CN102481373A - 药用融合体和缀合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有改良的血清半衰期的药用融合体。这些融合体和缀合物包含多肽、免疫球蛋白(抗体)单个可变结构域和GLP和/或Exendin分子。本发明另外涉及包含这样的药用融合体和缀合物的应用、制剂、组合物和装置。
Description
本发明涉及具有改良的血清半衰期的药用融合体和缀合物。这些融合体和缀合物包含免疫球蛋白(抗体)单个可变结构域和GLP和/或Exendin分子。本发明另外涉及包含这样的药用融合体和缀合物的应用、制剂、组合物和装置。
背景技术
许多药物具有能用于治疗和/或诊断目的的活性,但由于给药时,它们迅速地从机体清除,因此具有有限的价值。例如,许多具有治疗用途活性的多肽通过肾脏迅速地从循环中清除。因此,为了获得想要的治疗效果,必须施用大剂量。需要具有改良的药代动力学性质的改良的治疗剂和诊断剂。
一类这样的在体内或体循环中具有短半衰期的药物是肠降血糖素激素诸如胰高血糖素-样肽1或肽YY以及Exendin,例如Exendin-4。
胰高血糖素-样肽(GLP)-1是肠降血糖素激素,具有有效的葡萄糖-依赖性的促胰岛素和胰高血糖素抑制(glucagonostatic)作用、对胰腺β细胞的营养作用和对胃肠分泌和运动的抑制作用,这些结合起来来降低血浆葡萄糖和减小血糖波动幅度。此外,通过其提高饱腹感的能力,GLP-1会降低摄食量,因此限制体重增加,甚至可以引起体重减轻。总之,这些作用会赋予GLP-1独特的特征,被认为用作抗糖尿病剂是相当理想的,特别是由于其抗高血糖作用的葡萄糖依赖性会使严重低血糖的任何风险最小化。然而,它的药代动力学/药效动力学特征使得天然GLP-1在治疗上是无用的。因此,尽管连续给药时GLP-1最有效,但是单次皮下注射具有短期效果。GLP-1对体内酶降解是高度敏感的,二肽基肽酶IV(DPP-IV)的裂解可能是最相关的,因为这快速发生,并产生非促胰岛素的代谢物。因此,基于对影响其代谢稳定性和药代动力学/药效动力学特征的因素的理解,利用GLP-1的治疗潜能的策略已经成为热切研究的焦点。
已经进行了广泛的工作,尝试以使其降解减缓同时仍然保持生物活性的方式抑制肽酶或修饰GLP-1。WO05/027978公开了具有延长作用特征的GLP-1衍生物。WO02/46227公开了异种融合蛋白,其包括与GLP-1或类似物融合的多肽(例如,白蛋白)(这些类似物的公开内容通过引用并入本文,作为可用于本发明中的GLP-1类似物的实例)。WO05/003296、WO03/060071、WO03/059934公开了氨基融合蛋白,其中GLP-1已经与白蛋白融合,以尝试增加激素的半衰期。
然而,尽管这些努力,还是没有产生长效活性的GLP-1。
因此,特别是在糖尿病和肥胖症的领域中,存在对改良的GLP-1肽或其它药剂(诸如Exendin-4或PYY)的极大需要,它们同样具有促胰岛素效果,特别适于糖尿病和肥胖症的治疗。因此,需要修饰GLP-1、Exendin-4和其它促胰岛素肽,以提供更长的体内作用持续时间,同时维持它们的低毒性和治疗优势。
发明内容
本发明提供了一种组合物,其是融合体或缀合物,且其包含下述物质或由其组成:(a)促胰岛素药剂或分子,或肠降血糖素药物或分子,其可以是例如Exendin-4、PYY(例如3-26PYY)或GLP-1(例如GLP-1(7-37)A8G突变体),其作为与(b)的融合体或缀合物存在;(b)特异性地结合血清白蛋白(AlbudAbs TM)的dAb,其选自:(i)DOM7h-14结构域抗体(dAb)(DOM 7h-14的氨基酸序列如图1(h):SEQ IDNO 8所示),(ii)DOM 7h-14-10结构域抗体(dAb)(DOM 7h-14-10的氨基酸序列如图1(o):SEQ ID NO 26所示),或与DOM 7h-14-10dAb的序列具有最多4个氨基酸差异的dAb;和(iii)DOM 7h-11-15dAb(DOM 7h-11-15的氨基酸序列如图1(p):SEQ ID NO 27所示),或(iv)DOM 7h-14-10R108C结构域抗体(dAb)(DOM 7h-14-10的氨基酸序列如图1(r)所示)。
氨基酸连接物或化学连接物也可以任选地存在,其连接促胰岛素药剂或肠降血糖素药物(例如Exendin-4和/或GLP-1或PYY)和dAb(例如DOM7h-14dAb、DOM 7h-14-10dAb、DOM 7h-11-15dAb)。所述连接物可以是例如螺旋连接物,例如图1(k):SEQ ID NO 11所示的序列的螺旋连接物,或它可以是gly-ser连接物,例如具有在图1(l):SEQ ID NO 12中所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中,本发明的融合体(或缀合物)可以另外包含分子,例如其它肽或多肽。
促胰岛素药剂或肠降血糖素药物(例如Exendin和/或GLP-1)可以作为与dAb的N-端或C-端的融合体(或缀合物)而存在。
在某些实施方案中,本发明提供了一种多肽,所述多肽包含选自下述的融合体分子或由其组成:
(a)2xGLP-1(7-37)A8G DOM7h-14dAb融合体(DAT0114,氨基酸序列如图1(a):SEQ ID NO 1所示)
(b)Exendin4(G4S连接物)3DOM7h-14dAb融合体(DAT0115,氨基酸序列如图1(b):SEQ ID NO 2所示),
(c)Exendin4-DOM7h-14dAb融合体(DAT0116,氨基酸序列如图1(c):SEQ ID NO 3所示)。
(d)Exendin4、螺旋连接物、DOM7h-14dAb融合体(DAT0117,氨基酸序列如图1(d):SEQ ID NO 4所示)。
(e)GLP-1(7-37)A8G(G4S连接物)3DOM7h-14dAb融合体(DAT0118,氨基酸序列如图1(e):SEQ ID NO 5所示),
(f)GLP-1(7-37)A8G DOM7h-14dAb融合体(DAT0119,氨基酸序列如图1(f):SEQ ID NO 6所示),
(g)GLP-1(7-37)A8G、螺旋连接物、DOM7h-14dAb融合体(DAT0120,氨基酸序列如图1(g):SEQ ID NO 7所示),
(h)Exendin4、(G4S)3、连接物DOM7h-14-10融合体(DMS7139,氨基酸序列如图1(m):SEQ ID NO 24所示),
(i)Exendin4、(G4S)3、连接物DOM7h-11-15融合体(DMS7143,氨基酸序列如图1(n):SEQ ID NO 25所示)。
本发明也提供了缀合物分子,其包含上述那些(即具有SEQ IDNO 1-7和SEQ ID NO 24-25所示的氨基酸序列的那些)的氨基酸序列或由其组成。
在某些实施方案中,本发明提供了一种多肽,其包含缀合物分子或由其组成,所述缀合物分子是:
经由赖氨酸(导入在PYY的10位)和4个重复PEG连接物缀合到C-端酰胺化的PYY3-36上的DOM 7h-14-10(R108C)AlbudAb。该肽缀合物的氨基酸序列和结构如图14所示。
本发明也提供了一种多肽,其包含下述氨基酸序列或由其组成:Exendin4、(G4S)3、连接物DOM7h-14-10融合体(DMS7139,氨基酸序列如图1(m):SEQ ID NO 24所示),或与DMS7139的氨基酸序列具有最多4个氨基酸变化的融合体或缀合物分子,所述氨基酸序列如图1(m)所示。
DOM 7h-14是结合血清白蛋白的人免疫球蛋白单个可变结构域或dAb(Vk),且它的氨基酸序列如图1(h):SEQ ID NO 8所示。DOM7h-14dAb的CDR区在图1(h):SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列中标有下划线。
DOM 7h-14-10是结合血清白蛋白的人免疫球蛋白单个可变结构域或dAb,且它的氨基酸序列如图1(o):SEQ ID NO 26所示。DOM7h-14-10dAb的CDR区在图1(o):SEQ ID NO 26所示的氨基酸序列中标有下划线。
DOM 7h-11-15是结合血清白蛋白的人免疫球蛋白单个可变结构域或dAb,且它的氨基酸序列如图1(p):SEQ ID NO 27所示。DOM7h-11-15dAb的CDR区在图1(p):SEQ ID NO 27所示的氨基酸序列中标有下划线。
本文使用的“融合体”表示这样的融合蛋白:其包含结合血清白蛋白的DOM7h-14dAb或DOM7h-14-10dAb或DOM 7h-11-15dAb作为第一部分,且包含促胰岛素药剂或肠降血糖素药物作为第二部分。结合血清白蛋白的dAb和所述药物或药剂作为单个连续多肽链的离散部件(部分)存在。第一(dAb)和第二(肠降血糖素药物或促胰岛素药剂)部分可以通过肽键直接互相键合,或通过合适的氨基酸或肽或多肽连接物相连。在适当时,可以存在其它部分,例如肽或多肽(例如第三、第四)和/或连接物序列。第一部分可以是在相对于第二部分的N-端位置、C-端位置或内部。在某些实施方案中,所述融合蛋白含有一个或超过一个(例如一个至约20个)dAb部分。
本文使用的“缀合物”表示这样的组合物:其包含结合血清白蛋白的dAb,促胰岛素药剂或肠降血糖素药物(例如GLP-1、Exendin-4、PYY例如PYY 3-36)与所述dAb共价地或非共价地键合。促胰岛素药剂或肠降血糖素药物可以直接地或通过合适的连接物部分(例如PEG连接物部分)间接地共价键合dAb。所述药物或药剂可以键合在dAb的任意合适的位置(诸如氨基-端、羧基-端),或通过合适的氨基酸侧链(例如,赖氨酸的ε氨基,或半胱氨酸的硫醇基)进行键合。或者,所述药物或药剂可以直接地(例如,静电相互作用、疏水相互作用)或间接地(例如,通过互补的结合配偶体(例如,生物素和抗生物素蛋白)的非共价结合,其中一个配偶体共价地键合药物或药剂,且互补的结合配偶体共价地键合dAb)非共价地键合dAb。
本发明另外提供了本发明任一种缀合物或融合体(例如DAT0114、DAT 0115、DAT0116、DAT0117、DAT0118、DAT0119和DAT120、DMS 7139或DMS 7143或DMS 7143)的(基本上)纯的单体。在一个实施方案中,它是至少98、99、99.5%纯的或100%纯的单体。
本发明也提供了编码本文所述的融合体的核酸,例如编码DAT0114、DAT 0115、DAT0116、DAT0117、DAT0118、DAT0119和DAT120、DMS 7139或DMS 7143的核酸,例如其中所述核酸序列如图2(SEQ ID NO 13-32)所示。也提供了包含这些核酸的宿主细胞。
本发明也提供了编码dAb的氨基酸,所述dAb结合选自下述的血清白蛋白(AlbudAbs TM):DOM7h-14(SEQ ID NO 8)、DOM7h-14-10(SEQ ID NO 26)、DOM7h-11-15(SEQ ID NO 27)和DOM7h-14-10R108C(SEQ ID NO 42)。
本发明也提供了编码dAb的核酸,所述dAb结合选自下述的血清白蛋白:DOM7h-14(SEQ ID NO 23)、DOM7h-14-10(SEQ ID NO 31)、DOM7h-11-15(SEQ ID NO 32)和DOM 7h-14-10R108C(SEQ ID NO44)。
本发明另外提供了一种生产本发明的融合体的方法,所述方法包括:在适合表达所述重组核酸的条件下,维持宿主细胞,所述宿主细胞包含编码本发明的融合体的重组核酸和/或构建体,由此生产融合体。
本发明也提供了组合物(例如,药物组合物),其包含本发明的融合体或缀合物。
本发明也提供了一种治疗个体的方法,所述个体具有疾病或障碍,诸如本文所述的那些,例如代谢病诸如高血糖症、受损的葡萄糖耐受性、β细胞缺乏、糖尿病(例如I型或II型糖尿病或妊娠糖尿病)或肥胖症或特征在于进食过量的疾病,例如,所述方法可以用于抑制食欲,例如在帕-魏二氏综合征中,且所述方法包括:给所述个体施用治疗有效量的本发明的融合体或缀合物。
其它代谢障碍包括、但不限于:胰岛素抗性、胰岛素缺乏、超高胰岛素血症、高血糖症、血脂异常、高脂血症、高酮血症、高血压、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、肾衰竭、神经病(例如,自主神经病、副交感神经神经病和多神经病)、视网膜病变、白内障、代谢障碍(例如,胰岛素和/或葡萄糖代谢障碍)、内分泌障碍、肥胖症、体重减轻、肝障碍(例如,肝病、肝硬化和与肝移植有关的障碍)和与这些疾病或障碍有关的病症。
另外,使用本发明的化合物可以预防或治疗的与糖尿病有关的病症包括、但不限于:高血糖症、肥胖症、糖尿病视网膜病变、单神经病、多神经病、动脉粥样硬化、溃疡、心脏病、中风、贫血、坏疽(例如,脚和手的坏疽)、阳痿、感染、白内障、肾功能减退、自主神经系统功能失常、受损的白细胞功能、腕管综合征、Dupuytren挛缩和糖尿病酮症酸中毒。
本发明也提供了用于治疗或预防与高血糖有关的疾病的方法,所述方法包括:给患者或受试者施用至少一剂量的本发明的缀合物或融合体和/或药物组合物。
本发明另外涉及:使用本发明的缀合物或融合体,调节患者中的胰岛素响应性的方法,以及增加细胞的葡萄糖摄取的方法,和调节细胞的胰岛素敏感性的方法。也提供了刺激胰岛素合成和释放的方法,增强脂肪、肌肉或肝组织对胰岛素摄取的敏感性的方法,刺激葡萄糖摄取的方法,减慢消化过程的方法,或阻断患者中胰高血糖素的分泌的方法,所述方法包括:给所述患者施用本发明的融合体或缀合物,例如施用至少一剂量的本发明的药用缀合物或融合体和/或药物组合物。
本发明的融合体或缀合物和/或药物组合物可以单独施用,或与其它分子或部分例如多肽、治疗蛋白和/或分子(例如,胰岛素和/或其它蛋白(包括抗体)、肽或小分子,它们调节患者中的胰岛素敏感性、体重、心脏病、高血压、神经病、细胞代谢和/或葡萄糖、胰岛素或其它激素水平)组合施用。在具体实施方案中,本发明的缀合物或融合体与胰岛素(或胰岛素衍生物、类似物、融合蛋白或促分泌剂)组合施用。
本发明也提供了本发明的缀合物或融合体用于生产药剂的应用,所述药剂用于治疗疾病或障碍,诸如上述那些中的任一种,例如代谢障碍诸如高血糖症、糖尿病(I型糖尿病或II型糖尿病或妊娠糖尿病)或肥胖症。
本发明也涉及本文所述的融合体或缀合物用于治疗、诊断或预防的应用。
本发明的融合体或缀合物(例如融合体的dAb组分)可以进一步格式化(formatted)成具有更大的流体动力学尺寸,以进一步延长半衰期,例如,通过连接PEG基团、血清白蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或至少其转铁蛋白-结合部分、抗体Fc区域,或通过缀合抗体结构域。例如,结合血清白蛋白的dAb可以格式化成抗体的更大抗原结合片段(例如,格式化成Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、IgG、scFv)。
在本公开内容描述的本发明的其它实施方案中,作为在本发明的融合体中使用“dAb”的替代,预见到,技术人员可以使用这样的结构域,其包含dAb的CDR,例如结合血清白蛋白的DOM 7h-14、DOM7h-14-10或DOM 7h-11-15的CDR(例如,移植到合适的蛋白支架或骨架上的CDR,例如affibody、SpA支架、LDL受体A类结构域或EGF结构域)。本公开内容作为整体应当相应地解释,以提供这样的替代dAb的结构域的公开。
在某些实施方案中,本发明提供了根据本发明的融合体或缀合物,其包含促胰岛素药剂或肠降血糖素药物和双-特异性配体或多-特异性配体,所述配体包括根据本发明的第一dAb(其结合血清白蛋白例如DOM 7h-14、DOM 7h-14-10或DOM 7h-11-15)和第二dAb(其具有与第一dAb相同或不同的结合特异性)和任选地在多-特异性配体的情况下的其它dAb。第二dAb(或其它dAb)可以任选地结合不同的靶物,例如FgFr 1c或CD5靶物。
因而,在一个方面,本发明提供了用于通过肠胃外给药来递送的本发明的融合体或缀合物,所述肠胃外给药例如通过皮下注射、肌肉内注射或静脉内注射、吸入、鼻递送、透粘膜递送、经口递送、递送至患者的胃肠道、直肠递送或眼递送。在一个方面,本发明提供了本发明的融合体或缀合物在药剂生产中的应用,所述药剂用于下述递送:皮下注射、吸入、静脉内递送、鼻递送、透粘膜递送、经口递送、递送至患者的胃肠道、直肠递送或眼递送。
在一个方面,本发明提供了通过皮下注射、肺递送、静脉内递送、鼻递送、透粘膜递送、经口递送、递送至患者的胃肠道、直肠递送或眼递送来递送给患者的方法,其中所述方法包括:给患者施用药学有效量的本发明的融合体或缀合物。
在一个方面,本发明提供了口服的、可注射的、可吸入的、可雾化的或眼的制剂,其包含本发明的融合体或缀合物。所述制剂可以是片剂、丸剂、胶囊、液体或糖浆剂。在一个方面,所述组合物可以口服给药,例如作为饮料,例如作为用于治疗肥胖的体重减轻饮料来销售。在一个方面,本发明提供了一种用于直肠递送给患者的制剂,所述制剂可以提供为例如栓剂。
例如,可以如在WO 03/002136(通过引用并入本文)中所述,制备用于GLP-1化合物的肠胃外给药的组合物。
例如,可以如在欧洲专利号272097(授权给Novo Nordisk A/S)或在WO 93/18785(都通过引用并入本文)中所述,制备用于某些肽的鼻给药的组合物。
术语“受试者”或“个体”在本文中被定义为包括动物,如哺乳动物,包括但不限于,灵长类动物(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛科、羊科、马科、犬科、猫科、啮齿动物科或鼠科物种。
本发明也提供了一种试剂盒,其用于将根据本发明的组合物(例如,本发明的缀合物或融合体)施用给受试者(例如,患者),所述试剂盒包含组合物(例如,本发明的缀合物或融合体)、药物递送装置和任选的使用说明书。所述组合物(例如,缀合物或融合体)可以提供为制剂,诸如冷冻干燥的制剂。在某些实施方案中,所述药物递送装置选自:注射器、吸入器、鼻内或眼给药装置(例如,mister、眼或鼻滴管)和无针注射装置。
本发明的组合物(例如缀合物或融合体)可以低压冻干进行储存,并在使用前在合适的载体中重构。可以使用任意合适的低压冻干方法(例如,喷雾干燥、饼干燥)和/或重构技术。本领域技术人员会理解,冷冻干燥和重构可以导致不同程度的抗体活性损失,且可能必须调节使用水平来补偿。在一个具体实施方案中,本发明提供了一种组合物,其包含本文所述的低压冻干的(冷冻干燥的)组合物(例如,药用缀合物、药用融合体)。优选地,低压冻干的(冷冻干燥的)组合物(例如,药用缀合物、药用融合体)在再水合时,其活性损失不超过约20%、或不超过约25%、或不超过约30%、或不超过约35%、或不超过约40%、或不超过约45%、或不超过约50%(例如,对血清白蛋白的结合活性)。
