EA021146B1 - Продукты слияния и конъюгаты лекарственных средств - Google Patents

Продукты слияния и конъюгаты лекарственных средств Download PDF

Info

Publication number
EA021146B1
EA021146B1 EA201190184A EA201190184A EA021146B1 EA 021146 B1 EA021146 B1 EA 021146B1 EA 201190184 A EA201190184 A EA 201190184A EA 201190184 A EA201190184 A EA 201190184A EA 021146 B1 EA021146 B1 EA 021146B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
zeg
rgo
agd
luz
ley
Prior art date
Application number
EA201190184A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201190184A1 (ru
Inventor
Кристофер Херринг
Люси Дж. Хольт
Лорен С. Эспер
Себастьян Майер
Малгожата Пупека-Свидер
Original Assignee
Глаксо Груп Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=42308293&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA021146(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Глаксо Груп Лимитед filed Critical Глаксо Груп Лимитед
Publication of EA201190184A1 publication Critical patent/EA201190184A1/ru
Publication of EA021146B1 publication Critical patent/EA021146B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/12—Antidiuretics, e.g. drugs for diabetes insipidus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к продуктам слияния лекарственных средств, которые имеют улучшенные периоды полувыведения из сыворотки. Эти продукты слияния и конъюгаты содержат полипептиды, единичные вариабельные домены иммуноглобулина (антитела) и молекулы GLP (глюкагоноподобный пептид) и/или эксендина. Изобретение также относится к применениям, препаратам, композициям и устройствам, содержащим такие продукты слияния и конъюгаты лекарственных средств.

