1. Uma diminuição do sinal em altas concentrações (curva em forma de sino) foi mais acentuada com o aumento da afinidade com CD137, enquanto o aumento da afinidade com PDL1 não contribuiu para esse efeito. A luminescência foi lida 6 h após a adição das células repórteres Jurkat e os dados foram ajustados usando ajuste sigmoidal 4PL (GraphPad Prism).

[0040] FIG. 16 Ativação de CD137 no ensaio do gene repórter NFkB-Luciferase por scDb com diferentes afinidades para PDL1 e CD137. Na presença de PDL1 expressando células HCC827 estimuladas com IFNy, durante 24 h a 10 ng/ml, STR enxertado com scDb ativou a sinalização de CD137 em células Jurkat. O urelumab serviu como molécula de referência para avaliar a ativação relativa da sinalização de CD137. A potência aumentou ligeiramente com o aumento da afinidade para CD137 e PDL1. Uma diminuição do sinal em altas concentrações (curva em forma de sino) foi mais acentuada com o aumento da afinidade com CD137, enquanto o aumento da afinidade com PDL1 não contribuiu para esse efeito. A luminescência foi lida 6 h após a adição das células repórteres Jurkat e os dados foram ajustados usando ajuste sigmoidal 4PL (GraphPad Prism).

[0041] FIG. 17 Ativação de CD137 por moléculas com meia-vida sérica prolongada no ensaio do gene repórter NFkB-Luciferase após 6 h. Na presença de células CHO que expressam PDL1, moléculas de meia-vida longas ativaram a sinalização de CD137 em células Jurkat, enquanto nenhuma ativação foi observada quando as células CHO WT foram testadas. O urelumab ativou a sinalização de CD137 independentemente da expressão de PDL1. Curiosamente, apesar das afinidades semelhantes aos dois alvos, o PRO1057 mostrou um sinal máximo muito maior que o PRO1058. E ainda, o monovalente scDb-scFv PRO1057 mostrou ativação mais forte do que o respectivo PRO1060 de formato Morrison bivalente. A luminescência foi lida 6 h após a adição das células repórteres Jurkat e os dados foram ajustados usando ajuste sigmoidal 4PL (GraphPad Prism).

[0042] FIG. 18 Ativação de CD137 por moléculas com meia-vida sérica prolongada no ensaio do gene repórter NFkB-Luciferase após 24 h. Na presença de células CHO que expressam PDL1, moléculas de meia-vida longas ativaram a sinalização CD137 em células Jurkat, enquanto nenhuma ativação foi observada quando as células CHO WT foram testadas. O urelumab ativou a sinalização de CD137 independentemente da expressão de PDL1. Curiosamente, apesar das afinidades semelhantes aos dois alvos, o PRO1057 mostrou um sinal máximo muito maior que o PRO1058, que após 24 horas excedeu até a atividade do scDb Pro885. Além disso, o scDb- scFv PRO1057 monovalente mostrou uma ativação muito mais forte que o respectivo formato bivalente de Morrison PRO1060. A luminescência foi lida 24 h após a adição de células repórteres Jurkat e os dados foram ajustados usando o ajuste sigmoidal 4PL (GraphPad Prism).

[0043] FIG. 19 (A) ativação de CD137 por moléculas com meia- vida prolongada, após 24 h. Na presença de células HCC827 não estimuladas ou estimuladas com IFNy a 10 ng/ml por 24 h, moléculas de meia-vida longas ativaram a sinalização de CD137 nas células Jurkat. O urelumab serviu como molécula de referência para avaliar a ativação relativa da sinalização CD137. O scDb- scFv PRO1057 monovalente mostrou maior ativação máxima que o respectivo formato bivalente de Morrison PRO1060. A luminescência foi lida 24 h após a adição das células repórteres Jurkat e os dados foram ajustados usando ajuste sigmoidal 4PL

(GraphPad Prism). (B) As moléculas scDb-scFv tri-específicas PRO1430, PRO1431, PRO1432, PRO1473, PRO1476, PRO1479, PRO1480, PRO1481 e PRO1482 foram testadas no ensaio de atividade de CD137 na presença de HCC827 estimulado por IFNy (10 ng/ml) por 6 h e 24 h. Nesta experiência, o PRO885 serviu como molécula de referência para avaliar a ativação relativa da sinalização de CD137. A molécula scDb-scFv tri-específica PRO1186 foi levada junto em cada placa para comparar sua atividade com as outras moléculas scDb-scFv. A luminescência foi lida 6 h ou 24 h após a adição das células repórteres Jurkat e as concentrações das moléculas testadas com valores crescentes de RLU foram ajustadas apenas usando o ajuste sigmoidal 4PL (GraphPad Prism).

[0044] FIG. 20 Ativação de células T ex vivo. O acoplamento co-estimulador da PDL1 e CD137 por PRO885 é mostrado, levando à produção de IL-2 claramente acima dos níveis de base de IL-2. As células CHO-A2 são células transgênicas CHO que expressam PDL1.

[0045] FIG. 21 Ensaio de ativação de células T ex vivo. PBMC foram estimulados com SEA a 10 ng/ml e tratados com diluições em série da molécula de referência avelumab, um coquetel das moléculas de referência avelumab e urelumab, ou scFv PRO997, scDb PRO885 ou scDb PRO885 ou scDb-scFvs PRO1430, PRO1479 e PRO1480 por 96 h. A ativação das células T foi avaliada por quantificação de IL-2 em sobrenadantes colhidos por ELISA. O tratamento com PRO885, PRO997, PRO1430, PRO1479 e PRO1480 resultou em secreção de IL-2 pronunciada. O PRO997 apresentou maior potência que avelumab. PRO885 mostrou tamanho de efeito muito aumentado, quando comparado com avelumab. O tratamento com scDb-scFvs resultou em secreção pronunciada de IL-2 quando comparado ao coquetel das moléculas de referência. O PRO 1480 apresentou tamanho de efeito muito maior quando comparado aos outros scDb-scFvs. Os dados foram ajustados usando o ajuste sigmoidal 4PL (GraphPad Prism).

[0046] FIG. 22 Representação esquemática dos formatos exemplares dos anticorpos multiespecíficos da divulgação: diacorpos de cadeia única (scDb) (A), scDb-scFvs (B), moléculas de IgG-scFv (C e D).

[0047] FIG. 23 Ensaio de ativação de células T ex vivo. (A)- (D) PBMC foram estimulados com SEA a 10 ng/ml (enterotoxina estafilocócica A) e tratados com diluições em série de avelumab, urelumab, a combinação de avelumab e urelumab, o scDb PRO885, e a scDb-scFv PRO1175 ou PRO 1186 por 96 h. A ativação das células T foi avaliada por quantificação de IL-2 em sobrenadantes colhidos por ELISA. PRO1175 e PRO 1186 mostraram potência superior para estimular a produção de IL-2 em PMBC, quando comparados com a combinação de avelumab e urelumab. Os dados foram ajustados usando o ajuste sigmoidal 4PL (GraphPad Prism). (E)-(I) PBMC estimulados com 10 ng/ml de SEA foram tratados com diluições em série das moléculas scDb-scFv PRO1430, PRO1431, PRO1476, PRO1479, PRO1482 por 96 h. A molécula scDb-scFv tri- específica PRO1186 serviu como molécula de referência para avaliar a produção relativa de IL-2 em PBMCs em cada placa. PRO1430, PRO1479 e PRO1482 demonstraram potência superior para estimular a produção de IL-2 em PMBCs quando comparadas às outras moléculas scDb-scFv. As concentrações das moléculas testadas com valores crescentes de IL-2 foram ajustadas apenas com ajuste sigmoidal 4PL (GraphPad Prism). (J)-(K) PBMCs de doadores saudáveis foram incubados por 3 dias na presença de um anticorpo anti-CD3. PDL1 humano expressando células CHO e diluições em série de avelumab, urelumab, combinação avelumab/urelumab ou anti-PDL1xCD137 PRO 1186 (scDb-scFv2) foram adicionados à cultura. A secreção de IFNγ foi avaliada por ELISA. O PRO 1186 foi mais potente para induzir a produção de IL-2 (J) e IFNγ (K) do que avelumab ou urelumab, ou a combinação dos dois. Na ausência de anticorpos anti-CD3, os níveis de IL-2 e IFNγ eram comparáveis à secreção basal de citocinas em todas as concentrações testadas, mostrando a necessidade de sinalização de TCR ou envolvimento de CD3 para sinalização produtiva de CD137. (L) Estimulação de células T ex vivo no ensaio SEA PBMC pela molécula scDb-scFv PRO1186 e combinações de CDG7 anti- humano e IgGs PDL1 anti-humano. As RLUs medidas normalizadas para Urelumab são representadas em função das concentrações de moléculas em ng/ml. (M) Secreção máxima de IL-2 de células T ex vivo no ensaio SEA PBMC pela molécula scDb-scFv PRO1186 e combinações de IgGs anti-humano CD137 e anti-humano PDL1. A média dos níveis de IL-2 em altas concentrações das moléculas testadas (8000, 1600, 320 ng/ml) foram calculadas e comparadas. O PRO1186 mostrou níveis estatisticamente significativos de IL-2 maiores do que as combinações de IgGs (p <0,0001). Análise estatística por ANOVA 1way e teste de comparações múltiplas de Tukey.

[0048] FIG. 24 Atividade antitumoral dos anticorpos multiespecíficos PRO1057 (scDb-scFv anti-PDL1xCD137xHSA) e PRO1060 (formato Morrison anti-PDL1xCD137) em comparação com a terapia anti-PDL1 (PRO1137) e anti-CD137 (PRO1138 ou urelumab) em xenoenxertos HCC827 NCCLC humanos usando a cepa de camundongos NOG imunodeficientes e células mononucleares do sangue periférico humano alogênico (hPBMC). Camundongos foram tratados com os anticorpos multiespecíficos (PRO1057 e PRO1060), anti-

PDL1 (PRO1037), anti-CD137 (PRO1038 ou urelumab) ou veículo i.p. nos dias 0, 3, 7 e 10. A atividade relativa comparada a 0,1 mg de dose de avelumab é indicada entre parêntesis como unidades relativas (rU). Os volumes tumorais foram medidos duas vezes por semana até os camundongos serem sacrificados nos dias 17 e 18. Os volumes tumorais são normalizados para o volume tumoral no início do tratamento (volume relativo do tumor). (A) Volumes médios relativos do tumor (n = 8 camundongos por grupo) de camundongos reconstituídos com PBMCs de dois doadores. A linha pontilhada indica a hora do tratamento. (B) Volumes médios relativos do tumor de camundongos reconstituídos com PBMCs do doador B (n = 4 camundongos por grupo). (C) Volumes tumorais relativos individuais de camundongos reconstituídos com PBMCs de dois doadores. Cada símbolo representa um animal individual dentro do mesmo grupo de tratamento. (D) Volumes tumorais relativos individuais de camundongos reconstituídos com PBMCs do doador B. Cada símbolo representa um animal individual dentro do mesmo grupo de tratamento.

[0049] FIG. 25 Xenoenxerto de HCC827 em camundongos NOG substituídos de hPBMC. O peso corporal de camundongos NOG HCC827 desafiados mediante tratamento com anticorpos multiespecíficos PRO1057 (scDb-scFv anti-PDL1xCD137xHSA) e PRO1060 (formato Morrison anti-PDL1xCD137) em comparação com terapia anti-PDL1 (PRO1137) e anti-CD137 (PRO1138 ou urelumab). O peso corporal foi medido duas vezes por semana até os camundongos serem sacrificados nos dias 17 e 18.

[0050] FIG. 26 Xenoenxerto HCC827 em camundongos NOG substituídos de hPBMC. Linfócitos infiltrantes de tumor de camundongos NOG desafiados de HCC827 tratados com anticorpos multiespecíficos PRO1057 (scDb-scFv anti-PDL1xCD137xHSA) e PRO1060 (formato Morrison anti-PDL1xCD137) e anti-PDL1 (PRO1137) ou anti-CD137 (PRO1138 ou anticorpos anti-CD137 (PRO1138 ou urelumab), respectivamente) foram estudados por citometria de fluxo. (A) Frequência de células T reguladoras humanas (CD4+, FoxP3+) é mostrada como porcentagem de células CD45+. (B) A proporção de frequência de células T CD8+ humanas e frequência de células T reguladoras humanas (Treg) no microambiente tumoral (TME) é representada. Cada símbolo representa um animal individual dentro do mesmo grupo de tratamento.

[0051] FIG. 27 Xenoenxerto HCC827 em camundongos NOG substituídos de hPBMC. Linfócitos infiltrantes de tumor de camundongos NOG desafiados de HCC827 tratados com anticorpos multiespecíficos PRO1057 (scDb-scFv anti-PDL1xCD137xHSA) e PRO1060 (formato Morrison anti-PDL1xCD137) e anti-PDL1 (PRO1137) ou anti-CD137 (PRO1138 ou anticorpos anti-CD137 (PRO1138 ou urelumab), respectivamente) foram estudados por citometria de fluxo. (A) Frequência de células T CD4+ ativadas humanas (CD4+, PD-1+) é mostrada como porcentagem de células CD45+. (B) A frequência de células T CD8+ ativadas humanas (CD 8+, PD-1+) é mostrada como porcentagem de células CD45+. Cada símbolo representa um animal individual dentro do mesmo grupo de tratamento.

[0052] FIG. 28 Avaliação da eficácia antitumoral do bloqueio PDL1 e estimulação localizada concomitante de CD137 em camundongos NOG enxertados com células-tronco hematopoiéticas CD34+ derivadas de sangue do cordão umbilical humano (UCB HSCs). A atividade anti-tumoral do anticorpo multiespecífico PRO1186 (scDb-scFv anti-PDL1xCD137xHSA) foi comparado com o tratamento com terapia anti-PDL1 de IgG 1 (PRO1196 ou avelumab) e anti- CD137 de IgG 4 (urelumab) ou a combinação do anti-PDL1 IgG1 (PRO1196) com o anti-CD137 IgG4 (PRO1138). Os camundongos foram tratados com palivizumab (0,1 mg), anti-PDL1 de IgG 1 (0,1 mg de PRO1196, ou 0,1 mg de avelumab), anti-CD137 de IgG4 (0,1 mg de urelumab), PRO1186 em 3 diferentes níveis de doses (0,02 mg, 0,1 mg e 0,5 mg), ou uma combinação de anticorpo anti-PDL1 de IgG 1 (PRO1196) e anti-CD137 de IgG4 (PRO1138) (0,1 mg cada) nos dias 0, 5, 10, 15 e 20 (linhas pontilhadas verticais). O crescimento do tumor e o peso corporal foram registrados duas vezes por semana.

[0053] FIG. 29 Avaliação da eficácia antitumoral do bloqueio de PDL1 e estimulação localizada concomitante de CD137 em camundongos NOG enxertados com células-tronco hematopoiéticas CD34+ derivadas de sangue do cordão umbilical humano (UCB HSCs). A atividade anti-tumoral do anticorpo multiespecífico PRO1186 (scDb-scFv anti-PDL1xCD137xHSA; todos os níveis de dose combinados) foi comparada com o tratamento com anti-PDL1 de IgG 1 (PRO1196 e avelumab combinado) e anti-CD137 de IgG4 (urelumab) ou a combinação anti-PDL1 de IgG1 (PRO1196) com a anti-CD137 de IgG4 (PRO1138). Todas as estatísticas foram calculadas usando GraphPad Prism Versão 6. A significância estatística foi determinada usando o teste unidirecional ANOVA aplicando a correção de Bonferroni. Os gráficos mostram média com 95% de IC (intervalo de confiança). O crescimento do tumor e o peso corporal foram registrados duas vezes por semana.

[0054] FIG. 30 Avaliação da eficácia antitumoral em camundongos NOG enxertados com células-tronco hematopoiéticas CD34+ derivadas do sangue do cordão umbilical humano (UCB HSCs).

O peso corporal e o volume relativo do tumor, após tratamento com o anticorpo multiespecífico PRO1186 (scDb-scFv anti- PDL1xCD137xHSA) foram comparados com o tratamento com terapia de anti-PDL1 de IgG 1 (PRO1196 ou avelumab) e anti-CD137 de IgG 4 (urelumab) ou a combinação de anti-PDL1 de IgG1 (PRO1196) com anti-CD137 de IgG4 (PRO1138).

[0055] FIG. 31 Linfócitos infiltrantes de tumor de camundongos NOG desafiados por HCC827 enxertados com células- tronco CD34+ hematopoiéticas derivadas de sangue de cordão umbilical humano (HSCs UCB) foram analisados após o tratamento com o anticorpo multiespecífico PRO1186 (scDb-scFv anti- PDL1xCD137xHSA) ou anti-PDL1 de IgG 1 (PRO1196 ou avelumab) ou anti-CD137 de IgG4 (urelumab) isoladamente, ou a combinação de anti-PDL1 de IgG1 (PRO1196) com anti-CD137 de IgG4 (PRO1138). A terapia de anti-PDL1xCD137 levou a maior frequência de células T citotóxicas (CD8+, GrB+) e aumento na razão CD8+/CD4+ e CD8+,GrB+/Treg no tumor.

[0056] FIG. 32 linfócitos infiltrantes de tumor de camundongos NOG desafiados com HCC827 enxertados com células estaminais hematopoiéticas do cordão umbilical humanas derivadas de sangue CD34+ (UCB HSCs) e tratados com o anticorpo multiespecífico PRO1186 (scDb-scFv anti-PDL1xCD137xHSA) foram analisados. O tratamento com o anticorpo multiespecífico PRO1186 (scDb-scFv anti-PDL1xCD137xHSA; todos os níveis de dose combinados) foi comparado a tratamentos com anti-PDL1 de IgG1 sozinho (PRO1196 e avelumab combinados, anti-CD137 de IgG4 sozinho (urelumab), ou a combinação do anti-PDL1 de IgG1 (PRO1196) com o anti-CD137 de IgG4 (PRO1138). Todos os dados estatísticos foram calculados utilizando GraphPad Prism Versão

6. A significância estatística foi determinada utilizando ANOVA unidirecional aplicando a correção de Bonferroni. os gráficos mostram a média com IC de 95% (intervalo de confiança). A terapia anti-PDL1xCD137 levou a maior frequência de células T citotóxicas (CD8+) no tumor.

[0057] FIG. 33 A análise farmacocinética para quantificar o anticorpo multiespecífico PRO1186 (scDb-scFv anti- PDL1xCD137xHSA) em amostras de soro de animais em estudo de xenoenxerto de HCC827 utilizando camundongos NOG substituídos com células estaminais CD34+ humanas. As concentrações de PRO1186 (scDb-scFv anti-PDL1xCD137xHSA) em amostras de soro diluídas foram interpoladas a partir da curva de calibração. Os parâmetros farmacocinéticos foram estimados por meio do suplemento de software PK solver, usando uma abordagem não compartimental.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0058] Embora a utilização de anticorpos terapêuticos que agonizam CD137 seja uma estratégia de tratamento muito promissora, ela está associada a dificuldades como baixa eficácia dos anticorpos agonistas anti-CD137 e suas altas toxicidades e eventos adversos. A reticulação de receptores co- estimuladores de células T por, por exemplo, uma IgG bivalente de comprimento total, como no caso do urelumab, suporta a estimulação global das células T, resultando em toxicidades limitantes pela dose (Figura 1A). Existe assim uma necessidade no campo da medicina por novos anticorpos agonistas anti-CD137, que são capazes de potentemente induzir sinalização de CD137 sem superestimulação sistêmica de células T e, portanto, que tenham menor taxa de toxicidades limitativas pela dose e eventos adversos em relação aos anticorpos atualmente disponíveis.

[0059] A presente invenção fornece um anticorpo multiespecífico compreendendo: (a) pelo menos um domínio de ligação a CD137 (CD137-BD) e (b) pelo menos um domínio de ligação a PDL1 (PDL1-BD). O anticorpo multiespecífico da presente divulgação é capaz de agonizar a sinalização de CD137 de uma maneira direcionada, por exemplo, em um local de interesse, nomeadamente no microambiente tumoral positivo para PDL1. O anticorpo multiespecífico da presente invenção é capaz de mediar, por exemplo, agonizar, a sinalização de CD137 potente, sem qualquer necessidade pela reticulação por anticorpo secundário F(ab')2 anti-humano ou imobilização de plástico de cultura de tecidos, como no caso de PF-05082566 (Fisher et al., Cancer Immunol Immunother 61:1721-1733 (2012)) ou interação de receptor Fcγ. Assim, o anticorpo multiespecífico da presente invenção devido à sua capacidade de mediar, por exemplo, agonizar a sinalização potente de CD137 sem interagir com o receptor Fcγ, não leva à depleção de células que expressam CD137. Além disso, foi surpreendentemente descoberto que o anticorpo multiespecífico da presente divulgação, mesmo quando monovalente para CD137, em particular quando compreendendo o novo domínio de ligação de CD137 da presente divulgação, é capaz de aglomerar e agonizar CD137, no entanto apenas na presença de células PDL1 positivas, evitando a ativação sistêmica de CD137. A ligação monovalente a CD137 e a estrutura com menos Fc do anticorpo multiespecífico garantem que o agonismo de CD137 em células efetoras só possa surgir quando o anticorpo se liga concomitantemente a PDL1 na superfície das células alvo.

[0060] Além disso, foi surpreendentemente descoberto que, o anticorpo multiespecífico da presente divulgação compreendendo (a) pelo menos um domínio de ligação a CD137 (CD137-BD), (b) pelo menos um domínio de ligação a PDL1 (PDL1-BD) e (c) pelo menos um domínio de ligação à albumina sérica humana (HSA-BD) demonstrou propriedades benéficas adicionais, como (i) agrupamento aprimorado de CD137 em comparação com anticorpos bivalentes não reticulados, (ii) aumento da meia-vida dos anticorpos enquanto retém a capacidade para bloquear PDL1 e para agonizar CD137, e (iii) uma cinética benéfica (por exemplo, níveis mais elevados de ativação CD137). Além disso, a adição de um domínio anti-HSA com meia vida estendida não apenas permite uma dosagem conveniente, mas também deve promover a entrega da molécula aos microambientes do tumor.

[0061] Os anticorpos multiespecíficos da presente invenção fornecem assim vantagens terapêuticas distintas sobre composições e terapias convencionais.

[0062] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é comumente entendido pelos versados na técnica à qual esta invenção se refere.

[0063] Os termos "compreendendo" e "incluindo" são usados neste documento em seu sentido aberto e não limitativo, a menos que indicado de outra forma. No que diz respeito a essas últimas concretizações, o termo "compreendendo" inclui, assim, o termo mais restrito "consistindo em".

[0064] Os termos "um" e "uma" e "o" e "a" e referências semelhantes no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações a seguir) devem ser interpretados para abranger tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contradito pelo contexto. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma pluralidade de células, incluindo suas misturas. Quando a forma plural é usada para compostos, sais e similares, isso significa também um único composto, sal ou semelhante.

[0065] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a um anticorpo multiespecífico compreendendo: (a) pelo menos um domínio de ligação a CD137 (CD137-BD) e (b) pelo menos um domínio de ligação a PDL1 (PDL1-BD).

[0066] O termo "anticorpo" e similares, como usados aqui, incluem anticorpos inteiros ou cadeias únicas dos mesmos; e qualquer fragmento de ligação ao antígeno (isto é, "porção de ligação ao antígeno") ou cadeias únicas do mesmo; e moléculas compreendendo CDRs de anticorpos, regiões VH ou regiões VL (incluindo, sem limitação, anticorpos multiespecíficos). Um "anticorpo inteiro" de ocorrência natural é uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada é composta por uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada é composta por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é composta por uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve é composta por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs dispostos a partir do terminal amino para o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis de cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.

[0067] Os termos "domínio de ligação", "seu fragmento de ligação ao antígeno", "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo e semelhantes, conforme usados aqui, referem-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo intacto que retêm a capacidade de se ligarem especificamente a um determinado antígeno (por exemplo, CD137, PDL1, HSA). As funções de ligação ao antígeno de um anticorpo podem ser realizadas por fragmentos de um anticorpo intacto. Em algumas concretizações, um domínio de ligação de um anticorpo multiespecífico da presente invenção é selecionado a partir do grupo que consiste em um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; um fragmento F(ab)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de charneira; um fragmento Fd consistindo em domínios VH e CH1; um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; um fragmento de anticorpo de domínio único (dAb) (Ward et al., 1989 Nature 341: 544-546), que consiste em um domínio VH; uma região determinante de complementaridade isolada (CDR), dsFv, um scAb, STAB, um anticorpo de domínio único (sdAb ou dAb), um anticorpo de cadeia pesada de domínio único e um anticorpo de cadeia leve de domínio único, um VHH, um VNAR, anticorpos de domínio único com base na estrutura VNAR do tubarão e domínios de ligação baseados em scaffolds alternativos, incluindo, mas limitados a, domínios baseados em anquirina, fynômeros, avímeros, anticalinas, fibronectinas e locais de ligação que estão sendo construídos em regiões constantes de anticorpos (por exemplo, tecnologia F-star (Tecnologia de Anticorpo Modular da F-StarTM). Adequadamente, um domínio de ligação da presente invenção é um fragmento Fv de cadeia única (scFv) ou domínios variáveis de anticorpo único. Numa concretização preferida, um domínio de ligação da presente invenção é um fragmento Fv de cadeia única (scFv).

[0068] O termo "Regiões Determinantes de Complementaridade" ("CDRs") refere-se a sequências de aminoácidos com limites determinados usando qualquer um de vários esquemas bem conhecidos, incluindo os descritos por Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5ª ed. Serviço de Saúde Pública, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda, MD (esquema de numeração “Kabat”), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 (esquema de numeração “Chothia”), numeração ImMunoGenTics (IMGT) (Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003) (esquema de numeração "IMGT") e esquema de numeração descrito em Honegger & Pluckthun, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670 (numeração “AHo”). Por exemplo, para formatos clássicos, sob Kabat, os resíduos de aminoácidos CDR no domínio variável de cadeia pesada (VH) são numerados 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) e 95-102 (HCDR3); e os resíduos de aminoácido CDR no domínio variável da cadeia leve (VL) são numerados 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) e 89-97 (LCDR3) sob Chothia, os aminoácidos CDR na VH são numerados 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2) e 95-102 (HCDR3); e os resíduos de aminoácidos em VL são numerados 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) e 89-97 (LCDR3). Definições de CDR de Kabat e Chothia, as CDRs consistem nos resíduos de aminoácidos 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) e 95-102 (HCDR3) na VH humana e nos resíduos de aminoácidos 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) e 89-97 (LCDR3) na VL humana. Sob IMGT, os resíduos de aminoácidos CDR na VH são numerados aproximadamente 26-35 (HCDR1), 51-57 (HCDR2) e 93-102 (HCDR3), e os resíduos de aminoácidos CDR na VL são numerados aproximadamente 27-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) e 89-97 (LCDR3) (numeração de acordo com “Kabat”). Sob IMGT, as CDRs de um anticorpo podem ser determinadas usando o programa IMGT/DomainGap Align.

[0069] No contexto da presente invenção, o sistema de numeração sugerido por Honegger & Pluckthun (“AHo) é usado (Honegger & Pluckthun, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670), a menos que seja mencionado de outra forma. Além disso, os seguintes resíduos são definidos como CDRs de acordo com o esquema de numeração AHo: LCDR1 (também referido como CDR-L1): L24-L42; LCDR2 (também conhecido como CDR-L2): L58-L72; LCDR3 (também referido como CDR-L3): L107-L138; HCDR1 (também referido como CDR-H1): H27-H42; HCDR2 (também referido como CDR-H2): H57-H76; HCDR3 (também referido como CDR-H3): H108-H138. Por uma questão de clareza, o sistema de numeração de acordo com Honegger & Pluckthun leva em consideração a diversidade de comprimentos encontrada nos anticorpos que ocorrem naturalmente, tanto nas diferentes subfamílias VH e VL e, em particular, nas CDRs, e fornece lacunas (gaps) nas sequências. Assim, em um dado domínio variável do anticorpo, geralmente nem todas as posições 1 a 149 serão ocupadas por um resíduo de aminoácido.

[0070] O termo "especificidade de ligação", conforme aqui utilizado, refere-se à capacidade de um anticorpo individual reagir com um determinante antigênico e não com um determinante antigênico diferente. Como aqui utilizado, o termo "se liga especificamente a" ou é "específico para" refere-se a interações mensuráveis e reproduzíveis, como a ligação entre um alvo e um anticorpo, que é determinante da presença do alvo na presença de uma população heterogênea de moléculas incluindo moléculas biológicas. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a um alvo (que pode ser um epítopo) é um anticorpo que se liga a esse alvo com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outros alvos. Na sua forma mais geral (e quando nenhuma referência definida é mencionada), "ligação específica" refere-se à capacidade do anticorpo de discriminar entre o alvo de interesse e uma molécula não relacionada, conforme determinado, por exemplo, de acordo com métodos de ensaio de especificidade conhecidos no estado da técnica. Tais métodos compreendem, mas não estão limitados a, Western blot, ELISA, RIA, ECL, IRMA, SPR (ressonância plasmônica de superfície) e rastreamento de peptídeos. Por exemplo, um teste ELISA padrão pode ser realizado. A pontuação pode ser realizada pelo desenvolvimento de cores padrão (por exemplo, anticorpo secundário com peróxido de rábano silvestre e tetrametil benzidina com peróxido de hidrogênio). A reação em certos poços é pontuada pela densidade óptica, por exemplo, a 450 nm. O contexto típico (= reação negativa) pode ser de cerca de 0,1 OD; reação positiva típica pode ser de cerca de 1 OD. Isso significa que a proporção entre uma pontuação positiva e uma negativa pode ser 10 vezes ou mais. Em um outro exemplo, um ensaio de SPR pode ser realizado, em que pelo menos 10 vezes, preferencialmente pelo menos 100 vezes a diferença entre uma base de referência e um sinal indica uma ligação específica. Tipicamente, a determinação da especificidade de ligação é realizada ao usar não uma única molécula de referência, mas um conjunto de cerca de três a cinco moléculas não relacionadas, como leite em pó, transferrina ou semelhante.

[0071] Adequadamente, o anticorpo da invenção é um anticorpo isolado. O termo "anticorpo isolado", como usado aqui, refere- se a um anticorpo que está substancialmente livre de outros anticorpos com diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a CD137 e PDL1 está substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a antígenos que não CD137 e PDL1, por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a CD137, PDL1 e albumina sérica humana está substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a antígenos que não sejam CD137, PDL1 e albumina sérica humana). Além disso, um anticorpo isolado pode estar substancialmente livre de outro material celular e/ou químicos.

[0072] Adequadamente, o anticorpo da invenção é um anticorpo monoclonal. O termo "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal", conforme usado aqui, refere-se a anticorpos que são substancialmente idênticos à sequência de aminoácidos ou que são derivados da mesma fonte genética. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe uma especificidade e afinidade de ligação para um epítopo específico, ou especificidades e afinidades de ligação para epítopos específicos.

[0073] Os anticorpos da invenção incluem, mas não estão limitados a, quiméricos, humanos e humanizados.

[0074] O termo "anticorpo quimérico" (ou seu fragmento de ligação ao antígeno) é uma molécula de anticorpo (ou seu fragmento de ligação ao antígeno) na qual (a) a região constante, ou uma porção dela, é alterada, substituída ou trocada para que o local de ligação ao antígeno (região variável) esteja ligado a uma região constante de uma classe diferente ou alterada, função efetora e/ou espécie, ou uma molécula totalmente diferente que confere novas propriedades ao anticorpo quimérico, por exemplo, uma enzima, toxina, hormônio, fator de crescimento, droga, etc.; ou (b) a região variável, ou uma porção dela, é alterada, substituída ou trocada por uma região variável com uma especificidade de antígeno diferente ou alterada. Por exemplo, um anticorpo de camundongo pode ser modificado substituindo sua região constante pela região constante de uma imunoglobulina humana. Devido à substituição por uma região constante humana, o anticorpo quimérico pode reter sua especificidade no reconhecimento do antígeno enquanto reduz a antigenicidade no ser humano em comparação com o anticorpo original do camundongo.

[0075] O termo "anticorpo humano" (ou seu fragmento de ligação ao antígeno), conforme aqui utilizado, destina-se a incluir anticorpos (e seus fragmentos de ligação ao antígeno) com regiões variáveis nas quais as regiões framework e CDR são derivadas de sequências de origem humana. Além disso, se o anticorpo contiver uma região constante, a região constante também será derivada dessas sequências humanas, por exemplo, sequências da linha germinativa humana ou versões mutadas das sequências da linha germinativa humana. Os anticorpos humanos e seus fragmentos de ligação ao antígeno da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências humanas (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica do local in vitro ou por mutação somática in vivo). Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antígeno não humano. Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na técnica, incluindo bibliotecas de exibição de fagos (Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol, 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222: 581 (1991)). Também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos os métodos descritos em Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., J. Immunol, 147 (1): 86-95 (1991). Veja também van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001). Os anticorpos humanos podem ser preparados pela administração do antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir esses anticorpos em resposta a um desafio antigênico, mas cujos loci endógenos foram desativados, por exemplo, xenomice imunizado (ver, por exemplo, as patentes US 6.075.181 e 6.150.584 em relação à tecnologia XENOMOUSE™). Veja também, por exemplo, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557- 3562 (2006) em relação a anticorpos humanos gerados através de uma tecnologia de hibridoma de células B humanas.

[0076] Um anticorpo "humanizado" (ou seu fragmento de ligação ao antígeno), como usado aqui, é um anticorpo (ou seu fragmento de ligação ao antígeno) que retém a reatividade de um anticorpo não humano, sendo menos imunogênico em humanos. Isso pode ser conseguido, por exemplo, retendo as regiões CDR não humanas e substituindo as partes restantes do anticorpo por suas contrapartes humanas (isto é, a região constante, bem como as porções estruturais da região variável). Modificações adicionais da região estrutural podem ser feitas nas sequências estruturais humanas, bem como nas sequências CDR derivadas da linha germinativa de outras espécies de mamíferos. Os anticorpos humanizados da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências humanas (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica do local in vitro ou por mutação somática in vivo, ou uma substituição conservadora para promover estabilidade ou fabricação). Ver, por exemplo, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851- 6855, 1984; Morrison e Oi, adv. Immunol., 44: 65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28: 489-498, 1991; e Padlan, Molec. Immun., 31: 169-217,

1994. Outros exemplos de tecnologia de engenharia humana incluem, mas não se limitam à tecnologia Xoma, divulgada na Patente dos EUA 5.766.886.

[0077] O termo "anticorpo humanizado recombinante", conforme usado aqui, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, como anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humanizado, por exemplo, de um transfectoma, e anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva junção (splicing)

de todo ou parte de um gene da imunoglobulina humana, sequências para outras sequências de DNA.

[0078] Adequadamente, o anticorpo da invenção ou seu fragmento de ligação ao antígeno é humanizado. Adequadamente, o anticorpo da invenção ou seu fragmento de ligação ao antígeno é humanizado e compreende CDRs derivadas de coelho.

[0079] O termo "anticorpo multiespecífico", conforme usado aqui, refere-se a um anticorpo que se liga a dois ou mais epítopos diferentes em pelo menos dois ou mais alvos diferentes (por exemplo, CD137 e PDL1). O termo "anticorpo multiespecífico" inclui biespecífico, triespecífico, tetraespecífico, pentaespecífico e hexaespecífico. O termo "anticorpo biespecífico", conforme usado aqui, refere-se a um anticorpo que se liga a dois epítopos diferentes em pelo menos dois alvos diferentes (por exemplo, CD137 e PDL1). O termo "anticorpo triespecífico", conforme usado aqui, refere-se a um anticorpo que se liga a três epítopos diferentes em pelo menos três alvos diferentes (por exemplo, CD137, PDL1 e HSA).

[0080] O termo "epítopo" significa um determinante da proteína capaz de ligação específica a um anticorpo. Os epítopos consistem normalmente em agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e têm geralmente características estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específicas. Epítopos "conformacionais" e "lineares" são diferenciados pelo fato de que a ligação ao primeiro, mas não o último, é perdida na presença de solventes desnaturantes.

[0081] O termo "epítopo conformacional", conforme usado aqui, refere-se a resíduos de aminoácidos de um antígeno que se juntam na superfície quando a cadeia polipeptídica se dobra para formar a proteína nativa e mostram uma taxa significativamente reduzida de troca de HD devido à ligação ao Fab. O epítopo de conformação contém, mas não está limitado a, o epítopo funcional.

[0082] O termo "epítopo linear" refere-se a um epítopo com todos os pontos de interação entre a proteína e a molécula que interage (como um anticorpo) ocorrendo linearmente ao longo da sequência de aminoácidos primária da proteína (contínua).

[0083] O termo "reconhecer", conforme usado aqui, refere-se a um fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo que encontra e interage (por exemplo, se liga) com seu epítopo conformacional.

[0084] Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da presente invenção é monovalente, bivalente ou mutivalente para a especificidade de CD137. Em uma concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção é bivalente para especificidade de CD137. Numa concretização preferida, o anticorpo multiespecífico da presente invenção é monovalente para a especificidade de CD137.

[0085] Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da presente invenção é monovalente, bivalente ou multivalente para especificidade de PDL1. Numa concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção é bivalente quanto à especificidade de PDL1. Numa concretização preferida, o anticorpo multiespecífico da presente invenção é monovalente para a especificidade de PDL1.

[0086] O termo "anticorpo multivalente" refere-se a uma única molécula de ligação com mais de uma valência, em que "valência" é descrita como o número de porções de ligação ao antígeno que se ligam a epítopos em moléculas alvo idênticas. Como tal, a molécula de ligação única pode se ligar a mais de um local de ligação em uma molécula alvo. Exemplos de anticorpos multivalentes incluem, mas não estão limitados a anticorpos bivalentes, anticorpos trivalentes, anticorpos tetravalentes, anticorpos pentavalentes e semelhantes.

[0087] O termo "anticorpo monovalente", como usado aqui, refere-se a um anticorpo que se liga a um único epítopo em uma molécula alvo, como CD137. Além disso, o termo "domínio de ligação" ou "domínio de ligação monovalente", como aqui utilizado, refere-se a um domínio de ligação que se liga a um único epítopo em uma molécula alvo, como CD137.

[0088] O termo "anticorpo bivalente", conforme usado aqui, refere-se a um anticorpo que se liga a dois epítopos em pelo menos duas moléculas alvo idênticas, como as moléculas alvo CD137.

[0089] Recentemente, a fim de obter a função de reticulação adicional e alcançar certos níveis de ativação de CD137, foi proposto o uso de polipeptídeos de fusão multivalentes e multiespecíficos que se ligam a PDL1 e CD137. Eckelman et al. demonstraram que, enquanto o acoplamento bivalente de CD137 no caso de INBRX-105 (um polipeptídeo multivalente e multiespecífico possuindo dois domínios de ligação PDL1, dois domínios de ligação CD137 e uma região Fc) é insuficiente para eficazmente agrupar e mediar a sinalização de CD137 produtiva, o acoplamento de um segundo antígeno de superfície celular PDL1 na presença de células positivas para PDL1 permite maior agrupamento de CD137 e sinalização produtiva (WO 2017/123650).

[0090] Os inventores da presente invenção surpreendentemente descobriram agora que um anticorpo multiespecífico compreendendo (a) apenas um domínio de ligação a CD137 (CD137-BD); e (b) pelo menos um domínio de ligação a PDL1 (PDL1-BD) é capaz de ativar efetivamente a sinalização de CD137 de maneira direcionada. O monovalente estável multiespecífico (por exemplo, bi- /triespecífico) para moléculas CD137 da presente invenção é mostrado não ser capaz de agonizar CD137 nas células T na ausência de um outro tipo de célula, que é reconhecido pelo domínio de ligação PDL1 (Figura 1B). A ativação eficaz de CD137 ocorre apenas na presença de células positivas para PDL1 devido à ligação de domínios anti-PDL1 dos anticorpos multiespecíficos da invenção a moléculas de PDL1 expostas na superfície de células positivas para PDL1 (Figura 1C e Figura 2). Isto leva ao aumento da densidade dos anticorpos multiespecíficos da presente invenção em um local específico e, assim, ao aumento da densidade dos domínios de ligação ao CD137. Os CD137-BDs podem, portanto, efetivamente agrupar e agonizar o CD137. Essa ligação concomitante a PDL1 e CD137 aciona a ativação seletiva de células T reativas a tumores e simultaneamente bloqueia a sinalização de PD-1 (Figura 2). Devido à alta superexpressão de PDL1 nas células tumorais, a sinalização de CD137 é ativada apenas localmente na presença das referidas células tumorais, o que leva a uma toxicidade sistêmica reduzida. Assim, espera-se que o anticorpo da invenção tenha vários efeitos benéficos em comparação com as opções de tratamento atuais. Prevê-se que o anticorpo da invenção tenha (i) menor taxa de eventos adversos relacionados ao sistema imunológico e (ii) menor taxa de toxicidades limitantes pela dose.

[0091] Numa concretização preferida, o anticorpo multiespecífico da presente invenção é monovalente para a especificidade de CD137. Importantemente, o anticorpo multiespecífico monovalente para especificidade de CD137 da presente invenção não é capaz de induzir a sinalização de CD137 sistemicamente devido a uma falta de ativação de CD137 na ausência de agrupamento, o que é causado pela ligação de PDL1- BD ao seu antígeno. Numa concretização, a presente invenção refere-se a um anticorpo multiespecífico compreendendo (a) um CD137-BD; e (b) pelo menos um PDL1-BD, preferencialmente um ou dois PDL1-BDs, mais preferencialmente um PDL1-BD. Assim, o anticorpo multiespecífico da invenção é monovalente, bivalente ou multivalente para especificidade de PDL1, preferencialmente monovalente para especificidade de PDL1. Numa concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende um CD137-BD e um PDL1-BD. Numa concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção consiste em um CD137-BD e um PDL1-BD.

[0092] O termo "CD137" refere-se em particular ao CD137 humano com o número de identificação UniProt Q07011, aqui reproduzido como SEQ ID NO: 197. Adequadamente, o CD137-BD da presente invenção tem como alvo o CD137, em particular o CD137 humano, como mostrado no número de identificação UniProt Q07011, aqui reproduzido como SEQ ID NO: 197. Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da invenção que compreende um BD-CD137 com alvo CD137 humano e de cynomoglous (Macaca fascicularis). De um modo preferido, o anticorpo multiespecífico da invenção que compreende um CD137-BD não bloqueia a interação de CD137/CD137L.

[0093] O CD137-BD da invenção se liga especificamente a CD137. Adequadamente, os anticorpos multiespecíficos da invenção compreendem um CD137-BD, em que o referido CD137-BD se liga especificamente a CD137. Numa concretização específica, o referido CD137-BD tem uma especificidade de ligação ao CD137 humano e não se liga ao CD40 humano e/ou não se liga ao OX40 humano, em particular como determinado por SPR.

[0094] Adequadamente, o CD137-BD da invenção é um agonista de CD137. Um "ativador" ou "anticorpo ativador" ou "agonista" ou "anticorpo agonista" ou "domínios de ligação ao agonista" ou "domínio de ligação de ativação" é aquele que aprimora ou inicia a sinalização pelo antígeno ao qual ele se liga. No contexto da presente invenção, o termo "agonista de CD137" abrange os domínios de ligação a CD137 da invenção que são capazes de ativar a sinalização de CD137 em seu agrupamento, por exemplo, em que a ligação de pelo menos dois dos referidos CD137-BDs permite a multimerização das moléculas CD137 ligadas e sua ativação. Em algumas concretizações, os anticorpos agonistas ativam a sinalização sem a presença do ligante natural.

[0095] Em algumas concretizações, o CD137-BD da invenção é derivado de um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo.

[0096] CD137-BDs adequados para uso no anticorpo multiespecífico da presente invenção são novos domínios de ligação fornecidos na presente divulgação. Os novos CD137-BDs da invenção incluem, mas não estão limitados a, anticorpos monoclonais humanizados isolados como aqui descrito, incluindo nos Exemplos. Exemplos de tais CD137-BDs são anticorpos ou seus domínios de ligação cujas sequências estão listadas na Tabela 1. Detalhes adicionais sobre a geração e caracterização dos anticorpos e domínios de ligação aqui descritos são fornecidos nos Exemplos. Os novos CD137-BDs da presente invenção são particularmente adequados para os fins da presente invenção. Os anticorpos multiespecíficos da presente invenção compreendendo pelo menos um dos referidos CD137-BD, por exemplo, monovalentes para a especificidade de ligação a CD137, são capazes de ativar CD137 na presença de células positivas para PDL1.

[0097] Adequadamente, o CD137-BD especificamente se liga a CD137 e é caracterizado por um ou mais dos seguintes parâmetros: (i) se liga ao CD137 humano com uma constante de dissociação (KD) inferior a 50 nM, particularmente inferior a 10 nM, particularmente inferior a 5 nM, particularmente inferior a 1 nM, particularmente inferior a 1 nM, particularmente inferior a 500 pM, mais particularmente inferior a 100 pM, mais particularmente inferior a 50 pM, particularmente em que o referido anticorpo é um scFv (afinidade monovalente); (ii) se liga ao CD137 humano com uma taxa de Koff de 10−3 s-1 ou menos, ou 10−4 s-1 ou menos, ou 10−5 s-1 ou menos conforme medido por SPR, particularmente em que o referido anticorpo é um scFv; (iii) se liga ao CD137 humano com uma taxa de Kon de pelo menos 104 M-1s-1 ou superior, pelo menos, 105 M-1s-1 ou superior, pelo menos 106 M-1s-1 ou superior, como medido por SPR, particularmente em que o referido anticorpo é um scFv; (iv) opcionalmente, não concorre com o urelumab; (v) opcionalmente, não concorre com o utomilumab;

(vi) opcionalmente, é reativo cruzado com CD137 de Macaca fascicularis (Cynomolgus); e (vii) opcionalmente, não inibe a interação entre CD137 e seu ligante CD137L, em particular conforme medido por ELISA de competição.

[0098] O termo "avidez" refere-se a uma medida informativa da estabilidade ou força geral do complexo anticorpo-antígeno. É controlado por três fatores principais: afinidade do epítopo do anticorpo; a valência do antígeno e do anticorpo; e o arranjo estrutural das partes que interagem. Em última análise, esses fatores definem a especificidade do anticorpo, isto é, a probabilidade de que o anticorpo específico se ligue a um epítopo de antígeno preciso.

[0099] Como usado aqui, o termo "afinidade" refere-se à força da interação entre anticorpo e antígeno em locais antigênicos únicos. Dentro de cada local antigênico, a região variável do anticorpo “braço” interage através de forças não-covalentes fracas com o antígeno em vários locais; quanto mais interações, mais forte a afinidade.

[0100] "Afinidade de ligação" geralmente se refere à força da soma total de interações não covalentes entre um único local de ligação de uma molécula (por exemplo, de um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Salvo indicação em contrário, como usado aqui, "afinidade de ligação", "se liga a", "se ligam a" ou "ligando a" referem-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, um fragmento de anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X pelo seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (KD). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos no estado da técnica, incluindo os aqui descritos. Os anticorpos de baixa afinidade geralmente se ligam ao antígeno lentamente e tendem a se dissociar rapidamente, enquanto os anticorpos de alta afinidade geralmente se ligam ao antígeno mais rapidamente e tendem a permanecer mais tempo ligados. É conhecida no estado da técnica uma variedade de métodos para medir a afinidade de ligação, qualquer um dos quais pode ser utilizado para os fins da presente invenção. Concretizações ilustrativas e exemplares específicas para medir a afinidade de ligação, isto é, a força de ligação são descritas a seguir.

[0101] O termo "Kassoc", "Ka" ou "Kon", conforme usado aqui, é destinado a se referir à taxa de associação de uma interação anticorpo-antígeno específica, enquanto o termo "Kdis", "Kd" ou "Koff”, como aqui utilizado, pretende se referir à taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno específica. Em uma concretização, o termo "KD", como aqui utilizado, destina- se a se referir à constante de dissociação, que é obtida a partir da razão de Kd para Ka (isto é, Kd/Ka) e é expressa como uma concentração molar (M). O “KD” ou “valor de KD” ou "KD" ou "valor de KD" de acordo com esta invenção é uma concretização medida utilizando ensaios de ressonância de superfície plasmônica utilizando um instrumento SPR MASS-1 (Sierra Sensors). Para medir a afinidade, um anticorpo específico para a região Fc das IgG de coelho (Bethyl Laboratories, Cat. Nº A120-111A) é imobilizado em um chip sensor (SPR-2 Affinity Sensor, High Capacity Amine, Sierra Sensors) utilizando um procedimento de acoplamento de amina padrão. Os anticorpos monoclonais de coelho nos sobrenadantes de células B são capturados pelo anticorpo IgG anti-coelho imobilizado. É necessária uma concentração mínima de IgG nos sobrenadantes das células B para permitir a captura suficiente. Após a captura dos anticorpos monoclonais, o CD137 ECD humano (Peprotech, cat. 310-15-1MG) ou, como no caso de PDL1- BD, PDL1 humano (Peprotech) é injetado nas células de fluxo por 3 minutos em uma concentração de 90 nM, e a dissociação da proteína da IgG capturada no chip sensor foi deixada prosseguir por 5 min. Após cada ciclo de injeção, as superfícies são regeneradas com duas injeções de 10 mM de glicina-HCl. As constantes de taxa de dissociação aparente (kd) e de associação (ka) e a constante de equilíbrio aparente de dissociação (KD) são calculadas com o software de análise MASS-1 (Analyzer, Sierra Sensors) usando modelo de ligação Langmuir e a qualidade dos ajustes é monitorada com base no Chi2 relativo (Chi2 normalizado para o nível de ligação máximo extrapolado do analito), que é uma medida da qualidade do ajuste da curva. Quanto menor o valor para o Chi2, mais preciso é o ajuste no modelo de ligação Langmuir individual. Os resultados são considerados válidos se as unidades de resposta (RU) para ligação ao ligante forem pelo menos 2% das RUs para a captura de anticorpos. As amostras com as RUs para a ligação com menos do que 2% dos RUs para captura de anticorpo são consideradas mostrando nenhuma ligação específica de CD137 ou PDL1 ao anticorpo capturado. A constante de dissociação de equilíbrio (KD) é calculada como a relação koff/kon. Ver, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865- 881 (1999).

[0102] Adequadamente, a afinidade do anticorpo multiespecífico da invenção para CD137 pode ser comparável ou superior à afinidade de CD137L para CD137. Adequadamente, a afinidade do anticorpo multiespecífico da invenção para CD137 pode ser comparável ou superior à afinidade de urelumab para CD137. Será observado que a maior afinidade do domínio de ligação a CD137 pode ser particularmente adequada para uso no anticorpo multiespecífico da invenção, em que o referido anticorpo é monovalente para CD137. A afinidade de ligação de um anticorpo ou seu fragmento de ligação pode ser determinada, por exemplo, pela constante de dissociação (KD). Uma afinidade mais forte é representada por um KD mais baixo, enquanto uma afinidade mais fraca é representada por um KD mais alto.

[0103] Assim, numa concretização adequada, o anticorpo multiespecífico da invenção ou a CD 137-BD da invenção liga-se a CD137 humano com um KD de entre 5 a 50.000 pM, 5 a 40.000 pM, 5 a 30.000 pM, 5 a 20.000 pM, 5 a 10.000 pM, 5 a 9.000 pM, 5 a

8.000 pM, 5 a 7.000 pM, 5 a 6.000 pM, 5 a 5.000 pM, 5 a 2.500 pM, 5 a 1.000 pM, 5 a 750 pM, 5 a 500 pM, 5 a 250 pM, 5 a 100 pM, 5 a 75 pM, 5 a 50 pM, 5 a 30 pM, em particular conforme medido por SPR. Em uma concretização adicional, o anticorpo multiespecífico da invenção ou o CD137-BD da invenção se liga ao CD137 humano com uma KD entre 10 nM e 10 pM, preferencialmente entre 10 nM e 0,1 nM, por exemplo, entre 5 nM e 0,1 nM, mais preferencialmente entre 5 nM e 1 nM, em particular como medido por SPR.

[0104] Numa concretização adequada, o anticorpo multiespecífico da invenção ou o CD137-BD da invenção se liga ao CD137 humano com um KD inferior a aproximadamente 50 nM, inferior a aproximadamente 45 nM, inferior a aproximadamente 40 nM, inferior a aproximadamente 35 nM, inferior a aproximadamente 30 nM, inferior a aproximadamente 25 nM, inferior a 20 nM, inferior a aproximadamente 15 nM, inferior a aproximadamente 10 nM, inferior a aproximadamente 9 nM, inferior a aproximadamente 8 nM, inferior a aproximadamente 8 nM, inferior a aproximadamente 7 nM, inferior a aproximadamente 6 nM, inferior a aproximadamente 5 nM, inferior a aproximadamente 4 nM, inferior a aproximadamente 3 nM, inferior a 2 nM, inferior a 1 nM, inferior a 0,5 nM, inferior a 0,25 nM ou inferior a 0,1 nM, inferior a 50 pM, inferior a 40 pM, inferior a 30 pM, inferior a 20 pM, em particular conforme medido por SPR. Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da invenção ou o CD137-BD da invenção liga-se ao CD137 humano com uma KD inferior a 10 nM, em particular como medido por SPR. De preferência, o anticorpo multiespecífico da invenção ou o CD137-BD da invenção liga-se ao CD137 humano com uma KD inferior a 5 nM, em particular como medido por SPR. Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da invenção ou o CD137-BD da invenção liga-se ao CD137 humano com uma KD inferior a 1 nM, em particular como medido por SPR. Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da invenção ou o CD137-BD da invenção liga-se ao CD137 humano com uma KD inferior a 50 pM, em particular como medido por SPR.

[0105] Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da invenção ou o CD137-BD da invenção se liga ao CD137 humano com uma taxa de Kon de pelo menos 103 M-1s-1 ou superior, pelo menos 104 M-1s- 1ou maior, pelo menos 5x104 M-1s-1 ou maior, pelo menos 105 M-1s-1 ou maior, pelo menos 5x105 M-1s-1 ou maior, pelo menos 106 M-1s-1 ou maior, pelo menos 5x106 M-1s-1 ou superior, pelo menos 107 M- 1s-1 ou superior, pelo menos 5x107 M-1s-1 ou superior, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície (SPR).

Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da invenção ou o CD137-BD da invenção se liga ao CD137 humano com uma taxa de Kon de pelo menos 104 M-1s-1 ou superior, em particular pelo menos 105 M-1s-1 ou superior, conforme medido por SPR, particularmente em que o referido anticorpo é um scFv (afinidade monovalente).

[0106] Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da invenção ou o CD137-BD da invenção se liga ao CD137 humano com uma taxa de Koff de 10−3 s−1 ou menos, 3x10−3 s−1 ou menos, 5x10−3 s−1 ou menos, 10−4 s−1 ou menos, 5x10−4 s−1 ou menos, 10−5 s−1 ou menos, 5x10−5 s−1 ou menos, 10−6 s−1 ou menos, ou 10−7 s−1 ou menos, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície (SPR). Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da invenção ou o CD137-BD da invenção se liga ao CD137 humano com uma taxa Koff de 10−4 s−1 ou menos, em particular 10−5 s−1 ou menos, conforme medido por SPR.

[0107] Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da invenção ou o CD137-BD da invenção possui uma ligação ao CD137 humano de pelo menos 60% ou mais, pelo menos 70% ou mais, pelo menos 75% ou mais, pelo menos 80% ou mais, pelo menos 85% ou mais, pelo menos 90% ou mais, pelo menos 95% ou mais, conforme medido com SPR e normalizado para os níveis de ligação obtidos para urelumab.

[0108] Numa concretização, o CD137-BD da invenção não compete de forma cruzada pela ligação com urelumab. A presente invenção fornece assim o CD137-BD que se liga a um epítopo diferente do urelumab. O urelumab, também referido como BMS-663513, é um mAb de IgG4 totalmente humanizado da Bristol-Myers Squibb e está descrito nos documentos WO 2004/010947, US 6.887.673 e US

7.214.493, que são incorporados no presente pedido por referência em sua totalidade. Noutra concretização, o CD137-BD da invenção compete de forma cruzada pela ligação com urelumab.

[0109] Numa concretização, o CD137-BD da invenção não compete de forma cruzada pela ligação com utomilumab. A presente invenção fornece assim o CD137-BD que se liga a um epítopo diferente do utomilumab. O utomilumab, também referido como PF-05082566, é um mAb de IgG2 totalmente humano da Pfizer, e é descrito nos documentos WO 2012/032433 e US 8821867, que são aqui incorporados no presente pedido por referência na sua totalidade. Noutra concretização, o CD137-BD da invenção compete de forma cruzada pela ligação com utomilumab.

[0110] Numa outra concretização, o CD137-BD da invenção não compete de forma cruzada pela ligação nem com o urelumab nem com o utomilumab. A presente invenção fornece, assim, o CD137-BD da invenção que se liga a um epítopo diferente do urelumab e utomilumabe.

[0111] Os termos "competir" ou "competir de forma cruzada" e termos relacionados são usados de forma intercambiável aqui para significar a capacidade de um anticorpo ou outro agente de ligação para interferir com a ligação de outros anticorpos ou agentes de ligação a CD137 em um ensaio de ligação competitivo padrão.

[0112] A capacidade ou a extensão à qual um anticorpo ou outro agente de ligação é capaz de interferir com a ligação de outro anticorpo ou molécula de ligação a um alvo de interesse, por exemplo, CD137, PDL1, e, por conseguinte, pode-se dizer para competir de forma cruzada de acordo com a invenção, pode ser determinada usando ensaios de ligação de competição padrão. O ensaio quantitativo sustentável de competição cruzada usa uma abordagem baseada em FACS ou AlphaScreen para medir a competição entre um anticorpo marcado (por exemplo, marcado com His, biotinilado ou radioativo) ou fragmento do mesmo e um outro anticorpo ou fragmento do mesmo em termos de ligação ao alvo.

Em geral, um anticorpo de competição cruzada ou seu fragmento é, por exemplo, um que se ligará ao alvo no ensaio de competição cruzada, de modo que, durante o ensaio e na presença de um segundo anticorpo ou fragmento do mesmo, o deslocamento registrado do domínio ou polipeptídeo variável único de imunoglobulina de acordo com a invenção é de até 100% (por exemplo, no ensaio de competição com base em FACS) do deslocamento teórico máximo (por exemplo, deslocamento por anticorpo frio (por exemplo, não marcado) ou fragmento do mesmo que precisa ser bloqueado) pelo anticorpo potencialmente bloqueador a ser testado ou seu fragmento, que está presente em uma determinada quantidade.

De preferência, os anticorpos concorrentes cruzados ou seus fragmentos têm um deslocamento registrado que está entre 10% e 100%, mais preferencialmente entre 50% e 100%. Para os fins desta invenção, foi utilizado um ELISA de competição, o protocolo correspondente é descrito em detalhes na seção "Exemplos" da presente divulgação.

Em uma concretização, o CD137-BD da invenção não inibe a ligação do urelumab e/ou utomilumab à proteína CD137, o que demonstra que o CD137-BD da invenção não pode competir com o urelumab e/ou o utomilumab, respectivamente, pela ligação para CD137; tais CD137-BD ou um anticorpo compreendendo o referido domínio pode, de acordo com a teoria não limitante, ligar-se a um epítopo diferente (por exemplo, um estruturalmente diferente ou um espacialmente remoto) em CD137 como urelumab ou utomilumab, respectivamente. Numa concretização, o CD137-BD da invenção inibe a ligação de urelumab ou utomilumab à proteína CD137, o que demonstra que o CD137-BD da invenção pode competir com urelumab ou utomilumab, respectivamente para a ligação a CD137; esse CD137-BD ou um anticorpo compreendendo o referido domínio pode, de acordo com a teoria não limitativa, se ligar ao mesmo epítopo ou de sobreposição (por exemplo, um epítopo estruturalmente semelhante ou espacialmente proximal) em CD137 como urelumab ou utomilumab, respectivamente.

[0113] A presente invenção proporciona também domínios de ligação que se ligam ao mesmo epitopo como fazem os CD137-BDs listados na Tabela 1. Os domínios de ligação podem, por conseguinte, ser identificados com base na sua capacidade para competir de forma cruzada (por exemplo, para inibir competitivamente a ligação, de uma maneira estatisticamente significativa) com outros anticorpos e seus fragmentos de ligação a antígeno da invenção em ensaios de ligação a CD137.

[0114] A capacidade de um domínio de ligação de teste para inibir a ligação do CD137-BD da invenção à proteína CD137 demonstra que o domínio de ligação de teste pode competir com esse CD137-BD pela ligação a CD137; esse domínio de ligação pode, de acordo com a uma teoria não limitativa, se ligar ao mesmo ou a um epítopo relacionado (por exemplo, um estruturalmente semelhante ou espacialmente proximal) no CD137 como o CD137-BD com o qual ele compete. Numa certa concretização, o domínio de ligação que se liga ao mesmo epítopo em CD137 que o CD137-BD da presente invenção é um anticorpo monoclonal humano ou humanizado. Tais anticorpos monoclonais humanos ou humanizados podem ser preparados e isolados como aqui descrito.

[0115] Uma vez determinado o epítopo desejado em um antígeno, é possível gerar anticorpos para esse epítopo, por exemplo, utilizando as técnicas descritas na presente invenção. Alternativamente, durante o processo de descoberta, a geração e caracterização de anticorpos pode elucidar informações sobre epítopos desejáveis. A partir desta informação, é então possível rastrear competitivamente os anticorpos quanto à ligação ao mesmo epítopo. Uma abordagem para conseguir isso é realizar estudos de competição cruzada para encontrar anticorpos que se ligam competitivamente entre si, por exemplo, os anticorpos competem pela ligação ao antígeno. Um processo de alto rendimento para anticorpos "binning" com base em sua competição cruzada é descrito no documento WO 2003/48731. Como será notado por um versado na técnica, praticamente qualquer coisa à qual um anticorpo possa se ligar especificamente poderia ser um epítopo. Um epítopo pode compreender aqueles resíduos aos quais o anticorpo se liga.

[0116] As regiões de um determinado polipeptídeo que incluem um epítopo podem ser identificadas usando qualquer número de técnicas de mapeamento de epítopos, bem conhecidas no estado da técnica. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols em Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, Nova Jersey. Por exemplo, os epítopos lineares podem ser determinados ao, por exemplo, sintetizar simultaneamente um grande número de peptídeos em suportes sólidos, os peptídeos correspondendo a porções da molécula de proteína e reagindo os peptídeos com anticorpos enquanto os peptídeos ainda estão ligados aos suportes. Tais técnicas são conhecidas no estado da técnica e descritas em, por exemplo, Patente US No. 4.708.871; Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 8: 3998-4002; Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 82: 78-182; Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23: 709-715. Da mesma forma, os epítopos conformacionais são facilmente identificados pela determinação da conformação espacial dos aminoácidos CD137, como por exemplo, troca de hidrogênio/deutério, cristalografia de raios-X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Veja, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. As regiões antigênicas das proteínas também podem ser identificadas usando gráficos padrão de antigenicidade e hidropatia, como os calculados usando, por exemplo, o programa Omiga versão 1.0, disponível no Oxford Molecular Group. Este programa de computador emprega o método Hopp/Woods, Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78: 3824-3828; para determinar perfis de antigenicidade e a técnica de Kyte-Doolittle, Kyte et al., (1982) J.MoI. Biol. 157: 105- 132; para parcelas de hidropatia.

[0117] Adequadamente, o CD137-BD se liga especificamente a CD137 e é caracterizado por um ou mais dos seguintes parâmetros: a) quando no formato scFv, tem uma temperatura de fusão (Tm), determinada por fluorimetria de varredura diferencial (DSF), de pelo menos 50° C, preferencialmente de pelo menos 55° C, mais preferencialmente de pelo menos 60° C, em particular em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é formulado em tampão fosfato-citrato a pH 6,4, NaCl 150 mM, em particular em tampão fosfato-citrato 50 mM a pH 6,4, NaCl 150 mM;

b) quando no formato scFv, possui uma perda no teor de monômeros, após armazenamento por pelo menos duas semanas, particularmente por pelo menos quatro semanas, a 4° C, menor que 7%, por exemplo, menor que 6%, menor que 5%, menor que 4%, menor que 3%, menor que 2%, preferencialmente menor que 1%, quando o anticorpo da invenção estiver em uma concentração inicial de 10 mg/ml, e em particular em que o anticorpo da invenção, por exemplo, o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é formulado em tampão de citrato de fosfato 50 mM com NaCl 150 mM a pH 6,4; e/ou c) quando no formato scFv, possui uma perda no teor de monômero, após armazenamento por pelo menos duas semanas, particularmente por pelo menos quatro semanas, a 40° C, inferior a 5%, por exemplo, inferior a 4%, inferior a 3%, menos de 2%, preferencialmente menos de 1%, quando o anticorpo da invenção está em uma concentração inicial de 10 mg/ml, e em particular em que o anticorpo da invenção, por exemplo, o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, é formulado em tampão de citrato de fosfato 50 mM com NaCl 150 mM a pH 6,4.

[0118] O DSF é descrito anteriormente (Egan, et al., MAbs, 9 (1) (2017), 68-84; Niesen, et al., Nature Protocols, 2 (9) (2007) 2212-2221). O ponto médio da transição para o desdobramento térmico das construções scFv é determinado por fluorimetria de varredura diferencial usando o corante de fluorescência SYPRO® Orange (consulte Wong & Raleigh, Protein Science 25 (2016) 1834- 1840). Amostras em tampão fosfato-citrato a pH 6,4 são preparadas a uma concentração final de proteína de 50 µg/mL e contendo uma concentração final de 5x SYPRO® Orange em um volume total de 100 µl. Vinte e cinco microlitros de amostras preparadas são adicionados em triplicata às placas de PCR do gene AB de parede branca. O ensaio é realizado em uma máquina qPCR usada como termociclador e a emissão de fluorescência é detectada usando a rotina de calibração de corante personalizada do software. A placa de PCR contendo as amostras de teste é submetida a uma rampa de temperatura de 25° C a 96° C em incrementos de 1° C com pausas de 30 s após cada incremento de temperatura. O tempo total do teste é de cerca de duas horas. A Tm é calculada pelo software GraphPad Prism usando um método matemático de segunda derivada para calcular o ponto de inflexão da curva. A Tm relatada é uma média de três medições.

[0119] A perda no teor de monômeros é determinada pela área sob o cálculo da curva dos cromatogramas de SE-HPLC. SE-HPLC é uma técnica de separação baseada em uma fase estacionária sólida e uma fase móvel líquida, conforme descrito no capítulo 621 da USP. Esse método separa moléculas com base em seu tamanho e forma, utilizando uma fase estacionária hidrofóbica e uma fase móvel aquosa. A separação de moléculas está ocorrendo entre o volume de vazio (V0) e o volume total de permeação (VT) de uma coluna específica. As medições por SE-HPLC são realizadas em um sistema Chromaster HPLC (Hitachi High-Technologies Corporation) equipado com injeção automatizada de amostras e um detector de UV ajustado para o comprimento de onda de detecção de 280 nm. O equipamento é controlado pelo software EZChrom Elite (Agilent Technologies, versão 3.3.2 SP2), que também suporta a análise dos cromatogramas resultantes. As amostras de proteína são clarificadas por centrifugação e mantidas a uma temperatura de 4-6° C no amostrador automático antes da injeção. Para a análise de amostras de scFv, a coluna Shodex KW403-4F (Showa Denko Inc.,

# F698920 2) é empregada com uma fase móvel salina tamponada padronizada (fosfato de sódio 50 mM pH 6,5, cloreto de sódio 300 mM) na vazão recomendada de 0,35 mL/min. A carga alvo da amostra por injeção foi de 5 µg. As amostras são detectadas por um detector de UV a um comprimento de onda de 280 nm e os dados registrados por um conjunto de software adequado. Os cromatogramas resultantes são analisados na faixa de V0 a VT, excluindo assim os picos associados à matriz com >10 min de tempo de eluição.

[0120] A presente invenção proporciona os CD137-BDs que especificamente se ligam a proteína CD137, os referidos domínios de ligação compreendendo uma CDR de VH possuindo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VH listadas na Tabela

1. Em particular, a invenção proporciona CD137-BDs que se ligam especificamente à proteína CD137, os referidos CD137-BDs compreendendo (ou alternativamente, consistindo em) uma, duas, três ou mais CDRs de VH com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VH listadas na Tabela 1.

[0121] A presente invenção também fornece CD137-BDs que se ligam especificamente à proteína CD137, os referidos CD137-BDs compreendendo uma CDR de VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VL listadas na Tabela 1. Em particular, a invenção fornece CD137-BDs que se ligam especificamente à proteína CD137, os referidos CD137-BDs compreendendo (ou alternativamente, consistindo em) uma, duas, três ou mais CDRs de VL tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VL listadas na Tabela 1.

[0122] Outros CD137-BDs da invenção incluem aminoácidos que foram mutados, mas possuem pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92,

93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade nas regiões CDR com as regiões CDR representadas nas sequências descritas na Tabela

1. Em um aspecto, outros CD137-BDs da invenção incluem sequências de aminoácidos mutantes em que não mais de 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos foram mutados nas regiões de CDR quando comparadas com as regiões de CDR representadas na sequência descrita na Tabela 1.

[0123] Os termos "idêntico" ou "identidade", no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências polipeptídicas, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências iguais. “Percentagem (%) de identidade de sequência” e “homologia”, com respeito ao ácido nucleico, um peptídeo, um polipeptídeo ou uma sequência de anticorpo são definidas como a percentagem de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos numa sequência candidata que são idênticos aos nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos na sequência específica de ácido nucleico, peptídeo ou polipeptídeo, após o alinhamento das sequências e a introdução de lacunas, se necessário, para atingir a identidade percentual máxima da sequência, e não considerando nenhuma substituição conservadora como parte da identidade da sequência. O alinhamento para fins de determinação da porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, usando software de computador disponível ao público, como o software BLAST, BLAST-2 ou ALIGN. Os versados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências sendo comparadas.

[0124] Para comparação de sequências, normalmente uma sequência atua como uma sequência de referência, à qual as sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computador, as coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e os parâmetros do programa do algoritmo de sequência são designados. Parâmetros de programa padrão podem ser usados ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequências calcula as identidades percentuais das sequências de teste relativas à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.

[0125] Dois exemplos de algoritmos que são adequados para determinar a porcentagem de identidade de sequência e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389- 4040, 1977; e Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990, respectivamente. O software para realizar análises BLAST está disponível ao público no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia.

[0126] A identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos também pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17, 1988) que foi incorporado ao programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4. Além disso, a porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando Needleman e Wunsch (J. Mol, Biol. 48: 444-453, 1970), que foi incorporado ao programa GAP no pacote de software GCG (disponível em www.gcg.com), usando uma matriz

Blossom 62 ou uma matriz PAM250 e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou

6.

[0127] O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos naturais e sintéticos, bem como análogos e miméticos de aminoácidos que funcionam de maneira semelhante aos aminoácidos que ocorrem naturalmente. Os aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, bem como os aminoácidos que são modificados posteriormente, por exemplo, hidroxiprolina, gama-carboxiglutamato e O-fosfoserina. Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados aqui de forma intercambiável para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são um mimético químico artificial de um aminoácido correspondente natural, bem como a polímeros de aminoácidos naturais e polímeros de aminoácidos não naturais. Salvo indicação em contrário, uma sequência polipeptídica particular também envolve implicitamente variantes modificadas conservadoramente.

[0128] Adequadamente, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada (HCDR1) compreendendo, preferencialmente consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 4 5, 8, 11, 35, 38, 41 e 44, preferencialmente SEQ ID NO: 1; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada (HCDR2) compreendendo, preferencialmente consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 6, 9, 12, 36, 39, 42 e 45, preferencialmente SEQ ID NO: 2; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada (HCDR3) compreendendo, preferencialmente consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 7, 10, 13, 37, 40, 43 e 46, preferencialmente SEQ ID NO: 3; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve (LCDR1) compreendendo, preferencialmente consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 18, 21, 24, 48, 51 e 54, preferencialmente SEQ ID NO: 18; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve (LCDR2) compreendendo, preferencialmente consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19, 22, 25, 49, 52 e 55, preferencialmente SEQ ID NO: 19; e (f) uma região variável de cadeia leve de CDR3 (LCDR3) compreendendo, consistindo preferencialmente em, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 20, 23, 26, 50, 53, e 56, de preferência a SEQ ID NO: 20. Adequadamente, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada (HCDR1) compreendendo, preferencialmente consistindo em, uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade para qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 4, 5, 8, 11, 35, 38, 41 e 44, de preferência SEQ ID NO: 1; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada (HCDR2) com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2 6, 9, 12, 36, 39, 42 e 45, preferencialmente SEQ ID NO: 2; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada (HCDR3) com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 7,

10, 13, 37, 40, 43 e 46, preferencialmente SEQ ID NO: 3; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve (LCDR1) com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 18, 21, 24, 48, 51 e 54, preferencialmente SEQ ID NO: 18; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve (LCDR2) com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 19 22, 25, 49, 52 e 55, preferencialmente SEQ ID NO: 19; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve (LCDR3) possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 20, 23, 26, 50, 53, e 56, de preferência a SEQ ID NO: 20.

[0129] Em uma concretização, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (a) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 18, 19 e 20, respectivamente; (b) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 4, 6 e 7, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 21, 22 e 23, respectivamente; (c) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 5, 6 e 7, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 21, 22 e 23, respectivamente; (d) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 8, 9 e 10, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 18, 19 e 20, respectivamente; (e) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 11, 12 e 13, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 24, 25 e 26, respectivamente; (f) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 35, 36 e 37, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 48, 49 e 50,

respectivamente; (g) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 38, 39 e 40, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 51, 52 e 53, respectivamente; (h) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 41, 42 e 43, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 48, 49 e 50, respectivamente; (i) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 44, 45 e 46, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 54, 55 e 56, respectivamente. Numa concretização preferida, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 18, 19 e 20, respectivamente.

[0130] Adequadamente, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (a) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 18, 19 e 20, respectivamente; (b) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 4, 6 e 7, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 21, 22 e 23, respectivamente; (c) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 5, 6 e 7, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90,

91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 21, 22 e 23, respectivamente; (d) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 8, 9 e 10, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 18, 19 e 20, respectivamente; (e) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 11, 12 e 13, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 24, 25 e 26, respectivamente; (f) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 35, 36 e 37, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 48, 49 e 50, respectivamente; (g) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 38, 39 e 40, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 51, 52 e 53, respectivamente; (h) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 41, 42 e 43, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 48, 49 e 50, respectivamente; (i) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 44, 45 e 46, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 54, 55 e 56, respectivamente.

Numa concretização preferida, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 18, 19 e 20, respectivamente.

Adequadamente, o CD137- BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (a) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1; (b) uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2; (c) uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 3; (d) uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 18; (e) uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 19; e (f) uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 20.

[0131] Numa outra concretização, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (a) uma HCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5; (b) uma HCDR2 compreendendo, de preferência consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (c) uma HCDR3 compreendendo, de preferência consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; (d) uma LCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (e) uma LCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; e (f) uma LCDR3 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23. Adequadamente, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (a) uma HCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5; (b) uma HCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 6; (c) uma HCDR3 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 7; (d) uma LCDR1 compreendendo, de preferência consistindo na sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 21; (e) uma LCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90,

91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 22; e (f) uma LCDR3 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 23.

[0132] Em ainda uma outra concretização, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (a) uma HCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; (b) uma HCDR2 compreendendo, de preferência consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; (c) uma HCDR3 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; (d) uma LCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; (e) uma LCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; e (f) uma LCDR3 compreendendo, de preferência consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. Adequadamente, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (a) uma HCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 35; (b) uma HCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 36; (c) uma HCDR3 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 37; (d) uma LCDR1 compreendendo, de preferência consistindo na sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 48; (e) uma LCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 49; e (f) uma LCDR3 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 50.

[0133] Numa outra concretização, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (a) uma HCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; (b) uma HCDR2 compreendendo, de preferência consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (c) uma HCDR3 compreendendo, de preferência consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (d) uma LCDR1 compreendendo, de preferência consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; (e) uma LCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; e (f) uma LCDR3 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53. Adequadamente, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (a) uma HCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 38; (b) uma HCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94,

95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 39; (c) uma HCDR3 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 40; (d) uma LCDR1 compreendendo, de preferência consistindo na sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 51; (e) uma LCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 52; e (f) uma LCDR3 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 53.

[0134] Numa concretização preferida, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende um CD137-BD, em que o referido CD137-BD compreende: (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo, preferencialmente consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 59, 62, 65 e 68, preferencialmente SEQ ID NO: 59; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo, de preferência consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 60, 63, 66 e 69, preferencialmente SEQ ID NO: 60; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo, de preferência consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 61, 64, 67 e 70, preferencialmente SEQ ID NO: 61; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo, preferencialmente consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 74, 77 e 80, preferencialmente SEQ ID NO: 74; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo, preferencialmente consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 75, 78 e 81, preferencialmente SEQ ID NO: 75; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo, de preferência consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 76, 79 e 82, preferencialmente SEQ ID NO: 76. Adequadamente, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 59, 62, 65 e 68, preferencialmente SEQ ID NO: 59; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 60, 63, 66 e 69, preferencialmente SEQ ID NO: 60; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 61, 64, 67 e 70, preferencialmente SEQ ID NO: 61; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 74, 77 e 80, preferencialmente SEQ ID NO: 74; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 75, 78 e 81, preferencialmente SEQ ID NO: 75; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve com pelo menos 60, 70,

80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 76, 79 e 82, preferencialmente SEQ ID NO: 76.

[0135] Em uma concretização, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (a) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, respectivamente; (b) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 62, 63 e 64, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 77, 78 e 79, respectivamente; (c) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 65, 66 e 67, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, respectivamente; (d) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 68, 69 e 70, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 80, 81 e 82, respectivamente. Numa concretização preferida, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, respectivamente.

[0136] Adequadamente, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (a) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, respectivamente; (b) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as

SEQ ID NOs: 62, 63 e 64, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 77, 78 e 79, respectivamente; (c) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 65, 66 e 67, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, respectivamente; (d) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 68, 69 e 70, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 80, 81 e 82, respectivamente.

Numa concretização preferida, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, respectivamente.

Adequadamente, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (a) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 59; (b) uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 60; (c) uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos

60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 61; (d) uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 9% de identidade com a SEQ ID NO: 74; (e) uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade com a SEQ ID NO: 75; e (f) uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 76.

[0137] Numa outra concretização, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende um domínio VH e um domínio VL. No contexto da presente invenção, os termos "VH" (cadeia pesada variável), "VL" (cadeia leve variável), "Vκ" e "Vλ" se referem a famílias de sequências de cadeia pesada e leve de anticorpos que são agrupadas de acordo com a identidade de sequência e homologia. Métodos para a determinação de homologias de sequência, por exemplo, usando uma matriz de pesquisa de homologia como BLOSUM (Henikoff, S. & Henikoff, JG, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 10915-10919) e métodos para o agrupamento de sequências de acordo com homologias é bem conhecido dos versados na técnica. Para VH, Vκ e Vλ, diferentes subfamílias podem ser identificadas, como mostrado, por exemplo, em Knappik et al., J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86, que agrupa VH em VH1A, VH1B e VH2 a VH6, Vκ em Vκ1 a Vκ4 e Vλ em Vλ1 a Vλ3. In vivo, as cadeias Vκ do anticorpo, as cadeias Vλ e as cadeias VH são o resultado do rearranjo aleatório dos segmentos V e J da cadeia germinativa κ, segmentos V e J da cadeia germinativa λ e segmentos da cadeia pesada V, D e J, respectivamente. À qual subfamília uma determinada cadeia variável de anticorpo pertence é determinada pelo segmento V correspondente e, em particular, pelas regiões estruturais FR1 a FR3. Assim, qualquer sequência de VH que é caracterizada no presente pedido por um conjunto específico de regiões de estrutura HFR1 a HFR3, pode ser combinada com qualquer sequência de HFR4, por exemplo, uma sequência de HFR4 retirada de um dos segmentos J da linha germinativa da cadeia pesada, ou uma sequência de HFR4 tirada de uma sequência VH reorganizada.

[0138] Adequadamente, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende sequências estruturais do domínio VH4 ou VH3, preferencialmente sequências estruturais do domínio VH4, mais preferencialmente sequências estruturais do domínio VH3.

[0139] Um exemplo específico de um VH pertencente à família VH3 é representado na SEQ ID NO: 71. Em particular, as regiões de estrutura FR1 a FR4, extraídas da SEQ ID NO: 71, pertencem à família VH3 (Tabela 1, regiões marcadas em negrito). Adequadamente, um VH pertencente à família VH3, como aqui utilizado, é um VH compreendendo FR1 a FR4 tendo pelo menos 85%, preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade de sequência de FR1 a FR4 da SEQ ID NO:

71.

[0140] Um exemplo específico de um VH pertencente à família VH4 é representado na SEQ ID NO: 14. Em particular, as regiões de estrutura FR1 a FR4 retiradas da SEQ ID NO: 14 pertencem à família VH4 (Tabela 1, regiões marcadas em negrito). Adequadamente, um VH pertencente à família VH4, como aqui utilizado, é um VH compreendendo FR1 a FR4 tendo pelo menos 85%,

preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade de sequência de FR1 a FR4 da SEQ ID NO:

14.

[0141] Adequadamente, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende estruturas Vκ FR1, FR2 e FR3, particularmente estruturas Vκ1 ou Vκ3, preferencialmente estruturas Vκ1 FR1 a 3 e uma estrutura FR4, que é selecionada a partir de Vκ FR4, particularmente Vκ1 FR4, Vκ3 FR4 e um Vλ FR4. As estruturas Vκ1 adequadas FR1 a 3 são apresentadas na SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 83 (Tabela 1, as regiões FR estão marcadas em negrito). As estruturas Vκ1 adequadas FR1 a 3 compreendem a sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90% de identidade com a sequência de aminoácidos correspondente a FR1 a 3 e extraídas da SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 83 (Tabela 1, as regiões FR estão marcadas em negrito). Vλ FR4 adequado é como estabelecido na SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205. Em uma concretização, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende Vλ FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90% de identidade para compreender uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205.

[0142] Em uma concretização, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (i) as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de: a. SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 18, 19 e 20, respectivamente; ou b. SEQ ID NOs: 35, 36 e 37, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 48, 49 e 50, respectivamente; ou c. SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, respectivamente; (ii) sequências estruturais de domínio VH3 ou VH4 FR1 a FR4; de preferência as sequências estruturais de domínio VH4 FR1 a FR4, mais preferencialmente as sequências estruturais de domínio VH3 FR1 a FR4; e (iii) um domínio VL compreendendo uma estrutura VL compreendendo estruturas Vκ FR1, FR2 e FR3, particularmente Vκ1 ou Vκ3 FR1 a FR3, preferencialmente Vκ1 FR1 a FR3, e uma estrutura FR4, que é selecionada a partir de uma Vκ FR4, particularmente Vκ1 FR4, Vκ3 FR4 e um Vλ FR4, particularmente Vλ FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90% de identidade para compreender uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, mais particularmente Vλ FR4 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, preferencialmente Vλ FR4 compreendendo uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 199.

[0143] Numa concretização preferida, o referido CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, respectivamente.

[0144] Em uma concretização, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende:

(i) as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de:

a.

SEQ ID NOs: 4, 6 e 7, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 21, 22 e 23, respectivamente;

b.

SEQ ID NOs: 5, 6 e 7, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 21, 22 e 23, respectivamente; ou c.

SEQ ID NOs: 38, 39 e 40, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 51, 52 e 53, respectivamente;

(ii) sequências estruturais de domínio VH3 ou VH4 FR1 a FR4; de preferência as sequências estruturais de domínio VH4 FR1 a FR4, mais preferencialmente as sequências estruturais de domínio VH3 FR1 a FR4; e

(iii) um domínio VL compreendendo uma estrutura VL compreendendo estruturas Vκ FR1, FR2 e FR3, particularmente Vκ1 ou Vκ3 FR1 a FR3, preferencialmente Vκ1 FR1 a FR3, e uma estrutura FR4, que é selecionada a partir de uma Vκ FR4, particularmente Vκ1 FR4, Vκ3 FR4 e um Vλ FR4, particularmente Vλ FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90% de identidade para compreender uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, mais particularmente Vλ FR4 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, preferencialmente Vλ FR4 compreendendo uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 199.

[0145] Em uma concretização, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende uma VL compreendendo: (i) domínios CDR CDR1, CDR2 e CDR3; (ii) regiões estruturais Vκ humanas FR1 a FR3, particularmente regiões estruturais Vκ1 humanas FR1 a FR3; (iii) FR4, que é selecionado a partir de (a) uma sequência de linha germinativa de Vλ humana para FR4, particularmente uma sequência de linha germinativa de Vλ selecionada da lista de: SEQ ID NO: 199 a 205, preferencialmente Vλ FR4 compreendendo uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 199; e (b) uma sequência baseada em Vλ, que possui uma ou duas mutações, particularmente uma mutação, em comparação com a sequência de linha germinativa de Vλ humana mais próxima para FR4 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, preferencialmente Vλ FR4 compreendendo uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 199.

[0146] Numa concretização preferida, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (i) as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de: a. SEQ ID NOs: 4, 6 e 7, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 21, 22 e 23, respectivamente; b. SEQ ID NOs: 5, 6 e 7, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 21, 22 e 23, respectivamente; ou c. SEQ ID NOs: 38, 39 e 40, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 51, 52 e 53, respectivamente (ii) sequências estruturais de domínio VH4 FR1 a FR4; e (iii) um domínio VL compreendendo uma estrutura VL compreendendo estruturas Vκ1 FR1, FR2 e FR3 e um Vλ FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90% de identidade para compreender uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer um dos SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, particularmente Vλ FR4 como estabelecido em SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, preferencialmente SEQ ID NO: 199.

[0147] Em outra concretização preferida, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (i) as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 18, 19 e 20, respectivamente; (ii) sequências estruturais de domínio VH3 FR1 a FR4; e (iii) um domínio VL compreendendo uma estrutura VL compreendendo estruturas Vκ1 FR1, FR2 e FR3 e um Vλ FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90% de identidade para compreender uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, particularmente Vλ FR4 como estabelecido em SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, preferencialmente SEQ ID NO: 199.

[0148] Numa concretização mais preferida, o CD137-BD do anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende:

(i) as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, respectivamente; (ii) sequências estruturais de domínio VH3 FR1 a FR4; e (iii) um domínio VL compreendendo uma estrutura VL compreendendo estruturas Vκ1 FR1, FR2 e FR3 e um Vλ FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90% de identidade para compreender uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, particularmente Vλ FR4 como estabelecido em SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, preferencialmente SEQ ID NO: 199.

[0149] Adequadamente, o CD137-BD da invenção compreende um domínio VH listado na Tabela 1. Adequadamente, o CD137-BD da invenção compreende (uma sequência de aminoácidos VH listada na Tabela 1, em que não mais que cerca de 10 aminoácidos em uma estrutura (por exemplo, uma sequência que não é uma CDR) foi mutada (em que uma mutação é, como vários exemplos não limitativos, uma adição, substituição ou exclusão). Apropriadamente, o CD137-BD da invenção compreende uma sequência de aminoácido VH listada na Tabela 1, em que não mais do que cerca de 20 aminoácidos em uma sequência estrutural (por exemplo, uma sequência que não é uma CDR) foram mutados (em que uma mutação é, como vários exemplos não limitativos, uma adição, substituição ou deleção). Outros CD137-BD da invenção incluem aminoácidos que foram mutados, mas que possuem pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento identidade nas regiões VH com as regiões VH representadas nas sequências descritas na Tabela 1.

[0150] Adequadamente, o CD137-BD da invenção compreende um domínio VL listado na Tabela 1. Adequadamente, o CD137-BD da invenção compreende uma sequência de aminoácidos VL listada na Tabela 1, em que não mais que cerca de 10 aminoácidos em uma sequência estrutural (por exemplo, uma sequência que não é uma CDR) foi mutada (em que uma mutação é, como vários exemplos não limitativos, uma adição, substituição ou exclusão). Adequadamente, o CD137-BD da invenção compreende uma sequência de aminoácidos VL listada na Tabela 1, em que não mais do que cerca de 20 aminoácidos em uma sequência estrutural (por exemplo, uma sequência que não é uma CDR) foram mutados (em que um mutação é, como vários exemplos não limitativos, uma adição, substituição ou exclusão). Outros CD137-BD da invenção incluem aminoácidos que foram mutados, mas possuem pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade nas regiões VL com as regiões VL representadas nas sequências descritas na Tabela 1.

[0151] Adequadamente, o CD137-BD da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento, preferencialmente pelo menos 90%, idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17 e 47, preferencialmente SEQ ID NO: 17; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento, preferencialmente pelo menos 90 por cento, idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30 e 57, preferencialmente SEQ ID NO: 30.

[0152] Adequadamente, o CD137-BD da presente invenção compreende: uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17 e 47, preferencialmente SEQ ID NO: 17; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30 e 57, de preferência SEQ ID NO: 30.

[0153] Numa outra concretização, o CD137-BD da presente invenção compreende: (a) uma sequência VH da SEQ ID NO: 14 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 27; (b) uma sequência VH da SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 28; (c) uma sequência VH da SEQ ID NO: 16 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 29; (d) uma sequência VH da SEQ ID NO: 17 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 30; ou (e) uma sequência VH da SEQ ID NO: 47 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 57. Numa concretização preferida, o CD137-BD da presente invenção compreende uma sequência VH da SEQ ID NO: 17 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 30.

[0154] Em uma concretização, o CD137-BD da presente invenção compreende: (a) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 4, 6 e 7, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 21, 22 e 2 3, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 14 e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 27;

(b) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 4, 6 e 7, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 21, 22 e 23, respectivamente, uma sequência VH em pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 28;

(c) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 5, 6 e 7, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 21, 22 e 23, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 16 e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 29;

(d) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 4, 6 e 7, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 21, 22 e 23, respectivamente, uma sequência VH em pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 17 e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 30, de preferência em que o referido VH compreende uma mutação G51C (numeração AHo) e o referido VL compreende T141C mutação (numeração AHo); ou

(e) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 38, 39 e 40, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 51, 52 e 53, respectivamente, uma sequência VH em pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 47 e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 57.

[0155] Em uma concretização, o CD137-BD da presente invenção compreende: (a) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 1 8, 1 9 e 20, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 14 e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 27; (b) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 18, 19 e 20, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 28; (c) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 1 8, 1 9 e 20, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 16 e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 29; (d) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 1 8, 1 9 e 20, respectivamente, uma sequência VH pelo menos

60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 17 e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 30, de preferência em que o referido VH compreende uma mutação G51C (numeração AHo) e o referido VL compreende a mutação T141C (numeração AHo); ou (e) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 35, 36 e 37, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 48, 49 e 50, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 47 e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 57.

[0156] Em uma concretização preferida, o CD137-BD da presente invenção compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 18, 19 e 20, respectivamente, uma sequência VH de pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 17, e uma sequência VL de pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 30, de preferência em que o referido VH compreende um Mutação G51C (numeração AHo) e o referido VL compreende a mutação T141C (numeração AHo). Adequadamente, o referido CD137-BD da presente invenção é mutado de modo a formar uma ponte de dissulfeto de interdomínio artificial na região de estrutura, em particular em que o par de cisteínas substitui Gly 51 (numeração Aho) na referida VH e Thr 141 (numeração Aho) na referida VL.

Foi surpreendentemente descoberto que esse CD137-BD compreendendo uma ponte dissulfeto de interdomínio tem uma termostabilidade significativamente aumentada.

[0157] O termo "artificial" com referência a uma ponte dissulfeto ("ponte S-S" ou "diS") significa que a ponte S-S não é formada naturalmente pelo anticorpo do tipo selvagem, mas é formada por um mutante modificado de uma molécula mãe, em que pelo menos um aminoácido estranho contribui para a ligação dissulfeto. A engenharia direcionada ao local de pontes de dissulfeto artificial diferencia-se claramente daquelas naturalmente disponíveis em imunoglobulinas nativas ou em anticorpos modulares, como os descritos no documento WO 2009/000006, porque pelo menos um dos locais dos pilares de uma ponte de dissulfeto artificial é tipicamente localizado além das posições dos resíduos Cys no anticorpo do tipo selvagem, proporcionando assim uma ponte dissulfeto alternativa ou adicional dentro da região da estrutura. A ponte dissulfeto artificial da presente invenção pode ser projetada em vermelho dentro de um domínio de anticorpo ("ponte intradomínio"), o que estabilizaria a estrutura da folha beta ou a ponte entre os domínios ("ponte interdomínio") ou cadeias de domínios ("ponte entre cadeias"), para restringir a estrutura do anticorpo multiespecífico de acordo com a invenção e apoiar sua interação com potenciais parceiros de ligação.

[0158] Em uma concretização, o CD137-BD da presente invenção compreende: (a) uma sequência VH da SEQ ID NO: 14 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 27;

(b) uma sequência VH da SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 28; (c) uma sequência VH da SEQ ID NO: 16 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 29; (d) uma sequência VH da SEQ ID NO: 17 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 30; ou (e) uma sequência VH da SEQ ID NO: 47 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 57.

[0159] Em uma concretização, o CD137-BD da presente invenção compreende: (a) uma sequência VH da SEQ ID NO: 14 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 27; (b) uma sequência VH da SEQ ID NO: 15 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 28; (c) uma sequência VH da SEQ ID NO: 16 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 29; (d) uma sequência VH da SEQ ID NO: 17 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 30; ou (e) uma sequência VH da SEQ ID NO: 47 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 57.

[0160] Numa concretização preferida, o CD137-BD da presente invenção compreende uma sequência VH da SEQ ID NO: 17 e uma VL da SEQ ID NO: 30.

[0161] Em uma concretização, o CD137-BD da presente invenção é descrito na Tabela 1. Em uma concretização, o CD137-BD da presente invenção é pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94,

95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntico à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 58. Numa concretização, o CD137-BD da presente invenção é como estabelecido na SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 58. Numa concretização, o CD137-BD da presente invenção é como estabelecido na SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 34. Numa concretização preferida, o CD137- BD da presente invenção é como estabelecido na SEQ ID NO: 33. Numa concretização mais preferida, o CD137-BD da presente invenção é como estabelecido na SEQ ID NO: 34.

[0162] Numa concretização preferida, o CD137-BD da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento, preferencialmente pelo menos 90 por cento, idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 71, 72 e 73, preferencialmente SEQ ID NO: 71, mais preferencialmente SEQ ID NO: 73; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento, preferencialmente pelo menos 90 por cento, idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 83, 84 e 85, preferencialmente SEQ ID NO: 83, mais preferencialmente SEQ ID NO: 85. Em uma concretização específica, o CD137-BD da presente invenção compreende: uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 71, 72 e 73, preferencialmente SEQ ID NO: 71, mais preferencialmente SEQ ID NO: 73; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 83, 84 e 85, preferencialmente SEQ ID NO: 83, mais preferencialmente SEQ ID NO: 85.

[0163] Numa outra concretização, o CD137-BD da presente invenção compreende: (a) uma sequência VH da SEQ ID NO: 71 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 83; (b) uma sequência VH da SEQ ID NO: 72 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 84; ou (c) uma sequência VH da SEQ ID NO: 73 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 85. Numa concretização preferida, o CD137-BD da presente invenção compreende uma sequência VH da SEQ ID NO: 71 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 83. Em uma concretização mais preferida, o CD137- BD da presente invenção compreende uma Sequência VH da SEQ ID NO: 73 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 85.

[0164] Numa concretização preferida, o CD137-BD da presente invenção compreende: (a) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 71, e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 83, de preferência em que o referido VH compreende uma mutação G51C (numeração AHo) e o referido VL compreende a mutação T141C (Numeração AHo); (b) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, respectivamente, uma sequência VH pelo menos

60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 72 e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 84; ou (c) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 73, e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 85, de preferência em que o referido VH compreende uma mutação G51C (numeração AHo) e o referido VL compreende a mutação T141C (Numeração AHo).

[0165] Numa concretização preferida, o CD137-BD da presente invenção compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, respectivamente, uma sequência VH de pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 71 e uma sequência de VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 83, de preferência em que o referido VH compreende uma mutação G51C (Numeração AHo) e o referido VL compreende a mutação T141C (numeração AHo). Adequadamente, o referido CD137- BD da presente invenção é mutado para formar uma ponte dissulfeto artificial entre domínios na região da estrutura, em particular em que o par de cisteínas substitui Gly 51 (numeração AHo) no referido VH e Thr 141 (numeração AHo) na referida VL. Foi surpreendentemente descoberto que esse CD137-BD compreendendo uma ponte dissulfeto interdomínio tem uma termostabilidade significativamente aumentada.

[0166] Numa concretização preferida, o CD137-BD da presente invenção compreende uma sequência VH da SEQ ID NO: 71 e uma VL da SEQ ID NO: 83. Numa concretização mais preferida, o CD137-BD da presente invenção compreende uma sequência VH da SEQ ID NO: 73 e uma VL da SEQ ID NO: 85.

[0167] Em uma concretização, o CD137-BD da presente invenção é descrito na Tabela 1. Em uma concretização, o CD137-BD da presente invenção é pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntico à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 86, 87 e 88. Numa concretização, o CD137-BD da presente invenção é como estabelecido na SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87 ou SEQ ID NO:

88. Numa concretização preferida, o CD137-BD da presente invenção é como estabelecido na SEQ ID NO: 86. Numa concretização mais preferida, o CD137-BD da presente invenção é como estabelecido na SEQ ID NO: 88.

[0168] Outros CD137-BD da presente invenção incluem aqueles em que os aminoácidos ou ácidos nucleicos que codificam os aminoácidos foram mutados, mas têm pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95% de identidade com as sequências descritas na Tabela 1. Em uma concretização, inclui sequências de aminoácidos mutantes em que não mais de 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos foram mutados nas regiões variáveis quando comparados com as regiões variáveis representadas na sequência descrita na Tabela 1, mantendo substancialmente a mesma atividade terapêutica. O termo "substancialmente a mesma atividade" como aqui utilizado refere- se à atividade indicada por substancialmente a mesma atividade sendo pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou até mesmo pelo menos 100% ou pelo menos 110% ou pelo menos 120% ou pelo menos 130% ou pelo menos 140% ou pelo menos 150% ou pelo menos 160%, ou pelo menos 170%, ou pelo menos 180%, ou pelo menos 190%, por exemplo, até 200% da atividade conforme determinado para o CD137-BD parental, em particular o CD137-BD da invenção descrita na Tabela 1.

[0169] Dado que cada um desses domínios ou anticorpos de ligação podem se ligar a CD137 e que a especificidade de ligação ao antígeno é fornecida principalmente pelas regiões CDR1, 2 e 3, as sequências VH CDR1, 2 e 3 e as sequências VL CDR1, 2 e 3 podem ser "misturadas e combinadas” (ou seja, CDRs de diferentes domínios ou anticorpos de ligação podem ser misturados e combinados, embora cada domínio de ligação ou cada anticorpo deva conter uma VH CDR1, 2 e 3 e uma VL CDR1, 2 e 3 para criar outras moléculas de ligação a CD137 da invenção. Tal CD137-BD "misturado e combinado" pode ser testado usando os ensaios de ligação conhecidos no estado da técnica e os descritos nos Exemplos (por exemplo, ELISA). Quando as sequências de CDR de VH são misturadas e combinadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência VH específica deve ser substituída por uma sequência CDR estruturalmente semelhante. Da mesma forma, quando as sequências CDR de VL são misturadas e combinadas, a sequência CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência VL específica deve ser substituída por uma sequência CDR estruturalmente semelhante. Será facilmente aparente para o versado na técnica que novas sequências de VH e VL podem ser criadas por mutação de uma ou mais sequências da região CDR de VH e/ou VL com sequências estruturalmente semelhantes das sequências CDR mostradas aqui para anticorpos monoclonais ou domínios de ligação da presente invenção.

[0170] Em ainda outra concretização, a presente invenção fornece um CD137-BD compreendendo sequências de aminoácidos que são homólogas às sequências descritas na Tabela 1, e o referido domínio de ligação se liga a CD137 e mantém as propriedades funcionais desejadas desses domínios de ligação descritos na Tabela 1.

[0171] Por exemplo, a invenção fornece um CD137-BD compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95 porcento idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 47, 71, 72 e 73, preferencialmente SEQ ID NO: 17, mais preferencialmente SEQ ID NO: 71; a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30, 57, 83, 84 e 85, de preferência a SEQ ID NO: 30, mais de preferência a SEQ ID NO: 85; em que o domínio de ligação se liga especificamente à proteína CD137 humana.

[0172] Em uma concretização, as sequências de aminoácidos VH e/ou VL podem ser 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências estabelecidas na Tabela 1. Em uma concretização, as sequências de aminoácidos VH e/ou VL podem ser idênticas, exceto uma substituição de aminoácidos em não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 posições de aminoácidos.

[0173] Em uma concretização, o CD137-BD da invenção possui uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3, em que uma ou mais dessas sequências CDR especificaram sequências de aminoácidos com base no CD137-BD aqui descrito ou suas modificações conservadoras, e em que a CD137-BD retém as propriedades funcionais desejadas do CD137-BD da invenção.