活性是在低压冻干之前产生组合物效果所需要的组合物(例如,药用缀合物、药用融合体)的量。例如,获得并维持希望的血清浓度希望的时间段所需要的缀合物或融合体的量。可以在低压冻干之前使用任意合适的方法测定组合物(例如,药用缀合物、药用融合体)的活性,并可以在再水合之后使用相同方法测定活性,以测定损失的活性的量。
本发明也提供了包含本发明的融合体或缀合物的持续释放制剂,这样的持续释放制剂可以包含与下述物质相组合的本发明的融合体或缀合物:例如玻璃酸、微球或脂质体和其它药学上或药理学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。这样的持续释放制剂可以是例如栓剂形式。
在一个方面,本发明提供了一种药物组合物,其包含本发明的融合体或缀合物和药学上或生理上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
本发明也提供了修饰的前导序列,其可以在它的C端末端处具有氨基酸序列AMA或AWA,其中所述前导序列不是野生型序列。所述修饰的前导序列可以是OmpA-AMA或-AWA;或OmpT-AMA或-AWA;或GAS-AMA或-AWA。
所述修饰的前导序列可以用于在宿主细胞中表达异源多肽。所述异源多肽可以包含促胰岛素药剂或肠降血糖素药物或由其组成。所述异源多肽可以包含结构域抗体(dAb)或由其组成,所述结构域抗体例如结合血清白蛋白的dAb。
由所述修饰的前导序列表达的异源多肽可以是包含下述物质或由其组成的融合体或缀合物:(a)促胰岛素药剂或肠降血糖素药物,其作为与(b)的融合体或缀合物存在;(b)dAb,例如结合血清白蛋白的dAb,例如选自下述的dAb:结合血清白蛋白且具有图1(h)(SEQ ID NO8)所示的氨基酸序列的DOM 7h-14Vk结构域抗体(dAb),具有图1(o)(SEQ ID NO 26)所示的氨基酸序列的DOM 7h-14-10dAb,和具有图1(p)(SEQ ID NO 27)所示的氨基酸序列的DOM 7h-11-15dAb。
所述修饰的前导序列也可以用于表达这样的异源多肽,其包含选自下述的融合体或由其组成:
(a)2xGLP-1(7-37)A8G DOM7h-14dAb融合体(DAT0114,氨基酸序列如图1(a):SEQ ID NO 1所示)
(b)Exendin4(G4S连接物)3DOM7h-14dAb融合体(DAT0115,氨基酸序列如图1(b):SEQ ID NO 2所示),
(c)Exendin4-DOM7h-14dAb融合体(DAT0116,氨基酸序列如图1(c):SEQ ID NO 3所示)。
(d)Exendin4、螺旋连接物、DOM7h-14dAb融合体(DAT0117,氨基酸序列如图1(d):SEQ ID NO 4所示)。
(e)GLP-1(7-37)A8G(G4S连接物)3DOM7h-14dAb融合体(DAT0118,氨基酸序列如图1(e):SEQ ID NO 5所示),
(f)GLP-1(7-37)A8G DOM7h-14dAb融合体(DAT0119,氨基酸序列如图1(f):SEQ ID NO 6所示),
(g)GLP-1(7-37)A8G、螺旋连接物、DOM7h-14dAb融合体(DAT0120,氨基酸序列如图1(g):SEQ ID NO 7所示),
(h)Exendin4、(G4S)3、连接物DOM7h-14-10融合体(DMS7139,氨基酸序列如图1(m):SEQ ID NO 24所示),
(i)Exendin4、(G4S)3、连接物DOM7h-11-15融合体(DMS7143,氨基酸序列如图1(n):SEQ ID NO 25所示)。
要由所述修饰的前导序列表达的异源多肽也可以包含具有上述那些(即具有SEQ ID NO 1-7和SEQ ID NO 24-25所示的氨基酸序列的那些)的氨基酸序列的缀合物分子或由其组成。
要由所述修饰的前导序列表达的异源多肽也可以包含下述氨基酸序列或由其组成:Exendin4、(G4S)3、连接物DOM7h-14-10融合体(DMS7139,氨基酸序列如图1(m):SEQ ID NO 24所示),或与DMS7139的氨基酸序列具有最多4个氨基酸变化的融合体或缀合物分子,所述氨基酸序列如图1(m)所示。
用于表达的宿主细胞可以是微生物宿主细胞、原核宿主细胞、革兰氏阴性细菌宿主细胞或大肠杆菌宿主细胞。
也提供了一种生产下述物质的混合物的方法:(i)促胰岛素药剂或肠降血糖素药物;和(ii)在促胰岛素药剂或肠降血糖素药物的N-端减去2个氨基酸的促胰岛素药剂或肠降血糖素药物;所述方法包括下述步骤:使用前导序列在宿主细胞中表达(i),所述前导序列会导致在促胰岛素药剂或肠降血糖素药物的1位之前裂解和3位之前裂解。促胰岛素药剂或肠降血糖素药物可以是例如与本文定义的结合血清白蛋白的dAb的融合体或缀合物的形式。本发明也提供了通过上述方法得到的或可得到的混合物。
所述前导序列可以是ompA、ompT、GAS或任一种上述修饰的序列。所述方法可以包括下述步骤:通过异源表达,在宿主细胞中生产混合物。所述宿主细胞可以是微生物宿主细胞、原核宿主细胞、革兰氏阴性细菌宿主细胞或大肠杆菌宿主细胞。
促胰岛素药剂和肠降血糖素药物(诸如GLP-1)具有多种治疗效果,它们可以由GLP-1R(诸如刺激胰腺的葡萄糖依赖性的胰岛素分泌的那些)介导。还已经提出,存在一类可以由DPPIV裂解产物GLP-19-36酰胺(或GLP-1 9-37)介导的作用。GLP-1 9-37不具有刺激胰腺的葡萄糖敏感的胰岛素分泌的活性,但是已经提出它具有其它生物学效应,可能是通过非-GLP-1R驱动的机理。由于迄今为止GLP-1类分子的大多数临床应用已经靶向糖尿病(通过胰腺GLP-1R),已经将对DPPIV的稳定性工程化进肽中,这如下实现:通过使用非人GLP-1类似物诸如Exendin-4,或突变GLP-1中的氨基酸8或9,诸如用于Albiglutide(Syncria)中,或通过在肽的氨基末端处的化学修饰或合成修饰。另一个方案是,使用小分子DPPIV抑制剂诸如维格列汀(Galvus)和西他列汀(Januvia),完全阻断DPPIV活性,这会延长任何内源分泌的GLP-1的半衰期。这两种方案均会有效地降低DPPIV代谢物GLP-1 9-36酰胺或GLP-1 9-37的水平。
然而,已经提出,DPPIV代谢物GLP-1 9-36酰胺或GLP-1 9-37具有希望的生物学效应。几项研究已经证实,GLP-1 7-36酰胺的DPPIV裂解产物(即GLP-1 9-36酰胺,其在GLP-1 7-36分泌后快速地形成,且在正常条件下比GLP-1 7-37更丰富)可能具有生物学效应。已经为该机理提出了几种不同的作用途径,如下所列:
GLP-1(9-37)是GLP-1R的拮抗剂:参见例如:Eur J Pharmacol.1996 Dec 30;318(2-3):429-35。
胰高血糖素-样肽-1-(9-36)酰胺是胰高血糖素-样肽-1-(7-36)酰胺在体内施用给狗以后的主要代谢物,且它作为拮抗剂作用于胰腺受体(Knudsen LB,Pridal L.J Biol Chem.1997 Aug 22;272(34):21201-6),也是胰腺胰高血糖素-样肽-1受体的高效价拮抗剂(Montrose-RafizadehC,Yang H,Rodgers BD,Beday A,Pritchette LA,Eng J.J Biol Chem.1997 Aug 22;272(34):21201-6)。
GLP-1(9-37)通过不同机理向GLP-1(7-37)发出信号,通过非胰岛素依赖性的机理:(Am J Physiol Endocrinol Metab.2002Apr;282(4):E873-9.)
或通过在肥胖个体中起增加胰岛素敏感性的作用:(Obesity(Silver Spring)。2008 Jul;16(7):1501-9.Epub 2008 Apr 17。
GLP-1(9-36)酰胺(即GLP-1(7-36)酰胺的裂解产物)是一种糖调节肽(Elahi D,Egan JM,Shannon RP,Meneilly GS,Khatri A,HabenerJF,Andersen DK)。
尚未证实Exendin的减去2个氨基酸形式的这种活性,因为这不是作为DPPIV裂解的结果而形成,但是对于Exendin-4的减去2个氨基酸形式的情况,这也可能的。还已经证实,在心脏作用和其它作用方面,Exendin-4通过依赖于和独立于GLP-1R的途径起作用(Circulation.2008;117:2340-2350:Cardioprotective and VasodilatoryActions of Glucagon-Like Peptide 1 Receptor Are Mediated ThroughBoth Glucagon-Like Peptide 1 Receptor-Dependent and-IndependentPathways Kiwon Ban,MSc;M.Hossein Noyan-Ashraf,PhD;JudithHoefer,MD;Steffen-Sebastian Bolz,MD,PhD;Daniel J.Drucker,MD;Mansoor Husain,MD)。这会增加下述可能性,即实际上可能存在全长和减去2个氨基酸形式的Exendin的类似的且平行的活性。
至少2个工艺途径可用于生产促胰岛素药剂或肠降血糖素药物和减去2个氨基酸形式的混合物。
例如,可以分别生产全长GLP-1 7-36酰胺(以希望的半衰期延长形式诸如AlbudAb)和GLP-1 9-36酰胺(或希望的融合蛋白)。然后混合它们,得到具有希望比例的GLP-1 7-36和GLP-1 9-36分子的产物。可以使用2个平行的GMP工艺来生产药物混合物。
一种替代方法是,选择这样的分泌信号:负责去除信号序列的信号肽酶对其不具有单个裂解位点,而是具有2个裂解位点。使用的分泌信号可以以确定的比例切割它们。因而,依赖于选择的分泌信号,生成的比例可以是:
100%1位之前裂解,得到GLP-1 7-36(或其它促胰岛素药剂或肠降血糖素药物全长分子);或100%3位之前裂解,得到GLP-1 9-36(或其它促胰岛素药剂或肠降血糖素药物减去2个氨基酸序列);或每种全长或减2形式在0至100之间的任意百分比。例如,所述比例可以是:
90%全长∶10%减去2个氨基酸;
80%全长∶20%减去2个氨基酸;
75%全长∶25%减去2个氨基酸;
50%全长∶50%减去2个氨基酸;
25%全长∶75%减去2个氨基酸;
20%全长∶80%减去2个氨基酸;或
10%全长∶90%减去2个氨基酸。
选择适当的前导序列来产生希望的比例,将允许从一个单独的宿主细胞进行生产。在GMP工艺方面,这是一个关键的优点。这允许开发两种物质的潜在治疗效果,同时保留对内源酶的稳定性。
还用氨基端二肽酶处理整个范围的其它内源肽和类似物,产生最初的全长分子和/或二肽酶敏感的物质。因而,该方案可以用于生产任意肽和蛋白,其中单个生产运行可以产生长度相差几个氨基酸的2种物质的确定的混合物,其中相差的氨基酸包含信号肽酶的识别位点的一部分。可能在哺乳动物、真核或原核宿主细胞中(例如在大肠杆菌中)利用该方法。
附图说明:
图1:是下述氨基酸序列的图解:(a)DAT0114(SEQ ID NO 1),(b)DAT0115(SEQ ID NO 2),(c)DAT0116(SEQ ID NO 3),(d)DAT0117(SEQ ID NO 4),(e)DAT0118(SEQ ID NO 5),(f)DAT0119(SEQ ID NO 6),(g)DAT0120(SEQ ID NO 7),(h)DOM 7h-14(SEQID NO 8)(dAb)(CDR标有下划线),(i)GLP-1 7-37A(8)G(SEQ ID NO9),(j)Exendin-4(SEQ ID NO 10),(k)螺旋连接物(SEQ ID NO 11),(l)Gly-ser连接物(SEQ ID NO 12),(m)DMS 7139(SEQ ID NO 24,(n)DMS 7143(SEQ ID NO 25),(o)DOM 7h-14-10(SEQ ID NO 26)(dAb)(CDR标有下划线),(p)DOM 7h-11-15(SEQ ID NO 27)(dAb)(CDR标有下划线),(q)OmpT AWA信号肽(前导序列)(SEQ ID NO 28),(r)DOM7h-14-10R108C(SEQ ID NO 42),(s)PYY 3-36(具有在10位的赖氨酸)(SEQ ID NO 43)。
图2:是下述核酸序列的图解:(a)DAT0114(哺乳动物构建体)(SEQ ID NO 13),(b)DAT0115(哺乳动物构建体)(SEQ ID NO 14),(c)DAT0115(为大肠杆菌构建体优化)(SEQ ID NO 15),(d)DAT0116(哺乳动物构建体)(SEQ ID NO 16),(e)DAT0116(为大肠杆菌构建体优化)(SEQ ID NO 17),(f)DAT0117(哺乳动物构建体)(SEQ ID NO18),(g)DAT0117(为大肠杆菌构建体优化)(SEQ ID NO 19),(h)DAT0118(哺乳动物构建体)(SEQ ID NO 20),(i)DAT0119(哺乳动物构建体)(SEQ ID NO 21),(j)DAT0120(哺乳动物构建体)(SEQ ID NO22),(k)Dom7h-14(SEQ ID NO 23),(l)DMS 7139(SEQ ID NO 29,(m)DMS 7143(SEQ ID NO 30),(n)Dom7h-14-10(SEQ ID NO 31)(dAb),(o)DOM7h-11-15(SEQ ID NO 32)(dAb),(p)Omp AWA信号肽(SEQ ID NO 33),(q)DOM 7h-14-10R108C(dAb)(SEQ ID NO 44),(r)食蟹猴的cDNA(SEQ ID NO 45),(s)寡核苷酸1(SEQ ID NO 47),(t)寡核苷酸2(SEQ ID NO 48),(u)用于在大肠杆菌中表达的DMS7139的核酸序列(SEQ ID NO 50)。
图3:(a)显示了通过施用DAT0115造成的肥胖症小鼠模型的剂量依赖性的体重减轻,(b)显示了通过施用DAT0115造成的肥胖症小鼠模型的每日摄食量。
图4:显示了DAT0115的DSC:实线-DAT0115迹线,虚线-拟合非-2-态模型。
图5:显示了溶菌酶的DSC:实线-溶菌酶迹线,虚线-拟合非-2-态模型(迹线叠加,所以不可看到虚迹线)。
图6:显示了DAT0115的SEC MALLS。
图7:显示了DAT0117的SEC MALLS。
图8:显示了DAT0120的SEC MALLS。
图9:显示了前导序列的氨基酸序列:(a)ompA(大肠杆菌来源的)(SEQ ID NO 34),(b)ompA-AMA(人工序列)(SEQ ID NO 35),(c)ompA-AWA(人工序列)(SEQ ID NO 36),(d)ompT(大肠杆菌来源的)(SEQ ID NO 37),(e)ompT-AMA(人工序列)(SEQ ID NO 38),(f)GAS(酿酒酵母来源的)(SEQ ID NO 39),(g)GAS-AMA(人工序列)(SEQ ID NO 40),(h)GAS-AWA(人工序列)(SEQ ID NO 41),(i)PelB(胡萝卜软腐欧文氏菌)(SEQ ID NO 46),(j)Mal E(人工序列)(SEQID NO 49)。
图10:显示了通过质谱法分析的纯化的DMS7139。
图11:显示了血糖降低的统计显著性的图解,包括DAT0115和对照之间、DMS7139和对照之间、以及DMS7139和DAT0115之间的对比,(a)显示了研究设计,(b)葡萄糖AUC的图解表示。没有覆盖水平线的置信区间是显著的。
图12:表明,与DOM7h-14对照相比,重复剂量的DMS7139显示出剂量-依赖性的HbA1c降低。
图13:表明,在肥胖症DIO小鼠模型中,与DOM7h-14对照相比,DAT0115和DMS7139显示出摄食量和体重的剂量-依赖性减少。在图中,mcg=微克。
图14:显示了一种肽缀合物,它是:通过赖氨酸(导入在PYY的10位)和4个重复PEG连接物缀合到C-端酰胺化的PYY3-36上的DOM7h-14-10(R108C)AlbudAbs。线代表连接物,其共价地连接至DOM7h-14-10(R108C)AlbudAb的游离C端半胱氨酸和在PYY序列的10位处的赖氨酸。该肽缀合物的氨基酸序列和结构如下。
图15:表明,与媒介物对照相比,DMS7605表现出剂量依赖性的体重减轻。
具体实施方式
在本说明书中已经参照实施方案描述了本发明,描述方式使得本说明书能够既清楚又简明。但是应当理解,在不偏离本发明的情况下,可以对这些实施方案进行各种组合或分开。
除非另有说明,否则本文所用的所有科技术语都具有本领域(例如细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学)普通技术人员公知的相同含义。将标准技术用于分子、遗传和生化方法(一般参见Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.和Ausubel等,Short Protocols in Molecular Biology(1999)第4版,JohnWiley&Sons,Inc.,所述文献通过引用并入本文)和化学方法。
本文使用的术语“促胰岛素药剂”是指,能够刺激激素胰岛素、或引起激素胰岛素的刺激、合成或表达或活性的化合物。促胰岛素药剂的已知实例包括、但不限于:例如葡萄糖、GIP、GLP、Exendin(例如Exendin-4和Exendin-3)、PYY和OXM。
本文使用的术语“肠降血糖素”是指一类胃肠激素,其在葡萄糖水平正常时或特别是升高时,会引起释放的胰岛素的量增加。作为实例,它们包括GLP-1、GIP、OXM、PYY(例如PYY 3-36)、VIP和PP(胰腺多肽)。
本文关于多肽所用的术语“类似物”是指修饰的肽,其中肽的一个或更多个氨基酸残基已经被其它氨基酸残基置换,和/或其中一个或更多个氨基酸残基已经从肽删除,和/或其中一个或更多个氨基酸残基已经从肽删除,和/或其中一个或更多个氨基酸残基已经添加至肽。这样的氨基酸残基的添加或删除可以发生在肽的N-端和/或肽的C-端,或它们可以在肽内部。使用简单的系统来描述GLP-1的类似物:例如GLP-1A8G(7-37个氨基酸)指定GLP-1类似物,其中在8位的天然存在的丙氨酸已经被甘氨酸残基置换。使用根据IUPAC-IUB命名法所用的氨基酸标准单字母缩写,描绘肽类似物及其衍生物的通式。