Description

Настоящее изобретение относится к продуктам слияниям и конъюгатам лекарственных средств, которые имеют улучшенные периоды полувыведения из сыворотки. Эти продукты слияния и конъюгаты содержат единичные вариабельные домены иммуноглобулина (антитела) и молекулы ОЬР (глюкагоноподобный пептид) и/или эксендина. Изобретение также относится к применениям, препаратам, композициям и устройствам, содержащим такие продукты слияния и конъюгаты лекарственных средств.
Предшествующий уровень техники
Многие лекарственные средства, обладающие активностями, которые могут быть полезны для терапии и/или диагностики, имеют ограниченное значение, поскольку они быстро выводятся из организма при введении. Например, многие полипептиды, которые обладают терапевтически полезными активностями, быстро выводятся из кровотока через почки. Соответственно, для получения желаемого терапевтического эффекта следует вводить большую дозу. Существует потребность в улучшенных терапевтических и диагностических агентах, которые имеют улучшенные фармакокинетические свойства.
Один из таких классов лекарственных средств, которые имеют короткий период полувыведения из организма или системного кровотока, представляет собой инкретиновые гормоны, такие как глюкагоноподобный пептид 1 или пептид ΥΥ, а также эксендин, например эксендин-4.
Глюкагоноподобный пептид (ОЬР)-1 представляет собой инкретиновый гормон с сильными глюкозозависимым инсулинотропным и глюкагоностатическим действиями, трофическими эффектами на βклетки поджелудочной железы и ингибиторными эффектами на желудочно-кишечную секрецию и моторику, которые приводят к снижению концентрации глюкозы в плазме и уменьшению колебаний уровня глюкозы. Кроме того, благодаря его способности усиливать насыщение, ОЬР-1 снижает потребление пищи, ограничивая таким образом увеличение массы тела, и может даже вызывать потерю массы. Взятые вместе, эти действия дают уникальный профиль ОЬР-1, который считается весьма желательным для антидиабетического агента, в частности, поскольку зависимость его антигипергликемических эффектов от глюкозы должна минимизировать риск развития тяжелой гипогликемии. Однако его фармакокинетический/фармакодинамический профиль является таким, что нативный ОЬР-1 не является терапевтически полезным. Таким образом, хотя ОЬР-1 является наиболее эффективным при постоянном введении, однократные подкожные инъекции оказывают кратковременные эффекты. ОЬР-1 является очень чувствительным к ферментативной деградации ίη νίνο, и расщепление дипептидилпептидазой IV (ЭРР-1У) является возможно наиболее подходящим, поскольку это происходит быстро и приводит к образованию неинсулинотропного метаболита. Поэтому стратегии использования терапевтического потенциала ОЬР-1, основанные на понимании факторов, влияющих на его метаболическую стабильность и фармакокинетический/фармакодинамический профиль, были в центре интенсивных исследований.
Была проделана большая работа с целью ингибирования пептидазы или модификации ОЬР-1 таким образом, чтобы замедлить его деградацию при сохранении биологической активности. В АО 05/027978 описаны производные ОЬР-1, имеющие пролонгированный профиль действия. В АО 02/46227 описаны гетерологичные слитые белки, содержащие полипептид (например, альбумин), слитый с ОЬР-1 или аналогами (описание этих аналогов включено в данную заявку посредством ссылки в виде примеров аналогов ОЬР-1, которые можно использовать в настоящем изобретении). В АО 05/003296, АО 03/060071, АО 03/059934 описан амино-слитый белок, где ОЬР-1 был подвергнут слиянию с альбумином с целью увеличения периода полувыведения гормона.
Однако, несмотря на эти усилия, активный ОЬР-1 длительного действия не был получен.
Фактически, особенно в области диабета и ожирения, имеется огромная потребность в улучшенных пептидах ОЬР-1 или других агентах, таких как эксендин-4 или РΥΥ, которые сходным образом оказывают инсулинотропный эффект, пригодный, в частности, для лечения диабета и ожирения. Таким образом, существует потребность в модификации ОЬР-1, эксендина-4 и других инсулинотропных пептидов для обеспечения более длительного действия ίη νίνο, при сохранении их низкой токсичности и терапевтических преимуществ.
Краткое изложение сущности изобретения
В настоящем изобретении предложена композиция, которая представляет собой продукт слияния или конъюгат и которая содержит или состоит из (а) инсулинотропного агента или молекулы, или инкретинового лекарственного средства или молекулы, которые могут представлять собой, например, эксендин-4, РΥΥ, например 3-26 РΥΥ, или ОЬР-1, например мутант ОЬР-1 (7-37) А8О, присутствующего в виде продукта слияния или конъюгата с (б) бАЬ. которое специфически связывается с сывороточным альбумином (А1ЬибАЬ ТМ), выбранным из (1) доменного антитела (бАЬ) ЭОМ7Н-14 (аминокислотная последовательность ЭОМ7Н-14 представлена на фиг. 1(й): БЕЦ ГО ЫО: 8), (2) доменного антитела (бАЬ) ЭОМ7Н-14-10 (аминокислотная последовательность ЭОМ7Й-14-10 представлена на фиг. 1(ο): БЕЦ ГО ЫО: 26) или бАЬ, которое имеет вплоть до 4 аминокислотных различий от последовательности бАЬ ЭОМ7Й-14-10; и (3) бАЬ ЭОМ7Й-11-15 (аминокислотная последовательность ЭОМ7Й-11-15 представлена на фиг. 1(р): БЕЦ ГО ЫО: 27) или (4) доменного антитела (бАЬ) ЭОМ7Н-14-10 К108С (аминокислотная последовательность ЭОМ7Н-14-10 представлена на фиг. 1(г)).
Аминокислотный или химический линкер также возможно может присутствовать, соединяя инсулинотропный агент или инкретиновое лекарственное средство, например эксендин-4 и/или ОЬР-1, или
- 1 021146
ΡΥΥ с ЙЛЬ. например с Ό0Μ7Η-14 ЙЛЬ. Ό0Μ7Η-14-10 йЛЬ. Ό0Μ7Η-11-15 йЛЬ. Линкер может представлять собой, например, спиральный линкер, например спиральный линкер с последовательностью, представленной на фиг. 1(к): 8ЕЦ ГО N0: 11, или он может представлять собой §1у-8ет линкер, например, с аминокислотной последовательностью, представленной на фиг. 1(1): 8ЕЦ ГО N0: 12.
В некоторых воплощениях продукты слияния (или конъюгаты) по изобретению могут содержать дополнительные молекулы, например дополнительные пептиды или полипептиды.
Инсулинотропный агент или инкретиновое лекарственное средство (например, эксендин и/или ОЬР-1) может присутствовать в виде продукта слияния (или конъюгата) либо с Ν-концом, либо с Сконцом ЙЛЬ.
В некоторых воплощениях в изобретении предложен полипептид, содержащий или состоящий из слитой молекулы, которая выбрана из следующего:
(а) продукт слияния 2 х (0ЬР)-1 (7-37) Л80 Ό0Μ7Η-14 йЛЬ (ΌΆΤ0114, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(а): 8ЕЦ ГО N0: 1), (б) продукт слияния эксендина-4 (048 линкер)3 Ό0Μ7Η-14 йЛЬ (ΌΆΤ0115, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(Ь): 8ЕЦ ГО N0: 2), (в) продукт слияния эксендин-4 - Ό0Μ7Η-14 йЛЬ (ΌΆΤ0116, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(с): 8ЕЦ ГО N0: 3), (г) продукт слияния эксендина-4, спирального линкера, Ό0Μ7Η-14 йЛЬ (ΌΆΤ0117, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(й): 8ЕЦ ГО N0: 4), (д) продукт слияния 0ЬР-1 (7-37) А80 (048 линкер)3 Ό0Μ7Η-14 йЛЬ (ΌΆΤ0118, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(е): 8ЕЦ ГО N0: 5), (е) продукт слияния 0ЬР-1 (7-37) А80 Ό0Μ7Η-14 йАЬ (ΌΆΤ0119, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(1): 8ЕЦ ГО N0: 6), (ж) продукт слияния 0ЬР-1 (7-37) Ά80, спирального линкера, Ό0Μ7Η-14 йАЬ (ΌΆΤ0120, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(д): 8ЕЦ ГО N0: 7), (з) продукт слияния эксендина-4, (048)3 линкера, Ό0Μ71ι-14-10 (ΌΜ87139, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(т): 8ЕЦ ГО N0: 24), (и) продукт слияния эксендина-4, (048)3 линкера, Ό0Μ7Η-11-15 (ΌΜ87143, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(п): 8ЕЦ ГО N0: 25).
В изобретении также предложены молекулы конъюгата, содержащие или состоящие из аминокислотных последовательностей молекул, описанных выше, т.е. молекул с аминокислотными последовательностями, представленными 8ЕЦ ГО N0: 1-7 и 8ЕЦ ГО N0: 24-25.
В некоторых воплощениях в изобретении предложен полипептид, содержащий или состоящий из молекулы конъюгата, которая представляет собой Ό0Μ71ι-14-10 (Р108С) А1ЬийАЬ, конъюгированное с амидированным по С-концу ΡΥΥ3-36 посредством лизина (введенного в положение 10 ΡΥΥ) и линкера из 4 повторов ПЭГ (полиэтиленгликоль). Аминокислотная последовательность и структура этого пептидного конъюгата представлена на фиг. 14.
В изобретении также предложен полипептид, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности продукта слияния эксендина-4, (048)3 линкера, Ό0Μ71ι-14-10 (ΌΜ87139, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(т): 8ЕЦ ГО N0: 24), или молекулы продукта слияния или конъюгата, которая имеет вплоть до 4 аминокислотных изменений из аминокислотной последовательности ΌΜ87139, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(т).
Ό0Μ7Η-14 представляет собой единичный вариабельный домен иммуноглобулина человека или ЙАЬ (Ук), которые связываются с сывороточным альбумином, и его аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(й): 8ЕЦ ГО N0: 8. СЭР-области Ό0Μ7Η-14 йАЬ подчеркнуты в аминокислотной последовательности, представленной на фиг. 1(й): 8ЕЦ ГО N0: 8.
Ό0Μ71ι-14-10 представляет собой единичный вариабельный домен иммуноглобулина человека или ЙАЬ, которые связываются с сывороточным альбумином, и его аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(о): 8ЕЦ ГО N0: 26. СЭР-области Ό0Μ7Η-14-10 йАЬ подчеркнуты в аминокислотной последовательности, представленной на фиг. 1(о): 8ЕЦ ГО N0: 26.
Ό0Μ7Η-11-15 представляет собой единичный вариабельный домен иммуноглобулина человека или ЙАЬ, которые связываются с сывороточным альбумином, и его аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(р): 8ЕЦ ГО N0: 27. СЭР-области Ό0Μ7Η-11-15 йАЬ подчеркнуты в аминокислотной последовательности, представленной на фиг. 1(р): 8ЕЦ ГО N0: 27.
Как использовано в данной заявке, продукт слияния относится к слитому белку, который содержит Ό0Μ7Η-14 йАЬ, или Ό0Μ7Η-14-10 йАЬ, или Ό0Μ7Η-11-15 йАЬ, которое связывает сывороточный альбумин, в качестве первой группировки и инсулинотропный агент или инкретиновое лекарственное средство в качестве второй группировки. ЙАЬ, которое связывает сывороточный альбумин, и лекарственное средство или агент присутствуют в виде отдельных частей (группировок) единичной непрерывной полипептидной цепи. Первая (ЙАЬ) и вторая (инкретиновое лекарственное средство или инсулинотропный агент) группировки могут быть непосредственно связаны друг с другом посредством пептидной связи или связаны через подходящую аминокислоту, или пептидный или полипептидный линкер. Дополни- 2 021146 тельные группировки, например пептиды или полипептиды (например, третья, четвертая) и/или линкерные последовательности, могут быть представлены, при необходимости. Первая группировка может иметь Ы-концевую, С-концевую или внутреннюю локализацию относительно второй группировки. В некоторых воплощениях слитый белок содержит одну или более чем одну (например, от одной до примерно 20) бАЬ группировок.
Как использовано в данной заявке, конъюгат относится к композиции, содержащей бАЬ. которое связывает сывороточный альбумин, с которым инсулинотропный агент или инкретиновое лекарственное средство, например ОЬР-1, эксендин-4, ΡΥΥ, например ΡΥΥ 3-36, связаны ковалентно или нековалентно. Инсулинотропный агент или инкретиновое лекарственное средство могут быть ковалентно связаны с бАЬ прямо или опосредованно посредством подходящей линкерной группировки, например, ПЭГ линкерной группировки. Лекарственное средство или агент могут быть связаны с бАЬ в любом подходящем положении, таком как аминоконец, карбоксильный конец или подходящие аминокислотные боковые цепи (например, ε-аминогруппа лизина или тиольная группа цистеина). Альтернативно, лекарственное средство или агент могут быть нековалентно связаны с бАЬ прямо (например, электростатическое взаимодействие, гидрофобное взаимодействие) или опосредованно (например, посредством нековалентного связывания комплементарных партнеров по связыванию (например, биотина и авидина), где один партнер ковалентно связан с лекарственным средством или агентом, и комплементарный партнер по связыванию ковалентно связан с бАЬ).
В изобретении также предложен (по существу) чистый мономер любого из конъюгатов или продуктов слияния по изобретению, например, ΌΑΤ0114, ΌΑΤ0115, ΌΑΤ0116, ΌΑΤ0117, ΌΑΤ0118, ΌΑΤ0119 и ΌΑΤ120, ΌΜ87139, или ΌΜ87143, или ΌΜ87143. В одном воплощении он представляет собой по меньшей мере 98, 99, 99,5 или 100% чистого мономера.
В изобретении также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие продукты слияния, описанные в данной заявке, например, нуклеиновые кислоты, кодирующие ΌΑΤ0114, ΌΑΤ0115, ΌΑΤ0116, ΌΑΤ0117, ΌΑΤ0118, ΌΑΤ0119 и ΌΑΤ120, ΌΜ87139 или ΌΜ87143, и, например, где последовательности нуклеиновых кислот представлены на фиг. 2 (8ЕО ГО N0: 13-32). Предложены также клетки-хозяева, которые содержат эти нуклеиновые кислоты.
В изобретении также предложены аминокислоты, кодирующие 6АЬ§, которые связываются с сывороточным альбумином (А1ЬибАЬ§ ΤΜ), выбранные из Ω0Μ7Η-14 (8Е0 ГО N0: 8), Ω0Μ7Η-14-10 (8Е0 ГО N0: 26), Ό0Μ7711-15 (8ЕО ΙΌ N0: 27) и Ό0Μ7714-10Κ1080 (8ЕО ΙΌ N0: 42).
В изобретении также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие 6АЬ§, которые связываются с сывороточным альбумином, выбранные из Ω0Μ71ι-14 (8Е0 ΙΌ N0: 23), Ω0Μ7Η-14-10 (8Е0 ΙΌ N0: 31), Ό0Μ7711-15 (8ЕО ΙΌ N0: 32) и Ό0Μ7714-10Κ1080 (8ЕО ΙΌ N0: 44).
В изобретении также предложен способ получения продукта слияния по настоящему изобретению, включающий поддержание клетки-хозяина, которая содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту и/или конструкцию, которая кодирует продукт слияния по изобретению в условиях, подходящих для экспрессии упомянутой рекомбинантной нуклеиновой кислоты, посредством чего продуцируется продукт слияния.
В изобретении также предложены композиции (например, фармацевтические композиции), содержащие продукт слияния или конъюгат по изобретению.
В изобретении также предложен способ лечения индивидуума, имеющего заболевание или расстройство, такое как описано в данной заявке, например, метаболическое заболевание, такое как гипергликемия, нарушенная толерантность к глюкозе, дефицит бета-клеток, диабет (например, диабет 1 типа или 2 типа или гестационный диабет) или ожирение, или заболевания, характеризующиеся перееданием, например, его можно использовать для подавления аппетита, например, в случае синдрома ПрадераВилли, и который включает введение упомянутому индивидууму терапевтически эффективного количества продукта слияния или конъюгата по изобретению.
Другие метаболические расстройства включают, но не ограничиваются этим, инсулинорезистентность, дефицит инсулина, гиперинсулинемию, гипергликемию, дислипидемию, гиперлипидемию, гиперкетонемию, гипертензию, болезнь коронарных артерий, атерослероз, почечную недостаточность, невропатию (например, автономную невропатию, парасимпатическую невропатию и полиневропатию), ретинопатию, катаракту, метаболические расстройства (например, расстройства метаболизма инсулина и/или глюкозы), эндокринные расстройства, ожирение, потерю массы, расстройства печени (например, заболевание печени, цирроз печени и расстройства, ассоциированные с трансплантацией печени), и состояния, ассоциированные с этими заболеваниями или расстройствами.
Кроме того, состояния, ассоциированные с диабетом, которые можно предупредить или лечить соединениями по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются этим, гипергликемию, ожирение, диабетическую ретинопатию, мононевропатию, полиневропатию, атерослероз, язвы, болезни сердца, инсульт, анемию, гангрену (например, на ногах и руках), импотенцию, инфекцию, катаракту, плохую функцию почек, неправильное функционирование вегетативной нервной системы, нарушенную функцию лейкоцитов, туннельный синдром запястья, контрактуру Дюпюитрена и диабетический кетоацитоз.
- 3 021146
В изобретении также предложены способы лечения или предупреждения заболеваний, ассоциированных с повышенным уровнем глюкозы в крови, включающие введение по меньшей мере одной дозы конъюгатов или продуктов слияния и/или фармацевтических композиций по настоящему изобретению пациенту или субъекту.
Изобретение также относится к способам регулирования восприимчивости к инсулину у пациента, а также способам увеличения поглощения глюкозы клеткой и способам регулирования чувствительности клетки к инсулину, с использованием конъюгатов или продуктов слияния по изобретению.
Кроме того, предложены способы стимулирования синтеза и высвобождения инсулина, повышения чувствительности жировой, мышечной или печеночной ткани к поглощению инсулина, стимулирования поглощения глюкозы, замедления процесса пищеварения или блокирования секреции глюкагона у пациента, включающие введение указанному пациенту продукта слияния или конъюгата по изобретению, например, включающие введение по меньшей мере одной дозы конъюгата или продукта слияния лекарственных средств и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению.
Продукты слияния или конъюгаты и/или фармацевтические композиции по изобретению можно вводить отдельно или в комбинации с другими молекулами или группировками, например полипептидами, терапевтическими белками и/или молекулами (например, инсулином и/или другими белками (включая антитела), пептидами или небольшими молекулами, которые регулируют чувствительность к инсулину, массу, болезнь сердца, гипертензию, невропатию, клеточный метаболизм и/или уровни глюкозы, инсулина или других гормонов у пациента). В конкретных воплощениях конъюгаты или продукты слияния по изобретению вводят в комбинации с инсулином (или производным, аналогом, слитым белком или средством, усиливающим секрецию инсулина).
В изобретении также предложено применение конъюгата или продукта слияния по изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства, такого как любое из вышеупомянутых, например, метаболическое расстройство, такое как гипергликемия, диабет (1 или 2 типа или гестационный диабет) или ожирение.
Изобретение также относится к применению продукта слияния или конъюгата, как описано в данной заявке, для применения в терапии, диагностике или профилактике.
Продукты слияния или конъюгаты по изобретению, например, ЙАЬ компонент продукта слияния может быть дополнительно сформатирован для получения большего гидродинамического размера для последующего увеличения периода полувыведения, например, путем присоединения группы ПЭГ, сывороточного альбумина, трансферрина, рецептора трансферрина или, по меньшей мере, его трансферринсвязывающей части, Ре-области антитела или путем конъюгирования с доменом антитела. Например, ЙЛЬ, которое связывает сывороточный альбумин, может быть сформатировано в виде более крупного антиген-связывающего фрагмента антитела (например, сформатировано в виде РаЬ, РаЬ', Р(аЬ)2, Р(аЬ')2, 1дО, 8еРу).
В других воплощениях изобретения, описанных в данном описании, вместо применения ЙЛЬ в продукте слияния по изобретению предполагается, что специалист может использовать домен, который содержит СЭКб из ЙЛЬ, например, СЭКб из ΌΘΜ71ι-14. ΌΘΜ7Η-14-10 или ΌΘΜ7Ρ-11-15, которое связывает сывороточный альбумин (например, СЭКб, перенесенные на подходящий белковый каркас или скелет, например, аффитело, 8рЛ каркас, домен рецептора БЭБ класса А или домен БОР). Описание в целом следует истолковывать соответствующим образом для того, чтобы обеспечить описание таких доменов вместо ЙАЬ.
В некоторых воплощениях в изобретении предложен продукт слияния или конъюгат согласно изобретению, которые содержат инсулинотропный агент или инкретиновое лекарственное средство и лиганд с двойной специфичностью или полиспецифический лиганд, который содержит первое ЙАЬ согласно изобретению, которое связывает сывороточный альбумин, например, ΌΘΜ7Ρ-14, ΌΘΜ7Η-14-10 или ΌΘΜ7Ρ-11-15, и второе ЙАЬ, которое имеет такую же или другую специфичность связывания по сравнению с первым ЙАЬ и возможно, в случае полиспецифических лигандов, дополнительные ЙАЬ§. Второе ЙАЬ (или дополнительные ЙАЬ§) возможно могут связывать другую мишень, например, РдРг 1с или СЭ5 мишень.
Таким образом, в одном аспекте в изобретении предложены продукты слияния или конъюгаты по изобретению для доставки посредством парентерального введения, например, посредством подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции, ингаляции, интраназальной доставки, трансмукозальной доставки, пероральной доставки, доставки в ЖК (желудочно-кишечный) тракт пациента, ректальной доставки или доставки в глаза. В одном аспекте в изобретении предложено применение продуктов слияния или конъюгатов по изобретению в изготовлении лекарственного средства для доставки посредством подкожной инъекции, ингаляции, внутривенной доставки, интраназальной доставки, трансмукозальной доставки, пероральной доставки, доставки в ЖК тракт пациента, ректальной доставки или доставки в глаза.
В одном аспекте в изобретении предложен способ доставки пациенту посредством подкожной инъекции, доставки в легкие, внутривенной доставки, интраназальной доставки, трансмукозальной доставки, пероральной доставки, доставки в желудочно-кишечный тракт пациента, ректальной доставки или доставки в глаза, включающий введение пациенту фармацевтически эффективного количества продукта
- 4 021146 слияния или конъюгата по изобретению.
В одном аспекте в изобретении предложен препарат для пероральной доставки, доставки посредством инъекции, ингаляции, небулайзера или доставки в глаза, содержащий продукт слияния или конъюгат по изобретению. Препарат может представлять собой таблетку, пилюлю, капсулу, жидкость или сироп. В одном аспекте композиции можно вводить перорально, например, в виде напитка, например, продаваемого в виде напитка для снижения массы тела для лечения ожирения. В одном аспекте в изобретении предложен препарат для ректальной доставки пациенту, который может быть предложен, например, в виде суппозитория.
Композиция для парентерального введения СЬР-1 соединений может быть приготовлена, например, как описано в \О 03/002136 (включенной в данную заявку посредством ссылки).
Композиция для интраназального введения некоторых пептидов может быть приготовлена, например, как описано в Европейском патенте № 272097 (на имя Νονο ΝοΓάίδΚ А/δ) или в \О 93/18785 (все включено в данную заявку посредством ссылки).
Термин субъект или индивидуум определен в данной заявке как включющий животных, таких как млекопитающие, включая, но не ограничиваясь этим, приматов (например, людей), коров, овец, коз, лошадей, собак, кошек, кроликов, морских свинок, крыс, мышей или других видов крупного рогатого скота, овец, лошадей, собак, кошек, грызунов или мышей.
В изобретении также предложен набор для применения при введении композиций согласно изобретению (например, конъюгатов или продуктов слияния по изобретению) субъекту (например, пациенту), содержащий композицию (например, конъюгат или продукт слияния по изобретению), устройство для доставки лекарственного средства и возможно инструкции по применению. Композиция (например, конъюгат или продукт слияния) может быть предложена в виде препарата, такого как лиофилизированный препарат. В некоторых воплощениях устройство для доставки лекарственного средства выбрано из группы, состоящей из шприца, ингалятора, устройства для интраназального введения или введения в глаза (например, генератора тумана, капельницы для глаз или носа) и устройства для безыгольной инъекции.
Композиции (например, конъюгаты или слияния) по данному изобретению могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящем носителе перед применением. Может быть использован любой подходящий способ лиофилизации (например, сушка распылением, сушка до твердого остатка (саке бтушд)) и/или методы восстановления. Специалистам в данной области понятно, что лиофилизация и восстановление могут приводить к различным степеням потери активности антител и что уровни применения могут быть скорректированы для компенсации. В конкретном воплощении в изобретении предложена композиция, содержащая лиофилизированную (высушенную замораживанием) композицию (например, конъюгат лекарственного средства, продукт слияния лекарственного средства), как описано в данной заявке. Предпочтительно лиофилизированная (высушенная замораживанием) композиция (например, конъюгат лекарственного средства, продукт слияния лекарственного средства) теряет не более чем примерно 20%, или не более чем примерно 25%, или не более чем примерно 30%, или не более чем примерно 35%, или не более чем примерно 40%, или не более чем примерно 45%, или не более чем примерно 50% своей активности (например, связывающей активности в отношении сывороточного альбумина) при регидратации. Активность представляет собой количество композиции (например, конъюгата лекарственного средства, слияния лекарственного средства), необходимое для получения эффекта композиции перед тем, как она была лиофилизирована. Например, количество конъюгата или продукта слияния, необходимое для достижения и поддержания желаемой концентрации в сыворотке в течение желаемого периода времени. Активность композиции (например, конъюгата лекарственного средства, продукта слияния лекарственного средства) можно определить с использованием любого подходящего способа до лиофилизации, и активность можно определить с использованием того же способа после регидратации для определения потерянной активности.
В изобретении также предложены композиции с замедленным высвобождением, содержащие продукты слияния или конъюгаты по изобретению, где композиции с замедленным высвобождением могут содержать продукт слияния или конъюгат по изобретению в комбинации, например, с гиалуроновой кислотой, микросферами или липосомами и другими фармацевтически или фармакологически приемлемыми носителями, эксципиентами и/или разбавителями. Такие композиции с замедленным высвобождением могут находиться в форме, например, суппозиториев.
В одном аспекте в изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая продукт слияния или конъюгат по изобретению и фармацевтически или физиологически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.
В изобретении также предложена модифицированная лидерная последовательность, которая имеет на своем С-конце аминокислотную последовательность АМА или А\А, где лидерная последовательность не является последовательностью дикого типа. Модифицированная лидерная последовательность может представлять собой ОтрА-АМА или -А\А; или ОтрТ-АМА или-А\А; или СА8-АМА или А\А.
Модифицированная лидерная последовательность может быть использована для экспрессии гете- 5 021146 рологичного полипептида в клетке-хозяине. Гетерологичный полипептид может содержать или состоять из инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства. Гетерологичный полипептид может содержать или состоять из доменного антитела (6АЬ), например 6АЬ, которое связывает сывороточный альбумин.
Гетерологичный полипептид для экспрессии с помощью модифицированной лидерной последовательности может представлять продукт слияния или конъюгат, содержащий или состоящий из (а) инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства, присутствующего в виде продукта слияния или конъюгата с (б) 6АЬ, например 6АЬ, которое связывает сывороточный альбумин, например 6АЬ, выбранным из Ук доменного антитела (6АЬ) БОМ7Й-14, которое связывает сывороточный альбумин и которое имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 1(й) (8ЕО ГО N0: 8), БОМ7Й-14-10 6АЬ, которое имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 1(о) (8Е0 ГО N0: 26), и БОМ7Н-11-15 6АЬ, которое имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 1(р) (8Е0 ГО N0: 27).
Модифицированная лидерная последовательность также может быть использована для экспрессии гетерологичного полипептида, который содержит или состоит из продукта слияния, выбранного из следующего:
(а) продукт слияния 2 х (0ЬР)-1 (7-37) А80 БОМ7Н-14 6АЬ (БАТ0114, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(а): 8Е0 ГО N0: 1), (б) продукт слияния эксендина-4 (048 линкер)3 БОМ7Н-14 6АЬ (БАТ0115, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(Ь): 8Е0 ГО N0: 2), (в) продукт слияния эксендина-4 - БОМ7Н-14 6АЬ (БАТ0116, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(с): 8Е0 ГО N0: 3), (г) продукт слияния эксендина-4, спирального линкера, БОМ7Н-14 6АЬ (БАТ0117, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(6): 8Е0 ГО N0: 4), (д) продукт слияния 0ЬР-1 (7-37) А80 (048 линкер)3 БОМ7Н-14 6АЬ (БАТ0118, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(е): 8Е0 ГО N0: 5), (е) продукт слияния 0ЬР-1 (7-37) А80 БОМ7Н-14 6АЬ (БАТ0119, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(ί): 8Е0 ΙΌ N0: 6), (ж) продукт слияния 0ЬР-1 (7-37) А80, спирального линкера, БОМ7Н-14 6АЬ (БАТ0120, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(д): 8Е0 ГО N0: 7), (з) продукт слияния эксендина-4, (048)3 линкера, БОМ7Й-14-10 (БМ87139, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(т): 8Е0 ГО N0: 24), (и) продукт слияния эксендина-4, (048)3 линкера, БОМ7Н-11-15 (БМ87143, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(п): 8Е0 ГО N0: 25).
Гетерологичный полипептид, подлежащий экспрессии с помощью модифицированной лидерной последовательности, также может содержать или состоять из молекул конъюгата с аминокислотными последовательностями, описанными выше, т.е. с аминокислотными последовательностями, представленными 8ЕС ГО 1-7 и 8ЕС ГО 24-25.
Гетерологичный полипептид, подлежащий экспрессии с помощью модифицированной лидерной последовательности, также может содержать или состоять из аминокислотной последовательности продукта слияния эксендина-4, (048)3 линкера, БОМ7Н-14-10 (БМ87139, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(т): 8Е0 ГО N0: 24), или молекулы продукта слияния или конъюгата, которая имеет вплоть до 4 изменений аминокислот в аминокислотной последовательности БМ87139, аминокислотная последовательность представлена на фиг. 1(т).
Клетка-хозяин для экспрессии может представлять собой микробную клетку-хозяина, прокариотическую клетку-хозяина, грамотрицательную бактериальную клетку-хозяина или Е. сой клетку-хозяина.
Также предложен способ получения смеси (1) инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства; и (2) инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства без 2 аминокислот на Ν-конце инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства; включающий стадию экспрессирования (1) в клетке-хозяине с использованием лидерной последовательности, которая приводит к расщеплению перед положением 1 и расщеплению перед положением 3 инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства. Инсулинотропный агент или инкретиновое лекарственное средство может находиться в форме продукта слияния или конъюгата, например, с 6АЬ, которое связывает сывороточный альбумин, как определено выше. В изобретении также предложены смеси, полученные или получаемые способом, описанным выше.
Лидерная последовательность может представлять собой отрА, отрТ, 0А8 или любую из модифицированных последовательностей, описанных выше. Способ может включать стадию продуцирования смеси в клетке-хозяине посредством гетерологичной экспрессии. Клетка-хозяин может представлять собой микробную клетку-хозяина, прокариотическую клетку-хозяина, грамотрицательную бактериальную клетку-хозяина или клетку-хозяина Е. сой.
Инсулинотропные агенты и инкретиновые лекарственные средства, такие как 0ЬР-1, имеют широкий спектр терапевтических эффектов, которые могут опосредоваться через СЙР-1Р (такие как эффекты,
- 6 021146 стимулирующие глюкозозависимую секрецию инсулина из поджелудочной железы). Также предположили, что имеется класс эффектов, которые могут опосредоваться продуктом расщепления ИРР1У, ОЬР-1 936амидом (или ОЬР-1 9-37). ОЬР-1 9-37 не является активным при стимуляции глюкозочувствительной секреции инсулина из поджелудочной железы, но, по-видимому, оказывает другие биологические эффекты, возможно, посредством механизма, не связанного с ОЬР-1К. Поскольку на сегодняшний день большинство клинических применений молекул класса ОЬР-1 нацелены на диабет, через ОЕР-1К поджелудочной железы, устойчивость к ПРР1У была разработана в пептидах, либо с использованием нечеловеческого аналога ОЬР-1, такого как эксендин-4, либо посредством мутирования аминокислот 8 или 9 в ОЬР-1, таких как использованы в А1Ыд1иЬ6е (8упспа). или посредством химических или синтетических модификаций на аминоконце пептида. Дополнительный подход заключался в глобальной блокаде активности ПРР1У с использованием низкомолекулярных ингибиторов ПРР1У, таких как вилдаглиптин (Оа1уик) и ситаглиптин (1аииу1а), которая пролонгирует период полувыведения любого эндогенного секретируемого ОЬР-1. Оба этих подхода эффективно уменьшают уровень ПРР1У метаболита ОЬР-1 9-36амида или ОЬР-1 9-37.
Однако предположили, что ПРР1У метаболит ОЬР-1 9-36амид или ОЬР-1 9-37 оказывают желательный биологический эффект. Несколько исследований показали, что продукт расщепления ПРР1У ОЬР-1 7-36 амид, а именно ОЬР-1 9-36амид, который быстро образуется после секреции ОЬР-1 7-36 и является более обильным в нормальных условиях, чем ОЬР-1 7-37, может оказывать биологический эффект. Для этого механизма было предложено несколько различных путей действия, как указано ниже. ОЬР-1(9-37) представляет собой антагонист ОЬР-1К (см., например, Еиг 1 РЬагтасо1. 1996 Иес 30; 318(23):429-35).
Глюкагоноподобный пептид-1-(9-36) амид является основным метаболитом глюкагоноподобного пептида-1-(7-36) амида после введения ίη νίνο собакам и действует в качестве антагониста на панкреатический рецептор (Кпибкеп Ь.В., Рпба1 Ь. 1 ΒίοΙ СЬет. 1997 Аид 22; 272(34): 21201-6) и высокоактивные антагонисты панкреатического рецептора глюкагоноподобного пептида-1 (Моп1гоке-КаП/абеЬ С., Уапд Н., Кобдегк Β.Ό., Вебау А., РгЪсЬейе Ь.А., Епд 1. 1 Вю1 СЬет. 1997 Аид 22; 272 (34):21201-6).
ОЬР-1 (9-37) передает сигнал посредством другого механизма на ОЬР-1 (7-37), посредством инсулиннезависимого механизма (Ат 1 РЬукю1 Епбосгто1 Ме1аЬ. 2002 Арг; 2, 82(4):Е873-9). ОЬР-1-(9-36) амид уменьшает уровень глюкозы в крови у анестезированных свиней посредством механизма, который не вовлекает секрецию инсулина (Пеасоп С.Р., Р1атЬоеск А., Мо11ег 8., НоМ Ы).
Или посредством увеличения чувствительности к инсулину у лиц, страдающих ожирением (ОЬекЬу (8Дуег 8рг1пд). 2008 1и1; 16(7):1501-9. ЕриЬ 2008 Арг 17).
ОЬР-1 (9-36) амид, продукт расщепления ОЬР-1 (7-36) амида, является глюкорегуляторным пептидом (Е1аЬ1 Ό., Едап ТМ., 8Ьаппоп КР., МепеЫу О.8., КЬаЬт А., НаЬепег ТР., Апбегкеп И.К.).
Эта активность не была показана для типов эксендина без двух аминокислот, поскольку они не образовывались в результате ЭРР1У расщепления, но возможно, что это также может быть в случае разновидностей эксендина-4 без двух аминокислот. Также было показано, что эксендин-4 действует через ОЬР-1 К-зависимый и независимый пути в контексте сердечных и других эффектов (Слгси1аОоп. 2008; 117:2340-2350: СагЫоргоЮсйуе апб УакобПаЮгу АсОопк о! О1исадоп-Пке Рер11бе 1 КесерЮг Аге МеФа1еб ТЬгоидЬ Во1Ь О1исадоп-Ь1ке Рер11бе 1 КесерЮг-ЭерепбеЩ апб тберепбегИ РаФгаук Кл\\оп Вап, М8с; М. Ноккеш Ыоуап-АкЬгаГ, РЬИ; ίιι6ίΦ НоеГег, МИ; 81еГГеп-8еЬакОап Вок, МИ, РЬЭ; Иате1 1. Игискег, МИ; Мапкоог Никат, МИ). Это повышает вероятность того, что действительно могут быть сходные и параллельные активности как для полноразмерного эксендина, так и для форм эксендина без двух аминокислот.
По меньшей мере, имеются два пути продуцирования смесей инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства и вариантов без двух аминокислот. Например, возможно раздельное продуцирование полноразмерного ОЬР-1 7-36амида (в желательном формате с пролонгированным периодом полувыведения, таком как А1ЬибАЬ) и ОЬР-1 9-36амид (или желательный слитый белок). Затем они могут быть смешаны с получением продукта с желательным соотношением молекул ОЬР-1 7-36 и ОЬР-1 9-36. Для получения смеси лекарственных средств можно использовать два параллельных ОМР процесса.
Альтернативный способ заключается в выборе сигнала секреции, для которого сигнальный пептидазный фермент, ответственный за удаление сигнальной последовательности, имеет не один сайт расщепления, а скорее два сайта расщепления. Их разрезают в соотношении, определяемом используемым сигналом секреции. Таким образом, в зависимости от выбранного сигнала секреции полученное соотношение может представлять собой 100% расщепление перед положением 1 с получением ОЬР-1 7-36 (или полноразмерной молекулы другого инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства); или 100% расщепление перед положением 3 с получением ОЬР-1 9-36 (или аминокислотной последовательности другого инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства минус две аминокислоты); или любой % от 0 до 100 для каждого полноразмерного варианта или вариантов минус две аминокислоты.
Например, соотношение может представлять собой
90% полноразмерный:10% минус 2 аминокислоты;
- 7 021146
80% полноразмерный:20% минус 2 аминокислоты;
75% полноразмерный:25% минус 2 аминокислоты;
50% полноразмерный:50% минус 2 аминокислоты;
25% полноразмерный:75% минус 2 аминокислоты;
20% полноразмерный:80% минус 2 аминокислоты; или
10% полноразмерный:90% минус 2 аминокислоты.
Выбор подходящей лидерной последовательности для получения желательного соотношения позволит продуцировать из одной клетки-хозяина. Это является ключевым преимуществом с точки зрения ОМР процесса. Это позволяет эксплуатировать потенциальные терапевтические эффекты обеих форм при сохранении устойчивости к эндогенным ферментам.
Целый ряд других эндогенных пептидов и аналогов также подвергаются обработке аминоконцевыми дипептидазами, давая первоначальную полноразмерную молекулу и/или чувствительную к дипептидазе форму. Таким образом, этот подход может быть полезен для продукции любых пептидов и белка, где один раунд получения может давать определенную смесь двух форм, отличающихся в длину на несколько аминокислот, где различные аминокислоты содержат часть сайта распознавания для сигнальной пептидазы. Применение этого процесса возможно в клетках-хозяевах млекопитающих, эукариотических или прокариотических клетках-хозяевах, например в Е. сой.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 представляет иллюстрацию аминокислотных последовательностей (а) ΌΑΤ0114 (8ЕЦ ГО N0: 1), (Ь) ΌΆΤ0115 (8ЕЦ ГО N0: 2), (с) ΌΆΤ0116 (8ЕЦ ГО N0: 3), (й) ΌΆΤ0117 (8ЕЦ ГО N0: 4), (е) ΌΆΤ0118 (8ЕЦ ГО N0: 5), (ί) ΌΆΤ0119 (8ЕЦ ΙΌ N0: 6), (д) ΌΑΤ0120 (8ЕЦ ΙΌ N0: 7), (Й) Э0М7Й-14 (8ЕЦ ΙΌ N0: 8) (йАЬ) (СЭР подчеркнуты), (ί) ОЬР-1 7-37 А(8)О (8ЕЦ ГО N0: 9), (]) эксендин-4 (8ЕЦ ГО N0: 10), (к) спиральный линкер (8ЕЦ ГО N0: 11), (I) О1у-8ег линкер (8ЕЦ ГО N0: 12), (т) ΌΜ87139 (8ЕЦ ГО N0: 24, (η) ΌΜ87143 (8ЕЦ ГО N0: 25), (о) Э0М7Й-14-10 (8ЕЦ ГО N0: 26) (йАЬ) (СЭР подчеркнуты), (р) Э0М7Й11-15 (8ЕЦ ГО N0: 27) (йАЬ) (СЭР подчеркнуты), (с.|) сигнальный пептид (лидер) 0тρΤ А\УА (8ЕЦ ГО N0: 28), (г) Э0М7Й-14-10Р108С (8ЕЦ ГО N0: 42), (δ) ΡΥΥ 3-36 (с лизином в положении 10) (8ЕЦ ГО N0: 43).
Фиг. 2 представляет иллюстрацию последовательностей нуклеиновых кислот: (а) ΌΑΤ0114 (конструкция млекопитающего) (8ЕЦ ГО N0: 13), (Ь) ΌΑΤ0115 (конструкция млекопитающего) (8ЕЦ ГО N0: 14), (с) ΌΑΤ0115 (отимизировано для конструкции Е. сой) (8ЕЦ ГО N0: 15), (й) ΌΑΤ0116 (конструкция млекопитающего) (8ЕЦ ГО N0: 16), (е) ΌΑΤ0116 (оптимизировано для конструкции Е. сой) (8ЕЦ ГО N0: 17), (ί) ΌΑΤ0117 (конструкция млекопитающего) (8ЕЦ ГО N0: 18), (д) ΌΑΤ0117 (оптимизировано для конструкции Е.сой) (8ЕЦ ГО N0: 19), (й) ΌΑΤ0118 (конструкция млекопитающего) (8ЕЦ ГО N0: 20), (ί) ΌΑΤ0119 (конструкция млекопитающего) (8ЕЦ ГО N0: 21), (]) ΌΑΤ0120 (конструкция млекопитающего) (8ЕЦ ГО N0: 22), (к) Э0М7Й-14 (8ЕЦ ГО N0: 23), (I) ЭМ87139 (8ЕЦ ГО N0: 29, (т) ЭМ87143 (8ЕЦ ГО N0: 30), (η) Э0М7Й-14-10 (8ЕЦ ΙΌ N0: 31) ^Ь), (о) Э0М7Й-11-15 (8ЕЦ ГО N0: 32) ^Ь), (р) сигнальный пептид 0тр ДУД (8ЕЦ ГО N0: 33), (ф Э0М7Й-14-10 Р108С ^Ь) (8ЕЦ ГО N0: 44), (г) кДНК яванского макака (8ЕЦ ГО N0: 45), (δ) олигонуклеотид 1 (8ЕЦ ГО N0: 47), (I) олигонуклеотид 2 (8ЕЦ ГО N0: 48), (и) последовательность нуклеиновой кислоты ЭМ87139 для экспрессии в Е. сой (8ЕЦ ГО N0: 50).