[0174] O termo "variante conservadoramente modificada" ou "variantes conservadoras" se aplica a sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos. No que diz respeito a sequências particulares de ácidos nucleicos, variantes conservadoramente modificadas referem-se aos ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas, ou onde o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos, a sequências essencialmente idênticas. Devido à degeneração do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer proteína. Por exemplo, todos os códons GCA, GCC, GCG e GCU codificam o aminoácido alanina. Assim, em todas as posições em que uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucleico são "variações silenciosas", que são uma espécie de variações modificadas conservadoramente. Cada sequência de ácido nucleico que aqui codifica um polipeptídeo também descreve todas as variações silenciosas possíveis do ácido nucleico. Um versado na técnica reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que é normalmente o único códon para metionina, e TGG, que é normalmente o único códon para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Por conseguinte, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo está implícita em cada sequência descrita.

[0175] Para sequências polipeptídicas, "variantes conservadoramente modificadas" ou "variantes conservadoras" incluem substituições, deleções ou adições individuais a uma sequência polipeptídica que resultam na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente semelhante. As tabelas de substituição conservadora que fornecem aminoácidos funcionalmente semelhantes são bem conhecidas no estado da técnica. Tais variantes modificadas conservadoramente são adicionais e não excluem variantes polimórficas, homólogos interespécies e alelos da invenção. Os oito grupos a seguir contêm aminoácidos que são substitutos conservadores um do outro: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W); 7) serina (S), treonina (T); e 8) cisteína (C), metionina (M) (ver, por exemplo, Creighton, Proteins (1984)). Em uma concretização, o termo "modificações de sequência conservadora" é usado para se referir a modificações de aminoácidos que não afetam ou alteram significativamente as características de ligação do anticorpo que contém a sequência de aminoácidos.

[0176] Por conseguinte, a invenção fornece um CD137-BD que consiste em uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3, em que: a CDR1 de região variável de cadeia pesada compreende, de preferência consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 4, 5, 8, 11, 35, 38, 41, 44, 59, 62, 65 e 68, de preferência SEQ ID NO: 1, mais preferencialmente SEQ ID NO: 59, ou suas variantes conservativas; a CDR2 de região variável de cadeia pesada compreende, de preferência consiste em, uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 6, 9, 12, 36, 39, 42, 45, 60, 63, 66 e 69, preferencialmente SEQ ID NO: 2, mais preferencialmente SEQ ID NO: 60, ou suas variantes conservativas; a CDR3 de região variável de cadeia pesada compreende, de preferência consiste em, uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 7, 10, 13, 37, 40, 43, 46, 61, 64, 67 e 70, de preferência SEQ ID NO: 3, mais preferencialmente SEQ ID NO: 61, ou suas variantes conservativas; a CDR1 de região variável de cadeia leve compreende, de preferência consiste em, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 18, 21, 24, 48, 51, 54, 74, 77 e 80, preferencialmente SEQ ID NO: 18, mais preferencialmente SEQ ID NO: 74, ou suas variantes conservativas; a CDR2 de região variável de cadeia leve compreende, de preferência consiste em, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 19, 22, 25, 49, 52, 55, 75, 75, 78 e 81, de preferência SEQ ID NO: 19, mais preferencialmente SEQ ID NO: 75, ou suas variantes conservativas; e a CDR3 de região variável de cadeia leve compreende, de preferência consiste em, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 20, 23, 26, 50, 53, 56, 76, 79 e 82, preferencialmente SEQ ID NO: 20, mais preferencialmente SEQ ID NO: 76, ou suas variantes conservativas; em que o referido CD137- BD é capaz de ativar a sinalização de CD137 com ou sem reticulação adicional.

[0177] Em uma concretização, o CD137-BD ou o anticorpo multiespecífico compreendendo o referido CD137-BD da invenção otimizado para expressão em uma célula de mamífero tem uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que uma ou mais dessas sequências possuem sequências de aminoácido especificadas com base nos CD137-BDs descritos aqui ou modificações conservadoras dos mesmos, e em que o CD137-BD ou o anticorpo multiespecífico compreendendo o referida CD137-BD retém as propriedades funcionais desejadas do CD137-BD da invenção. Por conseguinte, a invenção fornece o CD137-BD ou o anticorpo multiespecífico compreendendo o referido CD137-BD da invenção otimizado para expressão em uma célula de mamífero compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve em que: a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 47, 71, 72 e 73, preferencialmente SEQ ID NO: 17, mais preferencialmente SEQ ID NO: 71, e suas modificações conservadoras; e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30, 57, 83, 84 e 85, preferencialmente SEQ ID NO: 30, mais preferencialmente SEQ ID NO: 83, e suas modificações conservadoras; em que o referido CD137-BD é capaz de ativar a sinalização de CD137 com ou sem reticulação adicional.

[0178] Como usado aqui, o termo "otimizado" significa que uma sequência de nucleotídeos foi alterada para codificar uma sequência de aminoácidos usando códons preferidos na célula ou organismo de produção, geralmente uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de Pichia, uma Célula de ovário de hamster chinês (CHO) ou uma célula humana. A sequência nucleotídica otimizada é projetada para reter completamente ou tanto quanto possível a sequência de aminoácidos originalmente codificada pela sequência nucleotídica inicial, que também é conhecida como sequência "parental". As sequências otimizadas aqui foram projetadas para ter códons que são preferidos nas células de mamíferos. No entanto, a expressão otimizada dessas sequências em outras células eucarióticas ou células procarióticas também é contemplada aqui. As sequências de aminoácidos codificadas por sequências nucleotídicas otimizadas também são referidas como otimizadas.

[0179] Outro tipo de modificação da região variável é a mutação de resíduos de aminoácidos nas regiões CDRl, CDR2 e/ou CDR3 de VH e/ou VL para melhorar assim uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse, conhecido como "maturação por afinidade". A mutagênese dirigida ao local ou mutagênese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a(s) mutação(ões) e o efeito na ligação do anticorpo, ou outra propriedade funcional de interesse, pode ser avaliada em ensaios in vitro ou in vivo, conforme descrito aqui e fornecido no Exemplos. Modificações conservadoras (como discutido acima) podem ser introduzidas. As mutações podem ser substituições, adições ou deleções de aminoácidos. Além disso, normalmente não mais do que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região CDR são alterados.

[0180] Um anticorpo "amadurecido por afinidade" ou domínio de ligação é aquele com uma ou mais alterações em um ou mais domínios variáveis que resultam em uma melhoria na afinidade do anticorpo ou domínio de ligação ao antígeno, em comparação com um anticorpo parental ou domínio de ligação que não possui essas alterações. Numa concretização, um anticorpo ou domínio de ligação maturado por afinidade possui afinidades nanomolares ou mesmo picomolares para o antígeno alvo. Os anticorpos ou domínios amadurecidos por afinidade são produzidos por procedimentos conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992) descreve a maturação por afinidade por embaralhamento nos domínios VH e VL. A mutagênese aleatória da região hipervariável (HVR) e/ou resíduos estruturais é descrita por, por exemplo: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169: 147-155 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154 (7): 3310- 9 (1995); e Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992).

[0181] Em uma concretização, um CD137-BD "maturado por afinidade" da invenção compreende: uma VH4 compreendendo mutações I44V; F89V; Y105F, em particular compreendendo uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 15; e uma VL compreendendo a mutação A51P, em particular compreendendo uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 28.

[0182] Em outra concretização, um CD137-BD "maturado por afinidade" da invenção compreende: uma VH4 compreendendo mutações V25A; I44V; V82K; F89V; Y105F, em particular compreendendo uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 16; e uma VL compreendendo mutações I2L; A51P, em particular compreendendo uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 29.

[0183] Um CD137-BD da invenção pode ser preparado usando um anticorpo ou um domínio de ligação do mesmo com uma ou mais das sequências VH e/ou VL mostradas aqui como material de partida para projetar um domínio de ligação modificado, que pode ter propriedades alteradas desde o domínio de ligação de início. Um domínio de ligação pode ser manipulado modificando um ou mais resíduos dentro de uma ou ambas as regiões variáveis (ou seja, VH e/ou VL), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões estruturais.

[0184] Um tipo de engenharia de região variável que pode ser realizada é o enxerto de CDR. Os anticorpos ou domínios de ligação dos mesmos interagem com os antígenos alvo predominantemente através de resíduos de aminoácidos que estão localizados nas seis regiões determinantes da complementaridade da cadeia pesada e leve (CDRs). Por esse motivo, as sequências de aminoácidos dentro das CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais ou domínios de ligação do que sequências fora das CDRs. Como as sequências de CDR são responsáveis pela maioria das interações anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes ou domínios de ligação que imitam as propriedades de anticorpos específicos que ocorrem naturalmente através da construção de vetores de expressão que incluem sequências CDR do anticorpo específico que ocorre naturalmente enxertado nas sequências estruturais de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (ver, por exemplo, Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332: 323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321: 522-525; Queen, C. et al. 1989 Proc. Natl. Acad., EUA 86: 10029-10033; Patente US 5.225.539 de Winter e Patentes US

5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 de Queen et al.).

[0185] Tais sequências estruturais podem ser obtidas em bancos de dados públicos de DNA ou referências publicadas que incluem sequências de genes de anticorpos da linha germinativa ou sequências de anticorpos reorganizadas. Por exemplo, sequências de DNA da linha germinativa para genes da região variável de cadeia pesada e leve humana podem ser encontradas no banco de dados de sequência da linha germinativa humana “Vbase” (disponível na Internet em www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), bem como em Kabat, EA, et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, Publicação NIH No. 91-3242; Tomlinson, IM, et al., 1992 J. fol. Biol. 227: 776-798; e Cox, JPL et al., 1994 Eur. J. Immunol. 24: 827-836; o conteúdo de cada um dos quais é expressamente incorporado aqui por referência. Por exemplo, sequências de DNA da linha germinativa para genes da região variável de cadeia pesada e leve humana e sequências de anticorpos rearranjadas podem ser encontradas no banco de dados "IMGT" (disponível na Internet em www.imgt.org; veja Lefranc, MP et al., 1999 Nucleic Acids Res. 27: 209-212; o conteúdo de cada um dos quais é expressamente incorporado aqui por referência).

[0186] Um exemplo de sequências estruturais para uso no CD137- BD da invenção são aquelas estruturalmente semelhantes às sequências estruturais usadas por CD137-BDs selecionados da invenção. As sequências CDRl, 2 e 3 de VH e CDRl, 2 e 3 de VL podem ser enxertadas em regiões estruturais que possuem a sequência idêntica à encontrada no gene da imunoglobulina da linha germinativa da qual a sequência estrutural deriva, ou as sequências CDR podem ser enxertadas em regiões estruturais que contêm uma ou mais mutações em comparação com as sequências da linha germinativa. Por exemplo, verificou-se que, em certos casos, é benéfico fazer a mutação de resíduos nas regiões estruturais para manter ou aumentar a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo ou seu domínio de ligação (ver, por exemplo, as patentes US 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e

6.180.370 de Queen et al).

[0187] Adequadamente, o CD137-BD da invenção é selecionado a partir do grupo que consiste em: um Fab, um Fv, um scFv, dsFv, um scAb, STAB, um anticorpo de domínio único (sdAb ou dAb), um anticorpo de cadeia pesada de domínio único, e um anticorpo de cadeia leve de domínio único, um VHH, um VNAR, anticorpos de domínio único com base na estrutura VNAR do tubarão e domínios de ligação com base em scaffolds alternativos, incluindo, mas limitado a, domínios baseados em anquirina, finômeros, avímeros, anticalinas, fibronectinas e locais de ligação sendo construídos em regiões constantes de anticorpos (por exemplo, tecnologia f- star (Tecnologia de Anticorpo Modular da F-starTM)).

[0188] Adequadamente, o CD137-BD da invenção é um fragmento de anticorpo sc Fv. Os fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "scFv" ou "sFv" compreendem os domínios VH e VL de um anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipeptídeo Fv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite ao sFv formar a estrutura desejada para a ligação ao alvo. Os fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "scFv"

compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. Geralmente, os polipeptídeos scFv compreendem ainda um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL, que permite que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação ao antígeno (ver, por exemplo, Pluckthun, The pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, Nova Iorque, 1994), pp. 269-315).

[0189] Em concretizações particulares, o referido CD137-BD é um scFv compreendendo o ligante de acordo com a SEQ ID NO: 206.

[0190] Em uma concretização adicional, o CD137-BD da invenção é um fragmento variável de cadeia única (scFv) como mostrado nas SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 58, preferencialmente SEQ ID NO: 34. Numa concretização, o CD137-BD da invenção é um fragmento variável de cadeia única (scFv) como mostrado na SEQ ID NO: 32. Em outra concretização, o CD137-BD da invenção é um fragmento variável de cadeia única (scFv) como mostrado na SEQ ID NO: 33. Numa concretização preferida, o CD137-BD da invenção é um fragmento variável de cadeia única (scFv) como mostrado na SEQ ID NO: 34. Numa outra concretização preferida, o CD137-BD da invenção é um fragmento variável de cadeia única (scFv) como mostrado na SEQ ID NO: 86, 87 ou 88, preferencialmente SEQ ID NO: 86, mais preferencialmente SEQ ID NO: 88.

[0191] Outro domínio de ligação a CD137 adequado para uso no anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende ou é derivado de um anticorpo selecionado do grupo que consiste em: (i) urelumab (BMS-663513; um mAb IgG4 totalmente humanizado; Bristol-Myers Squibb; descrito nos documentos WO 2004/010947, US

6.887.673 e US 7.214.493, que são incorporados no presente pedido por referência na sua totalidade); e (ii) utomilumab (PF- 05082566; um mAb IgG2 totalmente humano; Pfizer; descrito em WO 2012/032433 e US 8 821 867, que é aqui incorporado no presente pedido por referência na sua totalidade).

[0192] O anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende pelo menos um domínio de ligação a PDL1 (PDL1-BD).

[0193] O termo "PDL1" refere-se em particular à PDL1 humana com o número de identificação UniProt Q9NZQ7, aqui reproduzida como SEQ ID NO: 198. Adequadamente, o PDL1-BD da presente invenção tem como alvo PDL1, em particular PDL1 humana como mostrado na UniProt ID número Q9NZQ7, reproduzida aqui como SEQ ID NO: 198. Adequadamente, os anticorpos da presente invenção ou seus fragmentos de ligação a antígeno compreendendo um PDL1-BD com alvo em PDL1 humana e de cinomogloso (Macaca fascicularis) (Macaca fascicularis), e preferencialmente não reage de maneira cruzada com PDL1 de Mus musculus. O PDL1-BD da presente invenção se liga especificamente à proteína PDL1 humana.

[0194] O PDL1-BD da presente invenção é um inibidor de PDL1. O termo "bloqueador" ou "anticorpo bloqueador" ou "inibidor" ou "anticorpo inibidor" ou "antagonista" ou "anticorpo antagonista" ou "domínio de ligação bloqueador" ou "domínio de ligação inibidor" refere-se a um anticorpo ou domínio de ligação que inibe ou reduz uma atividade biológica do antígeno ao qual se liga. Em algumas concretizações, anticorpos de bloqueio ou domínios de ligação de bloqueio ou anticorpos antagonistas ou domínios de ligação de antagonista inibem substancial ou completamente a atividade biológica do antígeno. O PDL1-BD da presente invenção tem como alvo, diminui, e inibe a capacidade de ligação da PDL1 aos seus parceiros de ligação, interferindo assim na função da PDL1. Em particular, o PDL1-BD da presente invenção bloqueia a interação da PDL1 com seu receptor, especificamente com PD-1. Em algumas concretizações, o PDL1-BD da presente invenção bloqueia a interação da PDL1 com seu receptor ou receptores, especificamente com PD-1 e/ou B7-1.

[0195] Em algumas concretizações, o PDL1-BD é derivado de um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo.

[0196] PDL1-BDs adequados para uso no anticorpo multiespecífico da presente invenção são novos domínios de ligação fornecidos na presente divulgação. Os novos domínios de ligação a PDL1 da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, anticorpos monoclonais humanizados isolados como aqui descrito, incluindo nos Exemplos. Exemplos de tais PDL1- BDs são anticorpos ou seus domínios de ligação cujas sequências estão listadas na Tabela 2.

[0197] Adequadamente, o PDL1-BD da presente invenção se liga especificamente ao PDL1 e é caracterizado por um ou mais dos seguintes parâmetros: (i) se liga a PDL1 humana com uma constante de dissociação (KD) inferior a 10 nM, particularmente inferior a 5 nM, particularmente inferior a 1 nM, particularmente inferior a 500 pM, mais particularmente inferior a 100 pM, preferencialmente inferior a 50 pM, mais preferencialmente menos do que 10 pM, mais preferencialmente 5 pM, em particular como medido por ressonância plasmônica de superfície (SPR), particularmente em que o referido anticorpo é um scFv (afinidade monovalente);

(ii) liga-se à PDL1 humana com uma taxa de Koff de 10−3 s-1 ou menos, ou 10−4 s-1 ou menos, ou 10−5 s-1 ou menos conforme medido por SPR, particularmente em que o referido anticorpo é um scFv; (iii) se liga à PDL1 humana com uma taxa de Kon de pelo menos 103 M-1s-1 ou superior, pelo menos 104 M-1s-1 ou superior, pelo menos, 105 M-1s-1 ou superior, pelo menos 106 M-1s-1 ou superior, conforme medido por SPR, particularmente em que o referido anticorpo é um scFv; (iv) é uma reação cruzada com PDL1 de Macaca fascicularis (Cynomolgus), em particular liga-se a PDL1 de Cynomolgus com um KD de menos do que 10 nM, menos do que 5 nM, particularmente menos do que 1 nM, particularmente menos do que 500 pM, mais particularmente menos do que 100 pM, preferencialmente menos do que 10 pM, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície; (v) não é reativo cruzado à PDL1 de Mus musculus, em particular conforme medido por SPR; e/ou (vi) não se liga à PDL2 humana, em particular conforme medido por SPR.

[0198] Numa concretização, o PDL1-BD da presente invenção tem uma alta afinidade para PDL1, por exemplo, PDL1 humana. Numa concretização adequada, o PDL1-BD da invenção se liga à PDL1 humana com um KD de entre 1 a 50,000 pM, 1 a 40,000 pM, 1 a 30000 pM, 1 a 20,000 pM, 1 a 10,000 pM, 1 a 5,000 pM, 1 a 2,500 pM, 1 a 1,000 pM, 1 a 750 pM, 1 a 500 pM, 1 a 250 pM, 1 a 100 pM, em particular quanto medido por ressonância plasmônica de superfície (SPR). Em uma concretização adequada, o PDL1-BD da invenção se liga à PDL1 humana com um KD menor que aproximadamente 50 nM, menor que aproximadamente 45 nM, menor que aproximadamente 40 nM, menor que aproximadamente 35 nM, menor que aproximadamente 30 nM, menor que aproximadamente 25 nM, menor que 20 nM, menor que aproximadamente 15 nM, menor que aproximadamente 10 nM, menor que aproximadamente 9 nM, menor que aproximadamente 8 nM, menor que aproximadamente 7 nM, menor que aproximadamente 7 nM, menor que aproximadamente 6 nM, menor que aproximadamente 5 nM, menor que aproximadamente 4 nM, menor que aproximadamente 3 nM, menor que 2 nM, menor que 1 nM, menor que 0,5 nM, menor que 0,25 nM, menor que 100 pM, menor que 10 pM ou menor que 5 pM, em particular conforme medido pelo SPR. Adequadamente, o PDL1-BD da invenção liga-se à PDL1 humana com um KD inferior a 1 nM. Adequadamente, o PDL1-BD da invenção liga- se à PDL1 humana com um KD inferior a 0,5 nM, em particular como medido por SPR. Adequadamente, o PDL1-BD da invenção liga-se à PDL1 humana com um KD inferior a 100 pM, em particular como medido por SPR. Preferencialmente, o PDL1-BD da invenção liga- se à PDL1 humana com um KD inferior a 10 pM, em particular como medido por SPR. Mais preferencialmente, o PDL1-BD da invenção liga-se à PDL1 humana com um KD inferior a 5 pM, em particular como medido por SPR.

[0199] Adequadamente, o PDL1-BD da invenção liga-se à PDL1 humana com uma taxa de Kon de pelo menos 103 M-1s-1 ou superior, pelo menos 104 M-1s-1 ou superior, pelo menos, 5x104 M-1s-1 ou superior, pelo menos 105 M-1s-1 ou superior, pelo menos 5x105 M-1s- 1 ou superior, pelo menos 106 M-1s-1 ou superior, pelo menos 5x106 M-1s-1 ou superior, pelo menos 107 M-1s-1 ou superior, pelo menos 5x107 M-1s-1 ou superior, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície (SPR). De um modo preferido, o PDL1-BD da invenção liga-se à PDL1 humana com uma taxa de Kon de pelo menos 105 M-1s-1 ou superior, em particular, pelo menos 106 M-1s-1 ou superior, tal como medido pela SPR, particularmente em que o referido anticorpo é um scFv (afinidade monovalente).

[0200] Adequadamente, o PDL1-BD da invenção se liga à PDL1 humana com uma taxa de Koff de 10−3 s−1 ou menos, 3x10−3 s−1 ou menos, 5x10−3 s−1 ou menos, 10−4 s−1 ou menos, 5x10−4 s−1 ou menos, 10−5 s−1 ou menos, 5x10−5 s−1 ou menos, 10−6 s−1 ou menos ou 10−7 s−1 ou menos conforme medido por ressonância plasmônica de superfície (SPR). De preferência, o PDL1-BD da invenção se liga à PDL1 humana com uma taxa de Koff de 10−3 s−1 ou menos, 10−4 s−1 ou menos, em particular 10−5 s−1 ou menos, conforme medido por SPR.

[0201] Adequadamente, o PDL1-BD da presente invenção se liga especificamente a PDL1 e é caracterizado por um ou mais dos seguintes parâmetros: (i) quando no formato scFv, tem uma temperatura de fusão (Tm), determinada por fluorimetria de varredura diferencial, de pelo menos 55° C, por exemplo, pelo menos 60° C, preferencialmente pelo menos 65° C, mais preferencialmente pelo menos 70° C, em particular em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é formulado em tampão fosfato-citrato a pH 6,4, NaCl 150 mM, em particular em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é formulado em tampão citrato de fosfato 50 mM com NaCl 150 mM a pH 6,4; (ii) quando no formato scFv, tem uma perda no teor de monômero, após cinco ciclos consecutivos de congelamento e descongelamento, inferiores a 5%, preferencialmente inferior a 3%, mais preferencialmente inferior a 1%, quando o anticorpo da invenção está em uma concentração inicial de 10 mg/ml, em particular em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é formulado em tampão de citrato de fosfato 50 mM com NaCl 150 mM a pH 6,4; e/ou (iii) quando no formato scFv, possui uma perda no teor de monômero, após armazenamento por pelo menos duas semanas, particularmente por pelo menos quatro semanas, a 4° C, menor que 15%, por exemplo, menor que 12%, menor que 10%, menor que 7%, menor que 5%, menor que 4%, menor que 3%, menor que 2%, preferencialmente menor que 1%, quando o anticorpo da invenção estiver em uma concentração inicial de 10 mg/ml, e em particular em que o anticorpo da invenção, por exemplo, o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, é formulado em tampão de citrato de fosfato 50 mM com NaCl 150 mM a pH 6,4.

[0202] Adequadamente, o PDL1-BD da invenção compreende uma CDR de VH com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VH listadas na Tabela 2. Em particular, o PDL1-BD da invenção compreende uma, duas, três ou mais CDRs de VH com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VH listadas na Tabela 2.

[0203] Adequadamente, o PDL1-BD da invenção compreende uma CDR de VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VL listadas na Tabela 2. Em particular, o PDL1-BD da invenção compreende uma, duas, três ou mais CDRs de VL tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VL listadas na Tabela 2.

[0204] Outros PDL1-BDs da invenção incluem aminoácidos que foram mutados, mas têm pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93,

94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade nas regiões CDR com as regiões CDR representadas nas sequências descritas na Tabela 2. Outros PDL1-BDs da invenção incluem sequências de aminoácidos mutantes em que não mais de 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos foram mutados nas regiões CDR quando comparados com as regiões CDR representadas na sequência descrita na Tabela 2.

[0205] A presente invenção fornece um PDL1-BD, que compreende (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo, de preferência consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 89, 92, 93, 96, 99, 119, 122, 123, 126 e 129, de preferência a SEQ ID NO: 89 ou 119, mais de preferência a SEQ ID NO: 89; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo, preferencialmente consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 90, 94, 97, 100, 120, 124, 127 e 130, preferencialmente SEQ ID NO: 90 ou 120, mais preferencialmente SEQ ID NO: 90; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo, de preferência consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 91, 95, 98, 101, 121, 125, 128 e 131, preferencialmente SEQ ID NO: 91 ou 121, mais preferencialmente SEQ ID NO: 91; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo, preferencialmente consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 105, 108, 111, 135, 138 e 141, preferencialmente SEQ ID NO: 105 ou 135, mais preferencialmente SEQ ID NO: 105; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo, preferencialmente consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 106, 109, 112, 136,

139 e 142, preferencialmente SEQ ID NO: 106 ou 136, mais preferencialmente SEQ ID NO: 106; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo, de preferência consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 107, 110, 113, 137, 140 e 143, preferencialmente SEQ ID NO: 107 ou 137, mais de preferência SEQ ID NO: 107.

[0206] Adequadamente, o anticorpo isolado da invenção ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende: (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo, preferencialmente consistindo em, uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 89, 92, 93, 96, 99, 119, 122, 123, 126 e 129, de preferência SEQ ID NO: 89 ou 119, mais preferencialmente SEQ ID NO: 89; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo, preferencialmente consistindo em, uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade a qualquer uma das SEQ ID NOs: 90, 94, 97, 100, 120, 124, 127 e 130, preferencialmente SEQ ID NO: 90 ou 120, mais preferencialmente SEQ ID NO: 90; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo, de preferência consistindo em, uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade a qualquer uma das SEQ ID NOs: 91, 95, 98, 101, 121, 125, 128 e 131, preferencialmente SEQ ID NO: 91 ou 121, mais preferencialmente SEQ ID NO: 91; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo, de preferência consistindo em, uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92,

93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade a qualquer uma das SEQ ID NOs: 105, 108, 111, 135, 138 e 141, preferencialmente SEQ ID NO: 105 ou 135, mais preferencialmente SEQ ID NO: 105; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo, de preferência consistindo em, uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade a qualquer uma das SEQ ID NOs: 106, 109, 112, 136, 139 e 142, preferencialmente SEQ ID NO: 106 ou 136, mais preferencialmente SEQ ID NO: 106; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo, de preferência consistindo em, uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade a qualquer uma das SEQ ID NOs: 107, 110, 113, 137, 140 e 143, preferencialmente SEQ ID NO: 107 ou 137, mais preferencialmente SEQ ID NO: 107.

[0207] Em uma concretização, o PDL1-BD da invenção compreende: (a) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 89, 90 e 91, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 105, 106 e 107, respectivamente; (b) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 92, 94 e 95, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 108, 109 e 110, respectivamente; (c) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 93, 94 e 95, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 108, 109 e 110, respectivamente; (d) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 96, 97 e 98, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 105, 106 e 107, respectivamente; (e) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 99, 100 e 101, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID

NOs: 111, 112 e 113, respectivamente; (f) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 119, 120 e 121, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 135, 136 e 137, respectivamente; (g) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 122, 124 e 125, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 138, 139 e 140, respectivamente; (h) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 123, 124 e 125, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 138, 139 e 140, respectivamente; (i) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 126, 127 e 128, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 135, 136 e 137, respectivamente; (j) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 129, 130 e 131, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 141, 142 e 143, respectivamente. Em uma concretização, o PDL1-BD da invenção compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 89, 90 e 91, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 105, 106, e 107, respectivamente. Em outra concretização, o PDL1-BD da invenção compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 119, 120 e 121, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 135, 136, e 137, respectivamente.

[0208] Adequadamente, o PDL1-BD da invenção compreende: (a) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade às SEQ ID NOs: 89, 90 e 91, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou identidade de 99% às SEQ ID NOs: 105, 106 e 107, respectivamente; (b) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 92, 94 e 95, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NOs: 108, 109 e 110, respectivamente; (c) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 93, 94 e 95, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NOs: 108, 109 e 110, respectivamente; (d) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 96, 97 e 98, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NOs: 105, 106 e 107, respectivamente; (e) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 99, 100 e 101, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NOs: 111, 112 e 113, respectivamente; (f) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 119, 120 e 121, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NOs: 135, 136 e 137, respectivamente; (g) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NOs: 122, 124 e 125, respectivamente, e sequências

LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NOs: 138, 139 e 140, respectivamente; (h) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 123, 124 e 125, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NOs: 138, 139 e 140, respectivamente; (i) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NOs: 126, 127 e 128, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NOs: 135, 136 e 137, respectivamente; (j) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 129, 130 e 131, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NOs: 141, 142 e 143, respectivamente.

Em uma concretização, o PDL1-BD da invenção compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade às SEQ ID NOs: 89, 90 e 91, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade às SEQ ID NOs: 105, 106 e 107, respectivamente.

Em outra concretização, o PDL1-BD da invenção compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade às SEQ ID NOs: 119, 120 e 121, respectivamente, e sequências

LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade às SEQ ID NOs: 135, 136 e 137, respectivamente.

[0209] Adequadamente, o PDL1-BD da invenção compreende: (a) uma HCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89; (b) uma HCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; (c) uma HCDR3 compreendendo, de preferência consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91; (d) uma LCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 105; (e) uma LCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 106; e (f) uma LCDR3 compreendendo, de preferência consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107. Adequadamente, o PDL1-BD da invenção compreende: (a) uma HCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 89; (b) uma HCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 90; (c) uma HCDR3 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 91; (d) uma LCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 105; (e) uma LCDR2 compreendendo,

preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 106; e (f) uma LCDR3 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 107.

[0210] Numa outra concretização, o PDL1-BD da invenção compreende: (a) uma HCDR1 compreendendo, de preferência consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 92 ou SEQ ID NO: 93; (b) uma HCDR2 compreendendo, de preferência consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94; (c) uma HCDR3 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95; (d) uma LCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 108; (e) uma LCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 109; e (f) uma LCDR3 compreendendo, de preferência consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 110. Adequadamente, o PDL1-BD da invenção compreende: (a) uma HCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade com a SEQ ID NO: 92 ou SEQ ID NO: 93; (b) uma HCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 94; (c) uma HCDR3 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 95; (d) uma LCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 108; (e) uma LCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 109; e (f) uma LCDR3 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 110.

[0211] Adequadamente, o PDL1-BD da invenção compreende: (a) uma HCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 119; (b) uma HCDR2 compreendendo, de preferência consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 120; (c) uma HCDR3 compreendendo, de preferência consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; (d) uma LCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 135; (e) uma LCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 136; e (f) uma LCDR3 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 137. Adequadamente, o PDL1-BD da invenção compreende: (a) uma HCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 119; (b) uma HCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 120; (c)

uma HCDR3 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 121; (d) uma LCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 135; (e) uma LCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 136; e (f) uma LCDR3 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 137.

[0212] Numa outra concretização, o PDL1-BD da invenção compreende: (a) uma HCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 122 ou SEQ ID NO: 123; (b) uma HCDR2 compreendendo, de preferência consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 124; (c) uma HCDR3 compreendendo, de preferência consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 125; (d) uma LCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 138; (e) uma LCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 139; e (f) uma LCDR3 compreendendo, de preferência consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 140. Adequadamente, o PDL1-BD da invenção compreende: (a) uma HCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo na sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 122 ou SEQ ID NO: 123;

(b) uma HCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 124; (c) uma HCDR3 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 125; (d) uma LCDR1 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 138; (e) uma LCDR2 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 139; e (f) uma LCDR3 compreendendo, preferencialmente consistindo em, a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 140.

[0213] Em uma concretização adicional, a presente invenção fornece um PDL1-BD que se liga especificamente a PDL1 (por exemplo, proteína PDL1 humana), em que o referido domínio de ligação compreende um domínio VH e um domínio VL.

[0214] Adequadamente, o PDL1-BD da presente invenção compreende um VH1A, VH1B, VH3 ou VH4. Numa concretização, o PDL1- BD da presente invenção compreende o domínio VH3. Numa concretização, o PDL1-BD da presente invenção compreende o domínio VH4. Noutra concretização, o PDL1-BD da presente invenção compreende o domínio VH1A ou VH1B.

[0215] Um exemplo específico de uma VH pertencente à família VH1 está representado na SEQ ID NO: 103. Em particular, as regiões de estrutura FR1 a FR4, extraídas da SEQ ID NO: 103, pertencem à família VH1 (Tabela 1, regiões marcadas em negrito). Adequadamente, uma VH pertencente à família VH1, como aqui utilizado, é uma VH compreendendo FR1 a FR4 tendo pelo menos 85%, preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade de sequência a FR1 a FR4 da SEQ ID NO: 103.

[0216] Um exemplo específico de um VH pertencente à família VH3 é representado na SEQ ID NO: 104. Em particular, as regiões de estrutura FR1 a FR4, extraídas da SEQ ID NO: 104, pertencem à família VH3 (Tabela 2, regiões marcadas em negrito). Adequadamente, uma VH pertencente à família VH3, como aqui utilizado, é uma VH compreendendo FR1 a FR4 tendo pelo menos 85%, preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade de sequência a FR1 a FR4 da SEQ ID NO: 104.

[0217] Um exemplo específico de um VH pertencente à família VH4 é representado na SEQ ID NO: 102. Em particular, as regiões de estrutura FR1 a FR4 retiradas da SEQ ID NO: 102 pertencem à família VH4 (Tabela 2, regiões marcadas em negrito). Adequadamente, uma VH pertencente à família VH4, como aqui utilizado, é uma VH compreendendo FR1 a FR4 tendo pelo menos 85%, preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade de sequência a FR1 a FR4 da SEQ ID NO: 102.

[0218] Adequadamente, o PDL1-BD da presente invenção compreende: estruturas Vκ FR1, FR2 e FR3, particularmente estruturas Vκ1 ou Vκ3, preferencialmente estruturas Vκ1 FR1 a 3 e uma estrutura FR4, que é selecionada a partir de um Vκ FR4,

particularmente Vκ1 FR4, Vκ3 FR4 e um Vλ FR4. As estruturas Vκ1 adequadas FR1 a 3 são apresentadas na SEQ ID NO: 114 (Tabela 2, as regiões FR estão marcadas em negrito). As estruturas Vκ1 adequadas FR1 a 3 compreendem a sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90% de identidade com a sequência de aminoácidos correspondente a FR1 a 3 e extraída da SEQ ID NO: 114 (Tabela 2, as regiões FR estão marcadas em negrito). Vλ FR4 adequado é como estabelecido na SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205. Em uma concretização, o PDL1-BD da presente invenção compreende Vλ FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90% de identidade para compreender uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205.

[0219] Assim, em uma concretização, o PDL1-BD da presente invenção compreende: (i) as sequências HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de: a. as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 92, 94 e 95, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 108, 109 e 110, respectivamente; b. as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 122, 124 e 125, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 138, 139 e 140, respectivamente; ou c. as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 123, 124 e 125, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 138, 139 e 140, respectivamente;

(ii) um domínio VH3 ou VH4, preferencialmente um domínio VH4; e (iii) um domínio VL compreendendo uma estrutura VL compreendendo estruturas Vκ FR1, FR2 e FR3, particularmente Vκ1 ou Vκ3 FR1 a FR3, preferencialmente Vκ1 FR1 a FR3, e uma estrutura FR4, que é selecionada a partir de uma Vκ FR4, particularmente Vκ1 FR4, Vκ3 FR4 e um Vλ FR4, preferencialmente Vλ FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90% de identidade para compreender uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, de preferência Vλ FR4 é como estabelecido na SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, mais preferencialmente Vλ FR4 é como estabelecido na SEQ ID NO: 199.

[0220] Em outra concretização, o PDL1-BD da presente invenção compreende: (i) as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de: SEQ ID NOs: 93, 94 e 95, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 108, 109 e 110, respectivamente; (ii) um domínio VH1A, VH1B, VH3 ou VH4, preferencialmente um domínio VH1A ou VH1B; e (iii) um domínio VL compreendendo uma estrutura VL compreendendo estruturas Vκ FR1, FR2 e FR3, particularmente Vκ1 ou Vκ3 FR1 a FR3, preferencialmente Vκ1 FR1 a FR3, e uma estrutura FR4, que é selecionada a partir de uma Vκ FR4, particularmente Vκ1 FR4, Vκ3 FR4 e um Vλ FR4, preferencialmente Vλ FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90% de identidade para compreender uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, preferencialmente Vλ FR4 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, mais preferencialmente Vλ FR4 é como estabelecido na SEQ ID NO: 199.

[0221] Em uma concretização específica, o PDL1-BD da presente invenção compreende: (i) as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de: SEQ ID NOs: 119, 120 e 121, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 135, 136 e 137, respectivamente; (ii) um domínio de VH3 ou VH4, de preferência domínio VH4; e (iii) um domínio VL compreendendo uma estrutura VL compreendendo estruturas Vκ FR1, FR2 e FR3, particularmente Vκ1 ou Vκ3 FR1 a FR3, preferencialmente Vκ1 FR1 a FR3, e uma estrutura FR4, que é selecionada a partir de uma Vκ FR4, particularmente Vκ1 FR4, Vκ3 FR4 e um Vλ FR4, preferencialmente Vλ FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90% de identidade para compreender uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, preferencialmente Vλ FR4 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, mais preferencialmente Vλ FR4 é como estabelecido na SEQ ID NO: 199.

[0222] Numa concretização preferida, o PDL1-BD da presente invenção compreende: (i) as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 89, 90 e 91, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 105, 106 e 107, respectivamente;

(ii) sequências estruturais de domínio VH3 ou VH4 FR1 a FR4; de preferência as sequências estruturais de domínio VH3 FR1 a FR4; e (iii) um domínio VL compreendendo uma estrutura VL compreendendo estruturas Vκ FR1, FR2 e FR3, particularmente Vκ1 ou Vκ3 FR1 a FR3, preferencialmente Vκ1 FR1 a FR3, e uma estrutura FR4, que é selecionada a partir de uma Vκ FR4, particularmente Vκ1 FR4, Vκ3 FR4 e um Vλ FR4, preferencialmente Vλ FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90% de identidade para compreender uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, de preferência Vλ FR4 é como estabelecido na SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, mais preferencialmente Vλ FR4 é como estabelecido na SEQ ID NO: 199.

[0223] Em uma concretização, o PDL1-BD da presente invenção compreende uma VL compreendendo: (i) domínios CDR CDR1, CDR2 e CDR3; (ii) regiões estruturais Vκ humanas FR1 a FR3, particularmente regiões estruturais Vκ1 humanas FR1 a FR3; (iii) FR4, que é selecionado a partir de (a) uma sequência de linhas germinativas de Vλ humana para FR4, particularmente uma sequência de linhas germinativas de Vλ selecionada da lista de: SEQ ID NO: 199 a 205, preferencialmente Vλ FR4 é como estabelecido em SEQ ID NO: 199; e (b) uma sequência baseada em Vλ, que possui uma ou duas mutações, particularmente uma mutação, em comparação com a sequência de linha germinativa de Vλ humana mais próxima para FR4 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, preferencialmente SEQ ID NO: 199.

[0224] O PDL1-BD da invenção compreende um domínio VH listado na Tabela 2. Adequadamente, o PDL1-BD da invenção compreende uma sequência de aminoácidos VH listada na Tabela 2, em que não mais que cerca de 10 aminoácidos em uma sequência estrutural (para por exemplo, uma sequência que não é uma CDR) foi mutada (em que uma mutação é, como vários exemplos não limitativos, uma adição, substituição ou exclusão). Adequadamente, o PDL1-BD da invenção compreende uma sequência de aminoácidos VH listada na Tabela 2, em que não mais do que cerca de 20 aminoácidos em uma sequência estrutural (por exemplo, uma sequência que não é uma CDR) foram mutados (em que um mutação é, como vários exemplos não limitativos, uma adição, substituição ou exclusão). Outros PDL1- BDs da invenção incluem aminoácidos que foram mutados, mas têm pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade nas regiões VH com as regiões VH representadas nas sequências descritas na Tabela 2.

[0225] O PDL1-BD da invenção compreende um domínio VL listado na Tabela 2. Adequadamente, o PDL1-BD da invenção compreende uma sequência de aminoácidos VL listada na Tabela 2, em que não mais do que cerca de 10 aminoácidos em uma sequência estrutural (para por exemplo, uma sequência que não é uma CDR) foi mutada (em que uma mutação é, como vários exemplos não limitativos, uma adição, substituição ou exclusão). Adequadamente, o PDL1-BD da invenção compreende uma sequência de aminoácidos VL listada na Tabela 2, em que não mais do que cerca de 20 aminoácidos em uma sequência estrutural (por exemplo, uma sequência que não é uma CDR) foram mutados (em que um mutação é, como vários exemplos não limitativos, uma adição, substituição ou exclusão). Outros PDL1- BDs da invenção incluem aminoácidos que foram mutados, mas possuem pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade nas regiões VL com as regiões VL representadas nas sequências descritas na Tabela 2.

[0226] Adequadamente, o PDL1-BD da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento, de preferência pelo menos 90%, idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 102, 103, 104, 132, 133 e 134, preferencialmente SEQ ID NO: 102 ou 104, mais preferencialmente SEQ ID NO: 104; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento, preferencialmente pelo menos 90 por cento, idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 114, 115, 144 e 145, preferencialmente SEQ ID NO: 114 ou 115, mais preferencialmente SEQ ID NO: 115.

[0227] Em uma concretização, o PDL1-BD da invenção compreende: uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 102, 103, 104, 132, 133 e 134, preferencialmente SEQ ID NO: 102 ou 104, mais preferencialmente SEQ ID NO: 104; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 114, 115, 144 e 145, preferencialmente SEQ ID NO: 114 ou 115, mais preferencialmente SEQ ID NO: 115.

[0228] Numa outra concretização, o PDL1-BD da invenção compreende: (a) uma sequência VH da SEQ ID NO: 102 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 114; (b) uma sequência VH da SEQ ID NO: 103 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 114; (c) uma sequência VH da SEQ ID NO: 104 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 115; (d) uma sequência VH da SEQ ID NO: 132 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 144; (e) uma sequência VH da SEQ ID NO: 133 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 145; ou (f) uma sequência VH da SEQ ID NO: 134 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 144. Numa concretização preferida, o PDL1-BD da invenção compreende uma sequência VH da SEQ ID NO: 102 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 114. Numa concretização mais preferida, o PDL1-BD da invenção compreende uma sequência VH da SEQ ID NO: 104 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 115.

[0229] Em uma concretização, o PDL1-BD da presente invenção compreende: (a) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 92, 94 e 95, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 108, 109 e 110, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 102 e uma sequência VL de pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à SEQ ID NO: 114; (b) as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de: SEQ ID NOs: 93, 94 e 95, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 108, 109 e 110, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 103 e uma sequência VL pelo menos 60, 70,

80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à SEQ ID NO: 114;

(c) as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de: SEQ ID NOs: 92, 93 e 94, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 108, 109 e 110, respectivamente, uma sequência VH em pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 104 e uma sequência VL em pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à SEQ ID NO: 115, de preferência em que o referido VH compreende mutações G56A e Y105F (numeração AHo) e o referido VL compreende as mutações S9A e A51P (numeração AHo);

(d) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 122, 124 e 125, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 138, 139 e 140, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 132 e uma sequência VL de pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à SEQ ID NO: 144;

(e) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 123, 124 e 125, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 138, 139 e 140, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 133 e uma sequência VL de pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 145, de preferência em que o referido VH compreende as mutações V2S, V25A, I44V, G56A, V82K, F89V e Y105F (numeração AHo) e o referido VL compreende mutações I2F, M4L e A51P (numeração Aho); ou

(f) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 122, 124 e 125, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 138, 139 e 140, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 134 e uma sequência VL de pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à SEQ ID NO: 144, de preferência em que o referido VH compreende mutação V25A, I44 V, G56A, V82K e F89V (numeração AHo).

[0230] Em uma concretização, o PDL1-BD da presente invenção compreende: (a) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 89, 90 e 91, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs 105, 106 e 107, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 102 e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à SEQ ID NO: 114; (b) as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de: SEQ ID NOs: 89, 90 e 91, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 105, 106 e 107, respectivamente, a sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 103 e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à SEQ ID NO: 114; (c) as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de: SEQ ID NOs: 89, 90 e 91, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 105, 106 e 107, respectivamente, a sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 104 e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 115, de preferência em que o referido VH compreende mutações G56A e Y105F (numeração AHo) e o referido VL compreende mutações S9A e A51P (numeração AHo);

(d) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 119, 120 e 121, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 135, 136 e 137, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 132 e uma sequência VL de pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à SEQ ID NO: 144;

(e) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 119, 120 e 121, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 135, 136 e 137, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 133 e uma sequência VL de pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 145, de preferência em que o referido VH compreende as mutações V2S, V25A, I44V, G56A, V82K, F89V e Y105F (numeração AHo) e o referido VL compreende as mutações I2F, M4L e A51P (numeração Aho); ou

(f) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 119, 120 e 121, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 135, 136 e 137, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 134 e uma sequência VL de pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à SEQ ID NO: 144, de preferência em que o referido VH compreende mutações V25A, I44V, G56A, V82K e F89V (numeração Aho).

[0231] Em uma concretização preferida, o PDL1-BD da presente invenção compreende as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 89, 90 e 91, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 105, 106 e 107, respectivamente, uma sequência VH de pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 104 e uma Sequência de VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à SEQ ID NO: 115, de preferência em que o referido VH compreende as mutações G56A e Y105F (AHo numeração) e a referida VL compreende as mutações S9A e A51P (numeração Aho).

[0232] Em uma concretização, um PDL1-BD que se liga especificamente à PDL1 é um domínio de ligação descrito na Tabela

2. Numa concretização, o PDL1-BD da invenção que se liga especificamente à PDL1 é como estabelecido na SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147 ou SEQ ID NO: 148. Numa concretização, o PDL1-BD da invenção que se liga especificamente a PDL1 é como estabelecido na SEQ ID NO: 116 ou SEQ ID NO: 117, ou SEQ ID NO: 118, ou SEQ ID NO: 118, preferencialmente SEQ ID NO: 116, mais preferencialmente SEQ ID NO: 118. Em uma concretização, o PDL1- BD da invenção que se liga especificamente a PDL1 é como apresentado na SEQ ID NO: 146 ou SEQ ID NO: 147 ou SEQ ID NO: 148, de preferência a SEQ ID NO: 146, mais preferencialmente ID SEQ NO: 148.

[0233] Outros PDL1-BDs da invenção incluem aqueles em que os aminoácidos ou ácidos nucleicos que codificam os aminoácidos foram mutados, mas têm pelo menos 60, 70, 80, 90 ou 95% de identidade com as sequências descritas na Tabela 2. Em uma concretização, inclui sequências de aminoácidos mutantes em que não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos foram mutados nas regiões variáveis quando comparados com as regiões variáveis representadas na sequência descrita na Tabela 2, mantendo substancialmente a mesma atividade. O termo "substancialmente a mesma atividade" como aqui utilizado refere-se à atividade indicada por substancialmente a mesma atividade sendo pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou até mesmo pelo menos 100% ou pelo menos 110% ou pelo menos 120% ou pelo menos 130% ou pelo menos 140% ou pelo menos 150% ou pelo menos 160%, ou pelo menos 170%, ou pelo menos 180%, ou pelo menos 190%, por exemplo, até 200% da atividade, conforme determinado para o PDL1-BD parental, em particular o PDL1-BD da invenção descrito na Tabela 2.

[0234] Dado que cada um desses domínios de ligação pode se ligar a PDL1 e que a especificidade de ligação ao antígeno é fornecida principalmente pelas regiões CDR1, 2 e 3, as sequências CDR1, 2 e 3 de VH e as sequências CDR1, 2 e 3 de VL podem ser "misturadas e combinadas". Tais PDL1-BDs "misturados e combinados" podem ser testados usando os ensaios de ligação conhecidos na técnica e os descritos nos Exemplos (por exemplo, ELISAs). Quando as sequências CDR de VH são misturadas e combinadas, a sequência CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência VH específica deve ser substituída por uma sequência CDR estruturalmente semelhante. Da mesma forma, quando as sequências

CDR de VL são misturadas e combinadas, a sequência CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência VL específica deve ser substituída por uma sequência CDR estruturalmente semelhante.

[0235] Em ainda outra concretização, o PDL1-BD da invenção compreende sequências de aminoácidos que são homólogas às sequências descritas na Tabela 2, e o referido BD se liga a PDL1 e retém as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos descritos na Tabela 2.

[0236] Por exemplo, a invenção fornece um PDL1-BD compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 102, 103, 104, 132, 133 e 134, preferencialmente SEQ ID NO: 102 ou 104, mais preferencialmente SEQ ID NO: 104; a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 114, 115, 144 e 145, preferencialmente SEQ ID NO: 114 ou 115, mais preferencialmente SEQ ID NO: 115.

[0237] Em uma concretização, as sequências de aminoácidos VH e/ou VL podem ser 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências estabelecidas na tabela 2. Numa concretização, as sequências de aminoácidos VH e/ou VL podem ser idênticas, exceto uma substituição de aminoácidos em não mais que 1, 2, 3, 4 ou 5 posições de aminoácidos.

[0238] Em uma concretização, a invenção fornece um PDL1-BD compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3, em que uma ou mais dessas sequências CDR possuem sequências de aminoácidos especificadas com base nos PDL1-BDs aqui descritos ou suas modificações conservadoras, e em que os PDL1-BDs retêm as propriedades funcionais desejadas dos PDL1- BDs da invenção.

[0239] Por conseguinte, a invenção fornece um PDL1-BD compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo sequências CDR1, CDR2 e CDR3, em que: a CDR1 de região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 89, 92, 93, 96, 99, 119, 122, 123, 126 e 129, preferencialmente SEQ ID NO: 89 ou 119, mais preferencialmente SEQ ID NO: 89, ou variantes conservativas das mesmas; a região variável de cadeia pesada CDR2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 90, 94, 97, 100, 120, 124, 127 e 130, preferencialmente SEQ ID NO: 90 ou 120, mais preferencialmente SEQ ID NO: 90, ou variantes conservativas dos mesmos; a região variável de cadeia pesada CDR3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 91, 95, 98, 101, 121, 125, 128 e 131, preferencialmente SEQ ID NO: 91 ou 121, mais preferencialmente SEQ ID NO: 91, ou variantes conservativas dos mesmos; CDR1 de região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 105, 108, 111, 135, 138, e 141, de preferência a SEQ ID NO: 105 ou 135, mais de preferência a SEQ ID NO: 105, ou variantes conservativas dos mesmos; a CDR2 de região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 106, 109, 112, 136, 139 e 142, preferencialmente SEQ ID NO: 106 ou 136, mais preferencialmente SEQ ID NO: 106, ou variantes conservativas dos mesmos; e a CDR3 de região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 107, 110, 113, 137, 140, e 143, de preferência a SEQ ID NO: 107 ou 137, mais de preferência a SEQ ID NO: 107, ou variantes conservativas dos mesmos; em que o PDL1-BD se liga especificamente a PDL1 e é capaz de bloquear a interação PD- 1/PDL1.

[0240] Em uma concretização, um PDL1-BD da invenção é otimizado para expressão em uma célula de mamífero que possui uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que uma ou mais dessas sequências têm sequências de aminoácidos especificadas com base nos domínios de ligação descritos aqui ou modificações conservativas dos mesmos, e em que os domínios de ligação retêm as propriedades funcionais desejadas do PDL1-BD da invenção. Por conseguinte, a invenção fornece um PDL1-BD otimizado para expressão em uma célula de mamífero compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve em que: a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 102, 103, 104, 132, 133 e 134, preferencialmente SEQ ID NO: 102 ou 104, mais preferencialmente SEQ ID NO: 104, e suas modificações conservadoras; e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 114, 115, 144 e 145, preferencialmente SEQ ID NO: 114 ou 115, mais preferencialmente SEQ ID NO: 115, e suas modificações conservativas; em que o PDL1-BD se liga especificamente ao PDL1 e é capaz de bloquear a interação PD-1/PDL1.

[0241] Numa concretização, um PDL1-BD da invenção compreende: um VH3 compreendendo mutações G56A e Y105F, em particular compreendendo uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 104; e preferencialmente uma VL compreendendo Mutações S9A; A51P, em particular compreendendo uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 115.

[0242] Em uma concretização, um PDL1-BD "maturado por afinidade" da invenção compreende: um VH4 compreendendo mutações V25A; I44V; G56A; V82K; F89V, em particular compreendendo uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 134; e preferencialmente uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 144. Em uma concretização adicional, um PDL1-BD "maturado por afinidade" da invenção compreende: um VH4 compreendendo mutações V2S; V25A; I44V; G56A; V82K; F89V; Y105F, em particular compreendendo uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 133; e uma VL compreendendo mutações I2F; M4L; A51P, em particular compreendendo uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 145.

[0243] Um PDL1-BD da invenção adicionalmente pode ser preparado usando um anticorpo ou domínio de ligação tendo uma ou mais das sequências VH e/ou VL mostradas aqui como material de partida para projetar um domínio de ligação modificado, cujo domínio de ligação modificado pode ter propriedades alteradas do anticorpo de partida ou domínio de ligação. Um domínio de ligação pode ser manipulado modificando um ou mais resíduos dentro de uma ou ambas as regiões variáveis (ou seja, VH e/ou VL), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões estruturais.

[0244] Adequadamente, o PDL1-BD da invenção é selecionado a partir do grupo que consiste em: Fab, um Fv, um scFv, dsFv, um scAb, STAB e domínios de ligação com base em scaffolds alternativos, incluindo mas limitado a domínios à base de anquirina, avímeros, anticalinas, fibronectinas e locais de ligação sendo construídos em regiões constantes de anticorpos (por exemplo, tecnologia f-star (Tecnologia de Anticorpo Modular F-starTM)).

[0245] Adequadamente, o PDL1-BD da invenção é um fragmento de anticorpo scFv. Em concretizações particulares, o referido PDL1- BD é um scFv compreendendo o ligante de acordo com a SEQ ID NO:

206.

[0246] Em uma concretização adicional, o PDL1-BD da invenção é um fragmento variável de cadeia única (scFv) como mostrado em SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147 e SEQ ID NO: 148. Em uma concretização, o PDL1-BD da invenção é um scFv como mostrado na SEQ ID NO: 116 ou SEQ ID NO: 117 ou SEQ ID NO: 118, preferencialmente SEQ ID NO: 116 ou 118, mais preferencialmente SEQ ID NO: 118. Em uma concretização, o PDL1-BD da invenção é um scFv como mostrado na SEQ ID NO: 146 ou SEQ ID NO: 147 ou SEQ ID NO: 148, preferencialmente SEQ ID NO: 147 ou 148, mais preferencialmente SEQ ID NO: 148.

[0247] Outros PDL1-BDs adequados compreendem ou são derivados de um anticorpo selecionado do grupo que consiste em: (i) avelumab (MSB0010718C; anticorpo monoclonal IgG1 humano anti- PDL1; Merck-Serono; descrito em WO 2013/079174, que é aqui incorporado no presente pedido por referência na sua totalidade); (ii) atezolizumab (MPDL3280A, RG7446; anticorpo monoclonal IgG humano anti-PDL1; Hoffmann-La Roche); (iii) MDX- 1105 (BMS-936559; anticorpo monoclonal IgG4 anti-PDL1 humano; Bristol-Myers Squibb; descrito em WO 2007/005874, que é aqui incorporado no presente pedido por referência na sua totalidade); (iv) durvalumab (MEDI4736; anticorpo monoclonal IgG1 humanizado anti-PDL1; AstraZeneca; descrito em WO 2011/066389 e US 2013/034559, que são aqui incorporados no presente pedido por referência na sua totalidade); (v) KN035 (anticorpo monoclonal anti-PDL1; Medicamentos 3D); (vi) LY3300054 (anticorpo monoclonal anti-PDL1; Eli Lilly); e (vii) YW243.55.S70 (descrito em WO 2010/077634 e Patente US 8.217.149, a totalidade de cada uma das quais é aqui incorporada por referência).

[0248] Os inventores adicionalmente verificaram, surpreendentemente, que a uma determinada razão entre afinidades ou avidezes do(s) CD137-BD(s) e PDL1-BD(s), a janela de concentração de máxima atividade é estendida, a qual está prevista para ser benéfica para aplicações terapêuticas e permite maior flexibilidade na dosagem do anticorpo multiespecífico da invenção ou de composições farmacêuticas que os compreendem. Assim, em uma concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende pelo menos um CD137-BD e pelo menos um PDL1-BD, a afinidade do referido CD137-

BD em relação à afinidade do referido PDL1-BD é pelo menos 5,0, de preferência pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, mais preferencialmente pelo menos 500 vezes, por exemplo, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos pelo menos 900, pelo menos, 1000 vezes mais fraca, em particular quando medida por SPR.

Em outras palavras, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende, pelo menos, um CD137-BD e pelo menos um PDL1-BD, em que o referido CD137-BD liga-se à CD137 humana com uma constante de dissociação (KD) de, pelo menos, 5,0, de um modo preferido em pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, mais preferencialmente pelo menos 500 vezes, por exemplo, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos, 1000 vezes mais elevada em relação a uma constante de dissociação (KD) de ligação à PDL1 humana do referido PDL1-BD, em particular quando medida por SPR.

Assim, adequadamente, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende pelo menos um CD137-BD e pelo menos um PDL1- BD, em que o referido CD137-BD se liga à CD137 humana com uma constante de dissociação (KD) de 5 a 1000 vezes, por exemplo de 10 a 1000 vezes, preferivelmente 50 a 1000 vezes, mais preferivelmente de 100 a 1000 vezes, por exemplo, 200 a 1000 vezes, 300 a 1000 vezes, 400 a 1000 vezes, 500 a 1000 vezes, 600 a 1000 vezes, 700 a 1000 vezes, 800 a 1000 vezes, 900 a 1000 vezes mais elevada em relação a uma constante de dissociação (KD) de ligação à PDL1 humana do referido PDL1-BD, em particular quando medida por SPR.

Em uma concretização adicional, o referido CD137-BD se liga à CD137 humana com uma constante de dissociação

(KD) entre 10 nM e 10 pM, preferencialmente entre 10 nM e 0,1 nM, por exemplo, entre 5 nM e 0,1 nM, mais preferencialmente entre 5 nM e 1 nM, em particular em que o referido PDL1-BD se liga à PDL1 humana com uma constante de dissociação (KD) entre 1 nM e 1 pM, preferencialmente entre 0,5 nM e 1 pM, mais preferencialmente entre 100 pM e 1 pM, em particular quando medida por SPR. Em outra concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende pelo menos um CD137-BD e pelo menos um PDL1-BD, em que o referido CD137-BD tem a avidez de pelo menos 5,0, de preferência pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, mais preferencialmente pelo menos 500 vezes, por exemplo, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos, 1000 vezes mais fraca (inferior) em relação à avidez do referido PDL1-BD.

[0249] Em uma concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende pelo menos um CD137-BD e pelo menos um PDL1-BD, em que a afinidade do referido PDL1-BD em relação à afinidade do referido CD137-BD é de pelo menos 5,0, de preferência pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, mais preferencialmente pelo menos 500 vezes, por exemplo, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos, 1000 vezes mais forte, em particular quando medida por SPR. Em uma concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende pelo menos um CD137-BD e pelo menos um PDL1-BD, em que o referido PDL1-BD se liga à PDL1 humana com uma constante de dissociação (KD) de pelo menos 5,0, preferencialmente pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos

50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, mais preferencialmente pelo menos 500 vezes, por exemplo, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos, 1000 vezes menor em relação a uma constante de dissociação (KD) de ligação à CD137 humana do referido CD137-BD, em particular quando medida por SPR. Em outra concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende pelo menos um CD137-BD e pelo menos um PDL1-BD, em que o referido PDL1-BD tem a avidez de pelo menos 5,0, de preferência pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, mais preferencialmente pelo menos 500 vezes, por exemplo, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos, 1000 vezes mais forte (superior) em relação à avidez do referido CD137- BD, em particular quando medida por SPR.

[0250] Numa concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (i) pelo menos um CD137-BD, em que o referido CD137-BD compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 por cento, pelo menos, 90 por cento, ou, pelo menos, 95 percentagem idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31 ou 34, preferencialmente SEQ ID NO: 34; e (ii) pelo menos um PDL1-BD, em que o referido PDL1-BD compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 por cento, pelo menos, 90 por cento, ou, pelo menos, 95 por cento idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da lista que consiste na SEQ ID NO: 116, 117, 118, 146, 147 e 148, preferencialmente SEQ ID NO: 116 ou 118, mais preferencialmente SEQ ID NO: 118. Numa outra concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (i) pelo menos um CD137-BD, em que o referido CD137-BD compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 ou 34, de preferência a SEQ ID NO: 34; e (ii) pelo menos um PDL1-BD, em que o referido PDL1-BD compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da lista que consiste em SEQ ID NO: 116, 117, 118, 146, 147, e 148, de preferência a SEQ ID NO: 116 ou 118, mais preferencialmente SEQ ID NO: 118. Em uma concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (i) pelo menos um CD137-BD, em que o referido CD137-BD é um scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 por cento, pelo menos 90 por cento ou em pelo menos 95 por cento idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31 ou 34, preferencialmente SEQ ID NO: 34; e (ii) pelo menos um PDL1-BD, em que o referido PDL1-BD é um scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da lista que consiste em SEQ ID NO: 116, 117, 118, 146, 147 e 148, preferencialmente SEQ ID NO: 116 ou 118, mais preferencialmente SEQ ID NO: 118. Em uma concretização adicional, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (i) pelo menos um CD137-BD, em que o referido CD137-BD é um scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 ou 34, preferencialmente SEQ ID NO: 34; e (ii) pelo menos um PDL1-BD, em que o referido PDL1-BD é um scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada da lista que consiste na SEQ ID NO: 116, 117, 118, 146, 147, 148 e 148, preferencialmente SEQ ID NO: 116 ou 118, mais preferencialmente SEQ ID NO: 118.

[0251] Numa concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (i) pelo menos um CD137-BD, em que o referido CD137-BD compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 por cento, pelo menos, 90 por cento, ou, pelo menos, 95 por cento idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32; e (ii) pelo menos um PDL1-BD, em que o referido PDL1-BD compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 por cento, pelo menos, 90 por cento, ou, pelo menos, 95 por cento idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da lista que consiste em SEQ ID NO: 116, 117, 118, 146, 147 e 148, preferencialmente SEQ ID NO: 118. Numa outra concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (i) pelo menos um CD137-BD, em que o referido CD137- BD compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; e (ii) pelo menos um PDL1-BD, em que o referido PDL1-BD compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da lista que consiste em SEQ ID NO: 116, 117, 118, 146, 147, e 148, de preferência a SEQ ID NO: 118. Em uma concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (i) pelo menos um CD137-BD, em que o referido CD137-BD é um Fv compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 por cento, pelo menos 90 por cento ou em pelo menos 95 por cento idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32; e (ii) pelo menos um PDL1-BD, em que o referido PDL1-BD é um Fv compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do lista que consiste em SEQ ID NO: 116, 117, 118, 146, 147 e 148, preferencialmente SEQ ID NO: 118. Numa outra concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (i) pelo menos um CD137-BD, em que o referido CD137-BD é um Fv compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; e (ii) pelo menos um PDL1-BD, em que o referido PDL1-BD é um Fv compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada da lista que consiste na SEQ ID NO: 116, 117, 118, 146, 147 e 148, preferencialmente SEQ ID NO: 118.

[0252] Numa concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (i) pelo menos um CD137-BD, em que o referido CD137-BD compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 por cento, pelo menos, 90 por cento, ou, pelo menos, 95 por cento idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33; e (ii) pelo menos um PDL1-BD, em que o referido PDL1-BD compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 por cento, pelo menos, 90 por cento, ou, pelo menos, 95 por cento idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da lista que consiste na SEQ ID NO: 116, 117, 118, 146, 147 e 148, preferencialmente SEQ ID NO: 118. Numa outra concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (i) pelo menos um CD137-BD, em que o referido CD137- BD compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; e (ii) pelo menos um PDL1-BD, em que o referido PDL1-BD compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da lista que consiste em SEQ ID NO: 116, 117, 118, 146, 147, e 148, de preferência a SEQ ID NO: 118. Em uma concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (i) pelo menos um CD137-BD, em que o referido CD137-BD é um Fv compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 por cento, pelo menos 90 por cento ou em pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33; e (ii) pelo menos um PDL1-BD, em que o referido PDL1-BD é um Fv compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos

95% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do lista que consiste em SEQ ID NO: 116, 117, 118, 146, 147 e 148, preferencialmente SEQ ID NO: 118. Numa outra concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (i) pelo menos um CD137-BD, em que o referido CD137-BD é um Fv compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; e (ii) pelo menos um PDL1-BD, em que o referido PDL1-BD é um Fv compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada da lista que consiste na SEQ ID NO: 116, 117, 118, 146, 147 e 148, preferencialmente SEQ ID NO: 118.

[0253] Em uma concretização preferida, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (i) pelo menos um CD137-BD, em que o referido CD137-BD compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 por cento, pelo menos, 90 por cento, ou pelo menos 95 por cento idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 86 ou SEQ ID NO: 87 ou SEQ ID NO: 88, preferencialmente SEQ ID NO: 86, mais preferencialmente SEQ ID NO: 88; e (ii) pelo menos um PDL1-BD, em que o referido PDL1-BD compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 por cento, pelo menos, 90 por cento, ou, pelo menos, 95 por cento idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da lista que consiste na SEQ ID NO: 116, 117, 118, 146, 147 e 148, preferencialmente SEQ ID NO: 118. Numa outra concretização, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (i) pelo menos um CD137-BD, em que o referido CD137-BD compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86 ou SEQ ID NO: 87 ou SEQ ID NO: 88, preferencialmente SEQ ID NO: 86, mais preferencialmente SEQ ID NO: 88; e (ii) pelo menos um PDL1-BD, em que o referido PDL1-BD compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da lista que consiste em SEQ ID NO: 116, 117, 118, 146, 147, e 148, de preferência a SEQ ID NO: 118.

[0254] Numa concretização preferida, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (i) pelo menos um CD137-BD, em que o referido CD137-BD compreende sequências HCDR1, HCDR2, e HCDR3 de SEQ ID NOs: 1, 2, e 3, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 18, 1 9 e 20, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 17, de preferência uma sequência VH da SEQ ID NO: 17 e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 30, preferencialmente uma sequência VL da SEQ ID NO: 30; e (ii) pelo menos um PDL1-BD, em que o referido PDL1-BD compreende: (a) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 89, 90 e 91, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 105, 106 e 107, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 102, preferencialmente uma sequência VH da SEQ ID NO: 102, e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 114, preferencialmente uma sequência VL de SEQ ID NO: 114; ou (b) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 89, 90 e 91, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ

ID NOs: 105, 106 e 107, respectivamente, uma sequência VH em pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 104, preferencialmente uma sequência VH da SEQ ID NO: 104, e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 115, preferencialmente uma sequência VL de SEQ ID NO: 115; ou (c) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 119, 120 e 121, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 135, 136 e 137, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 133, preferencialmente uma sequência VH da SEQ ID NO: 133, e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 145, preferencialmente uma sequência VL de SEQ ID NO: 145; ou (d) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 119, 120 e 121, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 135, 136 e 137, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 134, preferencialmente uma sequência VH da SEQ ID NO: 134, e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 144, preferencialmente uma sequência VL de SEQ ID NO: 144.

[0255] Numa concretização mais preferida, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende:

(i) pelo menos um CD137-BD, em que o referido CD137-BD compreende sequências HCDR1, HCDR2, e HCDR3 de SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2, e LCDR3 de SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 71, de preferência uma sequência VH da SEQ ID NO: 71 e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 83, preferencialmente uma sequência VL da SEQ ID NO: 83; e

(ii) pelo menos um PDL1-BD, em que o referido PDL1-BD compreende:

(a) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 89, 90 e 91, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 105, 106 e 107, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 102, preferencialmente uma sequência VH da SEQ ID NO: 102, e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 114, preferencialmente uma sequência VL de SEQ ID NO: 114; ou

(b) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 89, 90 e 91, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 105, 106 e 107, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 104, preferencialmente uma sequência VH da SEQ ID NO: 104, e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,

97, 98 ou 99 por cento idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 115, preferencialmente uma sequência VL de SEQ ID NO: 115; ou (c) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 119, 120 e 121, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 135, 136 e 137, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 133, preferencialmente uma sequência VH da SEQ ID NO: 133, e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 145, preferencialmente uma sequência VL de SEQ ID NO: 145; ou (d) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 119, 120 e 121, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 135, 136 e 137, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 134, preferencialmente uma sequência VH da SEQ ID NO: 134, e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 144, preferencialmente uma sequência VL de SEQ ID NO: 144.

[0256] Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da invenção possui duas especificidades diferentes (PDL1 e CD137). Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da invenção é um anticorpo biespecífico. O anticorpo multiespecífico da presente invenção pode compreender uma especificidade adicional (triespecífica) ou especificidades (anticorpo tetra-específico, penta-específico ou hexa-específico). Numa concretização, o anticorpo multiespecífico é triespecífico.

[0257] Numa concretização, o anticorpo multiespecífico da invenção compreende um polipeptídeo da região Fc de imunoglobulina.

O termo "região Fc" aqui é usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes.

As regiões Fc de sequência nativa adequadas incluem lgG1, lgG2 (lgG2A, JgG2B), lgG3 e lgG4. "Receptor Fc" ou "FcR" descreve um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo.

O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa.

Além disso, um FcR preferido é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcγRI, FcyRII e FcγRIII, incluindo variantes alélicas e formas alternativamente emendadas desses receptores, os receptores FcγRII incluem FcγRIIA (um "receptor ativador") e FcγRI IB (um "receptor inibidor"), que possuem sequências de aminoácidos semelhantes que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos.

O receptor de ativação FcγRIIA contém um motivo de ativação à base de tirosina imunorreceptora (ITAM) em seu domínio citoplasmático.

O receptor inibidor FcγRIIB contém um motivo de inibição à base de tirosina imunorreceptora (ITIM) no seu domínio citoplasmático (ver M.

Daeron, Annu.

Rev.

Immunol. 5: 203-234 (1997).) Os FcRs são revisados em Ravetch e Kinet, Annu.

Rev.

Immunol. 9: 457-92 (1991); Capet et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); e de Haas et al., J.

Lab.

Clin.

Med. 126: 330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são abrangidos pelo termo "FcR". O termo "receptor Fc" ou "FcR" também inclui o receptor neonatal FcRn, responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto.

Guyer et al., J.

Immunol. 117: 587 (1976) e Kim et al., J.

Immunol. 24: 249

(1994). São conhecidos métodos de medir a ligação ao FcRn (ver, por exemplo, Ghetie e Ward, Immunol. Today 18: (12): 592-8 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology 15 (7): 637-40 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. TJI (8): 6213-6 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.). A ligação ao FcRn in vivo e a meia vida sérica dos polipeptídeos de ligação de alta afinidade ao FcRn humano podem ser analisadas, por exemplo, em camundongos transgênicos ou linhas celulares humanas transfectadas que expressam o FcRn humano, ou em primatas aos quais os polipeptídeos que possuem uma região Fc variante são administrados. O documento WO 2004/42072 (Presta) descreve variantes de anticorpos que melhoraram ou diminuíram a ligação a FcRs. Veja também, por exemplo, Shields et al. J. Biol. Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001).

[0258] Em outra concretização, o anticorpo da invenção não compreende um polipeptídeo da região Fc de imunoglobulina.

[0259] A fim de aumentar o número de especificidades/funcionalidades com o mesmo ou peso molecular menor, é vantajoso usar anticorpos compreendendo fragmentos de anticorpo, tais como fragmentos Fv, Fab, Fab' e F(ab')2 e outros fragmentos de anticorpo. Estas moléculas menores retêm a atividade de ligação ao antígeno de todo o anticorpo e também podem exibir uma melhor penetração no tecido e propriedades farmacocinéticas em comparação com as moléculas inteiras de imunoglobulina. Embora esses fragmentos pareçam exibir uma série de vantagens sobre as imunoglobulinas inteiras, eles também sofrem com uma taxa aumentada de depuração do soro, uma vez que não possuem o domínio Fc que fornece uma meia-vida longa in vivo (Medasan et al., 1997, J. Immunol. 158: 2211-2217). Moléculas com pesos moleculares mais baixos penetram de maneira mais eficiente nos tecidos-alvo (por exemplo, cânceres sólidos) e, portanto, prometem melhorar a eficácia na mesma dose ou em dose mais baixa.

[0260] Os inventores descobriram surpreendentemente que a adição do domínio de ligação de albumina de soro humano (HSA- BD) ao anticorpo multiespecífico da invenção que compreende (a) pelo menos um CD137-BD, e (b) pelo menos um PDL1-BD possui os seguintes efeitos benéficos: (i) uma meia-vida sérica do anticorpo multiespecífico da invenção compreendendo pelo menos um domínio de albumina sérica humana é comparável à de uma IgG; (ii) a adição de um domínio de ligação de albumina do soro humano ao anticorpo multiespecífico da invenção é compatível com as funcionalidades de outros domínios de ligação, por exemplo, o PDL1-BD retém a sua atividade de bloqueio e CD137-BD retém sua capacidade para ativar a sinalização de CD137 após o agrupamento; (iii) embora o domínio de ligação à albumina sérica humana aumente a EC50 do anticorpo multiespecífico da invenção para ativar a CD137, ele inesperadamente melhora o tamanho máximo do efeito, por exemplo, a ativação máxima da sinalização de CD137 é significativamente maior.

[0261] Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da presente invenção pode compreender um domínio de ligação adicional tendo uma especificidade para a albumina sérica humana. Em uma concretização, o anticorpo multiespecífico é constituído por: (i) pelo menos um CD137-BD; (ii) pelo menos um PDL1-BD; e (iii) pelo menos um HSA-BD. Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da presente invenção compreende: (i) um CD137-BD; (ii) pelo menos um PDL1-BD, preferencialmente um PDL1-BD ou dois PDL1-BDs, mais preferencialmente um PDL1-BD; e (iii) pelo menos um HSA-BD, preferencialmente um HSA-BD.

[0262] O termo "HSA" refere-se em particular à albumina sérica humana com o número de identificação UniProt P02768. A albumina sérica humana (HSA) é uma proteína abundante de 66,4 kDa no soro humano (50% da proteína total) composta de 585 aminoácidos (Sugio, Protein Eng, Vol. 12, 1999, 439-446). A proteína HSA multifuncional está associada à sua estrutura que permitiu ligar e transportar vários metabolizadores, como ácidos graxos, íons metálicos, bilirrubina e alguns medicamentos (Fanali, Molecular Aspects of Medicine, Vol. 33, 2012, 209-290). A concentração de HSA no soro é de cerca de 3,5-5 g/dL. Os anticorpos de ligação à albumina e seus fragmentos podem ser utilizados, por exemplo, para prolongar a meia-vida no soro in vivo de drogas ou proteínas conjugadas aos mesmos.

[0263] Em algumas concretizações, o HSA-BD é derivado de um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo.

[0264] HSA-BDs adequados para uso no anticorpo multiespecífico da invenção são domínios de ligação previstos no presente relatório descritivo. Os HSA-BDs da invenção incluem, mas não estão limitados a, anticorpos monoclonais humanizados cujas sequências estão listadas na Tabela 3.

[0265] Os HSA-BDs da invenção se ligam especificamente à albumina sérica humana. Os HSA-BDs da invenção compreendem uma CDR de VH com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VH listadas na Tabela 3. Em particular, a invenção fornece HSA-BDs compreendendo uma, duas, três ou mais CDRs de VH tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VH listadas na Tabela 3.

[0266] A invenção também fornece HSA-BDs compreendendo uma CDR de VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VL listadas na Tabela 3. Em particular, a invenção fornece HSA-BDs compreendendo uma, duas, três ou mais CDRs de VL com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VL listadas na Tabela 3.

[0267] Outros HSA-BDs da invenção incluem aminoácidos que foram mutados, mas têm pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade nas regiões CDR com as regiões CDR representadas nas sequências descritas na Tabela 3. Outros HSA-BDs da invenção incluem sequências de aminoácidos mutantes em que não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos foram mutados nas regiões CDR quando comparados com as regiões CDR representadas na sequência descrita na Tabela 3.

[0268] O HSA-BD da presente invenção compreende: (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo, de preferência consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 149, 152, 155, 158, 173, 176, 179 e 182, preferencialmente SEQ ID NO: 149 ou 173, mais preferencialmente SEQ ID NO: 149; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo, preferencialmente consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 150, 153, 156, 159, 174, 177, 180 e 183, preferencialmente SEQ ID NO: 150 ou 174, mais preferencialmente SEQ ID NO: 150; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo, de preferência consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 151, 154, 157, 160, 175, 178, 181 e 184, preferencialmente SEQ ID NO: 151 ou 175, mais preferencialmente SEQ ID NO: 151; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo, preferencialmente consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 162, 165, 168, 186, 189 e 192, preferencialmente SEQ ID NO: 162 ou 186, mais preferencialmente SEQ ID NO: 162; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo, de preferência consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 163, 166, 169, 187, 190 e 193, de preferência SEQ ID NO: 163 ou 187, mais preferencialmente SEQ ID NO: 163; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo, de preferência consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 164, 167, 170, 188, 191 e 194, preferencialmente SEQ ID NO: 164 ou 188, mais preferencialmente SEQ ID NO: 164. Adequadamente, o HSA-BD da presente invenção compreende: (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo, de preferência consistindo em, uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 149, 152, 155, 158, 173, 176, 179 e 182, preferencialmente SEQ ID NO: 149 ou 173, mais preferencialmente SEQ ID NO: 149; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo, preferencialmente consistindo em, uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade a qualquer uma das SEQ ID NOs: 150, 153, 156, 159, 174, 177, 180 e 183, preferencialmente

SEQ ID NO: 150 ou 174, mais preferencialmente SEQ ID NO: 150; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo, de preferência consistindo em, uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade a qualquer uma das SEQ ID NOs: 151, 154, 157, 160, 175, 178, 181 e 184, preferencialmente SEQ ID NO: 151 ou 175, mais preferencialmente SEQ ID NO: 151; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo, preferencialmente consistindo em, uma sequência de aminoácidos selecionada com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade para qualquer uma das SEQ ID NOs: 162, 165, 168, 186, 189 e 192, preferencialmente SEQ ID NO: 162 ou 186, mais preferencialmente SEQ ID NO: 162; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo, de preferência consistindo em, uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade a qualquer uma das SEQ ID N o s: 163, 166, 169, 187, 190, e 193, de preferência a SEQ ID NO: 163 ou 187, mais de preferência a SEQ ID NO: 163; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo, de preferência consistindo em, uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade para qualquer uma das SEQ ID NOs: 164, 167, 170, 188, 191 e 194, preferencialmente SEQ ID NO: 164 ou 188, mais preferencialmente SEQ ID NO: 164.

[0269] Em uma concretização, o HSA-BD da invenção compreende: (a) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 149, 150 e 151, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 162, 163 e 164, respectivamente; (b) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 152, 153 e 154, respectivamente,

e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 165, 166 e 167, respectivamente; ou (c) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 173, 174 e 175, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 186, 187 e 188, respectivamente; ou (d) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 176, 177 e 178, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 189, 190 e 191, respectivamente.

Numa concretização preferida, o HSA-BD da invenção compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 149, 150 e 151, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 162, 163 e 164, respectivamente.

Adequadamente, o HSA-BD da invenção compreende: (a) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade às SEQ ID NOs: 149, 150 e 151, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou Identidade de 99% às SEQ ID NOs: 162, 163 e 164, respectivamente; ou (b) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 152, 153, e 154, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 165, 166 e 167, respectivamente; ou (c) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 173, 174, e 175, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 186, 187 e 188, respectivamente; ou (c) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,

98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 176, 177, e 178, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 189, 190 e 191, respectivamente. Numa concretização preferida, o HSA-BD da invenção compreende: (a) sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade às SEQ ID NOs: 149, 150 e 151, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade às SEQ ID NOs: 162, 163 e 164, respectivamente.

[0270] Numa outra concretização, a invenção fornece um HSA- BD que se liga especificamente à albumina sérica humana, em que o referido domínio de ligação compreende um domínio VH e um domínio VL.

[0271] Adequadamente, o HSA-BD da invenção compreende um VH3 ou VH4. Numa concretização, o HSA-BD da invenção compreende sequências estruturais de domínio VH3. Um exemplo específico de um VH pertencente à família VH3 é representado na SEQ ID NO:

161. Em particular, as regiões de estrutura FR1 a FR4, extraídas da SEQ ID NO: 161, pertencem à família VH3 (Tabela 3, regiões marcadas em negrito). Adequadamente, um VH pertencente à família VH3, como aqui utilizado, é um VH compreendendo FR1 a FR4 tendo pelo menos 85%, preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade de sequência a FR1 a FR4 da SEQ ID NO: 161. Exemplos alternativos de sequências de VH3 e exemplos de sequências de VH4 podem ser encontrados em Knappik et al., J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86. Adequadamente, o HSA-BD da invenção compreende: estruturas Vκ FR1, FR2 e FR3,

particularmente estruturas Vκ1 ou Vκ3, preferencialmente estruturas Vκ1 FR1 a 3 e uma estrutura FR4, que é selecionada a partir de uma Vκ FR4, particularmente Vκ1 FR4, Vκ3 FR4 e um Vλ FR4. As estruturas Vκ1 adequadas FR1 a 3 são apresentadas na SEQ ID NO: 171 (Tabela 3, as regiões FR estão marcadas em negrito). Exemplos alternativos de sequências Vκ1, e exemplos de sequências Vκ2, Vκ3 ou Vκ4, podem ser encontrados em Knappik et al., J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86. As estruturas Vκ1 adequadas FR1 a 3 compreendem as sequências de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90% de identidade com as sequências de aminoácidos correspondentes a FR1 a 3 e extraídas da SEQ ID NO: 171 (Tabela 3, as regiões FR estão marcadas sem negrito). Vλ FR4 adequado é como estabelecido na SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205. Numa concretização, o HSA-BD da presente invenção compreende Vλ FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90 por cento de identidade a uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, de preferência a SEQ ID NO: 199.

[0272] Assim, em uma concretização, o HSA-BD da presente invenção compreende: (i) as sequências HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de: (a) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 152, 153 e 154, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 165, 166 e 167, respectivamente; ou (b) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 176, 177 e 178, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 189, 190 e 191, respectivamente;

(ii) sequências estruturais de domínio VH3 ou VH4 FR1 a FR4; de um modo preferido, as sequências estruturais de domínio VH3 FR1 a FR4; e (iii) um domínio VL compreendendo uma estrutura VL compreendendo estruturas Vκ FR1, FR2 e FR3, particularmente Vκ1 ou Vκ3 FR1 a FR3, preferencialmente Vκ1 FR1 a FR3, e uma estrutura FR4, que é selecionada a partir de uma Vκ FR4, particularmente Vκ1 FR4, Vκ3 FR4 e um Vλ FR4, preferencialmente Vλ FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90% de identidade a uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, de preferência Vλ FR4 é como estabelecido em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, mais preferencialmente Vλ FR4 é como estabelecido na SEQ ID NO:

199.

[0273] Assim, em uma concretização preferida, o HSA-BD da presente invenção compreende: (i) as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 149, 150 e 151, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 162, 163 e 164, respectivamente; (ii) sequências estruturais de domínio VH3 ou VH4 FR1 a FR4; de preferência as sequências estruturais de domínio VH3 FR1 a FR4; e (iii) um domínio VL compreendendo uma estrutura VL compreendendo estruturas Vκ FR1, FR2 e FR3, particularmente Vκ1 ou Vκ3 FR1 a FR3, preferencialmente Vκ1 FR1 a FR3, e uma estrutura FR4, que é selecionada a partir de um Vκ FR4, particularmente Vκ1 FR4, Vκ3 FR4 e um Vλ FR4, preferencialmente Vλ FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90% de identidade a uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, de preferência Vλ FR4 é como estabelecido em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, mais preferencialmente Vλ FR4 é como estabelecido na SEQ ID NO:

199.

[0274] Em uma concretização, o HSA-BD da presente invenção compreende uma VL compreendendo: (iv) domínios CDR CDR1, CDR2 e CDR3; (v) regiões estruturais de Vκ humanas FR1 a FR3, particularmente regiões estruturais de Vκ1 humanas FR1 a FR3; (vi) FR4, que é selecionado a partir de (a) uma sequência de linha germinativa de Vλ humana para FR4, particularmente uma sequência de linha germinativa de Vλ selecionada da lista de: SEQ ID NO: 199 a 205, preferencialmente SEQ ID NO: 199; e (b) uma sequência baseada em Vλ, que possui uma ou duas mutações, particularmente uma mutação, em comparação com a sequência de linha germinativa de Vλ humana mais próxima para FR4 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, preferencialmente SEQ ID NO: 199.

[0275] O HSA-BD da invenção compreende um domínio VH listado na Tabela 3. Adequadamente, o HSA-BD da invenção compreende uma sequência de aminoácidos VH listada na Tabela 3, em que não mais do que cerca de 10 aminoácidos em uma sequência estrutural (por exemplo, uma sequência que não é uma CDR) foi mutada (em que uma mutação é, como vários exemplos não limitativos, uma adição,

substituição ou exclusão). Adequadamente, o HSA-BD da presente invenção compreende uma sequência de aminoácidos VH listada na Tabela 3, em que não mais do que cerca de 20 aminoácidos em uma sequência estrutural (por exemplo, uma sequência que não é uma CDR) foram mutados (em que uma mutação é, como vários exemplos não limitativos, uma adição, substituição ou exclusão). Outros HSA-BDs da invenção incluem aminoácidos que foram mutados, mas possuem pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade nas regiões VH com as regiões VH representadas nas sequências descritas na Tabela 3.

[0276] O HSA-BD da invenção compreende um domínio VL listado na Tabela 3. Adequadamente, o HSA-BD da invenção compreende uma sequência de aminoácidos VL listada na Tabela 3, em que não mais do que cerca de 10 aminoácidos em uma sequência estrutural (por exemplo, uma sequência que não é uma CDR) foi mutada (em que uma mutação é, como vários exemplos não limitativos, uma adição, substituição ou exclusão). Adequadamente, o HSA-BD da invenção compreende uma sequência de aminoácidos VL listada na Tabela 3, em que não mais do que cerca de 20 aminoácidos em uma sequência estrutural (por exemplo, uma sequência que não é uma CDR) foram mutados (em que uma mutação é, como vários exemplos não limitativos, uma adição, substituição ou exclusão). Outros HSA- BDs da invenção incluem aminoácidos que foram mutados, mas possuem pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade nas regiões VL com as regiões VL representadas nas sequências descritas na Tabela 3.

[0277] Adequadamente, o HSA-BD da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95,

96, 97, 98 ou 99 por cento, preferencialmente pelo menos 90 por cento, idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 161 e 185, preferencialmente SEQ ID NO: 161; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento, preferencialmente pelo menos 90 por cento, idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 171 e 195, preferencialmente SEQ ID NO: 171.

[0278] Numa concretização, o HSA-BD da invenção compreende: uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 161 e 185, preferencialmente SEQ ID NO: 161; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 171 e 195, preferencialmente SEQ ID NO: 161.

[0279] Numa outra concretização, o HSA-BD da invenção compreende: (a) uma sequência VH da SEQ ID NO: 161 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 171; ou (b) uma sequência VH da SEQ ID NO: 185 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 195. Numa concretização preferida, o HSA-BD da invenção compreende uma sequência VH da SEQ ID NO: 161 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 171

[0280] Em uma concretização, o HSA-BD da invenção compreende: (a) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 152, 153 e 154, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 165, 166 e 167, respectivamente, uma sequência VH tendo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%

de identidade com a SEQ ID NO: 161 e uma sequência VL com pelo menos 60, 70, 80, 90 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 171; ou (b) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 176, 177 e 178, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 189, 190 e 191, respectivamente, uma sequência VH tendo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 185 e uma sequência VL com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 195.

[0281] Em uma concretização, o HSA-BD da invenção compreende: (a) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 149, 150 e 151, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 162, 163 e 164, respectivamente, uma sequência VH tendo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 161 e uma sequência VL com pelo menos 60, 70, 80, 90 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 171; ou (b) sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 173, 174 e 175, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 186, 187 e 188, respectivamente, uma sequência VH tendo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 185 e uma sequência VL com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 195.

[0282] Adequadamente, o HSA-BD da invenção é selecionado a partir do grupo que consiste em: um Fab, um Fv, um scFv, dsFv, um scAb, STAB e domínios de ligação com base em scaffolds alternativos, incluindo, mas limitado a, domínios à base de anquirina, fynômeros, avímeros, anticalinas, fibronectinas e locais de ligação sendo construídos em regiões constantes de anticorpos (por exemplo, tecnologia f-star (Tecnologia de Anticorpo Modular F-star TM)).

[0283] Adequadamente, o HSA-BD da invenção é um fragmento de anticorpo scFv. Numa concretização, o HSA-BD da presente invenção é como estabelecido na SEQ ID NO: 172 ou SEQ ID NO: 196, preferencialmente SEQ ID NO: 172.

[0284] Outro HSA-BD adequado para uso no anticorpo multiespecífico da invenção compreende ou é derivado de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) polipeptídeos que se ligam a albumina do soro (ver, por exemplo, Smith et al., 2001, Bioconjugate Chem. 12: 750-756; EP0486525; US6267964; WO 20 04/001064; WO 20 02/076489; e WO 20 01/45746); (ii) domínios variáveis de ligação individuais anti-albumina sérica descritos em Holt et al., Protein Engineering, Design, Selection, vol 21, 5, pp283-288, WO 20 04/003019, WO 2008/096158, WO 20 05/118,642, WO 2006/0591056 e WO 2011/006915; (iii) anticorpos anti-albumina sérica descritos nos documentos WO 2009/040562, WO 2010/035012 e WO 2011/086091.

[0285] O anticorpo multiespecífico da invenção pode estar em qualquer formato adequado.

[0286] Adequadamente, os domínios de ligação do anticorpo multiespecífico estão operacionalmente ligados. Os domínios de ligação do anticorpo multiespecífico da invenção são capazes de se ligar aos seus respectivos antígenos ou receptores simultaneamente.

[0287] Numa concretização, o anticorpo multiespecífico da invenção compreende pelo menos um CD137-BD, pelo menos um PDL1- BD, em que: (i) o referido CD137-BD e o referido PDL1-BD estão operacionalmente ligados um ao outro. Em uma concretização, o anticorpo multiespecífico da invenção compreende pelo menos um CD137-BD, pelo menos um PDL1-BD, pelo menos um HSA-BD, em que: (i) o referido CD137-BD e o referido PDL1-BD estão operacionalmente ligados ao referido HSA-BD; ou (ii) o referido CD137-BD e o referido HSA-BD estão ambos operacionalmente ligados ao referido PDL1-BD; ou (iii) o referido PDL1-BD e o referido HSA-BD estão ambos operacionalmente ligados ao referido CD137-BD. Numa concretização preferida, o anticorpo multiespecífico da invenção compreende pelo menos um CD137-BD, pelo menos um PDL1-BD, pelo menos um HSA-BD, em que o referido CD137-BD e o referido HSA-BD estão ambos operacionalmente ligados ao referido PDL1-BD.

[0288] O termo "operacionalmente ligado", como usado aqui, indica que duas moléculas (por exemplo, polipeptídeos, domínios, domínios de ligação) estão ligadas, de modo que cada uma retenha atividade funcional. Duas moléculas podem ser "operacionalmente ligadas", independentemente de estarem conectadas direta ou indiretamente (por exemplo, através de um ligante, através de uma porção, através de um ligante a uma porção). O termo "ligante" refere-se a um peptídeo ou outra porção que está opcionalmente localizada entre domínios de ligação ou fragmentos de anticorpo da invenção. Várias estratégias podem ser usadas para ligar covalentemente moléculas. Estas incluem, entre outras, ligações polipeptídicas entre os terminais N e C de proteínas ou domínios proteicos, ligação via ligações dissulfeto e ligação através de reagentes químicos de reticulação. Num aspecto desta concretização, o ligante é uma ligação peptídica, gerada por técnicas recombinantes ou síntese peptídica. A escolha de um ligante adequado para um caso específico em que duas cadeias polipeptídicas devem ser conectadas depende de vários parâmetros, incluindo, entre outros, a natureza das duas cadeias polipeptídicas (por exemplo, se elas oligomerizam naturalmente), a distância entre os Terminais N e C a serem conectados, se conhecida, e/ou a estabilidade do ligante em relação à proteólise e oxidação. Além disso, o ligante pode conter resíduos de aminoácidos que fornecem flexibilidade.

[0289] No contexto da presente invenção, o termo "ligante polipeptídico" refere-se a um ligante que consiste em uma cadeia de resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas que está conectando dois domínios, cada um sendo anexado a uma extremidade do ligante. O ligante polipeptídico deve ter um comprimento que seja adequado para ligar duas moléculas de tal maneira que assumam a conformação correta em relação uma à outra, de modo a manter a atividade desejada. Em concretizações particulares, o ligante polipeptídico tem uma cadeia contínua de 2 a 30 resíduos de aminoácidos (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 resíduos de aminoácidos). Além disso, os resíduos de aminoácidos selecionados para inclusão no ligante polipeptídico devem exibir propriedades que não interfiram significativamente na atividade do polipeptídeo. Assim, o peptídeo ligante em geral não deve exibir uma carga que seja inconsistente com a atividade do polipeptídeo, ou interfira na dobra interna, ou forme ligações ou outras interações com resíduos de aminoácidos em um ou mais monômeros que seriamente impediriam a ligação de domínios de monômeros receptores. Em concretizações particulares, o ligante de polipeptídeo é um polipeptídeo não estruturado. Os ligantes úteis incluem glicina- serina ou ligantes GS. Por ligantes "Gly-Ser" ou "GS" entende- se um polímero de glicinas e serinas em série (incluindo, por exemplo, (Gly-Ser)n, (GSGGS)n (GGGGS)n e (GGGS)n, em que n é um número inteiro de pelo menos um), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina e outros ligantes flexíveis, como a amarra para o canal de potássio de shaker e uma grande variedade de outros ligantes flexíveis, como será reconhecido pelos versados na técnica. Os polímeros de glicina-serina são preferidos uma vez que estes dois aminoácidos são relativamente não estruturados e, portanto, podem ser capazes de servir como uma ligação neutra entre os componentes. Em segundo lugar, a serina é hidrofílica e, portanto, capaz de solubilizar o que poderia ser uma cadeia de glicina globular. Em terceiro lugar, demonstrou-se que cadeias semelhantes são eficazes na junção de subunidades de proteínas recombinantes, como anticorpos de cadeia única.

[0290] Adequadamente, o anticorpo multiespecífico está em um formato selecionado a partir de qualquer formato multiespecífico adequado, por exemplo, biespecífico, conhecido na técnica, incluindo, a título de exemplo não limitativo, formatos baseados em um diacorpo de cadeia única (scDb), um scDb em tandem (Tandab), um scDb dimérico linear (LD-scDb), um scDb dimérico circular (CD-scDb), um agente biespecífico de células T (BiTE; di-scFv tandem), um tri-scFv tandem, um triacorpo (Fab-(scFv)2) ou bicorpo (Fab-(scFv)1), Fab, Fab-FV2, Morrison (fusão IgG CH3-

scFv (Morrison L) ou fusão IgG CL-scFv (Morrison H)), triacorpo, scDb-scFv, Fab2 biespecífico, di-minianticorpo, tetracorpo, fusão scFv-Fc-scFv, fusão scFv-HSA-scFv, di-diacorpo, DVD-Ig, COVD, fusões IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fc, IgG-scFv, como bsAb (scFv ligado ao terminal C da cadeia leve), Bs1Ab (scFv ligado ao terminal N da cadeia leve), Bs2Ab (scFv ligado ao terminal N da cadeia pesada), Bs3Ab (scFv ligado ao terminal C da cadeia pesada), Ts1Ab (scFv ligado ao terminal N da cadeia pesada e da cadeia leve), Ts2Ab (dsscFv ligado ao terminal C da cadeia pesada), anticorpos biespecíficos baseados em domínios Fc heterodiméricos, como anticorpos Knob-into-Hole (KiHs) (IgGs biespecíficos preparados pela tecnologia KiH); um Fv, scFv, scDb, tandem-di-scFv, tri-scFv em tandem, Fab-(scFv)2, Fab- (scFv)1, Fab, Fab-Fv2, COVD fundido ao N- e/ou ao C- terminal de qualquer cadeia de um domínio Fc heterodimérico ou qualquer outro domínio de heterodimerização, um MATCH (descrito em WO 2016/0202457; Egan T., et al., mAbs 9 (2017) 68-84) e DuoBodies (IgGs biespecíficos preparados pela tecnologia Duobody) (MAbs. 2017 fev/mar; 9 (2): 182-212. doi:

10.1080/19420862.2016.1268307). Particularmente adequado para uso aqui é um diacorpo de cadeia simples (scDb) ou scDb-scFv.

[0291] Numa concretização, o anticorpo multiespecífico da invenção está em um formato selecionado a partir da lista que consiste em scDb (diacorpo), scDb-scFv, triacorpo, e tricorpo. Particularmente adequado para uso aqui é um diacorpo de cadeia única (scDb), em particular um scDb monomérico biespecífico. Além disso, particularmente adequado para uso aqui é um scDb- scFv, em particular em que o referido CD137-BD e o referido PDL1-

BD estão na forma de um scDb e o referido HSA-BD é um scFv operacionalmente ligado ao referido scDb.

[0292] O termo "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpo com dois locais de ligação ao antígeno, cujos fragmentos compreendem um VH conectado ao VL na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL). Ao usar um ligante muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia para criar dois sítios de ligação ao antígeno. Os diacorpos podem ser bivalentes ou biespecíficos. Os diacorpos são descritos mais completamente em, por exemplo, EP404097, WO 93 /01161, Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003) e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003).

[0293] O scDb biespecífico, em particular o scDb monomérico biespecífico, compreende particularmente dois domínios variáveis da cadeia pesada (VH) ou seus fragmentos e dois domínios variáveis da cadeia leve (VL) ou seus fragmentos conectados pelos ligantes L1, L2 e L3 na ordem VHA-L1 -VLB-L2-VHB-L3-VLA, VHA- L1-VHB-L2-VLB-L3-VLA, VLA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VHA, VLA-L1-VHB-L2- VLB-L3 -VHA, VHB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB, VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3- VLB, VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VHB ou VLB-L1-VHA -L2-VLA-L3-VHB, em que os domínios VLA e VHA formam conjuntamente o local de ligação ao antígeno para o primeiro antígeno, e VLB e VHB formam conjuntamente o local de ligação ao antígeno para o segundo antígeno.

[0294] O ligante L1 é particularmente um peptídeo de 2-10 aminoácidos, mais particularmente 3-7 aminoácidos e mais particularmente 5 aminoácidos, e o ligante L3 é particularmente um peptídeo de 1-10 aminoácidos, mais particularmente 2-7 aminoácidos e, mais particularmente, 5 aminoácidos. Em concretizações particulares, o ligante L1 e/ou L3 compreende uma ou duas unidades de quatro (4) resíduos de aminoácidos de glicina e um (1) resíduo de aminoácido de serina (GGGGS)n, em que n = 1 ou 2, preferencialmente n = 1. Em concretizações mais particulares, o ligante L1 e/ou L3 é como estabelecido na SEQ ID NO: 207 ou SEQ ID NO: 2018, preferencialmente SEQ ID NO: 207.

[0295] O ligante médio L2 é particularmente um peptídeo de 10-40 aminoácidos, mais particularmente 15-30 aminoácidos e mais particularmente 20-25 aminoácidos. Em concretizações particulares, o referido ligante L2 compreende uma ou mais unidades de quatro (4) resíduos de aminoácidos de glicina e um (1) resíduo de aminoácido de serina (GGGGS)n, em que n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, de preferência n = 4. Em concretizações mais particulares, o ligante L2 é como apresentado na SEQ ID NO: 206.

[0296] Numa concretização, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb. Numa concretização específica, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade a qualquer uma das SEQ ID NOs: 209, 210, 211, 212, 213, 214 e 215. Numa concretização, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 209, 210, 211, 212, 213, 214 e

215. Em uma concretização adicional, o anticorpo multiespecífico da presente invenção é um scDb que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 209, 210, 211, 212, 213, 214 e 215.

[0297] Numa concretização, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb-scFv. O termo "scDb-scFv" refere-se a um formato de anticorpo, em que um fragmento Fv de cadeia única (scFv) é fundido por um ligante Gly-Ser flexível a um diacorpo de cadeia única (scDb). Numa concretização, o referido ligante Gly-Ser flexível é um peptídeo de 2-40 aminoácidos, por exemplo, 2-35, 2-30, 2-25, 2-20, 2-15, 2-10 aminoácidos, particularmente 10 aminoácidos. Em concretizações particulares, o referido ligante compreende uma ou mais unidades de quatro (4) resíduos de aminoácidos de glicina e um (1) resíduo de aminoácido de serina (GGGGS)n, em que n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, de preferência n = 2. Em concretizações mais particulares, o referido ligante é como estabelecido na SEQ ID NO: 20 8.

[0298] Em uma concretização específica, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb-scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento identidade a qualquer uma das SEQ ID NOs: 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230 e 231. Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb-scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade a qualquer uma das SEQ ID NOs: 222. Mais adequadamente, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb-scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade a SEQ ID NOs: 223 ou 224.

[0299] Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb-scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, preferencialmente pelo menos 90, por exemplo, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, por cento de identidade com a SEQ ID NO: 216, em que (a) o CD137-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 4, 6 e 7, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2, e LCDR3 das SEQ ID NOs: 21, 22 e 23, respectivamente, e (b) o PDL1-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 122, 124 e 125, respectivamente e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 138, 139 e 140, respectivamente; e (c) o HSA-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 152, 153 e 154, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 165, 166 e 167, respectivamente.

[0300] Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb-scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, preferencialmente pelo menos 90, por exemplo, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, porcento de identidade com a SEQ ID NO: 217, em que (a) o CD137-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 38, 39 e 40, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 51, 52 e 53, respectivamente, e (b) o PDL1-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 122, 124 e 125, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 138, 139 e 140, respectivamente; e (c) o HSA-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 152, 153 e 154, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 165, 166 e 167, respectivamente.

[0301] Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb-scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, preferencialmente pelo menos 90, por exemplo, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, porcento de identidade com a SEQ ID NO: 218, em que (a) o CD137-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 4, 6 e 7, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 21, 22 e 23, respectivamente, e (b) o PDL1-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 122, 124 e 125, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 138, 139 e 140, respectivamente; e (c) o HSA-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 176, 177 e 178, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 189, 190 e 191, respectivamente.

[0302] Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb-scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, preferencialmente pelo menos 90, por exemplo, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, por cento de identidade com a SEQ ID NO: 219, em que (a) o CD137-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 38, 39 e 40, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2, e LCDR3 das SEQ ID NOs: 51, 52 e 53, respectivamente, e (b) o PDL1-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das

SEQ ID NOs: 122, 124 e 125, respectivamente e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 138, 139 e 140, respectivamente; e (c) o HSA-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 176, 177 e 178, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 189, 190 e 191, respectivamente.

[0303] Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb-scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, preferencialmente pelo menos 90, por exemplo, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a SEQ ID NO: 220, em que (a) o CD137-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 4, 6 e 7, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 21, 22 e 23, respectivamente, e (b) o PDL1-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 92, 94 e 95, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 108, 109 e 110, respectivamente; e (c) o HSA-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 152, 153 e 154, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 165, 166 e 167, respectivamente.

[0304] Adequadamente, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb-scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, preferencialmente pelo menos 90, por exemplo, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, porcento de identidade com a SEQ ID NO: 221, em que (a) o CD137-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende sequências HCDR1,

HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 4, 6 e 7, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 21, 22 e 23, respectivamente, e (b) o PDL1-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 92, 94 e 95, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 108, 109 e 110, respectivamente; e (c) o HSA-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 176, 177 e 178, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 189, 190 e 191, respectivamente.

[0305] Numa concretização preferida, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb-scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, preferencialmente pelo menos 90, por exemplo, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, porcento de identidade com a SEQ ID NO: 222 ou SEQ ID NO: 223 ou SEQ ID NO: 224, preferencialmente SEQ ID NO: 222, mais preferencialmente SEQ ID NO: 223, em que (a) o CD137-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 18, 19 e 20, respectivamente, e (b) o PDL1-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 89, 90 e 91, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 105, 106 e 107, respectivamente; e (c) o HSA-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 149, 150 e 151, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 162, 163 e 164, respectivamente.

[0306] Em uma concretização, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb-scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, preferencialmente pelo menos 90, por exemplo, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade a SEQ ID NO: 225 ou SEQ ID NO: 226 ou SEQ ID NO: 227 ou SEQ ID NO: 228, preferencialmente SEQ ID NO: 225 ou SEQ ID NO: 228, mais preferencialmente SEQ ID NO: 225, em que (a) o CD137-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 18, 19 e 20, respectivamente, e (b) o PDL1-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 119, 120 e 121, respectivamente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 sequências de SEQ ID NOs: 135, 136 e 137, respectivamente; e (c) o HSA-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 149, 150 e 151, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 162, 163 e 164, respectivamente.

[0307] Em uma concretização, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb-scFv que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227 e 228, preferencialmente SEQ ID NO: 222 ou 223, mais preferencialmente SEQ ID NO: 223. Em uma concretização adicional, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb-scFv que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227 e 228, preferencialmente SEQ ID NO: 222 ou 223, mais preferencialmente SEQ ID NO: 223.

[0308] Em uma concretização adicional, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb-scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, preferencialmente pelo menos 90, por exemplo, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, por cento de identidade com as SEQ ID NOs: 229 ou SEQ ID NO: 230 ou SEQ ID NO: 231, preferencialmente SEQ ID NO: 229 ou SEQ ID NO: 231, mais preferencialmente SEQ ID NO: 229, em que (a) o CD137-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, respectivamente, e (b) o PDL1- BD do referido anticorpo multiespecífico compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 119, 120 e 121, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 135, 136, e 137, respectivamente; e (c) o HSA-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 149, 150 e 151, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 162, 163 e 164, respectivamente.

[0309] Numa concretização preferida, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb-scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento de identidade a SEQ ID NOs: 229 ou SEQ ID NO: 230 ou SEQ ID NO: 231, preferencialmente SEQ ID NO: 229 ou SEQ ID NO: 231, mais preferencialmente SEQ ID NO: 229. Em uma concretização específica, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb-

scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, preferencialmente pelo menos 90, por exemplo, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99, percentual de identidade com as SEQ ID NOs: 229 ou SEQ ID NO: 230 ou SEQ ID NO: 231, preferencialmente SEQ ID NO: 229 ou SEQ ID NO: 231, mais preferencialmente SEQ ID NO: 229, em que (a) o CD137-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, respectivamente e (b) o PDL1-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 89, 90 e 91, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 105, 106 e 107, respectivamente; e (c) o HSA-BD do referido anticorpo multiespecífico compreende as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 149, 150 e 151, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 162, 163 e 164, respectivamente.

[0310] Em uma concretização, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb-scFv que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230 e 231, preferencialmente SEQ ID NO: 222 ou 223, mais preferencialmente SEQ ID NO: 223. Em uma concretização adicional, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb- scFv que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230 e 231, preferencialmente SEQ ID NO: 222 ou 223, mais preferencialmente SEQ ID NO: 223. Em uma concretização preferida, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb-scFv compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 229, 230 e 231, de preferência SEQ ID NO: 229 ou 231, mais preferencialmente SEQ ID NO: 229. Numa concretização mais específica, o anticorpo multiespecífico da invenção é um scDb- scFv que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 229, 230 e 231, de preferência SEQ ID NO: 229 ou 231, mais preferencialmente SEQ ID NO: 229.

[0311] Numa concretização da presente invenção, o anticorpo multiespecífico da invenção está no formato Morrison-L.

[0312] Em uma concretização específica, o anticorpo multiespecífico da invenção compreende (i) uma cadeia leve Morrison-L compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NO: 232, e (ii) uma cadeia pesada Morrison-L compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NO: 233. Numa concretização, o anticorpo multiespecífico da invenção compreende (i) uma cadeia leve Morrison-L compreendendo um aminoácido de SEQ ID NO: 232 e (ii) uma cadeia pesada Morrison-L compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 233. Em uma concretização adicional, o anticorpo multiespecífico da invenção consiste em (i) uma cadeia leve Morrison-L compreendendo um aminoácido de SEQ ID NO: 232 e (ii) uma cadeia pesada Morrison-L compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 233.

[0313] Em outra concretização, o anticorpo multiespecífico da invenção compreende (i) uma cadeia leve Morrison-L compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NO: 236 e (ii) uma cadeia pesada Morrison-L compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NO: 237. Em uma concretização, o anticorpo multiespecífico da invenção compreende (i) uma cadeia leve Morrison-L compreendendo um aminoácido de SEQ ID NO: 236 e (ii) uma cadeia pesada Morrison- L compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 237. Em uma concretização adicional, o anticorpo multiespecífico da invenção consiste em (i) uma cadeia leve Morrison-L compreendendo um aminoácido de SEQ ID NO: 236 e (ii) uma cadeia pesada Morrison-L compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 237.

[0314] Numa concretização da presente invenção, o anticorpo multiespecífico da invenção está no formato Morrison-H.

[0315] Numa concretização específica, o anticorpo multiespecífico da invenção compreende (i) uma cadeia leve Morrison-H compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NO: 234, e (ii) uma cadeia pesada Morrison-H compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NO:

235. Em uma concretização, o anticorpo multiespecífico da invenção compreende (i) uma cadeia leve Morrison-H compreendendo um aminoácido da SEQ ID NO: 234 e (ii) uma cadeia pesada Morrison-H compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 235. Em uma concretização adicional, o anticorpo multiespecífico da invenção consiste em (i) uma cadeia leve Morrison-L compreendendo um aminoácido de SEQ ID NO: 234 e (ii) uma cadeia pesada Morrison-L compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 235.

[0316] Em outra concretização, o anticorpo multiespecífico da invenção compreende (i) uma cadeia leve Morrison-H compreendendo uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NO: 238 e (ii) uma cadeia pesada Morrison-H compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NO: 239. Em uma concretização, o anticorpo multiespecífico da invenção compreende (i) uma cadeia leve Morrison-H compreendendo um aminoácido da SEQ ID NO: 238 e (ii) uma cadeia pesada Morrison- H compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 239. Em uma concretização adicional, o anticorpo multiespecífico da invenção consiste em (i) uma cadeia leve Morrison-L compreendendo um aminoácido de SEQ ID NO: 238 e (ii) uma cadeia pesada Morrison-L compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 239.

[0317] Numa concretização da presente invenção, o anticorpo multiespecífico da invenção está em um formato MATCH descrito em WO 2016/0202457; Egan T., et al., MAbs 9 (2017) 68-84.

[0318] O anticorpo multiespecífico da invenção pode ser produzido usando qualquer método conveniente de fabricação de anticorpos conhecido no estado da técnica (ver, por exemplo, Fischer, N. & Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14 no que diz respeito à produção de construções biespecíficas Hornig, N. & Färber-Schwarz, A., Methods Mol. Biol. 907 (2012) 713-727 e WO 99/57150 no que diz respeito a diacorpos biespecíficos e scFvs em tandem). Exemplos específicos de métodos adequados para a preparação da construção biespecífica da invenção incluem ainda, entre outras, as tecnologias Genmab (ver Labrijn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (2013) 5145-5150) e Merus (ver de Kruif et al., Biotechnol. Bioeng. 106 (2010) 741-750). Os métodos para produção de anticorpos biespecíficos compreendendo uma parte Fc de anticorpo funcional também são conhecidos no estado da técnica (ver, por exemplo, Zhu et al., Cancer Lett. 86 (1994) 127-134); e Suresh et al., Methods Enzymol. 121 (1986) 210-228).

[0319] Estes métodos envolvem tipicamente a geração de anticorpos monoclonais, por exemplo, através da fusão de células de mieloma com células de baço de um camundongo que foi imunizado com o antígeno desejado usando a tecnologia de hibridoma (ver, por exemplo, Yokoyama et al., Curr. Protoc Immunol. Capítulo 2, Unidade 2.5, 2006) ou por meio de engenharia de anticorpos recombinantes (clonagem de repertório ou exibição de fagos/exibição de leveduras) (ver, por exemplo, Chames & Baty, FEMS Microbiol. Letters 189 (2000) 1-8), e a combinação dos domínios de ligação ao antígeno ou fragmentos ou partes deles de dois ou mais anticorpos monoclonais diferentes para dar uma construção biespecífica ou multiespecífica usando técnicas conhecidas de clonagem molecular.

[0320] As moléculas multiespecíficas da invenção podem ser preparadas conjugando as especificidades de ligação constituintes, utilizando métodos conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e depois conjugada uma com a outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, pode ser utilizada uma variedade de agentes de acoplamento ou reticulação para conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-5-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'- ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) e sulfosuccinimidil 4-(N- maleimidometil)ciclo-hexano-l- carboxilato (sulfo-SMCC) (ver, por exemplo, Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 8648). Outros métodos incluem os descritos em Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. 78, 118-132; Brennan et al., 1985 Science 229: 81-83) e Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367- 2375). Os agentes conjugadores são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis na Pierce Chemical Co. (Rockford, 111).

[0321] Quando as especificidades de ligação são anticorpos, elas podem ser conjugadas por ligação sulfidrila das regiões de charneira do terminal C das duas cadeias pesadas. Numa concretização particularmente, a região de charneira é modificada para conter um número ímpar de resíduos de sulfidrila, por exemplo um, antes da conjugação.

[0322] Alternativamente, duas ou mais especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil quando a molécula biespecífica é uma proteína de fusão mAb X mAb, mAb X Fab, Fab X F(ab')2 ou ligante

X Fab. Um anticorpo multiespecífico da invenção pode ser uma molécula de cadeia única compreendendo um anticorpo de cadeia única e um determinante de ligação, ou um anticorpo multiespecífico de cadeia única compreendendo dois determinantes de ligação. O anticorpo multiespecífico pode compreender pelo menos duas moléculas de cadeia única. Os métodos para a preparação de anticorpos e moléculas multiespecíficos são descritos, por exemplo, na Pat. US 5.260.203; Pat. US No.

5.455.030; Pat. US No. 4.881.175; Pat. US No. 5.132.405; Pat. US

5.091.513; Pat. US No. 5.476.786; Pat. US 5.013.653; Pat. US

5.258.498; e Pat. US No. 5.482.858.

[0323] A ligação dos anticorpos multiespecíficos aos seus alvos específicos pode ser confirmada por, por exemplo, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (REA), análise FACS, bioensaio (por exemplo, inibição do crescimento) ou ensaio Western Blot. Cada um desses ensaios geralmente detecta a presença de complexos proteína-anticorpo de interesse particular, empregando um reagente marcado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse.

[0324] Num aspecto adicional, a invenção proporciona um ácido nucleico que codifica o anticorpo multiespecífico da invenção ou fragmentos seus ou domínios de ligação seus. Tais sequências de ácidos nucleicos podem ser otimizadas para expressão em células de mamíferos.

[0325] O termo "ácido nucleico" é aqui utilizado alternadamente com o termo "polinucleotídeo(s)" e refere-se a um ou mais desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e seus polímeros, na forma de fita simples ou dupla. O termo abrange ácidos nucléicos contendo análogos nucleotídicos conhecidos ou resíduos ou ligações modificadas da coluna vertebral, que são sintéticos, naturais e não naturais, que possuem propriedades de ligação semelhantes ao ácido nucleico de referência e são metabolizados de maneira semelhante a nucleotídeos de referência. Exemplos de tais análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, metil fosfonatos, fosforatos quirometil, metil ribonucleotídeos 2-O-metil ribonucleotídeos, ácidos peptídicos-nucleicos (PNAs). Salvo indicação em contrário, uma sequência de ácido nucleico específica também inclui implicitamente variantes modificadas conservadoramente (por exemplo, substituições de códons degeneradas) e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, como detalhado abaixo, as substituições degeneradas de códons podem ser alcançadas gerando sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída por resíduos de base mista e/ou desoxininosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res 19: 5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608, 1985; e Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98, 1994).

[0326] A invenção fornece moléculas de ácido nucleico substancialmente purificadas que codificam polipeptídeos compreendendo segmentos ou domínios do anticorpo multiespecífico descrito acima. Quando expressos a partir de vetores de expressão apropriados, os polipeptídeos codificados por essas moléculas de ácido nucleico são capazes de exibir capacidade ou capacidades de ligação ao antígeno do anticorpo multiespecífico da presente invenção.

[0327] São também proporcionados na invenção polinucleotídeos que codificam pelo menos uma das regiões CDR e, normalmente,

todas as três regiões CDR dos domínios de ligação do anticorpo multiespecífico da presente invenção estabelecido nas Tabelas 1 a 3. Devido à degenerescência do código, uma variedade de sequências de ácidos nucleicos codificará cada uma das sequências de aminoácidos da imunoglobulina.

[0328] As sequências polinucleotídicas podem ser produzidas por síntese de DNA em fase sólida de novo ou por mutagênese por PCR de uma sequência existente (por exemplo, sequências como descritas nos Exemplos abaixo) que codificam o anticorpo multiespecífico da invenção ou seus fragmentos ou domínios de ligação. A síntese química direta de ácidos nucleicos pode ser realizada por métodos conhecidos na técnica, como o método fosfotriéster de Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90; o método fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109, 1979; o método dietilfosforamidito de Beaucage et al., Tetra. Lett. 22: 1859, 1981; e o método de suporte sólido da Pat. US No. 4.458.066. A introdução de mutações em uma sequência polinucleotídica por PCR pode ser realizada como descrito em, por exemplo, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, HA Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; Protocolos de PCR: um guia para métodos e aplicações, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, Califórnia, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19: 967, 1991; e Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991.

[0329] Também são fornecidos na invenção vetores de expressão e células hospedeiras para a produção do anticorpo multiespecífico da invenção ou seus fragmentos ou seus domínios de ligação.

[0330] O termo "vetor" pretende se referir a uma molécula de polinucleotídeo capaz de transportar outro polinucleotídeo ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a um loop de DNA de fita dupla circular no qual segmentos adicionais de DNA podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos com origem bacteriana de replicação e vetores de mamíferos epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, assim, são replicados junto com o genoma hospedeiro.

[0331] Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles estão operacionalmente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente "vetores de expressão"). Em geral, os vetores de expressão de utilidade nas técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. Na presente especificação, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados de forma intercambiável, pois o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada. No entanto, a invenção pretende incluir outras formas de vetores de expressão, como vetores virais (por exemplo, retrovírus com defeito de replicação, adenovírus e vírus adeno-associados), que possuem funções equivalentes. Nesse contexto particular, o termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma relação funcional entre dois ou mais segmentos polinucleotídicos (por exemplo,

DNA). Tipicamente, refere-se à relação funcional de uma sequência reguladora da transcrição com uma sequência transcrita. Por exemplo, uma sequência promotora ou potenciadora está operacionalmente ligada a uma sequência de codificação se estimular ou modular a transcrição da sequência de codificação em uma célula hospedeira apropriada ou outro sistema de expressão. Geralmente, as sequências reguladoras da transcrição promotora que estão operacionalmente ligadas a uma sequência transcrita são fisicamente contíguas à sequência transcrita, ou seja, elas são de ação cis. No entanto, algumas sequências reguladoras da transcrição, como intensificadores, não precisam ser fisicamente contíguas ou localizadas nas proximidades das sequências de codificação cuja transcrição elas intensificam.

[0332] Vários vetores de expressão podem ser empregados para expressar os polinucleotídeos que codificam as cadeias de anticorpos multiespecíficos ou fragmentos de ligação. Os vetores de expressão com base em vírus e os não virais podem ser usados para produzir os anticorpos em uma célula hospedeira de mamífero. Os vetores e sistemas não virais incluem plasmídeos, vetores epissomais, tipicamente com um cassete de expressão para expressar uma proteína ou RNA, e cromossomos artificiais humanos (ver, por exemplo, Harrington et al., Nat Genet. 15: 345, 1997). Por exemplo, vetores não virais úteis para expressão dos polinucleotídeos e polipeptídeos de ligação a CD137 em células de mamíferos (por exemplo, humanos) incluem pThioHis A, B e C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B e C (Invitrogen, San Diego, Califórnia), vetores MPS V e vários outros vetores conhecidos na técnica por expressar outras proteínas. Os vetores virais úteis incluem vetores baseados em retrovírus, adenovírus, vírus adenoassociados, vírus do herpes, vetores baseados em SV40, vírus do papiloma, vírus HBP Epstein Barr, vetores de vírus vaccinia e vírus da Floresta Semliki (SFV). Ver Brent et al., Supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49: 807, 1995; e Rosenfeld et al., Cell 68: 143, 1992.

[0333] A escolha do vetor de expressão depende das células hospedeiras pretendidas nas quais o vetor deve ser expresso. Tipicamente, os vetores de expressão contêm um promotor e outras sequências reguladoras (por exemplo, intensificadores) que estão operacionalmente ligadas aos polinucleotídeos que codificam uma cadeia de anticorpo multiespecífica ou um fragmento. Numa concretização, um promotor induzível é empregado para impedir a expressão de sequências inseridas, exceto sob condições de indução. Promotores induzíveis incluem, por exemplo, promotor de arabinose, lacZ, metalotioneína ou um promotor de choque térmico. Culturas de organismos transformados podem ser expandidas sob condições não indutoras sem influenciar a população por sequências codificadoras cujos produtos de expressão são mais bem tolerados pelas células hospedeiras. Além dos promotores, outros elementos reguladores também podem ser necessários ou desejados para a expressão eficiente de uma cadeia ou anticorpo multiespecífico de anticorpos. Estes elementos incluem tipicamente um códon de iniciação ATG e um local de ligação ao ribossomo adjacente ou outras sequências. Além disso, a eficiência da expressão pode ser aprimorada pela inclusão de intensificadores apropriados ao sistema celular em uso (ver, por exemplo, Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20: 125, 1994; e Bittner et al., Meth. Enzymol., 153: 516, 1987). Por exemplo, o intensificador de SV40 ou intensificador de CMV pode ser usado para aumentar a expressão em células hospedeiras de mamíferos.

[0334] Os vetores de expressão também podem fornecer uma posição de sequência de sinal de secreção para formar uma proteína de fusão com polipeptídeos codificados por inserir o anticorpo multiespecífico da invenção ou seus fragmentos ou seus domínios de ligação. Mais frequentemente, o anticorpo multiespecífico inserido da invenção ou seus fragmentos ou seus domínios de ligação são ligados às sequências de sinal antes da inclusão no vetor. Os vetores a serem utilizados para receber sequências que codificam domínios de ligação dos domínios variáveis de cadeia leve e pesada de anticorpo multiespecífico às vezes também codificam regiões constantes ou partes suas. Tais vetores permitem a expressão das regiões variáveis como proteínas de fusão com as regiões constantes, levando assim à produção de anticorpos intactos e seus fragmentos de ligação ao antígeno. Normalmente, essas regiões constantes são humanas.

[0335] O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira") refere-se a uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Deve-se entender que tais termos se referem não apenas à célula em questão, mas também à descendência de uma célula. Como certas modificações podem ocorrer nas gerações seguintes devido a mutações ou influências ambientais, essa descendência pode não ser idêntica à célula-mãe, mas ainda está incluída no escopo do termo "célula hospedeira", conforme aqui utilizado.

[0336] As células hospedeiras para abrigar e expressar o anticorpo multiespecífico da invenção ou seus fragmentos ou seus domínios de ligação podem ser procarióticos ou eucarióticos. E.

coli é um hospedeiro procariótico útil para clonar e expressar os polinucleotídeos da presente invenção. Outros hospedeiros microbianos adequados para uso incluem bacilos, como Bacillus subtilis, e outras enterobactérias, como Salmonella, Serratia e várias espécies de Pseudomonas. Nesses hospedeiros procarióticos, também é possível criar vetores de expressão, que normalmente contêm sequências de controle de expressão compatíveis com a célula hospedeira (por exemplo, uma origem de replicação). Além disso, qualquer número de uma variedade de promotores conhecidos estará presente, como o sistema promotor de lactose, um sistema promotor de triptofano (trp), um sistema promotor de beta-lactamase ou um sistema promotor do fago lambda. Os promotores tipicamente controlam a expressão, opcionalmente com uma sequência do operador, e têm sequências no local de ligação ao ribossomo e similares, para iniciar e concluir a transcrição e tradução. Outros micróbios, como leveduras, também podem ser empregues para expressar polipeptídeos de ligação a CD137 da invenção. Também podem ser utilizadas células de insetos em combinação com vetores de baculovírus.

[0337] Numa concretização, as células hospedeiras de mamíferos são usadas para expressar e produzir o anticorpo multiespecífico da invenção ou seus fragmentos ou seus domínios de ligação. Por exemplo, elas podem ser uma linha celular de hibridoma que expressa genes de imunoglobulina endógena ou uma linha celular de mamífero que abriga um vetor de expressão exógeno. Estas incluem qualquer célula mortal normal ou animal imortal normal ou anormal ou humana. Por exemplo, foram desenvolvidas várias linhas celulares hospedeiras adequadas capazes de secretar imunoglobulinas intactas, incluindo as linhas celulares CHO, várias linhas celulares Cos, células HeLa, linhas celulares de mieloma, células B transformadas e hibridomas. O uso da cultura de células de tecidos de mamíferos para expressar polipeptídeos é discutido geralmente em, por exemplo, Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, NY, NY, 1987. Os vetores de expressão para células hospedeiras de mamíferos podem incluir sequências de controle de expressão, como uma origem de replicação, um promotor e um intensificador (ver, por exemplo, Queen, et al., Immunol. Rev. 89: 49-68, 1986) e sítios de informações de processamento necessários, como locais de ligação ao ribossomo, locais de emenda ao RNA, locais de poliadenilação e sequências terminadoras transcricionais. Estes vetores de expressão geralmente contêm promotores derivados de genes de mamíferos ou de vírus de mamíferos. Os promotores adequados podem ser constitutivos, específicos do tipo de célula, específicos do estágio e/ou moduláveis ou reguláveis. Os promotores úteis incluem, entre outros, o promotor da metalotioneína, o principal promotor tardio do adenovírus constitutivo, o promotor do MMTV induzível por dexametasona, o promotor SV40, o promotor MRP polIII, o promotor constitutivo do MPS V, o promotor de CMV induzível pela tetraciclina (tal como o promotor humano imediato-precoce de CMV), o promotor constitutivo do CMV e combinações promotor- intensificador conhecidas no estado da técnica.

[0338] Os métodos para introduzir vetores de expressão contendo as sequências polinucleotídicas de interesse variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção de cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, enquanto o tratamento ou eletroporação com fosfato de cálcio pode ser usado para outros hospedeiros celulares. (Ver de forma geral Sambrook, et al., Supra). Outros métodos incluem, por exemplo, eletroporação, tratamento com fosfato de cálcio, transformação mediada por lipossomas, injeção e microinjeção, métodos balísticos, virossomas, imunolipossomos, conjugados de ácido policatiomnucleico, DNA nu, virions artificiais, fusão com a proteína estrutural VP22 do vírus da herpes (Elliot e O 'Hare, Cell 88: 223, 1997), captação de DNA aumentada por agente e transdução ex vivo.

Para a produção a longo prazo e de alto rendimento de proteínas recombinantes, a expressão estável será frequentemente desejada.

Por exemplo, linhas celulares que expressam estavelmente o anticorpo multiespecífico da invenção ou seus fragmentos ou domínios de ligação podem ser preparadas usando vetores de expressão da invenção que contêm origens virais de replicação ou elementos de expressão endógenos e um gene marcador selecionável.

Após a introdução do vetor, as células podem crescer por 1-2 dias em um meio enriquecido antes de serem trocadas para um meio seletivo.

O objetivo do marcador selecionável é conferir resistência à seleção, e sua presença permite o crescimento de células que expressam com sucesso as sequências introduzidas em meio seletivo.

As células resistentes e estavelmente transfectadas podem ser proliferadas utilizando técnicas de cultura de tecidos apropriadas ao tipo de célula.

A presente invenção fornece, assim, um método de produção do anticorpo da invenção ou seu fragmento de ligação ao antígeno, em que o referido método compreende a etapa de cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico ou um vetor que codifica o anticorpo da invenção ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por onde o referido anticorpo da divulgação ou um fragmento seu é expresso.

[0339] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método de produção do anticorpo multiespecífico da invenção ou a um domínio de ligação ou um fragmento do mesmo, o método compreendendo a etapa de cultivar uma célula hospedeira que expressa um ácido nucleico que codifica o anticorpo multiespecífico da invenção ou um domínio de ligação seu ou um fragmento seu.

[0340] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere- se a uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo multiespecífico da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis melhoram ou estabilizam a composição, ou facilitam a preparação da composição. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção, e similares que são fisiologicamente compatíveis.

[0341] Uma composição farmacêutica da invenção pode ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. A via e/ou modo de administração variam dependendo dos resultados desejados. A administração pode ser intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea ou administrada proximalmente ao local do alvo. O veículo farmaceuticamente aceitável deve ser adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, isto é, o anticorpo multiespecífico da invenção,

pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.

[0342] As composições farmacêuticas da invenção podem ser preparadas de acordo com métodos bem conhecidos e praticados rotineiramente no estado da técnica. Ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20ª ed., 2000; e Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, JR Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978. As composições farmacêuticas são preferencialmente fabricadas sob condições de GMP. Tipicamente, uma dose terapeuticamente eficaz ou dose eficaz do anticorpo multiespecífico da invenção é empregada nas composições farmacêuticas da invenção. Os anticorpos multiespecíficos da invenção são formulados em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais conhecidos pelos versados na técnica. Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta desejada ideal (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolus pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas na forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e uniformidade da dosagem. A forma de unidade de dosagem como aqui utilizada refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário.

[0343] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração em particular, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagem selecionado depende de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção empregadas, ou o éster, sal ou amida do mesmo, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular sendo empregado, a duração do tratamento, outros medicamentos, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com as composições particulares empregadas, idade, sexo, peso, condição, estado geral de saúde e histórico médico anterior do paciente sendo tratado e como fatores.

[0344] O anticorpo multiespecífico da invenção é geralmente administrado em várias ocasiões. Intervalos entre doses únicas podem ser semanais, mensais ou anuais. Os intervalos também podem ser irregulares, conforme indicado pela medição dos níveis sanguíneos do anticorpo multiespecífico da invenção no paciente. Alternativamente, o anticorpo multiespecífico da invenção pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada, caso em que é necessária uma administração menos frequente. A dosagem e a frequência variam dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, os anticorpos humanizados apresentam meia-vida mais longa que a dos anticorpos quiméricos e anticorpos não humanos. A dosagem e a frequência da administração podem variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dose relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente pouco frequentes durante um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento pelo resto de suas vidas. Em aplicações terapêuticas, às vezes é necessária uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada, e preferencialmente até que o paciente mostre melhora parcial ou completa dos sintomas da doença. Depois disso, o paciente pode receber um regime profilático.

[0345] Num aspecto, a presente invenção refere-se ao anticorpo multiespecífico da invenção ou à composição farmacêutica da invenção para uso como medicamento. Numa concretização adequada, a presente invenção fornece o anticorpo multiespecífico ou a composição farmacêutica para uso no tratamento de uma doença proliferativa, em particular um câncer em um indivíduo em necessidade.

[0346] Em outro aspecto, a presente invenção fornece o anticorpo multiespecífico ou a composição farmacêutica para uso na fabricação de um medicamento para tratamento de uma doença proliferativa, em particular um câncer.

[0347] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se à utilização do anticorpo multiespecífico ou da composição farmacêutica para o tratamento de uma doença proliferativa, em particular um câncer em um indivíduo em necessidade.

[0348] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere- se à utilização do anticorpo multiespecífico ou da composição farmacêutica na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença proliferativa, em particular um câncer, em um indivíduo necessitado.

[0349] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de um indivíduo compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo multiespecífico da presente invenção. Em uma concretização adequada, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de uma doença proliferativa, em particular um câncer em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo multiespecífico da presente invenção.

[0350] O termo "indivíduo" inclui animais humanos e não humanos. Animais não humanos incluem todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, como primatas não humanos, ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios e répteis. Exceto quando indicado, os termos "paciente" ou "indivíduo" são usados aqui de forma intercambiável.

[0351] Os termos "tratamento", "tratando", "tratar", "tratado" e similares, como aqui utilizados, referem-se à obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser terapêutico em termos de cura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença ou retardar a progressão da doença. "Tratamento", como aqui utilizado, abrange qualquer tratamento de uma doença em um mamífero, por exemplo, em um ser humano, e inclui: (a) inibição da doença, isto é, interrupção do seu desenvolvimento; e (b) aliviar a doença, isto é, causar regressão da doença.

[0352] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" refere-se à quantidade de um agente que, quando administrado a um mamífero ou outro indivíduo para o tratamento de uma doença, é suficiente para efetuar esse tratamento para a doença. A "quantidade terapeuticamente eficaz" variará dependendo do agente, da doença e sua gravidade e a idade, peso, etc., do indivíduo a ser tratado.

[0353] Numa concretização, a doença proliferativa é um câncer. O termo "câncer" refere-se a uma doença caracterizada pelo crescimento rápido e descontrolado de células aberrantes. As células cancerígenas podem se espalhar localmente ou através da corrente sanguínea e do sistema linfático para outras partes do corpo. Os termos "tumor" e "câncer" são usados aqui de forma intercambiável, por exemplo, ambos os termos abrangem tumores sólidos e líquidos, por exemplo, tumores difusos ou circulantes. Como usado aqui, o termo "câncer" ou "tumor" inclui pré-malignos, bem como cânceres e tumores malignos. O termo "câncer" é usado aqui para significar um amplo espectro de tumores, incluindo todas as malignidades sólidas e hematológicas. Exemplos de tais tumores incluem, mas não estão limitados a: um tumor benigno ou especialmente maligno, tumores sólidos, câncer cerebral, câncer renal, câncer de fígado, câncer de glândula adrenal, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de estômago (por exemplo, tumores gástricos), câncer de esôfago, câncer de ovário, câncer de colo do útero, câncer de reto, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas e câncer de pulmão de células pequenas), câncer de vagina, câncer de tireoide, melanoma (por exemplo, irressecável) ou melanoma metastático), carcinoma de células renais, sarcoma,

glioblastoma, mieloma múltiplo ou câncer gastrointestinal, especialmente carcinoma do cólon ou adenoma colorretal, um tumor no pescoço e na cabeça, câncer endometrial, síndrome de Cowden, doença de Lhermitte-Duclos, síndrome de Bannayan-Zonana, hiperplasia da próstata, uma neoplasia, especialmente de caráter epitelial, preferencialmente carcinoma mamário ou carcinoma espinocelular, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica (por exemplo, leucemia mieloide crônica positiva para cromossomo Philadelphia), leucemia linfoblástica aguda (por exemplo, leucemia linfoblástica aguda positiva para cromossomo Philadelphia), linfoma de não-Hodgkin, mieloma de células do plasma, o linfoma de Hodgkin, uma leucemia, e qualquer combinação dos mesmos. Numa concretização preferida, o câncer é um câncer de pulmão, preferencialmente câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). Noutra concretização, o referido câncer é um câncer colorretal.

[0354] O anticorpo multiespecífico da presente invenção, ou a composição da presente invenção, inibe o crescimento de tumores sólidos, mas também tumores líquidos. Em uma concretização adicional, a doença proliferativa é um tumor sólido. O termo "tumor sólido" significa especialmente câncer de mama, câncer de ovário, câncer de cólon, câncer de reto, câncer de próstata, câncer de estômago (especialmente câncer gástrico), câncer de colo do útero, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas e câncer de pulmão de células pequenas) e um tumor na cabeça e no pescoço. Além disso, dependendo do tipo de tumor e da combinação específica utilizada, pode ser obtida uma diminuição do volume do tumor. O anticorpo multiespecífico da presente invenção, ou a composição da presente invenção, também é adequado para evitar a disseminação metastática de tumores e o crescimento ou desenvolvimento de micrometástases em um indivíduo com câncer.

[0355] Em uma concretização, o referido câncer é positivo para PDL1, de preferência em que o referido câncer expressa altos níveis de PDL1 em comparação com um tecido saudável, em particular em que o referido câncer expressa PDL1 (mRNA ou proteína) pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, em pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, em nível pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 60 vezes, pelo menos 70 vezes, pelo menos 80 vezes, pelo menos 90 vezes, pelo menos 100 vezes mais alto em comparação com a expressão de PDL1 (mRNA ou proteína respectivamente) em um tecido saudável. Em algumas concretizações, o referido câncer é maligno. Em algumas concretizações, o referido câncer é benigno. Em algumas concretizações, o referido câncer é primário. Em algumas concretizações, o referido câncer é secundário. Numa concretização, o referido câncer é câncer de pulmão, preferencialmente câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). Noutra concretização, o referido câncer é um câncer colorretal.

[0356] Num aspecto, a presente invenção refere-se a um kit compreendendo o anticorpo multiespecífico da invenção ou a composição farmacêutica da invenção. O kit pode incluir um ou mais outros elementos, incluindo: instruções de uso; outros reagentes, por exemplo, um marcador, um agente terapêutico ou um agente útil para quelar ou acoplar de outro modo, um anticorpo a um marcador ou agente terapêutico ou uma composição radioprotetora; dispositivos ou outros materiais para preparar a molécula de anticorpo para administração; veículos farmaceuticamente aceitáveis; e dispositivos ou outros materiais para administração a um indivíduo.

Numa concretização específica, o kit compreende o anticorpo multiespecífico da invenção em uma quantidade farmaceuticamente eficaz.

Numa outra concretização, o kit compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz do anticorpo multiespecífico da invenção na forma liofilizada e um diluente e, opcionalmente, instruções para utilização.

O referido kit pode ainda compreender uma agulha de filtro para reconstituição e uma agulha para injeção.

Tabela 1. Exemplos de domínios de ligação a CD137 da presente invenção (resíduos de CDR mostrados em negrito e itálico).

SEQ ID NÚMERO Região Ab Sequência 38-02-A04 SEQ ID NO: 1 HCDR1 GFSFSNSYWIC (H27-H42; numeração AHo) SEQ ID NO: 2 HCDR 2 CTFVGSSDSTYYANWAKG (H57-H76; numeração AHo) SEQ ID NO: 3 HCDR 3 RHPSDAVYGYANNL (H108-H138; numeração AHo) SEQ ID NO: 4 HCDR1 VSGFSFSNSYW

(Definição AHo)

(38-02-A04 sc01)

(38-02-A04 sc05 IF)

SEQ ID NO: 5 HCDR1 ASGFSFSNSYW

(Definição AHo)

(38-02-A04 sc06 completo)

(38-02-A04 sc13)

SEQ ID NO: 6 HCDR2 TFVGSSDSTYYANWAKGR

(Definição AHo)

SEQ ID NO: 7 HCDR3 HPSDAVYGYANN

(Definição AHo)

SEQ ID NO: 8 HCDR1 NSYWIC

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 9 HCDR2 CTFVGSSDSTYYANWAKG

(Definição de Kabat) SEQ ID NO: 10 HCDR3 HPSDAVYGYANNL (Definição de Kabat) SEQ ID NO: 11 HCDR1 GFSFSNSY (Definição de Chothia) SEQ ID NO: 12 HCDR2 VGSSD (Definição de Chothia) SEQ ID NO: 1 HCDR3 PSDAVYGYANN 3 (Definição de Chothia) SEQ ID NO: 14 VH (VH4) (38-02-A04 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSNSYWICWIRQPPGKGLEWIG sc01) CTFVGSSDSTYYANWAKGRVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCA

RHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 15 VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSNSYWICWVRQPPGKGLEWIG

CTFVGSSDSTYYANWAKGRVTISVDSSKNQVSLKLSSVTAADTAVYFCA (VH4)

RHPSDAVYGYANNL WGQGTLVTVSS (38-02-A04 sc05 IF) Mutações VH: I44V; F89V; Y105F.

SEQ ID NO: 16 VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKASGFSFSNSYWICWVRQPPGKGLEWIG

CTFVGSSDSTYYANWAKGRVTISKDSSKNQVSLKLSSVTAADTAVYFCA (VH4)

RHPSDAVYGYANNL WGQGTLVTVSS (38-02-A04 sc06 completo) Mutações VH: V25A; I44V; V82K; F89V; Y105F SEQ ID NO: 17 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSNSYWICWVRQAPGKCLEWIG

CTFVGSSDSTYYANWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCA (VH3)

RHPSDAVYGYANNL WGQGTLVTVSS (38-02-A04 sc13)

Mutações VH: G51C (numeração AHo)

SEQ ID NO: 18 LCDR1 QASQSINNVLA

(L24-L42; numeração AHo)

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 19 LCDR2 RASTLAS

(L58-L72; numeração AHo)

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 20 LCDR3 QSSYGNYGD

(L107-L138; numeração AHo)

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 21 LCDR1 ASQSINNV

(Definição AHo)

SEQ ID NO: 22 LCDR2 RASTLASGVPSR

(Definição AHo)

SEQ ID NO: 23 LCDR3 SYGNYG

(Definição AHo)

SEQ ID NO: 24 LCDR1 SQSINNV

(Definição de Chothia)

SEQ ID NO: 25 LCDR2 RAS

(Definição de Chothia)

SEQ ID NO: 26 LCDR3 SYGNYG

(Definição de Chothia)

SEQ ID NO: 27 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIY

RASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGD (Vk1-sk17)

FGTGTKVTVLG (38-02-A04 sc01) SEQ ID NO: 28 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKPPKLLIY

RASTLASGVPSRFSGSGSGSGSGTGDGLGSSLQPEDFATYYCQSSYGNYGD (Vk1-sk17)

FGTGTKVTVLG (38-02-A04 sc05 IF) Mutações VL: A51P SEQ ID NO: 29 VL DLQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKPPKLLIYRASTLAS

GVPSRFSGSGSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGD FGTGTKVTVLG (Vk1-sk17) (38-02-A04 sc06 completo) Mutações VL: I2L; A51P

SEQ ID NO: 30 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIY

RASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGD (Vk1-sk17)

FGCGTKVTVLG (38-02-A04 sc13) Mutações VL: T141C (numeração AHo) SEQ ID NO: 31 scFv (VL-ligante-VH) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLAS

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGD (38-02-A04 sc01)

FGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVS GFSFSNSYWICWIRQPPGKGLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKG

RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 32 scFv (VL-ligante-VH) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKPPKLLIYRASTLAS

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGD (38-02-A04 sc05 IF)

FGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVS GFSFSNSYWICWVRQPPGKGLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKG RVTISVDSSKNQVSLKLSSVTAADTAVYFCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 33 scFv (VL-ligante-VH) DLQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKPPKLLIY (38-02-A04 sc06 RASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGD completo) FGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKAS

GFSFSNSYWICWVRQPPGKGLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKG

RVTISKDSSKNQVSLKLSSVTAADTAVYFCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 34 scFv (VL-ligante-VH) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLAS

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGD (38-02-A04 sc13)

FGCGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFSFSNSYWICWVRQAPGKCLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKG

RFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCA RHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSS 38-27-C05 sc01 SEQ ID NO: 35 HCDR1 GFSFNNDYDMC (H27-H42; numeração AHo) SEQ ID NO: 36 HCDR2 CIDTGDGSTYYASWAKG (H57-H76; numeração AHo)

SEQ ID NO: 37 HCDR3 REAASSSGYGMGYFDL

(H108-H138; numeração AHo)

SEQ ID NO: 38 HCDR1 VSGFSFNNDYD

(Definição AHo)

SEQ ID NO: 39 HCDR2 IDTGDGSTYYASWAKGR

(Definição AHo)

SEQ ID NO: 40 HCDR3 EAASSSGYGMGYFD

(Definição AHo)

SEQ ID NO: 41 HCDR1 NDYDMC

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 42 HCDR2 CIDTGDGSTYYASWAKG

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 43 HCDR3 EAASSSGYGMGYFDL

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 44 HCDR1 GFSFNNDY (Definição de Chothia) SEQ ID NO: 45 HCDR2 TGDG (Definição de Chothia) SEQ ID NO: 46 HCDR3 AASSSGYGMGYFD (Definição de Chothia) SEQ ID NO: 47 VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFNNDYDMCWIRQPPGKGLEWIG

CIDTGDGSTYYASWAKGRVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCA (VH4)

REAASSSGYGMGYFDL WGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 48 LCDR1 QSSQSVYDNNWLA (L24-L42; numeração AHo) (Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 49 LCDR2 RASNLAS

(L58-L72; numeração AHo)

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 50 LCDR3 QGTYLSSNWYWA

(L107-L138; numeração AHo)

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 51 LCDR1 SSQSVYDNNW

(Definição AHo)

SEQ ID NO: 52 LCDR2 RASNLASGVPSR

(Definição AHo)

SEQ ID NO: 53 LCDR3 TYLSSNWYW

(Definição AHo)

SEQ ID NO: 54 LCDR1 SQSVYDNNW

(Definição de Chothia) SEQ ID NO: 55 LCDR2 RAS (Definição de Chothia) SEQ ID NO: 56 LCDR3 TYLSSNWYW (Definição de Chothia) SEQ ID NO: 57 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVYDNNWLAWYQQKPGKAPKLLIY

RASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGTYLSSNWYWA (Vk1-sk17)

FGTGTKVTVLG SEQ ID NO: 58 scFv (VL-ligante-VH) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVYDNNWLAWYQQKPGKAPKLLIY

RASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGTYLSSNWYWA FGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVS GFSFNNDYDMCWIRQPPGKGLEWIGCIDTGDGSTYYASWAKG RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREAASSSGYGMGYFDL WGQGTLVTVSS

38-27-A11

SEQ ID NO: 59 HCDR1 GFSFSANYYPC

(H27-H42; numeração AHo)

SEQ ID NO: 60 HCDR2 CIYGGSSDITYDANWTK

(H57-H76; numeração AHo)

SEQ ID NO: 61 HCDR3 RSAWYSGWGGDL

(H108-H138; numeração AHo)

SEQ ID NO: 62 HCDR1 ASGFSFSANYY

(Definição AHo)

SEQ ID NO: 63 HCDR2 IYGGSSDITYDANWTKG

(Definição AHo)

SEQ ID NO: 64 HCDR3 SAWYSGWGGD

(Definição AHo)

SEQ ID NO: 65 HCDR1 ANYYPC

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 66 HCDR2 CIYGGSSDITYDANWTK

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 67 HCDR3 SAWYSGWGGDL

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 68 HCDR1 GFSFSANY

(Definição de Chothia)

SEQ ID NO: 69 HCDR2 GGSS

(Definição de Chothia)

SEQ ID NO: 70 HCDR3 AWYSGWGGD

(Definição de Chothia) SEQ ID NO: 71 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSANYYPCWVRQAPGKGLEWIG

CIYGGSSDITYDANWTKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCA (VH 3)

RSAWYSGWGGDL WGQGTLVTVSS (38-27-A11 sc02) SEQ ID NO: 72 VH ESQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSANYYPCWVRQAPGKGLEWIG

CIYGGSSDITYDANWTKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCA (VH 3)

RSAWYSGWGGDL WGPGTLVTVSS (38-27-A11 sc03) SEQ ID NO: 73 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSANYYPCWVRQAPGKCLEWIG

CIYGGSSDITYDANWTKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCA (VH 3)

RSAWYSGWGGDLWGQGTLVTVSS (38-27-A11 sc07) (G51C) SEQ ID NO: 74 LCDR1 QASQSISNRLA (L24-L42; numeração AHo)

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 75 LCDR2 SASTLAS

(L58-L72; numeração AHo)

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 76 LCDR3 QSTYYGNDGNA

(L107-L138; numeração AHo)

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 77 LCDR1 ASQSISNR

(Definição AHo)

SEQ ID NO: 78 LCDR2 SASTLASGVPSR

(Definição AHo)

SEQ ID NO: 79 LCDR3 TYYGNDGN

(Definição AHo)

SEQ ID NO: 80 LCDR1 SQSISNR (Definição de Chothia) SEQ ID NO: 81 LCDR2 SAS (Definição de Chothia) SEQ ID NO: 82 LCDR3 TYYGNDGN (Definição de Chothia) SEQ ID NO: 83 V L DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISNRLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTLAS

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSTYYGNDGNAFGTGTKVTVLG (Vk1-sk17) (38-27-A11 sc02) SEQ ID NO: 84 V L DFQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISNRLAWYQQKPGKPPKLLIYSASTLAS

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSTYYGNDGNA FGTGTKVTVLG (Vk1-sk17) (38-27-A11 sc03)

SEQ ID NO: 85 V L DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISNRLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTLAS

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSTYYGNDGNAFGCGTKVTVLG (Vk1-sk17) (38-27-A11 sc07) (T141C) SEQ ID NO: 86 scFv (VL-ligante-VH) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISNRLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTLAS

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSTYYGNDGNA (38-27-A11 sc02)

FGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (PRO1359)

GFSFSANYYPCWVRQAPGKGLEWIGCIYGGSSDITYDANWTK

GRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAWYSGWGGDLWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 87 scFv (VL-ligante-VH) DFQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISNRLAWYQQKPGKPPKLLIYSASTLAS

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSTYYGNDGNA (38-27-A11 sc03)

FGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSESQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (PRO1360)

GFSFSANYYPCWVRQAPGKGLEWIGCIYGGSSDITYDANWTK

GRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARSAWYSGWGGDLWGPGTLVTVSS SEQ ID NO: 88 scFv (VL-ligante-VH) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISNRLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTLAS

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSTYYGNDGNA (38- 27-A11 SC07)

FGCGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS

(VL-T141C; VH-G51C) GFSFSANYYPCWVRQAPGKCLEWIGCIYGGSSDITYDANWTK

GRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAWYSGWGGDLWGQGTLVTVSS (PRO1704) TABELA 2. Exemplos de domínios de ligação a PDL1 da presente invenção (resíduos de CDR mostrados em negrito e itálico).

SEQ ID NÚMERO Região Ab Sequência 37-20-B03 SEQ ID NO: 89 HCDR1 GFSFNSDYWIY (H27-H42; numeração AHo) SEQ ID NO: 90 HCDR2 SIYGGSSGNTQYASWAQG (H57-H76; numeração AHo) SEQ ID NO: 91 HCDR3 RGYVDYGGATDL

(H108-H138; numeração AHo)

SEQ ID NO: 92 HCDR1 VSGFSFNSDYW

(Definição AHo)

(37-20-B03 sc01)

SEQ ID NO: 93 HCDR1 ASGFSFNSDYW

(Definição AHo)

(37-20-B03 sc02)

(37-20-B03 sc09.1)

SEQ ID NO: 94 HCDR2 IYGGSSGNTQYASWAQGR

(Definição AHo)

SEQ ID NO: 95 HCDR3 GYVDYGGATD

(Definição AHo)

SEQ ID NO: 96 HCDR1 SDYWIY

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 97 HCDR2 SIYGGSSGNTQYASWAQG

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 98 HCDR3 GYVDYGGATDL

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 99 HCDR1 GFSFNSDY

(Definição de Chothia)

SEQ ID NO: HCDR2 GGSSG 100 (Definição de Chothia)

SEQ ID NO: HCDR3 YVDYGGATD 101

(Definição de Chothia) SEQ ID NO: VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFNSDYWIYWIRQPPGKGLEWIG 102 SIYGGSSGNTQYASWAQGRVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCA (VH4)

RGYVDYGGATDL WGQGTLVTVSS (37-20-B03 sc01) SEQ ID NO: VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSFNSDYWIYWVRQAPGQGLEWMG 103 SIYGGSSGNTQYASWAQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCA (VH1)

RGYVDYGGATDL WGQGTLVTVSS (37-20-B03 sc02) SEQ ID NO: VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFNSDYWIYWVRQAPGKGLEWIA 104 SIYGGSSGNTQYASWAQGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCA (VH 3)

RGYVDYGGATDL WGQGTLVTVSS (37-20-B03 sc09.1) Mutações: G56A; Y105F SEQ ID NO: LCDR1 QASQSIGTYLA 105

(L24-L42; numeração AHo)

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: LCDR2 RAFILAS 106 (L58-L72; numeração AHo)

(Definição K abat)

SEQ ID NO: LCDR3 QSNFYSDSTTIGPNA 107 (L107-L138; numeração AHo)

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: LCDR1 ASQSIGTY 108 (Definição AHo)

SEQ ID NO: LCDR2 RAFILASGVPSR 109 (Definição AHo) SEQ ID NO: LCDR3 NFYSDSTTIGPN 110 (Definição AHo) SEQ ID NO: LCDR1 SQSIGTY 111 (Definição de Chothia) SEQ ID NO: LCDR2 RAF 112 (Definição de Chothia) SEQ ID NO: LCDR3 NFYSDSTTIGPN 113 (Definição de Chothia) SEQ ID NO: VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSIGTYLAWYQQKPGKAPKLLIYRAFILAS 114 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSNFYSDSTTIGPNA (Vk1-sk17)

FGTGTKVTVLG

(37-20-B03 sc01) (37-20-B03 sc02) SEQ ID NO: VL DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCQASQSIGTYLAWYQQKPGKPPKLLIYRAFILAS 115 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSNFYSDSTTIGPNA (Vk1-sk17)

FGTGTKVTVLG (37-20-B03 sc0 9.1) Mutações: S9A; A51P SEQ ID NO: scFv (VL-ligante- DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSIGTYLAWYQQKPGKAPKLLIYRAFILAS 116 VH) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSNFYSDSTTIGPNA

FGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVS (37-20-B03 sc01)

GFSFNSDYWIYWIRQPPGKGLEWIGSIYGGSSGNTQYASWAQG (PRO997)

RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYVDYGGATDLWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: scFv (VL-ligante- DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSIGTYLAWYQQKPGKAPKLLIYRAFILAS 117 VH) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSNFYSDSTTIGPNA

FGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (37-20-B03 sc02)

GFSFNSDYWIYWVRQAPGQGLEWMGSIYGGSSGNTQYASWAQG (PRO1013)

RVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYVDYGGATDLWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: scFv (VL-ligante- DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCQASQSIGTYLAWYQQKPGKPPKLLIYRAFILAS 118 VH) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSNFYSDSTTIGPNA

FGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (37-20-B03 sc09.1)

GFSFNSDYWIYWVRQAPGKGLEWIASIYGGSSGNTQYASWAQG

RFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGYVDYGGATDLWGQGTLVTVSS 33-03-G02 SEQ ID NO: HCDR1 GFSFSSGYDMC 119 (H27-H42; numeração AHo) SEQ ID NO: HCDR2 CVVAGSVDITYYASWAKG 120 (H57-H76; numeração AHo) SEQ ID NO: HCDR3 RKDAYSDAFNL 121 (H108-H138; numeração AHo)

SEQ ID NO: HCDR1 VSGFSFSSGYD 122 (Definição AHo)

(33-03-G02 SC01)

SEQ ID NO: HCDR1 ASGFSFSSGYD 123 (Definição AHo)

(33-03-G02 sc03 completa)

(33-03 -G02 SC18)

SEQ ID NO: HCDR2 VVAGSVDITYYASWAKGR 124 (Definição AHo)

SEQ ID NO: HCDR3 KDAYSDAFN 125 (Definição AHo)

SEQ ID NO: HCDR1 SGYDMC 126 (Definição de Kabat)

SEQ ID NO: HCDR2 CVVAGSVDITYYASWAKG 127 (Definição de Kabat)

SEQ ID NO: HCDR3 KDAYSDAFNL 128 (Definição de Kabat)

SEQ ID NO: HCDR1 GFSFSSGY 129 (Definição de Chothia)

SEQ ID NO: HCDR2 AGSVD 130 (Definição de Chothia)

SEQ ID NO: HCDR3 DAYSDAFN 131 (Definição de Chothia)

SEQ ID NO: VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSSGYDMCWIRQPPGKGLEWIG 132 CVVAGSVDITYYASWAKGRVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCA (VH4)

RKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSS (33-03-G02 SC01) SEQ ID NO: 1 VH QSQLQESGPGLVKPSETLSLTCKASGFSFSSGYDMCWVRQPPGKGLEWIA 33 CVVAGSVDITYYASWAKGRVTISKDSSKNQVSLKLSSVTAADTAVYFCA (VH4)

RKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSS (33-03-G02 sc03 completa) (Mutações: V2S; V25A; I44V; G56A; V82K; F89V; Y105F) SEQ ID NO: 1 VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKASGFSFSSGYDMCWVRQPPGKGLEWIA 34 CVVAGSVDITYYASWAKGRVTISKDSSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCA (VH 4)

RKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSS (33-03-G02 sc18) Mutações VH: V25A; I44; G56A; V82K;

F89V (numeração AHo)

SEQ ID NO: 1 LCDR1 QASQSINDYLA 35 (L24-L42; numeração AHo)

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 1 LCDR2 KASTLAS 36 (L58-L72; numeração AHo)

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: 1 LCDR3 QQGYIITDIDNV 37 (L107-L138; numeração AHo)

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: LCDR1 AHo: ASQSINDY 138 (Definição AHo)

SEQ ID NO: LCDR2 AHo: KASTLAS GVPSR 139 (Definição AHo)

SEQ ID NO: LCDR3 AHo: GYIITDIDN 140 (Definição AHo)

SEQ ID NO: LCDR1 SQSINDY 141 (Definição de Chothia)

SEQ ID NO: LCDR2 KAS 142 (Definição de Chothia)

SEQ ID NO: LCDR3 GYIITDIDN 143 (Definição de Chothia) SEQ ID NO: VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLAS 144 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLG (Vk1-sk17) (33-03-G02 SC01) (33-03-G02 sc18) SEQ ID NO: VL DFQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKSPKLLIYKASTLAS 145 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLG (Vk1-sk17) (33-03-G02 sc03 completa) (Mutações VL: I2F; M4L; A51P) SEQ ID NO: scFv (VL-ligante- DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLAS 146 VH) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNV

FGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVS

(33-03-G02 SC01) GFSFSSGYDMCWIRQPPGKGLEWIGCVVAGSVDITYYASWAKG

RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSS (PRO830) SEQ ID NO: scFv (VL-ligante- DFQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKSPKLLIYKASTLAS 147 VH) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNV (33-03-G02 sc03 FGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSQLQESGPGLVKPSETLSLTCKAS

GFSFSSGYDMCWVRQPPGKGLEWIACVVAGSVDITYYASWAKG completa)

RVTISKDSSKNQVSLKLSSVTAADTAVYFCARKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: scFv (VL-ligante- DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC QASQSINDYLA WYQQKPGKAPKLLIY KASTLAS 148 VH) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQGYIITDIDNV

FGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKAS (33-03- G02 sc1 8)

GFSFSSGYDMC WVRQPPGKGLEWIA CVVAGSVDITYYASWAKG

RVTISKDSSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCA RKDAYSDAFNL WGQGTLVTVSS TABELA 3. Exemplos de domínios de ligação à albumina sérica humana da presente invenção (resíduos de CDR mostrados em negrito e itálico).

SEQ ID Região Ab Sequência

NÚMERO

19-01-H04 sc03

SEQ ID NO: HCDR1 GFSLSSNAMG 149 (H27-H42; numeração AHo)

SEQ ID NO: HCDR2 IISVGGFTYYASWAKG 150 (H57-H76; numeração AHo)

SEQ ID NO: HCDR3 RDRHGGDSSGAFYL 151 (H108-H138; numeração AHo)

SEQ ID NO: HCDR1 ASGFSLSSNA 152 (Definição AHo)

SEQ ID NO: HCDR2 ISVGGFTYYASWAKGR 153 (Definição AHo)

SEQ ID NO: HCDR3 DRHGGDSSGAFY 154 (Definição AHo)

SEQ ID NO: HCDR1 SNAMG 155 (Definição de Kabat)

SEQ ID NO: HCDR2 IISVGGFTYYASWAKG 156 (Definição de Kabat)

SEQ ID NO: HCDR3 DRHGGDSSGAFYL 157 (Definição de Kabat)

SEQ ID NO: HCDR1 GFSLSSN 158 (Definição de Chothia)

SEQ ID NO: HCDR2 VGG 159 (Definição de Chothia)

SEQ ID NO: HCDR3 RDRHGGDSSGAFY 160 (Definição de Chothia) SEQ ID NO: VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSNAMGWVRQAPGKGLEYIG 161 IISVGGFTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCA

RDRHGGDSSGAFYLWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: LCDR1 QSSESVYSNNQLS 162 (L24-L42; numeração AHo) (Definição de Kabat) SEQ ID NO: LCDR2 DASDLAS 163 (L58-L72; numeração AHo) (Definição de Kabat) SEQ ID NO: LCDR3 AGGFSSSSDTA 164

(L107-L138; numeração AHo)

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: LCDR1 SSESVYSNNQ 165 (Definição AHo)

SEQ ID NO: LCDR2 DASDLAS GVPSR 166 (Definição AHo)

SEQ ID NO: LCDR3 GFSSSSDT 167 (Definição AHo)

SEQ ID NO: LCDR1 SESVYSNNQ 168 Definição de Chothia)

SEQ ID NO: LCDR2 DAS 169 (Definição de Chothia)

SEQ ID NO: LCDR3 GFSSSSDT 170 (Definição de Chothia) SEQ ID NO: VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYSNNQLSWYQQKPGQPPKLLIY 171 DASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGFSSSSDTA

FGGGTKLTVLG SEQ ID NO: scFv (VL-ligante-VH) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYSNNQLSWYQQKPGQPPKLLIY 172 DASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGFSSSSDTA

FGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFSLSSNAMGWVRQAPGKGLEYIGIISVGGFTYYASWAKG

RFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARDRHGGDSSGAFYLWGQGTLVTVSS 23-13-A01 sc03 SEQ ID NO: HCDR1 GFSFSSSYWIC 173 (H27-H42; numeração AHo)

SEQ ID NO: HCDR2 CVFTGDGTTYYASWAKG 174 (H57-H76; numeração AHo)

SEQ ID NO: HCDR3 RPVSVYYYGMDL 175 (H108-H138; numeração AHo)

SEQ ID NO: HCDR1 ASGFSFSSSYW 176 (Definição AHo)

SEQ ID NO: HCDR2 VFTGDGTTYYASWAKGR 177 (Definição AHo)

SEQ ID NO: HCDR3 PVSVYYYGMD 178 (Definição AHo)

SEQ ID NO: HCDR1 SSYWIC 179 (Definição de Kabat)

SEQ ID NO: HCDR2 CVFTGDGTTYYASWAKG 180 (Definição de Kabat) SEQ ID NO: HCDR3 PVSVYYYGMDL 181 (Definição de Kabat) SEQ ID NO: HCDR1 GFSFSSSYW 182 (Definição de Chothia) SEQ ID NO: HCDR2 TGDG 183 (Definição de Chothia) SEQ ID NO: HCDR3 VSVYYYGMD 184 (Definição de Chothia) SEQ ID NO: VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSSYWICWVRQAPGKGLEWVG 185 CVFTGDGTTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCA

RPVSVYYYGMDLWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: LCDR1 QASQIISSRSA 186 (L24-L42; numeração AHo)

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: LCDR2 QASKLAS 187 (L58-L72; numeração AHo)

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: LCDR3 QCTYIDSNFGA 188 (L107-L138; numeração AHo)

(Definição de Kabat)

SEQ ID NO: LCDR1 ASQIISSR 189 (Definição AHo)

SEQ ID NO: LCDR2 QASKLAS GVPSR 190 (Definição AHo) SEQ ID NO: LCDR3 TYIDSNFG 191 (Definição AHo) SEQ ID NO: LCDR1 SQIISSR 192 (Definição de Chothia) SEQ ID NO: LCDR2 QAS 193 (Definição de Chothia) SEQ ID NO: LCDR3 TYIDSNFG 194 (Definição de Chothia) SEQ ID NO: VL DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQIISSRSAWYQQKPGQPPKLLIY 195 QASKLASGVPSRFSGSGSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQCTYIDSNFGA

FGGGTKLTVLG

SEQ ID NO: scFv (VL-ligante-VH) DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQIISSRSAWYQQKPGQPPKLLIYQASKLAS 196 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQCTYIDSNFGAFGGGTKLTVLG

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSSYWIC WVRQAPGKGLEWVGCVFTGDGTTYYASWAKG

RFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARPVSVYYYGMDLWGQGTLVTVSS TABELA 4. Outras sequências relacionadas à presente invenção.

SEQ ID Região Ab Sequência

NUMBER SEQ ID NO: CD137 humana MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQR 197 TCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDC

CFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPARE PGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDG

CSCRFPEEEEGGCEL SEQ ID NO: PDL1 humana MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEME 198 DKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGG

ADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTT TTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTH

LVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET SEQ ID NO: FR4 baseado em linha FGTGTKVTVLG 199 germinativa Vλ (Sk17) SEQ ID NO: FR4 baseado em linha FGGGTKLTVLG 200 germinativa Vλ (Sk12) SEQ ID NO: FR4 baseado em linha FGGGTQLIILG 201 germinativa Vλ SEQ ID NO: FR4 baseado em linha FGEGTELTVLG 202 germinativa Vλ SEQ ID NO: FR4 baseado em linha FGSGTKVTVLG 203 germinativa Vλ SEQ ID NO: FR4 baseado em linha FGGGTQLTVLG 204 germinativa Vλ

SEQ ID NO: FR4 baseado em linha FGGGTQLTALG 205 germinativa Vλ SEQ ID NO: Ligante GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 206 SEQ ID NO: Ligante GGGGS 207 SEQ ID NO: Ligante GGGGSGGGGS 208 Tabela 5. Exemplos de moléculas multiespecíficas e IgGs da presente invenção.

SEQ ID Formato Ab Sequência

NUMBER PRO885 (38-02-A04 sc01 scDb-i/33-03-G02 sc01 scDb-o) SEQ ID NO: scDb DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSG 209 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLGGGGGS

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSNSYWICWIRQPPGKGLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKG RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIY RASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGDFGTGTKVTVLGGGGGS QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSSGYDMCWIRQPPGKGLEWIGCVVAGSVDITYYASWAKG

RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSS PRO951 (38-27-C05 sc02 scDb-i/33-03-G02 sc01 scDb-o) SEQ ID NO: scDb DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSG 210 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLGGGGGS

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFNNDYDMCWVRQAPGKGLEWIGCIDTGDGSTYYASWAKGR FTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAREAASSSGYGMGYFDLWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVYDNNWLAWYQQKPGKAPKLL IYRASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGTYLSSNWYWAFGTGTKVTVLG GGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSSGYDMCWIRQPPGKGLEWIGCVVAGSVDITYYA

SWAKGRVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSS PRO1123 (38-02-A04 SC05 IF scDb-i/33-03-G02 SC01 scDb-o) SEQ ID NO: scDb DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSG 211 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLGGGGGS

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSNSYWICWVRQPPGKGLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKG RVTISVDSSKNQVSLKLSSVTAADTAVYFCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKPPKLLIY RASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGDFGTGTKVTVLGGGGGS QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSSGYDMCWIRQPPGKGLEWIGCVVAGSVDITYYASWAKG

RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSS PRO1124 (38-02-A04 SC06 completo scDb-i/33-03-G02 SC01 scDb-o) SEQ ID NO: scDb DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSG 212 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLGGGGGS

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKASGFSFSNSYWICWVRQPPGKGLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKG RVTISKDSSKNQVSLKLSSVTAADTAVYFCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKPPKLLIY RASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGDFGTGTKVTVLGGGGGS QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSSGYDMCWIRQPPGKGLEWIGCVVAGSVDITYYASWAKG

RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSS PRO1125 (38-02-A04 SC01 scDb-i/33-03-G02 SC02 IF scDb-o)

SEQ ID NO: scDb DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKSPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSG 213 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLGGGGGS

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSNSYWICWIRQPPGKGLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKG RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIY RASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGDFGTGTKVTVLGGGGGS QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSSGYDMCWVRQPPGKGLEWIACVVAGSVDITYYASWAKG

RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYFCARKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSS PRO1126 (38-02-A04 SC01 scDb-i/33-03-G02 sc03 completa scDb-o) SEQ ID NO: scDb DFQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKSPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSG 214 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLGGGGGS

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSNSYWICWIRQPPGKGLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKG RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIY RASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGDFGTGTKVTVLGGGGGS QSQLQESGPGLVKPSETLSLTCKASGFSFSSGYDMCWVRQPPGKGLEWIACVVAGSVDITYYASWAKG RVTISKDSSKNQVSLKLSSVTAADTAVYFCARKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSS

PRO1134 (38-02 A04-SC01 scDb-i/33-03-G02 SC07 GL VH3 scDb-O) SEQ ID NO: scDb DIQMTQSPSSLSASVGDAVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKSPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSG 215 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLGGGGGS

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSNSYWICWIRQPPGKGLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKG RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIY RASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGDFGTGTKVTVLGGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSGYDMCWVRQAPGKGLEWVGCVVAGSVDITYYASWAKG

RFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARKDAYSDAFNLWGPGTLVTVSS PRO963 (= PRO1051) (38-02-A04 sc01 scDb-i/33-03-G02 sc01 scDb-o/19-01-H04-sc03 scFv) SEQ ID NO: scDb-scFv DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSG 216 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLGGGGGS

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSNSYWICWIRQPPGKGLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKG RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIY RASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGDFGTGTKVTVLGGGGGS QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSSGYDMCWIRQPPGKGLEWIGCVVAGSVDITYYASWAKG RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYSNNQLSWYQQKPGQPPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGFSSSSDTAFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSNAMGWVRQAPGKGLEYIGIISVGGFTYYASWAKGRFT

ISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARDRHGGDSSGAFYLWGQGTLVTVSS PRO966 (= PRO1052) (38-27-C05 sc01 scDb-i/33-03-G02 sc01 scDb-o/19-01-H04-sc03 scFv) SEQ ID NO: scDb-scFv DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSG 217 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLGGGGGS

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFNNDYDMCWIRQPPGKGLEWIGCIDTGDGSTYYASWAKGR VTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREAASSSGYGMGYFDLWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVYDNNWLAWYQQKPGKAPKLL IYRASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGTYLSSNWYWAFGTGTKVTVLG GGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSSGYDMCWIRQPPGKGLEWIGCVVAGSVDITYYA SWAKGRVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYSNNQLSWYQQKPGQPPKLLIYDASDLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGFSSSSDTAFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSNAMGWVRQAPGKGLEYIGIISVGGFTYYASWA KGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARDRHGGDSSGAFYLWGQGTLVTVSS

PRO1057 (38-02-A04 SC01 scDb-i/33-03-G02 SC01 scDb-o/23- 12 -A01-sc03, sk17sh4) SEQ ID NO: scDb-scFv DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSG 218 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLGGGGGS

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSNSYWICWIRQPPGKGLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKG RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGDFGTGTKVTVLGGGGGS QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSSGYDMCWIRQPPGKGLEWIGCVVAGSVDITYYASWAKG RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGS VVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQIISSRSAWYQQKPGQPPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQCTYIDSNFGAFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVES GGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSSYWICWVRQAPGKGLEWVGCVFTGDGTTYYASWAKGRFTISRDN

SKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARPVSVYYYGMDLWGQGTLVTVSS PRO1058 (38-27-C05 sc01 scDb-i/33-03-G02 sc01 scDb-o/23-13-A01-sc03, sk17sh4) SEQ ID NO: scDb-scFv DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSG 219 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLGGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSL

TCKVSGFSFNNDYDMCWIRQPPGKGLEWIGCIDTGDGSTYYASWAKGRVTISVDSSKNQFSLKLSSVT AADTAVYYCAREAASSSGYGMGYFDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLS ASVGDRVTITCQSSQSVYDNNWLAWYQQKPGKAPKLLIYRASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQGTYLSSNWYWAFGTGTKVTVLGGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFS SGYDMCWIRQPPGKGLEWIGCVVAGSVDITYYASWAKGRVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC ARKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQIISSRSAWY QQKPGQPPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQCTYIDSNFGAFGGGT KLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSSYWICWVRQAP GKGLEWVGCVFTGDGTTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAE

DTATYFCARPVSVYYYGMDLWGQGTLVTVSS PRO1175 (37-20-B03-sc01-o/38-02-A04 sc01-i/19-01-H04sc03 scFv) SEQ ID NO: scDb-scFv DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSIGTYLAWYQQKPGKAPKLLIYRAFILASGVPSRFSGSGSG 220 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQSNFYSDSTTIGPNAFGTGTKVTVLGGGGGSQVQLQESGPGLVKPSET

LSLTCKVSGFSFSNSYWICWIRQPPGKGLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKGRVTISVDSSKNQFSLKL SSVTAADTAVYYCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQSSYGNYGDFGTGTKVTVLGGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFNSDY WIYWIRQPPGKGLEWIGSIYGGSSGNTQYASWAQGRVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARG YVDYGGATDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYSNNQLSWY QQKPGQPPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGFSSSSDTAFGGGT KLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSNAMGWVRQAPG KGLEYIGIISVGGFTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARDRHGGDSSGAFYL

WGQGTLVTVSS PRO11 86 (38-02-A04 sc01 scDb-i/37-20-B03sc01 scDb-o/23-13-A01-sc03 scFv) SEQ ID NO: scDb-scFv DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSIGTYLAWYQQKPGKAPKLLIYRAFILASGVPSRFSGSGSG 221 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQSNFYSDSTTIGPNAFGTGTKVTVLGGGGGSQVQLQESGPGLVKPSET

LSLTCKVSGFSFSNSYWICWIRQPPGKGLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKGRVTISVDSSKNQFSLKL SSVTAADTAVYYCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPS SLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQSSYGNYGDFGTGTKVTVLGGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFNSD YWIYWIRQPPGKGLEWIGSIYGGSSGNTQYASWAQGRVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR GYVDYGGATDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQIISSRSAWYQ QKPGQPPKLLIYQASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQCTYIDSNFGAFGGGTK LTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSSYWICWVRQAPG KGLEWVGCVFTGDGTTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARPVSVYYYGMDLW

GQGTLVTVSS PRO1430 (38-02-A04 sc 1 3 scDb-i/37-20-B03 sc01 scDb-o/19-01-H04 sc03 scFv)

SEQ ID NO: scDb-scFv DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSIGTYLAWYQQKPGKAPKLLIYRAFILASGVPSRFSGSGSG 222 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQSNFYSDSTTIGPNAFGTGTKVTVLGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGS

LRLSCAASGFSFSNSYWICWVRQAPGKCLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKGRFTISRDNSKNTVYLQM NSLRAEDTAVYYCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQSSYGNYGDFGCGTKVTVLGGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFNSDY WIYWIRQPPGKGLEWIGSIYGGSSGNTQYASWAQGRVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARG YVDYGGATDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYSNNQLSWY QQKPGQPPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGFSSSSDTAFGGGT KLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSNAMGWVRQAPG KGLEYIGIISVGGFTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARDRHGGDSSGAFYL

WGQGTLVTVSS PRO1479 (38-02-A04 sc 1 3 scDb-i/37-20-B03 sc0 9. 1 scDb-o/19-01-H04 sc03 scFv) SEQ ID NO: scDb-scFv DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCQASQSIGTYLAWYQQKPGKPPKLLIYRAFILASGVPSRFSGSGSG 223 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQSNFYSDSTTIGPNAFGTGTKVTVLGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGS

LRLSCAASGFSFSNSYWICWVRQAPGKCLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKGRFTISRDNSKNTVYLQM NSLRAEDTAVYYCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQSSYGNYGDFGCGTKVTVLGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFNSDY WIYWVRQAPGKGLEWIASIYGGSSGNTQYASWAQGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARG YVDYGGATDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYSNNQLSWY QQKPGQPPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGFSSSSDTAFGGGT KLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSNAMGWVRQAPG KGLEYIGIISVGGFTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARDRHGGDSSGAFYL

WGQGTLVTVSS PRO1482 (37-20-B03 sc0 9. 1 scDb- i/38-02-A04 sc 1 3 scDb- o// 19-01-H04 sc03 scFv) SEQ ID NO: scDb-scFv DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSG 224 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGDFGCGTKVTVLGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA

ASGFSFNSDYWIYWVRQAPGKGLEWIASIYGGSSGNTQYASWAQGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAE DTAVYFCARGYVDYGGATDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPASLSASVGDR VTITCQASQSIGTYLAWYQQKPGKPPKLLIYRAFILASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQSNFYSDSTTIGPNAFGTGTKVTVLGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSNSYWI CWVRQAPGKCLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARHPS DAVYGYANNLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYSNNQLSWY QQKPGQPPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGFSSSSDTAFGGGT KLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSNAMGWVRQAPG KGLEYIGIISVGGFTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARDRHGGDSSGAFYL

WGQGTLVTVSS PRO1431 (38-02-A04 sc 1 3 scDb-i/33-03-G02 sc18 scDb-o/19-01-H04 sc03 scFv) SEQ ID NO: scDb-scFv DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSG 225 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRL

SCAASGFSFSNSYWICWVRQAPGKCLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSL RAEDTAVYYCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSA SVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DFATYYCQSSYGNYGDFGCGTKVTVLGGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKASGFSFSSGYDMC WVRQPPGKGLEWIACVVAGSVDITYYASWAKGRVTISKDSSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARKDAY SDAFNLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYSNNQLSWYQQKP GQPPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGFSSSSDTAFGGGTKLTV LGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSNAMGWVRQAPGKGLE YIGIISVGGFTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARDRHGGDSSGAFYLWGQG

TLVTVSS PRO1473 (38-02-A04 sc 1 3 scDb-i/33-03-G02 sc03 scDb-o/19-01-H04 sc03 scFv)

SEQ ID NO: scDb-scFv DFQLTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKSPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSG 226 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRL

SCAASGFSFSNSYWICWVRQAPGKCLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSL RAEDTAVYYCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSA SVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DFATYYCQSSYGNYGDFGCGTKVTVLGGGGGSQSQLQESGPGLVKPSETLSLTCKASGFSFSSGYDMC WVRQPPGKGLEWIACVVAGSVDITYYASWAKGRVTISKDSSKNQVSLKLSSVTAADTAVYFCARKDAY SDAFNLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYSNNQLSWYQQKP GQPPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGFSSSSDTAFGGGTKLTV LGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSNAMGWVRQAPGKGLE YIGIISVGGFTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARDRHGGDSSGAFYLWGQG

TLVTVSS PRO1476 (33-03-G02 sc03 scDb- i/38-02-A04 sc 1 3 scDb-o/19-01-H04 sc03 scFv) SEQ ID NO: scDb-scFv DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSG 227 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGDFGCGTKVTVLGGGGGSQSQLQESGPGLVKPSETLSLTCK

ASGFSFSSGYDMCWVRQPPGKGLEWIACVVAGSVDITYYASWAKGRVTISKDSSKNQVSLKLSSVTAA DTAVYFCARKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSFQLTQSPSSLSASVGDRV TITCQASQSINDYLAWYQQKPGKSPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYY CQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSNSYWICWVR QAPGKCLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARHPSDAVY GYANNLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYSNNQLSWYQQKP GQPPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGFSSSSDTAFGGGTKLTV LGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSNAMGWVRQAPGKGLE YIGIISVGGFTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARDRHGGDSSGAFYLWGQG

TLVTVSS PRO1432 (33-03-G02 sc18 scDb- i/38-02-A04 sc 1 3 scDb-o/19-01-H04 sc03 scFv) SEQ ID NO: scDb-scFv DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSG 228 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGDFGCGTKVTVLGGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCK

ASGFSFSSGYDMCWVRQPPGKGLEWIACVVAGSVDITYYASWAKGRVTISKDSSKNQVSLKLSSVTAA DTAVYYCARKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRV TITCQASQSINDYLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYY CQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSNSYWICWVR QAPGKCLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARHPSDAVY GYANNLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYSNNQLSWYQQKP GQPPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGFSSSSDTAFGGGTKLTV LGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSNAMGWVRQAPGKGLE YIGIISVGGFTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARDRHGGDSSGAFYLWGQG

TLVTVSS PRO1480 (38-27-A11 sc02 scDb- i/37-20-B03 sc09.1 scDb-o/19-01-H04 sc03 scFv) SEQ ID NO: scDb-scFv DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCQASQSIGTYLAWYQQKPGKPPKLLIYRAFILASGVPSRFSGSGSG 229 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQSNFYSDSTTIGPNAFGTGTKVTVLGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGS

LRLSCAASGFSFSANYYPCWVRQAPGKGLEWIGCIYGGSSDITYDANWTKGRFTISRDNSKNTVYLQM NSLRAEDTAVYYCARSAWYSGWGGDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLS ASVGDRVTITCQASQSISNRLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQSTYYGNDGNAFGTGTKVTVLGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFNSDY WIYWVRQAPGKGLEWIASIYGGSSGNTQYASWAQGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARG YVDYGGATDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYSNNQLSWY QQKPGQPPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGFSSSSDTAFGGGT KLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSNAMGWVRQAPG KGLEYIGIISVGGFTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARDRHGGDSSGAFYL

WGQGTLVTVSS PRO1481 (38-27-A11 sc03 scDb- i/37-20-B03 sc09.1 scDb-o/19-01-H04 sc03 scFv)

SEQ ID NO: scDb-scFv DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCQASQSIGTYLAWYQQKPGKPPKLLIYRAFILASGVPSRFSGSGSG 230 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQSNFYSDSTTIGPNAFGTGTKVTVLGGGGGSESQLVESGGGLVQPGGS

LRLSCAASGFSFSANYYPCWVRQAPGKGLEWIGCIYGGSSDITYDANWTKGRFTISRDNSKNTVYLQM NSLRAEDTAVYFCARSAWYSGWGGDLWGPGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSFQLTQSPSSLS ASVGDRVTITCQASQSISNRLAWYQQKPGKPPKLLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQSTYYGNDGNAFGTGTKVTVLGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFNSDY WIYWVRQAPGKGLEWIASIYGGSSGNTQYASWAQGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARG YVDYGGATDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYSNNQLSWY QQKPGQPPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGFSSSSDTAFGGGT KLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSNAMGWVRQAPG KGLEYIGIISVGGFTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARDRHGGDSSGAFYL

WGQGTLVTVSS PRO 1480diS (38-27 A11-SC07 scDb- i/37-20-B03 sc09.1 scDb-O/19-01-H04 sc03 scFv) SEQ ID NO: scDb-scFv DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCQASQSIGTYLAWYQQKPGKPPKLLIYRAFILASGVPSRFSGSGSG 231 TDFTLTISSLQPEDFATYYCQSNFYSDSTTIGPNAFGTGTKVTVLGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGS

LRLSCAASGFSFSANYYPCWVRQAPGKCLEWIGCIYGGSSDITYDANWTKGRFTISRDNSKNTVYLQM NSLRAEDTAVYYCARSAWYSGWGGDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLS ASVGDRVTITCQASQSISNRLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYCQSTYYGNDGNAFGCGTKVTVLGGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFNSDY WIYWVRQAPGKGLEWIASIYGGSSGNTQYASWAQGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARG YVDYGGATDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYSNNQLSWY QQKPGQPPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGFSSSSDTAFGGGT KLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSNAMGWVRQAPG KGLEYIGIISVGGFTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARDRHGGDSSGAFYL

WGQGTLVTVSS PRO1059 (LC 33G-Ig02 IgG1 com 38-02-A04 sc01 scFV, PDL1/CD137 (scFv) Morrison silencioso) SEQ ID NO: Cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSG 232 Morrison-L TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLGTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV

CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKL LIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGDFGTGTKVTVLGGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSNSYWICWIRQPPGKGLEWIGCTFV GSSDSTYYANWAKGRVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTV SS

SEQ ID NO: Cadeia QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSSGYDMCWIRQPPGKGLEWIGCVVAGSVDITYYASWAKG 233 pesada RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS Morrison-L KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC

NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF

FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK PRO1060 (33-03-G02 IgG1 HC com 38-02-A04 sc01 scFV, PDL1/CD137 (scFv) Morrison silencioso) SEQ ID NO: Cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSG 234 Morrison-H TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLGTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV

CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL

SSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: Cadeia QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSSGYDMCWIRQPPGKGLEWIGCVVAGSVDITYYASWAKG 235 pesada RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS Morrison-H KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC

NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVG DRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQSSYGNYGDFGTGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKV SGFSFSNSYWICWIRQPPGKGLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKGRVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAAD

TAVYYCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSS PRO1061 (33-03-G02 sc01 IgG1 LC com 38-27-C05 sc01 scFv, PDL1/CD137 (scFv) Morrison silencioso) SEQ ID NO: Cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSG 236 Morrison-L TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLGTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV

CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKL LIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGDFGTGTKVTVLGGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSNSYWICWIRQPPGKGLEWIGCTFV GSSDSTYYANWAKGRVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTV

SS SEQ ID NO: Cadeia QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSSGYDMCWIRQPPGKGLEWIGCVVAGSVDITYYASWAKG 237 pesada RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS Morrison-L KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC

FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK PRO1062 (33-03-G02 sc01 IgG1 HC com 38-27-C05 sc01 scFv, PDL1/CD137 (scFv) Morrison silencioso) SEQ ID NO: Cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSG 238 Morrison-H TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLGTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV

CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL

SSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: Cadeia QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSSGYDMCWIRQPPGKGLEWIGCVVAGSVDITYYASWAKG 239 pesada RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS Morrison-H KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC

TAVYYCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSS PRO1137 (33-03-G02-sc01 IgG1) SEQ ID NO: IgG de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINDYLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSG 240 cadeia leve TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYIITDIDNVFGTGTKVTVLGTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV

CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL

SSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: IgG de QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSSGYDMCWIRQPPGKGLEWIGCVVAGSVDITYYASWAKG 241 cadeia RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKDAYSDAFNLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS pesada KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC

NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF

FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK PRO11 96 (37-20-B03 sc01 IgG1) SEQ ID NO: IgG de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSIGTYLAWYQQKPGKAPKLLIYRAFILASGVPSRFSGSGSG 242 cadeia leve TDFTLTISSLQPEDFATYYCQSNFYSDSTTIGPNAFGTGTKVTVLGTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA

SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH

QGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: IgG de QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFNSDYWIYWIRQPPGKGLEWIGSIYGGSSGNTQYASWAQG 243 cadeia RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYVDYGGATDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS pesada SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI

CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS

FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK PRO1138 (38-02-A04 sc01 IgG4) SEQ ID NO: IgG de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSINNVLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSG 244 cadeia leve TDFTLTISSLQPEDFATYYCQSSYGNYGDFGTGTKVTVLGTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL

NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP

VTKSFNRGEC SEQ ID NO: IgG de QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCKVSGFSFSNSYWICWIRQPPGKGLEWIGCTFVGSSDSTYYANWAKG 245 cadeia RVTISVDSSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHPSDAVYGYANNLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA pesada PCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKT

YTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF

FLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Em todo o texto deste pedido, se houver uma discrepância entre o texto do relatório descritivo (por exemplo, Tabelas 1 a 5) e a listagem de sequências, o texto do relatório descritivo deverá prevalecer.

[0357] Entende-se que certas características da invenção, que são, para maior clareza, descritas no contexto de concretizações separadas, também podem ser fornecidas em combinação em uma única concretização. Inversamente, várias características da invenção, que são, por uma questão de brevidade, descritas no contexto de uma única concretização, também podem ser fornecidas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada. Todas as combinações das concretizações pertencentes à invenção são especificamente adotadas pela presente invenção e são aqui divulgadas como se cada combinação fosse individual e explicitamente divulgada. Além disso, todos as subconjuntos das várias concretizações e elementos das mesmas também são especificamente adotados pela presente invenção e são divulgados aqui como se cada um desses subconjuntos fosse individual e explicitamente divulgado aqui.

[0358] A presente invenção não deve ser limitada em escopo pelas concretizações específicas aqui descritas. De fato, várias modificações da invenção, além das aqui descritas, tornar-se-ão evidentes para os versados na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações devem estar dentro do escopo das reivindicações anexas.

[0359] Na medida do possível sob a respectiva lei de patentes, todas as patentes, pedidos, publicações, métodos de teste, literatura e outros materiais citados aqui são incorporados por referência.

[0360] Os exemplos a seguir ilustram a invenção descrita acima, mas não pretendem, contudo, limitar o escopo da invenção de nenhuma maneira. Outros modelos de teste conhecidos como tais pelo versado na técnica pertinente também podem determinar os efeitos benéficos da invenção reivindicada.

Exemplos Exemplo 1: Afinidades a PDL1, CD137, HSA e MSA.

Métodos:

[0361] A afinidade com PDL1 das diferentes espécies foi determinada por medições de SPR usando um dispositivo Biacore T200 (GE Healthcare). Um anticorpo específico para a região Fc de IgGs humanos foi imobilizado em um chip sensor (chip sensor CM5, GE Healthcare) por acoplamento de amina. Para todos os formatos, com exceção dos formatos Morrison contendo Fc, a proteína quimérica PDL1-Fc de diferentes espécies foi capturada pelo anticorpo imobilizado. Neste experimento, CD137 humana marcada com Fc (R&D Systems, cat. 838-4B-100) e PDL1 humana marcada com Fc (Sino Biological, cat. 10084-H02H) foram capturadas usando o kit de captura de anticorpos humanos da GE Healthcare (cat. BR-1008-39).

[0362] Diluições em série de três vezes das moléculas específicas para PDL1 (0,12-90 nM) foram injetadas nas células de fluxo por três minutos e a dissociação foi monitorada por 10 minutos. Depois de cada ciclo de injeção, as superfícies foram regeneradas com uma injeção de uma solução 3M MgCl2. As constantes de taxa de dissociação aparente (kd) e de associação (ka) e a constante de equilíbrio de dissociação aparente (KD) foram calculadas usando o modelo de ligação de Langmuir um a um. A afinidade com CD137 das diferentes espécies foi determinada usando a configuração idêntica à da PDL1, com a exceção de que a proteína quimérica CD137-Fc de diferentes espécies foi capturada pelo anticorpo imobilizado.

[0363] Os formatos contendo Fc foram capturados diretamente pelo anticorpo específico para a região Fc das IgGs humanas. Diluições em série duplas do domínio extracelular PDL1 ou domínio extracelular CD137 variando de 90 a 0,35 nM foram testadas quanto à ligação à IgG capturada no chip biossensor. Depois de cada ciclo de injeção, as superfícies foram regeneradas com uma injeção de uma solução 3M MgCl2.

[0364] A afinidade das moléculas com a albumina sérica (SA) das diferentes espécies foi determinada por medições de SPR usando um dispositivo Biacore T200 (GE Healthcare). O SA foi diretamente acoplado a um chip sensor CM5 (GE Healthcare) usando química de acoplamento de amina. Após realizar um exame de regeneração e um teste de desempenho da superfície para encontrar as melhores condições de ensaio, uma resposta à dose foi medida e as curvas de ligação obtidas foram duplamente referenciadas (canal de referência vazio e injeção de analito zero) e ajustadas usando o modelo Langmuir 1:1 para recuperar parâmetros cinéticos. O ensaio foi realizado num tampão 1X PBS-Tween a pH 5,5.

Resultados:

[0365] As afinidades à PDL1 humana dos scDb-scFv são fornecidas na Tabela 6. A ligação à PDL1 humana foi confirmada para todos os scDb-scFv. As medidas da cinética de ligação para as construções humanizadas mostram uma diferença na afinidade de ligação para PDL1 ao comparar os enxertos de CDR e de estrutural (STR) do clone 33-03-G02, o enxerto de STR mostra uma melhoria de 20 vezes na afinidade em comparação com o enxerto de CDR do mesmo clone (PRO885 versus PRO1126 na Tabela 6). O enxerto de CDR derivado do clone 37-20-B03 (PRO997) mostra uma afinidade aproximadamente duas vezes maior quando comparado ao enxerto de STR do clone 33-03-G02. As afinidades de ligação para o enxerto de CDR de 33-03-G02 são semelhantes à afinidade de ligação do scFv parental quando combinadas em diferentes formatos multiespecíficos (compare PRO830 a PRO885, PRO951, PRO1123, PRO1124, PRO963, PRO966, PRO1057, PRO1058, PRO1059 e PRO1060 na Tabela 6). O scFv derivado de ambos os clones mostra afinidade quase idêntica à PDL1 humana e de macaco cynomolgus (ver PRO977 e PRO830 na Tabela 6). Quando comparadas com os scFvs correspondentes, as afinidades das multi-especificidades contendo as porções anti- PDL1 33-03-G02 sc18, 37-20-B03 sc01 e 37-20-B03 sc09.1 foram semelhantes (PRO1392, scFv de 33-03-G02 sc18: KD = 9,94E-12 M; PRO908, scFv de 37-20-B03 sc01: KD = 5,94E-12 M; e PRO1347, scFv de 37-20-sc09.1: KD = 9,00E-12M, respectivamente). Em contraste, foi observada uma diminuição na afinidade para PDL1 humana para todos os scDb-scFvs portadores da fração anti- PDL1 33 03-G02 sc03 quando comparado ao scFv PRO1183 correspondente (scFv de 33 03-G02 sc03: KD <2,09E-12 M). A perda de afinidade dessas construções deve-se principalmente a uma taxa de desligamento acelerada, resultando em uma constante de dissociação aumentada. A maior afinidade para PDL1 foi encontrada para PRO1430 com a porção de ligação anti-PDL1 37- 20-B03 sc09.1.

[0366] Como mostrado na Tabela 6, a ligação à CD137 humana foi confirmada para todos os scDb-scFvs. A medição da cinética de ligação para os enxertos de CDR das duas construções humanizadas específicas para CD137 derivadas do clone 38-02-A04 e 38-27-C05 mostra afinidades quase idênticas (compare PRO885 e PRO951 na Tabela 6). Para o clone 38-02-04, os resíduos estruturais descritos enxertados nas regiões estruturais levaram a uma melhoria da afinidade de mais de 200 vezes (compare PRO885 e PRO1124 na Tabela 6). Além disso, para construções derivadas do clone 38-02-04 foi observada a ligação à CD137 de camundongo, porém com afinidade muito reduzida.

Curiosamente, enquanto a afinidade com CD137 humana era semelhante para as moléculas multiespecíficas que contêm a porção de ligação anti-CD137 38- 02-A04 sc13 e 38-27-A11 sc03 quando comparada às afinidades de seus scFvs correspondentes (PRO1352, scFv de 38-02-A04 sc13, KD = 1,47E-09 M e PRO1360, scFv de 38-27-A11 sc03, KD = 2,34E-10 M, respectivamente), a afinidade das moléculas scDb-scFv portadoras da porção anti-CD137 38-27-A11 sc02 na parte interna do grampo (hairpin) de scDb (domínio scDb-i, ou seja, PRO1480) foi substancialmente melhor que a afinidade do scFv correspondente (PRO1359, KD = 3,24E-09 M; PRO1359, KD = 3,07E-09 M). Por outro lado, quando a parte anti-CD137 38-27-A11 sc02 foi colocada na parte externa do grampo scDb, a afinidade é comparável à do scFv PRO1359. Pode-se especular que esse ganho de afinidade possa ser causado por uma maior estabilização do domínio quando localizado na parte interna do grampo de scDb.

Como consequência, a afinidade com a CD137 humana das multi-especificidades que contêm a porção anti-CD137 38-27-A11 sc02 na parte interna do grampo de scDb é quase idêntica à afinidade dos scDb-scFvs com a porção anti-CD137 38-27-A11 sc03 (compare PRO1480 e PRO1481), que representa uma descoberta inesperada.

[0367] A ligação de scDb-scFvs à albumina sérica (SA) foi confirmada por SPR. Os scDb-scFvs contendo o domínio de ligação à SA derivada do clone 19-01-H04 mostram uma ligação de alta afinidade à albumina sérica humana, enquanto nenhuma ligação foi observada à SA de roedor. Para os scDb-scFvs contendo o clone 23-13-A01, foi observada ligação à SA humana, além disso, as moléculas se ligam com afinidade reduzida à SA de roedor (ver Tabela 6). Verificou-se que a ligação a HSA em pH 5,5 para PRO1430, PRO14379 e PRO1480 foi de alta afinidade (valor KD de baixas concentrações nanomolares) e comparáveis dentre as moléculas testadas, o que representa uma descoberta esperada, pois as moléculas testadas compartilham os mesmos domínios anti- SA (clone de IgG 19-01-H04). Aumentar o valor do pH para 7,4, além disso, não afetou substancialmente a afinidade das moléculas ao HSA (dados não mostrados).

Exemplo 2: Bloqueio da interação PDL1/PD-1 em um ensaio de gene repórter baseado em células usando células CHO expressando PDL1 e uma molécula ativadora de TCR, e células Jurkat expressando PD-1 e contendo um gene luciferase sob o elemento de resposta NFAT.

[0368] Método: No ensaio do gene repórter bioluminescente, as células T Jurkat manipuladas que expressam de maneira estável o repórter NFAT (fator nuclear das células T ativadas)-luciferase e o PD-1 humano atuam como células T efetoras. As células que expressam estavelmente a PDL1 humana e um ativador do receptor de células T (TCR) atuam como células apresentadoras de antígeno. O co-cultivo das duas linhas celulares induz a ativação da via Jurkat NFAT via reticulação do ativador de TCR/complexo de TCR. Após o acoplamento das células que expressam PDL1, a sinalização de PD-1 nas células T efetoras de PD-1 inibe a função das células T e resulta na inibição da via NFAT. O bloqueio da interação dos receptores PD-1 e PDL1 leva à reativação da via NFAT. 35000 células ativadoras CHO/PDL1/TCR (BPS Bioscience) em 100 µl de meio de cultura celular (DMEM/F12, 10% de FCS) foram adicionadas aos poços interiores de uma placa de cultura de células brancas e incubadas durante 16-20 h a 37o C e 5% de CO2. No dia seguinte, 95 µl de meio de cultura de células foram removidos de cada poço e 50 µl de diluições em série concentradas duas vezes das respectivas moléculas a serem testadas (de 3000 a 0,46 ng/ml), incluindo o avelumab de referência, foram adicionados. Em seguida, 50 µl de células de Jurkat efetoras que expressam PD-1 (BPS Bioscience) diluídos a 400000 células/ml em tampão de ensaio (RPMI 1640 com 10% de FCS) foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas 6 horas a 37° C e 5% de CO2. Finalmente, 50 µL de substrato de luciferase (BPS Bioscience) preparados de acordo com as instruções do fabricante, foram adicionados por poço e as placas foram incubadas a 30 minutos no escuro, a luminescência foi medida usando Topcount.

Resultados:

[0369] Os valores individuais de IC50 em cada placa foram calibrados contra a IC50 da molécula de referência avelumab que foi feita ao longo de cada placa (IC50 relativo: IC50,avelumab/IC 50,scFv de teste). Potências estão resumidas na Tabela 7 que mostra que o IC50 de todas as moléculas testadas está entre 0,1 vezes e 3,73 vezes o IC50 de avelumab.

TABELA 6. Afinidades de diferentes formatos para PDL1, CD137 e albumina sérica de diferentes espécies.

TABELA 7. Neutralização da interação PDL1/PD-1 no ensaio do gene repórter NF-AT.

[0370] Para avaliar a influência do conjunto de CDR e seleção da estrutura na potência para neutralizar a ligação de PDL1 a PD-1, três scFvs anti-PDL1 foram testados no ensaio baseado em células do gene repórter NFAT. PRO830 compreende o conjunto CDR do clone 33-03-G02 enxertado em uma estrutura VH4 e PRO997 e PRO1013 compreendem o conjunto CDR do clone 37-20-B03 enxertado em uma estrutura VH4 ou VH1, respectivamente. PRO830 tem a menor potência dos três scFvs testados com um valor de IC50 de 42,88 ng/ml, e tem uma potência semelhante como avelumab com um valor de IC50 de 34,09 ng/ml. PRO997 é a molécula mais potente. A potência do mesmo conjunto de CDR foi cerca de 2 vezes maior quando enxertado em uma estrutura VH4 do que na estrutura VH1. Os valores de IC50 foram 11,12 ng/mL contra 21,29 ng/ml, respectivamente (Figura 3 e Tabela 7).

[0371] A potência de neutralização da ligação de PDL1 a PD-1 foi determinada para moléculas bi-específicas que possuíam o domínio PDL1 33-03-G02 antes (enxerto de CDR) e depois da otimização do domínio (enxerto estrutural). O enxerto CDR (PRO885) foi comparado com um enxerto estrutural (PRO1126). A optimização de domínio melhorou a potência de neutralização por um fator de três, com valores de IC50 sendo 137,2 ng/ml para PRO885 e 48,15 ng/mL para PRO1126 (Figura 4 e Tabela 7).

[0372] A potência para neutralizar a interação PDL1/PD-1 também foi avaliada para várias moléculas tri-específicas que possuem o domínio anti-CD137 derivado do clone 38-02-A04 ou 38- 27-A11, o domínio anti-PDL1 derivado do clone 33-03-G02 ou clone 37-20-B03 e dois domínios diferentes de ligação à albumina sérica humana, para extensão da meia-vida (Figura 5 e Tabela 7). O domínio HSA derivado do clone 23-12-A01-sc03 também se liga à albumina sérica de camundongo. As experiências foram realizadas na presença de 25 mg/ml de HSA. A potência de neutralização de PRO1057 (IC50 = 665,1 ng/ml) foi menor do que para avelumab (Figura 5 e Tabela 7).

[0373] Outro formato que prolongaria a meia-vida no soro, o chamado formato de Morrison, foi testado no ensaio do gene repórter de potência baseado em células. Neste formato, uma especificidade é transportada pela porção IgG (bi-valência) e dois scFvs com especificidades para o segundo alvo são ligados por ligantes peptídicos flexíveis à cadeia pesada (HC) ou cadeia leve (LC) da IgG. Todas as moléculas de Morrison testadas carregavam o domínio anti-PDL1 do enxerto CDR do clone 33-03- G02 em ambos os braços IgG. As duas construções de PRO1059 e PRO1060 diferem pela fusão de dois scFvs anti-CD137, seja à cadeia pesada (HC) ou à cadeia leve (LC). O PRO1062 possui a mesma arquitetura do PRO1060 com um domínio CD137 diferente. As potências de neutralização de todas as moléculas foram semelhantes (Figura 6 e Tabela 7).

Exemplo 3: Bloqueio da interação de PDL1 com PD-1 e B7.1 usando ELISA de competição.

[0374] Estes ensaios foram realizados para avaliar a capacidade dos inibidores de PDL1 para bloquear a interação entre PDL1 e PD-1 ou PDL1 e B.71. Diferentes formatos, incluindo scFvs, scDbs, scDb-scFv e Morrison foram analisados no ELISA de competição e comparados com a referência IgG avelumab.

ELISA de competição PDL1/PD-1 Método

[0375] Microplacas ELISA revestidas durante a noite a 4° C com 4 µg/ml de PD-1 humana foram lavadas três vezes com 450 µl de tampão de lavagem por poço. As placas foram bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente adicionando 300 µl de PBS com 1% de BSA e 0,2% de tween (tampão de diluição) a cada poço. Os inibidores foram diluídos em série em etapas de três vezes para concentrações finais variando de 300 a 0,005 ng/ml em tampão de diluição contendo 1 ng/ml de PDL1 humana biotinilada. As misturas foram pré-incubadas por 1 hora a temperatura ambiente sob agitação suave em um misturador rotativo (21 rpm) e adicionadas às microplacas após 3 ciclos de lavagem com 450 µl de tampão de lavagem por poço. As placas foram incubadas por 1,5 horas a temperatura ambiente sob agitação suave, em seguida foram adicionados 10 ng/ml de estreptavidina-poliHRP40 a cada poço de microplaca após três lavagens com 450 µl de tampão de lavagem por poço. Após 1 h de incubação à temperatura ambiente, as placas foram lavadas três vezes com 450 µl de tampão de lavagem e a solução de substrato TMB foi adicionada. A reação enzimática foi parada após 6 minutos por adição de HCl 1 M e a absorbância foi medida a 450 nm usando 690 nm como comprimento de onda de referência. Para o cálculo de valores IC50, um ajuste de curva de quatro parâmetros logísticos (4PL) foi realizado em Graph Pad Prism utilizando valores de referência subtraídos.

Resultados

[0376] Os valores individuais de IC50 de cada placa foram calibrados contra o IC50 da molécula de referência avelumab que foram tomados ao longo de cada placa (IC50 relativo: IC50, avelumab/IC50, teste scFv). As potências estão resumidas na Tabela 8. Como ilustrado na Figura 7 e na Tabela 8, todos os inibidores de PDL1 bloquearam a interação de PD-1 com PDL1 quando testados no ELISA de competição. O scFv PRO830 bloqueou a interação com uma potência semelhante, enquanto PRO997 e PRO1013 exibiram significativamente valores mais baixos de IC50 do que avelumab e são assim inibidores mais potentes. Quando combinadas em formatos multiespecíficos, como scDbs ou Morrisons, todas as moléculas conservaram suas propriedades inibidoras. PRO885 foi menos potente do que avelumab ao passo que um valor inferior de IC50 foi determinado para PRO1126 compreendendo um domínio anti- PDL1 melhorado. Os formatos Morrison foram ligeiramente menos potentes quando comparados com avelumab. O efeito de neutralização de PRO1057 também foi mostrado na presença de albumina sérica humana, em que os valores de IC50 foram aproximadamente duas vezes mais elevados.

TABELA 8. Bloqueio da interação de PDL1 com PD-1 e B7.1 usando ELISA de competição.

ELISA de competição PDL1 /B7.1 Método

[0377] As microplacas ELISA revestidas durante a noite a 4° C com 4 µg/ml de B7.1 humano foram lavadas três vezes com 450 µl de tampão de lavagem por poço. As placas foram bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente adicionando 300 µl de PBS com 1% de BSA e 0,2% de tween (tampão de diluição) a cada poço. Os inibidores foram diluídos em série em etapas de 3 vezes para concentrações finais variando de 900 a 0,015 ng/ml em tampão de diluição contendo 40 ng/ml de PDL1 biotinilada. As misturas foram pré-incubadas por 1 hora à temperatura ambiente sob agitação suave em um misturador rotativo (21 rpm) e adicionadas às microplacas após 3 ciclos de lavagem com 450 µl de tampão de lavagem por poço. As placas foram incubadas por 1,5 horas à temperatura ambiente sob agitação suave, em seguida foram adicionados 10 ng/ml de estreptavidina-poliHRP40 a cada poço de microplaca após três lavagens com 450 µl de tampão de lavagem por poço. Após 1 h de incubação à temperatura ambiente, as placas foram lavadas três vezes com 450 µl de tampão de lavagem e a solução de substrato TMB foi adicionada. A reação enzimática foi parada após 6 minutos por adição de HCl 1 M e a absorbância foi medida a 450 nm usando 690 nm como comprimento de onda de referência. Para o cálculo de valores de IC50, um ajuste de curva de quatro parâmetros logísticos (4PL) foi realizado em Graph Pad Prism utilizando valores de referência subtraídos.

Resultados

[0378] Os valores individuais de IC50 de cada placa foram calibrados contra o IC50 da molécula de referência avelumab que foram tomados ao longo de cada placa (IC50 relativo: IC50, avelumab/IC50, teste scFv). As potências estão resumidas na Tabela 8. Exceto pelo PRO1126, todos os inibidores de PDL1 também foram testados quanto à sua capacidade de bloquear a interação do PD- 1 com B7.1. PRO830 apresentou potência semelhante ao avelumab enquanto que menores valores de IC50 foram determinados para PRO997 e PRO1013. Todos os scDbs e Morrisons também inibiram a interação entre PDL1 e B.7-1. O scDb PRO885 apresentou potência semelhante a avelumab enquanto que os valores de IC50 para os

Morrisons eram cerca de 2-3,4 vezes mais baixos. Dados mostrados na Figura 8 e Tabela 8.

Exemplo 4: Nenhuma inibição de CD137 e neutralização de CD137 por domínios anti-CD137 humanizados.

Métodos:

[0379] Para mostrar que PRO885 não interfere com a ligação do ligante de CD137 (CD137L) ao CD137, foi utilizado um ELISA competitivo. O anticorpo policlonal inibitório comercial anti- CD137 de cabra (Anticorpos on-line, Cat#ABIN636609) serviu de referência. Em resumo, o CD137 foi revestido na placa ELISA durante a noite e diluições em série do PRO885 foram adicionadas à placa ELISA. Posteriormente, foi adicionado CD137L biotinilado e o ligante ligado foi detectado pela adição de Streptavidin- HRP. Finalmente, o substrato de HRP TMB foi adicionado. Após desenvolvimento por 5 min, a reação foi parada com solução de HCl 1 M. A absorbância foi medida a 450 nm e 690 nm como referência.

Resultados:

[0380] As curvas de titulação obtidas para PRO885 contendo o domínio CD137 derivado do clone 38-02-A04 estão representadas na Figura 9A e as curvas de ligação obtidas para PRO951 contendo o domínio CD137 derivado do clone 38-27-C05 estão representadas na Figura 9B. As curvas de titulação obtidas para o PRO 1359 e PRO1360 contendo o domínio CD137 derivado do clone 38-27-A11 são representadas na Figura 9C. Enquanto o anticorpo de referência impediu completamente a ligação de CD137L a CD137, PRO885, PRO951, PRO1359 e PRO1360 não inibiram significativamente a ligação de CD137L a CD137 e, portanto, foram definidos como não neutralizantes.

Exemplo 5: Escaneamento (binning) de Epitopo de 38-02-A04 e 38- 27-C05 contra urelumab e utomilumab.

Métodos:

[0381] Os epítopos de ligação em CD137 das proteínas PRO885 (scDb contendo enxerto de CDR 38-02-A04), PRO951 (scDb contendo enxerto de CDR 38-27-C05), IgG de coelho derivado do clone 38- 27-A11 e as moléculas concorrentes urelumab (BMS) e utomilumab (Pfizer) foram comparados em um ensaio de escaneamento de epítopos SPR usando um dispositivo MASS-1 (Sierra Sensors). Uma configuração em sanduíche foi escolhida para examinar se as moléculas bloqueiam a ligação uma da outra a CD137. Portanto, PRO885, PRO951, IgG de coelho derivado do clone 38-27-A11, urelumab e utomilumab foram imobilizados em chips de sensor de amina de alta capacidade (HCA, Sierra Sensors). Em seguida, 90 nM do antígeno CD137 (PeproTech, cat. 310-15) foram injetados e capturados nos scDbs, IgG de coelho 38-27-A11, urelumab ou utomilumab, seguido imediatamente por uma injeção de 22,5 nM do segundo anticorpo (PRO885, PRO951, o IgG de coelho 38-27-A11, urelumab ou utomilumab). Os níveis de captura de CD137 em cada proteína e os níveis de resposta do segundo ligante foram determinados (unidades de resposta, RU). Calculando a resposta máxima teórica (Rmax), que depende dos pesos moleculares das proteínas envolvidas e dos níveis de captura, foi determinado o nível de ligação relativo (%) das proteínas no antígeno capturado. Se as moléculas se ligam da mesma forma, epítopos sobrepostos (por exemplo, estruturalmente semelhantes ou espacialmente proximais) ou similares em CD137, nenhuma ligação do anticorpo injetado sobre o CD137 capturado deve ser observada. Consequentemente, quando é observada a ligação do anticorpo, os dois pares de anticorpos se ligam a epítopos não sobrepostos. Os níveis de ligação relativa (em%) foram determinados para cada par de anticorpos. Por definição, um nível de ligação abaixo de 10% indica os mesmos ou uma sobreposição (por exemplo, uma estrutura similar ou espacialmente proximal) em CD137 e acima de 30% refere-se a epítopos não sobrepostos.

Resultados:

[0382] Quando o PRO885 foi imobilizado em um chip sensor, todos os três anticorpos PRO951, urelumab e utomilumab mostraram ligação a CD137 capturada pelo PRO885. Como esperado, nenhuma ligação foi observada para o PRO885 que foi usado como controle (Figura 10 e Figura 11). Quando o PRO951 foi imobilizado no chip do sensor, o urelumab e o PRO885 mostraram ligação, enquanto o utomilumab e o PRO951, usados como controle, não apresentaram ligação significativa (Figura 10 e Figura 12). Estes resultados mostram que PRO885 derivado do clone 38-02-A04 liga-se a epítopos diferentes em CD137 de urelumab, utomilumab e PRO951 derivado 38-27-C05. Em contraste, RO951 liga-se a um epitopo que se sobrepõe com utomilumab mas não com urelumab e PRO885.

[0383] O IgG 38-27-A11 não competiu com utomilumab pela ligação ao CD137, sugerindo epítopos não sobrepostos, enquanto competiu com urelumab pela ligação ao CD137, sugerindo epítopos iguais ou sobrepostos (Figura 10).

Exemplo 6: Avaliação do efeito agonístico de CD137 de moléculas anti-PDL1 xCD137 utilizando um ensaio baseado em células da linha celular transgênica repórter NFkB Jurkat que expressa CD137.

Introdução

[0384] Neste ensaio, a ativação da sinalização de CD137 em células Jurkat foi avaliada. A atividade da sinalização de CD137 é relatada por medição da expressão de luciferase que é acionada pela ativação de NF-kB induzida por CD137 em uma linha celular repórter Jurkat. A expressão da luciferase se correlaciona diretamente com a atividade do CD137. Além disso, o agrupamento de CD137 que é necessário para a ativação da via de sinal é facilitado através da formação de uma sinapse imunológica entre as células Jurkat e uma linha celular que expressa PDL1. Portanto, a expressão de PDL1 é necessária para agregação e ativação da CD137 na linha de células repórter.

Métodos

[0385] PDL1 expressando células CHO (clone A2) e células HCC827 não estimuladas ou estimuladas durante 24 h com 10 ng/ml de IFNy para aumentar a expressão de PDL1 foram semeadas a 25.000 células por poço em placas de cultura de 96 poços. Como controle negativo, as células CHO WT sem expressão de PDL1 foram semeadas na mesma densidade celular. Em seguida, diluições em série das moléculas anti-PDL1xCD137, bem como o competidor urelumab, foram preparadas e adicionadas às células. Em seguida, as células Jurkat repórter foram preparadas em meio de ensaio contendo HSA a 25 mg/ml ou sem e adicionado a uma densidade celular de 40.000 células por poço. A expressão de luciferase foi detectada por adição de reagente de Luciferase e foi lida por um leitor de luminescência 6 ou 24 h após a adição de células Jurkat. Os dados foram analisados por normalização das unidades de luminescência relativa (RLU) das amostras de teste para a RLU medida para urelumab (Figuras 13 a 18, Figura 19A) ou PRO885 (Figura 19B), produzindo valores da ativação relativa da sinalização de CD137.

[0386] PDL1 expressando células HCC827 estimuladas durante 24 h com 10 ng/ml de IFNy para aumentar a expressão de PDL1 foram semeadas a 25.000 células em 50 µl de meio de cultura celular (meio RPMI, 10% FCS) por poço em placas de cultura de 96 poços. Como controle negativo, as células CHO-K1 WT sem expressão de PDL1 foram semeadas na mesma densidade celular. Em seguida, diluições em série de 5 vezes de 25 µl de concentrados de 4 vezes das respectivas moléculas a serem testadas e as referências PRO1186 e PRO885 a partir de 40.000-0,02 ng/ml foram adicionadas. Em seguida, 25 µl de células Jurkat que expressam CD137 (Promega) diluídas a 1,6E+06 células/ml em tampão de ensaio (RPMI1640 com 10% de FCS e 100 mg/ml de HSA) foram adicionados a cada poço, resultando em uma concentração final de HSA de 25 mg/ml. As placas foram então incubadas por 6h e 24 a 37° C e 5% de CO2. Finalmente, 50 µL de substrato de luciferase (BPS Bioscience) preparado de acordo com o protocolo do fabricante foram adicionados por poço e as placas foram incubadas 15 minutos no escuro, a luminescência foi medida usando Flexstation ll. Os valores individuais de EC50, IC10/EC90 e AUC em cada placa foram calibrados com os respectivos valores da molécula de referência PRO1186 que foi levada ao longo de cada placa (Tabela 16C). Os valores de EC50 e EC90 da curva de resposta à dose foram obtidos usando um ajuste logístico de quatro parâmetros dos pontos com unidades de luminescência relativa crescente (URL) e, por outro lado, os pontos com URLs decrescentes foram ajustados usando um ajuste logístico de quatro parâmetros com fundo restrito para calcular o valor de IC10. A área sob a curva (AUC) foi calculada para todas as amostras usando dados normalizados do PRO885. Todos os parâmetros foram recuperados usando o software de prisma GraphPad.

Resultados I. Teste de PRO885 e PRO951 usando células CHO-PDL1:

[0387] Como mostrado na Figura 13, PRO885 e PRO951 ativaram a sinalização de CD137 mais eficiente na presença de células CHO que expressam PDL1 do que urelumab. O PRO885 mostrou a melhor potência e o maior sinal de ativação (PRO885, EC50 = 11,72 ng/ml, PRO951: EC50 = 33,68 ng/ml; urelumab: EC50 = 79,11 ng/ml, Tabela 9). Na ausência de PDL1, nem o PRO885 nem o PRO951 puderam ativar CD137 nas células repórteres enquanto urelumab mostrou a ativação do sinal de CD137 independentemente de PDL1.

TABELA 9. Valores de EC50 para moléculas anti-PDL1xCD137 usando células CHO-PDL1.

urelumab PRO885 PRO951 Fundo -0,4628 -8,1 -4,066 Topo 101,5 491,2 411,4 EC50 em ng/ml 79,11 11,72 33,68 R Quadrado 0,995 0,9922 0,9899 II. Teste de scDbs enxertado em STR usando células CHO- PDL1:

[0388] Como mostrado na Figura 14 e na Tabela 10, as moléculas anti-PDL1xCD137 scDb estimularam a sinalização de CD137 de forma mais eficiente do que urelumab. Ao contrário de urelumab, o efeito estimulador só foi observado para o scDb quando as células-alvo que expressam PDL1 estavam presentes. Todos os scDbs apresentaram potência idêntica para estimular a ativação do gene repórter Nf-kB na presença de células CHO que expressam PDL1 em níveis elevados. Em seguida, as mesmas moléculas foram testadas na presença de células que expressam uma quantidade menor de PDL1.

III. Teste de scDb enxertado com STR usando células HCC827 sem IFNy:

[0389] Como mostrado na Figura 15 e na Tabela 11, as moléculas anti-PDL1xCD137 scDb estimularam a sinalização de CD137 com mais eficiência do que urelumab. Os scDbs com afinidade melhoraram o domínio de CD137 (enxertos STR de 38-02-A04, PRO1120 e PRO1124) mostraram uma potência melhorada na ativação de CD137 quando comparados com o domínio de CD137 enxertado de CDR (por exemplo, PRO885, EC50 = 13,02 ng/ml, PRO1124: EC50 = 5,62 ng/ml, Tabela 11). Como nota, o aumento da afinidade para PDL1, como foi encontrado para o enxerto STR do domínio PDL1 (Pro1126), também resultou em aumento de potência quando comparado à molécula parental PRO885 (PRO885, EC50 = 13,02 ng/ml, PRO1126: EC50 = 6,97 ng/ml, Tabela 11). Em altas concentrações, o scDb enxertado com STR mostrou tendência a diminuir o sinal de ativação. Isso foi mais pronunciado para moléculas com um domínio de CD137 enxertado com STR (PRO1120 e PRO1126). Curiosamente, quando o enxerto de STR do domínio de PDL1 foi combinado com o enxerto de CDR de CD137, a diminuição do sinal em altas concentrações não foi observada (compare PRO885 e PRO1124 na Figura 15). Assim, a potência aumentou ligeiramente com o aumento da afinidade para CD137 e PDL1. Uma diminuição do sinal em altas concentrações

(curva em forma de sino) foi mais acentuada com o aumento da afinidade com CD137, enquanto o aumento da afinidade com PDL1 não contribuiu para esse efeito. Assim, antes a razão entre afinidade para CD137 e PDL1 do que as afinidades absolutas de cada domínio parece crítica para estender a janela de concentração da atividade máxima.

IV. Teste de scDb enxertado com STR usando células HCC827 com IFNγ:

[0390] A estimulação de HCC827 com IFNy levou ao aumento do sinal de ativação sem alterar a potência das moléculas de scDb. Como nota, a queda de sinal a alta concentração do scDb testado foi menos óbvia neste cenário, sugerindo uma correlação com a expressão de PDL1 (Figura 16 e Tabela 12).

V. Teste de moléculas de meia-vida longa usando células CHO-PDL1:

[0391] Como mostrado nas Figuras 17 e 18, Tabelas 13 e 14, moléculas anti-PDL1xCD137 de longa meia-vida testadas estimularam a sinalização de CD137 à mesma extensão que urelumab. Houve uma diferença quando os formatos Morrision (PRO1060, PRO1062) foram comparados aos formatos scDb-scFv (PRO1057, PRO1058). Embora os formatos Morrison mostrassem uma potência mais alta, o sinal máximo de ativação foi substancialmente aumentado quando o scDb-scFv foi testado. É importante notar que, após 24 h de incubação, o PRO1057 mostrou um notável sinal alto de ativação. Todas as moléculas de meia-vida longa testadas ativaram a sinalização de CD137 apenas na presença de células que expressam PDL1. Curiosamente, apesar das afinidades semelhantes aos dois alvos, o PRO1057 mostrou um sinal máximo muito maior que o PRO1058. Além disso, o scDb-scFv PRO1057 monovalente mostrou ativação mais forte que o respectivo formato bivalente de Morrison PRO1060.

VI. Teste de moléculas de meia-vida longas usando células HCC827 sem e com IFNy:

[0392] Conforme mostrado na Figura 19A e na Tabela 15, as moléculas anti-PDL1xCD137 de meia-vida longa testadas estimularam a sinalização de CD137 na mesma extensão que urelumab na presença de células que expressam quantidades menores de PDL1. A ativação máxima das moléculas testadas aumentou ainda mais quando as células alvo foram estimuladas por IFNy, sugerindo uma correlação direta da ativação de CD137 com os níveis de expressão de PDL1 nas células alvo. Como já foi dito acima, o PRO1057 mostrou um nível mais alto de ativação do gene repórter quando comparado aos formatos Morrison (PRO1060).

[0393] A Figura 19B representa os resultados dos testes de moléculas scDb-scFv tri-específicas PRO1430, PRO1431, PRO1432, PRO1473, PRO1476, PRO1479, PRO1480, PRO1481 e PRO1482 em ensaio de atividade de CD137 na presença de HCC827 estimulado por IFNy (10 ng/ml) por 6 h e 24 h.

[0394] Os dados para a ativação do gene repórter NF-kB por construções multiespecíficas PDL1 x CD137 estão resumidos nas Tabelas 16A, 16B e 16C.

[0395] Para comparar a forma das curvas de atividade das moléculas candidatas, a área sob a curva (AUC, representando uma medida combinada para amplitude do sinal e largura da curva em forma de sino, tamanho do efeito) e a largura do platô (A relação EC90/IC10, fornecendo uma indicação da janela terapêutica) foram calculadas (ver Tabela 16C). Os melhores valores rel. de AUC (pelo menos acima de 1 em um momento, quando normalizados para PRO1186) foram encontrados para PRO1430, PRO1479, PRO1480 e PRO1481. É importante notar que uma alta taxa de EC90/IC10 da amostra de teste indica uma ampla curva de resposta à dose em forma de sino e, como consequência, propõe uma faixa maior de concentração da atividade completa. Assim, os principais candidatos mostram atividade completa em uma faixa de concentração de várias centenas de vezes.

[0396] Com base nesses parâmetros, os scDb-scFvs com melhor desempenho no ensaio do gene repórter NF-kB foram PRO1430, PRO1479 e PRO1480.

TABELA 10. Valores de EC50 para moléculas anti-PDL1xCD137 usando células CHO-PDL1.

TABELA 11. Valores de EC50 para moléculas anti-PDL1xCD137 usando células HCC827 sem IFNγ.

TABELA 12. Valores de EC50 para scDb enxertado com STR usando células HCC827 estimuladas com IFNγ.

TABELA 13. Valores de EC50 para moléculas de meia-vida longa usando células CHO que expressam PDL1 (6 h).

TABELA 14. Valores de EC50 para moléculas de meia-vida longa usando células CHO que expressam PDL1 (24 h).

TABELA 15. Valores de EC50 para moléculas de meia-vida longa usando células HCC827 estimuladas com IFNγ.

TABELA 16A. Ativação do gene repórter NF-kB por construções multiespecíficas PDL1 x CD137.

TABELA 16B.

Ativação do gene repórter NF-kB por construções multiespecíficas PDL1xCD137.

TABELA 16C.

Potências de scDb-scFv para ativar a atividade de CD137 no ensaio do gene repórter NF- kB.

Os domínios anti-CD137 são derivados dos clones de IgG 38-02-A04 e 38-27-A11; os domínios anti-

PDL1 são derivados dos clones de IgG 37-20-B03 e 33-03-G02; O domínio anti-SA é derivado do clone de IgG 19-01-H04.

Ativação Área sob a Área rel. EC50 rel. máxima rel. IC10/EC90 curva sob a domínio domínio domínio Momento EC50 (EC50, de NF-kB Relação (razão de (calculada PRO ID curva scDb-i scDb-o scFv temporal[h] [ng/ml] PRO1186/EC50, (rel. a IC10/EC90 amostra/razão usando dados (AUCamostra amostra) PRO1186) de PRO1186) normalizados /AUCPRO1186) [%] de PRO885) 38-02- 37-20- 19-01- 6 9,80 1,31 110,08 72,42 0,22 196,40 1.03 PRO1430 A04- B03- H04- 24 4,42 1,51 98,57 1240,89 3,94 179,90 0,87 sc13 sc01 sc03 38-02- 33-03- 19-01- 6 21.02 0,68 55,29 5.03 0,30 83,15 0,40 PRO1431 A04 G02 H04 24 18,39 1.02 68,62 16,07 1,74 118,70 0,54 sc13 sc18 sc03 33-03- 38-02- 19-01- 6 19,36 0,67 63,36 26,84 0,36 111,40 0,59 PRO1432 G02 A04 H04 24 21,89 0,75 83,76 3.57 0,16 149,60 0,81 sc18 sc13 sc03

38-02- 33-03- 19-01- 6 2,40 2,30 36.19 53,87 1.01 52,34 0,31

PRO1473 A04 G02 H04 24 0,91 3.55 67,40 15,73 0,12 187,90 0,73 sc13 sc03 sc03

33-03- 38-02- 19-01- 6 5,97 2.02 36,35 34,24 2,66 93,49 0,39

PRO1476 G02 A04 H04 24 3,90 1,83 76,14 35,73 1,63 134,60 0,59 sc03 sc13 sc03

38-02- 37-20- 19-01- 6 7.38 1,74 108,25 81,94 0,25 191.10 1.11

PRO1479 A04 B03 H04 24 7.61 0,87 118,64 522,81 1,66 206,60 1,37 sc13 sc09.1 sc03

38-27- 37-20- 19-01- 6 6,44 1,93 114,29 42,99 0,54 232.10 1,20

PRO1480 A11 B03 H04 24 4,67 1,00 120,91 359,55 1,86 261,20 1,29 sc02 sc09.1 sc03

38-27- 37-20- 19-01- 6 7.22 1.04 147,28 23,74 1,71 291,90 1,37

PRO1481 A11 B03 H04 24 5,51 0,58 116,81 40,98 5,72 253,80 1,00 sc03 sc09.1 sc03

TABELA 17. Indução da secreção de IL-2 por células T mediante tratamento com PRO885.

ug/ml de 2 1 anticorpo anti-CD3 Células 50.000 100.000 200.000 50.000 100.000 200.000 CHO-A1/poço EC50 52,01 41,85 30,05 12,85 86,22 80,62 (ng/ml) Exemplo 7: Avaliação do efeito estimulador de células T do bloqueio concomitante de PDL1 e estimulação de CD137 em um ensaio baseado em células usando PBMC humano e células CHO transgênicas que expressam PDL1.

Método

[0397] As células CHO-A2 que expressam PDL1 foram semeadas em três diferentes densidades, variando de 50.000 a 200.000 células por poço em placas de cultura de 96 poços pré-revestidos com um anticorpo CD3 anti-humano. As placas foram incubadas durante a noite a 37° C, 5% de CO2. No dia seguinte, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas do sangue total humano fresco por meio de centrifugação em gradiente de densidade. 100.000 PBMCs por poço foram adicionados à placa de 96 poços, seguidos pela adição do anti-PDL1xCD137 scDb PRO885 em concentrações de 500, 50 e 5 ng/ml. Após 76 horas de incubação, os sobrenadantes celulares foram colhidos. Os níveis de interleucina-2 humana (IL-2) nos sobrenadantes da cultura foram quantificados usando o ensaio ELISA MAX humano de IL-2 da Biolegend, de acordo com as instruções do kit. As concentrações de IL-2 foram interpoladas a partir de uma curva padrão de IL- 2, calculadas de novo e plotadas contra as concentrações de PRO885 para o cálculo dos valores de EC50.

Resultados

[0398] Como mostrado na Figura 20, a IL-2 foi secretada pelas células T após bloqueio concomitante da interação PD-1/PDL1 e estimulação de CD137 pela adição da molécula biespecífica PRO885. Os níveis de IL-2 secretados aumentaram com o aumento da densidade de células anti-CD3 e células CHO-A2 e aumento das concentrações de PRO885. Na ausência de anticorpos anti-CD3, os níveis de IL-2 eram comparáveis à secreção basal de IL-2. O PRO885 ativou apenas células T co-estimuladas por um anticorpo anti-CD3. Nenhuma produção de IL-2 dependente da dose na ausência de estimulação com anti-CD3 confirma a ativação seletiva de células T específicas do antígeno. Esta descoberta demonstra que o PRO885 estimula apenas células T ativadas e sugere que o PRO885 in vivo estimularia especificamente células T específicas de tumores.

Exemplo 8: Avaliação do efeito estimulador de bloqueio de PDL1 concomitante e estimulação de CD137 num ensaio baseado em células utilizando PBMC humanas estimuladas com superantígeno SEA.

[0399] Neste experimento, o efeito sinérgico da inibição de PD-1/PDL1 e do agonismo de CD137 foi avaliado. O ensaio utilizou células mononucleares do sangue periférico (PBMC) que foram estimuladas com o superantígeno Enterotoxina Estafilocócica A (SEA), a fim de induzir a expressão de PDL1 nas células apresentadoras de antígenos (APC) e células T, respectivamente, e CD137 nas células T. Ao aplicar moléculas anti-PDL1xCD137, duas vias de sinalização reguladoras de células T foram direcionadas concomitantemente: inibição da via inibitória PD- 1/PDL1, bem como ativação da via CD137 através da formação de uma sinapse imunológica mediada pela molécula PRO885 anti- PDL1xCD137 biespecífica ou pela molécula anti-PDL1xCD137xHSA tri-específica PRO1175, PRO1430, PRO1479 ou PRO1480. A ativação de células T pela molécula biespecífica anti-PDL1xCD137 PRO885 (SEQ ID NO: 209) ou pela molécula triespecífica anti- PDL1xCD137xHSA PRO1175 (SEQ ID NO: 220), PRO1430 (SEQ ID NO: 222), PRO1479 (SEQ ID NO: 223) ou PRO1480 (SEQ ID NO: 229) foi avaliada. A ativação das células T foi avaliada pela secreção de interleucina-2 (IL-2) e comparada ao efeito mediado pela inibição da PDL1 mediada pelo anticorpo de referência avelumab. Além disso, o scFv anti-PDL1, PRO997, foi testado e comparado ao avelumab na mesma configuração experimental. Além disso, a ativação de células T pela molécula biespecífica anti-PDL1xCD137 PRO885 (SEQ ID NO: 209) ou pela molécula triespecífica anti-PDL1 xCD137xHSA PRO1175 (SEQ ID NO: 220), PRO1430 (SEQ ID NO: 222), PRO1479 (SEQ ID NO: 223) ou PRO1480 (SEQ ID NO: 229) foi comparada ao efeito do anticorpo de referência avelumab ou urelumab, ou uma combinação dos mesmos.

Método

[0400] As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas do sangue total humano fresco por meio de centrifugação em gradiente de densidade. Em seguida, os PBMC foram esgotados para as células NK usando o anticorpo anti-CD56 e o kit de separação de células MACS (Miltenyi Biotec). Em seguida, 100.000 PBMCs por poço foram adicionados à placa de 96 poços, seguido da adição de diluições em série de PRO885, PRO997, PRO1175, PRO1430, PRO1479 ou PRO1480, avelumab, urelumab e a combinação de avelumab e urelumab no ensaio tampão contendo SEA a uma concentração de 10 ng/ml. Após 96 horas de incubação a 37° C e 5% de CO2, os sobrenadantes celulares foram colhidos e os níveis de Interleucina-2 (IL-2) humana nos sobrenadantes da cultura foram quantificados usando o ensaio ELISA MAX humano de IL-2 da BioLegend de acordo com instruções do kit. As concentrações de IL-2 foram interpoladas a partir de uma curva padrão de IL-2, calculadas de volta e representadas graficamente contra avelumab, a combinação de avelumab e urelumab e concentrações de PRO885 para o cálculo de valores de EC50 (Figura 21 e Tabela 18), ou plotados contra avelumab, urelumab, a combinação de avelumab e urelumab, e concentrações de PRO885 e PRO1175, ou PRO1186 para o cálculo de valores de EC50 (Figura 23 e Tabela 19).

Resultados TABELA 18. Valores de EC50 para PRO885 e PRO997 no ensaio PBMC usando estimulação com SEA.

[0401] Como mostrado na Figura 21, a IL-2 foi secretada pelas células T após o bloqueio concomitante da interação PD-1/PDL1 e a estimulação de CD137 pela adição da molécula biespecífica PRO885. Quando comparado a avelumab, o PRO885 apresentou maior ativação das células T e melhor potência (PRO885, EC50 = 39,92 ng/ml; avelumab, EC50 = 69,89 ng/ml, Tabela 18). Esta descoberta demonstra que o scDb biespecífico anti-PDL1xCD137 PRO885 é capaz de induzir estimulação mais forte de células T do que o mero bloqueio de PDL1 por avelumab. Além disso, verificou-se que o scFv anti-PDL1 PRO997 de alta afinidade é mais potente na estimulação de células T do que avelumab (PRO997, EC50 = 40,86 ng/ml; avelumab, EC50 = 90,18 ng/ml, Tabela 18). Além disso, foi demonstrado que o scDb anti-PDL1xCD137 biespecífico PRO885: (i) foi capaz de induzir estimulação mais forte de células T do que urelumab (Figura 23), e (ii) foi mais potente na estimulação de células T do que urelumab (PRO 885, EC50 = 55,21 ng/ml, urelumab, EC50 = 278,3 ng/ml, Tabela 19).

TABELA 19. Valores de EC50 para avelumab, urelumab, a combinação de avelumab e urelumab, PRO885, e PRO1175 em ensaio de PBMC utilizando estimulação com SEA.

[0402] Além disso, enquanto a combinação de avelumab e urelumab foi capaz de induzir a estimulação de células T mais fortes do que avelumab sozinho (Figura 23), os scDb-scFvs PRO1175, PRO1186, PRO1430, PRO1479 e PRO1480 desencadearam uma produção ainda mais forte de IL-2 (Figuras 21 e 23), provavelmente devido à sua capacidade de hiperaglomeração de CD137. O scDb-scFv PRO1175 (i) foi capaz de induzir de forma significativa a estimulação mais forte de células T do que a combinação de avelumab e urelumab (Figura 23), e (ii) foi mais potente na estimulação de células T do que a combinação de avelumab e urelumab (PRO 1175, EC50 = 31,11 ng/ml, avelumab + urelumab, EC50 = 318,6 ng/ml, Tabela 19). Além disso, PRO1430, PRO1479, PRO1482 e PRO1480 demonstraram potência superior para estimular a produção de IL-2 em PMBCs, quando comparados às outras moléculas de scDb-scFv (Figuras 21 e 23). O scDb-scFv PRO1480 demonstrou a maior potência para estimular a produção de IL-2 em PMBCs quando comparado às outras moléculas de scDb-scFv testadas (Figuras 21).

Exemplo 9: A sinalização costim ocorre apenas em combinação com o estímulo de TCR e é mais pronunciada com scDb-scFv PDL1 xCD137 do que com a combinação de IgG 1 de PDL1 e IgG 4 de CD137.

[0403] Neste experimento, o efeito sinérgico da inibição de PD-1/PDL1 e do agonismo de CD137 foi avaliado. O ensaio utilizou células mononucleares do sangue periférico (PBMC) na presença de células CHO que expressam PDL1, um anticorpo anti-CD3, a fim de induzir a expressão de CD137 nas células T. Ao aplicar moléculas anti-PDL1xCD137, duas vias de sinalização reguladoras de células T foram direcionadas concomitantemente: inibição da via inibitória PD-1/PDL1, bem como ativação da via CD137 através da formação de uma sinapse imunológica mediada pela molécula anti- PDL1xCD137xHSA tri-específica (PRO 1186). A ativação das células T pela molécula tri-específica anti-PDL1xCD137xHSA PRO1186 foi avaliada pela secreção de Interleucina-2 (IL-2) ou IFNγ e comparada ao efeito mediado pela inibição da PDL1 mediada pelo anticorpo de referência comparativo avelumab, reticulação de CD137 mediada por urelumab ou uma combinação destes.

Método

[0404] As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas do sangue total humano fresco por meio de centrifugação em gradiente de densidade. Em seguida, 100.000 PBMCs por poço foram adicionados à placa de 96 poços contendo o anticorpo anti-CD3 (BD Pharmingen, Cat. No. 551916) a uma concentração de 2 mcg/ml e 10.000 células CHO que expressam PDL1 humana por poço, seguidas pela adição de diluições em série de PRO1186, avelumab, urelumab e a combinação de avelumab e urelumab no tampão de ensaio. Após 72 horas de incubação a 37° C e 5% de CO2, os sobrenadantes celulares foram colhidos e níveis de interleuquina-2 humana (IL-2) e IFNγ nos sobrenadantes de cultura foram quantificados. Os níveis de interleucina-2 (IL-2) foram quantificados utilizando o ensaio ELISA MAX humano de IL- 2 da BioLegend, de acordo com as instruções do kit. As concentrações de IL-2 foram interpoladas a partir de uma curva padrão de IL-2 (Figura 23E). Os níveis de IFNγ humano foram quantificados usando o ensaio IFN-γ DuoSet ELISA Humano da R&D Systems de acordo com as instruções do kit por ELISA (Figura 23F).

Resultados

[0405] Como mostrado na Figura 23(E) e (F), IL-2 e IFNy foram secretados pelas células T após o concomitante bloqueio da interação PD-1/PDL1 e estimulação de CD137 pela adição da molécula tri-específica PRO 1186. Esta descoberta demonstra que o scDb-scFv anti-PDL1xCD137xHSA PRO1186 triespecífico é capaz de induzir uma estimulação mais forte de células T do que o mero bloqueio de PDL1 por avelumab, ou bloqueio de CD137 por urelumab, ou a combinação dos mesmos. O PRO1186 foi mais potente para induzir a produção de IL-2 (Figura 23E) e IFNγ (Figura 23F) do que avelumab ou urelumab, ou a combinação dos mesmos. Na ausência de anticorpos anti-CD3, os níveis de IL-2 e IFNγ eram comparáveis à secreção basal de citocinas em todas as concentrações testadas, mostrando a necessidade de sinalização de TCR ou envolvimento de CD3 para sinalização produtiva de CD137.

Exemplo 10: Avaliação da eficácia antitumoral do bloqueio de PDL1 e estimulação localizada concomitante de CD137 no modelo de xenoenxerto de câncer de pulmão derivado de linhagem celular humana HCC827.

[0406] A atividade anti-tumoral do anticorpo multiespecífico da presente invenção foi comparada com a terapia de anti-PDL1 e anti-CD137 em xenoenxertos de HSC827 NSCLC humanos utilizando os camundongos NOG imunodeficientes de células mononucleares do sangue periférico de Taconic e alogênicas humanas. Linfócitos T humanos enxertados mostram xeno-reatividade contra classes I e II de histocompatibilidade principal (MHC) de estrangeiros e outros antígenos de células de camundongos. Como resultado, os linfócitos T causam um infiltrado inflamatório em diferentes órgãos que leva à morte dos animais após várias semanas, um processo conhecido como doença xenoenxerto versus hospedeiro (xGVHD). Foi demonstrado que o tratamento com anticorpos imunomoduladores, como anti- PDL1 e anti-CD137, exacerbou a xGVHD (Sanmamed MF et al. Nivolumab and urelumab enhance antitumor activity of human T lymphocytes engrafted in Rag2-/- IL2Rgnull immunodeficient mice. Cancer Res 2015;75(17):3466- 3478). Efeitos de PRO1057 (scDb-scFv; SEQ ID NO: 218) e PRO1060 (IgG-scFv com scFv de CD137 fundido com o terminal C da cadeia pesada da IgG; SEQ ID NOs: 234 e 235) sobre o volume tumoral foram comparados com o tratamento com a IgG1 contendo o mesmo domínio variável específico de PDL1 que o anticorpo multiespecífico da presente invenção (por exemplo, PRO1137) e com o IgG4 com o mesmo domínio variável específico de CD137 (PRO1138). Para fornecer evidência adicional de resposta imune localizada antitumoral, a frequência de linfócitos infiltrantes de tumores, tais como CD8+, CD4+ e células T reguladoras, foi analisada por citometria de fluxo. Para explorar a modulação do sistema imunológico sistemicamente após o tratamento anti- CD137/anti- PDL1, a frequência de células T CD4+ e CD8+ no fígado e baço foi analisada por citometria de fluxo. Além disso, os níveis sistêmicos de IFNg foram analisados utilizando um método de ELISA quantitativo.

Configuração do estudo e cronograma de tratamento

[0407] Camundongos NOG fêmeas receberam injeções unilaterais de 5x106 células HCC827. As células foram injetadas em uma mistura de suspensão celular a 50% em PBS e matrigel a 50% em um volume total de injeção de 100 µl. Após injeção de células de tumor em ratos NOG e o enxerto do tumor bem sucedido (volume médio de tumor do grupo de 80-100 mm3), os camundongos foram substituídos com 5x106 PBMC humanos por injeção intravenosa. No dia da randomização, quatro camundongos de cada grupo foram reconstituídos com PBMCs do doador A e outros quatro camundongos com PBMCs do doador B. O tratamento começou 1-2 horas após a injeção de PBMC e foi aplicado como segue: ID do dose Unidades no. dias de grupo composto diária relativas rota de dosagem total [mg] (rU) ratos 1 Veículo Na Na 0,3,7,10 ip 8 2 Dose baixa 0,08 mg 0,04 rU 0,3,7,10 ip 8 de PRO1057

3 Dose média 0,4 mg 0,2 rU 0,3,7,10 ip 8 PRO1057 4 Dose elevada 2 mg 1 rU 0,3,7,10 ip 8 de PRO1057 5 PRO1137 0,2 mg 1 rU 0,3,7,10 ip 8 6 PRO1138 0,2 mg 0,3,7,10 ip 8 7 PRO1060 0,2 mg 1 rU 0,3,7,10 ip 8

[0408] A dose elevada (HD) de PRO1057, bem como as doses de 0,2 mg de PRO1060 e PRO1137 foram definidas para atingir a mesma atividade relativa modelada para uma dose de 0,1 mg de Avelumab (por camundongo) com base em atividade in vitro dos anticorpos para bloquear a interação PD-1/PDL1 no ensaio do gene repórter NF-AT. Assim, uma dose de 2 mg de PRO1057 ou 0,2 mg de PRO1060 ou 0,2 mg de PRO1137 pode ser representada como uma unidade relativa (1 rU) em relação à dose de 0,1 mg de avelumab.

[0409] As medidas de peso corporal e volume tumoral por paquímetro foram realizadas duas vezes por semana. Os animais foram sacrificados em momentos definidos dependendo dos resultados do estudo. Todos os animais, exceto três, foram sacrificados no "mesmo" momento (no dia 17 e no dia 18). Três animais foram sacrificados já no dia 14 devido ao aparecimento da doença xenoenxerto versus hospedeiro (xGVHD). A coleta de amostra e processamento da primeira metade de cada grupo foram realizados no primeiro dia, e a coleta de amostra e processamento da segunda metade de cada grupo foram realizados no dia seguinte, por razões de capacidade. Os animais reconstituídos com PBMCs dos dois doadores diferentes foram igualmente representados nos dois coortes de amostragem. Tumores, baços e fígados a partir de todos os animais foram coletados no final do estudo e foram processados por citometria de fluxo, onde os seguintes marcadores humanos foram analisados: Vivo/Morto, CD4, CD8, CD25, FOXP3, TIM3, PD-1 e granzima B. As amostras de soro foram analisadas quanto aos níveis de IFNg por ELISA, utilizando o sistema de desenvolvimento DuoSet® ELISA da R&D Systems, de acordo com as instruções do fabricante.

Resultados

[0410] A atividade anti-tumoral dos anticorpos multiespecíficos PRO1057 (scDb-scFv anti-PDL1xCD137xHSA) e PRO1060 (formato Morrison anti-PDL1xCD137), anti-PDL1 (PRO1137) e anti-CD137 (PRO1138 ou urelumab) em xenoenxertos HCC827 NSCLC humanos utilizando a estirpe de ratos NOG imunodeficientes e as células mononucleares do sangue periférico humanas alogênicas (hPBMC) foram avaliadas medindo-se os volumes tumorais (Figura 24). Os volumes dos tumores foram medidos duas vezes por semana até os camundongos serem sacrificados no dia 17 ou no dia 18. Os volumes tumorais foram normalizados para o volume do tumor no início do tratamento (volume relativo do tumor). Tal como mostrado na Figura 24, camundongos portadores do tumor HCC827 tratados com anti-CD137 (PRO1138 ou urelumab) ou anticorpos monoclonais anti-PDL1 (PRO1137) mostraram crescimento do tumor semelhante ao do grupo de controle com veículo. Em contraste, o tratamento com anticorpos biespecíficos anti-PDL1xCD137 como um scDb-scFv (PRO1057) e uma IgG-scFv (PRO1060) resultou em uma estabilização clara do crescimento do tumor. Além disso, o tratamento com as moléculas biespecíficas anti-PDL1xCD137 em camundongos reconstituídos com PBMC do doador B resultou na regressão do tumor (Figuras 24B e 24D). Notavelmente, o tratamento com as moléculas biespecíficas não levou à perda de peso corporal médio, implicando que as moléculas são bem toleradas nas doses testadas, enquanto o tratamento com urelumab conduz a uma diminuição no peso corporal médio de 17 dias após o início do tratamento (Figura 25).

[0411] Além disso, as frequências de linfócitos T, nomeadamente células T reguladoras humanas (CD4+, FoxP3+; Figura 26A) e as células T humanas CD8+, foram analisadas em tumores no dia 17 ou dia 18 do tratamento (Figura 26). Linfócitos infiltrantes tumorais foram estudados por citometria de fluxo, e a razão de frequência de células T CD8+ humanas e frequência de células T humanas reguladoras (Treg) no micro ambiente tumoral (TME) foi determinada (Figura 26B).

[0412] O tratamento com urelumab sozinho resultou em uma frequência reduzida de células T reguladoras no microambiente do tumor, enquanto o tratamento anti-PDL1 (PRO1137) resultou em um aumento de células T reguladoras (Figura 26A). Curiosamente, o bloqueio de PD1/PDL1 e simultâneo desencadeamento de CD137 (presumivelmente na mesma célula) nos grupos de tratamento com PRO1057 e PRO1060 impediram um aumento das células T reguladoras observadas no grupo de tratamento anti-PDL1 (Figura 26A).

[0413] Além disso, o tratamento com anticorpos biespecíficos anti-PDL1xCD137 (PRO1057 e PRO1060) mostrou uma melhoria de mais do que duas vezes na razão intratumoral de células T CD8+ humanas/Treg humanas (CD4+FoxP3+) quando comparados com os grupos de tratamentos com monoterapias ou para o grupo controle veículo (Figura 26B). O aumento da razão CD8+/Treg observada nos grupos tratados com PRO1057 e PRO1060 indica que uma resposta antitumoral eficaz foi desencadeada pelos anticorpos biespecíficos anti-PDL1xCD137 no microambiente tumoral. A diminuição nas frequências das células T reguladoras e aumento das razões intratumorais de células T CD8+ humanas/Treg humanas (CD4+FoxP3+) após o tratamento com os anticorpos biespecíficos anti-PDL1xCD137 indicam que uma resposta efetora antitumoral/célula T de memória foi desencadeada com sucesso.

[0414] Além disso, a frequência de células T CD4+ e CD8+ que foram positivas para PD1 foi determinada para avaliar a percentagem de células T ativadas no microambiente tumoral (Figura 27). Foi observado um aumento dependente da dose nas células T CD8+ e CD4+ PD1-positivas para PRO1057, que em altas doses alcançaram níveis semelhantes de células T PD1-positivas como o tratamento com PRO1060 e PRO1037, confirmando a dosagem igual dos três compostos em termos da atividade de bloqueio de PDL1 (Figura 27A e B). Os dois anticorpos anti-CD137 PRO1038 e urelumab aparentemente não tiveram efeito na porcentagem de células T CD4+ ou CD8+ positivas para PD1.

Exemplo 11: Avaliação da eficácia antitumoral do bloqueio de PDL1 e estimulação localizada concomitante de CD137 em camundongos NOG enxertados com células-tronco hematopoiéticas CD34+ derivadas de sangue de cordão umbilical humano (UCB HSCs)

[0415] A atividade antitumoral do anticorpo multiespecífico da presente invenção foi comparada à terapia mono e em combinação de anti-PDL1 e anti-CD137 em xenoenxertos humanos HCC827 NSCLC usando estirpe de camundongos NOG enxertada com células-tronco CD34+ hematopoiéticas derivadas de sangue do cordão umbilical humano (UCB HSCs). O efeito de PRO1186 (scDb-scFv; SEQ ID NO:

221) no volume do tumor foi comparado com o tratamento com IgG1 contendo o mesmo domínio variável específico de PDL1 que o anticorpo multiespecífico da presente invenção (por exemplo, PRO1196, SEQ ID NOs: 242 e 243), Avelumab, urelumab. Além disso, o efeito de PRO1186 (scDb-scFv; SEQ ID NO: 221) no volume do tumor foi comparado com o tratamento combinado da IgG1 contendo o mesmo domínio variável específico de PDL1 que o anticorpo multiespecífico da presente invenção (PRO1196, SEQ ID NOs: 242 e 243) com o IgG4 com o mesmo domínio variável específico de CD137 (PRO1138, SEQ ID Nos: 244 e 245). Para fornecer evidência adicional de resposta localizada antitumoral imune, a frequência de linfócitos infiltrantes de tumores, tais como CD8+, CD4+ e células T reguladoras, foi analisada por citometria de fluxo. Para explorar a modulação do sistema imunológico sistemicamente após o tratamento anti-CD137/anti-PDL1, a frequência de células T CD4+ e CD8+ no fígado e baço foi analisada por citometria de fluxo. Além disso, os níveis sistêmicos de IFNγ foram analisados usando um método quantitativo de ELISA.

Configuração do estudo e cronograma de tratamento

[0416] Camundongos NOG fêmeas enxertados com células-tronco hematopoiéticas CD34+ derivadas de sangue de cordão umbilical humano (HSCs UCB) foram injetados subcutaneamente com células NCCLC HCC827. Os camundongos recebem injeções unilaterais de 5x106 células HCC827. As células foram injetadas em uma mistura de suspensão celular a 50% em PBS e matrigel a 50% em um volume total de injeção de 100 µl. Após a injeção de células tumorais em camundongos NOG e enxerto tumoral bem-sucedido (volume tumoral mediano do grupo de 80-100 mm3), os camundongos (n = 10) foram randomizados em grupos de tratamento:

dose ID do no. diária dias de grupo Composto rota de total dosagem ratos [mg] 1 Veículo (Palivizumab) 0,1 mg 0, 5, 10, ip 10 1 5, 20 2 IgG 1 anti-PD L1 0,1 mg 0,5,10,15, ip 10 (PRO1196) 20 3 Avelumab 0,1 mg 0,5,10,15, ip 10 20 4 Urelumab 0,1 mg 0,5,10,15, ip 10 20 5 Dose baixa de PRO1186 0,02 0,5,10,15, ip 10 mg 20 6 Dose média de PRO1186 0,1 mg 0,5,10,15, ip 10 20 7 Dose alta de PRO1186 0,5 mg 0,5,10,15, ip 10 20 8 Combinação anti-PDL1 IgG 0,1 mg 0,5,10,15, ip 10 1 (PRO1196) e anti-CD137 cada 20 IgG4 (PRO1138)

[0417] As medidas de peso corporal e volume tumoral por paquímetro foram realizadas duas vezes por semana. Os tumores foram colhidos no final do estudo e avaliados quanto à infiltração de células T humanas por citometria de fluxo.

Tumores, baços e fígados a partir de todos os animais foram recolhidos no final do estudo e foram processadas por citometria de fluxo, onde os seguintes marcadores humanos foram analisados: Vivo/Morto, CD4, CD8, CD25, FOXP3, TIM3, PD-1, e Granzyme B. As amostras de soro foram analisadas quanto aos níveis de IFNy por ELISA, utilizando o Sistema de Desenvolvimento DuoSet® ELISA da R&D Systems, de acordo com as instruções do fabricante.

Resultados

[0418] A atividade anti-tumoral dos anticorpos multiespecíficos PRO1186 (scDb-scFv anti-PDL1xCD137xHSA), anti- PDL1 (PRO1196 ou avelumab) e anti-CD137 (urelumab) em xenoenxertos HCC827 NSCLC humanos utilizando a estirpe de camundongos imunodeficientes NOG enxertados com células tronco hematopoiéticas CD34+ derivadas do sangue do cordão umbilical humano (UCB HSCs) foi avaliada medindo-se os volumes tumorais (Figuras 28 e 29). Os volumes tumorais foram medidos duas vezes por semana até os ratos serem sacrificados nos dias 25, 29 ou

30. Os volumes tumorais foram normalizados para o volume tumoral no início do tratamento (volume tumoral relativo). Conforme mostrado nas Figuras 28 e 29, o tratamento com anticorpos triespecíficos anti-PDL1xCD137xHSA, como um scDb-scFv (PRO1186) e a combinação de anti-PDL1 (PRO1196) e anti-CD137 (PRO1138), resultou em uma clara estabilização do crescimento do tumor. Notavelmente, o tratamento com as moléculas tri-específicas (PRO1186) não levou à perda de peso corporal médio, implicando que as moléculas são bem toleradas nos níveis de dose testados, enquanto o tratamento com a combinação de anti-PDL1 (PRO1196) e anti-CD137 (PRO1138) levou a um aumento no número de animais com perda de peso corporal superior a 10% ou 15%, respectivamente,

24 dias após o início do tratamento (Figura 30). A terapia com anti-PDL1xCD137xHSA (PRO1186) resultou em uma redução mais forte do crescimento de tumor do que a terapia com IgG anti-PDL1 (PRO1196) ou IgG anti-CD137 (urelumab). A terapia anti- PDL1xCD137xHSA (PRO1186) levou a taxas de resposta mais altas (30% vs 20%) e foi geralmente mais bem tolerada do que a terapia de combinação com anti-PDL1 e anti-CD137. Isso se correlaciona com a frequência mais alta de células T citotóxicas (CD8+ e CD8+, GrB+) e aumento de CD8+/CD4+ e razão CD8+, GrB+/Treg no tumor (Figuras 31 e 32). As frequências de linfócitos T, ou seja, as células T citotóxicas (CD8+, GrB+), células T CD4+ e células Tregs (Figuras 3 1 e 32), foram analisadas em tumores no dia 24, dia 29 e dia 30 do tratamento.

[0419] Além disso, foi realizada análise farmacocinética para quantificar anti-PDL1xCD137xHSA (PRO1186) em amostras de soro de animais no estudo de xenoenxerto HCC827 usando camundongos NOG substituídos por células-tronco CD34+ humanas (Figura 33, Tabela 20). As placas de ELISA foram revestidas durante a noite com CD137 e diluições em série de anti-PDL1xCD137xHSA (PRO1186) foram adicionadas para gerar uma curva de calibração. O anti- PDL1xCD137xHSA ligado (PRO1186) foi detectado com PDL1 humana biotinilada seguida por estreptavidina poli-HRP. As concentrações de PRO1186 em amostras de soro diluídas foram interpoladas a partir da curva de calibração. Os parâmetros farmacocinéticos foram estimados por meio do suplemento do software resolvedor PK, usando uma abordagem não compartimental. As meias-vidas de 41,7 horas, 36,8 horas e 38,4 horas foram determinadas pela análise da primeira fase de eliminação após a dosagem dos grupos PRO1186-HD (0,5 mg), PRO1186-MD (0,1 mg) e PRO1186-LD (0,02 mg), respectivamente.

TABELA 20. Análise farmacocinética de anti-PDL1xCD137xHSA (PRO1186) em amostras de soro de animais no estudo de xenoenxerto HCC827 usando camundongos NOG substituídos por células-tronco CD34+ humanas.

Molécula Dose/camundongo Rota T1/2 AUC0-d5 Razão AUC /ocasião [mg] [h] dose mais [mg/ml*h] alta/mais baixa 0,5 ip 41,6 16'978'964 PRO1186 0,1 ip 36,8 2'475'621 6,9 0,02 ip 38,4 331'269 7,5 Exemplo 12: Avaliação da eficácia antitumoral do bloqueio de PDL1 e estimulação localizada concomitante de CD137 em um modelo de câncer de cólon singênico MC38.

[0420] Além disso, a atividade antitumoral do anticorpo multiespecífico da presente invenção será testada em um modelo de carcinoma de cólon MC38 em camundongos singênicos C57BL/6 com um sistema imunológico intacto. Este modelo foi usado por outras pessoas para mostrar atividade antitumoral aprimorada por tratamento combinado com agonistas de CD137 e antagonistas de PD-1/PDL1 (Chen S et al. Combination of 4-1BB agonist and PD-1 antagonist promotes antitumor effector/memory CD8 T cells in a poorly immunogenic tumor model. Cancer Immunol Res 2014;3(2):149-160 e Rodriguez-Ruiz ME et al. Abscopal effects of radiotherapy are enhanced by combined immunostimulatory mAbs and are dependent on CD8 T cells and crosspriming. Cancer Res 2016;76(20):5994-6005).

[0421] Uma vez que ambos o domínio anti-CD137 e o domínio anti-PDL1 do anticorpo multiespecífico da presente invenção não são reativos para a PDL1 de camundongo, será usado um modelo modificado de engenharia de CD137 humano criado por CrownBio. Neste modelo, o domínio extracelular e transmembranar do CD137 de camundongo foi substituído pela respectiva sequência do CD137 humano na base de camundongos C57BL/6 usando o sistema CRISPR/Cas9. Além disso, será utilizada uma linha celular tumoral MC38 modificada que expressa PDL1 humana sob controle de um promotor de CMV em vez de PDL1 de camundongo. Efeitos do anticorpo multiespecífico da presente invenção sobre o volume tumoral será comparado com o tratamento com a combinação de IgG1 humanizado contendo o mesmo domínio variável específico de PDL1 como ND021 e com o IgG4 humanizado com o mesmo domínio variável específico de CD137. Para fornecer mais evidências da resposta imune antitumoral localizada, a frequência de linfócitos infiltrantes de tumores, como CD8+, CD4+ e células T reguladoras, será analisada por citometria de fluxo. Para explorar a modulação do sistema imunológico sistemicamente após o tratamento anti- CD137/anti-PDL1, a frequência das células T CD4+ e CD8+ no fígado e baço será analisada por citometria de fluxo e possivelmente imuno-histoquímica. Além disso, os níveis sistêmicos de IFNg podem ser analisados usando um método quantitativo de ELISA. Para caracterizar ainda mais o perfil de segurança da terapia combinada anti-CD137/anti-PDL1, os parâmetros da patologia química clínica associados principalmente à toxicidade hepática

(observada na terapia anti-CD137 na clínica), como níveis aumentados de alanina aminotransferase, glutamato desidrogenase e aspartato aminotransferase podem ser avaliados.

Exemplo 13: Anticorpos multiespecíficos exemplificativos da presente invenção.

Descrição geral scDb

[0422] Os diacorpos de cadeia única (scDb) são pequenos fragmentos de anticorpos bivalentes compostos por uma cadeia, compreendendo dois domínios VH e dois VL de dois anticorpos diferentes (Holliger et al. PNAS, 15 de julho de 1993; 90 (14): 6444-8). No formato Numab scDb, os domínios variáveis são conectados na orientação do domínio VLA-VHB-VLB-VHA por ligantes GS. Os ligantes nesses diacorpos de cadeia única (scDbs) forçam a montagem correta dos domínios e melhoram a estabilidade sem alterar a atividade de ligação ao antígeno. Os ligantes G4S curtos que conectam o VLA ao VHB e o VLB ao VHA são substancialmente mais curtos do que o necessário para permitir a montagem de domínios adjacentes e manter os domínios em uma conformação aberta, permitindo o emparelhamento correto dos domínios correspondentes. Os braços do diacorpo VLA-VHB e VLB- VHA são conectados por um ligante longo (G4S)4 entre os domínios VHB e VLB, permitindo a dimerização em uma orientação de cabeça a cauda, resultando em uma molécula bi-específica compacta com uma massa molecular de ∼50 kDa. O scDb pode ser expresso de forma recombinante em células hospedeiras de E. coli ou CHO-S. Veja a Figura 22A.

PRO885

[0423] PRO885 é uma molécula scDb compreendendo um domínio de ligação ao PDL1 externo (VLA/VHA) (33-03-G02 sc01) e um domínio específico de CD137 interno (VHB/VLB) (38-02-A04 sc01) conectado por dois flancos curtos ligantes G4S e um ligante central longo (G4S)4. Ambos os domínios consistem em CDRs de coelho que foram enxertadas em uma estrutura aceptora humana semelhante a VH4.

PRO951

[0424] PRO951 é uma molécula scDb compreendendo um domínio externo de ligação a PDL1 (VLA/VHA) (33-03-G02 sc01) e um domínio específico interno (VHB/VLB) de CD137 (38-27-C05 sc02) conectado por dois flancos curtos ligantes G4S e um ligante central longo (G4S)4. Ambos os domínios consistem em CDRs de coelho que foram enxertadas em estruturas aceptoras humanas. As CDRs específicas para PDL1 foram criadas em uma estrutura aceptora humana semelhante ao consenso de VH4, enquanto as CDRs específicas para CD137 foram criadas em uma estrutura aceptora humana semelhante ao consenso de VH3.

PRO1123

[0425] PRO1123 é uma molécula scDb que compreende um domínio externo de ligação a PDL1 (VLA/VHA) (33-03-G02 sc01) e um domínio específico interno (VHB/VLB) de CD137 (38-02-A04 sc05) conectado por dois flancos curtos ligantes G4S e um ligante central longo (G4S)4. Ambos os domínios consistem em CDRs de coelho que foram enxertadas em uma estrutura aceptora humana semelhante ao consenso de VH4. Além disso, o domínio CD137 contém poucos resíduos de coelho que participam na formação da interface VL- VH.

PRO1124

[0426] PRO1124 é uma molécula scDb compreendendo um domínio de ligação a PDL1 externo (VLA/VHA) (33-03-G02 sc01) e um domínio específico de CD137 interno (VHB/VLB) (38-02-A04 sc06) conectado por dois flancos curtos ligantes G4S e um ligante central longo (G4S)4. Ambos os domínios consistem em CDRs de coelho que foram enxertadas em uma estrutura aceptora humana semelhante ao consenso de VH4. Além disso, o domínio CD137 contém poucos resíduos de coelho participando da formação da interface VL-VH e potencialmente interagindo com o antígeno.

PRO1125

[0427] PRO1125 é uma molécula scDb compreendendo um domínio de ligação a PDL1 externo (VLA/VHA) (33-03-G02 sc02) e um domínio específico de CD137 interno (VHB/VLB) (38-02-A04 sc01) conectado por dois flancos curtos ligantes G4S e um ligante central longo (G4S)4. Ambos os domínios consistem em CDRs de coelho que foram enxertadas em uma estrutura aceptora humana semelhante ao consenso de VH4. Além disso, o domínio PDL1 contém poucos resíduos de coelho que participam na formação da interface VL- VH.

PRO1126

[0428] PRO1126 é uma molécula scDb que compreende um domínio de ligação a PDL1 externo (VLA/VHA) (33-03-G02 sc03) e um domínio específico de CD137 interno (VHB/VLB) (38-02-A04 sc01) conectado por dois flancos curtos ligantes G4S e um ligante central longo (G4S)4. Ambos os domínios consistem em CDRs de coelho que foram enxertadas em uma estrutura aceptora humana semelhante ao consenso de VH4. Além disso, o domínio PDL1 contém resíduos de coelho com mutação reversa participando da formação da interface VL-VH e potencialmente interagindo com o antígeno.

PRO1134

[0429] PRO1134 é uma molécula scDb compreendendo um domínio externo de ligação a PDL1 (VLA/VHA) (33-03-G02 sc07) e um domínio específico interno (VHB/VLB) de CD137 (38-02-A04 sc01) conectado por dois flancos curtos ligantes G4S e um ligante central longo (G4S)4. Ambos os domínios consistem em CDRs de coelho que foram enxertadas em uma estrutura aceptora humana semelhante ao consenso de VH4. Além disso, o domínio PDL1 contém resíduos de linha germinativa de coelho participando da formação da interface VL-VH e potencialmente interagindo com o antígeno.

Descrição geral scDb-scFv

[0430] Um scDb-scFv é um formato desenvolvido na Numab que adiciona um terceiro par de domínio variável de cadeia única (VLC/VHC) conectado via ligante (G4S)2 ao formato diacorpo de cadeia única altamente estável (scDb), conforme descrito acima (Orientação de domínio VLA-VHB-VLB-VHA com ligantes de núcleo G4S curtos e ligante central longo (G4S)4). Assim, o formato scDb- scFv consiste em um arranjo em tandem de um scDb com uma entidade scFv em uma única cadeia de proteínas e um peso molecular de ~80 kDa. O fragmento de anticorpo scDb-scFv pode ser expresso de forma recombinante em células de mamífero. Veja a Figura 22B.

PRO963

[0431] PRO963 é uma molécula scDb-scFv que consiste em um núcleo de scDb anti-PDL1 (33-03-G02 sc01, VLA/VHA) e anti-CD137 (38-02-A04 sc01, VHB/VLB) fundido no terminal C com uma entidade scFv anti-HSA (19-01-H04-sc03, VLC/VHC). Os domínios específicos de PDL1 e CD137 são estruturas aceptoras semelhantes ao consenso de VH4 humano com CDRs de coelho enxertadas, enquanto o domínio HSA consiste em CDRs de coelho enxertadas em uma estrutura aceptora baseada em VH3 humana contendo resíduos de coelho adicionais que suportam a preservação das características parentais de ligação de IgG de coelho.

PRO966 (PRO1052)

[0432] PRO966 é uma molécula scDb-scFv que consiste em um núcleo de scDb anti-PDL1 (33-03-G02 sc01, VLA/VHA) e anti-CD137 (38-27-C05 sc01, VHB/VLB) fundido no terminal C com uma entidade scFv anti-HSA (19-01-H04-sc03, VLC/VHC). Os domínios específicos de PDL1 e CD137 são estruturas aceptoras semelhantes ao consenso de VH4 humano com CDRs de coelho enxertadas, enquanto o domínio HSA consiste em CDRs de coelho enxertadas em uma estrutura aceptora baseada em VH3 humano contendo resíduos de coelho adicionais que suportam a preservação das características parentais de ligação de IgG de coelho.

PRO1057

[0433] PRO1057 é uma molécula scDb-scFv que consiste em um núcleo de scDb anti-PDL1 (33-03-G02 sc01, VLA/VHA) e anti-CD137 (38-02-A04 sc01, VHB/VLB) fundido no terminal C com uma entidade scFv anti-HSA (23-13-A01-sc03, VLC/VHC). Os domínios específicos de PDL1 e CD137 são estruturas aceptoras semelhantes ao consenso de VH4 humano com CDRs de coelho enxertadas, enquanto o domínio HSA consiste em CDRs de coelho enxertadas em uma estrutura aceptora baseada em VH3 humana contendo resíduos de coelho adicionais que suportam a preservação das características parentais de ligação de IgG de coelho, incluindo reatividade à albumina sérica murina.

PRO1058

[0434] PRO1058 é uma molécula scDb-scFv que consiste em um núcleo de scDb anti-PDL1 (33-03-G02 sc01, VLA/VHA) e anti-CD137 (38-27-C05 sc01, VHB/VLB) fundido no terminal C com uma entidade scFv anti-HSA (23-13-A01-sc03, VLC/VHC). Os domínios específicos de PDL1 e CD137 são estruturas aceptoras semelhantes ao consenso de VH4 humano com CDRs de coelho enxertadas, enquanto o domínio HSA consiste em CDRs de coelho enxertadas em uma estrutura aceptora baseada em VH3 humano contendo resíduos de coelho adicionais que suportam a preservação das características parentais de ligação de IgG de coelho, incluindo reatividade à albumina sérica murina.

PRO1186

[0435] PRO1086 é uma molécula scDb-scFv que consiste em um núcleo de scDb anti-PDL1 (37-20-B03 sc01, VLA/VHA) e anti-CD137 (38-02-A04 sc01, VHB/VLB) fundido no terminal C com uma entidade scFv anti-HSA (23-13-A01-sc03, VLC/VHC). Os domínios específicos de PDL1 e CD137 são estruturas aceptoras semelhantes ao consenso de VH4 humano com CDRs de coelho enxertadas, enquanto o domínio HSA consiste em CDRs de coelho enxertadas em uma estrutura aceptora baseada em VH3 humano contendo resíduos de coelho adicionais que suportam a preservação das características de ligação de IgG de coelho dos pais, incluindo reatividade à albumina sérica murina.

PRO1430

[0436] PRO1430 é uma molécula scDb-scFv que consiste em um núcleo de scDb anti-PDL1 (37-20-B03 sc01, VLA/VHA) e anti-CD137 (38-02-A04 sc13, VHB/VLB) fundido no terminal C com uma entidade scFv anti-HSA (19-01-H04 sc03, VLC/VHC). O domínio específico de PDL1 é uma estrutura aceptora semelhante ao consenso de VH4 humano com CDR de coelho enxertadas, enquanto os domínios CD137 e HSA consistem em CDR de coelho enxertadas em estruturas aceptoras baseadas em VH3 humano. O domínio HSA contém resíduos adicionais da estrutura de coelho que sustentam a preservação das características parentais de ligação de IgG de coelho e o domínio específico de CD137 contém uma ligação dissulfeto VL/VH estabilizante entre domínios.

PRO1479

[0437] PRO1479 é uma molécula scDb-scFv que consiste em um núcleo de scDb anti-PDL1 (37-20-B03 sc0 9.1, VLA/VHA) e anti- CD137 (38-02-A04 sc 13, VHB/VLB) fundido no núcleo no terminal C com uma entidade scFv anti-HSA (19-01-H04 sc03, VLC/VHC). Todos os domínios são estruturas aceptoras semelhantes ao consenso de VH3 humano com CDR de coelho enxertadas. Os domínios específicos de PDL1 e HSA contêm resíduos de estrutura de coelho adicionais que suportam a preservação das características parentais de ligação de IgG de coelho e o domínio específico de CD137 contém uma ligação dissulfeto de inter-domínio VL/VH estabilizante.

PRO1482

[0438] PRO1482 é uma molécula scDb-scFv consistindo em um scDb anti-CD137 (38-02-A04-SC13, VLA/VHA) e anti-PDL1 (3 7-20- B03 SC0 3, VHB/VLB) fundido no núcleo no terminal C com uma entidade scFv anti-HSA (19-01-H04 sc03, VLC/VHC). O domínio específico de PDL1 é uma estrutura aceptora semelhante ao consenso de VH4 humano com CDRs de coelho enxertadas, enquanto os domínios específicos CD137 e HSA consistem em CDRs de coelho enxertadas em estruturas aceptoras baseadas em VH3 humana. Todos os domínios contêm resíduos de estrutura de coelho adicionais que apoiam a preservação das características parentais de ligação de IgG de coelho.

PRO1431

[0439] PRO1431 é uma molécula scDb-scFv que consiste em um núcleo de scDb anti-PDL1 (33-03-G02 sc 18, VLA/VHA) e anti-CD137 (38-02-A04 sc 13, VHB/VLB) fundido no núcleo no terminal C com uma entidade scFv anti-HSA (19-01-H04 sc03, VLC/VHC). O domínio específico de PDL1 é uma estrutura aceptora semelhante ao consenso de VH4 humano com CDRs de coelho enxertadas, enquanto os domínios específicos CD137 e HSA consistem em CDRs de coelho enxertadas em estruturas aceptoras baseadas em VH3 humano. O domínio HSA contém resíduos adicionais da estrutura de coelho que suportam a preservação das características parentais de ligação de IgG de coelho e o domínio específico de CD137 contém uma ligação dissulfeto de inter-domínio VL/VH estabilizante.

PRO1473

[0440] PRO1473 é uma molécula scDb-scFv que consiste em um núcleo de scDb anti-PDL1 (33-03-G02 sc 03, VLA/VHA) e anti-CD137 (38-02-A04 sc 13, VHB/VLB) fundido no núcleo no terminal C com uma entidade scFv anti-HSA (19-01-H04 sc03, VLC/VHC). O domínio específico de PDL1 é uma estrutura aceptora semelhante ao consenso de VH4 humano com CDRs de coelho enxertadas, enquanto os domínios específicos CD137 e HSA consistem em CDRs de coelho enxertadas em estruturas aceptoras baseadas em VH3 humano. Os domínios específicos HSA e PDL1 contêm resíduos de estrutura de coelho adicionais que suportam a preservação das características parentais de ligação de IgG de coelho e o domínio CD137 contém uma ligação de dissulfeto inter-domínios VL/VH estabilizante.

PRO1476

[0441] PRO1476 é uma molécula scDb-scFv consistindo em um scDb anti-CD137 (38-02-A04 sc 13, VLA/VHA) e anti-PDL1 (33-03- G02 sc03, VHB/VLB) fundido no núcleo no terminal C com uma entidade scFv anti-HSA (19-01-H04 sc03, VLC/VHC). O domínio específico de PDL1 é uma estrutura aceptora semelhante ao consenso de VH4 humano com CDRs de coelho enxertadas, enquanto os domínios específicos CD137 e HSA consistem em CDRs de coelho enxertadas em estruturas aceptoras baseadas em VH3 humanas. Os domínios específicos de HSA e PDL1 contêm resíduos de estrutura de coelho adicionais que suportam a preservação das características parentais de ligação de IgG de coelho e o domínio específico de CD137 contém uma ligação dissulfeto de inter- domínio VL/VH estabilizante.

PRO1432

[0442] PRO1432 é uma molécula scDb-scFv consistindo em um scDb anti-CD137 (38-02-A04 sc 13, VLA/VHA) e anti-PDL1 (33-03- G02 sc 18, VHB/VLB) fundido no núcleo no terminal C com uma entidade scFv anti-HSA (19-01-H04 sc03, VLC/VHC). O domínio específico de PDL1 é uma estrutura aceptora semelhante ao consenso de VH4 humano com CDRs de coelho enxertadas, enquanto os domínios específicos CD137 e HSA consistem em CDRs de coelho enxertadas em estruturas aceptoras baseadas em VH3 humano. Os domínios específicos de HSA e PDL1 contêm resíduos de estrutura de coelho adicionais que suportam a preservação das características parentais de ligação de IgG de coelho e o domínio específico de CD137 contém uma ligação dissulfeto de inter- domínio VL/VH estabilizante.

PRO1480

[0443] PRO1480 é uma molécula scDb-scFv que consiste em um scDb anti-PDL1 (37-20-B03 sc0 9.1, VLA/VHA) e anti-CD137 (38- 27-A11sc02, VHB/VLB) fundido no núcleo no terminal C com uma entidade scFv anti-HSA (19-01-H04 sc03, VLC/VHC). Todos os domínios são estruturas aceptoras semelhantes ao consenso de VH3 humano com CDR de coelho enxertadas. Os domínios específicos de PDL1 e HSA contêm resíduos de estrutura de coelho adicionais que suportam a preservação das características parentais de ligação de IgG de coelho.

PRO1481

[0444] PRO1481 é uma molécula scDb-scFv que consiste em um scDb anti-PDL1 (37-20-B03 sc0 9.1, VLA/VHA) e anti-CD137 (38- 27-A11sc03, VHB/VLB) fundido no núcleo no terminal C com uma entidade scFv anti-HSA (19-01-H04 sc03, VLC/VHC). Todos os domínios são estruturas aceptoras semelhantes ao consenso de VH3 humano com CDR de coelho enxertadas. Os domínios específicos de PDL1, CD137 e HSA contêm resíduos adicionais de estrutura de coelho que suportam a preservação das características parentais de ligação de IgG de coelho.

PRO1480 com DiS

[0445] PRO1480 com DiS é uma molécula scDb-scFv que consiste em um núcleo de scDb anti-PDL1 (37-20-B03 sc0 9.1, VLA/VHA) e anti-CD137 (38-27-A11sc07, VHB/VLB) fundido no núcleo no terminal C com uma entidade scFv anti-HSA (19-01-H04 sc03, VLC/VHC). Todos os domínios são estruturas aceptoras semelhantes ao consenso de VH3 humano com CDR de coelho enxertadas. Os domínios específicos de PDL1 e HSA contêm resíduos de estrutura de coelho adicionais que suportam a preservação das características parentais de ligação de IgG de coelho e o domínio específico de CD137 contém uma ligação dissulfeto de inter- domínio VL/VH estabilizante.

Descrição geral IgG-scFv

[0446] As moléculas de IgG-scFv são anticorpos biespecíficos que consistem em porções scFv fundidas a uma IgG monoespecífica (Coloma MJ, Morrison SL Nat. Biotechnol. 1997; 15: 159-163.). O terminal amino ou carboxi de cada cadeia leve ou pesada pode ser anexado com domínios scFv de especificidades ainda diferentes, o que leva a um repertório diversificado de tipos de anticorpos biespecíficos IgG-scFv. As moléculas produzidas em Numab são do tipo IgG(H)-scFv ou IgG(L)-scFv, dois scFvs com a mesma especificidade ligada ao terminal C da cadeia pesada de IgG (HC) ou cadeia leve (LC) de comprimento total, contendo uma porção Fc silenciada e um ligante (G4S)2 que conecta a porção de IgG à porção scFv. O peso molecular total de ambos os tipos é de ~200 kDa e as moléculas podem ser expressas recombinantemente em células de mamíferos. Veja as figuras 22C e 22D.

PRO1059 (IgG(L)-scFv)

[0447] hIgG1 silenciosa anti-PDL1 (33-03-G02-SC01) com um domínio de scFv anti-CD137 (38-02-A04 SC01) fundido com o terminal C da LC. Um ligante (G4S)2 está conectando a porção de

IgG à porção scFv, que consiste em um domínio VL conectado via um ligante (G4S)4 ao domínio VH correspondente.

PRO1060 (IgG(H)-scFv)

[0448] hIgG1 anti-PDL1 silencioso (33-03-G02-sc01) com um domínio scFv anti-CD137 (38-02-A04 sc01) fundido ao terminal C da HC. Um ligante (G4S)2 está conectando a porção de IgG à porção scFv, que consiste em um domínio VL conectado via um ligante (G4S)4 ao domínio VH correspondente.

PRO1061 (IgG(L)-scFv)

[0449] hIgG1 silenciado anti-PDL1 (33-03-G02-SC01) com um domínio de scFv anti-CD137 (38-27-C05 sc01) fundido com o terminal C da LC. Um ligante (G4S)2 está conectando a porção de IgG à porção scFv, que consiste em um domínio VL conectado via um ligante (G4S)4 ao domínio VH correspondente.

PRO1062 (IgG(H)-scFv)

[0450] hIgG1 anti-PDL1 silencioso (33-03-G02-sc01) com um domínio de scFv anti-CD137 (38-27-C05 sc01) fundido ao terminal C da HC. Um ligante (G4S)2 está conectando a porção IgG com a porção de scFv, que em si é constituída por um domínio VL ligado através de ligante (G4S)4 ao domínio VH correspondente.

Exemplo 14: Caracterização Biofísica Caracterização biofísica dos domínios selecionados

[0451] Os domínios selecionados foram produzidos em escala maior (volume de expressão de 0,2L-1,2L) e foram concentrados para > 10 mg/mL usando tubos de concentração centrífuga após purificação (Tabela 21).

[0452] Os ScFvs foram submetidos a estudos de estabilidade, como um estudo de estabilidade de quatro semanas, no qual os scFvs foram formulados em um tampão aquoso (tampão de citrato de fosfato 50 mM com NaCL 150 mM a pH 6,4) a 10 mg/ml e armazenado em < -80° C, 4° C e 40° C por quatro semanas. No mínimo, a fração de monômeros e oligômeros na formulação foi avaliada pela integração das áreas de pico de SE-HPLC após uma semana, duas semanas e no final de cada estudo. Momentos temporais adicionais foram registrados para algumas das moléculas. A Tabela 22 compara as medições de d7 e ponto-final (endpoint) obtidas em d28 do estudo.

[0453] Além disso, a compatibilidade das moléculas de scFv foi avaliada em relação aos ciclos de congelamento- descongelamento (F/T) (estabilidade coloidal). Para a avaliação da estabilidade F/T, foram aplicados os mesmos métodos e parâmetros analíticos (% de teor de monômeros e % de perda de monômeros) como para o estudo de estabilidade de armazenamento (SE-HPLC, SDS-PAGE) para monitorar a qualidade das moléculas em cinco ciclos F/T. A Tabela 23 mostra o curso do teor de monômero em % ao longo de cinco ciclos F/T repetidos. Nenhuma das moléculas perdeu > 4% de teor monomérico após repetidos ciclos F/T.

[0454] O desdobramento térmico das moléculas foi avaliado usando o corante fluorescente SYPRO laranja. Amostras em condições relevantes de excipiente foram preparadas e o ensaio foi realizado em uma máquina qPCR. A emissão de fluorescência foi detectada usando a rotina de calibração de corante personalizada do software. A placa de PCR contendo as amostras de teste foi submetida a uma rampa de temperatura de 25° C a 96°

C em incrementos de 1° C. O ponto médio da transição de desdobramento (Tm) foi calculado pelo software GraphPad Prism, utilizando um método de segunda derivada matemática para calcular o ponto de inflexão da curva. A Tm relatada é uma média de três medições. A Tabela 24 mostra as temperaturas de fusão das moléculas formuladas em tampão genérico (tampão de fosfato- citrato a pH 6,4, NaCl 150 mM).

[0455] As principais moléculas selecionadas foram submetidas a um estudo de estabilidade de estresse de pH de curto prazo, no qual as moléculas de scFv foram formuladas a 1 mg/ml em um conjunto de sistemas tampão aquosos (citrato de fosfato) com valores de pH entre 3,5 e 7,5. O teor monomérico em % e % de perda de monômero foi analisado após armazenamento por 2 semanas a 40° C nos respectivos sistemas tampão (dados não mostrados). Um resumo tabulado do teor monomérico, perda monomérica, concentração e perda de concentração ao longo do estudo é mostrado na Tabela 25.

Caracterização biofísica dos anticorpos multiespecíficos

[0456] As moléculas multiespecíficas selecionadas foram submetidas a estudos de estabilidade, como um estudo de estabilidade de quatro semanas, no qual as moléculas multiespecíficas foram formuladas no seguinte tampão: tampão fosfato e citrato 25 mM com NaCl 150 mM, sacarose 1 M a pH 5,5 a 10 mg/ml e armazenado a <- 20° C, 4° C, 20° C e 40° C durante quatro semanas. No mínimo, a fração de monômeros e oligômeros na formulação foi avaliada após um dia, 4 dias, uma semana e todas as semanas até 12 semanas utilizando SE-HPLC. A tabela resume as descobertas na Tabela 26.

Tabela 21. Fabricação de domínios para estudo de estabilidade

ID do clone ID de Estratégia Volume Sistema Quantid Rendim SEC Rend Rendime Pureza Teor Perda proteína de de de ade de ento S/N imen nto por SE-HPLC monomér monomér enxertia express express proteín pós- ? to L de [% ico a ica na ão [mL] ão a após proteí fina express monômer 10 concent proteín na L l ão o] mg/mL ração a L [mg/L] [mg] [mg/L] [%] de 10

[mg] mg/mL

38-02-A04-sc05 PRO1181 IF 1200 BL21 9,3 7,8 S 4,7 3,9 88 77,8 10,2

38-02-A04-sc06 PRO1182 FULL 1200 BL21 19,8 16,5 S 5,6 4,7 95 72,9 22,1

38-02-A04-sc09 PRO1348 CDR 200 CHO 16,6 83,1 N 8 39,8 97 94,3 2,7

38-02-A04-sc13 PRO1352 CDR com ID 200 CHO 12,2 61 S 3,9 19,3 99,1 99,0 0,1 diS

38-27-A11 sc02 PRO1359 CDR 200 CHO 13,7 68,5 S 6,8 34,2 99 99,0 0,0

38-27-A11 sc03 PRO1360 FULL 200 CHO 12,9 64,7 S 6,2 30,8 99,1 98,7 0,4

Rend Rendim Perda de imen Rendimen Pureza Teor de Volume ento Rendi teor de to to final SE-HPLC monômero a ID de Estru de após Purificaç mento Tm monômero ID do clone pós por L de [% 10 mg/mL [% proteína tura express captur ão SEC? final [°C] na Capt expressã monômer de ão [mL] a [mg] concentraç o L o [mg/L] o] monômero] [mg/L] ão [%] [mg]

33-03-G02-sc01 PRO830* VH4 300 2,0 6,7 NÃO 2,0 6,7 99,0 80,0 98,3 -0,7

33-03-G02-sc03 PRO1183* VH4 1200 16,9 14,1 SIM 4,0 3,3 100,0 NA 99,7 -0,3

33-03-G02-sc18 PRO1392 VH4 200 9,3 46,7 NÃO 7,4 37,2 97,0 72,4 97,4 0,4

37-20-B03-sc01 PRO908* VH4 1200 18,6 15,5 SIM 5,3 4,4 89,0 NA 75,4 -15,3

37-20-B03-sc09 PRO1347 VH3 200 8,0 38,9 SIM 2,3 11,5 98,1 74,8 98,5 0,4

*expressão bacteriana

Tabela 22 A. Quatro semanas estudo de estabilidade do anti-CD137 scFv domínios.

ID do clone ID de Temp. Teor Teor monomérico perda de Concentração de perda de teor proteína [° C] monomérico [%] teor proteína [mg/mL] proteico [%] inicial [%] monomérico [%] d0 d7 d28 d7 d28 d0 d7 d28 d7 d28 -80 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA 38-02-A04-sc05 PRO1181 4 77,8 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA 40 77,8 78,2 77,8 -0,5 0,1 10,4 10,4 9,6 0,2 7,7 -80 72,9 72,8 72,9 0,1 0,0 20,6 21,0 24,8 -2,0 -20,5 38-02-A04-sc06 PRO1182 4 72,9 72,9 72,8 73,5 0,1 -0,8 20,6 20,7 19,9 -0,7 3,3 40 72,9 72,8 72,1 0,1 1,1 20,6 20,5 20,7 0,3 -0,6

-80 94,3 93,2 91,2 1,1 3,3 10,0 11,0 11,2 -10,3 -11,8

38-02-A04-sc09 PRO1348 4 94,3 94,3 84,6 83,4 10,3 11,5 10,0 11,2 11,3 -12,1 -13,2

40 94,3 85,7 84,5 9,1 10,4 10,0 11,5 12,0 -15,2 -20,5

-80 99,0 99,1 99,1 0,0 -0,1 11,4 11,8 11,7 -3,6 -2,7

38-02-A04-sc13 PRO1352 4 99,0 99,0 99,1 99,1 -0,1 -0,1 11,4 11,9 11,8 -4,3 -3,7

40 99,0 99,1 99,0 -0,1 0,0 11,4 12,5 12,9 -9,3 -13,2

-80 99,0 99,0 98,8 98,8 0,2 0,2 10,5 11,2 11,6 -7,0 -11,0

38-27-A11 sc02 PRO1359 4 99,0 98,8 97,9 0,2 1,2 10,5 11,2 11,1 -6,6 -5,5

40 99,0 80,1 79,1 19,1 20,1 10,5 10,8 11,1 -3,2 -6,3

-80 98,7 98,7 98,6 97,4 0,1 1,3 10,9 9,7 10,3 11,1 5,6

38-27-A11 sc03 PRO1360 4 98,7 97,7 93,1 1,0 5,7 10,9 10,6 9,3 2,8 14,6

40 98,7 79,0 77,4 20,0 21,6 10,9 12,0 11,2 -9,9 -2,7

Tabela 22B. Estudo de estabilidade de quatro semanas dos domínios anti-PDL1 scFv.

Temp ID da Teor monomérico Concentração de Perda do teor de ID do Clone Proteína [°C] [%] Perda monomérica [%] Proteína [mg/mL] proteína [%] d0 d7 d28 d7 d28 d0 d7 d28 d7 d28 -80 98,3 98,5 98,4 -0,2 -0,1 10,5 12,0 11,4 -14,2 -9,2 33-03-G02-sc01 PRO830 4 98,3 97,9 96,8 0,4 1,6 10,5 12,4 12,0 -18,6 -14,5 40 98,3 93,3 84,9 5,0 13,6 10,5 10,4 11,6 0,6 -10,6 -80 99,7 NA 99,4 NA 0,3 20,6 20,8 21,1 NA -2,6 33-03-G02-sc03 PRO1183 4 99,7 NA 87,9 NA 11,8 20,6 20,8 21,0 NA -1,9 40 99,7 NA 71,0 NA 28,8 20,6 21,0 22,0 NA -7,1

-80 97,4 97,4 97,2 0,0 0,2 10,6 9,4 11,0 11,7 -3,9

33-03-G02-sc18 PRO1392 4 97,4 97,1 96,9 0,2 0,5 10,6 10,7 10,7 -0,9 -1,3

40 97,4 94,2 84,7 3,2 13,0 10,6 10,7 11,2 -0,8 -5,9

-80 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA

37-20-B03-sc09 PRO1347 4 98,5 97,1 94,6 1,4 4,0 10,6 11,4 11,5 -7,6 -8,0

40 98,5 83,1 75,6 15,6 23,3 10,6 11,9 11,7 -12,1 -10,0

-80 75,4 74,4 73,5 1,4 2,5 10,4 10,3 9,9 1,1 4,8

37-20-B03-sc01 PRO908 4 75,4 74,1 73,8 1,7 2,1 10,4 9,9 9,9 4,9 4,7

40 75,4 75,4 73,2 0,0 3,0 10,4 11,5 11,4 -11,0 -9,6

Tabela 23. Avaliação da estabilidade F/T ao longo do tempo de 28 d.

ID do clone ID PRO F/T-1* F/T-2* F/T-3* F/T-4* F/T-5* 38-02-A04-sc13 PRO1352 0,0 0,1 N/D N/D N/D 38-27-A11 sc02 PRO1359 0,0 -0,2 -0,1 -0,1 -0,2 38-27-A11 sc03 PRO1360 -0,1 -0,1 -0,3 -0,2 -1,3 *% de perda monomérica mediante F/T ID do clone Estratégia Estru ID PRO F/T-1* F/T-2* F/T-3* F/T-4* F/T-5* de enxertia tura 37-20-B03-sc01 CDR VH4 PRO908 -0,8 -1,0 -1,1 -0,4 -1,9 33-03-G02-sc03 CHEIO VH4 PRO1183 -0,1 -0,4 -0,3 -0,4 -0,3 33-03-G02-sc18 PRO1183 VH4 PRO1392 -0,1 0,0 0,0 -0,2 -0,2 opt.

33-03-G02-sc01 CDR VH4 PRO830 0,2 0,1 0,1 N/D N/D 33-02-G02-sc09 CHEIO VH3 PRO1400 0,0 0,0 -0,1 N/D N/D *% de perda monomérica mediante ciclo F/T X NA: não avaliado Tabela 24. Fluorimetria de Varredura Diferencial dos domínios de scFv.

ID do clone ID de Estratégia de enxertia Tm Tinício proteína [°C] [°C]

38-02-A04-sc09 PRO1348 CDR (*) 61,1 56,7 38-02-A04-sc13 PRO1352 CDR com ID diS (*) 55,2 50,0 38-02-A04-sc13 PRO1352 CDR com ID diS (**) 62,6 58,0 38-27-A11 sc02 PRO1359 CDR (*) 64,4 61,0 38-27-A11 sc02 PRO1359 CDR (**) 68,3 64,3 (*) Resultados de experimentos usando uma concentração de proteína padrão de 100 µg/ml.

(**) Resultados de experimentos utilizando uma concentração de proteína de 50 ug/ml (experimento repetido devido à forma não- ideal da curva de fusão na concentração padrão).

ID de Tinício ID do clone proteína Tm [°C] [°C] 33-03-G02-sc18 PRO1392 72,40 67,00 37-20-B03-sc01 PRO997 64,39 59,00 37-20-B03-sc09 PRO1347 74,85 67,33 Tabela 25. Resumo tabulado da avaliação da estabilidade do pH perda concentração teor perda de ID do ID de Tampão monomérica de proteína Temperatura monomérico [%] teor [%] clone proteína final [%] [mg/mL] d0 d7 d14 d7 d14 d0 d7 d14 d7 d14 98, 98, 98, 1, 1, - pH 3,5 0,2 -0,2 1,1 3,0 38-02- 2 4 2 1 0 3,3 PRO1352 4° C A04 sc13 98, 98, 98, 0, 1, 10, - pH 4,5 0,2 -0,2 1,0 2 4 3 9 0 1 0,5

98, 98, 98, 1, 1, - pH 5,5 0,4 -0,2 1,1 9,5 1 4 2 0 0 0,6

- 98, 98, 1, 0, 26, pH 6,5 N/D N/D 0,1 1,0 14, 0 1 0 8 5 1

98, 98, 1, 1, pH 7,5 N/D N/D 0,2 1,0 1,1 6,7 0 2 0 0

98, 98, 98, 1, 1, - pH 3,5 -0,2 0,2 1,1 6,5 2 0 2 1 1 6,6

98, 98, 98, 0, 1, 18, - pH 4,5 1,1 0,1 1,0 2 0 1 9 1 4 4,1

98, 98, 98, 1, 1, 3,6 3,3 40° C pH 5,5 1,3 0,1 1,1 1 0 1 0 0 , ,

98, 98, 1, 1, pH 6,5 N/D 1,4 0,2 1,1 6,7 2,8 0 2 0 0

98, 98, 1, 1, 6,3 pH 7,5 N/D 1,4 0,1 1,1 4,1 0 1 0 0 ,

96, 96, 1, 1, - pH 3,5 N/D N/D -0,1 1,0 0,8 9 8 0 0 8,6

96, 97, 97, 1, 1, - pH 4,5 0,1 0,0 1,0 3,8 38-27- 9 0 0 0 0 7,3 PRO1359 4° C A11 sc02 96, 97, 96, 1, 0, - pH 5,5 0,3 -0,2 1,0 7,7 7 0 8 0 9 6,7

96, 97, 96, 1, 1, - pH 6,5 0,3 -0,1 1,0 4,0 7 0 9 0 0 3,2

96, 97, 96, 1, 1, - pH 7,5 0,4 -0,3 1,0 4,0 6 0 7 0 0 2,4

97, 97, 1, 1, - pH 3,5 N/D N/D 0,1 1,0 4,1 2 3 0 0 5,8

96, 97, 97, 1, 0, - pH 4,5 0,1 0,3 1,0 8,9 9 0 3 0 9 9,0

96, 97, 97, 1, 0, - 10, 40° C pH 5,5 0,3 0,4 1,0 7 0 4 0 9 7,9 8

96, 97, 97, 1, 0, - pH 6,5 0,9 0,0 1,0 7,0 7 5 5 0 9 4,6

96, 98, 97, 1, 1, - pH 7,5 1,4 -0,4 1,0 4,5 6 0 6 0 0 0,2

- 94, 94, 93, 1, 1, 21, pH 3,5 -0,1 -0,1 1,2 11, 1 0 9 1 0 1 1

93, 94, 93, 1, 1, pH 4,5 0,3 -0,3 1,1 2,5 7,7 8 0 7 0 0

4° C 93, 94, 93, 0, 1, 10, 38-27- pH 5,5 0,4 -0,3 1,1 4,8 PRO1360 7 0 7 9 0 5 A11 sc03 94, 93, 1, 1, pH 6,5 N/D N/D -0,3 1,0 5,8 2,8 0 7 0 0

94, 93, 1, 1, 3,1 pH 7,5 N/D N/D -0,1 1,1 4,2 0 9 0 0 ,

94, 97, 97, 1, 1, - 40° C pH 3,5 3,1, 0,3 1,0 1,6 1 0 3 1 0 8,7

93, 97, 96, 1, 1, - pH 4,5 3,5 -0,1 1,1 6,6 8 0 9 0 0 0,5

93, 97, 96, 0, 1, pH 5,5 3,6, -0,1 1,1 8,1 9,4 7 0 9 9 0

97, 96, 1, 1, pH 6,5 N/D N/D -0,1 1,1 2,1 8,1 0 9 0 0

97, 1, N/ pH 7,5 N/D N/D N/D N/D 1,1 N/D N/D 0 0 D

Tabela 26: Teor monomérico.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo multiespecífico, caracterizado pelo fato de que compreende: a) pelo menos um domínio de ligação a CD137 (CD137-BD); e b) pelo menos um domínio de ligação a PDL1 (PDL1-BD), em que o referido CD137-BD se liga à CD137 humana com uma constante de dissociação (KD) de pelo menos pelo menos 5 vezes, preferencialmente pelo menos 10 vezes, por exemplo, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, mais preferencialmente pelo menos 500 vezes, por exemplo, pelo menos 600, pelo menos 700, pelo menos 800, pelo menos 900, pelo menos 1.000 vezes mais em relação a uma constante de dissociação (KD) de ligação à PDL1 humana do referido PDL1-BD.

2. Anticorpo multiespecífico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é monovalente, bivalente ou multivalente para a especificidade de CD137, preferencialmente monovalente e, opcionalmente, em que o referido anticorpo é monovalente, bivalente ou multivalente para especificidade de PDL1, preferencialmente monovalente.

3. Anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende ainda pelo menos um domínio de ligação à albumina sérica humana, preferencialmente um domínio de ligação à albumina sérica humana.

4. Anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido CD137-BD é um agonista de CD137.

5. Anticorpo multiespecífico de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido CD137-BD: a) se liga à CD137 humana com uma constante de dissociação (KD) menor que 50 nM, particularmente menor que 10 nM, particularmente menor que 5 nM, particularmente menor que 1 nM, particularmente menor que 500 pM, mais particularmente menor que 100 pM, mais particularmente menor que 50 pM, particularmente em que o referido anticorpo é um scFv (afinidade monovalente); b) liga-se à CD137 humana com uma taxa de Koff de 10-3 s-1 ou inferior, ou 10-4 s-1 ou inferior, ou 10-5 s-1 ou menos, conforme medido por SPR, particularmente em que o referido anticorpo é um scFv; c) se liga à CD137 humana com uma taxa de Kon de pelo menos 104 M-1s-1 ou superior, pelo menos 105 M-1s-1 ou superior, pelo menos 106 M-1s-1 ou superior, como medido por SPR, particularmente em que o referido anticorpo é um scFv; d) opcionalmente, não concorre com o urelumab; e) opcionalmente, não concorre com o utomilumab; e/ou f) é reativo cruzado com CD137 de Macaca fascicularis (Cynomolgus).

6. Anticorpo multiespecífico de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido CD137-BD compreende (i) as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de: a) SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, respectivamente; ou b) SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 18, 19 e 20, respectivamente; e (ii) sequências estruturais de domínio VH3 ou VH4 FR1 a FR4; de preferência as sequências estruturais de domínio VH3 FR1 a FR4; e (iii) um domínio VL compreendendo uma estrutura VL compreendendo estruturas Vκ FR1, FR2 e FR3, particularmente Vκ1 ou Vκ3 FR1 a FR3, preferencialmente Vκ1 FR1 a FR3, e uma estrutura FR4, que é selecionada a partir de uma Vκ FR4, particularmente Vκ1 FR4, Vκ3 FR4 e um Vλ FR4, particularmente Vλ FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90% de identidade para compreender uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, mais particularmente Vλ FR4 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, preferencialmente Vλ FR4 compreendendo uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 199.

7. Anticorpo multiespecífico de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido CD137-BD compreende sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente, e sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 71, e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 83, de preferência em que a referida VH compreende uma mutação G51C

(numeração AHo) e a referida VL compreende a mutação T141C (numeração AHo).

8. Anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o referido PDL1-BD é um bloqueador de PDL1.

9. Anticorpo multiespecífico de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido PDL1-BD: a) liga-se à PDL1 humana com uma constante de dissociação (KD) inferior a 50 nM, particularmente inferior a 10 nM, particularmente inferior a 5 nM, particularmente inferior a 1 nM, particularmente inferior a 500 pM, mais particularmente inferior a 100 pM, de preferência inferior a 10 pM, mais preferencialmente 5 pM, particularmente em que o referido anticorpo é um scFv (afinidade monovalente); b) liga-se à PDL1 humana com uma taxa de Koff de 10−3 s-1 ou menos, ou 10−4 s−1 ou menos, ou 10−5 s−1 ou menos conforme medido por SPR, particularmente em que o referido anticorpo é um scFv; c) liga-se à PDL1 humana com uma taxa de Kon de pelo menos 103 M- 1s-1 ou superior, pelo menos 104 M-1s-1 ou superior, pelo menos 105 M-1s-1 ou superior, pelo menos 106 M-1s-1 ou superior, conforme medido por SPR, particularmente em que o referido anticorpo é um scFv; d) é reativo cruzado com PDL1 de Macaca fascicularis (Cynomolgus); e/ou e) não é reativo cruzado a PDL1 de Mus musculus.

10. Anticorpo multiespecífico de acordo com a reivindicação 8 ou reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido PDL1-BD compreende a) as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 das SEQ ID NOs: 89, 90 e 91, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 das SEQ ID NOs: 105, 106 e 107, respectivamente; b) sequências estruturais de domínio VH3 ou VH4 FR1 a FR4; de preferência as sequências estruturais de domínio VH3 FR1 a FR4; e c) um domínio VL compreendendo uma estrutura VL compreendendo estruturas Vκ FR1, FR2 e FR3, particularmente Vκ1 ou Vκ3 FR1 a FR3, preferencialmente Vκ1 FR1 a FR3, e uma estrutura FR4, que é selecionada a partir de um Vκ FR4, particularmente Vκ1 FR4, Vκ3 FR4 e um Vλ FR4, preferencialmente Vλ FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos com pelo menos 60, 70, 80, 90% de identidade para compreender uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, de preferência Vλ FR4 é como estabelecido na SEQ ID NO: 199 a SEQ ID NO: 205, mais preferencialmente Vλ FR4 é como estabelecido na SEQ ID NO: 199.

11. Anticorpo multiespecífico de acordo com a reivindicação 8 ou reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido PDL1-BD compreende as sequências HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de: SEQ ID NOs: 92, 93 e 94, respectivamente, e as sequências LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 108. 109 e 110, respectivamente, uma sequência VH pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 104 e uma sequência VL pelo menos 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99%

idêntica à SEQ ID NO: 115, preferencialmente em que a referida VH compreende as mutações G56A e Y105F (Numeração AHo) e a referida VL compreende as mutações S9A e A51P (numeração AHo).

12. Anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 11, caracterizado pelo fato de que o referido HSA-BD compreende: (a) uma sequência VH da SEQ ID NO: 161 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 171; ou (b) uma sequência VH da SEQ ID NO: 185 e uma sequência VL da SEQ ID NO: 195.

13. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo multiespecífico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

14. Anticorpo multiespecífico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizados pelo fato de que são para uso como medicamento.

15. Método de produção do anticorpo multiespecífico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico ou um vetor que codifica o anticorpo multiespecífico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou um domínio de ligação seu ou um fragmento seu.