当提及多肽使用时,本文使用的“片段”是具有这样氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列与整个天然存在的多肽的一部分,但是并非其所有氨基酸序列相同。片段可以是“独立的”,或被包含在更大多肽内,它们作为单个更大多肽中的单个连续区域,形成所述更大多肽的一部分或区域。作为实例,天然存在的GLP-1的片段包括天然存在的氨基酸1-36的氨基酸7-36。此外,多肽的片段也可以是天然存在的部分序列的变体。例如,包含天然存在的GLP-1的氨基酸7-30的GLP-1片段也可以是在它的部分序列内具有氨基酸置换的变体。
本发明的合适的促胰岛素药剂的实例包括:GLP-1、GLP-1衍生物、GLP-1类似物、或GLP-1类似物的衍生物。另外,它们包括Exendin-4、Exendin-4类似物和Exendin-4衍生物或片段和Exendin-3、Exendin-3衍生物和Exendin-3类似物。
本文使用的术语“GLP-1”是指GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-38)、GLP-1(7-39)、GLP-1(7-40)、GLP-1(7-41)、GLP-1类似物、GLP-1肽、GLP-1衍生物、或GLP-1类似物的突变体或片段或衍生物。这样的肽、突变体、类似物和衍生物是促胰岛素药剂。
例如GLP-1可以是具有图1(i):SEQ ID NO 9所示的氨基酸序列的GLP-1(7-37)A8G突变体。
在国际专利申请号90/11296(The General Hospital Corporation)中描述了其它GLP-1类似物,该专利申请涉及包含GLP-1(7-36)和其功能衍生物的肽片段,所述肽片段的促胰岛素活性超过GLP-1(1-36)或GLP-1(1-37)的促胰岛素活性,还涉及它们作为促胰岛素药剂的应用(通过引用并入本文,特别作为用于本发明中的药物的实例)。
国际专利申请号WO 91/11457(Buckley等人)公开了有活性的GLP-1肽7-34、7-35、7-36和7-37的类似物,它们也可以用作根据本发明的GLP-1药物。
本文使用的术语“Exendin-4肽”是指Exendin-4(1-39)、Exendin-4类似物、Exendin-4肽的片段、Exendin-4衍生物、或Exendin-4类似物的衍生物。这样的肽、片段、类似物和衍生物是促胰岛素药剂。Exendin-4(1-39)的氨基酸序列如图1(j):SEQ ID NO 10所示。
在PCT专利公开WO 99/25728(Beeley等人)、WO 99/25727Beeley等人)、WO 98/05351(Young等人)、WO 99/40788(Young等人)、WO 99/07404(Beeley等人)和WO 99/43708(Knudsen等人)(都通过引用并入本文,特别作为用于本发明中的药物的实例)中,描述了可用于本发明中的其它Exendin-类似物。
本文使用的“肽”表示通过肽键连接到一起的约2至约50个氨基酸。
本文使用的“多肽”表示通过肽键连接到一起的至少约50个氨基酸。多肽通常包含三级结构,并折叠成功能结构域。
本文使用的“展示系统”表示这样的系统,其中对于基于希望的特性(诸如物理的、化学的或功能的特性)的选择,可以得到多肽或肽的集合。所述展示系统可以是多肽或肽(例如,在溶液中,固定化在合适的支持物上)的合适集合。所述展示系统也可以是采用细胞表达系统(例如,在例如转化的、感染的、转染的或转导的细胞中表达核酸文库,和在细胞表面上展示编码的多肽)或无细胞表达系统(例如,乳液区室化和展示)的系统。示例性的展示系统将核酸的编码功能与所述核酸编码的多肽或肽的物理的、化学的和/或功能的特性相关联。当采用这样的展示系统时,可以选择具有希望的物理的、化学的和/或功能的特性的多肽或肽,并可以容易地分离或回收编码选择的多肽或肽的核酸。许多将核酸的编码功能与多肽或肽的物理的、化学的和/或功能的特性相关联的展示系统是本领域已知的,例如,噬菌体展示(噬菌体展示,例如噬粒展示)、核糖体展示、乳液区室化和展示、酵母展示、嘌呤霉素展示、细菌展示、在质粒上展示、共价展示等(参见,例如,EP 0436597(Dyax),美国专利号6,172,197(McCafferty等人),美国专利号6,489,103(Griffiths等人))。
本文使用的“有功能的”描述了具有生物活性(诸如特异性的结合活性)的多肽或肽。例如,术语“有功能的多肽”包括通过它的抗原-结合位点结合靶抗原的抗体或其抗原结合片段。
本文使用的“靶配体”表示被多肽或肽特异性地或选择性地结合的配体。例如,当多肽是抗体或其抗原结合片段时,靶配体可以是任意希望的抗原或表位。与靶抗原的结合依赖于有功能的多肽或肽。
本文使用的“抗体”是指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段(例如Fab、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭合构象多特异性抗体、二硫键连接的scFv、双特异抗体),无论是源自天然地产生抗体的任何物种,还是通过重组DNA技术制备;无论分离自下列哪种样品:血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌。
本文使用的“抗体形式”表示任意合适的多肽结构,其中可以掺入一个或更多个抗体可变结构域,从而赋予该结构对抗原的结合特异性。多种合适的抗体形式是本领域已知的,例如,嵌合的抗体、人源化的抗体、人抗体、单链抗体、双特异性的抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同源二聚体和异源二聚体、任意前述物质的抗原-结合片段(例如,Fv片段(例如,单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段)、单个抗体可变结构域(例如,dAb、VH、VHH、VL)和任意前述物质的修饰形式(例如,通过共价连接聚乙二醇或其它合适的聚合物或人源化的VHH进行修饰)。
短语“免疫球蛋白单个可变结构域”表示独立于其它V区或结构域而特异性地结合抗原或表位的抗体可变结构域(VH、VHH、VL)。免疫球蛋白单个可变结构域可以以含有其它可变区或可变结构域的形式(例如,同源多聚体或异源多聚体)存在,其中其它区域或结构域不是单个免疫球蛋白可变结构域的抗原结合所必需的(即其中免疫球蛋白单个可变结构域与抗原的结合独立于另外的可变结构域)。“结构域抗体”或“dAb”与本文所用的术语“免疫球蛋白单个可变结构域”同义。“单个免疫球蛋白可变结构域”与本文所用的术语“免疫球蛋白单个可变结构域”同义。“单个抗体可变结构域”与本文所用的术语“免疫球蛋白单个可变结构域”同义。在一个实施方案中,免疫球蛋白单个可变结构域是人抗体可变结构域,但是也包括来自其它物种的单个抗体可变结构域,诸如啮齿动物(例如,如在WO 00/29004中所公开的,其内容通过引用整体并入本文)、铰口鲨和骆驼科(Camelid)VHH dAb。骆驼科VHH是这样的免疫球蛋白单个可变结构域多肽:其源自包括骆驼、美洲驼羊、羊驼、单峰骆驼和原驼在内的物种,且生产天然地缺少轻链的重链抗体。所述VHH可以是人源化的。
“结构域”是折叠的蛋白结构,它具有独立于蛋白的其余部分的三级结构。通常,结构域负责蛋白的离散的功能性质,并且在许多情况下可以添加、去除或转移给其它蛋白,而不丧失该蛋白和/或该结构域的其余部分的功能。“单个抗体可变结构域”是折叠的多肽结构域,其包含抗体可变结构域特有的序列。因此,它包括完整的抗体可变结构域和修饰的可变结构域(例如,其中一个或更多个环已经被不是抗体可变结构域特有的序列所置换),或者已被截短或包含N-端或C-端延伸的抗体可变结构域,以及至少保留全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。
术语“文库”表示异源多肽或核酸的混合物。文库由成员组成,每个成员都具有单个多肽或核酸序列。就这一方面而言,“文库”和“集合”同义。文库成员之间的序列差异会造成文库中存在的多样性。文库可以是多肽或核酸的简单混合物的形式,或者可以是用核酸文库转化的生物体或细胞的形式,例如细菌、病毒、动物或植物细胞等。在一个实施方案中,每个单个的生物体或细胞仅含有一个或有限数目的文库成员。在一个实施方案中,将核酸掺入到表达载体中,以表达该核酸所编码的多肽。因此,在一个方面,文库可以是宿主生物体群体的形式,每个生物体含有一个或更多个表达载体拷贝,所述载体含有核酸形式的文库的单个成员,该成员可以被表达而产生其相应的多肽成员。因此,宿主生物体群体具有编码多种多肽的集合的潜力。
本文使用的术语“剂量”表示施用给受试者的融合体或缀合物的量,所述施用是一次性全部施用(单位剂量),或在确定的时间段内的2次或更多次施用。例如,剂量可以表示在1天(24小时)(日剂量)、2天、1周、2周、3周或1个月或更多个月的过程中施用给受试者的融合体或缀合物的量(例如通过单次施用,或通过2次或更多次施用)。给药之间的间隔可以是任何希望的时间量。
短语“半衰期”表示融合体或缀合物的血清或血浆浓度在体内降低50%所需要的时间,例如因为天然机制所致降解和/或清除或隔离。本发明的融合体或缀合物在体内是稳定的,其半衰期因结合抵抗降解和/或清除或隔离的血清白蛋白分子(例如人血清白蛋白(HSA))而延长。这些血清白蛋白分子是天然存在的蛋白,它们本身在体内的半衰期较长。如果分子的功能活性在体内的持续时间比对延长半衰期的分子不具有特异性的类似分子更长的话,则该分子的半衰期延长。例如,将本发明的包含对人血清白蛋白(HSA)特异性的dAb和肠降血糖素药物或促胰岛素药剂(诸如GLP-1或Exendin)的融合体或缀合物与相同配体(其中不存在对HSA的特异性,即不结合HSA,但是结合另一种分子。例如,它可以结合细胞上第三靶物)相比较。通常,半衰期延长10%、20%、30%、40%、50%或以上。2x、3x、4x、5x、10x、20x、30x、40x、50x、100x、200x、300x或以上的半衰期延长范围是可能的。或者,或另外,最高达30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x、200x、300x、400x的半衰期延长范围也是可能的。
本文使用的“流体动力学尺寸”表示,基于分子在水溶液中的扩散,分子(例如,蛋白分子、配体)的表观尺寸。可以处理蛋白在溶液中的扩散或运动,以衍生出蛋白的表观尺寸,其中所述尺寸由蛋白颗粒的“Stokes半径”或“流体动力学半径”给出。蛋白的“流体动力学尺寸”取决于质量和形状(构象),所以具有相同分子量的两种蛋白可能具有不同的流体动力学尺寸(基于蛋白的总构象)。
如下进行两个序列之间的“同源性”或“同一性”或“相似性”(这些术语在本文可互换使用)的计算。为了最佳比较目的,比对序列(例如对于最佳比对,可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入缺口,为了比较目的,非同源序列可以忽略不计)。在一个实施方案中,为了比较目的所比对的参照序列的长度是参照序列长度的至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、80%、90%、100%。然后,比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的某个位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时,那么分子在该位置是相同的(本文所用的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。两个序列之间的同一性百分比随考虑缺口数和各缺口长度后的序列共享的相同位置数而变化,需要引入这些缺口以进行两个序列的最佳比对。使用采用默认参数的算法BLAST 2 Sequences(Tatusova,T.A.等人,FEMS Microbiol Lett,174:187-188(1999),可以准备和测定氨基酸和核苷酸序列比对以及如本文定义的同源性、相似性或同一性。
核酸、宿主细胞:
本发明涉及分离的和/或重组的核酸,它们编码本文所述的本发明的融合体,例如由SEQ ID NO 13-23编码的那些。
在本文中称作“分离的”核酸是,已经与在它的原始环境中(例如,在细胞中,或在核酸的混合物诸如文库中)的其它物质(例如,其它核酸,诸如基因组DNA、cDNA和/或RNA)分离的核酸。分离的核酸可以分离为载体(例如,质粒)的一部分。
在本文中称作“重组的”核酸是,已经通过重组DNA方法生产的核酸,所述重组DNA方法包括依赖于人工重组的方法,诸如克隆进载体或染色体中(其中使用例如限制性酶、同源重组、病毒等),以及使用聚合酶链式反应(PCR)制备的核酸。
本发明也涉及重组宿主细胞例如哺乳动物或微生物,其包含(一种或更多种)重组核酸或表达构建体,它们包含编码本文所述的本发明的融合体的核酸。还提供了制备本文所述的本发明的融合体的方法,所述方法包括:在适合表达融合体多肽的条件下,维持本发明的重组宿主细胞,例如哺乳动物或微生物。如果需要,所述方法可以另外包括分离或回收融合体的步骤。
例如,使用任意适合选定的宿主细胞的方法(例如,转化、转染、电穿孔、感染),可以将编码本发明的融合体多肽的核酸分子(即,一个或更多个核酸分子)或包含这样的核酸分子的表达构建体(即,一个或更多个构建体)导入合适的宿主细胞中,使得所述核酸分子可操作地连接至一个或更多个表达控制元件(例如,在载体中,在通过细胞中的过程建立的构建体中,整合进宿主细胞基因组中),以制备重组宿主细胞。可以在适合表达的条件下(例如,在有诱导物存在下,在合适的动物中,在补充了适当的盐、生长因子、抗生素、营养补剂等的合适的培养基中),维持得到的重组宿主细胞,由此生产编码的肽或多肽。如果需要,可以分离或回收编码的肽或多肽(例如,从动物、宿主细胞、培养基、乳汁)。该方法包括在转基因动物的宿主细胞中表达(参见,例如,WO 92/03918,GenPharm International)。
也可以在合适的体外表达系统中生产本文所述的本发明的融合体多肽,例如通过化学合成,或通过任意其它合适的方法。
如本文所述和例证的,本发明的融合体或缀合物通常会以高亲和力结合血清白蛋白。
例如,本发明的融合体或缀合物可以以约5微摩尔至约100pM(例如约1微摩尔至约100pM,例如约5-50nm,例如约10-30nm,例如约20-30nm)的亲和力(KD;KD=Koff(kd)/Kon(ka)[通过表面等离子体共振测定])结合人血清白蛋白。
可以在大肠杆菌中或在毕赤酵母物种(例如,巴氏毕赤酵母)中表达本发明的融合体或缀合物,也可以在任意酵母或真菌细胞中表达它们。在一个实施方案中,当在大肠杆菌中或在毕赤酵母物种(例如,巴氏毕赤酵母)中或在哺乳动物细胞培养物(例如CHO或HEK 293细胞)中表达时,以至少约0.5mg/L的量分泌融合体。尽管当在大肠杆菌中或在毕赤酵母物种中或在哺乳动物细胞中表达时,本文所述的融合体或缀合物可以是可分泌的,但是可以使用任意合适的方法来生产它们,所述方法例如合成化学方法或不采用大肠杆菌或毕赤酵母物种的生物生产方法。
在某些实施方案中,当施用有效量时,本发明的融合体和缀合物些组合物例如特别适合通过直接局部肺递送来施用给受试者。这些组合物可以例如直接地施用给肺,例如通过吸入,例如通过使用喷雾器装置。这些用于肺递送的组合物可以包含生理上可接受的缓冲液,其具有约4至约8(例如约7至约7.5)的pH范围和这样的粘度:其大致等于约2%至约10%PEG 1000在含有1.2%(w/v)蔗糖的50mM磷酸盐缓冲液中的溶液的粘度。
本发明的融合体或缀合物可以低压冻干进行储存,并在使用前在合适的载体中重构。已经证实,该技术对于常规免疫球蛋白是有效的,且可以采用本领域已知的冷冻干燥和重构技术。本领域技术人员会理解,冷冻干燥和重构可以导致不同程度的抗体活性损失(例如对于常规免疫球蛋白,IgM抗体倾向于具有比IgG抗体更大的活性损失),且可能必须向上调节使用水平来补偿。
对于预防应用而言,例如当施用给具有前驱糖尿病或胰岛素抗性的个体时,也可以以类似或稍低的剂量施用含有本发明的融合体或缀合物的组合物,以预防、抑制或延迟疾病发作(例如,维持缓解或静止状态,或者预防急性期)。熟练的临床医生能够确定合适的给药间隔,以治疗、抑制或预防疾病。当施用本发明的融合体或缀合物来治疗、抑制或预防疾病时,可以施用最多每天4次、每周两次、每周一次、每两周一次、每月一次或每两月一次,剂量为例如约0.0001mg/kg至约10mg/kg(例如,约0.001mg/kg至约10mg/kg,例如约0.001mg/kg至约1mg/kg,例如约0.01mg/kg至约1mg/kg,例如约0.01mg/kg至约0.1mg/kg)。
用本文所述的组合物进行的治疗被视为“有效”的条件是:相对于治疗前存在的所述症状,或者相对于未用所述组合物或其它合适对照治疗的个体(人或模型动物)中的所述症状,一种或更多种症状减轻(例如减轻至少10%或在临床评价量表中至少一个点)。尽管症状随所针对的疾病或障碍的确切性质而明显不同,但是可以由一般熟练的临床医生或技术人员进行测定。
类似地,如果相对于未经所述组合物治疗的类似个体(人或动物模型)的所述症状,一种或更多种症状的发作或严重程度延迟、减少或消除,则用本文所述的组合物进行的预防是“有效”的。
本发明的融合体和缀合物可以作为单独施用的组合物来使用,或它们可以与其它治疗剂或活性剂(例如其它多肽或肽或小分子)结合施用。这些其它的药剂可以包括各种药物,例如二甲双胍、胰岛素、格列酮类(例如罗格列酮)、免疫抑制剂、免疫刺激剂。
本发明的融合体和缀合物可以与一种或更多种额外的治疗剂或活性剂一起施用和/或配制。当本发明的融合体或缀合物与额外的治疗剂一起施用时,可以在额外的药剂之前、同时、一起或之后,施用所述融合体或缀合物。通常,以提供重叠的治疗效果的方式,施用本发明的融合体或缀合物和额外的药剂。
半衰期:
促胰岛素药剂或肠降血糖素药物(例如GLP-1或Exendin配体)的增加的半衰期可用于体内用途中。本发明如下解决了该问题:通过提供促胰岛素药剂或肠降血糖素药物(例如GLP和Exendin)的增加的体内半衰期,并从而提供这些分子的功能活性在体内的更长持续时间。
如本文所述,与单独的促胰岛素药剂或肠降血糖素药物相比,本发明的组合物(即包含本文所述的融合体或缀合物)可以具有显著延长的体内血清或血浆半衰期和/或增加的AUC和/或增加的平均停留时间(MRT)。另外,在本发明的组合物(例如,缀合物或融合体)中,促胰岛素药剂或肠降血糖素药物的活性通常基本上不改变。然而,与单独的促胰岛素药剂或肠降血糖素药物相比,本发明组合物的活性的某些变化是可接受的,且通常会被本发明的缀合物或融合体的改良的药代动力学性质补偿。例如,本发明的药用缀合物或融合体可以以比单独的药物更低的亲和力结合药物靶物,但是与单独的药物相比具有大致等效或更优的效能,这是由于药物组合物的改良的药代动力学性质(例如,延长的体内血清半衰期。更大的AUC)。另外,由于本发明的缀合物或融合体的增加的半衰期,它们可以以比单独的促胰岛素药剂或肠降血糖素药物更低的频率施用,例如它们可以每月一次或每周一次地施用给患者,并且与施用单独的促胰岛素药剂或肠降血糖素药物相比,它们也达到促胰岛素药剂或肠降血糖素药物在血液中的更恒定的水平,从而实现希望的治疗效果或预防效果。