На фиг. 3 (а) показано дозозависимое уменьшение массы тела в мышиной модели ожирения при введении ΌΑΤ0115, (Ь) показано суточное потребление пищи в мышиной модели ожирения при введении ΌΑΤ0115.
На фиг. 4 показана Э8С (дифференциальная сканирующая калориметрия) ΌΑΤ0115: сплошная линия - кривая для ΌΑΤ0115, пунктирная линия соответствует необратимой модели двух состояний (поп-251а1е тойе1).
На фиг. 5 показана Э8С лизоцима: сплошная линия - кривая для лизоцима, пунктирная линия - соответствует необратимой модели двух состояний (поп-2-81а1е тойе1) (кривые перекрываются, поэтому пунктирная линия не видна).
На фиг. 6 показаны 8ЕС МЛЕТ8 (гель-фильтрация/многоугловое лазерное светорассеяние) для ΌΑΤ0115.
На фиг. 7 показаны 8ЕС ΜΑ^^δ для ΌΑΤ0117.
На фиг. 8 показаны 8ЕС ΜΑ^^δ для ΌΑΤ0120.
На фиг. 9 показаны аминокислотные последовательности лидерных последовательностей: (а) отрΑ (происходящая из Е. сой) (8ЕЦ ГО N0: 34), (Ь) отрΑ-ΑΜΑ (искусственная последовательность) (8ЕЦ ГО N0: 35), (с) отрЛ-Л\VЛ (искусственная последовательность) (8ЕЦ ГО N0: 36), (й) отрΤ (происходящая из Е. сой) (8ЕЦ ГО N0: 37), (е) отрΤ-ΑΜΑ (искусственная последовательность) (8ЕЦ ГО N0: 38), (ί) ΟΑδ (происходящая из δ. сегеу181ае) (8ЕЦ ГО N0: 39), (д) ОΑδ-ЛΜΑ (искусственная последовательность) (8ЕЦ ГО N0: 40), (Й) ΟΑδ-Α^Α (искусственная последовательность) (ЪЕЦ ГО N0: 41), (ί) Ре1 В (Έπνίηί;·ι сагофуога) 0ЕЦ ГО N0: 46), (|) Ма1 Е (искусственная последовательность) (ЪЕЦ ГО N0: 49).
На фиг. 10 показано очищенное ^Μδ7139, анализируемое с помощью масс-спектрометрии.
На фиг. 11 показана статистически значимое снижение уровня глюкозы в крови, включающее сравнение между ΌΑΤ0115 и контролем, ^Μδ7139 и контролем и между ^Μδ7139 и ΌΑΤ0115, (а) показана
- 8 021146 схема исследования, и (Ь) графическое представление ЛИС для глюкозы. Доверительные интервалы, которые не перекрываются с горизонтальной линией, являются значимыми.
На фиг. 12 показано, что повторная доза ΌΜ87139 демонстрирует дозозависимое снижение НЬА1с (гликозилированный гемоглобин) по сравнению с ΌΟΜ7Η-14 контролем.
На фиг. 13 показано, что ΌΑΤ0115 и ΌΜ87139 демонстрирует дозозависимое уменьшение потребления пищи и массы тела по сравнению с ΌΟΜ7Η-14 контролем в мышиной модели ΌΙΟ-ожирения (ожирения, индуцированной диетой). На графике мкг= микрограммы.
На фиг. 14 показан пептидный конъюгат, который представлет собой ΌΟΜ7Ε-14-10 (К108С) А1Ьи6АЬ, конъюгированное с амидированным по С-концу ΡΥΥ3-36 посредством лизина (введенного в положение 10 ΡΥΥ) и линкера из 4 повторов ПЭГ. Линия представляет собой линкер, который ковалентно присоединен к свободному С-концевому цистеину ΌΟΜ7Η-14-10 (К108С) А1ЬибАЬ и лизину в положении 10 последовательности ΡΥΥ.
На фиг. 15 показано, что ΌΜ87605 демонстрирует дозозависимое уменьшение массы тела по сравнению с контролем-растворителем.
Подробное описание изобретения
В пределах данного описания изобретение было описано со ссылкой на воплощения таким образом, чтобы сделать данное описание ясным и точным. Предполагается и следует понимать, что воплощения можно различным образом комбинировать или разделять, не выходя за рамки изобретения.
Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют такое же значение, как и обычно понятное специалисту в данной области (например, в культуре клеток, молекулярной генетике, химии нуклеиновых кислот, методах гибридизации и биохимии). Для молекулярных, генетических и биохимических способов используют стандартные методы (см. в основном ЗатЬгоок е! а1., Μοίθ^ατ С1ошпд: А ЬаЬогаЮгу Μαηιιαί. 26 еб. (1989) Со16 8ргшд НагЬог ЬаЬогаЮгу Рге88, Со16 8ргшд НагЬог, Ν.Υ. и Аи8иЬе1 е! а1., 81юг1 РгоЮсоН ίη Μο1еси1а^ Вю1о§у (1999) 4'1' Еб, 1оНп ^УНеу & §оп8, 1пс., которые включены в данную заявку посредством ссылки) и химические методы.
Термин инсулинотропный агент, используемый в данной заявке, означает соединение, которое способно стимулировать, или вызывать стимуляцию, синтез или экспрессию, или активность гормона инсулина. Известные примеры инсулинотропных агентов включают, но не ограничиваются этим, например, глюкозу, ΟΙΡ, ОЬР, эксендин (например, эксендин-4 и эксендин-3), ΡΥΥ и ОХМ.
Термин инкретин, используемый в данной заявке, означает тип желудочно-кишечного гормона, который вызывает увеличение количества высвобождаемого инсулина при нормальных уровнях глюкозы или, в частности, когда они повышаются. В качестве примера они включают ΟΕΡ-1, ΟΙΡ, ОХМ, ΡΥΥ (например, ΡΥΥ 3-36), νΐΡ и РР (панкреатический полипептид).
Термин аналог, используемый в данной заявке, относящийся к полипептиду, означает модифицированный пептид, где один или более аминокислотных остатков пептида были заменены другими аминокислотными остатками, и/или где один или более аминокислотных остатков были делетированы из пептида, и/или где один или более аминокислотных остатков были добавлены к пептиду. Такое добавление или такая делеция аминокислотных остатков могут иметь место на Ν-конце пептида и/или на С-конце пептида, или они могут иметь место в пределах пептида. Для описания аналогов ΟΕΡ-1 используют простую систему: например, ΟΕΡ-1 А8О (аминокислоты 7-37) означает аналог ΟΕΡ-1, где природный аланин в положении 8 был заменен остатком глицина. Формулы пептидных аналогов и их производных изображены с использованием стандартной однобуквенной аббревиатуры для аминокислот, используемой согласно номенклатуре ЮТАС-ШВ.
Как использовано в данной заявке, фрагмент, когда используется в ссылке на полипептид, означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является частью аминокислотной последовательности полноразмерного природного полипептида. Фрагменты могут быть отдельно расположенными или находящимися в пределах более крупного полипептида, из которого они образуют часть или участок в виде единого непрерывного участка в одном более крупном полипептиде. Так, например, фрагмент природного ΟΕΡ-1 будет включать аминокислоты 7-36 из природных аминокислот 1-36. Кроме того, фрагменты полипептида также могут быть вариантами природной частичной последовательности. Например, фрагмент ΟΕΡ-1, содержащий аминокислоты 7-30 природного ΟΕΡ-1, также может быть вариантом, имеющим аминокислотные замены в пределах его частичной последовательности.
Примеры подходящих инсулинотропных агентов по изобретению включают ΟΕΡ-1, производные ΟΕΡ-1, аналоги ΟΕΡ-1 или производное аналога ΟΕΡ-1. Кроме того, они включают эксендин-4, аналоги эксендина-4 и производные или фрагменты эксендина-4, и эксендин-3, производные эксендина-3 и аналоги эксендина-3.
Термин ΟΕΡ-1, используемый в данной заявке, означает ΟΕΡ-1 (7-37), ΟΕΡ-1 (7-36), ΟΕΡ-1 (7-35), ΟΌΡ-1 (7-38), ΟΌΡ-1 (7-39), ΟΕΡ-1 (7-40), ΟΕΡ-1 (7-41), аналог ΟΕΡ-1, пептид ΟΕΡ-1, производное, или мутант, или фрагмент ΟΕΡ-1, или производное аналога ΟΕΡ-1. Такие пептиды, мутанты, аналоги и производные представляют собой инсулинотропные агенты.
Например, ΟΕΡ-1 может представлять собой мутант ΟΕΡ-1 (7-37) А8О с аминокислотной последовательностью, представленной на фиг. 1(т): 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 9.
- 9 021146
Другие аналоги ОЬР-1 описаны в международной патентной заявке № 90/11296 (Тйе Оеиега1 Ηοδρί!а1 Сотротайоп), которая относится к пептидным фрагментам, которые содержат ОЬР-1 (7-36) и его функциональные производные и имеют инсулинотропную активность, которая превышает инсулинотропную активность ОЬР-1 (1-36) или ОЬР-1 (1-37), и к их применению в качестве инсулинотропных агентов (включенных в данную заявку посредством ссылки, в частности, посредством примеров лекарственных средств для применения в настоящем изобретении).
В международной патентной заявке № \УО 91/11457 (Виск1еу е! а1.) описаны аналоги активных пептидов ОЬР-1 7-34, 7-35, 7-36 и 7-37, которые могут быть полезны в качестве ОЬР-1 лекарственных средств согласно настоящему изобретению.
Термин эксендин-4 пептид, используемый в данной заявке, означает эксендин-4 (1-39), аналог эксендина-4, фрагмент пептида эксендина-4, производное эксендина-4 или производное аналога эксендина4. Такие пептиды, фрагменты, аналоги и производные представляют собой инсулинотропные агенты. Аминокислотная последовательность эксендина-4 (1-39) представлена на фиг. 1(|) 8ЕЦ ГО N0: 10.
Дополнительные аналоги эксендина, которые полезны для настоящего изобретения, описаны в РСТ патентных публикациях \УО 99/25728 (Вее1еу е! а1.), \УО 99/25727 Вее1еу е! а1.), \УО 98/05351 (Уоиид е! а1.), \УО 99/40788 (Уоиид е! а1.), \УО 99/07404 (Вее1еу е! а1.) и \УО 99/43708 (Кпибвеи е! а1.) (все включены в данную заявку посредством ссылки, в частности, посредством примеров лекарственных средств для применения в настоящем изобретении).
Как использовано в данной заявке, пептид относится к аминокислотам в количестве от примерно 2 до примерно 50, которые соединены между собой с помощью пептидных связей.
Как использовано в данной заявке, полипептид относится по меньшей мере к примерно 50 аминокислотам, которые соединены между собой с помощью пептидных связей. Полипептиды обычно содержат третичную структуру и сворачиваются в функциональные домены.
Как использовано в данной заявке, дисплейная система относится к системе, в которой коллекция полипептидов или пептидов доступна для селекции на основе желаемой характеристики, такой как физическая, химическая или функциональная характеристика. Дисплейная система может представлять собой подходящий репертуар полипептидов или пептидов (например, в растворе, иммобилизованном на подходящем носителе). Дисплейная система также может представлять собой систему, которая использует клеточную систему экспрессии (например, экспрессию библиотеки нуклеиновых кислот, например, в трансформированных, инфицированных, трансфицированных или трансдуцированных клетках и дисплей кодируемых полипептидов на поверхности клеток) или бесклеточную систему экспрессии (например, компартментализацию и дисплей с использованием эмульсии). Примерные дисплейные системы связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида или пептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой. При использовании такой дисплейной системы могут быть выбраны полипептиды или пептиды, которые имеют желаемые физические, химические и/или функциональные характеристики, и нуклеиновая кислота, кодирующая выбранный полипептид или пептид, может быть легко выделена или извлечена. Число дисплейных систем, которые связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида или пептида, известны в данной области техники, например, бактериофаговый дисплей (фаговый дисплей, например, фагмидный дисплей), рибосомный дисплей, компартментализация и дисплей с использованием эмульсии, дрожжевой дисплей, пуромициновый дисплей, бактериальный дисплей, дисплей на плазмиде, ковалентный дисплей и тому подобное (см, например, ЕР 0436597 ГОуах). патент США № 6172197 (МсСаГГеПу е! а1.), патент США № 6489103 (ОтЖ!Й8 е! а1.)).
Как использовано в данной заявке, функциональный описывает полипептид или пептид, который имеет биологическую активность, такую как специфическая связывающая активность. Например, термин функциональный полипептид включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с целевым антигеном с помощью его антигенсвязывающего сайта.
Как использовано в данной заявке, целевой лиганд относится к лиганду, который специфически или селективно связывается полипептидом или пептидом. Например, когда полипептид представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, целевой лиганд может представлять собой любой желаемый антиген или эпитоп. Связывание с целевым антигеном зависит от того, является полипептид или пептид функциональным.
Как использовано в данной заявке, антитело относится к 1дО, 1дМ, 1дА, 1§ϋ или 1дЕ или фрагменту (такому как РаЬ, Р(аЬ')2, Ρν, дисульфид-связанный Ρν, 8сРу, полиспецифическое антитело с закрытой конформацией, дисульфид-связанный 8сΡν, диатело), независимо от того, происходят ли они из видов, естественно продуцирующих антитело, или созданы с помощью технологии рекомбинантных ДНК; или выделены из сыворотки, В-клеток, гибридом, трансфектом, дрожжей или бактерий.
Как использовано в данной заявке, антительный формат относится к любой подходящей полипептидной структуре, в которой один или более вариабельных доменов антитела могут быть встроены таким образом, чтобы придать специфичность связывания в отношении антигена на структуре. Разнообразие подходящих форматов антитела известны в данной области техники, таких как химерные антитела, гу- 10 021146 манизированные антитела, человеческие антитела, одноцепочечные антитела, биспецифические антитела, тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры тяжелых и/или легких цепей антитела, антигенсвязывающие фрагменты любого из вышеперечисленных (например, Ρν-фрагмент (например, одноцепочечные Ρν (8θΡν), дисульфид-связанные Ρν), РаЬ-фрагмент, РаЬ'-фрагмент, Р(аЬ')2фрагмент), единичный вариабельный домен антитела (например, бЛЬ. νΗ, νΗΗ, Уь) и модифицированные варианты любого из вышеуказанного (например, модифицированные посредством ковалентного присоединения полиэтиленгликоля или другого подходящего полимера или гуманизированный νΗΗ).
Фраза единичный вариабельный домен иммуноглобулина относится к вариабельному домену антитела (νΗ, νΗΗ, νθ, который специфически связывает антиген или эпитоп, независимо от других Vобластей или доменов. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина может присутствовать в формате (например, гомо- или гетеро-мультимера) с другими вариабельными областями или вариабельными доменами, где другие области или домены не требуются для антигенного связывания единичным вариабельным доменом иммуноглобулина (т.е. когда единичный вариабельный домен иммуноглобулина связывает антиген независимо от дополнительных вариабельных доменов). Доменное антитело или бЛЬ представляет собой то же самое, что и термин единичный вариабельный домен иммуноглобулина, используемый в данной заявке. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой то же самое, что и термин единичный вариабельный домен иммуноглобулина, используемый в данной заявке. Единичный вариабельный домен антитела представляет собой то же самое, что и термин иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, используемый в данной заявке. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой в одном воплощении вариабельный домен человеческого антитела, но также включает единичные вариабельные домены антитела из других видов, таких как νΗΗ бЛЬк грызунов (например, как описано в νΟ 00/29004, содержание которой включено в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте), акулы-няньки и верблюдовых. Верблюжьи νΗΗ представляют собой полипептиды иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, которые происходят из видов, включающих верблюда, ламу, альпака, дромадера и гуанако, которые продуцируют антитела из тяжелых цепей, естественно лишенные легких цепей. νΗΗ могут быть гуманизированными.
Домен представляет собой свернутую белковую структуру, которая имеет третичную структуру, независимую от остального белка. Как правило, домены отвечают за определенные функциональные свойства белков и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перенесены в другие белки без потери функции оставшегося белка и/или домена. Единичный вариабельный домен антитела представляет собой свернутый полипептидный домен, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антител. Поэтому он включает полноразмерные вариабельные домены антител и модифицированные вариабельные домены, например, в которых одна или более петель заменены последовательностями, которые не характерны для вариабельных доменов антител, или вариабельные домены антител, которые были укорочены или содержат Ν- или С-концевые удлинения, а также свернутые фрагменты вариабельных доменов, которые сохраняют, по меньшей мере, связывающую активность и специфичность полноразмерного домена.
Термин библиотека относится к смеси гетерогенных полипептидов или нуклеиновых кислот. Библиотека состоит из членов, каждый из которых имеет одну полипептидную или нуклеиновокислотную последовательность. В этом смысле библиотека является синонимом термина репертуар. Различия последовательностей между членами библиотеки отвечают за разнообразие, присутствующее в библиотеке. Библиотека может принимать форму простой смеси полипептидов или нуклеиновых кислот или может быть в форме организмов или клеток, например, бактерий, вирусов, животных или растительных клеток и тому подобного, трансформированных библиотекой нуклеиновых кислот. В одном воплощении каждый индивидуальный организм или клетка содержит только один или ограниченное число членов библиотеки. В одном воплощении нуклеиновые кислоты включены в экспрессирующие векторы с целью обеспечения экспрессии полипептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами. Поэтому в одном аспекте библиотека может принимать форму популяции организмов-хозяев, где каждый организм содержит одну или более копий экспрессирующего вектора, содержащего один член библиотеки в форме нуклеиновой кислоты, которая может экспрессироваться для получения его соответствующего полипептидного члена. Таким образом, популяция организмов-хозяев имеет потенциал для кодирования большого репертуара разнообразных полипептидов.
Используемый в данной заявке термин доза относится к количеству продукта слияния или конъюгата, вводимого субъекту единовременно (единица дозы) или за два или более введений в течение определенного временного интервала. Например, доза может относиться к количеству продукта слияния или конъюгата, вводимого субъекту в течение одних суток (24 ч) (суточная доза), двух суток, одной недели, двух недель, трех недель или одного или более месяцев (например, посредством одного введения или посредством двух или более введений). Интервал между дозами может составлять любое желаемое количество времени.
Фраза период полувыведения относится к времени, необходимому для уменьшения на 50% концентрации продукта слияния или конъюгата в сыворотке или плазме ίη νίνο, например, благодаря деградации и/или выведению или секвестрации природными механизмами. Продукты слияния или конъюгаты
- 11 021146 по изобретению стабилизированы ίη νίνο, и их период полувыведения увеличен посредством связывания с молекулами сывороточного альбумина, например, человеческим сывороточным альбумином (Н8А), которые демонстрируют устойчивость к деградации и/или выведению или секвестрации. Эти молекулы сывороточного альбумина представляют собой природные белки, которые сами по себе имеют продолжительный период полувыведения ίη νίνο. Период полувыведения молекулы увеличивается, если его функциональная активность сохраняется ίη νίνο в течение более продолжительного периода времени, чем у подобной молекулы, которая не является специфической в отношении молекулы, увеличивающей период полувыведения. Например, продукт слияния или конъюгат по изобретению, содержащие 6АЬ, специфическое в отношении человеческого сывороточного альбумина (Н8А), и инкретиновое лекарственное средство или инсулинотропный агент, такие как СЬР-1 или эксендин, сравнивают с таким же лигандом, у которого специфичность к Н8А отсутствует, т.е. он не связывает Н8А, но связывает другую молекулу. Например, он может связывать третью мишень на клетке. Как правило, период полувыведения увеличивают на 10, 20, 30, 40, 50% или более. Возможны увеличения в диапазоне 2х, 3х, 4х, 5х, 10х, 20х, 30х, 40х, 50х, 100х, 200х, 300х или более относительно периода полувыведения. Альтернативно или дополнительно, возможны увеличения в диапазоне вплоть до 30х, 40х, 50х, 60х, 70х, 80х, 90х, 100х, 150х, 200х, 300х, 400х относительно периода полувыведения.
Как использовано в данной заявке, гидродинамический размер относится к кажущемуся размеру молекулы (например, белковой молекулы, лиганда) на основании диффуции молекулы через водный раствор. Диффузию или движение белка через раствор можно преобразовать для получения кажущегося размера белка, где размер задается радиусом Стокса или гидродинамическим радиусом белковой частицы. Гидродинамический размер белка зависит как от массы, так и формы (конформации), так что два белка, имеющих одинаковую молекулярную массу, могут иметь различные гидродинамические размеры на основании общей конформации белка.
Расчеты гомологии, или идентичности, или сходства между двумя последовательностями (термины используются в данной заявке взаимозаменяемо) осуществляются следующим образом. Последовательности выравнивают для целей оптимального сравнения (например, в одну или обе первую и вторую аминокислотную или нуклеиновокислотную последовательность можно вводить бреши для оптимального выравнивания, и негомологичные последовательности можно не учитывать для целей сравнения). В воплощении длина ссылочной последовательности, выравниваемой для целей сравнения, составляет по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70, 80, 90, 100% от длины ссылочной последовательности. Аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или положениях нуклеотидов затем сравнивают. Когда положение в первой последовательности занято таким же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, тогда молекулы идентичны по этому положению (как использовано в данной заявке, гомология аминокислот или нуклеиновой кислоты эквивалентна идентичности аминокислот или нуклеиновой кислоты). Процент идентичности между двумя последовательностями зависит от числа идентичных положений, общих для этих последовательностей, с учетом числа брешей и длины каждой бреши, которые необходим вводить для оптимального выравнивания двух последовательностей. Выравнивания аминокислотной и нуклеотидной последовательности и гомология, сходство или идентичность, как определено в данной заявке, могут быть получены и определены с использованием алгоритма ВЬА8Т 2 8ес|иепсе5 с использованием параметров по умолчанию (Так^ома, Т. А. с1 а1., РЕМ8 МютоЬю1 Ьей, 774:187-188 (1999)).
Нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева
Изобретение относится к выделенным и/или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим продукты слияния по изобретению, которые описаны в данной заявке, например, кодируемые с помощью 8Еф ГО N0: 13-23.
Нуклеиновые кислоты, называемые в данной заявке выделенными, представляют собой нуклеиновые кислоты, которые были отделены от другого вещества (например, других нуклеиновых кислот, таких как геномная ДНК, кДНК и/или РНК) в их первоначальном окружении (например, в клетках или в смеси нуклеиновых кислот, таких как библиотека). Выделенная нуклеиновая кислота может быть выделена в виде части вектора (например, плазмиды).
Нуклеиновые кислоты, называемые в данной заявке рекомбинантными, представляют собой нуклеиновые кислоты, которые были получены с помощью методологии рекомбинантных ДНК, включая методы, которые основаны на искуственной рекомбинации, такие как клонирование в вектор или хромосому с использованием, например, рестрикционных ферментов, гомологичной рекомбинации, вирусов и тому подобного, и нуклеиновых кислот, полученных с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Изобретение также относится к рекомбинантной клетке-хозяину, например, клетке млекопитающего или микробной клетке, которая содержит (одну или более чем одну) рекомбинантную нуклеиновую кислоту или экспрессирующую конструкцию, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую продукт слияния по изобретению, как описано в данной заявке. Также предложен способ получения продукта
- 12 021146 слияния по изобретению, как описано в данной заявке, включающий поддержание рекомбинантной клетки-хозяина по изобретению, например, клетки млекопитающего или микробной клетки, в условиях, подходящих для экспрессии слитого полипептида. Способ также может включать стадию выделения или извлечения продукта слияния, при необходимости.
Например, молекулу нуклеиновой кислоты (т.е. одну или более молекул нуклеиновых кислот), кодирующую слитый полипептид по изобретению или экспрессирующую конструкцию (т.е. одну или более конструкций), содержащую такую(ие) молекулу(ы) нуклеиновой кислоты, можно вводить в подходящую клетку-хозяина для создания рекомбинантной клетки-хозяина с использованием любого метода, подходящего для выбранной клетки-хозяина (например, трансформации, трансфекции, электропорации, инфекции), так что молекула(ы) нуклеиновой кислоты функционально связана(ы) с одним или более элементами, регулирующими экспрессию (например, в векторе, в конструкции, созданной с помощью процессов в клетке, интегрированной в геном клетки-хозяина). Полеченную рекомбинантную клеткухозяина можно поддерживать в условиях, подходящих для экспрессии (например, в присутствии индуктора, в подходящем животном, в подходящих культуральных средах, дополненных подходящими солями, ростовыми факторами, антибиотиками, пищевыми добавками и т.д.), посредством чего продуцируется кодируемый пептид или полипептид. При необходимости, кодируемый пептид или полипептид может быть выделен или извлечен (например, из животного, клетки-хозяина, среды, молока). Этот процесс охватывает экспрессию в клетке-хозяине трансгенного животного (см., например, ШО 92/03918, СепРйагт 1п1етпа1юпа1).
Слитые полипептиды по изобретению, описанные в данной заявке, также могут продуцироваться в подходящей системе экспрессии ш νίΐτο, например, посредством химического синтеза или любого другого подходящего способа.
Как описано и проиллюстрировано в данной заявке, продукты слияния или конъюгаты по изобретению, как правило, связывают сывороточный альбумин с высокой аффинностью.
Например, продукты слияния или конъюгаты по изобретению могут связывать человеческий сывороточный альбумин с аффинностью (ΚΌ; КО=Ко££(кй)/Коп(ка) (как определено методом поверхностного плазмонного резонанса) от примерно от 5 мкмоль до примерно 100 пМ, например, от примерно 1 мкмоль до примерно 100 пМ, например примерно 5-50 нм, например примерно 10-30 нм, например примерно 2030 нм.
Продукты слияния или конъюгаты по изобретению могут экспрессироваться в Е. сой или видах Р1сЫа (например, Р. ра51оп5). и они также могут экспрессироваться в любых дрожжевых или грибковых клетках. В одном воплощении продукт слияния секретируется в количестве по меньшей мере примерно 0,5 мг/л при экспрессии в Е. сой или видах РюЫа (например, Р. рахЮгц); или в клеточной культуре млекопитающего (например, клетках СНО или НЕК 293). Хотя продукты слияния или конъюгаты, описанные в данной заявке, могут секретироваться при экспрессии в Е. сой или видах РюЫа или клетках млекопитающих, их можно производить с использованием любого подходящего способа, такого как способы химического синтеза или способы биологического производства, которые не используют Е. сой или виды РюЫа.
В некоторых воплощениях продукты слияния и конъюгаты по изобретению являются эффективными в животных моделях, таких как описанные в ШО 2006/059106 (например, на с. 104-105 опубл. ШО 2006/059106) или описанные в примерах в данной заявке при введении в эффективном количестве. Как правило, эффективное количество составляет от примерно 0,0001 до примерно 10 мг/кг (например, от примерно 0,001 до примерно 10 мг/кг, например, от примерно 0,001 до примерно 1 мг/кг, например, от примерно 0,01 до примерно 1 мг/кг, например, от примерно 0,01 до примерно 0,1 мг/кг). Модели заболевания известны специалистам в данной области техники как предсказывающие терапевтическую эффективность у людей.
Как правило, продукты слияния и конъюгаты по настоящему изобретению будут использоваться в очищенной форме вместе с фармакологически или физиологически подходящими носителями. Обычно эти носители могут включать водный или спиртовой/водный растворы, эмульсии или суспензии, в том числе физиологический раствор и/или забуференную среду. Парентеральные носители могут включать раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия и раствор Рингера с лактатом. Подходящие физиологически приемлемые адъюванты, если необходимо сохранить полипептидный комплекс в суспензии, могут быть выбраны из загустителей, таких как карбоксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон, желатин и альгинаты.
Внутривенные носители включают жидкости и питательные вещества и электролиты, основанные, например, на декстрозе Рингера. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как противомикробные агенты, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы (Маск (1982) Кетшд1оп'8 Рйаттасеийса1 8с1епсе8, 16!й Еййюп). Можно использовать различные подходящие препараты, включая препараты с пролонгированным высвобождением.
Путь введения фармацевтических композиций согласно изобретению может быть любым из широко известных специалистам в данной области техники. Для терапии продукты слияния или конъюгаты лекарственных средств по изобретению можно вводить любому пациенту в соответствии со стандартны- 13 021146 ми методами.
Введение может быть выполнено любым подходящим способом, в том числе парентерально, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, перорально, трансдермально, через легкие или же, соответственно, путем прямой инфузии с помощью катетера. Дозировка и частота введения будут зависеть от возраста, пола и состояния пациента, одновременного введения с другими лекарственными средствами, противопоказаний и других параметров, принимаемых во внимание врачом. Введение может быть локальным или системным, как указано.
В одном воплощении в изобретении предложен препарат для доставки в легкие, который содержит (а) конъюгаты или продукты слияния по изобретению и (б) фармацевтически приемлемый буфер, и где композиция содержит жидкие капли, и примерно 40% или более, например 50% или более, жидких капель, присутствующих в композиции, имеют размер в диапазоне, который составляет менее чем примерно 6 мкм, например, от примерно 1 до примерно 6 мкм, например, менее чем примерно 5 мкм, например, от примерно 1 до примерно 5 мкм. Эти композиции особенно подходят, например, для введения субъекту посредством прямой локальной доставки в легкие. Эти композиции могут быть, например, введены непосредственно в легкие, например, посредством ингаляции, например, с использованием устройства небулайзера. Эти композиции для легочной доставки могут содержать физиологически приемлемый буфер, который имеет диапазон рН от примерно 4 до примерно 8, например, от примерно 7 до примерно 7,5, и вязкость, которая примерно равна вязкости раствора от примерно 2 до примерно 10% ПЭГ 1000 в 50 мМ фосфатном буфере, содержащем 1,2% (мас./об.) сахарозы.
Продукты слияния или конъюгаты по данному изобретению могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящем носителе перед применением. Было показано, что этот метод является эффективным с обычными иммуноглобулинами и могут быть использованы известные в данной области техники методы лиофилизации и восстановления. Специалисту в данной области понятно, что лиофилизация и восстановление могут приводить к различной степени потери активности антитела (например, что касается традиционных иммуноглобулинов, то 1дМ антитела, как правило, имеют большую потерю активности, чем 1дС антитела) и что используемые уровни следует корректировать в большую сторону для компенсации.
Для профилактических применений, например, при введении индивидуумам с предиабетом или с инсулинорезистентностью, композиции, содержащие продукты слияния или конъюгаты по настоящему изобретению, также можно вводить в аналогичной или несколько более низкой дозе для предупреждения, ингибирования или замедления начала заболевания (например, для поддержания ремиссии или стабильности, или для предупреждения острой фазы). Опытный врач способен определять подходящий интервал дозировок для лечения, подавления или предупреждения заболевания. При введении продукта слияния или конъюгата по изобретению для лечения, подавления или предупреждения заболевания его можно вводить вплоть до четырех раз в день, двух раз в неделю, одного раза в неделю, одного раза каждые две недели, одного раза в месяц или одного раза каждые два месяца при дозе, например, от примерно 0,0001 до примерно 10 мг/кг (например, от примерно 0,001 до примерно 10 мг/кг, например, от примерно 0,001 до примерно 1 мг/кг, например, от примерно 0,01 до примерно 1 мг/кг, например, от примерно 0,01 до примерно 0,1 мг/кг).
Лечение или терапию, выполняемую с использованием композиций, описанных в данной заявке, считают эффективной, если один или более симптомов уменьшаются (например, по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на один пункт по шкале клинической оценки) относительно таких симптомов, присутствующих до лечения, или относительно таких симптомов у индивидуума (человека или модельного животного), которого не лечат такой композицией или другим подходящим контролем. Очевидно, что симптомы будут варьировать в зависимости от точной природы целевого заболевания или расстройства, но могут быть измерены обычным врачом или медицинским работником.
Аналогично, профилактика, выполняемая с использованием композиции, описанной в данной заявке, является эффективной, если появление или тяжесть одного или более симптомов замедляется, уменьшается или отменяется относительно таких симптомов у сходного индивидуума (человека или модельного животного), которого не лечат данной композицией.
Продукты слияния и конъюгаты по настоящему изобретению можно использовать в виде отдельно вводимых композиций или их можно вводить вместе с другими терапевтическими или активными агентами, например, другими полипептидами или пептидами или небольшими молекулами. Эти дополнительные агенты могут включать различные лекарственные средства, такие как, например, метформин, инсулин, глитазоны (например, росиглитазон), иммунодепрессанты, иммуностимуляторы.
Продукты слияния и конъюгаты по изобретению можно вводить и/или приготавливать в виде препарата вместе с одним или более дополнительными терапевтическими или активными агентами. Когда продукт слияния или конъюгат по изобретению вводят с дополнительным терапевтическим агентом, тогда продукт слияния или конъюгат можно вводить до, одновременно или после введения дополнительного агента. Как правило, продукт слияния или конъюгат по изобретению и дополнительный агент вводят способом, который обеспечивает перекрывание терапевтического эффекта.
- 14 021146
Период полувыведения
Увеличенный период полувыведения инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства, например, ОЬР-1 или эксендинового лиганда полезен в применениях ίη νίνο. Эта проблема решается в изобретении путем обеспечения увеличенного периода полувыведения инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства, например, ОЬР и эксендина, ίη νίνο и, следовательно, более продолжительного времени персистенции в теле функциональной активности этих молекул.
Как описано в данной заявке, композиции по изобретению (т.е. содержащие продукты слияния или конъюгаты, описанные в данной заявке) могут иметь значительно более пролонгированный период полувыведения из сыворотки или плазмы ίη νίνο и/или увеличенную АИС и/или увеличенное среднее время удержания (МКТ) по сравнению с одним только инсулинотропным агентом или инкретиновым лекарственным средством. Кроме того, активность инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства обычно, по существу, не изменяется в композиции по изобретению (например, конъюгата или продукта слияния). Однако некоторое изменение активности композиций по изобретению по сравнению с одним только инсулинотропным агентом или инкретиновым лекарственным средством является приемлемым и обычно компенсируется за счет улучшенных фармакокинетических свойств конъюгатов или продуктов слияния по изобретению. Например, конъюгаты или продукты слияния лекарственных средств по изобретению могут связывать лекарственную мишень с более низкой аффинностью, чем одно только лекарственное средство, но имеют примерно равную или более высокую эффективность по сравнению с одним только лекарственным средством вследствие улучшенных фармакокинетических свойств (например, пролонгированного периода полувыведения из сыворотки ίη νίνο, большей АИС) композиции лекарственного средства. Кроме того, вследствие увеличенного периода полувыведения конъюгатов или продуктов слияния по изобретению их можно вводить менее часто, чем один только инсулинотропный агент или инкретиновое лекарственное средство, например, их можно давать пациентам один раз в месяц или один раз в неделю, и они также обепечивают более постоянный уровень инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства в крови, чем введение одного только инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства, достигая таким образом желаемого терапевтического или профилактического эффекта.
Способы фармакокинетического анализа и определения периода полувыведения лиганда хорошо известны специалистам в данной области (подробности можно найти в КетеШ, А е1 а1. СЬетка1 51аЫ1Пу οί РкагтасенИсаК: А ΗаηάЬοοк Рэг РкагтасМх и в Ре1ег§ е1 а1., Ρ1ι;·ιπη;κο1<ίιΜΚ ;·ιη;·ι1\'8ί8: А Ргас11са1 Арргоаск (1996). Ссылка также сделана на Рка^тасοк^ηеΐ^С8, М О|Ьа1Ш & Ό Регтом, опубликованную Магсе1 Эеккег, 2'1 Ке\\ ех ебНют! (1982), в которой описаны фармакокинетические параметры, такие как периоды полувыведения ΐ-альфа и ΐ-бета и площадь под кривой (АИС)).
Периоды полувыведения (ΐ1/2 альфа и ΐ1/2 бета) и АИС и МКТ можно определить из кривой концентрации лиганда в сыворотке или плазме относительно времени. Можно использовать пакет аналитических программ νίηΝοηΙίη (доступный от Ркаг81дк1 Согр., Мοиηΐа^η У1е\у, СА94040, США), например, для моделирования кривой. В первой фазе (альфа-фазе) лиганд подвергается, главным образом, распределению в организме пациента, с некоторой элиминацией. Вторая фаза (бета-фаза) является конечной фазой, когда лиганд уже распределен и концентрация в сыворотке уменьшается, поскольку лиганд выводится из организма пациента. Период полувыведения ΐ-альфа представляет собой период полувыведения для первой фазы, и период полувыведения ΐ-бета представляет собой период полувыведения для второй фазы. Кроме того, для определения периода полувыведения можно использовать некомпартментную модель, хорошо известную в данной области техники.
В одном воплощении в настоящем изобретении предложен продукт слияния или конъюгат согласно изобретению, которые имеют период полувыведения, например, у субъектов-людей в диапазоне примерно 12 ч или более, например, от примерно 12 ч до примерно 21 суток, например, от примерно 24 ч до примерно 21 суток, например, примерно 2-10 суток, например, примерно 3-4 суток.
Продукты слияния или конъюгаты по изобретению также могут быть дополнительно сформатированы для того, чтобы иметь больший гидродинамический размер, например, путем присоединения ПЭГ группы, сывороточного альбумина, трансферрина, рецептора трансферрина или, по меньшей мере, его трансферрин-связывающей части, Рс-области антитела или посредством конъюгирования с доменом антитела.
Гидродинамический размер может быть определен с использованием способов, которые хорошо известны в данной области техники. Например, гель-фильтрационную хроматографию можно использовать для определения гидродинамического размера лиганда. Подходящие гель-фильтрационные матрицы для определения гидродинамических размеров лигандов, такие как сшитые агарозные матрицы, хорошо известны и легко доступны.
Композиции по изобретению, т.е. композиции, содержащие продукты слияния и конъюгаты, описанные в данной заявке, обеспечивают несколько дополнительных преимуществ. Компонент доменное антитело является очень стабильным, небольшим относительно антител и других антигенсвязывающих фрагментов антител, может быть получен с высокими выходами посредством экспрессии в Е. сο1^ или дрожжах (например, РкЫа ра8Шг18), и антигенсвязывающие фрагменты антител, которые связывают сы- 15 021146 вороточный альбумин, можно легко выбрать из библиотек человеческого происхождения или любых желаемых видов. Соответственно, композиции по изобретению, которые содержат бАЬ, которое связывает сывороточный альбумин, можно получить легче, чем терапевтические средства, которые обычно получают в клетках млекопитающих (например, человеческие, гуманизированные или химерные антитела), и можно использовать бАЬз, которые не являются иммуногенными (например, человеческое бАЬ можно использовать для лечения или диагностики заболевания у людей).