药代动力学分析方法和配体半衰期的测定方法是本领域技术人员所熟知的。细节可以参见:Kenneth,A等人:Chemical Stability of在动物模型中是有效的,所述动物模型例如在WO 2006/059106(例如在公开的WO 2006/059106的第104-105页)中描述的那些,或在本文的实施例中描述的那些。一般而言,有效量是约0.0001mg/kg至约10mg/kg(例如,约0.001mg/kg至约10mg/kg,例如约0.001mg/kg至约1mg/kg,例如约0.01mg/kg至约1mg/kg,例如约0.01mg/kg至约0.1mg/kg)。本领域技术人员公认所述疾病模型能够预测在人类中的治疗效能。
通常,本发明的融合体和缀合物以纯化形式与药理上或生理学上合适的载体一起使用。通常,这些载体可以包括水性溶液或醇/水溶液、乳剂或混悬剂,任一种包括盐水和/或缓冲介质。胃肠外媒介物可以包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠以及乳酸化的林格液。如果需要在混悬剂中维持多肽复合物的话,则可以从增稠剂中选出合适的生理上可接受的辅料,这些增稠剂例如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐。
静脉内的媒介物包括流体和营养补充剂和电解质补充剂,例如基于林格氏葡萄糖的那些。也可含有防腐剂和其它添加剂,例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack(1982)Remington’sPharmaceutical Sciences,第16版)。各种合适的制剂都可采用,包括延长释放制剂。
根据本发明的药物组合物的给药途径可以为本领域普通技术人员公知的任何途径。对于治疗,可以根据标准技术,将本发明的药用融合体或缀合物施用给任何患者。
可通过任何合适的方式进行施用,包括胃肠外、静脉内、肌肉内、腹膜内、口服、透皮、通过肺途径,或者在合适时用导管直接输注。给药的剂量和频率取决于患者年龄、性别和状况、同时施用的其它药物、禁忌和临床医生要考虑的其它参数。按照指示,可以局部给药或全身给药。
在一个实施方案中,本发明提供了一种用于递送给肺的肺制剂,其包含:(a)本发明的缀合物或融合体,和(b)药学上可接受的缓冲液,其中所述组合物包含液滴,且存在于组合物中的约40%或更多(例如50%或更多)的液滴具有在下述范围内的尺寸:小于约6微米,例如约1微米至约6微米,例如小于约5微米,例如约1至约5微米。这Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists,和Peters等人,Pharmacokinetic analysis:A Practical Approach(1996)。也参见:“Pharmacokinetics”,M Gibaldi&D Perron,Marcel Dekker出版,2nd Rev.ex edition(1982),它描述了药代动力学参数诸如tα和tβ半衰期和曲线下面积(AUC)。
从配体相对于时间的血浆或血清浓度曲线,可以确定半衰期( 和)和AUC和MRT。可以使用WinNonlin分析包(可从PharsightCorp.,Mountain View,CA94040,USA得到),例如,建立曲线的模型。在第一阶段(α阶段),配体主要进行在患者中的分布,具有一些消除。第二阶段(β阶段)是末期,这时配体已经分布,且血清浓度随着配体从患者清除而降低。tα半衰期是第一阶段的半衰期,tβ半衰期是第二阶段的半衰期。另外,本领域众所周知的无分区拟合模型也可以用于确定半衰期。
在一个实施方案中,本发明提供了根据本发明的融合体或缀合物,其在例如人受试者中具有在下述范围内的消除半衰期:约12小时或更长,例如约12小时至约21天,例如约24小时至约21天,例如约2-10天,例如约3-4天。
本发明的融合体或缀合物也可以进一步格式化成具有更大的流体动力学尺寸,例如,通过连接PEG基团、血清白蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或至少其转铁蛋白-结合部分、抗体Fc区域,或通过缀合抗体结构域。
使用本领域众所周知的方法,可以测定流体动力学尺寸。例如,可以使用凝胶过滤色谱法来测定配体的流体动力学尺寸。适用于测定配体的流体动力学尺寸的凝胶过滤基质(诸如交联的琼脂糖基质)是众所周知的,且可容易地得到。
本发明的组合物(即包含本文所述的融合体和缀合物的那些)会提供几个另外的优点。所述结构域抗体组分是非常稳定的,比抗体和抗体的其它抗原-结合片段更小,可以通过在大肠杆菌或酵母(例如,巴氏毕赤酵母)中表达来高产量地生产,且可以从人来源文库或从任意希望的物种容易地选择结合血清白蛋白的抗体的抗原-结合片段。因此,可以比通常在哺乳动物细胞中生产的治疗剂(例如,人抗体、人源化的抗体或嵌合的抗体)更容易地生产本发明的包含结合血清白蛋白的dAb的组合物,且可以使用非免疫原性的dAb(例如,人dAb可以用于治疗或诊断人的疾病)。
当促胰岛素药剂或肠降血糖素是含有结合血清白蛋白的dAb的药物组合物的一部分时,可以降低促胰岛素药剂或肠降血糖素药物的免疫原性。因此,本发明提供了一种融合体或缀合物组合物,其在含有结合血清白蛋白的dAb的药物组合物的背景下,可以具有更低的免疫原性(例如相对于单独的促胰岛素药剂或肠降血糖素),或可以是基本上无免疫原性的。因而,这样的组合物可以在一段时间内重复施用给受试者,且具有最小的由受试者的免疫系统产生抗-药物抗体而引起的效能损失。
另外,与单独的促胰岛素药剂或肠降血糖素相比,本文所述的缀合物或融合体组合物可以具有增加的安全性特性和更少的副作用。例如,作为dAb的血清白蛋白-结合活性的结果,本发明的融合体和缀合物在血管循环中具有增加的停留时间。另外,本发明的融合体和缀合物在全身给药(例如,血管内给药)后基本上不能穿过血脑屏障和积累在中枢神经系统中。因此,与单独的促胰岛素药剂或肠降血糖素药物相比,本发明的融合体或缀合物可以以更大的安全性和更小的副作用来施用。类似地,与单独的药物相比,所述融合体或缀合物可以具有减小的对特定器官(例如,肾脏或肝脏)的毒性。
实施例:
实施例1:GLP-1(A8G)或Exendin-4和DOM7h-14AlbudAb的遗传融合体的表达:
将Exendin-4或GLP-1(7-37)(在8位的丙氨酸被甘氨酸替换([Gly8]GLP-1))作为与DOM7h-14(结合血清白蛋白的结构域抗体(dAb)(AlbudAb),其具有下示的氨基酸序列)的融合体克隆进pTT-5载体(可从加拿大的CNRC得到)中。在每种情况下,GLP-1或Exendin-4是在构建体的5’末端处,dAb是在3’末端处。总之,制备了7个构建体(DAT0114、DAT 0115、DAT0116、DAT 0117、DAT 0118、DAT 0119、DAT 0120),它们具有图1(A-G)所示的氨基酸序列。没有连接物,或具有gly-ser连接物(G4S)或螺旋连接物(Arai,R.,H.Ueda,等人(2001).“Design of the linkers which effectively separate domains of abifunctional fusion protein.”Protein Eng 14(8):529-32.456)或由GLP-1或Exendin-4和dAb之间的第二个GLP-1部分组成的连接物。所述连接物被包括作为间隔物,以使GLP-1或Exendin-4在空间上与dAb分离,从而防止GLP-1或Exendin-4和GLP-1受体之间的结合的位阻。构建体的序列如图1(A-G)所示。
使用碱性裂解,在大肠杆菌中制备无内毒素的DNA(使用无内毒素的质粒Giga试剂盒,可从Qiagen CA得到),并用于转染HEK293E细胞(可从加拿大的CNRC得到)。每个烧瓶使用333ul 293fectin(Invotrogen)和250ug DNA,以1.75x106细胞/ml,转染进250ml/烧瓶的HEK293E细胞,并在30℃表达5天。通过离心,收获上清液,并通过在蛋白L上的亲和纯化进行纯化。使蛋白分批结合树脂(填充在柱上),并用10柱体积的PBS洗涤。用50ml 0.1M甘氨酸pH2洗脱蛋白,并用Tris pH8中和。在SDS-PAGE凝胶上鉴别预期尺寸的蛋白,尺寸如下面的表1所示。
表1:DAT0114、DAT 0115、DAT0116、DAT 0117、DAT 0118、DAT0119、DAT 0120的分子量
融合蛋白 | 预期的分子量 |
DAT0114 | 18256 |
DAT0115 | 16896 |
DAT0116 | 15950 |
DAT0117 | 19798 |
DAT0118 | 15936 |
DAT0119 | 15318 |
DAT0120 | 18895 |
实施例2:证实GLP-1和Exendin-4AlbudAbs融合体会结合血清白蛋白:
通过表面等离子体共振(Biacore AB,可从GE Healthcare得到),分析GLP-1和Exendin-4AlbudAbs融合体,以得到关于亲和力的信息。使用被血清白蛋白包被的CM5Biacore芯片(羧甲基化的葡聚糖基质),进行分析。将每种要测试的血清白蛋白(人、大鼠和小鼠血清白蛋白)的约1000个共振单元(RU)在乙酸盐缓冲液pH5.5中固定化。Biocore AB的流动池1是未包被的、阻断的阴性对照,流动池2被人血清白蛋白(HSA)包被(815RU),流动池3被大鼠血清白蛋白(RSA)包被(826RU),流动池4被小鼠血清白蛋白(MSA)包被(938RU)。如上面的实施例所述,在哺乳动物组织培养物中表达测试的每种融合体分子。
如下制备融合体分子的浓度范围(在16nM-2μM范围内):在BIACORE HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES,pH7.4,0.15M NaCl,3mMEDTA,0.005%表面活性剂P20)中稀释,并流过BIACORE芯片。
通过使结合速率(on-rate)和解离速率(off-rate)曲线拟合dAb在KD区域中的浓度所产生的迹线,从BIACORE迹线计算亲和力(KD)。亲和力(KD)总结在下面的表2中:
表2:GLP-1和Exendin-4AlbudAbs对人、大鼠和小鼠血清白蛋白的结合
上面的结果证实,融合体分子保留结合所有类型的血清白蛋白的能力,这表明,它们可能具有延长的体内半衰期。
实施例3:GLP-1和Exendin-4AlbudAbs融合体在GLP-1受体结合试验(GLP-1R BA)中是有活性的:
将融合体缓冲液更换进100mM NaVl、20mM柠檬酸盐pH 6.2中。同时,以2x105细胞/mL,将CHO 6CRE GLP1R细胞(用6个驱动萤光素酶报告基因的cAMP反应元件以及用人GLP-1受体稳定转染的CHO K1细胞(可从美国典型组织保藏中心ATCC得到))接种进悬浮介质中。维持悬浮培养24小时。然后在含有2mM L谷氨酰胺的15mM HEPES缓冲液(可从Sigma得到)中稀释细胞(2.5x105细胞/ml),并分配进含有10ul/孔的待测化合物的384-孔平板中。加入试验对照以后,将平板返回培养箱,在37℃和5%CO2温育3h。温育后,如试剂盒所述,将稳定的glo萤光素酶底物(可从Promega得到)加入孔中,并用自粘合平板密封带(Weber Marking Systems Inc.目录号607780)密封平板。将平板放入读数器(Viewlux,Perkin Elmer)中,并重新温育5分钟,然后读出荧光和绘制结果。在有和没有10uM白蛋白存在下,在浓度范围内测定化合物,在有和没有白蛋白存在下拟合剂量响应曲线。计算EC50,并总结在下面的表3中:
表3:GLP-1和Exendin-4AlbudAbs融合体在GLP-1受体结合试验(GLP-1R BA)中的活性
上面的结果证实,测试的所有融合体分子保留结合GLP-1受体的能力。所述结果还证实,在有血清白蛋白存在下,该能力得到保留。因此,这些融合体分子可能保留在体内结合GLP-1受体的能力。
实施例4:在HEK 293哺乳动物组织培养物中表达DAT0115、DAT0116、DAT0117和DAT0120,随后通过蛋白L亲和捕获和离子交换色谱法进行纯化:
该实验的目的是,生产用于体内和体外表征的蛋白。如以前所述,在HEK 293E细胞的哺乳动物组织培养物中,从pTT-5载体表达蛋白。简而言之,制备和纯化无内毒素的DNA,并用于转染HEK293E细胞。在摇动培养箱中在30℃表达蛋白5天,离心培养物,并收获上清液(含有目标蛋白)。通过在蛋白L琼脂糖流线亲和树脂(树脂GEHealthcare,自制偶联的蛋白L)上的亲和捕获,从上清液纯化蛋白。然后用10柱体积的PBS洗涤树脂,再用5柱体积的0.1M甘氨酸pH2.0洗脱蛋白。用1柱体积的1M Tris甘氨酸pH8.0进行中和。在该情况下(与以前的实施例相比),然后进行其它纯化。将蛋白(在tris-甘氨酸中)缓冲液更换为20mM乙酸盐pH 5.0,然后使用Akta,装载上1个(或平行的2个)在20mM乙酸盐pH 5.0中预平衡的6mlresource S柱(GE healthcare)。用相同的缓冲液洗涤后,通过在20mM乙酸盐pH5.0中的0-0.75M或0-1M NaCl梯度,洗脱蛋白。然后通过SDS-PAGE电泳和通过质谱法,鉴别正确大小的级分,然后合并,以制备最终的蛋白样品。然后将蛋白缓冲液更换进20mM柠檬酸盐、pH6.2、100mM NaCl,并浓缩至0.5-5mg/ml。穿过0.2uM过滤器,过滤蛋白,以确保无菌度。然后将蛋白用于下述的实施例中。
实施例5:DAT0115、DAT0116、DAT0117和DAT0120对1、3和6个冻融循环的稳定性的对比:
该研究的目的是,对比DAT0115、DAT0116、DAT0117和DAT0120对1、3和6个冻融循环的稳定性。如上所述,在HEK 293E细胞的哺乳动物组织培养物中,从pTT-5载体表达每种蛋白,并在蛋白L亲和树脂上、然后通过离子交换色谱法进行纯化。将蛋白缓冲液更换进20mM柠檬酸盐、100mM NaCl中,并使用相同的缓冲液稀释至0.5mg/ml。然后对每种蛋白的0.5ml等分试样(在埃彭道夫管中)进行0、1、3或6个冻融循环,每个循环包括:在干冰上3分钟,随后在37℃水浴中2分钟(在该实验中观察到,在37℃2分钟足以使蛋白溶液彻底融化)。在完成必要数目的冻融循环后,在2-8℃储存蛋白样品,直到进一步分析。然后通过SDS PAGE电泳、GLP-1R结合试验、在Superdex 75柱上的尺寸排阻色谱法和质谱法,对蛋白进行分析。观察到,1、3或6个冻融循环没有使所有4种蛋白的SDS-PAGE曲线、GLP-1R BA的效价和质谱曲线显著脱离基线。在SEC分析中的最大峰高受到影响,在DAT0115、DAT-116、DAT0117和DAT0120的6个冻融循环后,分别保留了最大峰高的78%、86%、104%和57%。结论是,与其它3种蛋白相比,DAT0120对冻融循环的稳定性更低。
表4:DAT0115、DAT0116、DAT0117和DAT0120对1、3和6个冻融循环的稳定性的对比结果
实施例6:DAT0115在II型糖尿病的db/db小鼠模型中的作用持续时间的证实:
该研究的目的是,测定DAT0115对db/db小鼠的口服葡萄糖耐受性的作用持续时间。在开始实验之前3天,按照递减的葡萄糖水平对动物分类,然后隔离。然后将每个隔离区内的一只动物指定为26个研究组中的每一个。这会确保每个研究组中类似的平均起始葡萄糖水平。
在口服葡萄糖负荷之前5h、24h、48h、72h、96h或120h小时,以1mg/Kg、0.3mg/Kg或0.1mg/Kg(并非在每个时间点施用所有剂量,细节参见下表),皮下地施用DAT0115(在HEK293细胞中生产,并如上所述纯化)。对于0.1mg/Kg和0.3mg/Kg剂量,在24h之前的时间点(包括24h),对于1mg/Kg剂量,在72h之前的时间点(包括72h),与媒介物处理的db/db小鼠相比,DAT0115在口服葡萄糖耐量试验(OGTT)的2小时时段内显著降低了葡萄糖AUC。当在口服葡萄糖丸之前5h施用时,以42μg/Kg作为阳性对照施用的Exendin-4也显著降低OGTT以后的葡萄糖AUC。下面的表5显示了每个DAT0115研究组的AUC与媒介物相比的减小百分比。星号指示,使用假发现率校正,DAT0115与媒介物相比,P<0.05。
表5:显示了每个DAT0115研究组的AUC与媒介物相比的减小百分比(星号指示,使用假发现率校正,DAT0115与媒介物相比,P<0.05)
实施例7:DAT0115在饮食诱发的肥胖(DIO)小鼠肥胖症模型中的效能的证实:
该研究的目的是,使用确立的小鼠饲喂模型(饮食诱发的肥胖小鼠)来确定,DAT0115治疗是否会影响摄食量并从而影响体重。这可以作为用于人类的预测。用60%千卡高脂肪辐照饮食,将雄性C57Bl/6小鼠(购自Taconic)育肥12周,然后转移至自制设施。在到达后,在温度和湿度受控室(70-72℉,湿度=48-50%,5AM/5PM光照周期)中,在alpha-dri垫层上单个地圈养小鼠。将饮食改为45%高脂肪饮食,并使动物适应18天。在施用实验化合物之前,每天给小鼠皮下注射盐水一次,持续3天,并监测摄食量。隔离小鼠,并分组,使得组之间或组内的体重和摄食量没有不同。在研究当天,使用5ml/kg注射体积,如下给8只小鼠组皮下给药:给3组施用DAT0115(低、中和高剂量),给一组施用阴性对照分子(DOM7h-14 AlbudAb,但是没有Exendin-4缀合物),给一组施用Exendin-4阳性对照。
表6:确立DAT0115在饮食诱发的肥胖(DIO)小鼠肥胖症模型中的效能的方法
每天测量日摄食量和体重,持续10天。与DOM7h-14对照相比,DAT0115表现出剂量依赖性的体重和摄食量减小(参见图3a和3b)。因此得出结论,来自该小鼠研究的数据支持下述假设,即DAT0115是良好的临床候选物。
实施例8:DAT0115、DAT0116和DAT0117在II型糖尿病小鼠模型中的血浆半衰期的测定:
该研究的目的是,测定DAT0115、DAT0116和DAT0117在II型糖尿病小鼠模型(db/db小鼠)中的血浆消除特性,并从结果计算药代动力学参数。如前所述,制备DAT0115、DAT0116和DAT0117蛋白:简而言之,使用HEK293E细胞,在哺乳动物组织培养物中表达蛋白,并如下进行纯化:分批吸附到蛋白L-琼脂糖亲和树脂上,然后用pH2.0甘氨酸洗脱,并用Tris PH 8.0中和。随后,使用在20mM乙酸盐pH5.0中的0-1M盐梯度,在Resource S柱上进行离子交换色谱法。然后合并含有目标蛋白的级分,并缓冲液更换进100mM NaCl、20mM柠檬酸盐pH6.2。对蛋白进行过滤除菌,缓冲液更换,去除内毒素并测试,然后在体内应用。
给未禁食的雄性db/db小鼠组(缺乏瘦素受体的LEPr db纯合小鼠,具有瘦素受体基因(lepr)中的突变)皮下地或静脉内地施用1mg/KgDAT0115、DAT0116或DAT0117。对于静脉内给药,在给药前、给药后0.25、0.5、1、4、7、12、24、36、48和60小时,对于皮下给药,在给药前、给药后0.5、1、4、7、12、24、36、48和60小时,通过末端抽血,收集血液样品,并制备血浆。冷冻血浆样品,以后解冻,用于通过固相萃取和LC/MS/MS来分析DAT0115、DAT0116或DAT0117水平(在适当时),以检测蛋白片段(来自蛋白的Exendin-4部分)的存在。然后使用WinNonLin软件,使用计算的血浆水平来拟合药代动力学参数。皮下和静脉内给药后的半衰期和生物利用度如下表所示。从结果(参见下面的表7)得出结论,所有3种化合物在II型糖尿病小鼠模型中表现出理想的药代动力学参数。因此,这些分子表现出在糖尿病人中的良好药代动力学参数的潜力,该研究有利于选择DAT0115或DAT0116,它们优于DAT0117。
表7:DAT0115、DAT0116和DAT0117在II型糖尿病小鼠模型中的血浆半衰期
实施例9:DAT0115、DAT0116、DAT0117在大鼠中的血浆半衰期的测定:
该研究的目的是,测定DAT0115、DAT0116和DAT0117在大鼠中的血浆消除特性,并从结果计算药代动力学参数。如前所述,制备DAT0115、DAT0116和DAT0117蛋白:简而言之,使用HEK293E细胞,在哺乳动物组织培养物中表达蛋白,并如下进行纯化:分批吸附到蛋白L-琼脂糖亲和树脂上,然后用pH 2.0甘氨酸洗脱,并用TrisPH 8.0中和。随后,使用在20mM乙酸盐pH5.0中的0-1M盐梯度,在Resource S柱上进行离子交换色谱法。然后合并含有目标蛋白的级分,并缓冲液更换进100mM NaCl、20mM柠檬酸盐pH6.2。对蛋白进行过滤除菌,缓冲液更换,进行质量控制,然后在体内应用。
为了测定血浆半衰期,给3只大鼠组单次静脉内或皮下注射0.3mg/Kg(静脉内)或1.0mg/Kg(皮下)的DAT0115、DAT0116或DAT0117。通过在72h时段内从尾静脉系列抽血,得到血浆样品,并通过LC/MS/MS进行分析,以检测融合体片段(来自融合体的Exendin-4部分)的存在。然后使用WinNonLin软件,使用计算的血浆水平来拟合药代动力学参数。皮下和静脉内给药后的半衰期和生物利用度如下表8所示。从结果得出结论,所有3种化合物在大鼠中表现出理想的药代动力学参数。因此,所有这些分子表现出在人类中的良好药代动力学参数的潜力,该研究有利于选择DAT0115,它优于DAT0116或DAT0117。
表8:皮下和静脉内给药后的半衰期和生物利用度
实施例10:DAT0115在食蟹猴中的血浆半衰期的测定:
该研究的目的是,测定DAT0115在非人灵长类动物(食蟹猴)中的药代动力学参数,以实现参数的异速生长标定,并得到DAT0115是否可能在人类中具有良好药代动力学特性的最佳可能指示。如前所述,使用HEK293E细胞,在哺乳动物组织培养物中表达DAT0115Exendin-4AlbudAbs融合体,并纯化。简而言之,如下纯化蛋白:分批吸附到蛋白L-琼脂糖亲和树脂上,然后用pH 2.0甘氨酸洗脱,并用Tris PH 8.0中和。随后,使用在20mM乙酸盐pH5.0中的0-1M盐梯度,在Resource S柱上进行离子交换色谱法。然后合并含有目标蛋白的级分,并缓冲液更换进100mM NaCl、20mM柠檬酸盐pH6.2。
对蛋白进行充分的质量控制(包括SDS-PAGE、质谱法、活性测定:GLP-1R-BA、pH检查、渗透性检查),过滤除菌,并去除内毒素。然后将证实具有低内毒素的蛋白(<0.05EU/mg蛋白)用于体内研究。
在该研究中使用6只雌性食蟹猴(Macaca fascicularis;CharlesRiver Laboratories BRF,Houston,TX,Primate Products,Miami,FL和/或Covance Research Products,Inc.,Alice,TX)。在开始给药时,所述猴子是大约2-9岁(体重范围是大约2-5千克)。在环境受控室(64F-84F;30-70%相对湿度)中,以12-小时光/暗周期,将猴子单个圈养在不锈钢笼子中。每天2次地给雌性猴供给大约6片饼干Monkey Diet#5038(PMI Nutrition International,Richmond,IN),并每天1次地分配新鲜水果。根据剂量组(3个皮下和3个静脉内),给每只动物皮下地或静脉内地施用实验化合物(DAT0115)。剂量是0.1mg/Kg。在给药当天,第一次饲喂发生在每只猴子给药后大约1小时内(如果研究-相关的操作要求动物脱离它们的当地圈舍延长的时间段,则延长至给药后2.5小时)。第二次饲喂离第一次饲喂超过2小时。为了环境强化的目的,在生存力检查时或该时间附近,将额外的水果、豆类和/或蔬菜(例如,葡萄、嫩胡萝卜、花生)提供给每只猴子,或作为适应环境或研究相关操作以后的奖赏方法。过滤的自来水(由Aqua Pennsylvania,Inc.供给,并定期分析)可随意得到。
在给药前(0小时)和名义上在给药后5分钟(仅静脉组)、0.5、4、8、24、48、96、144、192、288、336、504和672小时(来自静脉内给药组的动物之一的药代动力学样品仅收集至24h,所以该动物已经从药代动力学拟合排除),从股血管收集血浆样品(约2ml)。通过质谱法分析样品,并使用WinNonLin拟合软件拟合数据。药代动力学参数如下:对于静脉内给药(n=2):T1/2 67h,MRT 46h,Vz 327ml/Kg和Cl3.3ml/小时/Kg;对于皮下给药(n=3):T1/2 68h,MRT 98h,Vz 306ml/Kg和Cl 3.1ml/小时/Kg。计算的生物利用度为99%。
从该研究(和从食蟹猴和人血清白蛋白的biacore结合数据)得出结论,DAT0115在食蟹猴中的68h皮下半衰期(如上所述)证实了相同分子在人类中的半衰期可能足够长,与每周(或更低频率的)给药需求相关联。
实施例11:DAT0115在食蟹猴中的药效动力学(PD)的测定:
如上所述,在食蟹猴中进行药代动力学(PK)研究。该研究的主要目的是,测定DAT0115在食蟹猴中的药代动力学参数(如在以前的实施例中所述),但是次要目的是,得到DAT0115化合物在猴子中的效能的指示(在研究中没有足够的能力确定统计显著性)。为了实现该次要目的,在研究过程中,监测猴子的饼干消耗。在给药以后的数天发现,在所有猴子中存在摄食量减少的趋势。结论是,这可能是由于所述分子的Exendin-4部分作为食欲抑制剂的确定记录的效应。因此,DAT0115被证实在体内有活性。为了保证动物的福利,水果和治疗在大多数天中被消耗,不论饼干消耗如何。
表9:每天被食蟹猴消耗的饼干的测量(在第1天施用DAT0115)
实施例12:使用表面等离子体共振证实,DAT0115Exendin-4AlbudAbs融合体会结合大鼠、食蟹猴和人血清白蛋白:
表达和纯化DAT0115,然后通过表面等离子体共振(Biacore,GEHealthcare)进行分析,以得到关于亲和力的信息。使用抗生蛋白链菌素芯片(SA)进行分析,所述芯片被生物素化的血清白蛋白包被。将200-1000共振单元(RU)的每种血清白蛋白固定化在芯片上。流动池1未包被,流动池2被HSA包被,流动池3被RSA包被,流动池4被CSA包被。通过稀释进BIACORE HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES,pH7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005%表面活性剂P20)中,制备融合体的浓度范围(在15.6nM-2μM范围内),并流过BIACORE芯片。
通过使结合速率(on-rate)和解离速率(off-rate)曲线拟合dAb在KD区域中的浓度所产生的迹线,从BIACORE迹线计算亲和力(KD)。亲和力(KD)总结在下面的表中:
表10:DAT0115的亲和力(KD)
血清白蛋白类型 | DAT0115 |
HSA | 600nM |
RSA | 2uM |
CSA | 2uM |
实施例13:通过差示扫描量热法(DSC)表征DAT0115热变性:
该实验的目的是,使用配有自动采样器的毛细管池微热量计VP-DSC(Microcal),通过DSC(差示扫描量热法),监测DAT0115的热变性。在20mM柠檬酸盐pH6.2、100mM NaCl中透析蛋白过夜,过滤,然后以1mg/ml的浓度制备,通过在280nm的吸光度测定该浓度。将过滤的透析缓冲液用作所有样品的参照。以180℃/小时的加热速率,进行DSC。在每个样品之前,注射1%decon溶液,然后注射缓冲液,以清洁池,并提供仪器基线。使用Origin 7Microcal软件,分析得到的迹线。从样品迹线减去从参照缓冲液得到的DSC迹线。将样品的确切摩尔浓度用于计算(由Origin自动实现)。选择转变之前/之后的上基线和下基线线性区域的基线设置,并使用立方连接函数进行连接。使得到的图拟合非-2-态模型,产生表观的Tm和ΔH/ΔHv值。
使来自DAT0115的迹线拟合非-2-态转变模型,具有56.3℃的appTm。拟合优度是令人满意的(参见图4)。如预期的,对照迹线、溶菌酶、使用相同仪器的运行产生了良好质量的数据,具有完美拟合(得到的溶菌酶的AppTm是76.2℃,这与文献报道的数据相一致(参见图5))。因此,结论是,该实验已经提供了可靠的数据,表明DAT0115是具有56.3℃熔解温度的分子,这是临床候选物可接受的。
实施例14:通过SEC MALLS来表征处于溶解态的DAT0115、DAT0117和DAT0120:
该实验的目的是,通过SEC MALLS来测定溶解态的DAT0115、DAT0117和DAT0120。纯化样品,并在适当缓冲液(PBS)中透析,并在透析以后过滤,测定浓度,并调节至1mg/ml。BSA和HSA购自Sigma,不经进一步纯化地使用。
仪器使用细节:
将具有自动采样器(SIL-20A)和SPD-20A Prominence紫外/可见光检测器的Shimadzu LC-20AD Prominence HPLC系统连接至WyattMini Dawn Treos(MALLS,多角度激光散射检测器)和Wyatt OptilabrEX DRI(鉴别折光指数)检测器。以下述次序连接检测器:LS-UV-RI。RI和LS仪器都运行在488nm的波长。使用TSK2000(Tosohcorporation)或BioSep2000(Phenomenex)柱(二者是基于二氧化硅的HPLC柱,具有类似的分离范围,1-300kDa),流动相为50或200mM磷酸盐缓冲液(含有或不含盐)pH7.4或1xPBS。使用的流速是0.5或1ml/min,调节运行时间以反映不同的流速(45或23min),预期对分子的分离没有显著影响。在PBS中制备蛋白为1mg/ml的浓度,注射体积为100ul。根据生产商的说明书,用甲苯校正光散射检测器。将UV检测器输出和RI检测器输出连接至光散射仪器,使得来自所有3个检测器的信号可以同时被Wyatt ASTRA软件收集。几次注射在PBS流动相中的BSA(0.5或1ml/min),跑过Tosoh TSK2000柱,通过Wyatt软件收集UV、LS和RI信号。然后使用ASTRA软件,分析迹线,并按照生产商的说明书,将信号标准化比对,并校正谱带增宽。然后取校正常数的平均值,并输入用于将来的样品运行的模板中。
绝对摩尔质量计算:
将100ul 1mg/ml样品注射上适当的预平衡的柱。
在SEC柱以后,使样品穿过3个在线检测器——UV、MALLS(多角度激光散射)和DRI(鉴别折光指数),以进行绝对摩尔质量测定。在柱上进行的稀释是约10倍,使得测定溶解态的浓度是100ug/ml或约8uM dAb。
在ASTRA中计算以及齐姆图技术的基础(其经常以分批样品模式执行)是来自Zimm的方程[J.Chem.Phys.16,1093-1099(1948)]:
其中
·c是溶剂中溶质分子的质量浓度(g/mL)
·M是重均摩尔质量(g/mol)
·A2是第二维里(virial)系数(mol mL/g2)
·K*=4p2n0 2(dn/dc)2l0 -4NA -1是光学常数,其中n0是溶剂在入射辐射(真空)波长的折光指数,l0是入射辐射(真空)波长,按照纳米来表示,NA是阿佛加德罗数(Avogadro’s number),等于6.022x1023mol-1,且dn/dc是相对于溶质浓度变化的溶剂-溶质溶液的鉴别折光指数增量,按照mL/g来表示(该因子必须使用dRI检测器独立测量)。
P(q)是理论上-衍生出的波形因子,大约等于1-2μ2<r2>/3!+…,其中μ=(4π/λ)sin(θ/2),且<r2>是均方半径。P(q)是分子的z-平均尺寸、形状和结构的函数。
·Rq是超瑞利比(excess Rayleigh ratio)(cm-1)
该方程假定垂直极化的入射光,且对阶c2是有效的。
为了使用Zimm拟合方法(其拟合Rq/K*c vs.sin2(q/2))进行计算,我们需要展开方程1的倒数为c的一阶:
在该情况下,适当的结果是
和
其中m0≡d[K*c/Rθ]/d[sin2(θ/2)]θ→0 方程5
通过ASTRA软件,自动进行计算,产生图,为每个部分测定出摩尔质量[Astra手册]。
将从该图得到的在色谱图上观察到的每个峰的摩尔质量与单个蛋白单位的预期分子量相对比。这允许我们得出关于蛋白溶解态的结论。
实验数据:
DAT0115
将100μl 1mg/ml DAT0115注射上Superdex 200柱,在20mM柠檬酸盐、0.1M NaCl、pH6.2中平衡。流速设定为0.5ml/min。蛋白在单个峰洗脱,跨整个峰宽测定的分子量是17.4kDa(单体的预期分子量是16.9kDa)。洗脱效率是100%。参见图6(HSA对照的表现符合预期,证实了DAT0115的实验结果。它洗脱成分子量为64kDa(单体)和110kDa(二聚体)的2个峰。HSA二聚体的分子量可能不是非常精确,这归因于在该峰内非常小量的蛋白)。
DAT0117
将100μl 1mg/ml DAT0117注射上TSK2000柱,在50mM磷酸盐缓冲液、pH7.4中平衡。流速设定为1ml/min。约50%注射量的DAT0117被洗脱出柱,成为2个分子量为约35-45kDa的重叠峰(二聚体和以上),这指示在这里测试的条件下的强烈自结合(BSA对照的表现符合预期,证实了DAT0117实验结果,产生摩尔质量为61kDa和146kDa(单体和二聚体)的2个峰)。关于SEC Mal结果,参见图7。
DAT0120
将100μl 1mg/ml DAT0117注射上TSK2000柱,在50mM磷酸盐缓冲液、pH7.4中平衡。流速设定为1ml/min。约50%注射量的DAT0120被洗脱出GF柱,成为稍微不对称的峰,测得分子量为约25kDa。这指示在这里测试的条件下DAT0120的自结合,蛋白似乎处于快速的单体-二聚体平衡中(BSA对照的表现符合预期,证实了DAT0120实验结果,产生摩尔质量为61kDa和146kDa(单体和二聚体)的2个峰)。关于SEC Mal结果,参见图8。
从上面这些实验得出结论,在这里使用的条件下,与其它2种表现出显著的自结合的分子相比,DAT0115表现出明显更少的(且可能没有)自结合。关于体内作用和生产过程中的上游和下游工艺,溶解单体态可能是优选的,所以对于溶解态的临床进展而言,DAT0115可能是最理想的分子。
实施例15:不使用亲和基质蛋白L,从哺乳动物表达进行纯化:
从HEK 293上清液纯化DAT0120和DAT0115。使用HEK 293E细胞,在哺乳动物组织培养物中从pTT-5载体表达每种蛋白。用PBS平衡1ml柱的MEP Hypercel树脂,用0.1M氢氧化钠洗涤,然后用PBS再次平衡。以2.5ml/min,将200ml上清液上柱,然后用PBS洗涤柱,并用0.1M甘氨酸pH2洗脱。洗脱后,通过加入1/5柱的1M TrispH 8,中和样品,并在室温保藏。在保藏后,样品表现出轻微沉淀,使用steriflip装置过滤,然后脱盐。
以10ml/min,用20mM醋酸钠pH5(测得pH 5.3)平衡2个26/10HiPrep脱盐柱,通过加入0.1M NaOH进行清洁,并重新平衡进20mM醋酸钠pH5中。
将DAT0115脱盐进20mM醋酸钠pH5中,然后装载上在20mM醋酸钠pH5(实际5.2)中平衡的1ml HiTrap SPFF。洗涤柱以后,对它进行含有20mM醋酸钠pH5、1M NaCl的0-100%梯度,收集吸光度超过5mAus的洗脱级分,并通过SDS-PAGE进行分析。
保藏SP FF级分过夜以后,对样品进行0.2um过滤,上2X26/10HiPrep脱盐柱上,该柱在20mM柠檬酸钠pH6.2、100mM NaCl中平衡过。在20ml离心式浓缩器中浓缩洗脱液,过滤除菌,并在1/10和1/200稀释度测试内毒素。
在2个稀释度测试内毒素,1/10稀释度产生30Eu/ml的值,峰回收为250。1/200实验产生<10.8Eu/ml的值,峰回收为126%。使用ID27823,对样品进行MS分析。存在低水平的污染物,其在80kDa标志物下面可见,且在高负载时,在110-160kDa标志物之间可见。样品看起来纯度大于95%。
实施例16.Exendin-4和DOM7h-14-10/DOM7h-11-15AlbudAb的遗传融合体的表达和纯化。
该实验的目的是,有效地表达DMS7139和DMS7143。DMS7139是Exendin-4与DOM7h-14-10(结合血清白蛋白的结构域抗体(dAb),也称作AlbudAbs TM)的融合体,DMS7143是Exendin-4与DOM7h-11-15(结合血清白蛋白的结构域抗体(dAb),也称作AlbudAb)的融合体,在大肠杆菌中,具有正确加工过的N-末端。然后可以在随后的实验中测试融合体的Exendin-4部分的活性和AlbudAbs部分的活性。
将Exendin-4克隆为与DOM7h-14-10或DOM7h-11-15的融合体,其中Exendin-4肽是在构建体的5’末端,且AlbudAbs是在3’末端。共制备2个构建体,各自包括在Exendin-4肽和AlbudAb之间的(Gly4Ser)3连接物。所述连接物被包括作为间隔物,以使Exendin-4在空间上与dAb分离,从而防止Exendin-4和GLP-1受体之间的结合的位阻。构建体的序列如图1(m)和1(n)所示。为了能够克隆进表达载体中,通过装配PCR来生产融合体,NdeI限制位点在5’,继之以修饰的OmpT(OmpT AWA氨基酸序列如图1(q)SEQ ID NO 28所示)信号肽,BamHI位点在3’末端上。OmpT AWA信号肽的最后3个密码子从野生型变为“GCTTGGGCC”(显示在图2(p):SEQ ID NO 33中),其编码AWA,而不是SFA。该变化会改善大肠杆菌信号肽酶在正确位点处的加工。
另外,融合体序列直接在肽酶切割位点后开始。NcoI消化位点已经被导入,其与信号肽的最后一个密码子和Exendin-4序列的前2个氨基酸重叠。该变化会促进将来的亚克隆,以及导致具有游离的Exendin-4的N-端末端的融合体的生产。包含上面列出的变化的修饰的pET12a表达载体(从EMD Biosciences得到的pET载体)被命名为pDOM35。
用NdeI和BamHI限制内切核酸酶消化载体和装配PCR,然后使用Quick Ligation试剂盒(NEB),将插入片段连接进载体中。将2微升该连接物用于转化MachI细胞。在恢复生长期以后,将细胞涂布在含有羧苄西林的琼脂平板上,在37℃温育过夜。对菌落测序,将含有正确序列的那些用于质粒扩增和分离(Plasmid Mini Prep试剂盒,Qiagen)。用质粒DNA转化BL21(DE3)细胞,将得到的菌落用于表达培养物的接种。如下进行表达:接种4x0.5升TB Onex培养基(补充了Overnight ExpressTM自身诱导溶液)的培养物、1滴消泡剂和100微克/毫升的羧苄西林。在250rpm搅拌下,在30℃温育培养物3夜,然后通过在3700xg离心1小时,澄清培养物上清液。然后使用蛋白L流线(GE Healthcare,目录号28-4058-03,蛋白L偶联的),从澄清的上清液中纯化表达的蛋白,并使用0.1M甘氨酸pH2.0,从蛋白L洗脱,然后使用0.1体积的1M Tris pH8.0进行中和。接着,浓缩蛋白,并在缓冲液A(20mM醋酸钠-乙酸pH 5.0)中透析,通过在AktaXpress(GEhealthcare)上的离子交换色谱法进行纯化。将蛋白在缓冲液A(无盐缓冲液)中装载上Resource S 6ml柱,然后用缓冲液B梯度(20mM醋酸钠-乙酸pH 5.01M NaCl)从0-68%B洗脱,进入65分钟级分(对于DMS7139)。在SDS-PAGE上和通过质谱法分析级分,合并具有正确质量的那些。将最终的蛋白透析进20mM柠檬酸盐0.1M NaCl缓冲液中,并通过SDS-PAGE和质谱法再次确认身份。
实施例17.使用表面等离子体共振证实,Exendin-4AlbudAbs融合体DMS7139和DMS7143会结合血清白蛋白
如上所述表达和纯化DMS7139和DMS7143,并通过表面等离子体共振(Biacore,GE Healthcare)进行分析,以得到关于亲和力的信息。使用被血清白蛋白包被的2个CM5芯片(羧甲基化的葡聚糖基质)进行分析。在乙酸盐缓冲液pH4.5中固定化~500共振单元(RU)的每种血清白蛋白。第一个芯片的流动池1未包被且被封闭,流动池2被MSA(560Rus)包被。第二个芯片的流动池1未包被且被封闭,流动池2被HSA包被,流动池3被CSA包被,流动池4被RSA包被。对于所有血清白蛋白,目的是包被芯片上的350RU蛋白的区域。
如下制备融合体的浓度范围(对于DMS7139,在55nM-1μM范围内;对于DMS7143,在24nM-4.4μM范围内):在BIACORE HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES,pH7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005%表面活性剂P20)中稀释,并流过BIACORE芯片。通过使结合速率(on-rate)和解离速率(off-rate)曲线拟合dAb在KD区域中的浓度所产生的迹线,从BIACORE迹线计算亲和力(KD)。亲和力(KD)总结在下面的表11中:
表11:
DMS7139(M) | DMS7143(M) | |
HSA | 2.69E-08 | 1.48E-08 |
RSA | 3.15E-08 | 2.19E-07 |
CSA | 4.23E-08 | 3.89E-08 |
MSA | 7.37E-08 | 8.93E-08 |
结论是,DMS7139和DMS7143对血清白蛋白的亲和力(DMS7143对RSA的亲和力除外)是在10-90nM范围内。这显著高于以前的融合体对SA的亲和力(例如DAT0115,它是用甘氨酸丝氨酸连接物连接到DOM7h-14AlbudAbs上的Exendin-4,它对这些血清白蛋白的亲和力是在数百nM范围内)。新的融合体(对血清白蛋白)的更高亲和力可能解释为在体内更长的血浆半衰期,这意味着,所述融合体能够以更低的频率施用,实现相同的效能,和/或维持随时间更持久的血浆药物水平,潜在地减少不希望的cMax有关的毒性或副作用。
实施例18
DMS7139和DMS7143融合体在GLP-1受体结合试验中是有活
性的
GLP-1R是7TM G-蛋白偶联的受体,其为了本试验的目的,在CHO细胞上表达。GLP-1或类似物对受体的活化会导致与该受体偶联的腺苷酸环化酶将ATP转化为cAMP。用6CRE/luc报告基因稳定地转染CHO细胞。因此,在GLP-1活化受体以后,由于cAMP的生成,启动子基因(含有6个拷贝的cAMP反应元件-6CRE)会驱动萤光素酶报告基因的表达。这随后催化与萤光素的反应,产生光,所述光可以在光度计上测量。
方法
通过将管形瓶半浸没在37℃水浴中,将CHO 6CRE GLP1R细胞快速解冻,将管形瓶的内容物转移至50ml falcon试管,向每个管形瓶中加入10ml RPMI(无酚红的)试验培养基(Sigma,目录号R7509)+2mM L-谷氨酰胺(Gibco,目录号25030)+15mM HEPES(Sigma,目录号H0887)。计数并在1200rpm离心5分钟后,将细胞重新悬浮于适当体积的RPMI试验培养基中,得到1x106细胞/ml,将50μl分配进白色96孔平底组织培养板(Costar 96孔组织培养板,白色,无菌,目录号3917)的每个孔中。将细胞在37C/5%CO2温育过夜。次日,从培养箱取出细胞,将50μl以前制备的对照/样品加入孔中,并将平板返回培养箱,在37℃和5%CO2温育3小时。
制备Exendin-4对照(Sigma,目录号E7144)
在V-底96孔平板中,将2μl(1mg/ml)Exendin-4加入到198μlRPMI试验培养基中,得到2.39μM溶液。将2μl该2.39μM溶液加入到237μl RPMI试验培养基中,得到20nM溶液(试验终浓度为10nM)。将对照按照1∶10向下系列稀释平板(15μl对照+135μl RPMI试验培养基),得到8点曲线。
制备未知的样品
使用与制备对照相同的方法,制备未知的样品。使最高浓度为需要的最终试验浓度的2倍,并按照1∶10向下稀释平板。
制备萤光素酶(Promega,目录号E2620)
从冰箱中取出需要数量的Bright-Glo萤光素酶等分试样,并在室温在暗处解冻。1个5ml管形瓶对于1个试验平板而言足够。
在温育时间以后,将50μl Bright-Glo萤光素酶试剂加入所有孔中,将平板在室温温育3min,以允许细胞裂解发生。使用M5e微量培养板读数器,读出发光(CPS,每秒的计数),每个孔读0.1秒。从所有其它孔中,减去仅含有细胞的背景孔的CPS。对照孔(GLP-1(7-36)或Exendin-4)应当在最高浓度表现出最大刺激。拟合未知样品的浓度效应曲线,使用GraphPad Prism或ExcelFit软件,从该曲线计算出EC50。
与Exendin-4一起,在GLP-1R BA试验中,测试了两种Exendin-4AlbudAbs融合体(DMS7139和DMS7143)的活性。结果如下面的表12所示:
表12:
从上面的结果得出结论,DMS7139和DMS7143在GLP-1R BA中显示出预期的活性,因此,它们可能在体内对GLP-1受体是有活性的。因此,DMS7139和DMS7143是将来临床前研究的良好候选物,如果临床前研究是成功的,将有进入临床研究的前景。
实施例19
将表达DAT0115或DAT0117的载体转化进大肠杆菌菌株Bl21-(DE3)(Novagen)中。以OD=0.1,接种装有50ml改良的极好的肉汤培养基(Sigma目录号T0918)的250ml烧瓶,然后补充50mg/l卡那霉素,在30℃进行培养。在A600=0.5-1,用IPTG诱导细胞至50μM终浓度,在相同的温度继续培养过夜。离心培养物,使用蛋白L树脂(自制),将DAT0115或DAT0117捕获脱离培养物上清液。在8℃进行分批结合过夜,用10柱体积的PBS洗涤树脂,并用3柱体积的0.1M甘氨酸pH=2从树脂洗脱DAT0115或DAT0117。通过加入1/5体积的1M Tris pH8.0,中和蛋白。然后通过SDS-凝胶和质谱法(MS),或通过Edman降解(Edman),分析蛋白。
使用如在实施例16中所述的条件,转化、培养和分析用星号(*)标记的表达DAT0117的载体。
表13:
实施例20使用MalE/pET30载体,表达和纯化DMS7139(Exendin-4和DOM7h14-10的遗传融合体)AlbudAbs
使用寡核苷酸no.1(图2s:SEQ ID NO 47)(GGAATTCCATATGAAAATCAAAACCGGTGCTCGCATCCTGGCTCTGTCCGCTCTGACCACTATGATGTTCTCCGCTTCCGCGCTGGCTCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGAC)和寡核苷酸no.2GTTCAGAATTCTTATTACCGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTG(图2t:SEQ IDNO 48),通过PCR,从含有DMS7139的质粒扩增DMS7139基因。扩增产物含有DMS7139构建体,该构建体具有N-端MalE信号序列MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA(图9j:SEQ ID NO 49),并在它的5’和3’末端分别具有NdeI和EcoRI的识别序列。用NdeI/EcoRI消化得到的基因片段,并连接进NdeI/EcoRI消化的pET30载体(Invitrogen)中。为了验证插入片段,使用T7-正向引物和T7-反向引物,对克隆测序。
将表达DMS7139的载体转化进含有pECO-pgl载体的大肠杆菌株BL21-(DE3)(Novagen)中(参见Aon等人applied and environmentalmicrobiology,2008年2月,第74卷,第2期,第950-958页),并在补充了50mg/l卡那霉素和37.5mg/L氯霉素的基本培养基中在30℃培养培养物(参见Korz D.J.等人J.Biotechnol.1995 39第59-65页)。在A600处于0.25和0.5之间时,用IPTG诱导细胞(得到的实际值0.347)至70μM终浓度,在28℃继续培养过夜。离心培养物,使用蛋白L树脂(自制),将DMS7139捕获脱离培养物上清液。在4℃进行分批结合过夜,用10柱体积的PBS洗涤树脂,并用3柱体积的0.1M甘氨酸pH=2从树脂洗脱DMS7139。然后通过SDS-凝胶和质谱法,分析蛋白。如图10所示,质谱法表明,存在非常纯的DMS7139。
也可以对编码蛋白DMS7139的DNA序列进行密码子优化,用于大肠杆菌表达,该序列如图2(u)SEQ ID NO 50所示。
实施例21 DMS7139以类似的效价结合小鼠、大鼠、食蟹猴和人GLP-1R
为了测定DMS7139对人、小鼠、大鼠和食蟹猴GLP-1R的相对效价,使用载黑素细胞功能的GLP-1R生物试验(类似于Jayawickreme等人,Curr Protocols in Pharmacol.2005)。已经确定地记载了通过7TM活化实现的黑素体易位,且已经证实停留在载黑素细胞内的G蛋白会以与哺乳动物细胞系统类似的方式偶联至GPCR(Gross等人,J CellBiol 2002;156:855-865)。该生物试验使用源自光滑爪蟾(Xenopuslaevis)的皮肤细胞的载黑素细胞细胞系,其具有黑色色素(黑色素),所述黑色色素含有称作黑素体的细胞器(Lerner,Trends Neurosci.1994;17:142-146)。细胞内cAMP水平的变化控制着黑素体聚集或在细胞中分布的程度,因而载黑素细胞色度与cAMP水平直接相关。下面给出了其它细节。
使用标准的分子生物学技术,将编码大鼠、小鼠和人GLP-1受体的全长开放读码框cDNA克隆进表达载体pJG3.6或pcDNA3中。Genebank登录号如下面的表14所示。
表14 Genebank登录号
从分离自食蟹猴肺、肝和脑的总RNA逆转录cDNA,从其扩增编码食蟹猴GLP-1R的克隆,并亚克隆进pcDNA3.2DGW中。确认全长cDNA序列。在T225烧瓶(Costar目录号3000)中,在L-15培养基中,在27℃和0%CO2维持载黑素细胞,并每周使用0.7x胰蛋白酶从汇合的烧瓶分流一次(1∶10),然后每周饲喂2次。食蟹猴的cDNA如图2(r)(SEQ ID NO 45)所示。
对于测定目的,洗涤细胞,胰蛋白酶化,并以15x106细胞/ml的浓度,重新悬浮于0.7x EPG PBS中。将800μl细胞与20-40μg cDNA一起轻轻混合,并在冰上温育20分钟。在温育后,将800μl细胞/cDNA混合物抽吸进比色皿中,在500V、725uF和950欧姆进行电穿孔。然后将细胞从比色皿直接转移进装有RFM(常规蛙培养基)的T75烧瓶中,在室温温育至少3小时,然后在培养箱(25℃,0%CO2)中过夜。次日,将细胞胰蛋白酶化,计数,并以300,000细胞/ml的密度加入Costar 96半孔平板(目录号3697)。2小时后,将它们放入在培养箱内密闭容器中过夜(25℃,0%CO2)。次日,抽吸培养基,将25μl含有1%DMSO和10nM褪黑激素的MAB(载黑素细胞试验缓冲液)加入每个孔中。将细胞温育1小时,在620nm在SLT波谱平板读数器上测量基础透光率。接着,将含有25μl 2x浓度肽和标准品的系列稀释液(12点系列,使用在MAB中的3倍稀释间隔)直接加入每个孔中。标准品包括褪黑激素10nM、MSH 200nM和MAB,并分别用于建立试验系统最小、最大和基础响应水平。在加入肽和标准品以后,将平板温育1小时,并如前所述测量透光率。使用Robosage(version 7.3.2),通过计算(1-Tf/Ti),其中Ti是最初的基线读数,Tf是响应读数,分析数据。
Gs-偶联的7TM受体活化(即GLP-1R)会导致细胞内cAMP的增加,造成以前已经使用褪黑激素聚集的黑素体会变得更分散,将该响应测量为穿过细胞的透光率的降低。或者,在降低cAMP的条件下,黑素体聚集,导致穿过细胞的透光率的增加。因此,在将含有质粒构建体的GLP-1R cDNA转染进载黑素细胞并短暂表达以后,从剂量-响应曲线可以计算出DMS7139用于GLP-1R活化的相对效价。结果如下面的表15所示。
表15 DMS7139在载黑素细胞试验中的效价
使用被人、小鼠、大鼠和食蟹猴GLP-1R转染的载黑素细胞,在试验中测试DMS7139的效价,对于每个物种,至少一式两份。双份试验的pEC50列出在表15中。对食蟹猴、人和大鼠受体的效价非常类似,对小鼠受体的效价可能稍微更低。总之,在表15中显示的该数据较好地确信,可能在可行的毒理学物种(大鼠和食蟹猴)中以及在人类中再现用该药物在小鼠模型中观察到的效能。
实施例22 DAT0115和DMS7139在II型糖尿病的db/db小鼠模型中的效能和作用持续时间
该研究的目的是,测定和对比DAT0115和DMS7139对10-11周龄db/db小鼠(从Jackson Labs得到)的口服葡萄糖耐受性的作用持续时间。按照开始实验之前3天评估的血糖水平,将动物随机分入治疗组。这会确保每个研究组中类似的平均起始葡萄糖水平。在口服葡萄糖丸之前120h、96h、72h或48h,以1mg/kg,皮下地施用DAT0115和DMS7139(显示在图11A中)。对于DMS7139,在120h之前的所有时间点,对于DAT0115,在96h之前的所有时间点,与媒介物处理的db/db小鼠相比,葡萄糖AUC在口服葡萄糖耐量试验(OGTT)的2小时时段内显著降低(图11B)。尽管在72h、96h或120h施用的DAT0115和DMS7139之间没有统计差异,在48h时,DAT0115对葡萄糖AUC的降低明显超过DMS7139。
结论是,DMS7139表现出的葡萄糖AUC的更一致的降低是这类药物的更理想特性的代表。因此,尽管该研究没有鉴别出明显的优越性,基于该数据和其它数据,选择DMS7139作为先导者。
实施例23与DOM7h-14对照相比,重复剂量的DMS7139显示出HbA1c的剂量依赖性的降低
该研究的目的是,检查在10-11周龄db/db小鼠(Jackson labs)中重复给药DMS7139以后的HbA1c降低。HbA1c是血红蛋白的糖化形式,其浓度被用作血浆葡萄糖浓度在延长的时间段内的替代度量。为了确保每个研究组中类似的平均起始HbA1c水平,基于实验开始之前3天的HbA1c水平,将db/db小鼠随机化。给动物皮下QD施用DMS7139(0.01、0.03、0.1、0.3mg/kg)、ByettaTM(0.0001、0.001、0.01、0.1mg/kg)或DOM7h-14~(0.3mg/kg),持续2周。在研究期间,测量体重、摄食量和葡萄糖,在14天结束时,测量HbA1c。
与对照(DOM7h-14)相比,在0.03、0.1和0.3mg/kg的DMS7139治疗组中,饲喂的葡萄糖和HbA1c显著降低,尽管它们相对于盐水对照而言不是显著的(参见图12的结果)。与基于用最低剂量的Exendin-4或DMS7139得到的数据所预期的值相比,用盐水对照得到的数据更低。没有观察到Exendin-4相对于盐水对照的变化。使用DMS7139时,也存在体重和摄食量的显著减小。Exendin-4在最高剂量时确实表现出对摄食量的显著影响。
结论是,DMS7139的重复施用会导致db/db小鼠中的HbA1c降低,以及对摄食量和体重的影响。这些变化与GLP-1R激动剂的预期结果相一致。