Иммуногенность инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства можно уменьшить, когда инсулинотропный агент или инкретин является частью композиции лекарственного средства, которая содержит бАЬ, связывающее сывороточный альбумин. Соответственно, в изобретении предложены композиции продукта слияния или конъюгата, которые могут быть менее иммуногенными (чем, например, один только инсулинотропный агент или инкретин) или которые могут быть, по существу, неиммуногенными в контексте композиции лекарственного средства, которая содержит бАЬ, связывающее сывороточный альбумин. Таким образом, такие композиции можно вводить субъекту повторно в течение времени с минимальной потерей эффективности из-за образования антител против лекарственного средства иммунной системой субъекта.
Кроме того, композиции конъюгата или продукта слияния, описанные в данной заявке, могут иметь профиль повышенной безопасности и незначительные побочные эффекты по сравнению с одним только инсулинотропным агентом или инкретином. Например, в результате связывающей активности бАЬ в отношении сывороточного альбумина продукты слияния и конъюгаты по изобретению имеют повышенное время пребывания в сосудистом кровотоке. Кроме того, продукты слияния и конъюгаты по изобретению, по существу, не способны пересекать гематоэнцефалический барьер и накапливаться в центральной нервной системе после системного введения (например, внутрисосудистого введения). Соответственно, продукты слияния или конъюгаты по изобретению можно вводить с большей безопасностью и уменьшенными побочными эффектами по сравнению с отдельно взятым инсулинотропным агентом или инкретиновым лекарственным средством. Аналогично, продукты слияния или конъюгаты могут иметь пониженную токсичность в отношении конкретных органов (например, почек или печени), чем отдельно взятое лекарственное средство.
Примеры
Пример 1. Экспрессия генетических продуктов слияния ОЬР-1 (А8О) или эксендина-4 и ΌΟΜ7Ε-14 А1ЬибАЬ.
Эксендин-4 или ОЬР-1 (7-37) с аланином в положении 8, замененным на глицин ([О1у8] ОЬР-1), клонировали в виде продукта слияния с ΌΟΜ7Ε-14 (доменное антитело (бАЬ), которое связывает сывороточный альбумин (А1ЬибАЬ) с аминокислотной последовательностью, показанной ниже) в вектор рТТ5 (получаемый от СНКС, Канада). В каждом случае ОЬР-1 или эксендин-4 находился на 5'-конце конструкции, а бАЬ на З'-конце. В целом, получили 7 конструкций (ЭАТ0114, ЭАТ0115, ЭАТ0116, ЭАТ0117, ЭАТ0118, ЭАТ0119, ЭАТ0120) с аминокислотными последовательностями, показанными на фиг. 1 (АО). У них не было ни линкера, §1у-зег линкера (О48), ни спирального линкера (Ага1, К., Н. Иеба, е! а1. (2001). Пез1§п оГ Ле йпкегз \у1йсЬ еГГесЙуе1у зерага!е бошатз оГ а ЫГипсйопа1 Гизюп рго!ет. Рго!ет Епд 14(8): 529-32.456), ни линкера, состоящего из второй ОЬР-1 группировки между ОЬР-1 или эксендином-4 и бАЬ. Линкеры включали в виде спейсеров для разделения в пространстве ОЬР-1 или эксендина-4 от бАЬ для предупреждения пространственного затруднения в связывании между ОЬР-1 или эксендином-4 и рецептором ОЬР-1. Последовательности конструкций представлены на фиг. 1 (А-О).
Свободную от эндотоксина ДНК готовили в Е. сой с использованием щелочного лизиса (используя набор свободной от эндотоксина плазмиды О1§а, получаемый от р1а§еп СА) и использовали для трансфекции клеток НЕК 293Е (получаемых от СНКС, Канада). Трансфекцию проводили в 250-мл флакон на клетках НЕК 293Е при 1,75 х 106 клеток/мл с использованием 333 мкл 293 фектина (1пуйго§еп) и 250 мкг ДНК на флакон, и экспрессию проводили при 30°С в течение 5 суток. Супернатант собирали центрифугированием и очистку проводили посредством аффинной очистки на белке Е. Белок периодически связывали со смолой, упаковывали в колонку и промывали 10 объемами колонки РВБ. Белок элюировали 50 мл 0,1 М глицина рН 2 и нейтрализовали Трис рН 8. Белок ожидаемого размера идентифицировали на ПААГ-ДСН геле, и размеры показаны в табл. 1 ниже.
Таблица 1. Молекулярные массы ОАТ0114, ОАТ0115, ОАТ0116,
ОАТ0117, ОАТ0118, ПАТ0119, ПАТ0120
- 16 021146
Пример 2. Показано, что продукты слияния ОЬР-1 и эксендин-4 А1Ьис1АЬ связывают сывороточный альбумин.
Продукты слияния ОЬР-1 и эксендин-4 А1ЬидАЬ анализировали методом поверхностного плазмонного резонанса (Ыаеоге АВ, полученный от ОЕ НеаЬЬсаге) для получения информации об аффинности. Анализ осуществляли с использованием СМ5 В1аеоге чипа (матрица из карбоксиметилированного декстрана), который был покрыт сывороточным альбумином. Примерно 1000 резонансных единиц (КИ) каждого тестируемого сывороточного альбумина (человеческого, крысиного и мышиного сывороточного альбумина) иммобилизовали в ацетатном буфере рН 5,5. Проточная кювета 1 Вюеоге АВ представляла собой непокрытый, блокированный отрицательным контроль, проточную кювету 2 покрывали человеческим сывороточным альбумином (НБА) (815 КИ), проточную кювету 3 покрывали крысиным сывороточным альбумином (КБА) (826 КИ) и проточную кювету 4 покрывали мышиным сывороточным альбумином (МБА) (938 КИ). Каждую тестируемую слитую молекулу экспрессировали в культуре ткани млекопитающего, как описано в примере выше.
Диапазон концентраций слитой молекулы готовили (в диапазоне от 16 нМ до 2 мкМ) путем растворения в В1АСОКЕ НВБ-ЕР буфере (0,01 М НЕРЕБ, рН 7,4, 0,15 М ЫаС1, 3 мМ ЕПТА, 0,005% сурфактанта Р20) и пропускали через чип В1АСОКЕ.
Аффинность (ΚΏ) расчитывали из кривых В1АСОКЕ путем подгонки кривых скорости ассоциации и скорости диссоциации к кривым, образованным концентрациями с1АЬ в области ΚΏ. Аффинности (ΚΏ) суммированы в следующей табл. 2.
Таблица 2. Связывание ОЬР-1 и эксендина-4 А1ЬийАЬ с человеческим, крысиным и мышиным сывороточным альбумином
Слияние С1_Р-1 (7-37) А8С, спиральный линкер, ООМ7Ь-14 Слияние 2х(С1_Р)-1(7-37) Α8Θ ООМ7К-14
Н8Д 110 нМ 150 нМ
РЗА 800 нМ 700 нМ
МЗА 110 нМ 130 нМ
Вышеприведенные результаты демонстрируют, что слитые молекулы сохраняют способность связываться со всеми типами сывороточного альбумина, и это показывает, что они, по-видимому, имеют пролонгированный период полувыведения ίη νίνο.
Пример 3. Продукты слияния ОЬР-1 и эксендин-4 А1ЬийАЬ активны в анализе связывания рецептора ОЬР-1 (ОЬР-1К ВА).
Продукты слияния подвергали замене буфера на 100 мМ Ыа^, 20 мМ цитрат рН 6,2. При этом клетки СНО 6СКЕ ОЬР1К (клетки СНО Κ1 (получаемые из Американской коллекции типовых культур, АТСС), стабильно трансфицированные 6 сАМР элементом ответа, запускающим люциферазный репортерный ген, а также человеческим рецептором ОЬР-1) сеяли в концентрации 2 х 105 клеток/мл в среду для суспензии. Суспензионную культуру поддерживали в течение 24 ч. Клетки затем разбавляли в 15 мМ НЕРЕБ буфере (получаемом от Бщша), содержащем 2 мМ Ь глутамина (2,5 х 105 клеток/мл), и распределяли в 384-луночные планшеты, содержащие 10 мкл/лунку анализируемого соединения. После добавления аналитического контроля планшеты возвращали в инкубатор на 3 ч при 37°С и 5% СО2. После инкубации в лунки добавляли субстрат для люциферазы з1еайу §1ο (получаемый от Ргошеда), как описано в наборе, и планшеты запечатывали с помощью самоклеющейся пленки для планшетов (АеЬег Магктд Бу§1еш8 1пс., кат. № 607780). Планшеты помещали в считывающее устройство ^1е^1их, Регкт Е1тег) и предварительно инкубировали в течение 5 мин перед считыванием флуоресценции и нанесения результатов на график. Соединение анализировали в диапазоне концентраций в присутствии и в отсутствие 10 мкМ альбумина, позволяя кривой доза-ответ согласовываться с присутствием и отсутствием альбумина. ЕС50 рассчитывали и суммировали в следующей табл. 3.
Таблица 3. Активность продуктов слияния ОЬР-1 и эксендин-4 А1ЬийАЬ в анализе связывания рецептора ОЬР-1 (ОЬР-1К ВА)
С1_Р-1РВА ЕС5о (пМ) п=3 С1-Р-1РВА (альбумин 10 мкМ) ЕС50 (пМ) п=2
продукт слияния эксендина-4 (С43)3 ООМ7И-14 8,9 35
продукт слияния эксендина-4 ООМ7И-14 12 72
продукт слияния эксендина-4, спирального линкера, ООМ7И-14 4,3 15
продукт слияния ΘΙ-Ρ-1 А86, спирального линкера, ООМ7И-14 17 130
СЬР-1 7-36 21 19
эксендин-4 1,0 0,82
Вышеприведенные результаты демонстрируют, что все тестируемые слитые молекулы сохраняют способность связываться с рецептором ОЬР-1. Результаты также демонстрируют, что эта способность сохраняется в присутствии сывороточного альбумина. Отсюда следует, что эти слитые молекулы, вероятно, будут сохранять способность связываться с рецептором ОЬР-1 ίη νίνο.
- 17 021146
Пример 4. Экспрессия БАТ0115, БАТ0116, БАТ0117 и БАТ0120 в клетках млекопитающих НЕК 293 с последующей очисткой посредством афинного захвата белком Ь и ионообменной хроматографии.
Цель данного эксперимента заключалась в продукции белка для характеристики ίη νίνο и ίη νΐίΓο. Белок экспрессировали в культуре ткани млекопитающих в клетках НЕК 293Е с использованием вектора рТТ-5, как описано ранее. Кратко, свободную от эндотоксина ДНК получали, очищали и использовали для трансфекции клеток НЕК 293Е. Белок экспрессировали в течение 5 дней при 30°С в инкубаторе с качалкой и культуры осаждали и собирали супернатант (содержащий исследуемый белок). Белок очищали из супернатанта посредством аффинного захвата на аффинной смоле белок Ь-агароза з!геаш1те (смола ОЕ НеаЕНсаге, белок Ь, конъюгированный производителем). Смолу затем промывали 10 объемами колонки РВ8, и затем белок элюировали 5 объемами колонки 0,1 М глицина рН 2,0. Нейтрализацию осуществляли с помощью 1 объема колонки 1 М трис-глицина, рН 8,0. В этом случае (в отличие от предыдущего примера) осуществляли дополнительную очистку. Белок (в трис-глициновом буфере) подвергали замене буфера на 20 мМ ацетат рН 5,0 перед нанесением с использованием Ак1а на 1 (или 2 параллельно) 6-мл колонок геЕюигсе δ (ОЕ БеаИБсаге), предварительно уравновешенных в 20 мМ ацетате рН 5,0. После промывания тем же буфером белок элюировали посредством градиента 0-0,75 М или 0-1 М №С1 в 20 мМ ацетате рН 5,0. Фракции правильного размера затем идентифицировали с помощью электрофореза в ПААГ -ДСН и масс-спектрометрии и затем объединяли для того, чтобы получить конечный образец белка. Затем в белке меняли буфер на 20 мМ цитрат, рН 6,2, 100 мМ №С1 и концентрировали до концентрации от 0,5 до 5 мг/мл. Белок фильтровали через фильтр 0,2 мкМ для обеспечения стерильности. Затем белок использовали в примерах, описанных ниже.
Пример 5. Сравнение устойчивости БАТ0115, БАТ0116, БАТ0117 и БАТ0120 к 1, 3 и 6 циклам замораживания-оттаивания.
Цель этого исследования заключалась в сравнении устойчивости БАТ0115, БАТ0116, БАТ0117 и БАТ0120 к 1, 3 и 6 циклам замораживания-оттаивания. Каждый белок экспрессировали в культуре ткани млекопитающего в клетках НЕК 293Е с вектора рТТ-5 и очищали на аффинной смоле с белком Ь с последующей ионообменной хроматографией, как описано выше. В белке заменяли буфер на 20 мМ цитрат, 100 мМ №С1 и разбавляли до 0,5 мг/мл с использованием того же буфера. 0,5 мл Аликвоты каждого белка (в пробирках Эппендорф) затем подвергали 0, 1, 3 или 6 циклам замораживания-оттаивания, где каждый цикл длится 3 мин на сухом льду и затем 2 мин в 37°С водяной бане. (Во время эксперимента наблюдали, что 2 мин при 37°С достаточно для полного оттаивания белкового раствора.) После завершения требуемого числа циклов замораживания-оттаивания образцы белка хранили при 2-8°С до последующего анализа. Белки затем подвергали анализу с помощью электрофореза в ПААГ-ДСН, анализа связывания ОБР-1К, эксклюзионной хроматографии на колонке Зирегйех 75 и масс-спектрометрии. Наблюдали, что профиль ПААГ-ДСН, активность в ОБР-1К ВА и профиль масс-спектрометрии всех четырех белков, по существу, не менялись относительно исходного уровня в результате 1, 3 или 6 циклов замораживания-оттаивания. Максимальная высота пика в 8ЕС (эксклюзионная хроматография) анализе менялась на 78, 86, 104 и 57% от максимальной высоты, поддерживаемой после 6 циклов замораживанияоттаивания для БАТ0115, БАТ-116, БАТ0117 и БАТ0120, соответственно. Установили, что БАТ0120 было менее устойчивым к циклам замораживания-оттаивания, чем три других белка.
Таблица 4. Результаты сравнения устойчивости БАТ0115, БАТ0116,
БАТ0117 и РАТ0120 к 1, 3 и 6 циклам замораживания-оттаивания
Образец Число циклов замораживания- оттаивания Высота пика (тАи) % максимальной высоты пика
ЭАТ0115 0 49 100%
ЭАТ0115 1 43 89%
ЭАТ0115 3 40 82%
ЭЛТОН 5 6 38 78%
ЭАТ0116 0 29 100%
ЭАТ0116 1 28 95%
ЭАТ0116 3 26 91%
ЭАТ0116 6 25 86%
ЭАТ0117 0 34 100%
ЭАТ0117 1 34 99%
ЭАТ0117 3 35 103%
ЭАТ0117 6 35 104%
ЭАТ0120 0 0 35 100%
ЭАТ0120 1 1 24 70%
ЭАТ0120 3 3 21 59%
ЭАТ0120 6 6 20 57%
шАИ - единица оптической плотности
Пример 6. Демонстрация продолжительности действия БАТ0115 в модели диабета II типа на мышах ЙЬМЬ.
Цель этого исследования заключалась в определении продолжительности действия БАТ0115 на пероральную толерантность к глюкозе у мышей ЙЬМЬ. Животных сортировали по уменьшению уровней глюкозы за три дня до начала эксперимента и затем блокировали. Одно животное в пределах каждого
- 18 021146 блока направляли в каждую из 26 групп исследования. Это обеспечивало сходный средний начальный уровень глюкозы в каждой исследуемой группе.
ΌΑΤ0115 (полученный в клетках НЕК 293 и очищенный, как описано выше) вводили подкожно по 1, 0,3 или 0,1 мг/кг за 5, 24, 48, 72, 96 или 120 ч до пероральной нагрузки глюкозой. (Не все дозы вводили в каждую временную точку, см. в таблице ниже для деталей). ΌΑΤ0115 значительно уменьшало АИС для глюкозы в течение 2 ч теста на пероральную толерантность к глюкозе (ΘΟΤΤ) по сравнению с мышами ЙЬ/ЙЬ, обработанными носителем, за пределами и включая 24 ч для доз 0,1 и 0,3 мг/кг и за пределами и включая временную точку 72 ч для дозы 1 мг/кг.
Эксендин-4, вводимый в качестве положительного контроля при 42 мкг/кг, также значительно уменьшал АИС для глюкозы после 0ΘΤΤ при введении за 5 ч до перорального болюса глюкозы. В табл. 5 ниже показано процентное уменьшение АИС для каждой из исследуемых групп ΌΑΤ0115 по сравнению с носителем. Звездочка указывает Р<0,05 для сравнения ^ΑΤ0115 с носителем с использованием коррекции уровня ложноположительных результатов.
Таблица 5. Демонстрирует процентное уменьшение АИС для каждой из исследуемых групп ^ΑΤ0115 по сравнению с носителем. (Звездочка указывает Р<0,05 для сравнения □АННк с носителем с использованием коррекции уровня ложноположительных результатов)
Время ОСТТ (часы 0,1 мг/кг 0,3 мг/кг 1 мг/кг
относительно дозирования) ΩΑΤ0115 ОАТ0115 ЭАТ0115
+5 60%* Не делали 76%*
+24 36%* 59%* 50%*
+48 28% 26% 37%*
+72 16% 26% 41 %*
+96 -12% Не делали 12%
Пример 7. Демонстрация эффективности □АННк в мышиной модели ожирения, индуцированного диетой (ΌΙ0).
Цель данного исследования заключалась в применении признанной мышиной модели питания (мыши с ожирением, индуцированным диетой) для того, чтобы определить, влияет ли обработка с помощью НАТО 115 на потребление пищи и, в результате, на массу тела. Это может быть прогнозом для людей. Самцов мышей С57Ы/6 (приобретенных у Ταοοπΐο) содержали на 60% ккал диете, содержащей обогащенную жирами и облученную пищу, в течение 12 недель и затем переводили в лабораторное помещение. По прибытии мышей индивидуально размещали на а1рНа-йп подстилках в комнате с контролируемой температурой и влажностью (70-72°Т (21,1-22,2°С), влажность = 48-50%, световой цикл с 5 утра до 5 вечера). Диету меняли на диету, содержащую до 45% жиров, и животных подвергали акклиматизации в течение 18 суток. Перед введением тестируемого соединения мышам подкожно инъецировали физиологический раствор один раз в сутки в течение трех суток и контролировали потребление пищи. Мышей отгораживали и группировали таким образом, чтобы масса тела и потребление пищи не отличались между группами и в пределах групп. В сутки исследования группам из 8 мышей вводили подкожно дозы следующим образом, используя объем инъекции 5 мл/кг. Трем группам вводили ОАТО^ (низкую, среднюю и высокую дозу), одной группе молекулу, являющуюся отрицательным контролем (Ό0Μ7Η-14 А1ЬийАЬ, но без эксендин-4 конъюгата), и одной группе - положительный контроль в отношении эксендина-4.
Таблица 6. Протокол для определения эффективности ^ΑΤ0115 в мышиной модели ожирения в случае ожирение, индуцированного диетой (ΌΙ0)
Группа Вводимое соединение Уровень дозы
1 Отрицательный контроль: ООМ7Н-14 в 100 мМ ЫаС1, 20 мМ цитрат/цитрат натрия рН 6,2 1 мг/кг
2 Эксендин-4 0,01 мг/кг
3 ОАТ0115 в 100 мМ №С1, 20 мМ цитрат/цитрат натрия рН 6,2 0,01 мг/кг
4 ОАТ0115 в 100 мМ №С1, 20 мМ цитрат/цитрат натрия рН 6,2 0,1 мг/кг
5 ОАТ0115 в 100 мМ №С1, 20 мМ цитрат/цитрат натрия рН 6,2 1 мг/кг
Суточное потребление пищи и массу тела измеряли ежесуточно в течение 10 суток. ^ΑΤ0115 показал дозозависимое уменьшение массы тела и потребление пищи по сравнению с Ό0Μ7Η-14 контролем (см. фиг. 3а и 3Ь). Поэтому можно заключить, что данные из этого исследования на мышах подтверждают гипотезу, что ^ΑΤ0115 может быть хорошим клиническим кандидатом.
Пример 8. Определение периода полувыведения из плазмы ^ΑΤ0115, ^ΑΤ0116 и ^ΑΤ0117 в мышиной модели диабета ΙΙ типа.
Цель данного исследования заключается в определении профиля элиминации из плазмы □АНИкТ ^ΑΤ0116 и ^ΑΤ0117 в мышиной модели диабета ΙΙ типа (ЙЬ/ЙЬ мыши) и вычислении РК параметров на основании результатов. ^ΑΤ0115, ^ΑΤ0116 и ^ΑΤ0117 белок готовили, как описано ранее. Кратко, белок экспрессировали в культуре ткани млекопитающего с использованием клеток НЕК 293Е и очищали с использованием периодической абсорбции на афинной смоле рго!ет Ь-адагозе с последующей элюцией
- 19 021146 глицином при рН 2,0 и нейтрализацией с помощью Трис рН 8,0. За этим следовала ионообменная хроматография на колонке Кезоигее δ с использованием 0-1 М солевого градиента в 20 мМ ацетате рН 5,0. Фракции, содержащие желаемый белок, затем объединяли, и буфер меняли на 100 мМ №С1, 20 мМ цитрат рН 6,2. Белок стерилизовали фильтрованием, меняли буфер, удаляли эндотоксин и тестировали перед использованием ίη νίνο.
Группам неголодающих самцов мышей с!Ь/с!Ь (гомозиготные мыши ЬЕРг с!Ь с недостаточностью лептинового рецептора в связи с мутациями в гене лептинового рецептора (1ерг)) вводили либо подкожно, либо внутривенно 1 мг/кг ΏΆΤ0115, ΏΆΤ0116 или ΏΆΤ0117. В предварительной дозе через 0,25, 0,5, 1, 4, 7, 12, 24, 36, 48 и 60 ч после введения внутривенных доз и предварительной дозе через 0,5, 1, 4, 7, 12, 24, 36, 48 и 60 ч после введения подкожных доз собирали образцы крови посредством терминального забора крови и получали плазму. Образцы плазмы замораживали и позднее размораживали для анализа уровней ΏΆΤ0115, ΏΆΤ0116 или ΏΆΤ0117 по мере необходимости посредством твердофазной экстракции и ЬС/Μδ/Μδ (жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией) для определения присутствия фрагмента белка (из эксендин-4 участка белка). Вычисленные уровни в плазме затем использовали для подгонки фармакокинетических параметров с использованием программного обеспечения νίηΝοηΜη. Период полувыведения после подкожного и внутривенного введения и биодоступность представлены в таблице ниже. На основании результатов сделали вывод (см. табл. 7 ниже), что все три соединения демонстрируют желаемые фармакокинетические параметры в мышиной модели диабета II типа. Поэтому эти молекулы демонстрируют потенциал хороших РК параметров у людей, больных диабетом, в этом исследовании в пользу выбора ΏΆΤ0115 или ΏΆΤ0116 относительно ΏΆΤ0117.
Таблица 7. Период полувыведения из плазмы ΏΆΤ0115, ΏΆΤ0116 и ΏΆΤ0117 в мышиной модели диабета II типа
Пример 9. Определение периода полувыведения из плазмы ΏΆΤ0115, ΏΆΤ0116, ΏΆΤ0117 у крыс.
Цель данного исследования заключается в определении профиля элиминации из плазмы ΏΆΤ0115, ΏΆΤ0116 и ΏΆΤ0117 у крыс и вычислении РК параметров на основании этих результатов. ΏΆΤ0115, ΏΆΤ0116 и ΏΆΤ0117 белок получали, как описано ранее. Кратко, белок экспрессировали в культуре ткани млекопитающего с использованием клеток ΗΕΚ 293Е и очищали с использованием периодической абсорбции на афинной смоле рго!ет Ь-адагозе с последующей элюцией глицином при рН 2,0 и нейтрализацией с помощью Трис рН 8,0. За этим следовала ионообменная хроматография на колонке Кезоигее δ с использованием 0-1 М солевого градиента в 20 мМ ацетате рН 5,0. Фракции, содержащие желаемый белок, затем объединяли и буфер меняли на 100 мМ №С1, 20 мМ цитрат рН 6,2. Белок стерилизовали фильтрованием, буфер заменяли и тестировали (рСеф перед применением ίη νίνο.
Для того чтобы определить период полувыведения из плазмы, группам из 3 крыс делали однократную в/в или п/к/ инъекцию по 0,3 мг/кг (в/в) или 1,0 мг/кг (п/к) ΏΆΤ0115, ΏΆΤ0116 или ΏΆΤ0117. Образцы плазмы получали путем периодического отбора крови из хвостовой вены в течение 72 ч и анализировали посредством ЬС/Μδ/Μδ для определения присутствия фрагмента продукта слияния (из эксендин-4 части продукта слияния). Вычисленные уровни в плазме затем использовали для подгонки фармакокинетических параметров с использованием программного обеспечения νίηΝοηΓίη. Период полувыведения после подкожного и внутривенного введения и биодоступность представлены в табл. 8 ниже. На основании этих результатов сделали вывод, что все три соединения демонстрируют желаемые фармакокинетические параметры у крысы. Поэтому все эти молекулы демонстрируют потенциал для хороших РК параметров у людей в этом исследовании в пользу выбора ΏΆΤ0115 относительно ΏΆΤ0116 или
ΏΆΤ0117.
Таблица 8. Период полувыведения после подкожного и внутривенного введения и биодоступность
Соединение Период полувыведения после внутривенного введения Период полувыведения после подкожного введения Биодоступность
ОАТ0115 4,9 ч 11,1 ч 81%
ϋΑΤ0116 4,1 ч 8,7 ч 32%
ϋΑΤ0117 4,9 ч 10,2ч 15%
Пример 10. Определение периода полувыведения из плазмы ΏΆΤ0115 у яванского макака.
Цель данного исследования заключалась в определении фармакокинетических параметров для
ΏΆΤ0115 у примата, не являющегося человеком (яванский макак), для обеспечения аллометрического
- 20 021146 измерения параметров и наилучшего возможного указания, имеет ли ΌΑΤ0115 подходящий РК профиль у людей. Продукт слияния ΌΑΤ0115 эксендин-4 Л1ЬийЛЬ экспрессировали в клетках НЕК 293Е в культуре ткани млекопитающего и очищали, как описано ранее. Кратко, белок очищали с использованием периодической абсорбции на афинной смоле рго!ет Б-адагозе с последующей элюцией глицином при рН 2,0 и нейтрализацией с помощью Трис рН 8,0. За этим следовала ионообменная хроматография на колонке Кезоигсе δ с использованием 0-1 М солевого градиента в 20 мМ ацетате рН 5,0. Фракции, содержащие желаемый белок, затем объединяли и буфер меняли на 100 мМ ЫаС1, 20 мМ цитрат рН 6,2.
Белок всесторонне тестировали (рСеб) (включая ПААГ-ДСН, масс-спектрометрию, анализ активности: ОЕР-1К-ВА, проверку рН, проверку осмолярности), стерилизовали фильтрованием и удаляли эндотоксин. Белок с подтвержденным низким эндотоксином (менее 0,05 Еи (единицы эндотоксина)/мг белка) использовали для исследования ΐπ νίνο.
В этом исследовании использовали шесть самок яванского макака (Масаса £азс1си1апз; Сйаг1ез КАег БаЬога1ог1ез ВКЕ, Ноиз1оп, ΤΧ, Рпша1е Ргобис1з, М1аш1, ЕБ и/или Сονаηсе Кезеагсй Ргобис1з, 1пс., Айсе, ΤΧ). Обезьяны были приблизительно в возрасте 2-9 лет (с диапазоном массы тела приблизительно 2-5 кг) в начале введения доз. Обезьян размещали индивидуально в клетках из нержавеющей стали в помещении^) с регулируемыми характеристиками окружающей среды (64Е-84Е; 30-70% относительной влажности) с 12-часовым циклом свет/темнота. Самкам обезьян давали приблизительно 6 штук печенья дважды в сутки из диеты для обезьян #5038 (РМ1 Ыи1гШоп 1п1егпа1юпа1, Кюйшопб, ΙΝ) и ежесуточную долю свежих фруктов. Каждому животному вводили исследуемое соединение (ΌΑΤ0115) либо подкожно, либо внутривенно согласно дозовой группе (3 п/к и 3 в/в). Доза составляла 0,1 мг/кг. В сутки введения дозы первое кормление происходило в течение приблизительно 1 ч после дозы для каждой обезьяны (растягивалось вплоть до 2,5 ч после введения дозы, если связанные с исследованием процедуры требовали отсутствия животных в месте их локального размещения в течение длительного периода времени). Второе кормление проводили не ранее чем через 2 ч после первого кормления. В целях обогащения среды каждую обезьяну обеспечивали дополнительными фруктами, бобовыми и/или овощами (например, виноградом, морковью, арахисом) во время или примерно во время проверки жизнеспособности или в качестве награды после акклиматизации или процедур, связанных с исследованием. Фильтрованная водопроводная вода (поставляемая Ациа Репизукаша, 1пс. и периодически анализируемая) была доступна без ограничений.
Образцы плазмы (приблизительно 2 мл) собирали из бедренного сосуда перед введением дозы (0 ч) и через примерно 5 мин (только в/в группа), 0,5, 4, 8, 24, 48, 96, 144, 192, 288, 336, 504 и 672 ч после введения дозы. (РК образцы у одного из животных в в/в группе были собраны к 24 ч, таким образом это животное было исключено из аппроксимации РК.) Анализ образцов проводили с помощью массспектрометрии и подгонку данных осуществляли с использованием программного обеспечения \ΥίπШпЫп. РК параметры были следующими для в/в введения (п=2): Τί/2 67 ч, ΜΚΤ 46 ч, νζ 327 мл/кг и С1 3,3 мл/ч/кг и для п/к введения (п=3): Т1/2 68 ч, ΜΚΤ 98 ч, νζ 306 мл/кг и С1 3,1 мл/ч/кг. Биодоступность вычислили как 99%.
На основании этого исследования сделали вывод (а также из данных по Ыасоге связыванию с сывороточным альбумином яванского макака и человека), что 68 ч п/к период полувыведения ΌΑΤ0115 у яванского макака (как описано выше) подтверждает, что период полувыведения той же молекулы у людей, по-видимому, будет достаточно продолжительным, чтобы коррелировать с требованием еженедельного (или менее частого) введения дозы.
Пример 11. Определение РИ ΌΑΤ0115 у яванского макака.
Исследование РК проводили на яванском макаке, как описано выше. Основная цель этого исследования заключалась в определении фармакокинетических параметров для ΌΑΤ0115 у яванского макака (как описано в предыдущем примере), но вторая цель состояла в получении доказательства эффективности ΌΑΤ0115 соединения у обезьян (без достаточной статистической значимости исследования). Для достижения этой второй цели во время исследования контролировали потребление обезьянами печенья. Было отмечено, что в следующие сутки после введения дозы наблюдалась тенденция уменьшения потребления пищи у всех обезьян. Сделали вывод, что это было вызвано, вероятно, хорошо документированным эффектом эксендин-4 части молекулы как средства для подавления аппетита. Таким образом, было показано, что ΌΑΤ0115 является активным ш νινί). Для обеспечения благополучия животных фрукты и угощения потреблялись в течение большинства суток, несмотря на потребление печенья.
Таблица 9. Измерение печенья, потребляемого ежедневно яванским макаком (вместе с дозой ΌΑΤ0115 на сутки 1)
Доза Сутки- 2 Сутки- 1 Сутки 1 Сутки 2 Сутки 3 Сутки 4 Сутки 5 Сутки 6 Сутки 7
0,1 мг/кг (в/в) 12 12 6 3 9 12 12 12 12
0,1 мг/кг (в/в) 12 12 0 1 0 4 6 10 11
0,1 мг/кг (в/в) 12 12 0 0 0 0 1 6 6
0,1 мг/кг (п/к) 12 12 5 0 4 11 7 11 12
0,1 мг/кг (п/к) 12 12 12 0 2 12 12 12 12
0,1 мг/кг (п/к) 12 12 11 12 11 12 8 12 12
- 21 021146
Пример 12. Продукт слияния ЭАТ0115 эксендин-4 А1Ьи6АЬ связывает сывороточный альбумин крысы, яванского макака и человека с использованием поверхностного плазмонного резонанса.
ЭАТ0115 экспрессировали, очищали и затем анализировали методом поверхностного плазмонного резонанса (Ыасоге, 0Е НеаННсаге) для получения информации об аффинности. Анализ осуществляли с использованием стрептавидинового чипа (8А), покрытого биотинилированным сывороточным альбумином. 200-1000 резонансных единиц (Ки) каждого сывороточного альбумина иммобилизовывали на чипе. Проточная кювета 1 была без покрытия, проточную кювету 2 покрывали Н8А, проточную кювету 3 покрывали К8А и проточную кювету 4 покрывали С8А. Готовили диапазон концентраций продукта слияния (в диапазоне от 15,6 нм до 2 мкМ путем разбавления в В1АСОКЕ НВ8-ЕР буфере (0,01 М НЕРЕ8, рН 7,4, 0,15 М №С1, 3 мМ ЕЭТА, 0,005% сурфактанта Р20) и пропускали через В1АСОКЕ чип.
Аффинность (ΚΌ) рассчитывали на основании В1АСОКЕ кривых путем подгонки кривых скорости ассоциации и скорости диссоциации с кривыми, полученными для концентраций 6АЬ в пределах ΚΌ. Аффинности (ΚΌ) представлены в следующей таблице.
Т аблица 10. Аффинность (ΚΌ) для ЭАТ0115
Типы сывороточного альбумина ϋΑΤ0115
Н5А 600 нМ
Β5Α 2 мкМ
СЗА 2 мкМ
Пример 13. Характеристика тепловой денатурации ЭАТ0115 посредством дифференциальной сканирующей калориметрии (Э8С).
Цель данного эксперимента состояла в контролировании тепловой денатурации ЭАТ0115 посредством Э8С (дифференциальная сканирующая калориметрия) с использованием капиллярного клеточного микрокалориметра УР-Э8С (М1сгоса1), оснащенного автоматической пипеткой. Белок диализовали в течение ночи в 20 мМ цитрата рН 6,2, 100 мМ №С1, фильтровали и затем доводили до концентрации 1 мг/мл, как определено по поглощению при 280 нм. Профильтрованный диализный буфер использовали в качестве стандарта для всех образцов. Э8С осуществляли при скорости нагревания 180°С/ч. Перед этим каждый образец в растворе подвергали деконтаминации (дегазации) до 1%, и затем вводили буфер для очистки клеток и обеспечения фонового уровня аппарата. Полученные кривые анализировали с использованием программного обеспечения Олдт 7 М1сгоса1. Э8С кривую, полученную для стандарного буфера, вычитали из кривой для образца. Точную молярную концентрацию образца использовали для вычислений (выполняемых автоматически с помощью Опдт). Базовые параметры для верхних и нижних базовых линейных участков до/после перехода выбирали и соединяли с использованием кубической функции связывания. Полученный график соответствует необратимой модели двух состояний (поп-2-з!а!е то6е1), дающей кажущуюся Тпл. и значения ЛНЛНу.
Кривая для ЭАТ0115 соответствовала модели необратимого поп-2-з1а1е перехода, с приблизит. Тпл. 56,3°С. Критерий согласованности был удовлетворительным (см. фиг. 4). Контрольная кривая для лизоцима, полученная с использованием того же оборудования, давала данные подходящего качества, как ожидалось с хорошим соответствием. (Приблизит. Тпл., полученная для лизоцима, составляла 76,2°С, что согласуется с литернатурными данными (см. фиг. 5).) Таким образом, сделали вывод, что эксперимент обеспечил надежные данные, показывающие, что ЭАТ0115 представляет собой молекулу с температурой плавления 56,3°С, что является приемлемым для клинического кандидата.
Пример 14. Характеристика ЭАТ0115, ЭАТ0117 и ЭАТ0120 в состоянии раствора посредством 8ЕС МАЬЬ8.
Цель данного эксперимента заключалась в определении состояния ЭАТ0115, ЭАТ0117 и ЭАТ0120 в растворе посредством 8ЕС МАЬЬ8. Образцы очищали и диализовали в соотвествующем буфере (РВ8) и фильтровали после диализа, определяли концентрацию и доводили до 1 мг/мл. В8А и Н8А приобретали в 81§та и использовали без дополнительной очистки.
Детали оборудования
Систему 8Ыта6/и ЬС-20АО Рготтепсе НРЬС (высокоэффективная жидкостная хроматография) с автоматическим пробозаборником (81Б-20А) и детектор 8РЭ-20А Рготтепсе υν/νΐδ соединяли с ШуаП Мт1 Г)а\уп Тгеоз (МАЬЬ8, детектор многоуглового лазерного светорассеяния) и детектором ШуаИ ОрИ1аЬ гЕХ ΌΚΙ (дифференциальный показатель преломления). Детекторы соединяли в следующем порядке Ь8-иУ-К1. Оба измерительных прибора ΚΙ и Ь8 работают при длине волны 488 нм. Использовали колонки Т81<2000 (ТозоН корпорация) или Вю8ер2000 (РНепотепех) (обе колонки НРЬС на основе диоксида кремния с похожим диапазоном разделения, 1-300 кДа) с подвижной фазой 50 или 200 мМ фосфатного буфера (с солью или без нее), рН 7,4 или 1 х РВ8. Используемая скорость потока составляла 0,5 или 1 мл/мин, время прохождения корректировали для отражения различных скоростей потока (45 или 23 мин) и предполагают, что это не будет оказывать значительного влияния на разделение молекул. Белки готовили в РВ8 в концентрации 1 мг/мл и объем инжекции составлял 100 мкл. Детектор светорассеивания калибровали с помощью толуола согласно инструкциям производителя. Вывод υν детектора и вывод ΚΙ детектора соединяли с прибором измерения светорассеяния таким образом, чтобы сигналы от всех трех
- 22 021146 детекторов можно было одновременно собирать с помощью программного обеспечения Шуа!! А8ТКА. Несколько инжекций В8А в подвижную фазу ΡΒ8 (0,5 или 1 мл/мин) пропускали через колонку То8оН Т8К2000 с получением υν, Ь8 и ΚΙ сигналов, собираемых с помощью программного обеспечения Шуа!!. Кривые затем анализировали с использованием программного обеспечения А8ТКА, и сигналы нормировали, выравнивали и корректировали с учетом уширения полосы согласно инструкциям производителя. Калиброванные константы затем усредняли и вводили в качестве эталона, который использовали для следующих образцов.
Расчеты абсолютной молярной массы
100 мкл 1 мг/мл Образца вводили в соответствующую предварительно уравновешенную колонку. После 8ЕС колонки образец пропускали через 3 последовательных детектора: υν, УА1.1.8 (многоугловое лазерное светорассеяние) и ΌΚΙ (дифференциальный показатель преломления), позволяющих определить абсолютную молярную массу. Разбавление, которое происходит на колонке, составляет примерно 10 раз, поэтому концентрация, при которой определяют состояние в растворе, составляет 100 мкг/мл или примерно 8 мкМ 6АЬ.
Основа расчетов в А8ТКА, а также метода построения графиков по Зимму (21тт), который часто осуществляют в периодическом методе анализа образцов, представляет собой уравнение из 21тт (I. СНет. ΡΗγ8. 16, 1093-1099 (1948))
- .ΜΡΐβ! - 2Л.сМ}Рг1§1 кс (Ур. 1) где с представляет собой концентрацию по массе растворенных молекул в растворителе (г/мл);
М представляет собой средневзвешенную молярную массу (г/моль);
А2 представляет собой второй вириальный коэффициент (моль мл/г2);
К* = 4р2-по2· (бп/бс)2·^’4·^'1 представляет собой оптическую константу, где п0 представляет собой показатель преломления растворителя при длине волны падающего излучения (вакуум), 10 представляет собой длину волны падающего излучения (вакуум), выраженную в нанометрах, представляет собой число Авогадро, равное 6,022 х 1023 моль-1, и бп/бс представляет собой приращение дифференциального показателя преломления раствора растворитель-растворенное вещество применительно к изменению концентрации растворенного вещества, выраженному в мл/г (этот фактор должен быть измерен независимо с использованием 6ΚΙ детектора).
Ρ(ς) представляет собой теоретически полученный формфактор, приблизительно равный
- 2/г 6а / 31+- /л) ' ' ; , где ( , и <г2> представляет собой среднеквадратичный радиус. Ρ(ς) представляет собой функцию ζсреднего размера, формы и структуры молекул.
представляет собой избыточное отношение Рэлея (см-1).
Данное уравнение предполагает вертикально поляризованный падающий свет и справедливо для порядка с2.
Для выполнения расчетов по методу выравнивания Зумма, который соответствует
Κς/К-с против 8т2(ц/2), необходимо разложить соответствующее ур. 1 первого порядка по с.
Для выполнения расчетов по методу выравнивания Зумма, который соответствует
Κς/К-с против 8т2(д/2), необходимо разложить соответствующее ур. 1 первого порядка по с:
Соответствующие результаты в этом случае представляют собой
Расчеты выполняли автоматически с помощью программного обеспечения А8ТКА с получением графика с молярной массой, определенной для каждого из срезов (8Нсе8) (пособие А81га).
Молярную массу, полученную из графика для каждого из пиков, наблюдаемую на хроматографии, сравнивали с ожидаемой молекулярной массой одной единицы белка. Это позволяет сделать вывод относительно состояния белка в растворе.
- 23 021146
Экспериментальные данные
ΌΆΤ0115
100 мкл 1 мг/мл ΌΆΤ0115 вводили в колонку §црегйех 200, уравновешенную в 20 мМ цитрата, 0,1 М ЫаС1, рН 6,2. Скорость потока установили на 0,5 мл/мин. Белок, элюированный в одном пике, с МШ (молекулярная масса) по всей ширине пика, составляет 17,4 кДа (ожидаемая МШ для мономера составляет 16,9 кДа). Эффективность элюции составляет 100%. См. фиг. 6. (Контроль Н8Л вел себя, как ожидалось, подтверждая экспериментальные результаты для ΌΆΤ0115. Он элюировался в виде двух пиков с МШ 64 кДа (мономер) и 110 кДа (димер). МШ димера Н8Л может быть не очень точной в связи с очень маленьким количеством белка в пределах этого пика).
ΌΆΤ0117
100 мкл 1 мг/мл ΌΆΤ0117 вводили в колонку Τ8Κ2000, уравновешенную в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4. Скорость потока установили на 1 мл/мин.
Примерно 50% инжектируемого количества ΌΆΤ0117 элюировалось с колонки в двух перекрывающихся пиках с МШ примерно 35-45 кДа (димер и выше), что демонстрирует сильную самоассоциацию в условиях, тестируемых в данной заяке. (Контроль В8А вел себя, как ожидалось, подтверждая экспериментальные результаты для ΌΆΤ0117, давая два пика с молярной массой 61 и 146 кДа (мономер и димер.) См. фиг. 7 в отношении результатов 8ЕС Ма1.
ΌΆΤ0120
100 мкл 1 мг/мл ΌΆΤ0117 вводили в колонку Τ8Κ2000, уравновешенную в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4. Скорость потока установили на 1 мл/мин. Примерно 50% инжектируемого количества ΌΆΤ0120 элюировалось с колонки СР в виде слегка ассиметричного пика с МШ, определенным как примерно 25 кДа. Это указывает на самоассоциацию ΌΆΤ0120 в условиях, тестируемых в данной заяке, белок, по-видимому, находится в быстром мономер-димерном равновесии. (Контроль В8Л вел себя, как ожидалось, подтверждая экспериментальные результаты для ΌΆΤ0120, давая два пика с молярной массой 61 и 146 кДа (мономер и димер).) См. фиг. 8 в отношении результатов 8ЕС Ма1.
На основании вышеизложенных экспериментов сделали вывод, что ΌΆΤ0115 демонстрирует значительно меньшую (возможно, никакую) самоассоциацию в условиях, используемых в данной заявке, по сравнению с двумя другими молекулами, которые демонстрируют значительную самоассоциацию. Мономерное состояние в растворе может быть предпочтительным относительно действия ш νί\Ό и предшествующего и последующего процесса во время получения, поэтому ΌΆΤ0115 может быть наиболее идеальной молекулой для клинического продвижения, что касается состояния в растворе.
Пример 15. Очистка после экспрессии в клетках млекопитающих без использования аффинной матрицы с белком Ь
Оба ΌΆΤ0120 и ΌΆΤ0115 очищали из супернатантов НЕК 293. Каждый белок экспрессировали в культуре ткани млекопитающего в клетках НЕК 293Е с вектора рТТ-5. 1 мл Колонку со смолой МЕР Нурегсе1 уравновешивали РВ8, промывали 0,1 М гидроксидом натрия и затем повторно уравновешивали РВ8. 200 мл Супернатанта наносили на колонку при 2,5 мл/мин и затем колонку промывали РВ8 и элюировали 0,1 М глицином, рН 2.
После элюции образец нейтрализовали путем добавления 1/5й объема 1 М Трис, рН 8, и хранили при комнатной температуре. Образец демонстрировал слабую преципитацию после хранения и его фильтровали с использованием стерильного устройства перед обессоливанием.
Две обессоливающие колонки 26/10 ШРгер уравновешивали 20 мМ ацетатом натрия, рН 5 (измеренный рН 5,3) при 10 мл/мин, промывали путем добавления 0,1 М ЫаОН и повторно уравновешивали 20 мМ ацетатом натрия, рН 5.
ΌΆΤ0115 подвергали обессоливанию в 20 мМ ацетата натрия, рН 5, перед нанесением на 1 мл Н1Τπφ 8РРР, уравновешенную в 20 мМ ацетата натрия, рН 5 (фактически 5,2). После промывания колонки его подвергали 0-100% градиенту с 20 мМ ацетатом натрия, рН 5, 1 М ЫаС1, и элюированные фракции с поглощением выше 5 тАик (единицы оптической плотности) собирали и анализировали с помощью ПААГ-ДСН.
После хранения 8Р РР фракций в течение ночи образец фильтровали через 0,2-мкм мембрану и наносили на обессоливающие колонки 2X26/10 ШРгер, уравновешенные в 20 мМ цитрата натрия, рН 6,2, 100 мМ ЫаС1. Элюат концентрировали в 20 мл центрифужном концентраторе, стерилизовали фильтрованием и тестировали на эндотоксин при разведениях 1/10 и 1/200.