实施例24与DOM7h-14对照相比,DAT0115和DMS7139在饮食诱发的肥胖(DIO)小鼠肥胖症模型中表现出剂量依赖性的摄食量和体重减小
这里所述的研究的目的是,测定DAT0115和DMS7139治疗是否会影响10天时段内的摄食量并从而影响体重,并测定这些化合物之一是否具有比其它化合物更长的作用持续时间。这可以作为用于人类的指示。使用DAT0115、Byetta和DMS7139剂量组,在饮食诱发的肥胖(DIO)小鼠饲喂模型中进行实验。
用60%千卡高脂肪辐照饮食(Research Diets D12492),将雄性C57Bl/6小鼠(Taconic)育肥12周,然后转移至自制设施。在到达后,在温度和湿度受控室(70-72℉,湿度=48-50%,5AM/5PM光照周期)中,在alpha-dri垫层上单个地圈养小鼠。将饮食改为45%高脂肪饮食(Research Diets D12451),并使动物适应18天。在施用实验化合物之前,给小鼠皮下注射盐水,持续3天,并监测摄食量。将小鼠分组,使得组之间的体重和摄食量没有不同。给3组各自施用0.01mg/kg、0.1mg/kg和1mg/kg的DAT0115或DMS7139,给一组施用阴性对照分子(DOM7h-14AlbudAbs TM,1mg/kg),给一组施用Exendin-4阳性对照(0.01mg/kg)。测定日摄食量和体重10天。
与DOM7h-14对照(参见图13的结果)相比,DAT0115和DMS7139表现出摄食量和体重的剂量依赖性的减小。应当指出,在图13中提及的Exendin是ByettaTM。来自该小鼠研究的数据表明,它们的效能之间没有统计差异。
实施例25 DMS7139在小鼠、大鼠和食蟹猴中的药代动力学分析
使用DSM7139,在3个模型物种(db/db小鼠、大鼠和食蟹猴)中,皮下地和静脉内地进行一组研究。选择剂量的目的是,达到预期在相关的时间点通过试验可检测出的血浆浓度:在小鼠中,1mg/kg静脉内和皮下;在大鼠中,1mg/kg皮下和0.3mg/kg静脉内;在食蟹猴中,0.1mg/kg静脉内和皮下。
用于药代动力学取样的时间点是:db/db小鼠(0.17、1、4、8、24、48、72、96、120和168小时)、大鼠(0.17、1、4、8、12、24、48、72、96和120小时)和食蟹猴(0.083(仅静脉内组)、0.5、4、8、24、48、96、144、192、288、336、504和672小时(4周))。进行血液的系列取样,但是小鼠除外,每个数据点处死一只动物。制备血浆样品,并冷冻保存,用于以后分析DMS7139水平。
使用两种定量测定法来在不同的研究中分析药代动力学样品:一种是ELISA方法,其检测分子的Exendin-4和AlbudAbs部分,一种是HPLC-MS/MS方法,其检测来自Exendin-4的N-端肽。这里显示了来自基于ELISA的方法的数据。
ELISA
使用ELISA测定法,测定食蟹猴血浆中的DAT0115和DMS7139水平。简而言之,用5μg/mL的在50mM碳酸钠缓冲液pH 9.4(100μL/孔)中的抗-Exendin-4抗体(Abcam目录号ab26263)在冰箱中包被96-孔fluoronunc平板(Nunc#437796)过夜。次日,用10mM Tris、150mMNaCl pH7.5+0.1%吐温-20(300μL/孔)洗涤平板5次,然后用200μl封闭缓冲液(superblock,thermoscientific#37535,在TBS中)封闭,名义上在37℃摇动大约1小时。如前所述洗涤孔,然后在摇动下,名义上在37℃温育100ul/孔的质量控制(QC)、标准品或样品大约2h。再次洗涤孔,然后在摇动下,用兔抗-人к轻链抗体在试验缓冲液(10mM Tris,150mM NaCl,0.1%BSA,0.1%吐温20pH 7.5)中的1∶2000最终稀释液名义上在37℃温育1h,随后如前所述洗涤。然后在摇动下,用100μl/孔的报告标签溶液(1/500,000的山羊抗-兔IgG缀合物在试验缓冲液中)名义上在37℃温育孔,如前所述洗涤。如下检测结合的DAT0115或GSK2374697A:加入100μL/孔的显影底物(upersignalELISA femto(thermoscientific#37075),恒速摇动大约1分钟,然后使用化学发光平板读数器(Wallac 1420 Victor Mulyilabel Counter(Perkin Elmer Life Sciences)读出。
使用WinNonLin软件X TBC版,对测量的血浆水平进行分区的和非分区的药代动力学分析(参见下面的表16)。对于非分区的结果,汇编DAT0115和DMS7139的所有pK数据,并在同一天拟合研究之间的一致性。显示的数据因此是DAT0115和DMS7139的汇编的数据、NCA结果和图。
在食蟹猴中,计算出的半衰期是106.4h或112.8h(静脉内)和113.8h或113.1h(皮下),分别通过分区的和非分区的方法进行计算。结论是,在所有3个物种中,DMS7139的血浆半衰期接近血清白蛋白自身的血浆半衰期,因此,鉴于DMS7139对人血清白蛋白具有类似的亲和力(例如,与食蟹猴血清白蛋白相比),这较好地确信,DMS7139会在人类中具有与每周(或更低频率的)给药相容的半衰期。
表16:
A)db/db小鼠数据(ELISA数据)
B)大鼠数据(ELISA数据)
C)食蟹猴数据(ELISA数据)
实施例26 DMS7139和DAT0115在食蟹猴中的药代动力学分析对比
为了选择最合乎需要的分子来开发用于人类,对比了DAT0115和DMS7139在食蟹猴中的药代动力学参数(参见表17)。我们的结论是,表中的数据表明,当皮下地或静脉内地施用时,与DAT0115相比,DMS7139具有更合乎需要的药代动力学参数,在食蟹猴中表现出更长的半衰期。更长的半衰期具有下述效应,即在更晚的时间点,DMS7139的血浆浓度总是高于DAT0115(数据未显示)。
表17:DAT0115和DMS7139在食蟹猴中的半衰期对比
实施例27:PYY(3-36)DOM7h-14-10(R108C)AlbudAbsTM肽缀合物DMS7605(它具有图14所示的结构,且它是:经由赖氨酸和4个重复PEG连接物缀合到PYY3-36上的DOM 7h-14-10(R108C)AlbudAbs)的生产:如下所述,在大肠杆菌中表达DOM7h-14-10(R108C)albudab,并纯化:将编码DOM7h-14-10(R108C)的基因克隆进载体pET30中。为了能够克隆进表达载体中,通过装配PCR来生产融合体,NdeI限制位点在5’,继之以PEL B前导序列(氨基酸序列显示在图9(i)SEQ ID NO 46中)。用NdeI和BamHI限制内切核酸酶消化载体和装配PCR,然后使用Quick Ligation试剂盒(NEB),将插入片段连接进载体中。将2微升该连接物用于转化MachI细胞。在恢复生长期以后,将细胞涂布在含有羧苄西林的琼脂平板上,在37℃温育过夜。对菌落测序,将含有正确序列的那些用于质粒扩增和分离(Plasmid Mini Prep试剂盒,Qiagen)。用质粒DNA转化BL21(DE3)细胞,将得到的菌落用于表达培养物的接种。如下进行表达:接种装有50ml改良的极好的肉汤培养基(Sigma)的250ml烧瓶,这是在OD=0.1接种,然后在补充了50mg/ml卡那霉素的条件下,在30℃进行培养。在A600=0.5-1时,用IPTG诱导细胞至50μM终浓度,继续在23℃培养过夜。然后,通过在3700xg离心1小时,澄清培养物上清液。然后使用蛋白L流线(GE Healthcare,目录号28-4058-03,蛋白L偶联的),从澄清的上清液中纯化表达的蛋白,并使用0.1M甘氨酸pH2.0,从蛋白L洗脱,然后通过加入1/5洗脱体积的1M Tris pH8.0进行中和。然后,使用0.1M柠檬酸,将蛋白的pH调至pH5,并装载用50mM柠檬酸钠pH5平衡过的30ml Source S柱(GE Healthcare)。使用AktaXpress FPLC(GE healthcare),在150ml内应用50mM柠檬酸钠pH5、1M NaCl的0-100梯度。在SDS-PAGE上分析级分,合并含有最纯产物的那些。将最终的蛋白脱盐进50mM磷酸钠pH6.5、5mMEDTA。
然后使用图14所示的PEG连接物,将Dom7h-14-10(R108C)AlbudAbs连接至PYY 3-36氨基酸分子(但是具有在10位处的赖氨酸,其可以用PEG连接物衍生)。通过标准的化学合成,制备PYY和PEG。然后使用在PEG连接物末端处的马来酰亚胺,将PYY肽缀合至如上所述制备的DOM7h-14-10(R108C)AlbudAbs的游离半胱氨酸上。
将DOM7h-14-10(R108C)脱盐进50mM磷酸钠pH6.5、5mMEDTA。然后将马来酰亚胺活化的肽与蛋白以1∶1比例进行混合,并温育,以允许缀合发生。
以与上述类似的方式,通过离子交换色谱法,从未反应的DOM7h-14-10(R108C)纯化缀合物。最后,以与上述类似的方式,使用蛋白L亲和纯化,从游离的肽纯化富含缀合物的级分。对最终的DMS7605缀合物进行缓冲液更换,并通过SDS-PAGE和质谱法进行分析。
实施例28:Exendin-4AlbudAbs(如上所述制备的DAT0115)和PYY(3-36)AlbudAbs融合体肽(如实施例27所述制备的DMS7605,且具有图14所示的结构)在载黑素细胞功能生物试验中的药理学特性。
使用用目标受体转染的细胞,在载黑素细胞功能生物试验中,测定了Exendin-4AlbudAbs(DAT 0115)和PYY(3-36)AlbudAbs(如实施例27所述制备的DMS7605,且具有图14所示的结构)的药理学特性。基本上如实施例21所述,具有下述不同,进行生物试验:将80ug cDNA用于人NPY1R,将40ug用于小鼠NPY1R,将40ug用于其它小鼠和人NPY受体(NPY2R、NPY4R和NPY5R)。
Exendin-4和PYY(3-36)AlbudAbs融合体肽(数据未显示)的药理学特性揭示,融合体会结合和活化小鼠和人NPY受体。DMS7605会结合NPY1R、NPY2R、NPY4R和NPY5R,其中NPY2R被最强烈地活化(数据未显示)。NPYR登录号如下:NPY1R:NM 00909(人)和NM 010934(小鼠);NPY2R:NM 00910(人)和NM 008731(小鼠);NPY4R:NM 005972(人)和NM 008919(小鼠);NPY5R:NM 006174(人)和NM 016708(小鼠)。
实施例29:与媒介物对照相比,DMS7605在饮食诱发的肥胖(DIO)小鼠肥胖症模型中表现出剂量依赖性的体重减轻
在饮食诱发的肥胖(DIO)小鼠肥胖症模型中进行实验,以评估DMS7605的效能(aka DMS7167:PYY3-36)。这里所述的研究的目的是,测定DMS7605治疗是否会影响6天时段内的摄食量和体重。这些结果可以作为用于人类的预测。
用60%千卡高脂肪饮食(Research Diets D12492),将雄性C57B1/6J小鼠(Taconic)育肥12周,然后转移至自制设施。在到达后,在温度和湿度受控室(70-72℉,湿度=48-50%,5AM/5PM光照周期)中,在alpha-dri垫层上单个地圈养小鼠。将饮食改为45%高脂肪饮食(Research Diets D12451),并使动物适应5周。允许动物随意地接近食物和水。在施用化合物之前,给小鼠皮下注射媒介物,持续1天,并监测摄食量。将小鼠分组,使得组之间的体重和摄食量没有不同。给各组隔日施用媒介物或3mg/kg、1mg/kg、0.3mg/kg或0.1mg/kg剂量的DMS7605。在3mg/kg(37.3%减少)、1mg/kg(31.3%减少)和0.3mg/kg(21.8%减少),观察到6天累积摄食量的统计上显著的变化(通过T-检验,p<0.05),而在0.1mg/kg,没有观察到显著变化(8.7%减少,通过T-检验,p=0.07)。在开始给药后第0、3和6天,测量体重。
与媒介物对照相比,DMS7605表现出剂量依赖性的体重减轻(图15)。在所有剂量,观察到体重的显著减轻(通过双路ANOVA,随后进行Bonferroni post-hoc分析,p<0.01)。
Claims (39)
1.一种融合体或缀合物组合物,其包含下述物质或由其组成:(a)促胰岛素药剂或肠降血糖素药物,其作为与(b)的融合体或缀合物存在;(b)结合血清白蛋白的dAb,其选自:(i)DOM 7h-14结构域抗体(dAb)(DOM 7h-14的氨基酸序列如图1(h):SEQ ID NO 8所示),(ii)DOM 7h-14-10结构域抗体(dAb)(DOM 7h-14-10的氨基酸序列如图1(o):SEQ ID NO 26所示),或与DOM 7h-14-10dAb的序列具有最多4个氨基酸差异的dAb;和(iii)DOM 7h-11-15dAb(DOM 7h-11-15的氨基酸序列如图1(p):SEQ ID NO 27所示),或(iv)DOM 7h-14-10R108C结构域抗体(dAb)(DOM 7h-14-10的氨基酸序列如图1(r)所示)。
2.根据权利要求1所述的融合体或缀合物,其中所述药物是Exendin-4、GLP-1分子或PYY分子、或它们的保留天然分子的结合活性的突变体或衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的融合体或缀合物,其中所述药物选自:(a)GLP-1(7-37)A8G突变体,其具有图1(i)(SEQ ID NO 9)所示的氨基酸序列,或(b)Exendin-4分子,其具有图1(j)(SEQ ID NO 10)所示的氨基酸序列,或(c)PYY3-36或具有在10位的赖氨酸,且具有图1s所示的氨基酸序列的PYY 3-36。
4.根据前述权利要求中任一项所述的融合体或缀合物,其包含连接药物和dAb的氨基酸连接物或化学连接物。
5.根据权利要求4所述的融合体或缀合物,其中所述氨基酸连接物是具有图1(k)(SEQ ID NO 11)所示的氨基酸序列的螺旋连接物,或具有图1(l)(SEQ ID NO 12)所示的氨基酸序列的gly-ser连接物。
6.根据前述权利要求中任一项的融合体,其中所述促胰岛素药剂或肠降血糖素药物作为融合体的一部分存在于dAb的N-端或C-端。
7.根据权利要求6所述的融合体或缀合物,其包含选自下述的氨基酸序列或由其组成:
(a)Exendin4、(G4S)3、连接物DOM7h-14-10融合体(DMS7139)
HGEGTFTSDLSKQMEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGG
GGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQK
PGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYY
CAQGLRHPKTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID NO 24)
(b)Exendin4、(G4S)3、连接物DOM7h-11-15融合体(DMS7143)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGG
GGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTMLSWYQQK
PGKAPKLLILAFSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
AQAGTHPTTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID NO 25)
(c)肽缀合物,它是:经由赖氨酸(导入在PYY的10位)和4个重复PEG连接物缀合到C-端酰胺化的PYY3-36上的DOM 7h-14-10(R108C)AlbudAb,如图14所示。
8.根据前述权利要求中任一项所述的融合体或缀合物,其中所述dAb进一步格式化以增加它的流体动力学尺寸,这是通过连接选自下述的分子到dAb上:PEG基团、血清白蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或至少其转铁蛋白-结合部分、抗体Fc区域,或通过缀合抗体结构域。
9.根据前述权利要求中任一项所述的融合体或缀合物,其包含另外的肽或多肽部分。
10.根据前述权利要求中任一项所述的融合体或缀合物,其包含额外的dAb部分,所述dAb部分具有与DOM 7h-14-10或DOM7h-11-15dAb相同或不同的结合特异性。
11.根据前述权利要求中任一项所述的融合体或缀合物,其在人类中具有12小时或更长例如12-21天的消除半衰期。
12.根据前述权利要求中任一项所述的融合体或缀合物,其以在约5微摩尔至约1皮摩尔范围内的KD结合人血清白蛋白。
13.一种药物组合物,其包含根据前述权利要求中任一项所述的融合体或缀合物以及药学上或生理上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
14.根据权利要求13所述的药物组合物,其包含另外的治疗剂或活性剂。
15.一种组合物,其包含:(a)根据权利要求1-12中任一项所述的融合体或缀合物,和(b)另外的治疗剂或活性剂,用于单独地、先后地或同时地施用给受试者。
16.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其用于治疗或预防代谢疾病或障碍。
17.根据权利要求16所述的组合物,其中所述疾病或障碍选自:高血糖症、受损的葡萄糖耐受性、β细胞缺乏、糖尿病(I型或II型糖尿病或妊娠糖尿病)、肥胖症或特征在于进食过量的疾病。
18.根据权利要求1-15中任一项所述的组合物在药剂生产中的应用,所述药剂用于治疗或预防代谢疾病或障碍。
19.根据权利要求1-15中任一项所述的组合物在药剂生产中的应用,所述药剂通过皮下、静脉内或肌肉内注射递送给受试者。
20.根据权利要求1-15中任一项所述的组合物在药剂生产中的应用,所述药剂用于肠胃外、口服、直肠、透粘膜、眼、肺或胃肠道递送。
21.一种治疗或预防代谢病的方法,所述方法包括,给患者施用治疗或预防有效量的根据权利要求1-15中任一项所述的组合物。
22.一种口服的、可注射的、可吸入的或可雾化的制剂,其包含根据权利要求1-15中任一项所述的组合物。
23.一种持续释放制剂,例如包含根据权利要求1-15中任一项所述的组合物的栓剂形式。
24.一种冷冻干燥制剂,其包含根据权利要求1-15中任一项所述的组合物。
25.一种递送装置,其包含根据权利要求1-15中任一项所述的组合物。
26.一种分离的或重组的核酸,其编码根据权利要求1-8中任一项所述的融合体,例如选自下述的序列:SEQ ID NO 50、30、29、15-22。
27.一种核酸,其编码根据权利要求7或8所述的融合体中的任一种。
28.一种载体,其包含如权利要求27或28所述的核酸。
29.一种宿主细胞,其包含如权利要求27或28所述的核酸或如权利要求29所述的载体。
30.一种生产融合体多肽的方法,所述融合体多肽包含下述物质或由其组成:(a)促胰岛素药剂或肠降血糖素药物,其作为与(b)的融合体存在;(b)选自下述的dAb:DOM 7h-14-10、DOM 7h-14-10R108C或DOM 7h-11-15结构域抗体(dAb),所述方法包括:在适合表达所述核酸或载体的条件下,维持如权利要求29所述的宿主细胞,由此生产融合体多肽。
31.一种治疗或预防患者,例如人患者,的与高血糖有关的疾病或障碍的方法,所述方法包括给所述患者施用治疗或预防有效量的根据权利要求1-15中任一项所述的组合物。
32.一种在患者,例如人患者,中刺激胰岛素生产和/或增加胰岛素敏感性的方法,所述方法包括,给所述患者施用至少一剂量的根据权利要求1-15中任一项所述的组合物。
33.一种修饰的前导序列,其具有在它的C末端处的氨基酸序列AMA或AWA,其中所述前导序列不是野生型序列。
34.如权利要求33所述的修饰的前导序列,其中所述序列选自:OmpA-AMA或-AWA;或OmpT-AMA或-AWA;或GAS-AMA或-AWA。
35.如权利要求33或34所定义的修饰的前导序列用于在宿主细胞中表达异源多肽的应用。
36.根据权利要求35所述的应用,其中所述异源多肽包含结构域抗体(dAb),例如结合血清白蛋白的dAb。
37.根据权利要求35或36所述的应用,其中所述异源多肽包含促胰岛素药剂或肠降血糖素药物或由其组成。
38.一种生产下述物质的混合物的方法:(i)促胰岛素药剂或肠降血糖素药物;和(ii)在促胰岛素药剂或肠降血糖素药物的N-端减去2个氨基酸的促胰岛素药剂或肠降血糖素药物,所述方法包括下述步骤:使用前导序列在宿主细胞中表达(i),所述前导序列导致在所述促胰岛素药剂或肠降血糖素药物的1位之前裂解和3位之前裂解。
39.通过如权利要求38所述的方法得到的或可得到的下述物质的混合物:(i)促胰岛素药剂或肠降血糖素药物;和(ii)在促胰岛素药剂或肠降血糖素药物的N-端减去2个氨基酸的促胰岛素药剂或肠降血糖素药物。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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US20120276098A1 (en) * | 2009-09-30 | 2012-11-01 | Bruce Hamilton | Drug fusions and conjugates with extended half life |
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US11644471B2 (en) | 2010-09-30 | 2023-05-09 | Ablynx N.V. | Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains |
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WO2012136790A1 (en) * | 2011-04-07 | 2012-10-11 | Glaxo Group Limited | Compositions comprising fusion proteins or conjugates with an improved half -life |
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CN102949731A (zh) * | 2011-09-16 | 2013-03-06 | 西藏海思科药业集团股份有限公司 | 与glp-2受体特异性结合的药物融合体 |
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CN102875675B (zh) * | 2012-04-26 | 2015-05-27 | 拜明(苏州)生物技术有限公司 | 抗人血清白蛋白单链抗体及其氮端连接多肽药物的方法 |
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CA2897345A1 (en) * | 2013-01-31 | 2014-08-07 | Glaxo Group Limited | Method of producing a protein |
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AR100639A1 (es) * | 2014-05-29 | 2016-10-19 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Composición para tratar diabetes que comprende conjugados de análogos de insulina de acción prolongada y conjugados de péptidos insulinotrópicos de acción prolongada |
AR100695A1 (es) | 2014-05-30 | 2016-10-26 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Composición para el tratamiento de diabetes mellitus que comprende insulina y un agonista dual glp-1 / glucagón |
EP3191521A2 (en) | 2014-09-12 | 2017-07-19 | F. Hoffmann-La Roche AG | Cysteine engineered antibodies and conjugates |
UY36870A (es) | 2015-08-28 | 2017-03-31 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Análogos de insulina novedosos |
JP7158378B2 (ja) | 2016-09-23 | 2022-10-21 | ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド | インスリン受容体との結合力が減少された、インスリンアナログ及びその用途 |
CN107281471A (zh) * | 2017-06-26 | 2017-10-24 | 中国药科大学 | 一种改构的胰高血糖素样肽-1及其修饰物的应用 |
US11752216B2 (en) | 2017-03-23 | 2023-09-12 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | Insulin analog complex with reduced affinity for insulin receptor and use thereof |
TWI809515B (zh) | 2017-12-21 | 2023-07-21 | 美商美國禮來大藥廠 | 腸促胰島素(incretin)類似物及其用途 |
TWI767095B (zh) | 2017-12-21 | 2022-06-11 | 美商美國禮來大藥廠 | 腸促胰島素(incretin)類似物及其用途 |
ES2929416T3 (es) | 2018-06-21 | 2022-11-29 | Novo Nordisk As | Nuevos compuestos para el tratamiento de la obesidad |
CN111234015B (zh) * | 2020-02-12 | 2021-04-06 | 康维众和(中山)生物药业有限公司 | 用于延长药物半衰期的抗体、其融合蛋白和应用 |
WO2021182928A1 (ko) * | 2020-03-12 | 2021-09-16 | 주식회사 에스엘메타젠 | 신규 이중 특이성 단백질 및 그의 용도 |
WO2022015039A1 (ko) * | 2020-07-14 | 2022-01-20 | (주)지아이이노베이션 | 글루카곤-유사 펩타이드-1 및 글루카곤-유사 펩타이드-2를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101128487A (zh) * | 2004-12-02 | 2008-02-20 | 杜门蒂斯有限公司 | 靶向血清白蛋白和glp-1或pyy的双特异性结构域抗体 |
WO2008149143A2 (en) * | 2007-06-06 | 2008-12-11 | Domantis Limited | Methods for selecting protease resistant polypeptides |
Family Cites Families (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ222907A (en) | 1986-12-16 | 1990-08-28 | Novo Industri As | Preparation for intranasal administration containing a phospholipid absorption enhancing system |
DE68927933T2 (de) | 1988-09-02 | 1997-08-14 | Dyax Corp | Herstellung und auswahl von rekombinantproteinen mit verschiedenen bindestellen |
ATE193541T1 (de) | 1989-03-20 | 2000-06-15 | Gen Hospital Corp | Insulinotropes hormon |
DE69129226T2 (de) | 1990-01-24 | 1998-07-30 | Douglas I Buckley | Glp-1-analoga verwendbar in der diabetesbehandlung |
US6172197B1 (en) | 1991-07-10 | 2001-01-09 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
KR100272077B1 (ko) | 1990-08-29 | 2000-11-15 | 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 | 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물 |
DK36492D0 (da) | 1992-03-19 | 1992-03-19 | Novo Nordisk As | Praeparat |
DK0966297T4 (da) | 1996-08-08 | 2013-03-18 | Amylin Pharmaceuticals Llc | Regulering af gastrointestinal motilitet |
ES2283936T3 (es) | 1997-07-07 | 2007-11-01 | Medical Research Council | Procedimiento de clasificacion in vitro. |
NZ502592A (en) | 1997-08-08 | 2002-03-28 | Amylin Pharmaceuticals Inc | Exendin agonist peptides and their use in the treatment of type I and II diabetes |
ES2297902T5 (es) | 1997-11-14 | 2013-07-09 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Compuestos novedosos agonistas de exendina |
MXPA00004670A (es) | 1997-11-14 | 2003-07-14 | Amylin Pharmaceuticals Inc | Compuestos agonistas de exendina novedosos. |
AU759058C (en) | 1998-02-13 | 2005-09-15 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Inotropic and diuretic effects of exendin and GLP-1 |
AU3247799A (en) | 1998-02-27 | 1999-09-15 | Novo Nordisk A/S | Glp-1 derivatives of glp-1 and exendin with protracted profile of action |
IL127127A0 (en) | 1998-11-18 | 1999-09-22 | Peptor Ltd | Small functional units of antibody heavy chain variable regions |
SI1355942T1 (sl) | 2000-12-07 | 2009-02-28 | Lilly Co Eli | Glp-1 fuzijski proteini |
JP5562510B2 (ja) | 2001-06-28 | 2014-07-30 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | 修飾glp−1の安定な処方剤 |
EP1463752A4 (en) | 2001-12-21 | 2005-07-13 | Human Genome Sciences Inc | ALBUMIN FUSION PROTEINS |
CA2471363C (en) | 2001-12-21 | 2014-02-11 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US9321832B2 (en) * | 2002-06-28 | 2016-04-26 | Domantis Limited | Ligand |
CA2513213C (en) | 2003-01-22 | 2013-07-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
WO2005027978A2 (en) | 2003-09-19 | 2005-03-31 | Novo Nordisk A/S | Albumin-binding derivatives of therapeutic peptides |
KR20120133403A (ko) * | 2004-06-01 | 2012-12-10 | 도만티스 리미티드 | 증강된 혈청 반감기를 가지는 이특이성 융합 항체 |
US20060052301A1 (en) | 2004-06-03 | 2006-03-09 | Ronen Shemesh | Splice variants of peptide YY, neuropeptide Y, pancreatic peptide Y and Amylin, and uses thereof |
CA2718480A1 (en) * | 2008-03-31 | 2009-10-08 | Glaxo Group Limited | Drug fusions and conjugates |
EP2398825B1 (en) * | 2009-02-19 | 2017-10-25 | Glaxo Group Limited | Single variable domain against serum albumin |
CA3079184A1 (en) * | 2009-02-19 | 2010-08-26 | Glaxo Group Limited | Improved anti-serum albumin binding variants |
CN104127880A (zh) * | 2009-03-27 | 2014-11-05 | 葛兰素集团有限公司 | 药用融合体和缀合物 |
US20120276098A1 (en) * | 2009-09-30 | 2012-11-01 | Bruce Hamilton | Drug fusions and conjugates with extended half life |
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2013
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101128487A (zh) * | 2004-12-02 | 2008-02-20 | 杜门蒂斯有限公司 | 靶向血清白蛋白和glp-1或pyy的双特异性结构域抗体 |
WO2008149143A2 (en) * | 2007-06-06 | 2008-12-11 | Domantis Limited | Methods for selecting protease resistant polypeptides |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115837014A (zh) * | 2016-05-18 | 2023-03-24 | 摩登纳特斯有限公司 | 编码松弛素的多核苷酸 |
Also Published As
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---|---|---|
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