Эндотоксин тестировали в двух разведениях, разведение 1/10 дало значение 30 ЕИ/мл со степенью извлечения 250. Тест 1/200 дал значение менее 10,8 ЕИ/мл со степенью извлечения 126%. Образец подвергали М8 (масс-спектрометрия) анализу с использованием ГО 27823. Наблюдались низкие уровни примесей, видимые ниже 80 кДа маркера и между 110-160 кДа маркерами при высокой нагрузке. Чистота образца составляла более 95%.
Пример 16. Экспрессия и очистка генетических продуктов слияния эксендина-4 и ИОМ7Й-1410ГООМ7Й-11-15 Л1ЬийЛЬ
Цель данного эксперимента заключалась в эффективной экспрессии ИМ87139 и ИМ87143. ИМ87139 представляет собой продукт слияния эксендина-4 с ИОМ7Й-14-10 (доменное антитело (ЙАЬ),
- 24 021146 которое связывает сывороточный альбумин, также известное как А1ЬийАЬ ТМ), и ΌΜ87143 представляет собой продукт слияния эксендина-4 с ΌΘΜ7Η-11-15 (доменное антитело (йАЬ), которое связывает сывороточный альбумин, также известное как А1ЬийАЬ) в Е. сой с правильно процессированными Ν-концами. Продукт слияния затем может быть протестирован в отношении активности эксендин-4 части и А1ЬийАЬ части в следующих экспериментах.
Эксендин-4 клонировали в виде продукта слияния с ΌΘΜ7Ε-14-10 или ΌΘΜ7Ε-11-15, где эксендин4 пептид находился на 5'-конце конструкции, а А1ЬийАЬ на З'-конце. В целом получили две конструкции, где каждая включает (С1у4§ег)3 линкера между эксендин-4 пептидом и А1ЬийАЬ. Линкер включали в качестве спейсера для пространственного отделения эксендина 4 от йАЬ для предупреждения стерического затруднения при связывании между эксендином-4 и рецептором СЬР-1. Последовательности конструкций показаны на фиг. 1(т) и 1(п). Чтобы обеспечить клонирование в экспрессирующий вектор, продукты слияния получали в виде совокупности ПЦР-продуктов (аззетЬ1у РСКз) с сайтом рестрикции для №е1 на 6'-конце, затем модифицированным сигнальным пептидом ОтрТ (аминокислотная последовательность ОтрТ ААА представлена на фиг. 1(ц). §ЕЦ ГО N0: 28) и с сайтом для ВатН1 на З'-конце. Сигнальный пептид ОтрТ ААА имеет последние три кодона, измененные из дикого типа в ОСТТОООСС (показан на фиг. 2(р): §ЕЦ ГО N0: 33), который кодирует ААА вместо 8РА. Это изменение улучшает процессинг в правильном сайте с помощью сигнальной пептидазы Е. сой.
Кроме того, последовательность продукта слияния начинается сразу после сайта расщепления пептидазой. Был введен сайт расщепления для Νοο1, который перекрывается с последним кодоном сигнального пептида и двумя первыми аминокислотами последовательности эксендина-4. Это изменение улучшает последующее субклонирование, а также приводит к получению продукта слияния со свободным Νконцом эксендина-4. Модифицированному экспрессирующему вектору рЕТ12а (векторы рЕТ, полученные из ΕΜΌ Вюзаепсез), содержащему перечисленные выше изменения, присвоили название ρΌ0Μ35. Вектор и РСК-сборки переваривали рестрикционными эндонуклеазами №е1 и ВатН1, с последующим лигированием вставки в вектор с использованием набора Цшск Ыдайоп (ΝΕΒ). 2 мкл Этого лигирования использовали для трансформации клеток Μ;κ1ι1. После периода восстановления роста клетки сеяли на чашки с агаром, содержащие карбенициллин, и инкубировали при 37°С в течение ночи. Колонии секвенировали и колонии, содержащие правильную последовательность, использовали для размножения и выделения плазмиды (Лазний Μίηί Ргер кй, Ц1адеп). Клетки ВЬ21(ОЕ3) трансформировали плазмидной ДНК, и полученные колонии использовали для инокуляции экспрессирующей культуры. Экспрессию осуществляли путем инокуляции 4 х 0,5 л культуральной среды ТВ Опех (дополненный растворами для аутоиндукции Оуегшдйк Ехргезз™), 1 капли пеногасителя и 100 мкг на мл карбенициллина. Культуру инкубировали в течение 3 ночей при 30°С с перемешиванием 250 об/мин и затем культуральный супернатант осветляли посредством центрифугирования при 3700 х д в течение 1 ч. Экспрессируемый белок затем очищали из осветленного супернатанта с использованием ргокеш Ь зкгеатйпе (ОЕ Неаййсаге, кат. № 28-4058-03, связанный с белком Ь) и элюировали с Ргокеш Ь с использованием 0,1 М глицина рН 2,0, затем нейтрализовали с использованием 0,1 объема 1 М Трис рН 8,0. Следующий белок концентрировали и диализовали в буфере А (20 мМ ацетат натрия-уксусная кислота, рН 5,0) и очищали с помощью ионообменной хроматографии на АккаХргезз (ОЕ Неаййсаге). Белок наносили на 6 мл колонку Кезоигсе δ в буфере А (бессолевой буфер) и затем элюировали градиентом буфера В (20 мМ ацетат натрия-уксусная кислота рН 5,0 1 М №С1) с 0-68% В в течение 65 мин по фракциям (для ΌΜδ7139). Фракции анализировали на ПААГ-ДСН и с помощью масс-спектрометрии, и фракции, имеющие правильную массу, объединяли. Конечный белок диализовали в буфере 20 мМ цитрат, 0,1 М №С1, и идентичность подтверждали с помощью ПААГ-ДСН и масс-спектрометрии.
Пример 17. Эксендин-4 А1ЬийАЬ продукты слияния ΌΜδ7139 и ΌΜδ7143 связывают сывороточный альбумин с использованием поверхностного плазмонного резонанса.
ΌΜδ7139 и ΌΜδ7143 экспрессировали и очищали, как описано выше, и анализировали методом поверхностного плазмонного резонанса (В1асоге, ОЕ Неаййсаге) для получения информации об аффинности. Анализ осуществляли с использованием двух СМ5 чипов (матрица карбоксиметилированного декстрана), которые были покрыты сывороточным альбумином. Примерно 500 резонансных единиц (КИ) каждого сывороточного альбумина иммобилизовывали в ацетатном буфере рН 4,5. Первый чип имел проточную кювету 1, непокрытую и блокированную, и проточную кювету 2, покрытую ΜδА (560 КИ). Второй чип имел проточную кювету 1, непокрытую и блокированную, проточную кювету 2 покрывали ЖА, проточную кювету 3 покрывали СδА и проточную кювету 4 покрывали К$А. Для всех сывороточных альбуминов задача заключалась в том, чтобы покрыть область 350 КИ белка на чипе.
Диапазон концентраций продукта слияния получали (в диапазоне от 55 нМ до 1 мкМ для ΌΜδ7139 и от 24 нМ до 4,4 мкМ для ΌΜδ7143) путем разбавления в В1АСОКЕ Μδ-ЕР буфере (0,01 М НΕРΕδ, рН 7,4, 0,15 М №С1, 3 мМ ЕОТА, 0,005% сурфактанта Р20) и пропускали через В1АСОКЕ чип. Аффинность (КО) расчитывали из В1АСОКЕ кривых посредством подгонки кривых скорости ассоциации и скорости диссоциации с кривыми, полученными с концентрациями йАЬ в области КО. Аффинности (КО) представлены в следующей табл. 11.
- 25 021146
Таблица 11
ОМ37139 (М) ЮМ37143 (М)
Н5А 2.69Е-08 1.48Е-08
ВЗА 3.15Е-08 2.19Е-07
СЗА 4.23Е-08 3.89Е-08
МЗА 7.37Е-08 8.93Е-08
Сделали вывод, что ΌΜ87139 и ΌΜ87143 имеют аффинность в отношении сывороточного альбумина, которая (за исключением аффинности ΌΜ87143 в отношении КБА) находится в диапазоне 10-90 нМ. Это значительно выше, чем аффинность в отношении БА предыдущих продуктов слияния (например, ЭАТ0115, которое представляет собой эксендин-4, связанный с ПОМ7Н-14 А1ЬидАЬ с глицинсериновым линкером, которое имеет аффинности к этим сывороточным альбуминам в диапазоне 100 нМ). Более высокая аффинность новых продуктов слияния (в отношении сывороточного альбумина), повидимому, приводит к более продолжительным периодам полувыведения из плазмы ίη νΐνίν которые будут означать, что продукты слияния можно будет вводить реже с той же эффективностью и/или поддерживать более постоянный уровень лекарственного средства в плазме в течение времени, потенциально уменьшая нежелательную сМах-связанную токсичность или побочные эффекты.
Пример 18. Продукты слияния ΌΜ87139 и ΌΜ87143 являются активными в анализе связывания рецептора ОЬР-1.
ОБР-1К представляет собой 7ТМ О-белок-сопряженный рецептор, который для целей этого анализа экспрессируется на клетках СНО. Активация рецептора с помощью ОЬР-1 или аналогов приводит к превращению АТР в сАМР с помощью аденилатциклазы, которая сопряжена с рецептором. Клетки СНО стабильно трансфицируются репортерным геном 6СКЕ/1ис. Поэтому при продукции сАМР после ОЬР-1 активации рецептора, промоторный ген (содержащий 6 копий сАМР отвечающего элемента - 6СКЕ) запускает экспрессию репортерного гена люциферазы. Это затем катализирует реакцию с люциферином для генерации света, который можно измерить на люминометре.
Способ
Клетки СНО 6СКЕ ОЬР1К быстро размораживали путем погружения флакона(ов) наполовину в 37°С водяную баню и содержимое флакона(ов) переносили в 50-мл пробирку Ра1сои и во флакон добавляли 10 мл среды ΚΡΜΙ (без фенолового красного) (Бщта, кат. #К7509) + 2 мМ Ь-глутамина (О1Ьсо, кат. # 25030) + 15 мМ НЕРЕБ (Бщта, кат. # Н0887). После подсчета и центрифугирования при 1200 об/мин в течение 5 мин клетки ресуспендировали в соответствующем объеме среды ΚΓΜΙ для получения 1 х 106 клеток на мл и 50 мкл распределяли в каждую лунку белого 96-луночного плоскодонного планшета для культивирования (Со8!аг 96-луночный планшет для культивирования тканей, белый стерильный, кат. # 3917). Клетки инкубировали в течение ночи при 37°С/5% СО2. На следующий день клетки извлекали из инкубатора и добавляли в лунки 50 мкл предварительно приготовленного контроля/образца и планшет возвращали в инкубатор на 3 ч при 37°С и 5% СО2.
Приготовление контроля эксендина-4 (Бщта, кат. #Е7144)
В 96-луночный планшет с У-образным дном добавляли 2 мкл 1 мг/мл эксендина-4 к 198 мкл среды ΚΓΜΙ для получения 2,39 мкМ раствора. Добавляли 2 мкл 2,39 мкМ раствора к 237 мкл среды ΚΡΜΙ для получения 20 нМ раствора (для конечной концентрации в анализе 10 нМ). Серийное разведение контроля 1:10 размещали внизу планшета (15 мкл контроль + 135 мкл среды ΚΡΜΙ) для получения 8-точечной кривой.
Приготовление неизвестных образцов
Для приготовления неизвестных образцов используют те же принципы, что и для приготовления контроля. Готовят наибольшую концентрацию, в два раза большую, чем требуемая конечная концентрация, и разбавляют 1:10 внизу планшета.
Приготовление люциферазы (Рготеда, кат. # Е2620)
Вытащить требуемое число аликвот люциферазы Впдй!-О1о из морозильника и разморозить при комнатной температуре в темноте. Одного 5-мл флакона достаточно для одного анализируемого планшета.
После инкубационного времени 50 мкл люциферазного реагента Впдй!-О1о добавляли во все лунки и планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 3 мин для обспечения лизиса клеток. Люминесценцию (число импульсов в с) считывали с использованием считывающего устройства для микропланшетов М5е, считывая каждую лунку в течение 0,1 с. СРБ (имп/с) фоновых лунок, содержащих только клетки, вычитали из всех других лунок. Контрольные лунки (ОЬР-1(7-36) или эксендин-4) должны демонстрировать максимальную стимуляцию при самых высоких концентрациях. Кривые эффекта концентрации неизвестных образцов аппроксимируют, после чего определяют ЕС50 с использованием программного обеспечения ОгарЬРад Рп8т или Ехсе1Рй.
Два продукта слияния эксендин-4 А1ЬидАЬ (ΌΜ87139 и ΌΜ87143) тестировали в анализе активности в ОБР-1К ВА параллельно с эксендином-4. Результаты представлены в табл. 12 ниже.
- 26 021146
Таблица 12
На основании вышеприведенных результатов сделали вывод, что ΌΜ87139 и ΌΜ87143 демонстрируют ожидаемую активность в 0ЬР-1Р ВА, и поэтому, вероятно, они будут активными против рецептора 0ЬР-1 ίη νινο. Поэтому ΌΜ87139 и ΌΜ87143 являются хорошими кандидатами для дальнейшего доклинического исследования с целью продвижения в клинику в случае успеха.
Пример 19. Вектор, экспрессирующий ВАТО115 или ^АΤ0117, трансформировали в штамм Е. соН В121-(ОЕ3) ^ονα^η). 250-мл Флакон, содержащий 50 мл модифицированной обогащенной питательной среды (81§та, кат. № Т0918), инокулировали при ΘΌ=0,1 и затем выращивали при 30°С в присутствии 50 мг/л канамицина. При А600=0,5-1 клетки индуцировали 1РТС (изопропилтиогалактозид) в конечной концентрации 50 мкМ, и рост продолжался при той же температуре в течение ночи. Культуру центрифугировали и ^АΤ0115 или ^АΤ0117 вылавливали из культурального супернатанта с использованием смолы с белком Ь (сделанной в лаборатории). Периодическое связывание наблюдали в течение ночи при 8°С, смолу промывали 10 объемами колонки РВ8, и ^АΤ0115 или ^АΤ0117 элюировали со смолы тремя объемами колонки 0,1 М глицина, рН 2. Белок нейтрализовали путем добавления 1/5 объема 1 М Трис рН 8,0. Белок затем анализировали посредством ДСН-геля и масс-спектрометрии (Μ8) или посредством деградации по Эдману (Ейтап).
Векторы, экспрессирующие ^АΤ0117, которые отмечены звездочкой (*) трансформировали, культивировали и анализировали с использованием условий, изложенных в примере 16.
Таблица 13
Название лидера Конструкция % полноразмерный М3 (Эдман) % минус две аминокислоты М3 (Эдман)
ОтрА ΌΑΤ0115 77% 23%
ОтрА-АМА ОАТ0115 100% 0%
ОтрА-А\Л/А ΌΑΤ0115 84% 16%
ОтрТ ОАТ0117* ОАТ0117 46% (42%) 41% 54% (58%) 59%
ОтрТ-АМА ϋΑΤ0117* 86% (83%) 14% (17%)
ОтрТ-АЖА ΌΑΤ0117* 100% (100%) 0% (0%)
САЗ ϋΑΤ0117 13% 87%
САЗ-АМА ϋΑΤ0115 72% 28%
Пример 20. Экспрессия и очистка ΌΜ87139 (генетическое слияние эксендина-4 и Ό0Μ7Μ4-10) А1ЬийАЬ с использованием вектора Μа1Е/рЕТ30/
Ген ΌΜ87139 амплифицировали с помощью ПЦР с плазмиды, содержащей ΌΜ87139, с использованием олигонуклеотида № 1 (фиг. 2(з): 8Ер ГО N0: 47) (еоААттссАТАтеААААТсААААСсеетестсесАтсстеестстетссес тстеАссАстАтеАтеттстссесттссесестеестсАтеетоААееААСА ТТТАССАОТСАС) и олигонуклеотида № 2 бТТСАСААТТСТТАТТАСССТТТСАТТТССАССТТССТСССТТб (Фиг. 2(1):
3ΕΩ Ю ΝΟ: 48).
Продукт амплификации содержит конструкцию ΌΜ87139 с ^концевой сигнальной последовательностью Μα1Ξ
ΜΚIΚΤΟАРI^А^δА^ΤΤΜΜΕδАδА^А (фиг. 9()): 8Ер ГО N0: 49) и оставляет на ее 5’- и 3’-концах последовательности для распознавания N41 и ЕсоР1, соответственно. Образующиеся генные фрагменты переваривали с помощью №е1/ЕсоР1 и лигировали в вектор рЕТ30, переваренный с помощью №е1/ЕсоР1 ЦпуЕгодеп). Для проверки вставки клоны секвенировали с использованием Т7-прямых и Т7обратных праймеров.
Вектор, экспрессирующий ΌΜ87139, трансформировали в штамм Е. соН ВЕ21-(ОЕ3) (^να^η), содержащий вектор рЕС0-рд1 (см. Аоп е! а1. аррНей апй епНгоптеп!а1 т1сгоЫо1о§у 1еЬ. 2008 νο1.74, №.2, рд 950-958) и культуры выращивали при 30°С в минимальной среде (см. Ког/ Ό.Ε е! а1. ЕВю1есЪпо1. 1995, 39, р. 59-65), дополненный 50 мг/л канамицина и 37,5 мг/л хлорамфеникола. При А600 от 0,25 до 0,5, клетки (фактическое полученное значение 0,347) индуцировали с помощью 1РТС до конечной концентрации 70 мкМ, и рост продолжался при 28°С в течение ночи. Культуру центрифугировали и ΌΜ87139 вылавливали из культурального супернатанта с использованием смолы с белком Е (сделанной в лаборатории). Периодическое связывание происходило в течение ночи при 4°С, смолу промывали 10 объемами колонки РВ8, и ΌΜ87139 элюировали из смолы тремя объемами колонки 0,1 М глицина рН 2. Белок затем анализировали посредством ДСН-геля и масс-спектрометрии. Как показано на фиг. 10, массспектрометрия демонстрирует очень чистый ΌΜ87139.
Последовательность ДНК, кодирующая белок ΌΜ87139, также может быть оптимизирована по кодонам для экспрессии в Е. соН, и эта последовательность представлена на фиг. 2(и) 8Ер ГО N0: 50.
Пример 21. ΌΜ87139 связывается с 0ЕР-1Р мыши, крысы, яванского макака и человека со сходной эффективностью.
- 27 021146
Для того чтобы определить относительную эффективность ЭМ87139 в отношении ОЬР-1 К человека, мыши, крысы и яванского макака, использовали биоанализ с меланофор-функциональным ОЬР-1К (сходный с 1ауа\\ас1<гете е1. а1., Сигг Рго1осо1к т РЬагтасо1. 2005). Транслокация меланосом посредством 7ТМ активации была хорошо задокументирована, и О-белки, расположенные внутри меланофорных клеток, как было показано, связаны с ОРСКк способом, сходным с клеточными системами млекопитающих (Огокк е! а1., I Се11 Вю1 2002; 156:855-865). В этом биоанализе используют меланофорную клеточную линию, происходящую из клеток кожи лягушки Хепорик ^ν^, которые обладают темным пигментом (меланином) и содержат органеллы, известные как меланосомы (Ьегпег, Тгепбк Хеигоксг 1994; 17:142-146). Изменения внутриклеточного уровня сАМР контролируют степень, с которой меланосомы агрегируют или распределены в пределах клетки, и, таким образом, плотность окрашивания меланофорных клеток непосредственно связана с уровнями сАМР. Дополнительные детали представлены ниже.
Полноразмерные кДНК с открытой рамкой считывания, кодирующие рецепторы ОЬР-1 крысы, мыши и человека, клонировали в экспрессирующий вектор рЮ3.6 или рсЬХАЗ с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Номера доступа в ОепеЬапк представлены ниже в табл. 14.
Таблица 14. Номера доступа в ОепеЬапк
οι_ρικ ОепеЬапк
крыса ΝΜ_012728
мышь ΝΜ_021332
человек ΝΜ 002062
Клон, кодирующий ОЬР-1К яванского макака, амплифицировали с кДНК, обратно транскрибируемой с тотальной РНК, выделенной из легкого, печени и головного мозга яванского макака, и субклонировали в рсДНК3.2ЬО^. Подтвердили полноразмерную последовательность кДНК. Меланофоры поддерживали во флаконах Т225 (Сок1аг, кат. № 3000) в среде Ь-15 при 27°С и 0% СО2 и пересевали один раз в неделю (1:10) с флакона с конфлюэнтным монослоем с помощью 0,7х трипсина с последующей двукратной подпиткой в неделю. кДНК яванского макака представлена на фиг. 2(г) (8ЕР ГО ΝΟ: 45).
Для аналитических целей клетки промывали, подвергали трипсинизации и ресуспендировали в 0,7х ЕРО РВ8 в концентрации 15 х 106 клеток на мл. 800 мкл Клеток осторожно смешивали с 20-40 мкг кДНК и инкубировали на льду в течение 20 мин. После инкубации 800 мкл смеси клеток/кДНК пипетировали в кювете и подвергали электропорации при 500 В, 725 мкФ и 950 Ом. Затем клетки переносили из кюветы непосредственно во флакон Т75, содержащий КРМ (обычная среда для лягушек), и инкубировали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 3 ч и затем в течение ночи в инкубаторе (25°С, 0% СО2). На следующий день клетки подвергали трипсинизации, подсчитывали и добавляли в 96полулуночные планшеты Сок1аг (кат. # 3697) при плотности 300000 клеток на мл. Через 2 ч их помещали в герметичном контейнере в инкубатор на ночь (25°С, 0% СО2). На следующий день среду удаляли и в каждую лунку добавляли по 25 мкл МАВ (буфер для анализа меланофоров), содержащего 1% ЬМ8О и 10 нМ мелатонина. Клетки инкубировали в течение 1 ч и фоновое пропускание измеряли на планшетридере 8ЬТ 8рес1га при 620 нм. Затем в каждую лунку непосредственно добавляли серийные разведения (последовательность из 12 точек с использованием 3-кратных интервалов разведения в МАВ), содержащие 25 мкл 2х концентраций пептидов и стандартов. Стандарты, включающие мелатонин 10 нМ, М8Н (меланоцитостимулирующий гормон) 200 нМ и МАВ, использовали для установления минимального, максимального и фонового уровней ответа в аналитической системе, соответственно. После добавления пептидов и стандартов планшеты инкубировали в течение 1 ч и измеряли пропускание, как указано выше. Данные анализировали с использованием КоЬокаде (версия 7.3.2) путем вычисления (1-ТГ/Т1), где Т1 представляет собой исходное фоновое значение и ТГ представляет собой значение ответа.
Активация Ок-сопряженного 7ТМ рецептора (т.е. ОЬР-1К) приводит к увеличению внутриклеточного сАМР, заставляя меланосомы, которые были предварительно агрегированы с использованием мелатонина, становиться более диспергированными, ответ, который измеряют по уменьшению светопропускания через клетку. Альтернативно, в условиях уменьшения сАМР меланосомы агрегируют, что приводит к увеличению светопропускания через клетку. Поэтому после трансфекции и временной экспрессии плазмидной конструкции, содержащей кДНК ОЬР-1К, в меланофорах, относительную эффективность ЬМ87139 для активации ОЬР-1К можно вычислить из кривой доза-ответ. Результаты представлены ниже в табл. 15.
- 28 021146
Таблица 15. Эффективность ^Μδ7139 в анализе меланофоров
Название клона С1.Р-1К яванского макака рЕС50 С1.Р-1К крысы рЕС50 оимк мыши рЕС50 ΘΙ.Ρ-1Κ человека рЕС50
ОМ87139 10,62 10,78 9,97 10,63
ΩΜ87139 10,63 11,11 10,50 11,39
ОМ87139 10,79
ОМ87139 11,07
6Ι.Ρ-1 (7-36) 11,03 11,16 11,17 11,43
СЬР-1 (7-36) 11,09 11,47 11,40
СЬР-1 (7-36) 10,97
^Μδ7139 тестировали в отношении эффективности в анализе с использованием меланофоров, трансфицированных ОЬР-1Р человека, мыши, крысы и яванского макака, по меньшей мере в двух повторностях для каждого вида. рЕС50 для дублирующих анализов представлены в табл. 15. Эффективности в рецепторах яванского макака, человека и крысы очень сходны с возможно несколько более низкой эффективностью для мышиного рецептора. В целом, эти данные, представленные в табл. 15, обеспечивают достоверное доказательство, что эффективность, наблюдаемая в мышиных моделях с этим лекарственным средством, по-видимому, воспроизводится в возможных таксономических видах (крыса и яванский макак), а также у человека.
Пример 22. Эффективность и продолжительность действия ΌΑΤ0115 и ^Μδ7139 на йЬ/йЬ мышиной модели диабета II типа.
Цель данного исследования заключалась в определении и сравнении продолжительности действия ΌΑΤ0115 и ^Μδ7139 на толерантность к пероральной глюкозе у 10-11-недельных мышей йЬ/йЬ (полученных из 1аск8оп ЬаЬ8). Животных рандомизировали по группам обработки в соответствии с уровнями глюкозы в крови, определенными за три дня до начала эксперимента. Это обеспечивало сходный средний начальный уровень глюкозы в каждой группе исследования. ΌΑΤ0115 и ^Μδ7139 вводили подкожно по 1 мг/кг за 120, 96, 72 или 48 ч до перорального введения глюкозы (показано на фиг. 11А).
ΑΙΑ' для глюкозы значительно уменьшалась в течение 2 ч в тесте на толерантность к перорально вводимой глюкозе (0ΟΤΤ) по сравнению с мышами йЬ/йЬ, обработанными контролем, для всех временных точек вполь до 120 ч для ^Μδ7139 и для всех временных точек вполь до 96 ч для ΌΑΤ0115 (фиг. 1 Ш). Хотя нет статистического различия между ΌΑΤ0115 и ^Μδ7139, вводимыми в 72, 96 или 120 ч, ΌΑΤ0115 снижало ΑυС для глюкозы значительно больше, чем ^Μδ7139 в 48 ч.
Сделали вывод, что более последовательное уменьшение ΑυС для глюкозы, продемонстрированное ^Μδ7139, было показателем более желательного профиля для лекарственного средства этого класса.
Таким образом, хотя это исследование не обнаружило явного превосходства, ^Μδ7139 выбрали в качестве ведущего на основании этих и других данных.
Пример 23. Повторная доза ^Μδ7139 демонстрирует дозозависимое снижение №Α1ο по сравнению с контрольным Б0М7Й-14.
Цель данного исследования заключалась в анализе снижения №Α1ο после повторной дозы ^Μδ7139 у 10-11-недельных мышей йЬ/йЬ (1аск8оп 1аЬ8). №Α1ο является гликозилированной формой гемоглобина, концентрацию которого используют в качестве косвенного показателя концентрации глюкозы в плазме в течение длительного периода времени. Чтобы обеспечить сходный средний начальный уровень №Α1ο в каждой из исследуемых групп, йЬ/йЬ мышей рандомизировали на основании уровней №Α1ο за три дня до начала эксперимента. Животным вводили либо ^Μδ7139 (0,01, 0,03, 0,1, 0,3 мг/кг), ВуеИа™ (0,0001, 0,001, 0,01, 0,1 мг/кг), либо И0М7Й-14 (0,3 мг/кг) подкожно ОП (ежедневно) в течение 2 недель. Измерения массы тела, потребления пищи и глюкозы проводили во время исследования одновременно с измерениями №Α1ο, производимыми в конце 14 суток.
Потребляемая с пищей глюкоза и №Α1ο были значительно снижены в группе обработки ^Μδ7139 при 0,03, 0,1 и 0,3 мг/кг по сравнению с контролем (И0М7Й-14), хотя они не отличались значительно от контроля с физиологическим раствором (см. результаты на фиг. 12). Данные, полученные для контроля с физиологическим раствором, были ниже, чем ожидалось на основании данных, полученных с самой маленькой дозой эксендина-4 или ^Μδ7139. Не наблюдалось никаких изменений с эксендином-4 по сравнению с контролем с физиологическим раствором.
Также наблюдалось значительное снижение массы тела и потребления пищи в случае ^Μδ7139. Эксендин-4 не продемонстрировал значительных эффектов на потребление пищи при самой высокой дозе.
Сделали вывод, что повторное введение ^Μδ7139 приводит к снижению №Α1ο у мышей йЬ/йЬ, а также влияет на потребление пищи и массу тела. Эти изменения согласуются с ожидаемыми изменениями для агониста ОЬР-1 Р.
Пример 24. ΌΑΤ0115 и ^Μδ7139 показали дозозависимое уменьшение потребления пищи и массы тела по сравнению с И0М7Й-14 контролем при индуцированном диетой ожирении (ИЮ) в мышиной модели ожирения.
Цель исследования, описанная в данной заявке, заключалась в том, чтобы определить, влияет ли
- 29 021146 обработка с помощью ΌΆΤ0115 и ΌΜ37139 на потребление пищи и, в результате, на массу тела в течение 10-суточного периода, и в том, чтобы определить, имеет ли одно из этих соединений большую продолжительность действия, чем другое. Это может быть прогнозом для людей. Эксперимент проводили в дозовых группах на модели ΌΆΤ0115 индуцированного диетой ожирения (ЭЮ) у мышей, которых кормили Вуейа и ΌΜδ7139.
Самцов мышей С57ВЕ6 (Τηοοηίο) содержали на 60% ккал диете, содержащей обогащенную жирами и облученную пищу, в течение 12 недель и затем переводили в лабораторное помещение. По прибытии мышей индивидуально размещали на а1рНа-йп подстилках в комнате с контролируемой температурой и влажностью (70-72°Ρ (21,1-22,2°С), влажность = 48-50%, световой цикл с 5 утра до 5 вечера). Диету меняли на 45% обогащенную жирами диету (Кезеатсй Э1е1з Ό12451) и животных подвергали акклиматизации в течение 18 суток. Перед введением соединения мышам вводили подкожно физиологический раствор в течение трех суток и контролировали потребление пищи. Мышей группировали таким образом, чтобы масса тела и потребление пищи не различались между группами. Каждой из трех групп вводили либо ΌΆΤ0115, либо ΌΜδ7139 при 0,01, 0,1 и 1 мг/кг, одной группе вводили молекулу, служащую отрицательным контролем (ΌΘΜ7Η-14 Л1ЬийЛЬ™ при 1 мг/кг) и одной группе вводили эксендин-4 в качестве положительного контроля (0,01 мг/кг). Суточное потребление пищи и массу тела определяли в течение 10 суток.
ΌΑΤ0115 и ΌΜδ7139 продемонстрировали дозозависимое уменьшение потребления пищи и массы тела по сравнению с ЭОМ7Н-14 контролем (см. результаты на фиг. 13). Примечание - эксендин, указанный на фиг. 13, представляет собой Вуейа™. Данные из исследования на мышах указывают на отсутствие статистического различия между эффективностью этих соединений.
Пример 25. РК анализ ΌΜδ7139 у мыши, крысы и яванского макака.
Серию исследований проводили подкожно и внутривенно на трех видах-моделях (мышь ЙЬ/ЙЬ, крыса и яванский макак) с ΌδΜ7139. Дозы выбирали с целью получения концентраций в плазме, предсказанных как обнаружимые с помощью анализов в соответствующих временных точках: 1 мг/кг внутривенно и подкожно мыши, 1 мг/кг подкожно и 0,3 мг/кг внутривенно крысе, 0,1 мг/кг внутривенно и подкожно яванскому макаку.
Временные точки для РК образцов представляли собой мышь ЙЬ/ЙЬ (0,17, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120 и 168 ч), крыса (0,17, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 и 120 ч) и яванский макак (0,083 (только внутривенная группа), 0,5, 4, 8, 24, 48, 96, 144, 192, 288, 336, 504 и 672 ч (4 недели)). Осуществляли серийный сбор образцов крови, за исключением мышей, где одно животное умерщвляли в каждую точку данных. Образцы плазмы готовили и хранили замороженными для дальнейшего анализа уровней ΌΜδ7139.
Два количественных анализа использовали для анализирования РК образцов в различных исследованиях: ΕυδΑ-метод, с помощью которого определяют эксендин-4 и А1ЬийАЬ части молекул, и ИРЬСΜδ/Μδ метод, с помощью которого определяют Ν-концевой пептид эксендина-4. Данные, полученные с помощью ΕυδΑ-метода, показаны здесь.
ΕΟδΑ
Уровень ΌΑΤ0115 и ΌΜδ7139 в плазме яванского макака определяли с использованием ΕΟδΑанализа. Кратко, 96-луночные планшеты ΠιιοϊΌηιιικ (№тс #437796) покрывали в течение ночи в холодильнике антителом против эксендина-4 (АЬеат, кат. #аЬ26263) при 5 мкг/мл в 50 мМ натрийкарбонатном буфере, рН 9,4 (100 мкл на лунку). На следующий день планшеты промывали 5 раз с помощью 10 мМ трис, 150 мМ №С1 рН 7,5 плюс 0,1% 1^ееи-20 (300 мкл на лунку), затем блокировали с помощью 200 мкл блокирующего буфера ^реЛ^ск, 11κηηο3^ηΙίΓχ # 37535, в ΤΒδ), встряхивали в течение приблизительно 1 ч при 37°С. Лунки промывали, как и ранее, затем инкубировали при встряхивании с 100 мкл на лунку ОС (контроля качества), стандартов или образцов в течение приблизительно 2 ч при 37°С. Затем лунки еще раз промывали и инкубировали с конечным разведением 1:2000 кроличьего антитела против каппа-легкой цепи человека в буфере для анализа (10 мМ Трис, 150 мМ №С1, 0,1% ΒδΑ, 0,1% Τ\\^η 20 рН 7,5) при встряхивании в течение 1 ч при 37°С с последующей промывкой, как и ранее. Лунки затем инкубировали при встряхивании с 100 мкл на лунку раствора репортерной метки (конъюгат козлиного антитела против кроличьего ^О) при 1/500000 в буфере для анализа при 37°С и промывали, как и ранее. Связанное ΌΑΤ0115 или ΟδΙ<2374697Α определяли путем добавляения 100 мкл на лунку субстрата для визуализации (иреплдшй ΕΟδΑ ГетЮ (11κπηο3^ηΙίΓΚ #37075) при постоянном встряхивании в течение приблизительно 1 мин и затем считывали с использованием хемилюминесцентного планшет-ридера (Ща11ас 1420 ЩсЮт Ми1уйаЬе1 СоигИег (Регкш Е1тег ПГе δ^η^3)).
Компартментный и некомпартментный фармакокинетические анализы осуществляли при измерении уровней в плазме с использованием программного обеспечения νίηΝοηΠη версии X ТВС (см. табл. 16 ниже). Для некомпартментных результатов все рК данные для ΌΑΤ0115 и ΌΜδ7139 собирали и подгоняли в тот же день в отношении согласованности между исследованиями. Поэтому показанные данные представляют собой собранные данные, NСΑ результаты и графические материалы для ΌΑΤ0115 и ΌΜδ7139.
У яванского макака вычисленный период полувыведения составлял 106,4 или 112,8 ч (в/в) и 113,8 или 113,1 ч (п/к), определенный с помощью компартментного и некомпартментного методов, соответст- 30 021146 венно. Определили, что во всех трех видах БМ87139 имеет период полувыведения из плазмы, приближающийся к таковому для самого сывороточного альбумина и поэтому дающий аналогичную аффинность, которую БМ87139 имеет в отношении человеческого сывороточного альбумина (по сравнению с сывороточным альбумином яванского макака, например), это обеспечивает достаточную уверенность в том, что БМ87139 будет иметь период полувыведения у человека, который согласуется с введением один раз в неделю (или реже).
Таблица 16
А) Данные для мышей ЙЬ/ЙЬ (данные ЕЫ8А)
Б) Данные для крыс (данные ЕЫ8А)
В) Данные для яванского макака (данные ЕЫ8А)
Некомпартментные методы Компартментные методы
Молекула КОА Доза А11С 0-ίηί С1_ / С1__Р Р Т1/2 С1_/С1__Р Т1/2
(мг/кг) (ч*нг/мл) (мл/ч/кг) (п/к) (ч) (мл/ч/кг) (ч)
(%)
ΌΜ87139 в/в 0,3 223069 1,3 н/а 25,4 1,4 47,2
п/к 1 151423 7,3 20,4 49,7 7 39,2
н/а - не анализировали
Пример 26. Сравнение РК анализа БМ87139 и БАТ0115 у яванского макака.
Для того чтобы выбрать наиболее желательную молекулу для применения у людей, фармакокинетические параметры у яванского макака сравнили для БАТ0115 и БМ87139 (см. табл. 17). Авторы заключили на основании данных в таблице, что БМ87139 имеет более желательные РК параметры, чем БАТ0115, демонстрируя более продолжительный период полувыведения у яванского макака при подкожном или внутривенном введении. Более продолжительный период полувыведения приводит к тому, что в более поздние временные точки БМ87139 присутствовал в постоянно более высокой концентрации в плазме, чем БАТ0115 (данные не показаны).
Таблица 17. Сравнение периода полувыведения БАТ0115 и БМ87139 у яванского макака
Некомпартментные методы Компартментные методы
Молекула ГСОА (способ анализа) Доза (мг/кг) А11С 0-ίηί (ч*нг/ мл) си СЬ_Р (мл/ч/ кг) Р (п/к) (%) Т1/г (ч) си СЬ_Р (мл/ч/ кг) Конечный Т1/2 (ч)
ϋΑΤ0115 в/в (ЬС/МЗ/МЗ) 0,1 34507,5 3,3 н/а 67,3 4 80,7
п/к (ЬС/МЗ/МЗ) 0,1 34203,8 3,1 99,1 67,9 2,9 91,1
ОМ57139 в/в (ΙΧ/Μ3/Μ5) 0,1 238360 0,4 н/а 110 0,4 117,6
В/В (ЕИЗА) 0,1 225925 0,4 н/а 106 0,5 112,8
п/к (ЬС/МЗ/МЗ) 0,1 128093 0,8 53,7 97,7 0,8 82,1
п/к (ЕИЗА) 0,1 139657 0,7 61,8 114 0,7 113,1
н/а - не анализировали
Пример 27. Получение РУУ (3-36) БОМ7к-14-10 (К108С) А1ЬийАЬ™ пептидного конъюгата БМ87605 (который имеет структуру, представленную на фиг. 14) и который представляет собой: БОМ7к-14-10 (К108С) А1ЬийАЬ, конъюгированное с РУУ3-36 посредством лизина и линкера из 4 повторов ПЭГ).
БОМ7к-14-10 (К108С) а1ЬийаЬ экспрессировали и очищали, как описано следующим образом в Ε.οοίΐ. Ген, кодирующий БОМ7к-14-10 (К108С), клонировали в вектор рЕТ30. Для того чтобы обеспечить клонирование в экспрессирующий вектор, продукты слияния получали в виде совокупности ПЦРпродуктов (а88етЬ1у РСК8) с сайтом рестрикции для Ме1 на 5', за которым следует лидерная последовательность РЕЬ В (аминокислотная последовательность, представленная на фиг. 9(ι) δΕρ ΙΌ NО: 46). Вектор и совокупность ПЦР-продуктов переваривали рестрикционными эндонуклеазами Νάαΐ и ВатН1 с последующим лигированием вставки в вектор с использованием набора Ршск ^ЕВ). 2 мкл
Продукта лигирования использовали для трансформации клеток Маск1. После периода восстановления роста клетки высевали на чашки с агаром, содержащие карбенициллин, и инкубировали при 37°С в течение ночи. Колонии секвенировали и колонии, содержащие правильную последовательность, использовали для размножения плазмиды и выделения (Р1а8т1Й МЫ Ргер кН, р1а§еп). Клетки ВЬ21(БЕ3) трансфор- 31 021146 мировали плазмидной ДНК и полученные колонии использовали для инокуляции экспрессирующей культуры. Экспрессию осуществляли путем инокуляции 250-мл флакона, содержащего 50 мл модифицированной питательной среды (егпПс Ьго1Н тсШа (§1§та), и его инокулировали при ΟΌ=0,1 и затем выращивали при 30°С вместе с 50 мг/мл канамицина. При А600=0,5-1 клетки индуцировали с помощью 1РТО (изопропилтиогалактозид) в конечной концентрации 50 мкМ и рост продолжали при 23°С в течение ночи. Затем культуральный супернатант осветляли центрифугированием при 3700х д в течение 1 ч. Экспрессированный белок затем очищали от осветленного супернатанта с использованием Рго1ет Ь 81геатПпе (ОЕ НеаНЬсаге, кат. № 28-4058-03, белок Ь-сопряженный) и элюировали с белка Ь с использованием 0,1 М глицина, рН 2,0, затем нейтрализовали путем добавления 1/5 объема элюции 1 М Трис, рН 8,0. Затем рН белка корректировали с использованием 0,1 М лимонной кислоты до рН 5 и белок наносили на 30-мл колонку §оигсе δ (ОЕ НеаНЬсаге), уравновешенную 50 мМ цитрата натрия, рН 5. Градиент 0-100 50 мМ цитрата натрия, рН 5, 1 М ЫаС1 применяли с использованием ЛИаХргезз РРЬС (ОЕ НеаНЬсаге) за 150 мл. Фракции анализировали на ПААГ-ДСН и фракции, содержащие самый чистый продукт, собирали. Конечный белок подвергали обессоливанию в 50 мМ фосфата натрия, рН 6,5, 5 мМ ЕЭТА.
ΌΟΜ71ι-14-10 (К108С) А1ЬибАЬ затем связывали с аминокислотной молекулой РУУ 3-36 (но с лизином в положении 10, который можно быть дериватизирован с помощью ПЭГ линкера) с использованием ПЭГ линкера, показанного на фиг. 14. РУУ и ПЭГ получали с помощью стандартного химического синтеза. Малеимид в конце ПЭГ линкера затем использовали для конъюгирования РУУ пептида со свободным цистеином ΌΟΜ71ι-14-10 (К108С) АЬибАЬ, полученных, как описано выше.
ΌΟΜ71ι-14-10 (К108С) подвергали обессоливанию в 50 мМ фосфате натрия, рН 6,5, 5 мМ ЕЭТА. Малеимид-активированный пептид затем смешивали с белком в соотношении 1:1 и инкубировали для обеспечения конъюгации.
Конъюгат очищали от непрореагировавшего ΌΟΜ71ι-14-10 (К108С) посредством ионообменной хроматографии таким же образом, как описано выше. Фракции, обогащенные конъюгатом, были окончательно очищены от свободного пептида с использованием аффинной очистки на белке Ь таким же образом, как описано выше. В конечном ΌΜδ7605 конъюгате заменяли буфер и анализировали с помощью ПААГ-ДСН и масс-спектрометрии.
Пример 28. Фармакологический профиль эксендин-4 А1ЬибАЬ (ПАТ0115, полученного, как описано выше) и РУУ (3-36) АЬибАЬ слитого пептида (ΌΜδ7605, полученного, как описано в примере 27, и со структурой, представленной на фиг. 14) в функциональном биоанализе меланофоров.
Фармакологический профиль эксендин-4 АЬибАЬ (ОАТ 0115) и РУУ(3-36) АЬибАЬ (ΌΜδ7605, полученного, как описано в примере 27, и со структурой, представленной на фиг. 14) определяли в функциональном биоанализе меланофоров с использованием клеток, трансфицированных рецепторами, представляющими интерес. Биоанализ осуществляли в основном, как описано в примере 21, со следующими различиями: 80 мкг кДНК использовали для ΝΓΥ1Κ человека, 40 мкг использовали для ЫРУ1К мыши и 40 мкг для других рецепторов ΝΈΥ мыши и человека (NРΥ2К, ΝΓΥ4Κ и ΝΓΥ5Κ).
Фармакологические профили эксендин-4 и РУУ (3-36) А1ЬибАЬ слитых пептидов (данные не показаны) выявили, что продукты слияния связывают и активируют как мышиные, так и человеческие рецепторы ΝΈΥ. ΌΜδ7605 связывает ΝΓΥ1Κ, ΝΓΥ2Κ, ΝΓΥ4Κ и NРΥ5К с ΝΓΥ2Κ, являющимися наиболее сильно активированным (данные не показаны). Номера доступа ΝΈΥΚ. являются следующими: ΝΈΥ1Κ.: ΝΜ 00909 (человек) и ΝΜ 010934 (мышь); ΝΓΥ2Κ: ΝΜ 00910 (человек) и ΝΜ 008731 (мышь); ΝΓΥ4Κ: ΝΜ 005972 (человек) и ΝΜ 008919 (мышь); ΝΓΥ5Κ: ΝΜ 006174 (человек) и ΝΜ 016708 (мышь).
Пример 29. ΌΜδ7605 продемонстрировал дозозависимое уменьшение массы тела по сравнению с контролем в модели ожирения на мышах с ожирением, индуцированным диетой (ΌΙΟ).
Эксперимент проводили в мышиной модели ожирения на мышах с ожирением, индуцированным диетой (ΌΙΟ), для оценки эффективности ΌΜδ7605 (ака ^Μδ7167:РΥУ3-36). Цель исследования, описанного в данной заявке, заключалась в определении влияния обработки с помощью ΌΜδ7605 на потребление пищи и массу тела в течение 6 суток. Эти результаты могут быть прогностическими для людей.
Самцов мышей С57В1/61 (Тасотс) содержали на 60% ккал обогащенной жирами диете (КезеагсЬ Эгеп Ό12492) в течение 12 недель и затем переводили в лабораторное помещение. По прибытии мышей индивидуально размещали на подстилках а1рЬа-Фт в помещениях с контролируемой температурой и влажностью (70-72°Р (21,1-22,2°С), влажность = 48-50%, световой цикл с 5 утра до 5 вечера). Диету заменяли на 45% обогащенную жирами диету (КезеагсЬ Эюп Ό12451), и животных подвергали акклиматизации в течение 5 недель. Животным предоставляли неограниченный доступ к еде и воде. Перед введением соединения мышам подкожно вводили носитель в течение одних суток и контролировали потребление пищи. Мышей разделяли на группы так, чтобы масса тела и потребление пищи не различались между группами. Группам вводили через сутки либо носитель, либо ΌΜδ7605 в дозах 3, 1, 0,3 или 0,1 мг/кг. Статистически значимые изменения (р<0,05 согласно Т-критерию) на шестые сутки суммарного потребления пищи наблюдали при 3 мг/кг (уменьшение 37,3%), 1 мг/кг (уменьшение 31,3%) и 0,3 мг/кг (уменьшение 21,8%), в то время как не наблюдали существенных изменений при 0,1 мг/кг (уменьшение 8,7%, р=0,07 согласно Т-критерию). Массу тела измеряли на 0, 3 и 6 сутки после начала введения доз.
- 32 021146
ΌΜ87605 показал дозозависимое уменьшение массы тела по сравнению с носителем-контролем (фиг. 15). Значительное уменьшение массы тела наблюдали при всех дозах (р<0,01 с помощью двухстороннего дисперсионного анализа (ΑNΟVΑ) с последующим анализом полученных данных (ро8!-Нос апа1у818) по ВопГеггош).
Таблица последовательностей
N0 Название клона
БАТ0114
Бак 0115
Бак 0116
БАТ0117
БАТ0118
БАТОН 9
БАТ0120
БОМ7Д-14
6БР-1 (7-37) А86 эксендин-4 спиральный линкер
61у-зег линкер
БАТ0114
БАТ0115 млекопитающего
БАТ0115 Е.соН
БАТ0116 млекопитающего
БАТ0116 Е.соН
БАТ0117 млекопитающего
БАТ0117 Е.соН
БАТ0118 млекопитающего
БАТОН 9 млекопитающего
БАТ0120 млекопитающего
Вош7Ь-14
Эксендин 4, (645)3, линкер БОМ7Н-14-Ю слияние эксендин 4, (648)3, линкер БОМ7Н-11-15
БОМ7Н-14-Ю
ВОМ7И-11-15
ОтрТ АМА
Длина
168
163
148
188
153
142
179
108
504
489
495
444
447
564
567
459
426
537
324
163
163
108
108
Эксендин 4, (645)3, линкер БОМ7Н-14-10
Эксендин 4, (643)3, линкер БОМ7Н-11-115
Бот7Н-14-10
Бот7Н-11-15
ОтрАМА отрА (происходящая из Е. соН) отрА-АМА отрА-АВДА отрТ (происходящая из Е. соН) отрТ-АМА
6А8 (происходящая из 5. сегеуазгае)
ΘΑ8-ΑΜΑ
6А5-АМА
БОМ7Н-14-10РЮ8С
ΡΥΥ 3-36 (с лизином в положении 10)
БОМ 7П-14-10 К108С кДНК рецептора бЬР-1 супото1диз
Ре1 В
Олигонуклеотид 1
Олигонуклеотид 2
489
489
324
324
108
324
1389
115
Ма1 Е 26 экспрессия ΌΜ8 7139 в Е.соН 489
Тип
Белок
Белок
Белок
Белок
Белок
Белок
Белок
Белок
Белок
Белок
Белок
Белок
ДНК
ДНК
ДНК
ДНК
ДНК
ДНК
ДНК
ДНК
ДНК
ДНК
ДНК
Белок
Белок
Белок
Белок
Белок
ДНК
ДНК
ДНК
ДНК
ДНК
Белок
Белок
Белок
Белок
Белок
Белок
Белок
Белок
Белок
Белок
ДНК
ДНК
Белок
ДНК
ДНК
Белок
ДНК

Claims (20)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Конъюгат, содержащий или состоящий из (а) инсулинотропного агента или инкретинового лекарственного средства и (б) 6АЬ, которое связывает сывороточный альбумин, выбранного из: (1) доменного антитела (6АЬ) ΌΟΜ7Η-14 (аминокислотная последовательность ΌΟΜ7Η-14 представлена на фиг.
    - 33 021146
    1(Ь): 8Ер ΙΌ N0: 8), (2) доменного антитела (ЙАЬ) Ό0Μ7Η-14-10 (аминокислотная последовательность Ό0Μ7Η-14-10 представлена на фиг. 1(о): 8Ер ΙΌ N0: 26) или ЙАЬ, которое имеет вплоть до 4 аминокислотных различий от последовательности ЙАЬ Ό0Μ7Η-14-10; и (3) ЙАЬ Ό0Μ7Η-11-15 (аминокислотная последовательность Ό0Μ7Η-11-15 представлена на фиг. 1(р): 8Ер ΙΌ N0: 27) или (4) доменного антитела (ЙАЬ) Ό0Μ7Η-14-10 К108С (аминокислотная последовательность Ό0Μ7Η-14-10 представлена на фиг. 1(г)).
  2. 2. Конъюгат по п.1, где лекарственное средство представляет собой эксендин-4, молекулу ОЬР-1 или молекулу ΡΥΥ, или их мутант или производное, которые сохраняют связывающую активность нативной молекулы.
  3. 3. Конъюгат по п.1 или 2, где лекарственное средство выбрано из (а) мутанта ОЬР-1 (7-37) А8О, который имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 1(ί) (8Ер ΙΌ N0: 9), или (б) молекулы эксендина-4, которая имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 1(]) (8Ер ΙΌ N0: 10), или (в) ΡΥΥ3-36 или ΡΥΥ3-36, который имеет лизин в положении 10 и имеет аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 1(з).
  4. 4. Конъюгат по любому из пп.1-3, который содержит аминокислотный или химический линкер, соединяющий лекарственное средство и ЙАЬ.
  5. 5. Конъюгат по п.4, где аминокислотный линкер представляет собой спиральный линкер с аминокислотной последовательностью, представленной на фиг. 1(к) (8Ер ΙΌ N0: 11), или §1у-зег линкер с аминокислотной последовательностью, представленной на фиг. 1(1) (8Ер ΙΌ N0: 12).
  6. 6. Конъюгат по любому из пп.1-5, где инсулинотропный агент или инкретиновое лекарственное средство присутствует в виде части продукта слияния либо на Оконце, либо на С-конце ЙАЬ.
  7. 7. Конъюгат по п.1, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из следующего:
    (а) продукт слияния эксендина-4, (О48)3, линкера Ό0Μ7Η-14-10 (ΌΜ87139)
    ΗΘΕΟΤΡΤδΟΙδΚΟΜΕΕΕΑνΚΙΡΙΕννίΚΝΘΘΡδδΘΑΡΡΡδΘΘΘΘΘδΘΘ
    ΘΟδΘΘΟΘδοιαΜταδΡδδίδΑδνΘΟΡντιτοΡΑδοννιοδαΐδννγαακ
    ΡΟΚΑΡΚΙΙΙΜννΡδδίαδΟνΡδΡΡδΘδΘδΘΤΟΡΤίΤΙδδΙ-αΡΕΟΡΑΤΥΥ
    ΟΑΟΘΙΚΗΡΚΤΡΘαΟΤΚνΕΙΚΡ (8Ε0 ГО N0: 24) (б) продукт слияния эксендина-4, (О48)3, линкера Ό0Μ7Η-11-15 (ΌΜ87143)
    ΗΘΕΘΤΡΤδ01_δΚαΜΕΕΕΑ\/ΡΙ.ΡΙΕννΐ.ΚΝΟΘΡδδΘΑΡΡΡδΘΘΘΟΘδΘΘ οαδοοΘΟδοιΟΜταδΡδδίδΑδνΘΟκντιτο^δκριοτΜίδννγαακ ΡΘΚΑΡΚίυυ\ΡδΚίαδΘνΡ8ΚΡ8Θ8ΘδΘΤ0ΡΤίΤΙ8δΙ_αΡΕ0ΡΑΤΥΥ0 ΑΟΑΘΤΗΡΤΤΡΘαΘΤΚνΕΙ ΚΡ (δΕΟ ГО N0: 25) (в) пептидный конъюгат, который представляет собой Ό0Μ7Η-14-10 (К108С) А1ЬиЙАЬ, конъюгированное с амидированным по С-концу ΡΥΥ3-36 посредством лизина (введенного в положение 10 ΡΥΥ) и линкера из 4 повторов ПЭГ, как показано на фиг. 14.
  8. 8. Конъюгат по любому из пп.1-7, где ЙАЬ дополнительно сформатировано для увеличения его гидродинамического размера путем присоединения к ЙАЬ молекул(ы), выбранных(ой) из следующего: ПЭГ группа, сывороточный альбумин, трансферрин, рецептор трансферрина или, по меньшей мере, его трансферрин-связывающий участок, Ье-область антитела, или посредством конъюгирования с доменом антитела.
  9. 9. Конъюгат по любому из пп.1-8, который содержит дополнительные ЙАЬ группировки, которые имеют одинаковые или разные специфичности связывания с ЙАЬз Ό0Μ7Η-14-10 или Ό0Μ7Η-11-15.
  10. 10. Конъюгат по любому из пп.1-9, который имеет период полувыведения у человека 12 ч или более, например 12-21 суток.
  11. 11. Конъюгат по любому из пп.1-10, который связывается с человеческим сывороточным альбумином с ΚΌ (аффинность) в диапазоне от примерно 5 мкмоль до примерно 1 пмоль.
  12. 12. Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат по любому из пп.1-11 в комбинации с фармацевтически или физиологически приемлемым носителем, эксципиентом или разбавителем.
  13. 13. Композиция, которая содержит (а) конъюгат по любому из пп.1-11 и (б) дополнительные терапевтические или активные агенты, для раздельного, последовательного или одновременного введения субъекту.
  14. 14. Применение композиции по п.12 или 13 для лечения или предупреждения метаболического заболевания или расстройства.
  15. 15. Применение по п.14, где заболевание или расстройство выбрано из гипергликемии, нарушенной толерантности к глюкозе, дефицита бета-клеток, диабета (диабета типа 1 или типа 2 или гестационного диабета), ожирения или заболеваний, характеризующихся перееданием.
    - 34 021146 (a) Продукт слияния 2х6ЬР-1 А86 ϋΟΜ7Ιΐ-14 (ОАТ0114)
    НОЕОГГГ8ОУ§$УЕЕО0ААКБИА5УЬУКОКНОЕОТРТ8ОУ$8УЬЕООААКЕ
    ΠΑ\νρνΚ(5ΚΟΪ9ΜΤρ8Ρ85ΕδΑ8ναθΚνΤΓΓ€ΐυν89\νΊΟ89Ε8\νΥ9ΡΚΡΟΚ
    ЛРКЕЕГМАУКЗЗЕрЗОУРЗРРЗОЗОЗОТОРТЕТБЗЕрРЕОРАТУУСАрОААЕР
    ЯТРОрОТКУЕЖа (5ЕО Ю ΝΟ: 1) (b) Продукт слияния эксендина-4, (648)3 линкера, ООМ7Ь-14 (ОАТ0115) НаЕСЛ'П'80Е8К9МЕЕЕАУ8ШЕ^ЬКНС6Р$86АРРР8аС<ЮС150О605С ϋϋΟ3ΟΐρΜΤρδΡ38Ε3ΑδνθϋΚνΤ1Τ€ΚΑ8ρ\νΐΟ3ρΐ,8\νΥ03ΚΡΟΚΑΡΚΙΧΪ М\¥К.88ЬР8СУР8КР308С18С>ТОРТЕТГ58ЕрРЕОРАТУУСАрОААЬРКТЕО<) откуежк (8ЕО Ю N0: 2) (c) Продукт слияния эксендина-4 ООМ7К-14 (ОАТ0116)
    ΗΟΕΟΊ'Π'30ΙΑΚ9ΜΕΕΕΑνΚΡΡΙΕλνΐ,ΚΝΟΟΡ330ΑΡΡΡ800Ι9ΜΤΟδΡ58Ε5Λ
    ЗУ00КУГП'СКА8()\УЮ8рЕ8\УУррКР0КАРКЕЫМЛУК88Ер80УР8КЕ8О8
    О8СРП7РТЕТ185ЕрРЕОЕАТУУСА0СААЕРРТЕОрСТКУЕГКК (8ЕО Ю N0: 3) (ό) Продукт слияния эксендин-4, спирального линкера, ООМ7И-14 (ОАТ0117) ΗΟΕΟΤΕΤ8ΟΙ.,8Κ0ΜΕΕΕΑνΗΕΡΪΕ\ν{,ΚΝΟϋΡ85θΑΡΡΡ80ΚΕΑΑΑΚΕΑΑΑΚ ΕΑΛΛΚΕΕΛΑΚΕΛΑΑΚΕΑΑΛΚΕΛΑΑΚΕ1ΑΑΟΐρΜΤρ8Ρ88Ε8Α3νθυκνΤΡΓ ϋΡΑ80ΨϊΟ^Ε5’^Ύ9<5ΚΡ6ΚΑΡΚΕΕίΜ^'Κ5δΕ9δθνΡ8ΗΡδΟ8686ΤΟΡΊΧΤ 188Е^РЕОЕАТУУСАР6ААЕРКТЕО0ОТКУЕ1КК (8Е0 Ю N0: 4) (е) Продукт слияния 6Ι_Ρ-1 Α8Θ, (648)3 линкера, ϋΟΜ7Μ4 (ϋΑΤ0118)
    ЕЮЕ0ТРТ8ОУ88УЕЕСрААКЕР1АШЕУКОКОООО8СЮОС80О00г8П1(^МТ
    08Р88Ь8А8УООКУТГГСРА5<Зи<Ю8(ЗЕ8\УУ09КР6КАРКЕЫМ\¥К88Е986
    УР8РР8а808€РтЕП/П83ЕрРЕПЕА7УУСАрОААЕРкГГОрОТКУЕ1КК (8Е0 Ю ΝΟ: 5) (ί) Продукт слияния 6Ι-Ρ-1 А86, РЗЗ линкера, ООМ7К-14 (ОАТ0119) НОЕСТЕГ8ВУ88УЕЕО(5ААКЕР1АЖУКОКОР53ОК)МТ05РЗЗЕ8А8УООК УТГГСКА8<ЛУЮЗрЕЗ^ррКРОКАРЮЛ.ЛМ\И<88Е98ОУР8РР8С8О8етО Р7'1,Т!88ЕрРЕОРЛТ\’УСАраЛАЕРКТНСрОТКУЕ!КК.
    (5Е<2 Ю N0: 6) (д) Продукт слияния 6ЬР-1 А86, спирального линкера, ООМ7И-14 (ОАТ0120)
    НОЕСР1ТТ8ОУ88УЕЕа$ААКЕПАУЪУКОКаКЕАААКЕАААКЕАЛАКЕЕА
    АКЕАААКЕАААКЕАААКЕЕААШ0МГ98Р88Е8А8УСПКУТГГСРА80^Ю
    8рЕ8\У¥р9КРаКАРКЕЕ1Ми^85Ер$бУРЗКЕ§О8а8ОТтТТ188ГОРЕПБ
    АТУУСАраЛАЕРРТРСрСРГКУИКП (8Е0 Ю ΝΟ: 7) (Ь) ООМ7К-14:
    8ЕО8ОУР.8РЕЗО8СЗОТ№~ГЕТ188ЕОРЕРРАТУУСАООААЕРРТЕСОСТКУЕ
    ГКК (8Е0 ГО ΝΟ: 8) (ΐ) 6Ι.Ρ-1 (7-37) А86:
    ΗΟΕΟΤΡΤδΡνδδΥΕΕΟ^ΑΛΚΕΡίΑΨΕνΚσΚΟ (8Е0 ГО ΝΟ: 9)
    ()) эксендин-4:
    Η0Ε0ΤΕΤ30Ε8Κς)ΜΕΕΕΑΥΚΕΡ1Εν/ΕΚΝθ0Ρ880ΑΡΡΡ8 (8ΕΟΙϋΝΟ:10)
    - 35 021146 (k) спиральный линкер:
    КЕАЛАКЕАААКЕАААКВХААКЕАААКЕАААКЕАААКЕЬАА:
    (8ЕО Ю ΝΟ: 11) (l) 61у-3ег линкер:
    0000080000800008 (ЗЕО Ю N0: 12) (т) Продукт слияния эксендина-4, (648)3 линкера, ООМ7И-14-Ю (ϋΜδ7139)
    Η0ΕΟΤΡΤ8ϋ1.5Κ0ΜΕΕΕΑνΚί.ΠΕ\νΕΚΝ0ΟΡ880ΑΡΡΡ80Ο0005(}00050
    СОО51)1рМТр8Р88Е8А8УОааУПТ0а.А8р^Ю8РЕ8^00КРОКАРКЕЫ
    ΜΨΚ55Ε0δθνΡ8ΕΡ5Ο8Ο80ΤϋΡ'ΓΕτΐ88Ε0ΡΕΟΡΑΤΥΥ0Λ0ΟΕΚ№Κ1ΈΟ0
    0ТКУЕ1КК.
    (δΕΟ Ю ΝΟ: 24) (η) Продукт слияния эксендина-4, (648)3 линкера, ϋΟΜ7Ιι-11-15 (ϋΜ37143)
    НОЕОТРТ80Е5КрМЕЕЕАУКЕПЕ\УЕКХООР880АРРР8000008000080
    0005ΰίΟΜΤ08Ρ8$Ε5Α$νθΠΚνΤΙΤΟΪΕ\$№ΟΤΜΕδ\νΥΟΟΚΡΟΚΑΡΚΕΠ
    ЕАР8КЕр8ОУР8КР8О8О8ОТОРТ1Л188ЕрРЕ0РАТУУСЛ0АО'ТНРТТРОрО
    ΤΚνΕΙΚΚ (δΕΟ Ю N0: 25) (ο) ϋΟΜ7ή-14-10
    РЮМТ08Р88Е8А8УОЕ>КУТ1ТСКА8О\У1О80Е8ШООКР0КАРК1..Е!МЛУК8
    8Т080УР5КР805080ТРГТЪТ185ЕОРЕРРАТУУСАООГ,КНРКТТОООТКУЕ
    ΪΚΚ (δΕΟ Ю N0: 26) (ρ) ϋΟΜ7ϊι-11-15
    РКЖГ08Р83[.§А8УОРктГС)1А5КРЮГМЕ8\УУООКРОКАРКЫЛЕАР8И
    ΕΟ80νΡ8ΗΕ868(35ΟΊΌΕΤΐ;Π88ΐηΡΕΠΕΑΤΥΥ€Α0ΑατΐΙΡΤΤΡαθΟΤΚνΕΊ
    Ο (8Ε0 Ю N0: 27) (ς) ОтрТ АМА сигнальный пептид (лидерный) ΜΚΑΚΕΕΟίνΕΤΤΡΪΑΙδΑψΑ (δΕΟ Ю ΝΟ: 28) (г) ООМ7К-14-ЮРЮ8С г&8£®8@1дШи8814рес11а1уусая^^Ьрк1^®1:куе9«;
    (δΕΟ Ю N0: 42) (δ) ΡΥΥ 3-36 (с лизином в положении 10) ΣΚΡΕΑΡ0ΚΟΑ5ΡΕεΕΝΕΫΥΑ5ΕΡΗΥΕΝΕνΤΚ0ΡΥ (δΕΟ Ю ΝΟ: 43)
    Фиг. 1. Аминокислотные последовательности
    - 36 021146 (a) ОАТ0114 - последовательность нуклеиновой кислоты (из конструкции млекопитающего):
    САТ0ОТСААОССАСеТТТАССАвТ<АТСТАА0Т1СТТЛТТТаСААОСеСА
    АОСТОССААООААТТСАТТССТТООСТООТОАААС.СССОАСАТСО'ГСАА
    00ОАССТП'АССАСТОА1'ОТААОТОП'АГП'00ААС0ССАА<5СТОССАА
    ССЗААТТСАТТССТТ00СТСОТСАААСОСС0А0АСАТССАСАТСАСССА0
    ТСТССАТССТСССТСТСТССАТСТСТАООАОАССОТОТСЛССАТСАСЛО
    ССЙООСААОТСАОТСЮАТТОООТСТСАОЧТАТСТООГАССАОСАСЛАА
    ССАССОЛЛАаССССТААССТССТСАТСАТСТСССС.'ГГСС1’СС.ГГОСААА
    ОТСОСОТСССАТСАСОГП'САОТООСАСТСОАТСТОООаСАОАТТТСАСТ
    СТСАССАТСАОСАаТСТССААССТСААОА'ПТГОСТАСОТАСТАСТОТОС тсасоотоссосоггосстаооасслтсосссаасссассааостссаа
    АТСАААСОО (ЗЕО ГО N0: 13) (b) ОАТ0115 - последовательность нуклеиновой кислоты (из конструкции млекопитающего):
    сатоотоааооаасатттассаотсасттотсааааслоатсоалолос асосастсссотталтаттсаотоостгааоаасооасоассаастао
    ССОООСАССТССОССАТСОООТСЮТСЮАОеССЮТТСАСаСООАООТСЮС
    АОС<ЗОСООТООСС<тОТСОаАСАТССАОАТОАСССЛОТСТССАТССТССС
    ТСТСТССАТСТОТАООЛОАССОТОТСАССАТСАС'П'ОССОООСААОТСАО
    ТСОА'П'ОООТС'ГСАОТТАТСГГСОТАССАОСАСАААССАаООАААОССС
    СТААОСТССТСАТСАТОТООСС'П'ССТСОТГаСАААОТООООТСССАТСА
    СОГГГСАОГ00СА0ТС0АГСТССОАСАСАТГТСАСТСТСАССАТСАОСАС
    ТСТССААССТСААОАТТТТОСТАСОТАСТАСТСТОСТСАОООТОСеССОТ
    ТОССТА0ОАСОТТСООССАЛ(ЮСАССААОСТООЛААТСААЛССтО (ЗЕО ГО N0: 14) (с) ОАТ0115 - последовательность нуклеиновой кислоты (из конструкции Е. соИ)‘.
    САСО<ЗТСААааТАССТГСАССТСТС5АССТОАОСАЛАСАОАТеОЛООАА0
    ЛАСССОТТСОТСТСЯ'ТСЛТСОАОТСОСТСЛААААСОСТСаТСССГГС'ГГСТ <30 ГОС'ГСССССАССОТСТОСТООТОСТООТСОЛ’СГСО тсстсстсоттс
    ТСОТООТООСООТАСССАСАТССАСАТСАСТСАСЗТССССААССТСТСТОТ
    СТОССТССОТТООСОАТСОТОПАСОАТСАСОТаССОТССТТСТСАСТОС
    ΑΊ СООТОССАОСТО'ГССТССТАТСАОСАОАААССОООСАААОССССОА
    ААСГССТСАТСАТСТООСОТАОСТСТСГОСА(ЗТСТООТОГАС.СаАОССОС
    ГТСГС'ГССГП'С'ГССГГГСТСО'ГАССаАС'ГГСАСССТ'ОАССАГТТССТСТСТС
    САОССООААСАТТТСОСОАССТАСТАСТСТССТСАОООТССООСАСТОС
    САСОТАСТТТТ0СССАО<ЗСТЛСОААА0'ГСС.АОАТТАААССТТААТСА (5Е<2 ГО N0:15) (ύ) ОАТ0116 - последовательность нуклеиновой кислоты (из конструкции млекопитающего):
    САТСтСТСААОСААСА'ГПАССАСТОАСТТОТСААААСАСАТСОААОАОО
    АСОСАбТССООПАГГТАТТОАОТООСГГААОААСОСАООАССААОТАС
    ССОООСАССТСССССАТСОООТаАСАТССАОАТОАСССАСТСТССАТССТ
    СССТОТСТОСАТСТОГАООАОАССОТОТСАССА'ГСАСТГОСССЗОССААОТ
    САОГ0аАТГ00а’Г’ОГСЛОТТАТСТГСОТАССАОСА0АААССА<ЗООААА<3
    ССССТААОСТССТСАТСАТОТООСОТТССТСОТТОСАААОТОСЮОТСССА
    ТСАСОПТСАОТОССАОТСОАТСТООСАСАОАТТТСАСТСТСАССАТСАО
    САСТСТОСААССТСЛАСАТТТТОСТАСОТАСТАСТСТССТСАООСТСССС
    ССТТСССТА00ЛСОТГСС00САА00ОАССААСОТССАААТСАААС0С.
    (5Е<2 ГО N0:
  16. 16)
    - 37 021146 (е) ϋΑΤ0116 - последовательность нуклеиновой кислоты (из конструкции Е. соИ):
    САСООТОААООТАСС'ГТСАССТСТОАССТОАОСАААСАОАТООАООААО
    АА^ОО'П'СО'ГСГОГГСАТООАОТООСТОАААААСООТООТССОТСТГГСТ
    ОСТССТСССССАССОТСТСАСЛТССЛОАТСАСТСАОТССССАА(5СТСТСТ
    ОТСТОССТССОТТООСОАТСОТОТТАССАТСАСОТСССОТОС'ГТСТСАОТ
    ООАТССО'ГГСССАОСТСТССГОСТАТСАОСАОАААССОООСАААОСССС
    ОАААСТССТОАТСАТСТООСОТАОСТСТСТССАОТСТООТОТАССОАОСС
    ОСТТСТСТООТТСТООТТСТООТАССОАСГГСАСССТОАССА1ТГССГСТС
    ТОСАОССООААОА
    ГП'ССССгАССТАСТЛСТСТСС'ГСАСаОТССОССАСТаССАСОТАСТТГТО
    ОССАОООТАСОАААОТСОЛОАТТАААС01ТААТОА (5ЕО ГО N0:
  17. 17) (О ОАТ0117 - последовательность нуклеиновой кислоты (из конструкции млекопитающего):
    САТООТОААООААСАТТТАССАОТОАС'ГТОТСААААСАОАТООААОАОО
    АООСАОТССОО'ГГА'ПТА'ГГОАО'ГООСТТААОААСООАООАССААОТАО
    СООООСАССТСООССАТСОООТАААОААОСООСООСОАААОААОСООС
    ООСОААЛСЛАССООСООСОАААОААТТООССОСААААСААОСОСССОС
    ОАААС.АЛССаС»ССЮСОАААОААОСОССООСОАААОАА-ГГО<}ССОСЛСА
    САТССАОАТаЛСССАСТСТССАТССТСССТСТСТОСЛТСТаТАССАСАСС
    ОТОТСАССАТСАСТТОССОООСААОТСАОТООАТТОООТСТСАОКТАТСТ
    ТООТАССАОСАОАААССАОСОАЛЛСЮСССТААОСТССГСАТСАТОТОСС
    ОТТССТСОТТОСАААОТООООТССХАТСАСОТТТСАОТООСАОТООАТСТ
    ОООАСАОАГПГАСТСТСАССАТСАОСАОТО'ОСААССТОААОАТТТТОС
    ТАСОТАСГАСГОТОСТСАОООТОСООСОТТОССТАООАСОТТСООССАА
    ОООАССААООТООАААТСЛААСОО (8ЕО ГО N0:
  18. 18) (д) ОАТ0117 - последовательность нуклеиновой кислоты (из конструкции Е. соН):
    САСООТСААООТАССТГСАССТСТОАССТОЛОСАААСАОАТООАООААО
    ААОСОСГГСОТСТОТТСАТСОАОТООСТОАААААСООТООТССОТС'П'СГ
    ООТССТССОССАССОТСТАААОААОСООСООСОАААОААОСООСОССС
    АААОААОСООССОССАААОААГгеаССОСААААСААОСОССОбССгААА
    ОААОСООСООСОАААОААОСООСООСОАААОААТТООССОСАСАСАТС
    САОАТОАСТСАОТССССААОСТСТСТОТСТОСС'ГОСОТТООСОАТСОТОТ
    ТАСОАТСАСОТОСССГОСГГСТСАОТООАТСООП'СССАОСТОТСО'ООТ
    АТСАОСАОАААССОСОСАЛЛОССССОАААСГССТОАТСАТСТССССТАС
    СТСТСТОСА6ТСТОО'Г'аТАССОАСССССГ1'СТСТОО'ГТС('ОС'Г'ГС'ГООТАС
    СОАСГГСЛСССТОАССАТТТССТСТСТОСАСССООААОАТГТСОСОАССТ
    АСГАСТСТОСТСАОООТОССССаСТОССАССП'АС'ГТГТООССАООСТАСС
    АААОТССАОАТТАААСОТТААТОА (8ЕО ГО N0:
  19. 19) (ή) ОАТ0118 - последовательность нуклеиновой кислоты (из конструкции млекопитающего):
    САТООТОААОООАССТГГАССАОТОАТОТААОТТСТТАТТТООААООССА
    АССТОСС.ААООААТТСАТТОСТТОаСТООТОЛААООССОАООТООАООС
    ООТТСАОССОаЛСОТООСАОСООСООТСССОООТСОСАСАТССАОАТО
    АСССА0ТСТССА1'ССТСССТ0ТСТ0САТСТ0ТА00А0АСС0Т0ТСАССАТ
    САСТТОССОО<ХАЛСТСАОТСОАТТОООТСТСАСТТАТС'П'С»ОТАССАОС
    АОАААССАОООАААОССССТААОСТССТОАТСАТСТООСОТТССТСОТГ
    ОСАААОТСОС»ОТСССАТСАСС’ПГ'САОТСС.САОТСОАТСТОООАСАОАТ
    1ТСАСТСТСАССАТСА0СА0ТС’ГОСААССТСААСАГГТОСТАС01'АСТА
    СТСТССТСАОООТОССЮСОТТОССТАООАСОТГСООССААОООАССААО
    ОТОСЛАЛ ТСАААСОО (5Е<а ГО N0: 20)
    - 38 021146 (ί) ϋΑΤ0119 - последовательность нуклеиновой кислоты (из конструкции млекопитающего):
    СЛТООТОАЛбООЛССПТГАССАО'ГОАТС'ГАЛОТТСтаТ'Н'аОААООССА
    АССТОССААООААТТСАП'ССП'ОСЮТССтТСАААСОССОАООАССААОС
    ТСО(}АСА'ГССАОА'ГОАСССАОТСТССАТССТСССТОТСТОСАТСТСТАСО
    АСАСССТСТСАССАТСАСТТСССОСОСААСТСАОТСОАТТООСТСТСАС
    ТТАТСТТООТАССАССАОАААССАОООАААСССССТААОСТССТаАТСА
    Т6ТООСО'1’ГССГСО'П'ОСАААО'ГбаООТСССАТСАССГГГСАОТаСгСАОТ
    ООАТСТОСОАСАСАТТТСАСТСТСАССАТСАОСАОТСТСзСААССТОААО
    АТПТОСГАСС.ГАСТАСТСТССТСАОССТОСООСОТТОССТАООАСОГГС
    ООССААССОАССААОСТОСАААТСАААСОО (5ЕО Ю N0: 21)
    0) ϋΑΤ0120 - последовательность нуклеиновой кислоты (из конструкции млекопитающего):
    сатоотсаасюоассттгассаотоатстааоттсттатттооаасссса
    АОС'ГОССААООААТТСАТТОС'П’ООСТСОТСАААООССОЛООАЛАЛОАА
    ОСаОСООСОАААОАЛОСООСООСОАААОААОССаСООСОАААОААТТО
    СССС.СААААСААаССОСОССОАААОАЛОСООСООСОАААОАЛОСООС
    ООСОАААаААТТОСССОСА(ЗАСАТССАС»АТСАСССАОТСТССАТСО'СС
    СТСТСТОСАТСТОТАООАОАССОТСТСАССАТСАСГГОССОООСААОТСА
    ОТООАтЮОТСТСАаТГАТС’ГТС6ТАССАОСАС»АААССАСООАА.АаСС
    ССТААОС'ГССТОАТСАТОТСОСОТТССТСОТОСАААОТОООеТСССАТС
    АСОПТСАС'ГСССАОТСОАТСТООСАСАОА'ГТТСАСТСТСАССАТСАОСА
    ОТСТОСААССТСААОАТТТТОСТАССТАСТАСТОТССТСАСООТСССОСО
    ТТОССТАСОАСОТТСООССААОООАССААООТОСАААТСАААССЮ (ЗЕО Ю N0: 22) (k) 0от7И-14 - последовательность нуклеиновой кислоты
    САСАТССА<ЗАГ«ЗАСССАСТСТССАТССТСССТСТС1'аСАТСТОТАООАОА
    ССОТОТСАССАТСАСТТСССОООСААОТСАСТООА'ГТООбТСТСАОТТАТ
    СТТаОТАССАССЛО.АААССАОООАЛЛОССССТААС.СТССТОАГСА'ГСТС аС<ПТССТСОТТССАААОТССС»СП'СССАТСАСОТТТСАОТСОСАОТ6ОАТ <:ТССОАСАОА1'ТГСАСТСТСАССАТСАОСАСТСТССААССтеААОАГПТ
    ОСТАСОТАСТАП'СхТОеТСАОООТСССОСОТОССГАООАСС'ПГСЮССА
    АОООАССААООТСОАААТСАААСОО (ЗЕО ГО ΝΟ: 23) (l) Продукт слияния эксендина-4, (048)3 линкера, 0ОМ7И-14-10 (0М87139)
    САТСОТОААООААСА1ТГАССАОТСАСТТОТСАААЛСАОАТОСААОАОО
    АОСхСАОТОСООТТАТГТАТТСАОТООСГТААОААСОСгАООАССААОТАО
    ССЮОССАССТССОССАТСОСОТСКЗТСаАСЮССО'П'САООСОСАООТСОС
    АОСаОССОТООССОСП'СаОАСАТССЛОАТОАСССАОТСТССАТССГССХ
    ТСТСТССЛТСТОТАОСАОАСССТСТСЛССАТСАСГгеССОСаСААСТСАО
    ТСОАТТОССТСТСАОТТАТСТТООТАССАОСАаАААССАОС»ОАААОССС
    СТААОСТССТСАТСАТСТСОСОПССТСОТТОСАААОТСОООТСССАТСА
    СОТ’ГТСАОТООСАСТООАТСтеООАСАОАП-ТСАСТСТСАССАТСЛОСАО
    ТСТаСААССТОААОА'ПТГС€“ГАСОТАСТАСТОТССТСАОСОТТТСАСЮС
    АТССТААСАСОТТСООССААОСОАССАЛСОТСОАААТСАААСаО (ЗЕО ГО ΝΟ: 29) (т) Продукт слияния эксендина-4, (048)3 линкера, ΟΟΜ7ΙΊ-11-115 (0М37143)
    САТОСТОААОСААСАТТТАССАОТС.АСТТОТСААААСАСАТОСААОАОО
    АСОСАОТССО<ЗПАПТАГГОАОТСО<ПТААОААСО<5АООАССААОТАО
    СОСЮСК'АССТССаССАТСООСгТССхТСОАаОССЗОТТСАООСООАООТСОС
    - 39 021146
    АОСООССЮТСОССОаГСООАСАТССАОАТОАСССАОТСТССАТССТССС ТОТСТОСАТСТОТАОСАОАСССТОТСАССАТСАСТТОССОООСААСТСОТ СССА’ГГОООАСОАТОГГААОТГООТАССАОСАОАААССАОСаАААОССС СТААОСТССТСАТССГ'геСПТП'СССа'1П'ОСАААОТООО<;ТСССАТСА СОГГТСАОТСОСАаТООАТСЛ'ССгОАСАОА'ГТТСАСТСТСАССАТСАОСАО ТСТССААССТОААОАТТТТССТАСеТАСТАСТССОСОСАООСТОООАСОС АТССТАСОАСОТТСООССААСКЮАССААООТСОАЛАТСАЛЛССО (8ЕО Ю N0: 30) (η) 0от7Н-14-10 - нуклеиновая кислота
    САСАТССАСгАТСгАСССАОТСТССЛТСС'ГСССТСгТСТСГОА'ГСТОТЛаОАСА ссототсассатсасттсссооосааотсаотсоаттссютстсасттат СТТООТАССАОСАОАААССАОСОАААОССССЪААОСТССТСЛ'ГСАТСТС ССОТТССТСОТТССАЛЛОТСООСТСССЛТСАСОТП'САОТСОСАО'геОАТ СТСаОАСАСА’ПТСАСТСТСАССАТСАССАОТСТССААССТОААОАТТТТ ОСТАСОТАСГАСТСТОСГСАОООТП'ОАООСАТССТААОАСОТТСОбССА А ОООАССААСГОТСаАААТСАААСОа (δΕΟ Ю N0: 31) (o) ϋΟΜ7Ιι-11-15 - нуклеиновая кислота
    ОАСАТССАОАТСАСССАОТСТССАТССТСССТСТСТССАТСТСТАООАОА
    ССОТОТСАССАТСАСТГОССОООСААОТСОТССОАТТОСОАСОЛТОГГАА
    О’ГТООТАССАОСАО/кААССАОООАААОССССТААОСТССГСгАТССГГОС
    ГГГГТСССОТТТССАААОТСССОТСССАТСАССТГТСАСТСССАОТООАТ
    СТОООАСАСА'ГТТСАСТСТСАССАТСАОСАОТСТОСААССТСААОАТПТ
    ОСТАССТАСТАСТССССОСАОеСТСООАСССАТССТАСОАСОГГСОеСС
    АА СОС.АССААОСТССАААТСААЛСОО (8ЕО Ю N0: 32) (p) ОтрАМА сигнальный пептид- последовательность нуклеиновой кислоты ак§сддде§айасгсскаддаака§1сс1дасааессекаксдс§а1са^едс«.§ддес (δΕΟ Ю ΝΟ: 33) (η) ϋΟΜ 7И-14-10 К108С - последовательность нуклеиновой кислоты §аса1сса§а1ёассса§Шсса1сс1ссс^Ш§са1с(0:й^з§аееё1^еасса1сасаясс^саайи;8ё аай^|§^кссса1сас§1иса§^ёса^1^§а(с{§§.^асаёашсас1с1сйсса1сайсаё1с1§саасс1ёаа§ (5ΕΩ Ю N0: 44) (г) Последовательность кДНК рецептора ΘΙ.Ρ-1 яванского макака АТСбССООСАСССССООСССОСПОСОССТСОСОСТССтеСТОСТСОСЮОТ СОТОООСАОСОСССЮСССССОСССССАОООТОССАСТОТОТСССТСТОС САаАСАЮТССАОАААТООССгЛОААТАСССЗАСОССЛОТОССАОСОСТССС ТСАСТСАСГхАСССАССТСССОССАСАОАСТОТТСТССААССООАССТТС ОАТСААТАТСССТССТООССЛОАТСОООАОССАООС'ГССГГСаТОААТО ТСАОСТОССССТСаТАССТССССТСООССАОСАСТСТбССССАОСуОССА СОТСТАСС<301ТСГаСАСА(ЗСГОААШССТСГОССТССА(ЗААООАСААС ТССАОС€ГГОСССТСГтЛаССАСТГСТСС<хЛОТОТОАСОАОТССААОСОАО (ХЮАОАОАААТГССССООАООАОСЛССТССТСТСССТСТАСАТСЛТСТА САСОСТССССТАСОСАСТСТССТТСТСТОСТСТСОТТАТССССТСТСССА ТССТССТТООСТГСАСАСАССТОСАСтеСАСССООААСТАСАТССАССТО ААССТОТТТОСАТССТТСАТССТйСбАОСЛТГСТССОТСЛТСАТСААООА СОСАОСССТСААОТСОАТСТАСАОСАСОС»ССОСССАОСАС(САССАОТС6 бАТОйОСТССТСТССТАССАСЮАСТСТСТааСО'аССОСОТОСТОТГТСТ аСТСАГССААТАСТСТОТСОСООССААТТ'АСТАСТООСТСТТООТОСАОО ОССгТСТАССТСТАСАСАСТССТООССТТСТССГуТСТТСТСТСАОСАЛСОЛ АТС’ГГСАООСТОТАТСТСАОСОТАООСТООООТСГГССССТССТОГГТОТ ТСТССССТСОООСАТТОТСААОТАССТСГА^ОАООАСОАООбСТССТСЮ АССАООААСТССААСАТСААСГАСТСИЭСТСАТТАТССООСТОСССАТТСТ аТГбССАГГСЮСКТГСААСТГССТСАТСТТТОГГСОООТСАТСТОСАГСОТ СХЗТАТОА ААСТСААСОССААТСТСАТС ТССААСАСАОЛСАТСЛААТС
    - 40 021146
    САСАСТТОССААОТССАСОСТОАСАСТСЛТСССССТССТОаООАСТСАТС
    АООТСАТСТТТСССЛТТОТСАТСЮАСОЛССА'ГОСССООООСАСССТОСОС
    ТТСАТСААОСТСГГСАСООАОСТСГССП'ТАССТССТ'ГССАОООС.СТОАТ
    ООГаСССАТСГГОТАСГОС'ГПаТСААСААТСАОСТССАОТТООААПТГС
    ООААОАОСТОООАОСОСТСОСООСТТОАССАС'ГТОСАСАТССАОАОООА
    САОСАОСАТОДАОССССТСААОТОТСССАССАОСАОССТСАОСАОТСОО
    СССАСаОСССССАОСЛССЛТОТЛСЛСЛОССАСГГОССАОСССТССТОСА
    ОС (8ЕО Ю N0: 45) (з) Олигонуклеотид 1
    ООААТГССАТАТОААААТСААААССООТССТСОСАТССТООСТСТСТССО
    СТСТОАССАСГАГаАТОТТСТССОСП’ССОСОСТООСТСАТООТСААООА
    АСАТТТАССАОТОАС (5Е0 Ю ΝΟ: 47) (I) Олигонуклеотид 2
    ОТГСАОААГ'ГС'ГТАТ'ГАСССтПТОАТТТССАССТТООТСССТТО (5Е0 Ю N0: 48) (и) Последовательность нуклеиновой кислоты ϋΜδ 7139 для экспрессии в Е. соН сас^^ааё8Сас§«сасс{с^асс15аёсаааса§аг§8абеааёааёс§бШ^1с1§«са1с8а8га^с15а §садедайисса§а1§ас!:са^ссссд1спйс1е1се§се1с1§К§§сдассд(§йасеа1саеи|Дсд18сдад ссад1§8а(сд§Цсссадсгдадс1дд1а1садсадаааесдддсааадедсссаааеГ§с1да1са1йддсде1е1 а§ссГ§са§Тс1^§1^Гасс^{с1сёШс1сс§§сГсГ2^и:1^1ас^ас«сассс1сасёг11е1с«ссс18саёсс ^§аа^ас1й^ссасс1ас1ас1§с§сасаё§ё1с1§сё1сассс8аааассис^саё^§1ассааа§1сёа§а1с ааасд!
    (5Е<5 Ю N0: 50)
    Фиг. 2. Последовательности нуклеиновых кислот = Масса тела (% изменения относительно исходного уровня·
    Фиг. 3а
    Фиг. 3Ь
    - 41 021146
    Фиг. 4
    Фиг. 5
    Время (мин)
    -1 Пик 1 Полидисперсность Мж/Мп Мж/Мп Μζ/Μη Μζ/Μη Значения молярной массы (г/моль) Мп 1,741 е+4 (1%) Мж 1,743е+4 (1%) Μζ 1,744е+4 (3%) Пределы пика (мин) 34.682 - 37,664 Инъецируемая масса (г) 1,0000е-4 Рассчитанная масса (г) 9,9398е-5
    Фиг. 6
    Время (мин)
    Пик 1 Пик 2 Полидисперсность Мж/Мп 1,017 (25%) 1,001 (17%) Μζ/Μη 1,037(46%) 1,003 (30%) Значения молярной массы (г/моль, Мп 4,378е+4 (17%) 3,471 е+4 (12%) Мж 4,454е+4 (18%) 3,475е+4 (12%) Μζ 4,538е+4 (42%) 3,480е+4 (27%) Пределы пика(мин) 8,311 -8,564 8,728 - 8,992 Инъецируемая масса (г) 2,0000е-4 Рассчитанная масса (г) 2,2014е-5 3,5001 е-5
    Фиг. 7
    - 42 021146
    Пик 1 Полидисперсность Μνν/Μη 1,009(16%) Μζ/Μη 1,019(29%) Значения молярной массы (г/моль) Мп 2,532е+4 (11%) Μνν 2,555е+4 (12%) Μζ 2,579е+4 (26%) Пределы пика (мин) 9,447-10,272 Инъецируемая масса (г) 1,5500е-4 Рассчитанная масса (г) 6,3720е-5
    Фиг. 8 (a) отрА (происходящая из Е. соИ)
    ΜΚΚΤΑΙΑΙΑνΑίΑΘΡΑΤνΑΟΑ (ЗЕО Ю ΝΟ: 34) (b) отрА-АМА (искусственная последовательность) МККТА1А1А\/А1_АОРАТ\/АМА (искусственная последовательность) (ЗЕО Ю ΝΟ: 35) (c) отрА-АМА (искусственная последовательность) ΜΚΚΤΑΙΑΙΑνΑίΑΘΡΑΤλ/ΑννΑ (искусственная последовательность) (ЗЕО Ю ΝΟ: 36) (ΰ) отрТ (происходящая из Е. соН)
    ΜΒΑΚΙ_Ι_0ΐνΐ_ΤΤΡΙΑΙ5δΡΑ (Е со//) (ЗЕО Ю N0: 37) (е) отрТ-АМА (искусственная последовательность)
    МРАК1±С1\/1_ТТР1А15АМА (искусственная последовательность) (ЗЕО Ю N0: 38) (ί) 6АЗ (происходящая из 3. сегеУ151ае)
    М1_РК31_8К1_АТАААРРА6УАТА (5. ΟθΓθνϊδΐθβ) (ЗЕО Ю ΝΟ: 39) (д) 6А5-АМА (искусственная последовательность) ΜΙΡΚ3ί3ΚΙΑΤΑΑΑΡΡΑ6νΑΜΑ (искусственная последовательность) (ЗЕО Ю N0: 40) (И) САЗ-АУУА (искусственная последовательность) М1.РК31.5К1_АТАААРРА6\/АУУА (искусственная последовательность) (ЗЕО Ю N0: 41) (ϊ) Ре1 В (Епмгйа саго1оуога)
    МКУИРТАААСШЬААОРАМА (ЗЕО Ю ΝΟ: 46) (Ϊ) сигнальная последовательность Ма1 Е ΜΚΙΚΤ6ΑΡΙ ЦМЗАЬТТММРЗАЗАкА (ЗЕО Ю N0: 49)
    Фиг. 9. Лидерные аминокислотные последовательности
    - 43 021146
    Фиг. 10
    Фиг. 11
    ОвНа НЬА1с МаНЫМс
    Фиг. 12
    Фиг. 13
    - 44 021146
    Й1яп1(ц5р5$!5а5удйгуааа5чулдбз15^язкр8карк1!)т»ге£к]5дур5
    Пзд5дздФйП(551дрей(а1уусадд!гЬркПддд«<уе!кс ίΚΡ£ΑΡΘΚ0Α3ΡΕΕΙΝΚΥΥΑ36ΚΗΥΙΝΐνΤΚ0ΚΥ-ΝΗ2 (8Е0 Ю ΝΟ: 37) где | означает химический линкер
    Химический линкер имеет следующую структуру:
    Фиг. 14
    Перечень последовательностей <110> ХЕРРИНГ, Кристофер ХОЛЬТ, Люси ЭСПЕР, Лорен МАЙЕР, Себастьян ПУПЕКА-СВИДЕР, Малгожата <120> Продукты слияния и конъюгаты лекарственных средств <130> ОВ63558 ИО <150> из 61/163917 <151> 2009-03-27 <160> 52 ' ' <170> ЕазбЗЕО для Игпбомз УегзЬоп 4.0 <210> 1 <211> 168 .
    <212> ПРТ .
    <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Продукт слияния 2хСЪР-1 А8С ООМ7Ь-14 (ϋΑΤ0114)
    <400> 1 ΗΪ5 С1у С1и С1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Азр Уа1 Зег Зег Туг Ьеи С1и С1у 1 5 10 15 С1п А1а А1а Ьуз С1и РЬе Не А1а Тгр Ьеи Уа1 Ьуз С1у Агд Низ С1у 20 25 30 С1и С1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Азр Уа1 Зег Зег Туг Ьеи С1и С1у С1п А1а 35 40 45 А1а Ьуз С1и РЬе 11е А1а Тгр Ьеи Уа1 Ьуз С1у Агд Азр Не С1п Меб 50 55 60 ТЬг О1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТЬг 65 70 75 80 Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Тгр Не С1у Зег О1п Ьеи Зег Тгр Туг 85 90 95 С1п С1п Ьуз Рго О1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Меб Тгр Агд Зег 100 105 НО Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у 115 120 125 ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РЬе А1а 130 135 140 ТЬг Туг Туг Суз А1а С1п С1у А1а А1а Ьеи Рго Агд ТЬг РЬе С1у 61п 145 150 155 160 С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд 165 <210> 2 <211> 163 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
    <220>
    <223> Продукт слияния эксендина-4, (043)3 линкера, ООМ7П-14 (ϋΑΤ0115) <400> 2
    ΗΪ3 С1у С1и С1у ТЬг РЬе ТНг Зег Азр Ьеи Зег Ьуз 01п Меб С1и С1и 15 10 15
    - 45 021146
    61и А1а Уа1 Агд Ьеи РНе Не 61и Тгр Ьеи Ьуз Азп С1у С1у Рго Зег 20 25 30
    Зег С1у А1а Рго Рго Рго Зег С1у С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у . 35 40 45
    С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег Азр 11е С1п Меб ТНг С1п Зег Рго Зег
    50 55 60'
    Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 61у Азр Агд Уа1 ТНг 11е ТНг Суз Агд А1а
    65 70 75 80
    Зег 61п Тгр 11е С1у Зег С1п Ьеи Зег Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у
    85 90 95
    Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е МеН Тгр Агд Зег Зег Ьеи С1п Зег О1у
    100 105 110
    Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи
    115 120 125
    ТНг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз А1а
    130 135 140
    С1п С1у А1а А1а Ьеи Рго Агд ТНг РНе С1у С1п С1у ТНг Ьуз Уа1 С1и 145 150 155 160
    11е Ьуз Агд <210> 3 <211> 148 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Продукт слияния эксендина-4 ООМ7Н-14 (БАТ0116) <400> 3
    Шз С1у С1и С1у ТНг РНе ТНг Зег Азр Ьеи Зег Ьуз С1п МеЬ С1и С1и 15 10 15
    С1и А1а Уа1 Агд Ьеи РНе 11е С1и Тгр Ьеи Ьуз Азп С1у С1у Рго Зег 20 25 30
    Зег С1у А1а Рго Рго Рго Зег С1у Азр 11е С1п Мер ТНг С1п Зег Рго 35 40 45
    Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТНг 11е ТНг Суз Агд
    50 55 60
    А1а Зег С1п Тгр 11е С1у Зег С1п Ьеи Зег Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго
    65 70 75 80
    С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е МеН Тгр Агд Зег Зег Ьеи С1п Зег
    85 90 95
    Е1у Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг
    100 105 110
    Ьеи ТНг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз
    115 120 125
    А1а С1п С1у А1а А1а Ьеи Рго Агд ТНг РНе С1у С1п С1у ТНг Ьуз Уа1
    130 135 140
    С1и 11е Ьуз Агд 145 <210> 4 <211> 188 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Продукт слияния эксендина-4, спирального линкера, ΩΟΜ7Η-14 <400> 4
    НЬз 61у 61и С1у ТНг РНе ТНг Зег Азр Ьеи Зег Ьуз 61п Мер С1и 61и 15 10 15 (РАТ0117) б1и А1а Уа1 Агд Ьеи РНе Не С1и Тгр Ьеи Ьуз Азп С1у С1у Рго 20 25 30
    Зег 61у А1а Рго Рго Рго Зег С1у Ьуз С1и А1а А1а А1а Ьуз С1и 35 40 45
    А1а А1а Ьуз С1и А1а А1а А1а Ьуз С1и Ьеи А1а А1а Ьуз С1и А1а
    50 55 60
    А1а Ьуз С1и А1а А1а А1а Ьуз С1и А1а А1а А1а Ьуз С1и Ьеи А1а 65 70 75
    Азр 11е С1п МеН ТНг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 85 90 95
    Азр Агд Уа1 ТНг Не ТНг Суз Агд А1а Зег С1п Тгр Не С1у Зег 100 105 110
    Ьеи Зег Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 115 120 125
    МеЬ Тгр Агд Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег
    130 135 140
    Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг Не Зег Зег Ьеи 61п 145 150 155
    С1и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз А1а С1п 61у А1а А1а Ьеи Рго 165 170 175
    ТНг РНе С1у С1п С1у ТНг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд 180 185
    Зег
    А1а
    А1а
    А1а
    С1у
    С1п
    Не
    С1у
    Рго
    160
    Агд <210> 5 <211> 153 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Продукт слияния СЬР-1 А8С, (С45)3 линкера, ΏΟΜ7Η-14 (ОАТ0118) <400> 5
    НЬз 1 С1у С1и С1у ТНг РНе ТНг Зег Азр Уа1 Зег Зег Туг Ьеи С1и С1у 5 10 15 С1п А1а А1а Ьуз С1и РНе Не А1а Тгр Ьеи Уа1 Ьуз С1у Агд С1у С1у 20 25 30 С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег Азр Не С1п 35 40 45 МеН ТНг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 50 55 60 ТНг Не ТНг Суз Агд А1а Зег С1п Тгр Не С1у Зег С1п Ьеи Зег Тгр 65 70 75 80 Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Мер Тгр Агд 85 90 95 Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег С1у Зег С1у Зег 100 105 НО С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РНе 115 120 125 А1а ТНг Туг Туг Суз А1а С1п С1у А1а А1а Ьеи Рго Агд ТНг РНе С1у 130 135 140 С1п С1у ТНг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд 145 150
    <210> 6 <211> 142 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Продукт слияния СЬР-1 А8С, Р35 линкера, ΩΟΜ7Η-14 (ϋΑΤ0119) <400> 6
    - 46 021146
    ΗΪ5 61у С1и С1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Азр Уа1 Зег Зег Туг Ьеи С1и С1у 15 10 15
    С1п А1а А1а Ьуз С1и РЬе Не А1а Тгр Ьеи Уа1 Ьуз С1у Агд С1у Рго 20 25 30
    Зег Зег Азр 11е С1п МеЬ ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег 35 40 45
    Уа1 61у Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Тгр 11е С1у 50 55 60
    Зег С1п Ьеи Зег Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи
    65 70 75 80
    Ьеи 11е МеЬ Тгр Агд Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе
    85 90 95
    Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи
    100 105 110
    С1п Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз А1а С1п С1у А1а А1а Ьеи
    115 120 125
    Рго Агд ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд
    130 135 140 <210> 7 <211> 179 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Продукт слияния СЬР-1 Α8Θ, спирального линкера, ЬОМ7Ь-14 <400> 7
    Шз С1у С1и С1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Азр Уа1 Зег Зег Туг Ьеи С1и С1у 15 10 15
    С1п А1а А1а Ьуз С1и РЬе 11е А1а Тгр Ьеи Уа1 Ьуз С1у Агд С1у Ьуз 20 25 30
    С1и А1а А1а А1а Ьуз С1и А1а А1а А1а Ьуз С1и А1а А1а А1а Ьуз С1и 35 40 45
    Ьеи А1а А1а Ьуз С1и А1а А1а А1а Ьуз С1и А1а А1а А1а Ьуз С1и А1а
    50 55 60
    А1а А1а Ьуз С1и Ьеи А1а А1а Азр 11е С1п Мер ТЬг С1п Зег Рго Зег
    65 70 75 80
    Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а
    85 90 95
    Зег С1п Тгр 11е С1у Зег С1п Ьеи Зег Тгр Туг С1п О1п Ьуз Рго С1у
    100 105 110
    Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е Мер Тгр Агд Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у
    115 120 125
    Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи
    130 135 140
    ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз А1а
    145 150 155 160
    С1п С1у А1а А1а Ьеи Рго Агд ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и
    165 170 175
    11е Ьуз Агд (ϋΑΤ0120) <210> 8 <211> 108 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> ООМ7Ь-14 <400> 8
    Азр 11е С1п МеЬ ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 10 15
    Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Тгр 11е С1у Зег
  20. 20 25 30
    Ьеи Зег Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи
    35 40 45
    МеЬ Тгр Агд Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег
    50 55 60
    Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п 65 70 75
    61и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз А1а С1п С1у А1а А1а Ьеи Рго 85 90 95
    ТЬг РЬе С1у 61п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд 100 105 <210> 9 <211> 31 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> СЬР-1 (7-37) А8С <400> 9
    Нгз С1у С1и С1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Азр Уа1 Зег Зег Туг Ьеи С1и 15 10 15
    С1п А1а А1а Ьуз С1и РЬе 11е А1а Тгр Ьеи Уа1 Ьуз С1у Агд С1у
    20 25 30 <210> 10 <211> 39 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> эксендин-4 <400> 10
    Шз С1у С1и С1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Азр Ьеи Зег Ьуз С1п МеЬ С1и 15 10 15
    С1и А1а Уа1 Агд Ьеи РЬе 11е С1и Тгр Ьеи Ьуз Азп С1у С1у Рго
    20 25 30
    Зег С1у А1а Рго Рго Рго Зег <210> 11 <211> 40 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> спиральный линкер <400> 11
    Ьуз С1и А1а А1а А1а Ьуз С1и А1а А1а А1а Ьуз С1и А1а А1а А1а 15 10 15
    01и Ьеи А1а А1а Ьуз С1и А1а А1а А1а Ьуз С1и А1а А1а А1а Ьуз
    20 25 30
    А1а А1а А1а Ьуз С1и Ьеи А1а А1а
    35 40
    С1у
    С1п
    11е
    С1у
    Рго
    Агд
    С1у
    С1и
    Зег
    Ьуз
    С1и
    - 47 021146 <210> 12 <211> 16 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> С1у-3ег линкер <400> 12
    С1у С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег 15 10 15 <210> 13 <211> 504 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> ОАТ0114 - последовательность нуклеиновой кислоты (из конструкции млекопитающего) <400> 13 сарддрдаад дааРРсаРРд адррсРРаРР дасаРссада аРсасРРдсс дддааадссс сдРРРсадРд даадаРРРРд дддассаадд ддассРРРас сРРддсРддР
    Рддааддсса
    РдасссадРс дддсаадРса сРаадсРссР дсадРддаРс сРасдРасРа
    РддаааРсаа садРдаРдРа даааддссда адсРдссаад
    РссаРссРсс дРддаРРддд даРсаРдРдд
    РдддасадаР сРдРдсРсад асдд адРРсРРаРР сарддрдаад дааРРсаРРд сРдРсРдсаР
    РсРсадРРаР сдРРссРсдР
    РРсасРсРса ддрдсддсдр
    Рддааддсса ддассРРРас сРРддсРддР сРдРаддада сРРддРасса
    РдсааадРдд ссаРсадсад
    РдссРаддас адсРдссаад 60 садРдаРдРа 120 даааддссда 180 ссдРдРсасс 240 дсадааасса 300 ддРсссаРса 360 РсРдсаассР 420 дРРсддссаа 480
    504 <210> 14 <211> 489 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> ΩΑΤ0115 - последовательность нуклеиновой кислоты (из конструкции млекопитающего) <400> 14 сарддрдаад
    РРаРРРаРРд ддрддаддсд садРсРссаР адРсадРдда сРссРдаРса ддаРсРддда
    РасРасРдРд аРсааасдд даасаРРРас адРддсРРаа дРРсаддсдд ссРсссРдРс
    РРдддРсРса
    РдРддсдРРс садаРРРсас сРсадддРдс садРдасРРд даасддадда аддрддсадс
    РдсаРсРдРа дРРаРсРРдд сРсдРРдсаа
    РсРсассаРс ддсдРРдссР
    Рсаааасада ссаадРадсд ддсддрддсд ддадассдРд
    Рассадсада адРддддРсс адсадРсРдс аддасдРРсд
    Рддаададда дддсассРсс ддРсддасаР
    РсассаРсас аассадддаа саРсасдРРР аассрдаада дссаадддас ддсадРдсдд 60 дссаРсдддР 120 ссадаРдасс 180 РРдссдддса 240 адссссРаад 300 садрддсадр 360 РРРРдсРасд 420 сааддРддаа 480
    489 <210> 15 <211> 495 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> 0ΑΤΌ115 Е. соИ) последовательность нуклеиновой кислоты (из конструкции <400> 15 сасддрдаад дРассРРсас сРсРдассРд адсааасада Рддаддаада адсддРРсдР 60 сРдРРсаРсд ддрддрддрд садРссссаа
    РсРсадРдда сРссРдаРса ддРРсРддРа
    РасРасРдРд аРРааасдРР адРддсРдаа дРРсРддРдд дсРсРсРдРс
    РсддРРссса
    РдРддсдРад ссдасРРсас сРсадддРдс ааРда ааасддрддр
    РддРддРРсР
    РдссРссдРР дсРдРссРдд сРсРсРдсад ссРдассаРР ддсасРдсса ссдРсРРсРд ддрддрддсд ддсдаРсдРд
    РаРсадсада
    РсРддРдРас
    РссРсРсРдс сдРасРРРРд дРдсРссдсс драдсдасар
    РРасдаРсас аассдддсаа сдадссдсРР адссддаада дссадддРас ассдРсРддР 120 ссадаРдасР 180 дрдссдрдср 240 адссссдааа 300 сРсРддРРсР 360 РРРсдсдасс 420 дааадРсдад 480 <210> 16 <211> 444 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> ОАТ0116 - последовательность нуклеиновой кислоты (и млекопитающего) конструкции <400> 16 сарддрдаад
    РРаРРРаРРд дасаРссада аРсасРРдсс дддааадссс сдРРРсадРд даадаРРРРд дддассаадд даасаРРРас адРддсРРаа
    РдасссадРс дддсаадРса сРаадсРссР дсадРддаРс сРасдРасРа
    РддаааРсаа садРдасРРд даасддадда
    РссаРссРсс дРддаРРддд даРсаРдРдд
    РдддасадаР сРдРдсРсад асдд
    Рсаааасада ссаадРадсд сРдРсРдсаР
    РсРсадРРаР сдРРссРсдР
    РРсасРсРса ддрдсддсдр
    Рддаададда дддсассРсс сРдРаддада сРРддРасса
    РдсааадРдд ссаРсадсад
    РдссРаддас ддсадРдсдд 60 дссаРсдддР 120 ссдРдРсасс 180 дсадааасса 240 ддРсссаРса 300 РсРдсаассР 360 дРРсддссаа 420 <210> 17 <211> 447 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> БАТ0116 - последовательность нуклеиновой кислоты (из конструкции Е. соИ) <400> 17 сасддрдаад сРдРРсаРсд аРссадаРда асдрдссдрд ааадссссда
    РРсРсРддРР даРРРсдсда асдааадРсд дРассРРсас адРддсРдаа сРсадРсссс сРРсРсадРд аасРссРдаР сРддРРсРдд ссРасРасРд адаРРааасд сРсРдассРд ааасддрддр аадсРсРсРд даРсддРРсс сардрддсдр
    РассдасРРс
    РдсРсадддр
    РРааРда адсааасада ссдРсРРсРд
    РсРдссРссд садсРдРссР адсРсРсРдс асссРдасса дсддсасРдс
    Рддаддаада дРдсРссдсс
    РРддсдаРсд ддРаРсадса адрсрддрдр
    РРРссРсРсР сасдРасРРР адсддРРсдР 60 ассдРсРдас 120 РдРРасдаРс 180 дааассдддс 240 ассдадссдс 300 дсадссддаа 360 РддссадддР 420
    447 <210> 18 <211> 564 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> ОАТ0117 - последовательность нуклеиновой кислоты (из конструкции млекопитающего) <400> 18 сарддрдаад
    РРаРРРаРРд ааадаадсдд ааадаадсдд дасаРссада аРсасРРдсс дддааадссс даасаРРРас адРддсРРаа сддсдааада сддсдааада
    РдасссадРс дддсаадРса сРаадсРссР садРдасРРд даасддадда адсддсддсд адсддсддсд
    РссаРссРсс дРддаРРддд даРсаРдРдд
    Рсаааасада ссаадРадсд ааадаадсдд ааадаадсдд сРдРсРдсаР
    РсРсадРРаР сдРРссРсдР
    Рддаададда дддсассРсс сддсдааада сддсдааада сРдРаддада сРРддРасса
    РдсааадРдд ддсадРдсдд 60 дссаРсдддР 120 аррддссдса 180 аррддссдса 240 ссдРдРсасс 300 дсадааасса 360 ддРсссаРса 420
    48 021146 сдНННсадНд дсадНддаНс НдддасадаН ННсасНсНса ссаНсадсад даадаЬЬНд сНасдНасНа сНдНдсНсад ддНдсддсдН НдссНаддас дддассаадд НддаааНсаа асдд <210> 19 <211> 567 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> ΩΑΤ0117 - последовательность нуклеиновой кислоты Е. соН) <400> 19 сасддНдаад дНассННсас сНсНдассНд адсааасада Нддаддаада сНдННсаНсд адНддсНдаа ааасддНддН ссдНсННсНд дНдсНссдсс даадсддсдд сдааадаадс ддсддсдааа даадсддсдд сдааадааНН даадсддсдд сдааадаадс ддсддсдааа даадсддсдд сдааадааНН аНссадаНда сНсадНсссс аадсЬсНсНд НсНдссНссд ННддсдаНсд асдНдссдНд сННсНсадНд даНсддННсс садсНдЬссН ддНаНсадса ааадссссда аасНссНдаН саНдНддсдЬ адсНсксНдс адНсНддНдН ННсНсНддНН сНддННсНдд НассдасННс асссНдасса НННссНсНсН даНННсдсда ссНасНасНд НдсНсадддН дсддсасНдс сасдНасННН асдааадНсд адаННааасд ННааНда <210> 20 <211> 459 <212> ДНК <213> ΩΑΤ0118 - последовательность нуклеиновой кислоты млекопитающего) <220>
    <223> ЬАТ0118 - последовательность нуклеиновой кислоты млекопитающего) <400> 20 сакддНдаад ддассНННас садНдаНдНа адННсННаНН Нддааддсса дааННсаННд сННддсНддН даааддссда ддНддаддсд дННсаддсдд ддсддНддсд ддНсддасаН ссадаНдасс садНсНссаН ссНсссНдНс ддадассдНд НсассаНсас ННдссдддса адНсадНдда ННдддНсНса Нассадсада аассадддаа адссссНаад сНссНдаНса НдНддсдННс адНддддНсс саНсасдНЬН садНддсадН ддаНсНддда садаШсас адсадНсНдс аассНдаада ННННдсНасд НасНасНдНд сНсадддНдс аддасдННсд дссаадддас сааддНддаа аНсааасдд <210> 21 <211> 426 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
    НсНдсаассН 480 дННсддссаа 540
    564 (из конструкции адсддНЬсдЬ 60 ассдНсНааа 120 ддссдсаааа 180 ддссдсадас 240 НдННасдаНс 300 дааассдддс 360 ассдадссдс 420 дсадссддаа 480 НддссадддН 540
    567 (из конструкции (из конструкции адсНдссаад 60 аддНддсадс 120 НдсаНсНдНа 180 дННаНсННдд 240 сНсдННдсаа 300 НсНсассаНс 360 ддсдННдссН 420
    459 <220>
    <223> ΩΑΤ0119 - последовательность нуклеиновой кислоты млекопитающего) (из конструкции <400> 21 саНддНдаад дааННсаННд
    НсНссаНссН садСддаЫд сНдаНсаНдН
    НсНдддасад
    НасНдНдсНс ааасдд ддассШас сННддсНддН сссНдНсНдс ддНсНсадЬН ддсдННссНс аиссасас!
    адддНдсддс садНдаНдНа даааддссда аНсНдНадда аНсННддЬас дННдсааадН сассаНсадс дННдссНадд адННсННаНН ддассаадсН дассдНдНса садсадааас ддддНсссаН адНсНдсаас асдННсддсс
    Нддааддсса сддасаНсса ссаНсасННд садддааадс сасдНННсад сНдаадаННН аадддассаа адсНдссаад 60 даНдасссад 120 ссдддсаадН 180 сссНаадсНс 240 НддсадНдда 300 НдсНасдНас 360 ддНддаааНс 420
    426 <210> 22 <211> 537 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> ЬАТ0120 - последовательность нуклеиновой кислоты (из конструкции млекопитающего) <400> 22 саНддНдаад ддассШас садНдаНдНа адННсННаНН Нддааддсса адсНдссаад 60 дааННсаННд сННддсНддН даааддссда ддаааадаад сддсддсдаа адаадсддсд 120 дсдааадаад сддсддсдаа адааННддсс дСаааадаад сддсддсдаа адаадсддсд 180 дсдааадаад сддсддсдаа адааННддсс дсадасаРсс адаНдассса дНсНссаНсс 240
    НсссНдНсЬд саНсНдНадд адассдНдНс ассаНсасНН дссдддсаад НсадНддаНН 300 дддНсНсадЬ ЬаЬсЬЬддЬа ссадсадааа ссадддааад ссссНаадсЬ ссЬдаНсаНд 360
    НддсдННссН сдННдсааад НддддНссса НсасдНННса дНддсадНдд аНсНдддаса 420 даНННсасНс НсассаНсад садНсНдсаа ссНдаадаЫ; ННдсНасдНа сНасНдНдсН 480 садддНдсдд сдННдссНад дасдННсддс саадддасса аддНддаааН сааасдд 537 <210> 23 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Ьот7Н-14 - последовательность нуклеиновой кислоты <400> 23 дасаНссада НдасссадНс НссаНссНсс сНдНсНдсаН сНдНаддада ссдНдЬсасс 60 аНсасННдсс дддсаадНса дНддаННддд НсНсадННаН сННддНасса дсадааасса 120 дддааадссс сНаадсНссН даНсаНдНдд сдННссНсдН НдсааадНдд ддНсссаНса 180 сдНННсадНд дсадНддаНс НдддасадаН ННсасНсНса ссаНсадсад НсНдсаассН 240 даадаННННд сНасдНасНа сНдНдсНсад ддЬдсддсдЬ НдссНаддас дННсддссаа 300 дддассаадд НддаааНсаа асдд 324 <210> 24 <211> 163 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Продукт слияния эксендина-4, (С43)3 линкера, ООМ7Н-14-Ю (ΩΜ57139)
    <400> 24 Нгз С1у С1и С1у ТНг РНе ТНг Зег Азр Ьеи Зег Ьуз С1п МеН С1и С1и 1 5 10 15 С1и А1а Уа1 Агд Ьеи РНе 11е 61и Тгр Ьеи Ьуз Азп С1у С1у Рго Зег 20 25 30 Зег С1у А1а Рго Рго Рго Зег 61у С1у 61у С1у С1у Зег С1у С1у С1у 35 40 45 С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег Азр 11е С1п МеН ТНг С1п Зег Рго Зег 50 55 60 Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 61у Азр Агд Уа1 ТНг 11е ТНг Суз Агд А1а 65 70 75 80 Зег С1п Тгр 11е С1у Зег С1п Ьеи Зег Тгр Туг С1п 61п Ьуз Рго С1у 85 90 95 Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е МеН Тгр Агд Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у 100 105 но Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи 115 120 125 ТНг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз А1а 130 135 140
    - 49 021146
    С1п С1у Ьеи Агд ΗΪ5 Рго Ьуз ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 145 150 155 160 Не Ьуз Агд <210> 25 <211> 163 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Продукт слияния эксендина-4, (С43)3 линкера, ООМ7Н-11-15 (ОМ37143)
    <400> 25 ΗΪ3 С1у С1и С1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Азр Ьеи Зег Ьуз С1п Мер С1и С1и 1 5 10 15 С1и А1а Уа1 Агд Ьеи РЬе Не С1и Тгр Ьеи Ьуз Аз η 61у 61у Рго Зег 20 25 30 Зег 61у А1а Рго Рго Рго Зег С1у С1у 61у С1у С1у Зег С1у 61у С1у 35 40 45 С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег Азр Не 61п МеР ТЬг С1п Зег Рго Зег 50 55 60 Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а 65 70 75 80 Зег Агд Рго Не С1у ТЬг МеР Ьеи Зег Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго 61у 85 90 95 Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Ьеи А1а РЬе Зег Агд Ьеи С1п Зег С1у 100 105 110 Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи 115 120 125 ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз А1а 130 135 140 61п А1а С1у ТЬг НЬз Рго ТЬг ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 145 150 155 160 Не Ьуз Агд
    <210> 26 <211> 108 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220> <223> ООМ7Ь-14-Ю <400> 26 Азр Не С1п Мер ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у 15 10 15 Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Тгр Не С1у Зег С1п 20 25 30 Ьеи Зег Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго 61у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не 35 40 45 Мер Тгр Агд Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у 50 55 60 Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго 65 70 75 80 С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз А1а С1п С1у Ьеи Агд НЬз Рго Ьуз 85 90 95 ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд 100 105 <210> 27 <211> 108 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность ООМ7Ь-11-15 <220> <223> ООМ7Ь-11-15 <400> 27 Азр Не С1п МеР ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у 15 10 15 Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег Агд Рго Не С1у ТЬг Мер 20 25 30 Ьеи Зег Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не 35 40 45 Ьеи А1а РЬе Зег Агд Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у 50 55 60 Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго 65 70 75 80 С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз А1а С1п А1а С1у ТЬг ΗΪ3 Рго ТЬг 85 90 95 ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд 100 105 <210> 28 <211> 20 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220> <223> сигнальный пептид (лидерный) ОтрТ АИА <400> 28 МеР Агд А1а Ьуз Ьеи Ьеи С1у Не Уа1 Ьеи ТЬг ТЬг Рго Не А1а Не 15 10 15
    Зег А1а Тгр А1а 20
    - 50 021146 <220>
    <223> Продукт слияния эксендина-4, (С45)3 линкера, БОМ7Н-11-115 (БМ37143) <400> 30
    сакддкдаад даасакккас садкдасккд ксаааасада кддаададда ддсадкдсдд 60 ккакккаккд адкддсккаа даасддадда ссаадкадсд дддсассксс дссаксдддк 120 ддкддаддсд дкксаддсдд аддкддсадс ддсддкддсд ддксддасак ссадакдасс 180 садкскссак сскссскдкс кдсакскдка ддадассдкд ксассаксас ккдссдддса 240 адксдкссда ккдддасдак дккаадккдд кассадсада аассадддаа адсссскаад 300 сксскдаксс ккдскккккс ссдкккдсаа адкддддксс саксасдккк садкддсадк 360 ддакскддда садаккксас ксксассакс адсадкскдс аасскдаада ккккдскасд 420 каскаскдсд сдсаддскдд дасдсаксск асдасдкксд дссаадддас сааддкддаа 480 аксааасдд 489 <210> 31 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Бот7Ь-14-10 - нуклеиновая кислота <400> 31 дасакссада кдасссадкс кссакссксс скдкскдсак скдкаддада ссдкдксасс 60 аксасккдсс дддсаадкса дкддаккддд ксксадккак сккддкасса дсадааасса 120 дддааадссс скаадсксск даксакдкдд сдккссксдк кдсааадкдд ддксссакса 180 сдккксадкд дсадкддакс кдддасадак кксаскскса ссаксадсад кскдсаасск 240 даадаккккд скасдкаска скдкдсксад ддкккдаддс аксскаадас дкксддссаа 300 дддассаадд кддаааксаа асдд 324 <210> 32 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Бот7Ь-11-15 - нуклеиновая кислота <400> 32 дасакссада кдасссадкс кссакссксс скдкскдсак скдкаддада ссдкдксасс 60 аксасккдсс дддсаадксд кссдаккддд асдакдккаа дккддкасса дсадааасса 120 дддааадссс скаадсксск дакссккдск кккксссдкк кдсааадкдд ддксссакса 180 сдккксадкд дсадкддакс кдддасадак кксаскскса ссаксадсад кскдсаасск 240 даадаккккд скасдкаска скдсдсдсад дскдддасдс аксскасдас дкксддссаа 300 дддассаадд кддаааксаа асдд 324
    <210> 33 <211> 60 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> ОтрАМА сигнальный пептид - последовательность нуклеиновой кислоты <400> 33 акдсдддсда аасксскадд аакадксскд асаасссска ксдсдаксад сдсккдддсс 60 <210> 34 <211> 21 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> отрА (происходящая из Е. соН) <400> 34
    Мек Ьуз Ьуз ТЬг А1а 11е А1а 11е А1а Уа1 А1а Ьеи А1а С1у РЬе А1а 15 10 15
    ТЬг Уа1 А1а С1п А1а 20 <210> 35 <211> 21 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> отрА-АМА (искусственная последовательность) <400> 35
    Мек Ьуз Ьуз ТЬг А1а 11е А1а 11е А1а νβΐ А1а Ьеи А1а С1у РЬе А1а 15 10 15
    ТЬг Уа1 А1а Мек А1а 20 <210> 36 <211> 21 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> отрА-АМА <400> 36
    Мек Ьуз Ьуз ТЬг А1а 11е А1а 11е А1а Уа1 А1а Ьеи А1а С1у РЬе А1а 15 10 15
    ТЬг Уа1 А1а Тгр А1а 20 <210> 37 <211> 20 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> отрТ (происходящая из Е. соН) <400> 37
    Мек Агд А1а Ьуз Ьеи Ьеи С1у Не \7а1 Ьеи ТЬг ТЬг Рго 11е А1а 11е 15 10 15
    Зег Зег РЬе А1а 20 <210> 38 <211> 20 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> отрТ-АМА <400> 38
    Мег Агд А1а Ьуз Ьеи Ьеи Е1у Не Уа1 Ьеи ТЬг ТЬг Рго 11е А1а Не 15 10 15
    Зег А1а МеЬ А1а 20 <210> 39 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> ЕАЗ (происходящая из 3. οβΓθνίδίΒβ) <400> 39
    МеЬ Ьеи РЬе Ьуз Зег Ьеи Зег Ьуз Ьеи А1а ТЬг А1а А1а А1а РЬе РЬе 15 10 15
    А1а С1у Уа1 А1а ТЬг А1а 20 <210> 40 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> ЕАЗ-АМА <400> 40
    Меб Ьеи РЬе Ьуз Зег Ьеи Зег Ьуз Ьеи А1а ТЬг А1а А1а А1а РЬе РЬе 15 10 15
    А1а Е1у Уа1 А1а МеЬ А1а 20 <210> 41 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> ЕАЗ-АИА <400> 41
    МеЬ Ьеи РЬе Ьуз Зег Ьеи Зег Ьуз Ьеи А1а ТЬг А1а А1а А1а РЬе РЬе
    15 10 15
    А1а Е1у Уа1 А1а Тгр А1а 20 <210> 42 <220>
    <223> ООМ7Ь-14-10КЮ8С <400> 42
    Азр Не Е1п Меб ТЬг Е1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 Е1у 15 10 15
    Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Тгр Не Е1у Зег Е1п 20 25 30
    Ьеи Зег Тгр Туг Е1п С1п Ьуз Рго Е1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не 35 40 45
    МеЬ Тгр Агд Зег Зег Ьеи 61п Зег О1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег Е1у 50 55 60
    Зег Е1у Зег Е1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго
    65 70 75 80
    Е1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз А1а Е1п Е1у Ьеи Агд Нгз Рго Ьуз
    85 90 95
    ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Суз
    100 105 <210> 43 <211> 34 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> ΡΥΥ 3-36 (с лизином в положении 10) <400> 43
    11е Ьуз Рго 51и А1а Рго 61у Ьуз Азр А1а Зег Рго 61и Е1и Ьеи Азп 15 10 15
    Агд Туг Туг А1а Зег Ьеи Агд Н1з Туг Ьеи Азп Ьеи Уа1 ТЬг Агд Е1п 20 25 30
    Агд Туг <210> 44 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> ЬОМ 7Ь-14-10 К108С - последовательность нуклеиновой кислоты <400> 44 дасаЬссада ЬдасссадЬс ЬссаЬсНсс сЪдЬсЬдсаЬ сЬдЬаддада ссдЬдЬсасс 60 абсасПдсс дддоаадЬса дЪддаПддд ЬсбсадНа); сПддЬасса дсадааасса 120 дддааадссс сЪаадсЬссЬ даЬсаТдГдд сдНссЬсдЪ СдсааадЬдд ддЪсссаЬса 180 сдЬИсадЬд дсадЬддаЬс Ьдддасадаб НсасЬсЪса ссабсадсад ЪсЬдсаассЬ 240 даадаППд сбасдбасЬа сбдбдсбсад ддНбдаддс аЬссбаадас дНсддссаа 300 дддассаадд ЬддаааЬсаа аЬдб 324 <210> 45 <211> 1389 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> последовательность кДНК рецептора ЕЬР-1 Супото1диз <400> 45 абддссддса сссссддссс дсбдсдссЬс дсдсЬссбдс -ЬдсЪсддддЬ ддбдддсадд 60 дссддссссс дсссссаддд ЬдссасЬдЬд ЬсссЬсЬддд адасддЬдса даааЬддсда 120 даабассдас дссадЬдсса дсдсбсссбд асЬдаддасс сассЪсссдс сасадасНд 180
    НсЬдсаасс ддассНсда Ъдаабабдсс Ьдскддссад а-еддддадсс аддсЪссПс 240 дбдаабдЬса дсбдссссЬд дбассбдссс Ьдддссадса дЬдбдссдса дддссасдЬд 300
    ЪассддПсЬ дсасадсЬда аддссЬскдд сЬдсадаадд асаасЬссад ссЬдсссЬдд 360 адддасНдЬ сддадЬдЬда ддадЬссаад сдаддддада даааНсссс ддаддадсад 420 сЪсскдЪссс ЬсЪасаЪсаб сЪасасддкд ддсЬасдсас ЬсЬссПсЬс ЬдсОсЬддП 480 аЬсдссЬсЬд сдаЬссЬссЬ ЬддсПсада сассЬдсасЬ дсасссддаа сЬасаЬссас 540 сбдаассЬдЬ НдсаЬссИ саЪсскдсда дсаНдгссд ЬсНсаЪсаа ддасдсадсс 600 сбсаадЬдда Ьдбасадсас ддссдсссад садсассадб дддаЬдддсЬ ссЬсЬссЬас 660 саддасЬсЬс ЬдддсЬдссд сдЬддЬдООО сЬдсЬсаЬдс ааЬаскдЬдЬ ддсддссааЪ 720
    СасЬасЬддс
    ЬсСдадсаас дЬСдЬссссЬ
    ЬссаасаЬда
    ЬЬссЬсаЬск
    Сдсаадасад дддасЬсаЬд
    ССсаЬсаадс
    ЬЬдЬасЬдсЬ сддсЬЬдадс адсадссЬда
    ЬссСдсадс
    ЬсЬЬддЬдда дааЬсЬЬсад ддддсаССдС асЬасЬддсЬ
    ЬЬдЬЬсдддЬ асаЬсаааЬд аддЬсаЬсЬЬ
    ЬдЬЬсасдда
    ЬЬдЬсаасаа асЬЬдсасаЬ дсадЬддддс дддсдЬдЬас дсЬдЬаЬдЬд саадЬассЬс саЬЬаЬссдд саЬсЕдсаЬс садасЬЬдсс
    ЬдссСЬЬдЬд дсСсЪссЬЬЬ
    ЬдаддЬссад ссададддас сасддсдддс сЬдЬасасас адсдЬаддсЬ
    ЬаЬдаддасд сЬдсссаЬЬс дЬддЬаЬсса аадЬссасдс аЬддасдадс ассЬссЬЬсс
    МддааМСс адсадсаЬда адсадсаЬдС
    ЬдсЬддссЬЬ ддддЬдЬЬсс адддсЬдсЬд
    ЬсЬЬЬдссаЬ аасЬдааддс
    ЬдасасЬсаЬ аЬдсссдддд аддддсЬдаЬ ддаададсЬд адссссЬсаа асасадссас сЬсддЬсЬЬс ссЬдсЬдЬЬЬ дассаддаас
    ЬддддЬдаас сааЬсЬсакд сссссЬдсСд сасссЬдсдс ддЬддссаСс ддадсдсЬдд дЬдЬсссасс
    ЬЬдссаддсс
    780
    840
    900
    960
    1020
    1080
    1140
    1200
    1260
    1320
    1380
    1389 <210> 46 <211> 22 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Ре1 В <400> 46
    МеС Ьуз Туг Ьеи Ьеи Рго ТЬг А1а А1а А1а 61у Вей Ьеи Ьеи Ьеи А1а
    А1а С1п Рго А1а МеЬ А1а <210> 47 <211> 115 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Олигонуклеотид 1 <400> 47 ддаакСссаЬ аЬдааааЬса ааассддЬдс ЬсдсаЬссЬд дсЬсЬдЪссд сЬсЬдассас 60 ЬаЬдаЬдЬЬс ЬссдсЬЬссд сдсЬддсЬса ЬддЬдаадда асаЬЬЬасса дЬдас 115 <210> 48 <211> 44 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Олигонуклеотид 2 <400> 48 дЬЬсадаакЬ сЬЬаЬЬассд ЬЬСдаНЬсс ассЬЬддЬсс сЬСд 44 <210> 49 <211> 26 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> Ма1 Е сигнальная последовательность <400> 49
    МеС Ьуз Не Ьуз ТЬг С1у А1а Агд 11е Деи А1а Ьеи Зег А1а Ьеи ТЬг 15 10 15
    ТЬг МеЬ МеТ РЬе Зег А1а Зег А1а Ьеи А1а <210> 50 <211> 489 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
    <223> последовательность нуклеиновой кислоты ϋΜ3 7139 для экспрессии в Е. соН <400> 50 сасддТдаад сТдТТсаТсд ддТддТддТд садТссссдТ адссадТдда сТдсТдаТса ддТТсТддТа
    ТасТасТдсд аТсааасдТ дТасдТТсас адТддсТдаа дТТсТддТдд сТТсТсТсТс
    ТсддТТссса
    ТдТддсдсТс сддасТТсас сасадддТсТ сТсТдассТд ааасддТддТ
    ТддТддТТсТ сдссТсТдТТ дсТдадсТдд
    ТадссТдсад ссТсасдаТс дсдТсасссд адсааасада ссдТсТТсТд ддТддТддТд ддсдассдТд
    ТаТсадсада
    ТсТддТдТас
    ТсТТсссТдс аааассТТсд
    Ьддаддаада дТдсТссдсс дсадсдаТаТ
    ТТассаТсас аассдддсаа сдТсТсдТТТ адссддаада дТсадддТас адсддТТсдТ 60 дссдТсТддТ 120 ссадаТдасТ 180 ТТдТсдТдсд 240 адсдссдааа 300 сТссддсТсТ 360 сНТдссасс 420 сааадТсдад 480
    489
EA201190184A 2009-03-27 2010-03-24 Продукты слияния и конъюгаты лекарственных средств EA021146B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16391709P 2009-03-27 2009-03-27
PCT/EP2010/053806 WO2010108937A2 (en) 2009-03-27 2010-03-24 Drug fusions and conjugates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201190184A1 EA201190184A1 (ru) 2012-05-30
EA021146B1 true EA021146B1 (ru) 2015-04-30

Family

ID=42308293

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201190184A EA021146B1 (ru) 2009-03-27 2010-03-24 Продукты слияния и конъюгаты лекарственных средств

Country Status (24)

Country Link
US (2) US8779103B2 (ru)
EP (1) EP2411054A2 (ru)
JP (1) JP2012521971A (ru)
KR (1) KR20110137819A (ru)
CN (2) CN104127880A (ru)
AR (1) AR076147A1 (ru)
AU (1) AU2010227552B2 (ru)
BR (1) BRPI1013588A2 (ru)
CA (1) CA2756853A1 (ru)
CL (1) CL2011002387A1 (ru)
CO (1) CO6361953A2 (ru)
DO (1) DOP2011000288A (ru)
EA (1) EA021146B1 (ru)
IL (1) IL215200A0 (ru)
MA (1) MA33221B1 (ru)
MX (1) MX2011010151A (ru)
NZ (1) NZ595344A (ru)
PE (1) PE20120514A1 (ru)
SG (1) SG174497A1 (ru)
TW (1) TW201100104A (ru)
UA (1) UA98911C2 (ru)
UY (1) UY32514A (ru)
WO (1) WO2010108937A2 (ru)
ZA (1) ZA201107022B (ru)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012521971A (ja) * 2009-03-27 2012-09-20 グラクソ グループ リミテッド 薬物融合体および複合体
CA2774552A1 (en) * 2009-09-30 2011-04-07 Glaxo Group Limited Drug fusions and conjugates with extended half life
US9040668B2 (en) 2010-05-20 2015-05-26 Glaxo Group Limited Anti-serum albumin binding variants
WO2011156328A1 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
WO2012175741A2 (en) 2011-06-23 2012-12-27 Ablynx Nv Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
EP2621953B1 (en) 2010-09-30 2017-04-05 Ablynx N.V. Biological materials related to c-met
US11644471B2 (en) 2010-09-30 2023-05-09 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
WO2012136790A1 (en) * 2011-04-07 2012-10-11 Glaxo Group Limited Compositions comprising fusion proteins or conjugates with an improved half -life
US9573992B2 (en) * 2011-06-23 2017-02-21 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins
CN102949731A (zh) * 2011-09-16 2013-03-06 西藏海思科药业集团股份有限公司 与glp-2受体特异性结合的药物融合体
CN102949730A (zh) * 2011-09-16 2013-03-06 西藏海思科药业集团股份有限公司 特异结合glp-1受体的药物融合体
US9346884B2 (en) 2011-09-30 2016-05-24 Ablynx N.V. Biological materials related to c-Met
CN102875675B (zh) * 2012-04-26 2015-05-27 拜明(苏州)生物技术有限公司 抗人血清白蛋白单链抗体及其氮端连接多肽药物的方法
CN102827277B (zh) * 2012-04-26 2014-12-10 拜明(苏州)生物技术有限公司 抗人血清白蛋白单链抗体及其碳端连接多肽药物的方法
SG11201505388QA (en) * 2013-01-31 2015-08-28 Glaxo Group Ltd Method of producing a protein
MA43289B1 (fr) 2014-01-20 2019-12-31 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Insuline à action prolongée et utilisation associée
RU2016137264A (ru) * 2014-02-21 2018-03-26 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи Слияния антитела к pcsk9~glp-1 и способы применения
JP7325928B2 (ja) 2014-05-16 2023-08-15 アブリンクス エン．ヴェー． 改善された免疫グロブリン可変ドメイン
AR100639A1 (es) * 2014-05-29 2016-10-19 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composición para tratar diabetes que comprende conjugados de análogos de insulina de acción prolongada y conjugados de péptidos insulinotrópicos de acción prolongada
TWI684458B (zh) 2014-05-30 2020-02-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 包含胰島素及ｇｌｐ-１/昇糖素雙重促效劑之治療糖尿病之組成物
CN107108724A (zh) 2014-09-12 2017-08-29 豪夫迈·罗氏有限公司 半胱氨酸改造抗体和缀合物
UY36870A (es) 2015-08-28 2017-03-31 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Análogos de insulina novedosos
WO2017201340A2 (en) * 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding relaxin
TWI774694B (zh) 2016-09-23 2022-08-21 南韓商韓美藥品股份有限公司 具有降低對胰島素受體之親和力之胰島素類似物及其用途
CN107281471A (zh) * 2017-06-26 2017-10-24 中国药科大学 一种改构的胰高血糖素样肽－1及其修饰物的应用
WO2018174668A2 (ko) 2017-03-23 2018-09-27 한미약품 주식회사 인슐린 수용체와의 결합력이 감소된 인슐린 아날로그의 결합체 및 이의 용도
TWI809515B (zh) 2017-12-21 2023-07-21 美商美國禮來大藥廠 腸促胰島素(incretin)類似物及其用途
TWI810937B (zh) 2017-12-21 2023-08-01 美商美國禮來大藥廠 腸促胰島素(incretin)類似物及其用途
US11753455B2 (en) 2018-06-21 2023-09-12 Novo Nordisk A/S Compounds for treatment of obesity
CN111234015B (zh) * 2020-02-12 2021-04-06 康维众和(中山)生物药业有限公司 用于延长药物半衰期的抗体、其融合蛋白和应用
WO2021182928A1 (ko) * 2020-03-12 2021-09-16 주식회사 에스엘메타젠 신규 이중 특이성 단백질 및 그의 용도
WO2022015039A1 (ko) * 2020-07-14 2022-01-20 (주)지아이이노베이션 글루카곤-유사 펩타이드-1 및 글루카곤-유사 펩타이드-2를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006059106A2 (en) * 2004-12-02 2006-06-08 Domantis Limited Bispecific domain antibodies targeting serum albumin and glp-1 or pyy
WO2008149143A2 (en) * 2007-06-06 2008-12-11 Domantis Limited Methods for selecting protease resistant polypeptides
WO2009121804A1 (en) * 2008-03-31 2009-10-08 Glaxo Group Limited Drug fusions and conjugates

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ222907A (en) 1986-12-16 1990-08-28 Novo Industri As Preparation for intranasal administration containing a phospholipid absorption enhancing system
EP1892296A1 (en) 1988-09-02 2008-02-27 Dyax Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
JPH04504246A (ja) 1989-03-20 1992-07-30 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション インシュリン刺激ホルモン
WO1991011457A1 (en) 1990-01-24 1991-08-08 Buckley Douglas I Glp-1 analogs useful for diabetes treatment
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
DK0546073T3 (da) 1990-08-29 1998-02-02 Genpharm Int Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
DK36492D0 (da) 1992-03-19 1992-03-19 Novo Nordisk As Praeparat
ATE417622T1 (de) 1996-08-08 2009-01-15 Amylin Pharmaceuticals Inc Regulation gastrointestinaler beweglichkeit
EP1801214B1 (en) 1997-07-07 2010-11-10 Medical Research Council In vitro sorting method
ES2293688T5 (es) 1997-08-08 2011-05-04 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Nuevos compuestos análogos de la exendina.
EP1032587B2 (en) 1997-11-14 2013-03-13 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Novel exendin agonist compounds
JP2003522721A (ja) 1997-11-14 2003-07-29 アミリン・ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 新規なエキセンジンアゴニスト化合物
AU759058C (en) 1998-02-13 2005-09-15 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Inotropic and diuretic effects of exendin and GLP-1
JP2003522099A (ja) 1998-02-27 2003-07-22 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 遅延作用プロファイルを有するｇｌｐ−１のｇｌｐ−１誘導体及びエキセンジン
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
JP2004528014A (ja) 2000-12-07 2004-09-16 イーライ・リリー・アンド・カンパニー Ｇｌｐ−１融合タンパク質
US20030119734A1 (en) 2001-06-28 2003-06-26 Flink James M. Stable formulation of modified GLP-1
CA2484556A1 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CA2471363C (en) 2001-12-21 2014-02-11 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2005003296A2 (en) 2003-01-22 2005-01-13 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US9321832B2 (en) * 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
CA2539253A1 (en) 2003-09-19 2005-03-31 Novo Nordisk A/S Albumin-binding derivatives of therapeutic peptides
WO2005118642A2 (en) * 2004-06-01 2005-12-15 Domantis Limited Bispecific fusion antibodies with enhanced serum half-life
US20060052301A1 (en) 2004-06-03 2006-03-09 Ronen Shemesh Splice variants of peptide YY, neuropeptide Y, pancreatic peptide Y and Amylin, and uses thereof
CN102405232B (zh) * 2009-02-19 2015-08-19 葛兰素集团有限公司 改良的抗血清清蛋白结合变体
SG173489A1 (en) * 2009-02-19 2011-09-29 Glaxo Group Ltd Improved anti-serum albumin binding variants
JP2012521971A (ja) * 2009-03-27 2012-09-20 グラクソ グループ リミテッド 薬物融合体および複合体
CA2774552A1 (en) * 2009-09-30 2011-04-07 Glaxo Group Limited Drug fusions and conjugates with extended half life

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006059106A2 (en) * 2004-12-02 2006-06-08 Domantis Limited Bispecific domain antibodies targeting serum albumin and glp-1 or pyy
WO2008149143A2 (en) * 2007-06-06 2008-12-11 Domantis Limited Methods for selecting protease resistant polypeptides
WO2009121804A1 (en) * 2008-03-31 2009-10-08 Glaxo Group Limited Drug fusions and conjugates

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
L. HOLT ET AL.: "Anti-serum albumin domain antibodies for extending the half lives of short lived drugs". PROTEIN ENGINEERING, DESIGN & SELECTION, vol. 21, no. 5, May 2008 (2008-05), pages 283-288, XP002591536, England, abstract discussion *
W-F. DOU ET AL.: "Expression, purification, and characterization of recombinant human serum albumin fusion protein with two human glucagon-like peptide-1 mutants in Pichia pastoris". PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, vol. 61, no. 1, 10 May 2008 (2008-05-10), pages 45-49, XP002591535, USA, abstract *

Also Published As

Publication number Publication date
MX2011010151A (es) 2011-12-14
CL2011002387A1 (es) 2012-07-20
SG174497A1 (en) 2011-10-28
JP2012521971A (ja) 2012-09-20
CN102481373A (zh) 2012-05-30
AR076147A1 (es) 2011-05-18
WO2010108937A2 (en) 2010-09-30
CO6361953A2 (es) 2012-01-20
UY32514A (es) 2010-10-29
UA98911C2 (ru) 2012-06-25
AU2010227552B2 (en) 2015-02-26
US20120100141A1 (en) 2012-04-26
TW201100104A (en) 2011-01-01
MA33221B1 (fr) 2012-04-02
DOP2011000288A (es) 2012-01-15
PE20120514A1 (es) 2012-05-14
EA201190184A1 (ru) 2012-05-30
AU2010227552A1 (en) 2011-11-03
CA2756853A1 (en) 2010-09-30
US8779103B2 (en) 2014-07-15
KR20110137819A (ko) 2011-12-23
WO2010108937A3 (en) 2010-11-25
ZA201107022B (en) 2013-03-27
NZ595344A (en) 2013-09-27
US20140193407A1 (en) 2014-07-10
BRPI1013588A2 (pt) 2016-04-19
CN104127880A (zh) 2014-11-05
IL215200A0 (en) 2011-12-29
EP2411054A2 (en) 2012-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA021146B1 (ru) Продукты слияния и конъюгаты лекарственных средств
EA018471B1 (ru) Слитые конструкции и конъюгаты лекарственного средства
US10253103B2 (en) Antibody specifically binding to GLP-1R and fusion protein thereof with GLP-1
KR20120092611A (ko) 연장된 반감기를 갖는 약물 융합체 및 컨쥬게이트
CN110078814A (zh) 修饰的fgf-21多肽及其用途
JP2016532448A5 (ru)
US11612640B2 (en) Acylated GLP-1 derivative
US20140056893A1 (en) Homodimeric Proteins
EA028183B1 (ru) Cx3cr1-связывающие полипептиды
JP2022532332A (ja) 代謝性疾患を治療するための融合タンパク質
WO2012136790A9 (en) Compositions comprising fusion proteins or conjugates with an improved serum half-life
WO2012136792A2 (en) Cck compositions

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU