KR20110137819A - 약물 융합체 및 컨쥬게이트 - Google Patents

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루시 제이. 홀트
로렌트 에스. 제스퍼스
세바스티안 메이어
말고르자타 푸펙카-스와이더
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Abstract

본 발명은 개선된 혈청 반감기를 갖는 약물 융합체에 관한 것이다. 이러한 융합체 및 컨쥬게이트는 폴리펩티드, 면역글로불린(항체) 단일 가변 도메인 및 GLP 및/또는 엑센딘(exendin) 분자를 포함한다. 또한, 본 발명은 이러한 약물 융합체 및 컨쥬게이트의 용도, 이를 포함하는 제제(formulation), 조성물 및 기구에 관한 것이다.

Description

약물 융합체 및 컨쥬게이트{DRUG FUSIONS AND CONJUGATES}
본 발명은 개선된 혈청 반감기를 갖는 약물 융합체(drug fusion) 및 컨쥬게이트(conjugate)에 관한 것이다. 이러한 융합체 및 컨쥬게이트는 면역글로불린(항체) 단일 가변 도메인 및 GLP 및/또는 엑센딘(exendin) 분자를 포함한다. 또한, 본 발명은 이러한 약물 융합체 및 컨쥬게이트의 용도, 이를 포함하는 제제(formulation), 조성물 및 기구에 관한 것이다.
치료 및/또는 진단 목적에 유용할 수 있는 활성을 갖는 많은 약물은 투여시 신체로부터 신속히 배출되기 때문에 한정된 가치를 갖는다. 예를 들어, 치료적으로 유용한 활성을 갖는 많은 폴리펩티드들은 신장을 통해 순환계로부터 신속히 배출된다. 따라서, 원하는 치료 효과를 달성하기 위하여 많은 투여량이 투여되어야 한다. 개선된 약물동력학적 특성을 갖는 개선된 치료제 및 진단제에 대한 필요성이 존재한다.
신체 또는 전신 순환에서 짧은 반감기를 갖는 한 가지 이러한 부류의 약물로는 글루카곤 유사 펩티드 1 또는 펩티드 YY 및 또한 엑센딘, 예를 들어 엑센딘-4와 같은 인크레틴 호르몬이 있다.
글루카곤 유사 펩티드(GLP)-1는 강력한 글루코스 의존성 인슐린 분비촉진(insulinotropic) 및 글루카곤 분비억제(glucagonostatic) 작용, 췌장 β 세포에 대한 영양 효과를 갖는 외에도, 위장 분비 및 운동성을 억제하여 혈장 글루코스를 저하시키고 혈당 변화폭(glycemic excursion)을 감소시키는 효과를 갖는 인크레틴 호르몬이다. 또한, 포만감(satiety)을 강화하는 그의 능력을 통해, GLP-1은 삭품 섭취량을 감소시켜서 체중 증가를 억제하고 심지어는 체중 감소를 초래할 수 있다. 합쳐서, 이러한 작용들은 항당뇨제에 아주 바람직한 것으로 판단되는 독특한 프로필을 GLP-1에 제공하는데, 특히 그의 항고혈당 효과의 글루코스 의존성이 심각한 저혈당증의 어떠한 위험성도 최소화시키기 때문이다. 그러나, 이의 약물동력학적/약물유전학적 프로필로 인해 본래의 GLP-1은 치료적으로 유용하지 않게 된다. 따라서, GLP-1은 연속 투여시 가장 효과적인 반면에, 단일의 피하 주사는 짧은 지속 효과를 갖는다. GLP-1은 생체내에서 효소 분해되기가 아주 쉽고, 디펩티딜 펩티다제 IV (DPP-IV)에 의한 분해는 신속히 일어나고 비인슐린 분비촉진 대사산물을 발생하기 때문에 아마도 가장 관련이 있다. 따라서, 이의 대사 안정성 및 약물동력학적/약물유전학적 프로필에 영향을 미치는 인자들의 이해에 기초하여 GLP-1의 치료 능력을 촉진하기 위한 방법이 집중적인 연구의 중심이 되어 왔다.
그 분해가 지연되도록 하면서 생물학적 활성이 계속 유지되도록 GLP- 1을 변형하거나 펩티다제를 억제하기 위한 시도로서 광범위한 연구가 수행되어 왔다. WO 05/027978호는 연장된 작용 프로필을 갖는 GLP-1 유도체를 개시하고 있다. WO 02/46227호는 GLP-1 또는 유사체에 융합된 폴리펩티드(예를 들어, 알부민)를 포함하는 이종 융합 단백질을 개시하고 있다(이러한 유사체의 개시는 본 발명에서 사용될 수 있는 GLP-1 유사체의 예로서 본원에 참조로 포함된다). WO 05/003296호, WO 03/060071호 및 WO 03/059934호는 호르몬의 반감기를 증가시키기 위한 시도로서 GLP-1이 알부민과 융합되어 있는 아미노 융합 단백질을 개시하고 있다.
그러나, 이러한 노력에도 불구하고, 오래 활성이 지속되는 GLP-1은 생산된 바 없다.
이와 같이, 특히 당뇨 및 비만의 분야에서는, 특히 당뇨 및 비만을 치료할 수 있는 인슐린 분비촉진 효과를 유사하게 갖는 개선된 GLP-1 펩티드 또는 엑센딘-4 또는 PYY와 같은 다른 작용제에 대한 중대한 필요성이 있다. 따라서, 그의 낮은 세포독성 및 치료적 이점이 유지되도록 하면서 GLP-1, 엑센딘-4 및 다른 인슐린 분비촉진 펩티드를 변형시켜서 그 작용이 생체내에서 더욱 장기간 지속되도록 할 필요가 있다.
발명의 개요
본 발명은 융합체 또는 컨쥬게이트인 조성물로서, (a) 예를 들어, 엑센딘-4, PYY, 예를 들어 3-26 PYY, 또는 GLP-1, 예를 들어 GLP-1 (7-37) A8G 돌연변이체일 수 있는 인슐린 분비촉진제 또는 분자, 또는 인크레틴 약물 또는 분자와, (b) 상기 (a)와의 융합체 또는 컨쥬게이트로 존재하는 것으로, 다음 (i) 내지 (iv)로부터 선택되는 혈청 알부민(AlbudAb TM)에 특이적으로 결합하는 dAb를 포함하거나 그것들로 구성되는 조성물을 제공한다: (i) DOM 7h-14 도메인 항체(dAb) (DOM 7h-14의 아미노산 서열은 도 1b(h)에 나타나있음: SEQ ID NO 8), (ii) DOM 7h-14-10 도메인 항체(dAb) (DOM 7h-14-10의 아미노산 서열은 도 1c-d(o)에 나타나있음: SEQ ID NO 26) 또는 DOM 7h-14-10 dAb의 서열과 4개 이하의 아미노산이 상이한 dAb, (iii) DOM 7h-11-15 dAb (DOM 7h-11-15의 아미노산 서열은 도 1d(p)에 나타나있음: SEQ ID NO 27), 또는 (iv) DOM 7h-14-10 R108C 도메인 항체(dAb) (DOM 7h-14-10의 아미노산 서열은 도 1d(r)에 나타나있음).
또한, 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물, 예를 들어 엑센딘-4 및/또는 GLP-1, 또는 PYY를 dAb, 예를 들어 DOM7h-14 dAb, DOM 7h-14-10 dAb, DOM 7h-11-15 dAb와 연결하는 아미노산 또는 화학적 링커가 임의로 존재할 수도 있다. 상기 링커는 예를 들어 나선형 링커, 예를 들어 도 1c(k)에 도시된 서열: SEQ ID NO 11의 나선형 링커일 수 있거나, 또는 예를 들어 도 1c(l)에 도시된 아미노산 서열: SEQ ID NO 12를 갖는 gly-ser 링커일 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 유합체(또는 컨쥬게이트)는 추가의 분자, 예를 들어 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
상기 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물(예를 들어, 엑센딘 및/또는 GLP-1)은 dAb의 N-말단 또는 C-말단과의 융합체(또는 컨쥬게이트)로서 존재할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 하기의 것들로부터 선택되는 융합 분자를 포함하거나 그로 이루어지는 폴리펩티드를 제공한다:
(a) 2xGLP-1 (7-37) A8G DOM7h-14 dAb 융합체(DATO114, 이의 아미노산 서열은 도 1a(a)에 도시되어 있음: SEQ ID NO 1),
(b) 엑센딘 4 (G4S 링커)3 DOM7h-14 dAb 융합체(DATO115, 이의 아미노산 서열은 도 1a(b)에 도시되어 있음: SEQ ID NO 2),
(c) 엑센딘 4 - DOM7h-14 dAb 융합체(DATO116, 이의 아미노산 서열은 도 1a(c)에 도시되어 있음: SEQ ID NO 3),
(d) 엑센딘 4, 나선형 링커, DOM7h-14 dAb 융합체(DATO117, 이의 아미노산 서열은 도 1a(d)에 도시되어 있음: SEQ ID NO 4),
(e) GLP-1 (7-37) A8G (G4S 링커)3 DOM7h-14 dAb 융합체(DATO118, 이의 아미노산 서열은 도 1b(e)에 도시되어 있음: SEQ ID NO 5),
(f) GLP-1 (7-37) A8G DOM7h-14 dAb 융합체(DATO119, 이의 아미노산 서열은 도 1b(f)에 도시되어 있음: SEQ ID NO 6),
(g) GLP-1 (7-37) A8G, 나선형 링커, DOM7h-14 dAb 융합체(DAT0120, 이의 아미노산 서열은 도 1b(g)에 도시되어 있음: SEQ ID NO 7),
(h) 엑센딘 4, (G4S)3, 링커 DOM7h-14-10 융합체(DMS7139, 이의 아미노산 서열은 도 1c(m)에 도시되어 있음: SEQ ID NO 24),
(i) 엑센딘 4, (G4S)3, 링커 DOM7h-11-15 융합체(DMS7143, 이의 아미노산 서열은 도 1c(n)에 도시되어 있음: SEQ ID NO 25).
또한, 본 발명은 전술한 아미노산 서열들, 즉 SEQ ID NO 1 내지 7 및 SEQ ID NO 24 및 25로 나타낸 아미노산 서열들을 포함하거나 그것들로 이루어지는 컨쥬게이트 분자를 제공한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 리신(PYY의 위치 10에 도입됨) 및 4개 반복 PEG 링커를 통해 C-말단이 아미드화된 PYY3-36에 컨쥬게이션된 DOM 7h-14-10 (R108C) AlbudAb인 컨쥬게이트 분자를 포함하거나 그것으로 이루어지는 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 펩티드 컨쥬게이트의 아미노산 서열 및 구조는 도 14에 도시되어 있다.
또한, 본 발명은 엑센딘 4, (G4S)3, 링커 DOM7h-14-10 융합체(DMS7139, 이의 아미노산 서열은 도 1c(m)에 도시되어 있음: SEQ ID NO 24), 또는 DMS7139(이의 아미노산 서열은 도 1c(m)에 도시되어 있음)의 아미노산 서열과 4개 이하의 아미노산 차이를 지니는 융합체 또는 컨쥬게이트 분자의 아미노산 서열을 포함하거나 그것으로 이루어지는 폴리펩티드를 제공한다.
DOM 7h-14는 혈청 알부민에 결합하는 인간 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 dAb (Vk)이고, 이의 아미노산 서열은 도 1b(h)에 도시되어 있다: SEQ ID NO 8. DOM 7h-14 dAb의 CDR 영역은 도 1b(h)에 도시된 아미노산 서열: SEQ ID NO 8에 서 밑줄로 나타낸다.
DOM 7h-14-10은 혈청 알부민에 결합하는 인간 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 dAb이고, 이의 아미노산 서열은 도 1c-d(o)에 도시되어 있다: SEQ ID NO 26. DOM 7h-14-10 dAb의 CDR 영역은 도 1c-d(o)에 도시된 아미노산 서열: SEQ ID NO 26에서 밑줄로 나타낸다.
DOM 7h-11-15은 혈청 알부민에 결합하는 인간 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 dAb이고, 이의 아미노산 서열은 도 1d(p)에 도시되어 있다: SEQ ID NO 27. DOM 7h-11-15 dAb의 CDR 영역은 도 1d(p)에 도시된 아미노산 서열: SEQ ID NO 27에서 밑줄로 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 용어 "융합체"(fusion)는 혈청 알부민에 결합하는 DOM7h-14 dAb 또는 DOM7h-14-10 dAb 또는 DOM 7h-11-15 dAb를 제1 부분(moiety)으로서 포함하고 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물을 제2 부분으로서 포함하는 융합 단백질을 의미한다. 혈청 알부민에 결합하는 dAb 및 약물 또는 작용제(agent)는 단일의 연속적인 폴리펩티드 사슬의 불연속적인 부분들로 존재한다. 제1 부분(dAb) 및 제2 부분(인크레틴 약물 또는 인슐린 분비촉진제)은 펩티드 결합을 통해 서로 직접 결합되거나 적당한 아미노산 또는 펩티드 또는 폴리펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다. 필요한 경우, 추가의 부분, 예를 들어 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 제3, 제4 부분) 및/또는 링커 서열이 존재할 수 있다. 제1 부분은 N-말단 위치, C-말단 위치 또는 제2 부분에 대하여 내부에 존재할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 융합 단백질은 하나 이상(예를 들어 1개 내지 약 20개)의 dAb 부분을 함유한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "컨쥬게이트"(conjugate)는 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물, 예를 들어, GLP-1, 엑센딘-4, PYY, 예를 들어 PYY 3-36이 공유 또는 비공유 결합된 혈청 알부민에 결합하는 dAb를 포함하는 조성물을 의미한다. 상기 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물은 dAb에 직접 또는 적당한 링커 부분, 예를 들어 PEG 링커 부분을 통해 간접적으로 공유결합될 수 있다. 상기 약물 또는 작용제는, 예를 들어 아미노 말단, 카르복실 말단 또는 적당한 아미노산 측쇄(예를 들어, 리신의 ε 아미노기 또는 시스테인의 티올기)를 통해 임의의 적합한 위치에서 dAb에 결합될 수 있다. 그렇지 않으면, 상기 약물 또는 작용제는 dAb에 직접적으로(예를 들어, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용) 또는 간접적으로(예를 들어, 상보성 결합 파트너(예를 들어, 비오틴 및 아비딘)의 비공유 결합을 통해, 여기서 하나의 파트너는 약물 또는 작용제에 공유결합되고 상보성 결합 파트너는 dAb에 공유결합됨) 비공유 결합될 수 있다.
또한, 본 발명은, 예를 들어, DATO114, DAT0115, DATO116, DATO117, DATO118, DATO119 및 DAT120, DMS 7139 또는 DMS 7143의 본 발명의 임의의 컨쥬게이트 또는 융합체의 (실질적으로) 순수한 모노머를 제공한다. 일 구체예에서, 이는 적어도 98, 99, 99.5% 순수하거나 100% 순수한 모노머이다.
또한, 본 발명은 본원에서 기재한 융합체를 엔코딩하는 핵산, 예를 들어 DATO114, DAT0115, DATO116, DATO117, DATO118, DATO119 및 DAT120, DMS 7139 또는 DMS 7143를 엔코딩하는 핵산을 제공하고, 예를 들어 핵산 서열이 도 2에 도시되어 있다 (SEQ ID NO 13 내지 32). 또한, 본 발명은 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 DOM7h-14 (SEQ ID NO 8), DOM7h-14-10 (SEQ ID NO 26), DOM7h-11-15 (SEQ ID NO 27) 및 DOM 7h-14-10R108C (SEQ ID NO 42)로부터 선택되는 혈청 알부민(AlbudAb TM)에 결합하는 dAb를 엔코딩하는 아미노산을 제공한다.
또한, 본 발명은 DOM7h-14(SEQ ID NO 23), DOM7h-14-10 (SEQ ID NO 31), DOM7h-11-15 (SEQ ID NO 32) 및 DOM 7h-14-10R108C (SEQ ID NO 44)에 결합하는 dAb를 엔코딩하는 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 융합체를 제조하는 방법으로서, 본 발명의 융합체를 엔코딩하는 재조합 핵산 및/또는 작제물을 포함하는 숙주 세포를 상기 재조합 핵산의 발현에 적당한 조건하에 유지시켜서 융합체를 생산하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)을 제공한다.
또한, 본 발명은 본원에서 기재한 것들과 같은 질병 또는 장애, 예를 들어, 고혈당증, 내당능 장애(impaired glucose tolerance), 베타 세포 결핍, 당뇨병(예를 들어, 제1형 또는 제2형 당뇨병 또는 임신성 당뇨병) 또는 비만과 같은 대사성 질병, 또는 과식에 특징이 있는 질병 (예를 들어 Prader-Willi 증후군에서 식욕을 억제하기 위해 사용될 수 있다)을 갖는 개체를 치료하기 위한 방법으로서, 치료적 유효량의 본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
다른 대사성 장애로는 인슐린 내성, 인슐린 결핍, 고인슐린혈증, 고혈당증, 이상지혈증, 고지질혈증, 고케톤혈증, 고혈압, 관상 동맥질환, 죽상동맥경화증, 신부전, 신경병증(예를 들어, 자율 신경병증, 부교감 신경병증 및 다발 신경병증), 망막병증, 백내장, 대사장애(예를 들어, 인슐린 및/또는 글루코스 대사성 장애), 내분비 장애, 비만, 체중 감소, 간 장애(예를 들어, 간질환, 간경변, 및 간이식과 관련된 장애), 이러한 질병 및 장애와 관련된 증상이 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 화합물을 이용하여 예방 또는 치료할 수 있는 당뇨병과 관련된 증상으로는 고혈당증, 비만, 당뇨성 망막병증, 단발 신경병증(mononeuropathy), 다발 신경병증(polyneuropathy), 죽상동맥경화증, 궤양, 심장병, 뇌졸중, 빈혈증, 회저(예를 들어, 발 및 손의 회저), 성교불능, 감염, 백내장, 신장 기능부전, 자율신경계의 기능장애, 백혈구 기능 손상, 수근관 증후군(Carpal tunnel syndrome), 듀피트렌 구축(Dupuytren's contracture) 및 당뇨성 케톤산증(diabetic ketoacidosis)이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 혈중 글루코스 증가와 관련된 질병을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 본 발명의 컨쥬게이트 또는 융합체 및/또는 약제학적 조성물의 적어도 1회 투여량(dose)을 환자 또는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 컨쥬게이트 또는 융합체를 이용하여 환자에서 인슐린 반응성을 조절하는 방법, 세포에 의한 글루코스 흡수를 증가시키는 방법, 및 세포의 인슐린 민감성을 조절하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 인슐린 합성 및 방출을 자극하는 방법, 인슐린 흡수쪽으로 지방세포, 근육 또는 간 조직 민감성을 개선하는 방법, 글루코스 흡수를 자극하는 방법, 소화 과정을 지연시키는 방법, 또는 환자에서 글루카곤 분비를 차단하는 방법으로서, 상기 환자에게 본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트를 투여하는 것을 포함하고, 예를 들어 적어도 1회 투여량의 본 발명의 약물 컨쥬게이트 또는 융합체 및/또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트 및/또는 약제학적 조성물은 단독으로 투여될 수 있거나 다른 분자 또는 부분, 예를 들어 폴리펩티드, 치료용 단백질 및/또는 분자(예를 들어, 인슐린 및/또는 다른 단백질(항체 포함), 펩티드, 또는 환자에서 인슐린 민감성, 체중, 심장병, 고혈압, 신경병증, 세포 대사, 및/또는 글루코스, 인슐린 또는 기타 호르몬 수준을 조절하는 작은 분자)와 조합하여 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 컨쥬게이트 또는 융합체는 인슐린(또는 인슐린 유도체, 유사체, 융합 단백질, 또는 분비촉진제)과 함께 투여된다.
또한, 본 발명은 전술한 것들 중 임의의 것과 같은 질병 또는 장애, 예를 들어, 고혈당증, 당뇨병(제1 형 및 제2 형 또는 임신성 당뇨병)또는 비만의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 컨쥬게이트 또는 융합체의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 치료, 진단 또는 예방에 사용하기 위한 본원에서 기재한 융합체 또는 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트, 예를 들어 그 융합체의 dAb 성분은 예를 들어, PEG 기, 혈청 알부민, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체 또는 이의 적어도 트랜스페린 결합 부위, 항체 Fc 영역의 부착에 의해서나, 항체 도메인으로의 컨쥬게이션에 의해 그 반감기를 더욱 연장하기 위해 보다 큰 유체역학적 크기를 가지도록 추가로 포맷(format)될 수 있다. 예를 들어, 혈청 알부민에 결합하는 dAb는 항체의 더욱 큰 항원 결합 단편으로서 포맷될 수 있다(예를 들어, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv로 포맷될 수 있다).
본 개시를 통해 기재되는 본 발명의 다른 구체예에서는, 본 발명의 융합체에서 "dAb"를 사용하는 대신에, 당업자는 dAb의 CDR들, 예를 들어 혈청 알부민에 결합하는 DOM 7h-14, DOM 7h-14-10 또는 DOM 7h-11-15의 CDR들(예를 들어, 적당한 단백질 스캐폴드 또는 골격, 예를 들어, 어피보디, SpA 스캐폴드, LDL 수용체 클래스 A 도메인 또는 EGF 도메인 상에 그래프팅된 CDR들)을 포함하는 도메인을 사용할 수 있는 것으로 예상된다. 따라서, 그 전체로서 본 개시는 dAb 대신에 이러한 도메인의 개시를 제공하는 것으로 판단되어야 한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 혈청 알부민에 결합하는 본 발명에 따른 제1 dAb, 예를 들어 DOM 7h-14, DOM 7h-14-10 또는 DOM 7h-11-15, 및 제1 dAb와 동일 또는 상이한 결합 특이성을 갖는 제2 dAb 및 임의적으로 다중 특이적 리간드의 경우 추가의 dAb들을 포함하는 이중 특이적 리간드 또는 다중 특이적 리간드 및 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물을 포함하는 본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트를 제공한다. 제2 dAb (또는 추가의 dAb들)는 상이한 표적, 예를 들어 FgFr 1c 또는 CD5 표적에 임의적으로 결합할 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 비경구 투여, 예를 들어, 피하, 근육내 또는 정맥내 주사, 흡입, 비내 전달, 경점막 전달, 경구 전달, 환자의 위장관으로의 전달, 직장 전달 또는 안내 전달을 통해 전달되는 본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 피하 주사, 흡입, 정맥내 전달, 비내 전달, 경점막 전달, 경구 전달, 환자의 위장관으로의 전달, 직장 전달 또는 안내 전달에 의해 전달되는 의약의 제조에서 본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트의 용도를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 피하 주사, 폐 전달, 정맥내 전달, 비내 전달, 경점막 전달, 경구 전달, 환자의 위장관으로의 전달, 직장 전달 또는 안내 전달에 의해 환자에게 전달하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 약제학적 유효량의 본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트를 포함하는 경구, 주사가능, 흡입가능, 분무가능(nebulisable) 또는 안내용 제제를 제공한다. 상기 제제는 정제, 환제, 캡슐, 액체 또는 시럽일 수 있다. 일 양테에서, 상기 조성물은 예를 들어 드링크제, 예를 들어 비만 치료용 체중 감소 드링크제로서 시판되는 드링크제로서 경구 투여될 수 있다. 일 양태에서, 본 발명은 환자에게 직장 전달되는 제제를 제공하는데, 상기 제제는 예를 들어 좌약 형태로 제공될 수 있다.
GLP-1 화합물의 비경구 투여를 위한 조성물은 예를 들어 WO 03/002136호(본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
특정 펩티드의 비내 투여용 조성물은 예를 들어 유럽특허 제 272097호(Novo Nordisk A/S) 또는 WO 93/18785호(모두 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
용어 "피검체" 또는 "개체"는 영장류(예, 인간), 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 기니 피그, 래트, 마우스 또는 기타 소, 양, 말, 개, 고양이, 설치동물 또는 뮤린 종을 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물과 같은 동물을 포함하는 것으로 본원에서 정의된다.
또한, 본 발명은 개체 (예를 들어, 환자)에게 본 발명에 따른 조성물(예를 들어, 본 발명의 컨쥬게이트 또는 융합체)를 투여하는데 사용하기 위한 키트로서, 조성물(예를 들어, 본 발명의 컨쥬게이트 또는 융합체), 약물 전달 기구 및 임의로 사용 지시서를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 조성물(예를 들어, 컨쥬게이트 또는 융합체)은 동결 건조 제제와 같은 제제로서 제공될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 약물 전달 기구는 주사기, 흡입기, 비내 또는 안내 투여 기구(예, 미스터(mister), 눈 또는 코 점적기(dropper)) 및 무침 주사 기구로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 조성물(예를 들어, 컨쥬게이트 또는 융합체)은 저장을 위해 동결건조되고 사용에 앞서 적당한 담체에서 재구성될 수 있다. 임의의 적당한 동결건조 방법(예를 들어, 분무 건조, 케이크 건조) 및/또는 재구성 기법을 이용할 수 있다. 당업자는 동결건조 및 재구성이 다양한 정도의 항체 활성의 손실을 야기할 수 있고 사용 수준은 이를 보상하도록 조절되어야 함을 이해할 것이다. 특정 구체에에서, 본 발명은 본원에서 기재된 동결건조(냉동건조) 조성물(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)을 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게, 상기 동결건조(냉동건조) 조성물(예를 들어, 약물 컨쥬게이트 또는 약물 융합체)은 재수화시 그 활성(예를 들어, 혈청 알부민에 대한 결합 활성)의 약 20% 이하, 또는 약 25% 이하, 또는 약 30% 이하, 또는 약 35% 이하, 또는 약 40% 이하, 또는 약 45% 이하, 또는 약 50% 이하를 잃는다. 활성은 동결건조되기 전 조성물의 효과를 생성하는데 필요한 조성물(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)의 양이다. 예를 들어, 원하는 시간 동안 원하는 혈청 농도를 달성 또는 유지하는데 필요한 컨쥬게이트 또는 융합체의 양이다. 상기 조성물(예를 들어, 약물 컨쥬게이트, 약물 융합체)의 활성은 동결건조 전에 임의의 적당한 방법을 이용하여 측정될 수 있고, 그 활성을 수화 후 동일한 방법을 이용하여 측정하여 손실된 활성의 양을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트를 포함하는 지속 방출 제제를 제공하는데, 이러한 지속 방출 제제는 예를 들어 히알루론산 미소구형체 또는 리포좀 및 기타 약제학적으로 또는 약리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트를 포함할 수 있다. 이러한 지속 방출 제제는 예를 들어 좌약의 형태일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트, 및 약제학적으로 또는 약리학적으로 허용가능한 담체, 부형체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 그 C 말단에 아미노산 서열 AMA 또는 AWA을 갖는 변형된 리더 서열로서, 야생형 서열이 아닌 리더 사열을 제공한다. 상기 변형된 리더 서열은 OmpA-AMA 또는 -AWA; 또는 OmpT-AMA 또는 -AWA; 또는 GAS-AMA 또는 -AWA일 수 있다.
상기 변형된 리더 서열은 숙주 세포에서 이종 폴리펩티드의 발현에 사용될 수 있다. 상기 이종 폴리펩티드는 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물을 포함하거나 그로 이루어질 수 있다. 상기 이종 폴리펩티드는 도메인 항체(dAb), 예를 들어 혈청 알부민에 결합하는 dAb를 포함하거나 그로 이루어질 수 있다.
상기 변형된 리더에 의한 발현을 위한 이종 폴리펩티드는 (a) 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물과, (b) 상기 (a)와의 융합체 또는 컨쥬게이트로 존재하는 것으로, dAb, 예를 들어 혈청 알부민에 결합하는 dAb, 예를 들어 혈청 알부민에 결합하고 도 1b(h)에서 도시한 아미노산 서열(SEQ ID NO 8)을 갖는 DOM 7h-14 Vk 도메인 항체(dAb), 도 1c-d(o)에서 도시한 아미노산 서열(SEQ ID NO 26)을 갖는 DOM 7h-14-10 dAb, 및 도 1d(p)에서 도시한 아미노산 서열(SEQ ID NO 27)을 갖는 DOM 7h-11-15 dAb로부터 선택된 dAb를 포함하거나 그것들로 구성되는 융합체 또는 컨쥬게이트일 수 있다.
또한, 상기 변형된 리더 서열은 다음 (a) 내지 (i)로부터 선택된 융합체를 포함하거니 그로 구성되는 이종 폴리펩티드의 발현에 사용될 수 있다:
(a) 2xGLP-1 (7-37) A8G DOM7h-14 dAb 융합체(DATO114, 이의 아미노산 서열은 도 1a(a)에 도시되어 있음: SEQ ID NO 1),
(b) 엑센딘 4 (G4S 링커)3 DOM7h-14 dAb 융합체(DATO115, 이의 아미노산 서열은 도 1a(b)에 도시되어 있음: SEQ ID NO 2),
(c) 엑센딘 4 - DOM7h-14 dAb 융합체(DATO116, 이의 아미노산 서열은 도 1a(c)에 도시되어 있음: SEQ ID NO 3),
(d) 엑센딘 4, 나선형 링커, DOM7h-14 dAb 융합체(DATO117, 이의 아미노산 서열은 도 1a(d)에 도시되어 있음: SEQ ID NO 4),
(e) GLP-1 (7-37) A8G (G4S 링커)3 DOM7h-14 dAb 융합체(DATO118, 이의 아미노산 서열은 도 1b(e)에 도시되어 있음: SEQ ID NO 5),
(f) GLP-1 (7-37) A8G DOM7h-14 dAb 융합체(DATO119, 이의 아미노산 서열은 도 1b(f)에 도시되어 있음: SEQ ID NO 6),
(g) GLP-1 (7-37) A8G, 나선형 링커, DOM7h-14 dAb 융합체(DAT0120, 이의 아미노산 서열은 도 1b(g)에 도시되어 있음: SEQ ID NO 7),
(h) 엑센딘 4, (G4S)3, 링커 DOM7h-14-10 융합체(DMS7139, 이의 아미노산 서열은 도 1c(m)에 도시되어 있음: SEQ ID NO 24),
(i) 엑센딘 4, (G4S)3, 링커 DOM7h-11-15 융합체(DMS7143, 이의 아미노산 서열은 도 1c(n)에 도시되어 있음: SEQ ID NO 25).
또한, 상기 변형된 리더에 의해 발현될 이종 폴리펩티드는 전술한 아미노산 서열을 갖는 컨쥬게이트 분자, 즉, SEQ ID NO 1 내지 7 및 SEQ ID NO 24 및 25에 도시된 아미노산 서열을 갖는 컨쥬게이트 분자를 포함하거나 그로 이루어질 수 있다.
또한, 상기 변형된 리더에 의해 발현될 이종 폴리펩티드는 엑센딘 4, (G4S)3, 링커 DOM7h-14-10 융합체(DMS7139, 이의 아미노산 서열은 도 1c(m)에 도시되어 있다: SEQ ID NO 24)의 아미노산 서열, 또는 DMS7139(이의 아미노산 서열은 도 1c(m)에 도시되어 있음)의 아미노산 서열과 4개 이하의 아미노산이 상이한 융합체 또는 컨쥬게이트 분자의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어질 수 있다.
발현을 위한 숙주 세포는 미생물 숙주 세포, 원핵 숙주 세포, 그램 음성 세균 숙주 세포, 또는 이.콜라이(E. coli) 숙주 세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 (i) 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물 및 (ii) 상기 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물의 N-말단에서 2개의 아미노산이 결실된 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물의 혼합물을 제조하는 방법으로서, 상기 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물의 위치 1 앞 절단 및 위치 3 앞 절단을 초래하는 리더 서열을 이용하여 숙주 세포에서 상기 (i)을 발현시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물은 예를 들어, 위에서 정의한 바와 같이 혈청 알부민에 결합하는 dAb와의 융합체 또는 컨쥬게이트의 형태일 수 있다. 또한, 본 발명은 전술한 방법에 의해 얻어지거나 얻어질 수 있는 혼합물을 제공한다.
상기 리더 서열은 ompA, ompT, GAS, 또는 전술한 변형된 서열들 중 어느 하나일 수 있다. 상기 방법은 이종 발현을 통해 숙주 세포에서 상기 혼합물을 생산하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 숙주 세포는 미생물 숙주 세포, 원핵 숙주 세포, 그램 음성 세균 숙주 세포, 또는 이.콜라이(E. coli) 숙주 세포일 수 있다.
GLP-1과 같은 인슐린 분비촉진제 및 인크레틴 약물은 GLP-1R(췌장으로부터 글루코스 의존성 인슐린 분비를 자극하는 것들과 같은)을 통해 매개될 수 있는 넓은 종류의 치료 효과를 갖는다. 또한, DPPIV 절단 생성물인 GLP-1 9-36 아미드(또는 GLP-1 9-37)에 의해 매개될 수 있는 부류의 효과가 있는 것으로 제안되어 왔다. GLP-1 9-37은 췌장으로부터 글루코스 민감성 인슐린 분비를 자극하는 활성은 없지만, 아마도 비 GLP-1R 구동 기작을 통해 다른 생물학적 활성을 갖는 것으로 제안되어 왔다. GLP-1 부류의 분자에 대한 최근까지의 대부분의 임상 용도가 췌장의 GLP-1R을 통해 당뇨병을 표적하는 것이었으므로, DPPIV에 대한 안정성은 엑센딘-4와 같은 비인간 GLP-1 유사체를 이용하거나, Albiglutide (Syncria)에서 사용된 것과 같이 GLP-1에서 아미노산 8 또는 9를 돌연변이시킴에 의해, 또는 상기 펩티드의 아미노 말단에서 화학적 또는 합성 변형을 통해 펩티드로 공학처리되어 왔다. 추가의 접근방법은 빌다그립틴(vildagliptin (Galvus)) 및 시타그립틴(sitagliptin (Januvia))과 같은 작은 분자 DPPIV 억제제를 이용하여 DPPIV 활성을 전체적으로 차단하여, 임의의 내생적인 분비된 GLP-1의 반감기를 연장시키는 것이었다. 이러한 두 접근 방법들은 모두 DPPIV 대사산물 GLP-1 9-36 아미드 또는 GLP-1 9-37의 수준을 효과적으로 감소시킨다.
그러나, DPPIV 대사산물 GLP-1 9-36 아미드 또는 GLP-1 9-37은 바람직한 생물학적 활성을 갖는 것으로 제안되어 왔다. 몇몇의 연구 결과, GLP-1 7-36 아미드의 DPPIV의 절단 생성물, 즉 GLP-1 7-36 분비 후 신속히 형성되고 정상 조건하에서 GLP-1 7-37보다 더욱 풍부하게 존재하는 GLP-1 9-36 아미드는 생물학적 효과를 가질 수 있는 것으로 확인되었다. 이러한 기작에 대한 몇몇의 상이한 작용 경로들은 아래와 같이 제안되어 왔다.
GLP-1(9-37)은 GLP-1R에서의 길항제이다(예를 들어, Eur J Pharmacol. 1996 Dec 30;318(2-3):429-35 참조).
글루카곤-유사 펩티드-1-(9-36) 아미드는 개로의 생체내 투여 후 글루카곤-유사 펩티드-1-(7-36)의 주요 대사산물로서, 췌장 수용체 상에서 길항제로서 (Knudsen LB, Pridal L. J Biol Chem. 1997 Aug 22; 272(34): 21201-6) 그리고 췌장 글루카곤-유사 펩티드-1 수용체의 고효능 길항제로 작용한다(Montrose-Rafizadeh C, Yang H, Rodgers BD, Beday A, Pritchette LA, Eng J. J Biol Chem. 1997 Aug 22;272(34):21201-6).
GLP-1(9-37)은 비인슐린 의존성 기작을 통해 GLP-1(7-37)에 상이한 기작으로 신호전달한다: (Am J Physiol Endocrinol Metab. 2002 Apr;282(4):E873-9.). GLP-1-(9-36) 아미드는 인슐린 분비를 수반하지 않는 기작을 통해 (Deacon CF, Plamboeck A, Møller S, Hoist JJ.) 또는 비만한 개체에서 인슐린 민감성을 증가시키도록 작용함으로써 마취된 돼지에서 혈중 글루코스를 감소시킨다: (Obesity (Silver Spring). 2008 Jul;16(7):1501-9. Epub 2008 Apr 17).
GLP-1 (7-36) 아미드의 절단 생성물인 GLP-1 (9-36) 아미드는 글루코스 조절 펩티드이다(Elahi D, Egan JM, Shannon RP, Meneilly GS, Khatri A, Habener JF, Andersen DK).
이러한 활성은 엑센딘의 2개 아미노산 결실 종의 경우에는 확인되지 않았는데, 이는 이것이 DPPIV 절단의 결과로서 형성되지 않으나, 이것이 또한 엑센딘-4의 2개 아미노산 결실 종에 대한 경우일 수도 있기 때문이다. 또한, 엑센딘-4는 심장 및 다른 효과의 측면에서 GLP-1R 의존성 및 비의존성 경로를 통해 작용하는 것으로 확인되어 왔다(Circulation. 2008;117:2340-2350: Cardioprotective and Vasodilatory Actions of Glucagon-Like Peptide 1 Receptor Are Mediated Through Both Glucagon-Like Peptide 1 Receptor-Dependent and-Independent Pathways Kiwon Ban, MSc; M. Hossein Noyan-Ashraf, PhD; Judith Hoefer, MD; Steffen-Sebastian BoIz, MD, PhD; Daniel J. Drucker, MD; Mansoor Husain, MD). 이로써, 엑센딘의 전장(full length) 형태 및 2개 아미노산 결실 형태 둘 모두에 대해 실제로 유사하고 비슷한 활성이 존재할 가능성이 높아진다.
인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물과 두 개 아미노산 결실 형태의 혼합물을 생산하기 위해 적어도 두 가지 과정의 경로를 이용할 수 있다. 예를 들어, 전장 GLP-1 7-36 아미드(AlbudAb와 같은 원하는 반감기 연장 포맷에서) 및 GLP-1 9-36 아미드(또는 원하는 융합 단백질)의 개별적인 생산이 있을 수 있다. 다음에, 이들을 혼합하여, 원하는 비율의 GLP-1 7-36 및 GLP-1 9-36 분자들을 갖는 생성물을 얻을 수 있다. 두 가지의 비슷한 GMP 과정을 이용하여 약물 혼합물을 제조할 수 있다.
대안적인 방법은 시그널 서열의 제거를 초래하는 시그널 펩티다제 효소가 단일 절단 부위를 갖기보다는 2개의 절단 부위를 갖는 경우의 분비 시그널을 선택하는 것이다. 이들은 사용된 분비 시그널에 의해 정해진 비율로 절단된다. 따라서, 선택된 분비 시그널에 따라, 그 생성되는 비율은 다음과 같을 수 있다:
GLP-1 7-36 (또는 다른 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물 전장 분자)를 얻기 위한 위치 1 앞 100% 절단; 또는 GLP-1 9-36 (또는 다른 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물 및 2개 아미노산 결실 서열)을 얻기 위한 위치 3 앞 100% 절단; 또는 전장 또는 2개 아미노산 결실 형태 각각에 대해 0 내지 100% 사이의 임의%의 절단. 예를 들어, 90% 전장: 10% 2개 아미노산 결실; 80% 전장:20% 2개 아미노산 결실; 75% 전장: 25% 2개 아미노산 결실; 50% 전장: 50% 2개 아미노산 결실; 25% 전장: 75% 2개 아미노산 결실; 20% 전장: 80% 2개 아미노산 결실; 또는 10% 전장: 90% 2개 아미노산 결실일 수 있다.
원하는 비율을 얻기 위한 적절한 리더 서열의 선택은 하나의 단일 숙주 세포로부터의 생산을 가능하게 할 것이다. 이는 GMP 과정의 측면에서 중요한 이점이다. 이는 내인생 효소에 대한 안정성을 유지하면서 두 종 모두의 가능한 치료 효과의 이용을 가능하게 한다.
또한, 전체 범위의 다른 내인성 펩티드 및 유사체를 아미노 말단 디펩티다제로 처리하여, 본래의 전장 분자 및/또는 디펩티다제 민감성 종이 얻어진다. 따라서, 이러한 접근방법은 소수의 아미노산 만큼 길이에 차이(상이한 아미노산들은 시그널 펩티다제에 대한 인식 부위의 일부를 포함함)가 있는 두 종들의 정의된 혼합물을 단일 제조 과정을 통해 제조할 수 있는 임의의 펩티드 및 단백질의 생산에 유용할 수 있다. 이러한 방법의 이용은 포유동물, 진핵 또는 원핵 숙주 세포, 예를 들어 이.콜라이(E. coli)에서 가능할 수 있다.
도 1은 (a) DAT0114 (SEQ ID NO 1), (b) DATO115 (SEQ ID NO 2), (c) DATO116 (SEQ ID NO 3), (d) DATO117 (SEQ ID NO 4), (e) DATO118 (SEQ ID NO 5), (f) DATO119 (SEQ ID NO 6) (g) DATO120 (SEQ ID NO 7) (h) DOM 7h-14 (SEQ ID NO 8) (dAb)(CDR은 밑줄로 나타냄), (i) GLP-1 7-37 A(8)G (SEQ ID NO 9), (j) 엑센딘-4 (SEQ ID NO 10), (k) 나선형 링커 (SEQ ID NO 11) (1) Gly-ser 링커 (SEQ ID NO 12), (m) DMS 7139 (SEQ ID NO 24), (n) DMS 7143 (SEQ ID NO 25) (o) DOM 7h-14-10 (SEQ ID NO 26) (dAb) (CDR은 밑줄로 나타냄), (p) DOM 7h-11-15 (SEQ ID NO 27) (dAb) (CDR은 밑줄로 나타냄) (q) OmpT AWA 시그널 펩티드 (리더) (SEQ ID NO 28), (r) DOM7h-14-10R108C (SEQ ID NO 42), (s) PYY 3-36 (위치 10에서 리신을 가짐) (SEQ ID NO 43)의 아미노산 서열을 예시한다.
도 2는 (a) DATO114 (포유동물 작제물) (SEQ ID NO 13), (b) DATO115 (포유동물 작제물) (SEQ ID NO 14), (c) DATO115 (이.콜라이(E. coli) 작제물에 대하여 최적화됨)(SEQ ID NO 15), (d) DATO116 (포유동물 작제물) (SEQ ID NO 16), (e) DATO116 (이.콜라이(E. coli) 작제물에 대하여 최적화됨) (SEQ ID NO 17), (f) DATO117 (포유동물 작제물) (SEQ ID NO 18), (g) DATO117 (이.콜라이(E. coli) 작제물에 대하여 최적화됨) (SEQ ID NO 19), (h) DATO118 (포유동물 작제물) (SEQ ID NO 20), (i) DATO119 (포유동물 작제물) (SEQ ID NO 21), (j) DATO120 (포유동물 작제물) (SEQ ID NO 22), (k) Dom7h-14 (SEQ ID NO 23) (1) DMS 7139 (SEQ ID NO 29), (m) DMS 7143 (SEQ ID NO 30), (n) Dom7h-14-10 (SEQ ID NO 31) (dAb), (o) DOM7h-11-15 (SEQ ID NO 32) (dAb), (p) Omp AWA 시그널 펩티드 (SEQ ID NO 33), (q) DOM 7h-14-10 R108C (dAb) (SEQ ID NO 44), (r) 시노몰구스 원숭이의 cDNA (SEQ ID NO 45), (s) 올리고뉴클레오티드 1 (SEQ ID NO 47), (t) 올리고뉴클레오티드 2 (SEQ ID NO 48), (u) 이.콜라이(E.coli)에서 발현을 위한 DMS 7139의 핵산 서열(SEQ ID NO 50)의 핵산 서열을 예시한다.
도 3(a)는 DATO115를 투여함에 의한 비만의 마우스 모델에서 체중의 용량 의존적인 감소를 도시하고, 도 3(b)는 DATO115를 투여함에 의한 비만의 마우스 모델에서 일당 음식 소비를 도시한다.
도 4는 DATO115의 DSC를 도시한다. 실선-DATO115 기록(trace), 점선-비-2-상태 모델에 합치(fit).
도 5는 리소자임의 DSC를 도시한다. 실선-리소자임, 점선-비-2-상태 모델에 합치(기록들이 중복되어 점선으로 된 기록이 확인될 수 없음).
도 6은 DATO115의 SEC MALLS를 도시한다.
도 7은 DATO117의 SEC MALLS를 도시한다.
도 8은 DAT0120의 SEC MALLS를 도시한다.
도 9는 리더의 아미노산 서열을 도시한다: (a) ompA (이.콜라이(E. coli) 유래) (SEQ ID NO 34), (b) ompA-AMA (인공 서열) (SEQ ID NO 35), (c) ompA-AWA (인공 서열) (SEQ ID NO 36), (d) ompT (이.콜라이(E. coli) 유래) (SEQ ID NO 37), (e) ompT-AMA (인공 서열) (SEQ ID NO 38), (f) GAS (에스.세레비지애(S. cerevisiae) 유래) (SEQ ID NO 39), (g) GAS-AMA (인공 서열) (SEQ ID NO 40), (h) GAS-AWA (인공 서열) (SEQ ID NO 41), (i) Pel B (에르위니아 카르토보라(Erwinia carotovora)) (SEQ ID NO 46), (j) MaI E (인공 서열) (SEQ ID NO 49).
도 10은 질량 분광법으로 분석한 정제된 DMS7139를 도시한다.
도 11은 DATO115와 대조군, DMS7139와 대조군 및 DMS7139와 DATO115 사이의 비교를 포함하는 혈중 글루코스 저하의 통계적 유의성을 예시한다. 도 11(a)는 연구 설계를 도시하고, 도 11(b)는 글루코스 AUC의 그래프 표시이다. 수평선과 중첩되지 않는 신뢰 간격이 유의적이다.
도 12는 DMS7139의 반복 투여가 DOM7h-14 대조군과 비교하여 HbA1c의 용량 의존적인 저하를 나타낸다는 것을 도시한다.
도 13은 DATO115 및 DMS7139가 비만의 DIO 마우스 모델에서 DOM7h-14 대조군과 비교하여 음식 소비 및 체중의 용량 의존적인 감소를 나타낸다는 것을 도시한다. 그래프에서 meg = 마이크로그램.
도 14는 리신(PYY의 위치 10에 도입됨) 및 4개 반복 PEG 링커를 통해, C 말단에서 아미드화된 PYY3-36에 컨쥬게이션된 DOM7h-14-10 (R108C) AlbudAb인 펩티드 컨쥬게이트를 도시한다. 선은 DOM7h-14-10 (Rl08C) AlbudAb의 유리 C 말단 시스테인 및 PYY 서열의 위치 10의 리신에 공유 결합되는 링커를 나타낸다. 이러한 펩티드 컨쥬게이트의 아미노산 서열 및 구조는 아래와 같다.
도 15는 DMS7605가 비히클 대조군과 비교하여 체중의 용량 의존적인 감소를 나타낸다는 것을 도시한다.
본 명세서에서는, 명확하고 간결한 명세서가 작성될 수 있도록 본 발명을 구체예들을 참조로 기재하였다. 구체예들은 본 발명에서 벗어남이 없이 다양하게 통합 및 분리될 수 있는 것으로 해석 및 이해되어야 한다.
달리 정의하지 않는 경우, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 당업계(예를 들어, 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 하이브리드화 기법 및 생화학 분야)에서 통상의 기술을 가진 당업자가 이해하고 있는 바와 동일한 의미를 갖는다. 표준 기법이 분자, 유전자 및 생화학 방법(일반적으로, 본원에 참조로 포함되는 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc. 참조) 및 화학적 방법에 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "인슐린 분비촉진제"(insulinotropic agent)는 호르몬 인슐린을 자극하거나, 호르몬 인슐린의 자극, 합성 또는 발현, 또는 활성을 유발하는 화합물을 의미한다. 인슐린 분비촉진제의 알려진 예로는 글루코스, GIP, GLP, 엑센딘(예를 들어, 엑센딘-4 및 엑센딘-3), PYY, 및 OXM이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "인크레틴"(incretin)은 글루코스 수준이 정상이거나 특히 증가되는 때 방출되는 인슐린의 양을 증가시키는 위장 호르몬의 유형을 의미한다. 이의 예로는 GLP-1, GIP, OXM, PYY (예를 들어, PYY 3-36), VIP 및 PP (췌장 폴리펩티드)가 있다.
폴리펩티드를 언급하면서 본원에서 사용되는 용어 "유사체"(analogue)는 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되었고/거나 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩티드로부터 결실되었고/거나 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩티드에 부가된 변형된 펩티드를 의미한다. 아미노산의 이러한 부가 또는 결실은 펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단에서 일어날 수 있거나 펩티드안에 존재할 수 있다. 간단한 계를 이용하여 GLP-1의 유사체를 설명한다. 예를 들어, GLP-1 A8G (7-37개 아미노산)은 위치 8의 천연발생 알라닌이 글리신 잔기로 치환되어진 GLP-1 유사체를 나타낸다. 펩티드 유사체 및 이의 유도체의 일반식은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 사용되는 아미노산에 대한 표준 단일 문자 약어를 이용하여 나타낸다.
본원에서 폴리펩티드의 언급시에 사용되는 용어 "단편"(fragment)은 완전한 천연발생 폴리펩티드의 아미노산 서열과 완전히 동일하지는 않지만 부분적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 단편은 독립적으로 존재(free-standing)할 수 있거나, 이들이 단일의 더욱 큰 폴리펩티드 내에서 단일의 연속적인 영역으로서 일부분 또는 영역을 형성하고 있는 더욱 큰 펩티드내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 천연발생 GLP-1의 단편은 천연발생 아미노산 잔기 1 내지 36 중의 아미노산 잔기 7 내지 36을 포함할 것이다. 또한, 폴리펩티드의 단편은 천연발생 부분 서열의 변이체일 수도 있다. 예를 들어, 천연발생 GLP-1의 아미노산 7 내지 30을 포함하는 GLP-1의 단편은 또한 이의 부분 서열에서 아미노산 치환을 갖는 변이체일 수 있다.
본 발명의 적당한 인슐린 분비촉진제의 예로는 GLP-1, GLP-1 유도체, GLP-1 유사체, 또는 GLP-1 유사체의 유도체가 있다. 또한, 그 예로는 엑센딘-4, 엑센딘-4 유사체 및 엑센딘-4 유도체 또는 단편 및 엑센딘-3, 엑센딘-3 유도체 및 엑센딘-3 유사체가 있다.
본원에서 사용되는 용어 "GLP-1"은 GLP-1 (7-37), GLP-1 (7-36), GLP-1 (7-35), GLP-1 (7-38), GLP-1 (7-39), GLP-1 (7-40), GLP-1 (7-41), GLP-1 유사체, GLP-1 펩티드, GLP-1 유도체 또는 돌연변이체, 또는 GLP-1 유사체의 단편 또는 유도체를 의미한다. 이러한 펩티드, 돌연변이체, 유사체 및 유도체는 인슐린 분비촉진제이다.
예를 들어 GLP-1은 도 1b(i)에서 도시한 아미노산 서열: SEQ ID NO 9를 갖는 GLP-1 (7-37) A8G 돌연변이체일 수 있다.
추가의 GLP-1 유사체들은, GLP-1 (7-36) 및 이의 기능적 유도체를 포함하고 GLP-1 (1-36) 또는 GLP-1 (1-37)의 인슐린분비 촉진 활성을 초과하는 인슐린 분비촉진 활성을 갖는 펩티드 단편 및 이의 인슐린 분비촉진제로서의 용도에 관한 국제 특허 출원 제 90/11296호(General Hospital Corporation사)(특히 본 발명에서 사용하기 위한 약물의 예에 대하여 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
국제 특허 출원 제 WO 91/11457호(Buckley et al..)는 본 발명에 따른 GLP-1 약물로서 유용할 수도 있는 활성 GLP-1 펩티드 7-34, 7-35, 7-36 및 7-37의 유사체를 개시하고 있다.
본원에서 사용되는 용어 "엑센딘-4 펩티드"(exendin-4 peptide)는 엑센딘-4 (1-39), 엑센딘-4 유사체, 엑센딘-4 펩티드의 단편, 엑센딘-4 유도체, 또는 엑센딘-4 유사체의 유도체를 의미한다. 이러한 펩티드, 단편, 유사체 및 유도체는 인슐린 분비촉진제이다. 엑센딘-4 (1-39)의 아미노산 서열은 도 1b-c(j)에 도시되어 있다: SEQ ID NO 10.
본 발명에서 유용한 추가의 엑센딘 유사체들은 PCT 특허 공보 WO 99/25728호 (Beeley et al.), WO 99/25727호 (Beeley et al.), WO 98/05351호 (Young et al.), WO 99/40788호 (Young et al.), WO 99/07404호 (Beeley et al), 및 WO 99/43708호 (Knudsen et al) (특히 본 발명에서 사용하기 위한 약물의 예에 대하여 모두 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "펩티드"는 펩티드 결합을 통해 함께 결합되는 약 2개 내지 약 50개 아미노산을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 함께 결합되는 적어도 약 50개의 아미노산을 의미한다. 폴리펩티드는 일반적으로 3차 구조를 포함하고 기능적 도메인들로 폴딩된다.
본원에서 사용되는 용어 "디스플레이 시스템"은 폴리펩티드 또는 펩티드들의 집합이 물리적, 화학적 또는 기능적 특성과 같은 원하는 특성을 기준으로 선택을 위해 접근할 수 있는 시스템을 의미한다. 상기 디스플레이 시스템은 폴리펩티드 또는 펩티드(예를 들어, 용액 상태, 적당한 지지체에 고정된 상태)의 적당한 레퍼터리일 수 있다. 또한, 상기 디스플레이 시스템은 세포 발현 시스템(예를 들어, 형질전환, 감염, 형질감염 또는 형질도입 세포에서 핵산 라이브러리의 발현, 및 세포 표면 상에 엔코딩된 폴리펩티드의 디스플레이) 또는 비세포 발현 시스템(예를 들어, 에멀젼 구획화 및 디스플레이)을 이용하는 시스템일 수도 있다. 예시적인 디스플레이 시스템은 핵산의 코딩 기능 및 상기 핵산에 의해 엔코딩된 폴리펩티드 또는 펩티드의 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특성을 연결한다. 이러한 디스플레이 시스템이 이용되는 경우, 원하는 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특성을 갖는 폴리펩티드 또는 펩티드가 선택될 수 있고 그 선택된 폴리펩티드 또는 펩티드를 엔코딩하는 핵산이 용이하게 분리 및 회수될 수 있다. 핵산의 코딩 기능 및 폴리펩티드 또는 펩티드의 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특성을 연결하는 다수의 디스플레이 시스템이 당업계에 알려져 있는데, 예를 들어, 박테리오파지 디스플레이(파지 디스플레이, 예를 들어 파지미드 디스플레이), 리보솜 디스플레이, 에멀젼 구획화 및 디스플레이, 효모 디스플레이, 퓨로마이신 디스플레이, 세균 디스플레이, 플라스미드 상의 디스플레이, 공유 디스플레이 등이 있다. (예를 들어, EP 0436597호 (Dyax), 미국특허 6,172,197호 (McCafferty et ah), 미국특허 6,489,103호 (Griffiths et al.) 참조).
본원에서 사용되는 용어 "기능적"은 특이적 결합 활성과 같은 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 펩티드를 설명하는 것이다. 예를 들어, 용어 "기능적 폴리펩티드"는 그 항원 결합 부위를 통해 표적 항원에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "표적 리간드"는 폴리펩티드 또는 펩티드에 의해 특이적이거나 선택적으로 결합되는 리간드를 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드가 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 경우, 그 표적 리간드는 임의의 원하는 항원 또는 에피토프일 수 있다. 표적 항원에의 결합은 그 폴리펩티드 또는 펩티드가 기능적인 지의 여부에 의존한다.
본원에서 사용되는 "항체"는 자연적으로 항체를 생성하는 임의의 종으로부터 유래되거나, 재조합 DNA 기술에 의해 발생되거나, 혈청, B-세포, 하이브리도마, 트랜스펙토마, 효모 또는 세균으로부터 분리되는 지와 무관하게, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 또는 단편 (예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv, 이황화물 결합 Fv, scFv, 밀페 형태 다중특이적 항체, 이황화물 결합 scFv, 디아보디(diabody))을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체 포맷"(antibody format)은 하나 이상의 항체 가변 도메인이 구조상의 항원에 대한 결합 특이성을 부여하도록 혼입될 수 있는 임의의 적당한 폴리펩티드 구조를 의미한다. 여러 가지 적당한 항체 포맷이 당업계에 알려져 있는데, 이의 예로는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간항체, 단쇄 항체, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 동종이합체 및 이종이합체, 전술한 것들 중 임의의 것의 항원 결합 단편(예를 들어, Fv 단편 (예를 들어, 단쇄 Fv (scFv), 이황화물 결합 Fv), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편), 단일 항체 가변 도메인(예를 들어, dAb, VH, VHH, VL), 및 전술한 것들 중 임의의 것의 변형된 형태(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 적합한 폴리머 또는 인간화 VHH의 공유 부착을 통해 변형된 것)이 있다.
문구 "면역글로불린 단일 가변 도메인"은 다른 V 영역 또는 도메인과 무관하게 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 가변 도메인(VH, VHH, VL)을 의미한다. 면역 글로불린 단일 가변 도메인은 다른 영역 또는 도메인이 단일 면역글로불린 가변 도메인에 의한 항원 결합에 요구되지 않는(즉, 면역글로불린 단일 가변 도메인이 추가의 가변 도메인과 무관하게 항원에 결합하는) 다른 가변 영역 또는 가변 도메인을 갖는 포맷(예를 들어, 동종 다합체 또는 이종 다합체)으로 존재할 수 있다. "도메인 항체" 또는 "dAb"는 본원에서 사용되는 용어인 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일한 것이다. "단일 면역글로불린 가변 도메인"은 본원에서 사용되는 용어인 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일한 것이다. "단일 항체 가변 도메인"은 본원에서 사용되는 용어인 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일한 것이다. 일 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 인간 항체 가변 도메인이지만, 설치동물(예를 들어, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 WO 00/29004호 참조), 너스 상어 및 낙타의 VHH dAb와 같은 다른 종 유래의 단일 항체 가변 도메인도 포함한다. 낙타의 VHH는 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 항체를 생성하는, 낙타, 라마, 알파카, 단봉낙타 및 야생라마를 비롯한 종들로부터 유래되는 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다.
"도메인"은 그 단백질의 나머지와 무관하게 3차 구조를 갖는 폴딩된 단백질 구조이다. 일반적으로, 도메인들은 단백질의 불연속적인 기능적 특성의 원인이 되고, 많은 경우 단백질의 나머지 및/또는 도메인의 기능의 손실 없이 다른 단백질에 부가, 제거 또는 전달될 수 있다. "단일 항체 가변 도메인"은 항체 가변 도메인들의 특징적 서열을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인이다. 따라서, 이는 완전 항체 가변 도메인, 또는 예를 들어 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특징이 아닌 서열로 치환되어 있는 변형된 가변 도메인, 또는 절단되었거나 N- 또는 C-말단 연장부를 포함하는 항체 가변 도메인, 및 전장 도메인의 적어도 결합 활성 및 특이성을 유지하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다.
용어 "라이브러리"(library)는 이종 폴리펩티드 또는 핵산의 혼합물을 의미한다. 상기 라이브러리는 그 각각이 단일 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 갖는 멤버들로 구성된다. 이러한 점에서, "라이브러리"는 "레퍼터리"와 동의어이다. 라이브러리 멤버들 사이의 서열 차이는 라이브러리에 존재하는 다양성의 원인이 된다. 상기 라이브러리는 폴리펩티드 또는 핵산의 간단한 혼합물의 형태를 취할 수 있거나, 핵산의 라이브러리로 형질전환된 유기체 또는 세포, 예를 들어, 세균, 바이러스, 동물 또는 식물 세포 등의 형태일 수 있다. 일 구체예에서, 각각의 개개 유기체 또는 세포는 단지 하나 또는 제한된 수의 라이브러리 멤버를 함유한다. 일 구체예에서, 상기 핵산은 핵산에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하기 위하여 발현 벡터에 혼입될 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 라이브러리는 숙주 유기체들의 집단의 형태를 취할 수 있는데, 각 유기체는 그의 상응하는 폴리펩티드 멤버를 생산하도록 발현될 수 있는 핵산 형태의 라이브러리의 단일 멤버를 함유하는 발현 벡터의 하나 이상의 카피를 함유한다. 따라서, 숙주 유기체들의 집단은 다양한 폴리펩티드들의 큰 레퍼러티를 엔코딩하는 능력이 있다.
본원에서 사용되는 용어 "투여량"(dose)은 개체에게 모두 한 번에 투여되거나(단위 투여량) 일정 시간 간격으로 2회 이상 투여되는 융합체 또는 컨쥬게이트의 양을 의미한다. 예를 들어, 투여량은 1일 (24 시간)(하루 투여량), 2일, 1주, 2주, 3주 또는 1달 이상에 걸쳐서 예를 들어 단일 투여 또는 2회 이상의 투여를 통해 개체에게 투여되는 융합체 또는 컨쥬게이트의 양을 의미한다. 투여 사이의 간격은 임의의 원하는 시간일 수 있다.
용어 "반감기"는 융합체 또는 컨쥬게이트의 혈청 또는 혈장 농도가 생체내에서 자연적 기작에 의한 분해 및/또는 배설 또는 배출로 인해 50% 만큼 감소하는데 걸리는 시간을 의미한다. 본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트는 생체내에서 안정화되고, 이의 반감기는 분해 및/또는 배설 또는 배출에 저항하는 혈청 알부민 분자, 예를 들어 인간 혈청 알부민(HSA)과의 결합을 통해 증가된다. 이러한 혈청 알부민 분자는 자체가 생체내에서 긴 반감기를 갖는 천연발생 단백질이다. 분자의 반감기는 이의 기능적 활성이 반감기 증가 분자에 특이적이지 않은 유사한 분자보다 더욱 긴 시간 동안 생체내에서 지속되는 경우에 증가된다. 예를 들어, 인간 혈청 알부민(HSA)에 특이적인 dAb 및 GLP- 1 또는 엑센딘과 같은 인크레틴 약물 또는 인슐린 분비촉진제를 포함하는 본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트는 HSA에 대한 특이성이 존재하지 않는, 즉 HSA에 결합하지 않지만 또 다른 분자에는 결합하는 동일한 리간드와 비교된다. 예를 들어, 이는 세포 상의 제3 표적에 결합할 수 있다. 대표적으로, 그 반감기는 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상만큼 증가된다. 반감기의 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 2Ox, 30x, 4Ox, 5Ox, 10Ox, 20Ox, 300x 또는 그 이상의 범위의 증가가 가능하다. 그렇지 않거나 또는 그에 부가하여, 반감기의 30x, 4Ox, 5Ox, 6Ox, 7Ox, 80x, 9Ox, 10Ox, 15Ox , 20Ox, 300x , 40Ox 까지의 범위의 증가가 가능하다.
본원에서 사용되는 용어 "유체역학적 크기"(hydrodynamic size)는 수용액을 통한 분자 확산에 기초한 분자(예를 들어, 단백질 분자, 리간드)의 외관상 크기를 의미한다. 용액을 통한 단백질의 분산 또는 이동은 단백질 입자의 "스토크스 반경"(Stokes radius) 또는 "유체역학적 반경"에 의해 주어지는 단백질의 외관상 크기를 유도하도록 처리될 수 있다. 단백질의 "유체역학적 반경"은 동일한 분자 질량을 갖는 두 단백질들이 단백질의 전체 형태를 기준으로 상이한 유체역학적 크기들을 가질 수 있도록 질량 및 형상(형태) 둘 모두에 의존한다.
두 서열들 사이의 "상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"(이 용어들은 본원에서 상호교환적으로 사용됨)의 계산은 디음과 같이 수행된다. 서열들은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 중의 하나 또는 둘 모두 또는 핵산 서열에 갭이 도입될 수 있고, 비상동성 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있다). 일 구체예에서, 비교목적을 위해 정렬된 참조 서열의 길이는 그 참조 서열 길이의 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 80%, 90%, 100%이다. 다음에, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 제1 서열의 위치를 제2 서열에서의 해당 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 차지하는 경우, 그 분자들은 그 위치에서 동일하다(본원에서 사용되는 아미노산 또는 핵산의 "상동성"은 아미노산 또는 핵산 "동일성"과 동일한 의미이다). 두 서열 사이의 동일성%은 두 서열들의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여 그 서열들이 공유하는 동일 위치들의 수의 함수이다. 본원에서 정의하는 바와 같은 아미노산 및 뉴클레오티드 서열 정렬 및 상동성, 유사성 또는 동일성은 디폴트 파라미터를 이용한 알고리즘 BLAST 2 서열을 이용하여 준비 및 측정될 수 있다(Tatusova, T. A. et al, FEMS Microbiol Lett, 774: 187-188 (1999).
핵산, 숙주 세포:
본 발명은 본원에서 기재되는 본 발명의 융합체를 엔코딩하는 분리된 및/또는 재조합 핵산, 예를 들어 SEQ ID NO 13 내지 23에 의해 엔코딩되는 것들에 관한 것이다.
본원에서 "분리된"으로 나타내는 핵산은 그의 본래 환경(예를 들어, 세포 또는 라이브러리와 같은 핵산들의 혼합물)에서 다른 물질(예를 들어, 게놈 DNA, cDNA 및/또는 RNA와 같은 다른 핵산)에서 분리된 핵산이다. 분리된 핵산은 백터(예를 들어, 플라스미드)의 일부로서 분리될 수 있다.
본원에서 "재조합"으로 나타낸 핵산은 예를 들어 제한 효소, 상동성 재조합, 바이러스 등을 이용한 벡터 또는 염색체로의 클로닝과 같은 인위적 재조합에 의존하는 방법을 비롯한 재조합 DNA 방법을 통해 생산된 핵산, 및 중합 효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 제조된 핵산이다,
또한, 본 발명은 본원에서 기재한 바와 같은 본 발명의 융합체를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 (하나 이상의) 재조합 핵산 또는 발현 작제물을 포함하는 재조합 숙주 세포, 예를 들어, 포유동물 또는 미생물에 관한 것이다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 융합체를 제조하는 방법으로서, 본 발명의 재조합 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 또는 미생물을 융합 폴리펩티드의 발현에 적절한 조건하에 유지시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 필요한 경우, 상가 융합체를 분리 또는 회수하는 던계를 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 핵산 분자(들)이 하나 이상의 발현 조절 엘리먼트(예를 들어, 숙주 세포 게놈에 통합된 벡터, 세포내 과정에 의해 발생된 작제물에서)에 작동 가능하게 연결되도록, 본 발명의 융합 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 분자(즉, 하나 이상의 핵산 분자) 또는 이러한 핵산 분자(들)를 포함하는 발현 작제물(즉, 하나 이상의 작제물)이, 선택된 숙주 세포에 적절한 임의의 방법(예를 들어, 형질전환, 형질감염, 전기천공, 감염)을 이용하여 적당한 숙주 세포에 도입되어 재조합 숙주 세포가 발생된다. 얻어지는 재조합 숙주 세포는 발현에 적당한 조건(예를 들어, 유도서열의 존재하에서, 또는 적당한 동물에서, 또는 적절한 염, 성장 인자, 항생제, 영양 성분 등이 첨가된 적당한 배양 배지에서)하에서 유지될 수 있어서, 엔코딩된 펩티드 또는 폴리펩티드가 제조된다, 필요한 경우, 상기 엔코딩된 펩티드 또는 폴리펩티드는 분리 또는 회수될 수 있다(예를 들어, 동물, 숙주 세포, 배지, 밀크로부터). 이러한 방법은 유전자이식 동물의 숙주 세포에서의 발현을 포함한다(예를 들어, WO 92/03918(GenPharm International사) 참조).
본원에서 기재한 본 발명의 융합 폴리펩티드는 예를 들어 화학적 합성 또는 어떠한 다른 적당한 방법을 통해 적당한 시험관내 발현 시스템에서 생산될 수도 있다.
본원에서 기재 및 예시하는 바와 같이, 본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트는 일반적으로 혈청 알부민에 높은 친화성으로 결합한다.
예를 들어, 본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트는 약 5 마이크로몰 내지 약 100 pM, 예를 들어 약 1 마이크로몰 내지 약 100 pM, 예를 들어 약 5 내지 50nm, 예를 들어 약 10 내지 30nm, 예를 들어 약 20 내지 30nm의 친화성(KD; KD=Koff (kd)/Kon (ka) [표면 플라즈몬 공명으로 측정])으로 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있다.
본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트는 이.콜라이(E. coli) 또는 피키아 종(예를 들어, 피. 파스토리스(P. pastoris))에서 발현될 수 있고 임의의 효모 또는 진균 세포에서 발현될 수도 있다. 일 구체예에서, 상기 융합체는 이.콜라이(E. coli), 피키아 종(예를 들어, 피키아 파스토리스) 또는 포유동물 세포 배양물(예를 들어, CHO 또는 HEK 293 세포)에서 발현시 적어도 약 0.5 mg/L의 양으로 분비된다. 본원에서 기재한 융합체 또는 컨쥬게이트는 이.콜라이(E. coli) 또는 피키아 종 또는 포유동물 세포에서 발현시 분비될 수 있지만, 이.콜라이(E. coli) 또는 피키아 종을 이용하지 않는 합성 화학적 방법 또는 생물학적 제조 방법과 같은 임의의 적당한 방법을 이용하여 생산할 수 있다.
특정의 구체예에서, 본 발명의 융합체 및 컨쥬게이트는 유효량으로 투여시, WO 2006/059106호(예를 들어 공개된 WO 2006 /059106호의 104-105면) 또는 본 발명의 실시예에서 기재된 것들과 같은 동물 모델에서 효능이 있다. 일반적으로, 유효량은 약 0.0001 mg/kg 내지 약 10 mg/kg (예를 들어, 약 0.001 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 예를 들어, 약 0.001 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 예를 들어, 약 0.01 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 예를 들어, 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.1 mg/kg)이다. 당업자는 질병 모델이 인간에서 치료 효능을 나타내는 것으로 인식하고 있다.
일반적으로, 본 발명의 컨쥬게이트 및 융합체는 약리학적 또는 생리학적으로 적절한 담체와 함께 정제된 형태로 이용될 것이다. 대표적으로, 이러한 담체로는 염수 및/또는 완충 매질을 비롯한, 수성 또는 알콜성/수용액, 에멀젼 또는 현탁액이 있을 수 있다. 비경구 비히클로는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨 및 락테이트화 링거액을 들 수 있다. 필요한 경우, 현탁액에서 폴리펩티드 복합체를 유지하기 위한 적당한 생리학적으로 허용가능한 보조제를 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알긴산염과 같은 증점제로부터 선택할 수 있다.
정맥내 비히클로는 링거 덱스트로스를 기반으로 하는 것들과 같은 유체 및 영양 보충제(replenisher) 및 전해질 보충제가 있다. 또한, 보존제 및 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 가스와 같은 기타 첨가제가 존재할 수도 있다(Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition). 연장된 방출 제제를 비롯한 여러 가지 적당한 제제를 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여 경로는 당업자에게 일반적으로 알려져 있는 경로들 중 임의의 것일 수 있다. 치료를 위하여, 본 발명의 약물 융합체 또는 컨쥬게이트는 표준 기법에 따라 임의의 환자에게 투여될 수 있다.
그 투여는 비경구, 정맥내, 근육내, 복막내, 경구, 경피, 폐 경로를 통해, 또는 적합하게는 카테터를 이용한 직접 흡입을 비롯한 임의의 적절한 방법으로 수행될 수 있다. 투여량 및 투여 횟수는 환자의 연령, 성별 및 상태, 다른 동시 투여 약물, 금기사항, 및 임상의에 의해 고려되어야 하는 기타 파라미터에 의존할 것이다. 투여는 지시에 따라 국소적 또는 전신적으로 이루어질 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 폐에 전달하기 위한 폐투여용 제제로서, (a) 본 발명의 컨쥬게이트 또는 융합체 및 (b) 약제학적으로 허용가능한 완충액을 포함하고, 그 조성물은 액적을 포함하고, 그 조성물에 존재하는 액적의 약 40% 이상, 예를 들어 50% 이상은 약 6 미크론 미만, 예를 들어, 약 1 내지 약 6 미크론, 예를 들어 약 5 미크론 미만, 예를 들어 약 1 내지 약 5 미크론의 크기를 갖는 제제를 제공한다. 이러한 조성물은 예를 들어 직접 국소적 폐 전달을 통해 개체에게 투여하기에 특히 적당하다. 이러한 조성물은 예를 들어, 네뷸라이저 기구를 이용한 예를 들어 흡입을 통해 폐에 직접 투여될 수 있다. 이러한 폐전달용 조성물은 약 4 내지 약 8의 pH, 예를 들어 약 7 내지 7.5의 pH, 및 1.2% (w/v) 수크로스를 함유하는 5OmM 인산염 완충액에 용해된 약 2% 내지 약 10% PEG 1000의 용액의 점도와 거의 동일한 점도를 갖는 생리적으로 허용가능한 완충액을 포함할 수 있다.
본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트는 저장을 위해 동결건조되고 사용에 앞서 적당한 담체에서 재구성될 수 있다. 이러한 기법은 통상적인 면역글로불린의 경우에 효과적인 것으로 확인되어 왔고, 잘 알려진 동결건조 및 재구성 기법이 이용될 수 있다. 당업자는 동결건조 및 재구성은 다양한 정도의 항체 활성 손실을 초래할 수 있고(예를 들어, 통상적인 면역글로불린의 경우, IgM 항체는 IgG 항체보다 활성 손실이 큰 경향이 있음) 그 사용 수준은 보상을 위해 상향 조절될 수 있음을 이해할 것이다.
예방 용도의 경우, 예를 들어, 당뇨병-전 또는 인슐린 내성을 갖는 개체에게 투여하는 경우, 본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트를 함유하는 조성물은 질병의 발병을 예방, 억제 또는 지연시키기 위하여(예를 들어, 완화 또는 정지를 지속시키거나 급성 단계를 방지함) 유사 또는 약간 낮은 투여량으로 투여될 수도 있다. 당업자는 질병을 치료, 억제 또는 예방하기 위한 적절한 투여 간격을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트가 질병을 치료, 억제 또는 예방하기 위하여 투여되는 경우, 이는 예를 들어 약 0.0001 mg/kg 내지 약 10 mg/kg (예를 들어, 약 0.001 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 예를 들어 약 0.001 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 예를 들어 약 0.01 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 예를 들어 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.1 mg/kg)의 투여량으로 하루에 4회 이하, 일주일에 2회, 일주일에 1회, 2주일에 1회, 1달에 1회, 또는 2달에 1회 투여될 수 있다.
본원에서 기재된 조성물을 이용하여 수행되는 치료 또는 요법은 하나 이상의 증상이 치료전에 존재하는 이러한 증상과 비교하여 또는 이러한 조성물 또는 다른 적당한 물질로 처리되지 않은 개체(인간 또는 동물 모델)에서의 이러한 증상과 비교하여 감소(예를 들어, 적어도 10%만큼 또는 임상 평가 점수에서 적어도 약 1점)되는 경우에 "효과적인" 것으로 간주된다. 증상은 표적되는 질병 또는 장애의 정확한 성질에 따라 명백히 변화하게 되지만, 당업자에 의해 측정될 수 있다.
유사하게, 본원에서 기재되는 조성물을 이용하여 수행되는 예방은 하나 이상의 증상의 발병 또는 중증도가 그 조성물로 처리하지 않은 유사한 개체(인간 또는 동물 모델)에서의 이러한 증상과 비교하여 지연, 감소 또는 폐지되는 경우에 "효과적"이다.
본 발명의 융합체 및 컨쥬게이트는 별개로 투여되는 조성물로서 사용될 수 있거나, 다른 치료제 또는 활성 작용제, 예를 들어 다른 폴리펩티드 또는 펩티드 또는 작은 분자와 함께 투여될 수 있다. 이러한 추가의 성분으로는 예를 들어 메트포르민, 인슐린, 글리타존(예를 들어, 로사글리타존), 면역억제제, 면역 자극제와 같은 여러가지 약물이 있을 수 있다.
본 발명의 융합체 및 컨쥬게이트는 한 종 이상의 추가의 치료제 또는 활성 작용제와 함께 투여 및/또는 제형화될 수 있다. 본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트가 추가의 치료제와 함께 투여되는 경우, 그 융합체 또는 컨쥬게이트는 추가의 작용제의 투여 이전, 동시 또는 이후에 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트 및 추가의 작용제는 치료 효과의 중복을 제공하도록 투여된다.
반감기:
인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물, 예를 들어 GLP-1 또는 엑센딘 리간드의 증가된 반감기는 생체내 용도로 유용하다. 본 발명은 생체내에서 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물, 예를 들어 GLP 및 엑센딘의 반감기를 증가시켜서 결과적으로 체내에서 이러한 분자의 지속 시간을 연장시킴으로써 이러한 문제를 해결한다.
본원에 기재한 바와 같이, 본 발명의 조성물(즉, 본원에 기재된 융합체 또는 컨쥬게이트를 포함하는)은 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물 단독의 경우와 비교하여, 현저하게 연장된 생체내 혈청 또는 혈장 반감기 및/또는 증가된 AUC 및/또는 증가된 평균 체류 시간(MRT)을 가질 수 있다. 또한, 일반적으로 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물의 활성은 본 발명의 조성물(예를 들어, 컨쥬게이트 또는 융합체)에서 실질적으로 변화되지 않는다. 그러나, 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물 단독의 경우와 비교하여 본 발명의 조성물의 활성에서 약간의 변화는 허용가능하고, 본 발명의 컨쥬게이트 또는 융합체의 개선된 약물동력학적 특성에 의해 일반적으로 보상된다. 예를 들어, 본 발명의 약물 컨쥬게이트 또는 융합체는 약물 단독의 경우와 비교하여 낮은 친화성으로 약물 표적에 결합할 수 있지만, 그 약물 조성물의 개선된 약물동력학적 특성(예를 들어, 연장된 생체내 혈청 반감기, 더 큰 AUC)로 인해 약물 단독의 경우와 비교하여 거의 대등하거나 우수한 효능을 갖는다. 또한, 본 발명의 컨쥬게이트 또는 융합체의 증가된 반감기로 인해, 이들은 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물 단독의 경우보다 덜 빈번하게 투여될 수 있다. 예를 들어, 이들은 한 달에 1회 또는 일주일에 1회 환자에게 제공될 수 있고, 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물 단독의 투여와 비교하여 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물의 더욱 일정한 수준을 달성함으로써, 원하는 치료 또는 예방 효과를 달성한다.
리간드 반감기의 약물동력학적 분석 및 측정 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상세한 사항은 다음문헌[Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). Reference is also made to 'Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982)]에서 확인될 수 있는데, 상기 문헌은 t 알파 및 t 베타 반감기 및 곡선하 면적(AUC)과 같은 약물동력학적 파라미터를 기재하고 있다.
반감기(t1/2 알파 및 t1/2 베타) 및 AUC 및 MRT는 시간에 따른 리간드의 혈장 및 혈청 농도의 곡선으로부터 측정할 수 있다. 예를 들어, WinNonlin 분석 패키지(Pharsight Corp.사, Mountain View, CA94040, USA)를 이용하여 곡선을 모델링할 수 있다. 제1 단계(알파 단계)에서, 리간드는 약간 제거되면서 환자내에 주로 분포한다. 제2 단계(베타 단계)는 리간드가 분포된 후의 말단 단계이고, 리간드가 환자로부터 제거됨에 따라 혈청 농도가 감소한다. t 알파 반감기는 제1 단계의 반감기이고, t 베타 반감기는 제2 단계의 반감기이다. 또한, 당업계에 잘 알려져 있는 비구획적 합치 모델(fitting model)을 이용하여 반감기를 측정할 수도 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 예를 들어, 인간 개체에서 약 12 시간 이상, 예를 들어 약 12 시간 내지 약 21일, 예를 들어 약 24 시간 내지 약 21일, 예를 들어 약 2 내지 10일, 예를 들어 약 3 내지 4일 범위의 제거 반감기를 갖는 본 발명에 따른 융합체 또는 컨쥬게이트를 제공한다.
또한, 본 발명의 융합체 또는 컨쥬게이트는 예를 들어, PEG 기, 혈청 알부민, 트랜스페린, 트랜스페린 또는 적어도 이의 트랜스페린 결합 부분, 항체 Fc 영역의 부착에 의해서나, 항체 도메인으로의 컨쥬게이션에 의해 더욱 큰 유체역학적 크기를 가지도록 추기로 포맷될 수 있다.
유체역학적 크기는 당업계에서 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 리간드의 유체역학적 크기를 측정할 수 있다. 가교된 아가로스 매트릭스와 같은 리간드의 유체역학적 크기를 측정하기 위한 적당한 겔 여과 매트릭스가 잘 알려져 있고 쉽게 이용가능하다.
본 발명의 조성물, 즉 본원에서 기재한 융합체 및 컨쥬게이트를 포함하는 것들은 몇몇의 추가의 이점을 제공한다. 도메인 항체 성분은 매우 안정하고, 항체 또는 항체의 다른 항원 결합 단편과 비교하여 작고, 이.콜라이(E. coli) 또는 효모(예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris))에서의 발현을 통해 고수율로 생산될 수 있고, 혈청 알부민에 결합하는 항체의 항원 결합 부위가 인간 기원 라이브러리 또는 임의의 원하는 종으로부터 용이하게 선택될 수 있다. 따라서, 혈청 알부민에 결합하는 dAb를 포함하는 본 발명의 조성물은 포유동물 세포(예를 들어, 인간, 인간화 또는 키메라 항체)에서 일반적으로 제조되는 치료제보다 더욱 용이하게 제조될 수 있고, 면역원성이 아닌 dAb가 사용될 수 있다(즉, 인간 dAb를 인간에서 질병의 치료 및 진단을 위해 이용할 수 있다).
인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물의 면역원성은 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴이 혈청 알부민에 결합하는 dAb를 함유하는 약물 조성물의 일부인 경우에 감소될 수 있다. 따라서, 본 발명은 덜 면역원성이거나(예를 들어, 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물 단독의 경우와 비교하여) 또는 혈청 알부민에 결합하는 dAb를 함유하는 약물 조성물에서 실질적으로 비면역원성일 수 있는 융합체 또는 컨쥬게이트 조성물을 제공한다. 따라서, 이러한 조성물은 개체의 면역계에 의한 항-약물 항체의 합성으로 인해 최소의 효능 상실과 함께 시간에 따라 개체에게 반복 투여될 수 있다.
게다가, 본원에서 기재한 컨쥬게이트 또는 융합체는 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물 단독의 경우 보다 향상된 안전성 프로필 및 적은 부작용을 갖는다. 예를 들어, dAb의 혈청 알부민 결합 활성의 결과로서, 본 발명의 융합체 및 컨쥬게이트는 혈관 순환계에서 향상된 체류 시간을 갖는다. 게다가, 본 발명의 융합체 및 컨쥬게이트는 혈뇌 장벽을 실질적으로 가로지를 수 없고 전신 투여(예를 들어, 혈관내 투여)후 중추 신경계에 축적될 수 없다. 따라서, 본 발명의 융합체 및 컨쥬게이트는 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물 단독의 경우와 비교하여 높은 안전성 및 감소된 부작용을 가지고서 투여될 수 있다. 마찬가지로, 그 융합체 및 컨쥬게이트는 약물 단독의 경우와 비교하여 특정 장기(예를 들어, 신장 또는 간)에 대하여 감소된 독성을 가질 수 있다.
실시예
실시예 1: GLP-1 (A8G) 또는 엑센딘-4와 D0M7h-H AlbudAb의 유전적 융합체의 발현:
위치 8의 알라닌이 글리신으로 치환된([Gly8] GLP-1) 엑센딘-4 또는 GLP-1 (7-37)을 DOM7h-14 (아래에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 혈청 알부민(AlbudAb)에 결합하는 도메인 항체(dAb))와의 융합체로서 pTT-5 벡터(CNRC사, Canada)에 클로닝했다. 각각의 경우마다, GLP-1 또는 엑센딘-4는 상기 작제물의 5' 말단에 위치하였고 dAb는 3' 말단에 위치하였다. 전체적으로, 도 1(A-G)에서 도시한 아미노산 서열을 갖는 7개의 작제물(DATO114, DAT0115, DATO116, DAT0117, DAT0118, DAT0119, DAT0120)을 만들었다. GLP-1 또는 엑센딘-4와 dAb의 사이에는 링커가 없거나 gly-ser 링커(G4S), 또는 나선형 링커(Arai, R., H. Ueda, et al. (2001). "Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein." Protein Eng 14(8): 529-32.456) 또는 제2 GLP-1 부분으로 구성된 링커가 있었다. 상기 링커들은 GLP-1 또는 엑센딘-4와 GLP-1 수용체의 사이의 결합의 입체 장애를 방지하기 위해 dAb로부터 GLP-1 또는 엑센딘-4를 공간적으로 분리하기 위한 스페이서로서 포함되었다. 상기 작제물들의 서열이 도 1(A-G)에서 도시되어 있다.
알칼리성 용해를 이용하여 내독소가 없는 DNA를 이.콜라이(E.coli)에서 제조하고 (Qiagen CA사로부터 입수가능한 내독소가 없는 플라스미드 Giga 키트를 이용) 이를 이용하여 HEK293E 세포(캐나다의 CNRC로부터 입수가능)를 형질감염시켰다. 형질감염은 플라스크당 250ug의 DNA 및 333ul의 293 펙틴(Invotrogen사)를 이용하여 1.75x106 세포/ml의 농도로 플라스크당 250 ml의 HEK293E 세포에 형질감염시키고, 30 ℃에서 5일간 발현시켰다. 그 상청액을 원심분리로 수확하고, 단백질 L상에서 친화성 정제했다. 단백질을 수지에 회분식으로 결합시키고, 컬럼상에 충진하고, 10 컬럼 부피의 PBS로 세척했다. 단백질을 50ml의 0.1M 글리신(pH 2)로 용리시키고 Tris pH8로 중화시켰다. 예상된 크기의 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에서 확인하고, 크기는 하기 표 1에서 나타낸다.
DATO114, DAT0115, DATO116, DAT0117, DAT0118, DAT0119, DAT0120의 분자량
융합 단백질 예상된 분자량
DATO114 18256
DATO115 16896
DATO116 15950
DATO117 19798
DATO118 15936
DATO119 15318
DATOl20 18895
실시예 2: GLP-1 및 엑센딘-4 AlbudAb 융합체가 혈청 알부민에 결합하는 것의 확인
GLP-1 및 엑센딘-4 AlbudAb 융합체를 표면 플라즈몬 공명(GE Healthcare사로부터 입수가능한 Biacore AB)으로 분석하여 친화성에 대한 정보를 얻었다. 그 분석은 혈청 알부민으로 코팅된 CM5 Biacore 칩(카르복시메틸화 덱스트란 매트릭스)을 이용하여 수행했다. 시험될 각 혈청 알부민(인간, 래트 및 마우스 혈청 알부민)의 약 1000개 공명 유닛(RU)을 아세테이트 완충액 pH 5.5에 고정하였다. Biocore AB의 유동 셀 1은 코팅하지 않은 상태로 차단 음성 대조군으로 사용했고, 유동 셀 2는 인간 혈청 알부민(HSA) (815 RU)으로 코팅했고, 유동 셀 3은 래트 혈청 알부민 (RSA)(826RU)로 코팅했고, 유동 셀 4는 마우스 혈청 알부민(MSA) (938 RU)으로 코팅했다. 테스트한 각각의 융합 분자는 상기 실시예에서 기재한 바와 같이 포유동물 조직 배양을 통해 발현시켰다.
BIACORE HBS-EP 완충액(0.01M HEPES, pH7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)에 희석하여 다양한 농도의 융합 분자를 제조하고(16nM 내지 2μM의 범위) BIACORE 칩을 가로질러 유동시켰다.
KD의 영역에서 dAb의 농도에 의해 발생된 기록(trace)에 온-레이트 및 오프-레이트 곡선을 합치시켜서 BIACORE 기록으로부터 친화성(KD)을 계산했다. 친화성(KD)은 하기 표 2에 요약되어 있다.
인간, 래트 및 마우스 혈청 알부민에 대한 GLP-1 및 엑센딘-4 AlbudAb의 결합
GLP-1 (7-37) A8G, 나선형 링커, DOM7h-14 융합체 2xGLP-1 (7-37) A8G DOM7h-14 융합체
HSA 110nM 150nM
RSA 800nM 700nM
MSA 110nM 130nM
상기의 결과는 융합 분자가 모든 형태의 혈청 알부민에 결합하는 능력을 유지하며 생체내에서 연장된 반감기를 가질 것임을 설명한다.
실시예 3: GLP-1 및 엑센딘-4 AlbudAb 융합체는 GLP-1 수용체 결합 검정(GLP-1R BA)시 활성이 있다
융합체를 10OmM NaVl, 2OmM 시트레이트 pH 6.2로 완충액 교환했다. 한편, CHO 6CRE GLP1R 세포(루시퍼라제 리포터 유전자를 구동하는 6 cAMP 반응 엘리먼트 및 또한 인간 GLP-1 수용체로 안정하게 형질감염된 CHO K1 세포(미국미생물보존센터(ATCC)로부터 입수가능))를 현탁 배지에 2 x 105 cells/mL의 농도로 시딩했다. 현탁 배지를 24 시간 동안 유지했다. 다음에, 세포를 2mM L 글루타민을 함유하는 15mM HEPES 완충액(Sigma로부터 입수가능)에 희석하고(2.5 x 105 cells/ml), 검정될 화합물을 lOul/well로 함유하는 384-웰 플레이트에 분배했다. 검정 대조군의 첨가 후, 플레이트를 37 ℃ 및 5% CO2에서 3 시간 동안 배양기로 돌려보냈다. 배양 후, 안정한 glo 루시퍼라제 기질(Promega로부터 입수가능)를 기재된 바와 같이 키트에서 웰에 첨가하고, 플레이트를 자기 접착성 플레이트 밀봉제(Weber Marking Systems Inc. Cat. No. 607780)로 밀봉했다. 플레이트를 리더(Viewlux, Perkin Elmer)에 위치시키고 5분간 예비배양한 다음 형광을 판독하고 결과를 플롯팅했다. 화합물을 lOuM 알부민의 존재 및 부재하에 다양한 농도로 검정하여, 투여량 반응 곡선이 알부민의 존재 및 부재하에 합치되도록 하였다. EC50을 계산하고 그 결과를 하기 표 3에 요약하여 나타낸다.
GLP-1 수용체 결합 검정(GLP-1R BA)에서 GLP-1 및 엑센딘-4 AlbudAb 융합체의 활성
GLP-1R BA
EC50(pM) n=3		 GLP-1R BA
(10 μM 알부민)
EC50(pM) n=2
엑센딘 4 (G4S)3 DOM7h-14 융합체 8.9 35
엑센딘 4 DOM7h-14 융합체 12 72
엑센딘 4, 나선형 링커, DOM7h-14 융합체 4.3 15
GLP-1 A8G, 나선형 링커, DOM7h-14 융합체 17 130
GLP-1 7-36 21 19
엑센딘-4 1.0 0.82
상기의 결과는 시험한 모든 융합 분자가 GLP-1 수용체에 결합하는 능력을 유지한다는 것을 입증한다. 또한, 상기 결과는 이러한 능력이 혈청 알부민의 존재하에서 유지된다는 것을 입증한다. 따라서, 이러한 융합 분자는 생체내에서 GLP-1 수용체에 결합하는 능력을 유지할 수 있을 것이다.
실시예 4: HEK 293 포유동물 조직 배양액에서 DATO115, DATO116, DATO117 및 DAT0120의 발현에 이어 단백질 L 친화성 포획 및 이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제
본 실험의 목적은 생체내 및 시험관내 특성 규명을 위해 단백질을 제조하는 것이었다. 단백질을 전술한 바와 같이 pTT-5 벡터로부터 HEK 293E 세포에서 포유동물 조직 배양을 통해 발현시켰다. 간략히 말해서, 내독소가 없는 DNA를 제조하고 정제하고 이를 이용하여 HEK293E 세포를 형질감염시켰다. 단백질 발현은 진탕 배양기에서 30 ℃로 5 일간 수행했고, 그 배양액을 침강(spun down)시키고 상청액(관심 단백질 함유)을 수확했다. 단백질 L 아가로스 스트림라인 친화성 수지(resin GE Healthcare, 인 하우스(in house) 커플링된 단백질 L) 상에서 친화성 포획을 통해 상청액으로부터 단백질을 정제했다. 다음에, 수지를 10 컬럼 부피의 PBS로 세척한 다음, 5 컬럼 부피의 0.1 M 글리신 pH2.0을 이용하여 단백질을 용리시켰다.
1 컬럼 부피의 1M Tris 글리신 pH8.0을 이용하여 중화를 수행했다. 이 경우(이전의 실시예와 비교하여), 추가의 정제를 수행했다. 단백질(트리스-글리신내)을 2OmM 아세테이트 pH 5.0으로 완충액 교환한 다음, 2OmM 아세테이트 pH 5.0으로 사전 평형화된 1개 (또는 2개의 평행한) 6ml 리소오스(resource) S 컬럼(GE healthcare)상에 Akta를 이용하여 로딩했다. 동일 완충액으로 세척한 후, 단백질을 2OmM 아세테이트 pH5.0에서 0-0.75M 또는 0-1M NaCl 구배를 통해 용리시켰다. 다음에, 올바른 크기의 분획들을 SDS-PAGE 전기영동 및 질량 분광법으로 확인한 다음, 합쳐서 최종 단백질 샘플을 만들었다. 다음에, 단백질을 2OmM 시트레이트, pH6.2, 10OmM NaCl로 완충액 교환하고 0.5 내지 5mg/ml로 농축했다. 단백질을 0.2uM 필터를 통해 여과하여 멸균성을 확보했다. 다음에, 단백질을 아래의 실시예에서 사용했다.
실시예 5: 1회, 3회 및 6회의 동결 해동 주기에 대한 DATO115, DATO116, DATO117 및 DATO120의 안정성의 비교
본 연구의 목적은 1회, 3회 및 6회의 동결 해동 주기에 대한 DATO115, DATO116, DATO117 및 DATO120의 안정성을 비교하는 것이었다. 각각의 단백질을 pTT-5 벡터로부터 HEK 293E 세포에서 포유동물 조직 배양을 통해 발현시키고, 단백질 L 친화성 수지상에서 정제한 다음, 전술한 바와 같이 이온 교환 크로마토그래피로 정제했다. 단백질을 2OmM 시트레이트, 10OmM NaCl로 완충액 교환하고, 동일 완충액을 이용하여 0.5mg/ml로 희석했다. 다음에, 각 단백질(에펜도르프 튜브에 함유됨)의 0.5 ml의 분취량을 0, 1, 3 또는 6회 동결 해동 주기로 처리하였는데, 각 주기는 건조 얼음 상에서 3분 유지한 다음 37 ℃ 워터 배스에서 2분간 유지하는 것을 포함했다. (실험 동안에 단백질 용액을 완전히 해동하는데 37 ℃에서 2분이면 충분한 것으로 관찰되었다). 필요한 수의 동결-해동 주기의 종료 후, 단백질 샘플을 차후의 분석시까지 2 내지 8 ℃에서 보관했다. 다음에, 단백질을 SDS PAGE 전기영동, GLP-1R 결합 검정, Superdex 75 컬럼 상에서의 크기 배제 크로마토그래피 및 질량 분광법을 통해 분석했다. 4종의 단백질 모두의 SDS-PAGE 프로필, GLP-1R BA에 의한 능력 및 질량 분광 프로필은 1회, 3회 또는 6회의 동결-해동 주기에 의해 기준선으로부터 유의적으로 변화되지 않는 것으로 관찰되었다. SEC 분석에서의 최대 피크 높이는 DATO115, DAT0116, DATO117 및 DATO120에 대해 6회 동결 해동 주기 후 유지된 최대 높이의 각각 78%, 86%, 104% 및 57% 였다. 결론적으로, DATO120은 다른 3종의 단백질보다 동결 해동 주기에 대하여 덜 안정한 것으로 확인되었다.
1회, 3회 및 6회의 동결 해동 주기에 대한 DATO115, DATO116, DATO117 및 DATO120의 안정성의 비교의 결과
샘플 동결 해동 주기의 수 피크 높이(mAU) 최대 피크 높이의 %
DAT0115 0 49 100%
DAT0115 1 43 89%
DAT0115 3 40 82%
DAT0115 6 38 78%
DAT0116 0 29 100%
DAT0116 1 28 95%
DAT0116 3 26 91%
DAT0116 6 25 86%
DAT0117 0 34 100%
DAT0117 1 34 99%
DAT0117 3 35 103%
DAT0117 6 35 104%
DAT0120 0 0 35 100%
DAT0120 1 1 24 70%
DAT0120 3 3 21 59%
DAT0120 6 6 20 57%
실시예 6: 제2형 당뇨병의 db/db 마우스 모델에서 DATO115 작용 지속기간의 확인
본 연구의 목적은 db/db 마우스에서 경구 글루코스 내성에 대한 DATO115 작용 지속기간을 확인하기 위한 것이다. 실험을 개시하기 3일전에 글루코스 수준을 감소시킴으로써 동물을 분류한 다음 차단시켰다. 다음에, 각 블록내의 1마리 동물을 26개 연구 그룹의 각각에 할당했다. 이로써, 각 연구 그룹에서의 유사한 평균 출발 글루코스 수준을 확보했다.
DATO115 (HEK293 세포에서 생산되고 전술한 바와 같이 정제됨)를 경구 글루코스를 로딩하기 5 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간 또는 12O 시간전에 1mg/Kg, 0.3mg/Kg 또는 0.1mg/Kg의 양으로 피하 투여했다. (모든 투여량이 매 시점에서 투여된 것은 아니었음, 상세한 사항에 대하여는 하기 표 참조). DATO115는 0.1mg/Kg 및 0.3mg/Kg 투여량의 경우 24 시간까지의 시점 및 1mg/Kg 투여량의 경우 72 시간까지의 시점에서 비히클 처리된 db/db 마우스와 비교하여 경구 글루코스 내성 시험(OGTT)의 2 시간 기간에 걸쳐서 글루코스 AUC를 유의적으로 감소시켰다. 또한, 양성 대조군으로서 42μg/Kg의 양으로 투여된 엑센딘-4는 경구 글루코스 볼루스를 투여하기 5시간 전에 투여되었을 때, OGTT에 따라서 글루코스 AUC를 유의적으로 감소시켰다. 하기 표 5는 비히클과 비교하여 DATO115 연구 그룹 각각에 대한 AUC 감소%를 나타낸다. 별표는 오류발견율 보정을 이용한 비히클에 대한 DATO115의 비교시 P<0.05를 나타낸다.
비히클과 비교하여 DATO115 연구 그룹 각각에 대한 AUC 감소%(별표는 오류발견율 보정을 이용한 비히클에 대한 DATO115의 비교시 P<0.05를 나타냄)
OGTT 시간 (투여를 기준으로 한 시간(hr)) 0.1 mg/kg DAT0115 0.3 mg/kg DAT0115 1 mg/kg DAT0115
+5 60%* 확인안됨 76%*
+24 36%* 59%* 50%*
+48 28% 26% 37%*
+72 16% 26% 41%*
+96 -12% 확인안됨 12%
실시예 7: 비만의 식이 유도 비만(DIO) 마우스 모델에서 DATO115의 효능
본 연구의 목적은 수립된 마우스 급식 모델(식이 유도 비만 마우스)를 이용하여 음식 소비 및 이에 따른 체중이 DATO115 처리에 영향을 받는 지의 여부를 확인하기 위한 것이다. 이는 인간에 대한 예측을 가능하게 한다. 수컷 C57B1/6 마우스(Taconic로부터 구입)를 60% kcal 고지방 조사(irradiated) 식이를 이용하여 12주간 살찌운 다음, 인 하우스 시설로 옮겼다. 도착 시, 마우스를 온도 및 습도가 조절된 룸(70-72 ℉, 습도 = 48-50%, 5 AM/5 PM 명 주기)에서 알파 드라이 베딩(bedding)상에 개별적으로 수용했다. 식이를 45% 고지방 식이로 변화시키고, 그 동물들을 18일간 순화시켰다. 시험 화합물의 투여 전, 마우스에게 염수를 하루에 한번 3일간 피하주사하고 음식 소비를 모니터링했다. 마우스를 차단하고 그룹들로 나누어서 체중 및 음식 소비가 그룹들 간에 또는 그룹들 내에서 차이가 없도록 하였다. 연구 당일에, 8마리 마우스의 그룹들에게 5 ml/kg 주사 부피를 이용하여 하기와 같이 피하 투여했다: 3개의 그룹에는 DATO115 (저, 중 및 고투여량)를 투여하고, 하나의 그룹에는 음성 대조 분자(DOM7h-14 AlbudAb, 엑센딘-4 컨쥬게이트 없음)를 투여하고, 하나의 그룹에는 엑센딘-4 양성 대조군을 투여했음.
비만의 식이 유도 비만(DIO) 마우스 모델에서 DAT0115의 효능을 설정하기 위한 프로토콜
그룹 투여된 화합물 투여량
1 음성 대조군: DOM7h-14; 100 mM NaCl, 20 mM 시트레이트/소듐 시트레이트 pH 6.2에 용해됨 1 mg/Kg
2 엑센딘-4 0.01 mg/Kg
3 DAT0115; 100 mM NaCl, 20 mM 시트레이트/소듐 시트레이트 pH 6.2에 용해됨 0.01 mg/Kg
4 DAT0115; 100 mM NaCl, 20 mM 시트레이트/소듐 시트레이트 pH 6.2에 용해됨 0.1 mg/Kg
5 DAT0115; 100 mM NaCl, 20 mM 시트레이트/소듐 시트레이트 pH 6.2에 용해됨 1 mg/Kg
일당 음식 소비 및 체중을 10일간 매일 측정했다. DATO115는 DOM7h-14 대조군과 비교하여 체중 및 음식 소비의 용량 의존적인 감소를 나타냈다(도 3a 및 도 3b 참조). 따라서, 이러한 마우스 연구의 데이터는 DATO115가 양호한 임상 후보라는 가설을 지지하는 것으로 확인되었다.
실시예 8: 제2 형 당뇨병의 마우스 모델에서 DATO115, DATO116 및 DATO117 의 혈장 반감기의 측정
본 연구의 목적은 제2 형 당뇨병의 마우스 모델(db/db 마우스)에서 DATO115, DATO116 및 DATO117에 대한 혈장 제거 프로필을 측정하고 그 결과로부터 PK 파라미터를 계산하기 위한 것이다. DATO115, DATO116 및 DATO117 단백질을 전술한 바와 같이 준비했다. 간략히 말해서, 단백질을 HEK293E 세포를 이용한 포유동물 조직 배양을 통해 발현시키고, 단백질 L-아가로스 친화성 수지에 회분식으로 흡수시킨 다음 pH 2.0의 글리신으로 용리시키고 Tris PH 8.0 로 중화하여 정제했다. 다음에, 2OmM 아세테이트 pH5.0에서 0-1 M 염 구배를 이용하여 Resource S 컬럼상에서 이온 교환 크로마토그래피에 처리했다. 다음에, 원하는 단백질을 함유하는 분획을 합치고 10OmM NaCl, 2OmM 시트레이트 pH6.2로 완충액 교환했다. 단백질을 여과하여 멸균하고, 완충액을 교환하고, 내독소를 제거하고 생체내에서 사용에 앞서 테스트했다.
금식하지 않은 수컷 db/db 마우스의 그룹(렙틴 수용체 유전자(lepr)에서 돌연변이를 갖는 렙틴 수용체가 결핍된 LEPr db 동형접합 마우스)에게 1mg/Kg DATO115, DATO116 또는 DATO117을 피하 또는 정맥내 투여했다. 투여전, 정맥내 투여 및 예비투여한 지 0.25, 0.5, 1, 4, 7, 12, 24, 36, 48 및 60 시간 후, 및 피하 투여한 지 0.5, 1, 4, 7, 12, 24, 36, 48 및 60 시간 후에, 말단 출혈로 혈액 샘플을 수집하고 혈장을 제조했다. 혈장 샘플을 동결시킨 다음, 적합한 경우 고체상 추출 및 LC/MS/MS에 의한 DATO115, DATO116 또는 DATO117 수준의 분석을 위해 해동시켜서 상기 단백질의 단편(단백질의 엑센딘-4 섹션으로부터)의 존재 여부를 검출했다. 다음에, 계산된 혈장 수준을 WinNonLin 소프트웨어를 이용하여 약물동력학적 파라미터에 합치시켰다. 피하 및 정맥내 투여 후의 반감기 및 생체이용률을 하기 표 7에 나타내었다. 결과(하기 표 7 참조)로부터, 3종의 화합물은 모두 제2 형 당뇨병의 마우스 모델에서 바람직한 약물동력학적 파라미터를 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, 이러한 분자는 당뇨 인간에서 양호한 PK 파라미터에 대한 가능성을 나타낼 수 있는데, 본 연구에서는 DATO117 보다는 DATO115 또는 DATO116이 바람직한 것으로 선택된다.
제2형 당뇨병의 마우스 모델에서 DATO115, DATO116 및 DATO117의 혈장 반감기
화합물 정맥내 투여후 반감기 피하투여후 반감기 생체이용률
DATO0015 13.8 18.6 65%
DATO0016 14.3 20.1 63%
DATO0017 11.4 11.2 25%
실시예 9: 래트에서 DAT0115, DAT0116 및 DAT0117의 혈장 반감기의 측정
본 연구의 목적은 래트에서 DATO115, DATO116 및 DATO117에 대한 혈장 제거 프로필을 측정하고 그 결과로부터 PK 파라미터를 계산하기 위한 것이다. DATO115, DATO116 및 DATO117 단백질을 전술한 바와 같이 준비했다. 간략히 말해서, 단백질을 HEK293E 세포를 이용한 포유동물 조직 배양을 통해 발현시키고, 단백질 L-아가로스 친화성 수지에 회분식으로 흡수시킨 다음 pH 2.0에서 글리신으로 용리시키고 Tris PH 8.0 으로 중화하여 정제했다. 다음에, 2OmM 아세테이트 pH5.0에서 0-1 M 염 구배를 이용하여 Resource S 컬럼상에서 이온 교환 크로마토그래피로 처리했다. 다음에, 원하는 단백질을 함유하는 분획을 합치고 10OmM NaCl, 2OmM 시트레이트 pH6.2로 완충액 교환했다. 단백질을 여과하여 멸균하고, 완충액을 교환하고, 생체내에서 사용에 앞서 테스트했다.
혈장 반감기를 측정하기 위하여, 3마리의 래트로 이루어진 그룹들에게 0.3mg/Kg (iv) 또는 1.0 mg/Kg (sc)의 DATO115, DATO116 또는 DATO117을 단일 정맥내(i.v) 또는 피하(s.c) 주사로 제공했다. 72 시간의 기간에 걸쳐 꼬리 정맥으로부터 연속 채혈에 의해 혈장 샘플을 얻고, LC/MS/MS로 분석하여 융합체의 단편(융합체의 4-엑센딘 섹션으로부터)의 존재 여부를 검출했다. 계산된 혈장 수준을 WinNonLin 소프트웨어를 이용하여 약물동력학적 파라미터에 합치시켰다. 피하 및 정맥내 투여 후의 반감기 및 생체이용률을 하기 표 8에 나타낸다. 결과로부터, 상기 3종의 화합물은 모두 래트에서 바람직한 약물동력학적 파라미터를 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, 이러한 분자는 모두 인간에서 양호한 PK 파라미터에 대한 가능성을 나타낼 수 있는데, 본 연구에서는 DATO116 또는 DATO117보다는 DATO115이 바람직한 것으로 선택된다.
피하 및 정맥내 투여후 반감기 및 생체이용률
화합물 정맥내 투여후 반감기 피하 투여후 반감기 생체이용률
DAT0115 4.9 시간 11.1 시간 81%
DAT0116 4.1 시간 8.7 시간 32%
DAT0117 4.9 시간 10.2 시간 15%
실시예 10: 시노몰구스 원숭이에서 DATO115의 혈장 반감기의 측정
본 연구의 목적은 비인간 영장류(시노몰구스 원숭이)에서 DATO115에 대한 약물동력학적 파라미터를 측정하여 파라미터들의 상대적(allometric) 스케일링을 가능하게 하고 DATO115가 인간에서 양호한 PK 프로필을 가질 수 있을지 여부의 가장 있음직한 지표를 제공하는 것이다. DATO115 엑센딘-4 AlbudAb 융합체를 포유동물 조직 배양물에서 HEK293E 세포에서 발현시키고 전술한 바와 같이 정제했다. 간략히 말해서, 단백질을 단백질 L-아가로스 친화성 수지로 회분식 흡수시킨 다음, pH 2.0에서 글리신을 이용하여 용리시키고, Tris pH 8.0을 이용하여 중화시킴에 의해 정제했다. 다음에, 2OmM 아세테이트 pH5.0에서 0-1 M 염 구배를 이용하여 Resource S 컬럼 상에서 이온 교환 크로마토그래피를 수행했다. 원하는 단백질을 함유하는 분획을 합치고 10OmM NaCl, 2OmM 시트레이트 pH6.2으로 완충액 교환했다.
단백질을 광범위하게 분석(SDS-PAGE, 질량 분광분석, 활성 분석:GLP-1R-BA, pH 검사, 삼투압 검사)하고, 여과를 통해 멸균하고, 내독소를 제거했다. 낮은 내독소(<0.05 EU/mg 단백질)를 갖는 것으로 확인된 단백질을 생체내 연구에 사용했다.
6마리의 암컷 시노몰구스 원숭이(Macaca fascicularis; Charles River Laboratories BRF, Houston, TX, Primate Products, Miami, FL and/or Covance Research Products, Inc., Alice, TX)를 본 연구에서 사용했다. 상기 원숭이는 초기 투여시 약 2 내지 9살 이었고 체중이 약 2 내지 5 kg의 범위였다. 상기 원숭이를 12시간 명암주기로 환경이 조절된 룸(들)(64 내지 84 ℉; 30 내지 70% 상대 습도)에서 스테인리스강 케이지에 개별적으로 수용시켰다. 상기 암컷 원숭이에게 Monkey Diet #5038 (PMI Nutrition International, Richmond, IN)의 약 6개의 비스켓을 하루에 2회 제공하고 신선한 과일을 매일 제공했다. 각각의 동물에게 투여 그룹(3개의 피하투여 및 3개의 정맥내 투여)에 따라 시험 화합물(DAT0115)을 피하 또는 정맥내 투여했다. 투여량은 0.1mg/Kg이었다. 투여 당일, 각 원숭이 마다 투여 후 1 시간 이내에 첫번째 급식했다(연구와 관련된 과정에서 동물이 연장된 기간의 시간 동안 국소적 수용에서 벗어날 필요가 있는 경우 투여 후 2.5 시간 이내로 연장됨). 두 번째 급식은 첫 번째 급식 후 2시간 이후에 이루어졌다. 환경 풍부화의 목적을 위하여, 추가의 과일, 콩과식물 및/또는 야채(예를 들어, 포도, 미니당근, 땅콩)을 생존력의 검사시 또는 순화 또는 연구 관련 과정 후 포상의 방법으로 각 원숭이에게 제공했다. 여과된 수돗물(Aqua Pennsylvania, Inc.에 의해 공급, 주기적으로 분석됨)에 자유로이 접근하도록 하였다.
투여전(0시간), 투여 후 명목상 5분(정맥내 투여의 경우만), 0.5시간, 4, 8, 24, 48, 96, 144, 192, 288, 336, 504 및 672 시간에 혈장 샘플 (약 2 ml)을 대퇴부 혈관으로부터 채취했다. (정맥내 투여 그룹의 경우 동물들 중 한 마리로부터의 PK 샘플은 24시간 까지만 채취되었으므로, 이러한 동물은 PK 합치(fitting)로부터 제외되었음). 샘플의 분석은 질량 분광법으로 수행했고, 데이터의 합치는 WinNonLin 합치 소프트웨어를 이용하여 수행했다. PK 파라미터는 다음과 같았다. 정맥내 투여의 경우 (n=2): T1 /267h, MRT 46h, Vz 327ml/Kg 및 Cl 3.3 ml/hr/Kg; 및 피하 투여의 경우 (n=3): T1 /268h, MRT 98h, Vz 306ml/Kg 및 Cl 3.1 ml/hr/Kg. 생체이용률은 99%로 계산되었다.
본 연구 (및 시노몰구스원숭이 및 인간 혈청 알부민에 대한 Biacore 결합 데이터)의 결과, (전술한 바와 같이) 시노몰구스 원숭이에서 DATO115의 68 시간 sc 반감기는 인간에서 동일 분자의 반감기가 매주 (또는 덜 빈번한) 투여에 대한 필요성과 관련시키기에 충분히 길다는 신뢰성을 제공한다.
실시예 11: 시노몰구스 원숭이에서 DATO115의 PD의 측정
PK 연구를 전술한 바와 같이 시노몰구스 원숭이에서 수행했다. 본 연구의 주요한 목적은 시노몰구스 원숭이(이전의 실시예에서 기재된 바와 같은)에서 DATO115에 대한 약물동력학적 파라미터를 측정하는 것이지만, 2차적인 목적은 그 원숭이에서 DATO115 화합물의 효능의 지표를 얻는 것이다 (통계적 유의성 연구에서 충분한 효력은 없다). 이러한 2차적인 목적을 달성하기 위하여, 연구 과정 동안 원숭이에 의한 비스켓 소비를 모니터링했다. 투여 이후의 날들에서, 모든 원숭이에서 음식 소비의 감소 추세가 확인되었다. 이는 아마도 식욕 억제제로서 상기 분자의 엑센딘-4 부분의 잘 입증된 효과 때문인 것으로 판단된다. 따라서, DATO115는 생체내에서 활성이 있는 것으로 나타났다. 동물의 복리를 확보하기 위하여 비스켓 소비에도 불구하고 대부분의 날에 과일 및 기타 음식물을 소비하도록 하였다.
시노몰구스 원숭이에 의해 매일 소비된 비스켓의 측정(1일째에 DATO115 투여)
투여량 -2일 -1일 1일 2일 3일 4일 5일 6일 7일
0.1 mg/Kg (정맥내) 12 12 6 3 9 12 12 12 12
0.1 mg/Kg (정맥내) 12 12 0 1 0 4 6 10 11
0.1 mg/Kg (정맥내) 12 12 0 0 0 0 1 6 6
0.1 mg/Kg (피하) 12 12 5 0 4 11 7 11 12
0.1 mg/Kg (피하) 12 12 12 0 2 12 12 12 12
0.1 mg/Kg (피하) 12 12 11 12 11 12 8 12 12
실시예 12: 표면 플라즈몬 공명 분석시 DATO115 엑센딘-4 AlbudAb 융합체는 래트, 시노몰구스 원숭이 및 인간 혈청 알부민에 결합한다:
DATO115를 발현 및 정제한 다음, 표면 플라즈몬 공명(Biacore, GE Healthcare)으로 분석하여 친화성에 대한 정보를 얻었다. 그 분석은 비오티닐화 혈청 알부민이 코팅된 스트렙타비딘 칩(SA)을 이용하여 수행했다. 각 혈청 알부민의 200 내지 1000 개 공명 유닛을 상기 칩에 고정화했다. 유동 셀 1은 코팅하지 않았고, 유동셀 2는 HSA로 코팅했고, 유동 셀 3은 RSA로 코팅했고, 유동 셀 4는 CSA로 코팅했다. BIACORE HBS-EP 완충액(0.01M HEPES, pH7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)에 희석하여 여러 가지 농도의 융합체를 제조하고(15.6 nM 내지 2μM 농도 범위) BIACORE 칩을 가로질러 유동시켰다. 친화성(KD)의 영역에서 dAb의 농도에 의해 발생된 기록에 온속도 및 오프속도를 합치시켜서 BIACORE 기록으로부터 친화성(KD)를 계산했다. 친화성(KD)은 하기의 표 10에 요약되어 있다.
DATO115의 친화성(KD)
혈청 알부민 형태 DAT0115
HSA 600 nM
RSA 2 μM
CSA 2 μM
실시예 13: 시차주사 열량측정(DSC)에 의한 DATO115 열변성의 특성규명
본 연구의 목적은 오토샘플러를 구비한 모세관 세포 열량계VP-DSC (Microcal)를 이용하여 DSC (Differential Scanning Calorimetry)에 의해 DATO115의 열변성을 모니터링했다. 단백질을 2OmM 시트레이트 pH6.2, 10OmM NaCl에 밤새 투석하고 여과한 다음, 280nm의 흡광도에서 측정한 바와 같이 1 mg/ml의 농도로 만들었다. 여과된 투석 완충액을 모든 샘플에 대한 참조로서 이용했다. DSC를 180 ℃/hour의 가열 속도로 수행했다. 각 샘플에 완충액을 주입하여 세포를 세척하고 기기 기선을 제공했다. 얻어진 기록(trace)을 Origin 7 Microcal 소프트웨어를 이용하여 분석했다. 참조 완충액으로부터 얻은 DSC 기록을 샘플 기록에서 감했다. 샘플의 정확한 몰 농도를 계산(Origin에 의해 자동적으로 수행됨)에 사용했다. 상부 및 하부 기선에 대한 기선 세팅을 위하여, 전이 전/후의 선형 영역을 큐빅 연결 함수(cubic connect function)를 이용하여 선택 및 연결했다. 얻어지는 그래프를 비 2상 모델에 합치시켜, 겉보기 온도Tm 및 △H△Hv 값을 발생했다. DATO115로부터의 기록을 56.3℃의 appTm으로서, 비-2상 전이 모델에 합치시켰다. 합치의 양호함은 만족스러웠다(도 4 참조). 동일 장치를 이용하여 진행한 대조 기록인 리소자임은 완전한 합치에 의해 예상된 바와 같이 양호한 품질의 데이터를 생성했다. (리소자임에 대하여 얻어진 AppTm은 76.2 ℃으로서, 문헌에 보고된 것과 일치한다(도 5 참조)). 따라서, 본 실험은 신뢰가능한 데이터를 제공하였으므로, DATO115은 56.3℃의 융점을 갖는 분자로서 임상 후보인 것으로 판단된다.
실시예 14: SEC MALLS에 의한 용액 상태에서 DATO115, DATO117 및 DAT0120의 특성 규명
본 연구의 목적은 용액상태에서 SEC MALLS에 의해 DATO115, DATO117 및 DAT0120을 측정하는 것이다. 샘플을 정제하고 적절한 완충액(PBS)에 투석한 다음 여과하고, 농도를 측정하고 1mg/ml으로 조절했다. BSA 및 HSA는 Sigma 로부터 구입하여 추가 정제 없이 사용했다.
기기의 사항:
오토샘플러 (SIL-20A) 및 SPD-20A Prominence UV/Vis 검출기를 갖는 Shimadzu LC-20AD Prominence HPLC 시스템을 Wyatt Mini Dawn Treos (MALLS, multi-angle laser light scattering detector) 및 Wyatt Optilab rEX DRI(differential refractive index) 검출기에 연결했다. 상기 검출기들은 LS-UV-RI의 순서로 연결했다. RI 및 LS 기기는 모두 488nm의 파장에서 작동했다. TSK2000 (Tosoh corporation) 또는 BioSep2000 (Phenomenex) 컬럼을 50 또는 200 mM 인산염 완충액 (염이 있거나 없음), pH7.4 또는 1xPBS의 이동상과 함께 사용했다(두 컬럼은 모두 1-30OkDa의 유사한 분리 범위를 갖는 실리카계 HPLC 캄럼임). 사용된 유속은 0.5 또는 l ml/min이고, 진행 시간을 조절하여 상이한 유속(45 또는 23 분)을 반영하는데, 이는 분자의 분리에 유의적인 영향을 미치는 것으로 예상되지 않는다. 단백질을 PBS에서 l mg/ml의 농도로 만들고 주입 부피는 lOO μl였다. 광산란 검출기를 제조사의 지시에 따라 톨루엔으로 보정했다. UV 검출기 풀력 및 RI 검출기 출력을 광산란 기기에 연결하여 모든 3개 검출기로부터의 시그널이 Wyatt ASTRA 소프트웨어에 의해 동시에 수집될 수 있도록 하였다. PBS (0.5 또는 l ml/min)에 용해된 BSA의 몇몇의 주입액을 Tosoh TSK2000 컬럼상에 진행시키면서, UV, LS 및 RI 시그널을 Wyatt 소프트웨어를 이용하여 수집했다. 다음에, 그 기록들을 ASTRA 소프트웨어를 이용하여 분석하고, 그 시그널을 제조사의 지시에 따라 표준화하고, 할당하고 띠 확장에 대하여 보정한다. 다음에, 검정 상수를 평균하고 주형에 입력하여 차후의 샘플 진행에 사용한다.
절대 몰 질량 계산:
lOO μl의 1mg/ml 샘플을 사전평형화한 컬럼에 주입했다. SEC 컬럼 후, 샘플을 3개의 온라인 검출기인 UV, MALLS (multi-angle laser light scattering) 및 DRI (differential refractive index)에 통과시켜서, 절대 몰질량 측정이 가능하도록 한다. 그 컬럼 상에서 일어나는 희석은 약 10배 이므로, 용액내 상태가 측정되는 농도는 100 μg/ml 또는 약 8 μM dAb 이다.
ASTRA에서의 계산 및, 회분 샘플 모드에서 자주 실시되는 Zimm 플롯 기법의 근거는 다음문헌[Zimm, J. Chem. Phys. 16, 1093-1099 (1948)]에 기재된 식이다:
[식 1]
Figure pct00001
상기 식에서,
- c는 용매에서 용질 분자의 질량 농도이고(g/mL)
- M은 중량 평균 몰 질량(g/mol)이고,
- A2는 제2 비리얼 계수(mol mL/g2)이고,
-
Figure pct00002
는 광학 성수로서, n0는 입사 방사선(진공) 파장에서 용매의 굴절율이고, lo는 나노미터로 표시되는 입사 방사선 (진공) 파장이고, NA는 6.022 x 1023 mol-1에 해당하는 아보가드로수이고, dn/dc는 mL/g로 표시되는 용매 농도의 변화에 대한 용매-용질 용액의 미분 굴절률 증분이고(이러한 인자는 dRI 검출기를 이용하여 독립적으로 측정하여야 함)
- P(q)는
Figure pct00003
(여기서,
Figure pct00004
,
Figure pct00005
는 평균 입방 반경임)으로서, P(q)는 분자의 z-평균 크기, 형태 및 구조의 함수이고,
-Rq는 과도 레일레이 비율(excess Rayleigh ratio) (cm-1)이다,
이 식은 수직 편광 입사광을 가정하고 차수 c2에 대하여 유효하다.
Figure pct00006
에 대한 합치인 Zimm 합치(fit) 방법을 이용하여 계산을 수행하기 위하여, 식 1의 역수를 c의 1차 차수로 확장할 필요가 있다:
[식 2]
Figure pct00007
이 경우에 적절한 결과는 다음 식 3, 식 4 및 식 5와 같다:
[식 3]
Figure pct00008
[식 4]
Figure pct00009
[식 5]
Figure pct00010
상기 계산은 ASTRA 소프트웨어를 이용하여 자동적으로 수행하여, 각각의 슬라이스에 대하여 측정한 몰질량을 갖는 플롯을 얻었다[Astra 매뉴얼]
크래마토그램 상에서 관찰된 각각의 피크의 플롯으로부터 얻은 몰질량을 단백질의 단일 유닛의 예상된 몰질량과 비교한다. 이는 단백질의 용액내 상태에 대한 결론을 유도하는 것을 가능하게 한다.
실험 데이터:
DAT0115
lOO μl의 l mg/ml DATO115를 2OmM 시트레이트, 0.1M NaCl, pH6.2로 평형시Superdex 200 상에 주입했다. 유속은 0.5ml/min로 설정했다. 그 단백질은 단일 피크로 용리했는데, 분자량은 그 피크의 전폭을 가로질러 17.4 kDa (모노머에 대한 예상 분자량은 16.9 kDa임)으로 측정되었다. 용리 효율은 100%이다. 도 6 참조. (HSA 대조군은 예상된 바와 같이 거동하여, DATO115에 대한 실험 결과가 확인되었다. 이는 분자량이 64 kDa (모노머) 및 110 kDa (이합체)인 두 개의 피크로 용리한다. HSA 이합체의 분자량은 그 피크내의 단백질의 양이 아주 작기 때문에 그다지 정확하지 않을 수 있다).
DAT0117
100 μl의 1mg/ml DATO117을 5OmM 인산염 완충액 pH7.4로 평형시킨 TSK2000 컬럼 상에 주입했다. 유속은 lml/min으로 설정했다. DATO117의 주입량의 약 50%가 35-45 kDa(이합체 이상)근처의 분자량을 갖는 두 개의 중복 피크로 컬럼에서 용리하여, 여기서 시험한 조건에서 강한 자기 회합을 알 수 있다. (BSA 대조군은 예상된 바와 같이 거동하여, DATO117 실험 결과가 확인되고, 6IkDa 및 146kDa (모노머 및 이합체)를 갖는 두 개의 피크를 나타낸다). SEC MaI 결과에 대하여는 도 7 참조.
DAT0120
100 μl의 1mg/ml DATO117을, 5OmM 인산염 완충액 pH7.4으로 평형시킨 TSK2000 컬럼상에 주입했다. 유속은 lml/min로 설정했다. DATO120의 주입량의 약 50%는 약 25kDa로 측정된 분자량과 함께 약간 비대칭 피크로 GF 컬럼에서 용리했다. 이는 시험한 조건에서의 강한 자기 회합을 나타내고, 그 단백질은 신속한 모노머-이합체 평형에 있는 것으로 보인다. (BSA 대조군은 예상된 바와 같이 거동하여, DATO117 실험 결과가 확인되고, 6IkDa 및 146kDa (모노머 및 이합체)를 갖는 두 개의 피크를 나타낸다). SEC MaI 결과에 대하여는 도 8 참조.
이러한 실험 결과로부터, DATO115는 유의적인 자기 회합을 나타내는 다른 2개의 분자와 비교하여 여기서 사용된 조건하에서 상당히 작은 (아미도 거의 없는) 자기 회합을 나타내는 것으로 판단되었다. 용액내 모노머 상태는 생체내 작용 및 제조 동안 상류측 및 하류측 과정 측면에서 바람직할 수 있기 때문에, DATO115가 용액내 상태의 측면에서 임상 진행에 가장 이상적인 분자일 수 있다.
실시예 15: 친화성 매트릭스 단백질 L을 이용함이 없이 포유동물 발현으로부터의 정제
DAT0120 및 DATO115 모두를 HEK 293 상청액으로부터 정제했다. 각 단백질은 pTT-5 벡터를 이용하여 HEK 293E 세포에서 포유동물 조직 배양을 통해 발현시켰다. MEP Hypercel 수지의 1 ml 컬럼을 PBS로 평형화하고, 0.1M 수산화나트륨으로 세척한 다음, PBS로 다시 평형화했다. 200ml의 상청액을 2.5ml/min의 속도로 그 컬럼에 적용한 다음, 그 컬럼을 PBS로 세척하고, 0.1 M 글리신 pH2로 용리시켰다.
용리 후, 그 샘플을 1/5 부피의 1M Tris pH 8을 첨가하여 중화시키고, 실온에서 보관했다. 그 샘플은 보관 후 가벼운 침전을 나타냈고, 탈염에 앞서 살균 장치(sterifiip device)를 이용하여 여과했다.
두 개의 26/10 HiPrep 탈염 컬럼을 lOml/min의 유속으로 2OmM 초산나트륨 pH5 (측정 pH 5.3)으로 평형시키고, 0.1M NaOH를 첨가하여 세정하고, 2OmM 초산나트륨 pH5으로 다시 평형시켰다. DATO115를, 2OmM 초산나트륨 pH5 (실제 5.2)로 평형시킨 1ml HiTrap SPFF에 로딩하기에 앞서 2OmM 초산나트륨 pH5로 탈염시켰다. 그 컬럼의 세척 후, 2OmM 초산나트륨 pH5, 1M NaCl를 이용하여 0-100% 구배로 용리시키고, 5mAus 이상의 흡광도를 갖는 용리 분획을 수집하고 SDS-PAGE로 분석했다.
SP FF 분획을 밤새 보관한 후, 그 샘플을 0.2um를 통해 여과하고, 2OmM 시트르산나트륨 pH6.2, 10OmM NaCl을 평형시킨 2X26/10 HiPrep 탈염 컬럼에 적용했다. 그 용리액을 20ml 원심분리 농축기에서 농축하고, 여과 살균하고, 내독소를 1/10 및 1/200 희석액에서 시험했다. 내독소는 두 희석액으로 시험하였는데, 1/10 희석액은 250의 스파이크 회수율로서 30Eu/ml의 값을 나타냈고, 1/200 희석액은 126%의 스파이크 회수율로서 <10.8Eu/ml의 값을 나타냈다. 그 샘플을 ID 27823을 이용하여 MS 분석했다. 높은 로딩량에서 8OkDa 마커 미만 및 110 내지 16OkDa 마커들의 사이에는 낮은 수준의 오염물이 있다. 그 샘플은 95% 이상 순수한 것으로 보인다.
실시예 16: 엑센딘-4 및 DOM7h-14-10/ DOM7h-11-15 AlbudAb의 유전자 융합체의 발현 및 정제
본 실험의 목적은 DMS7139 및 DMS7143를 효율적으로 발현하는 것이다. DMS7139은 엑센딘-4와 DOM7h-14-10 (혈청 알부민에 결합하는 도메인 항체(dAb), AlbudAb TM로도 알려짐)의 융합체이고, DMS7143은 엑센딘-4 와 DOM 7h-11-15 (혈청 알부민에 결합하는 도메인 항체(dAb), AlbudAb라고도 알려짐)의 융합체이다. 다음에, 상기 융합체는 다음의 실험에서 엑센딘-4 부분의 활성 및 AlbudAb 부분의 활성에 대하여 시험될 수 있다.
엑센딘-4를 DOM7h-14-10 or DOM7h-ll-15와의 융합체 형태로 클로닝하였는데, 엑센딘-4 펩티드는 그 작제물의 5'말단에 위치하였고, AlbudAb는 3' 말단에 위치하였다. 전체 2개의 작제물을 만들었는데, 각 작제물은 엑센딘-4와 AlbudAb의 사이에 (Gly4Ser)3 링커를 포함한다. 상기 링커는 GLP-1 수용체와 엑센딘-4 사이의 결합의 입체 장애를 방지하기 위해 dAb로부터 엑센딘-4를 공간적으로 분리하기 위한 스페이서로서 포함되었다. 그 작제물들의 서열이 도 1(m) 및 도 1(n)에 도시되어 있다. 발현 벡터에의 클로닝을 가능하게 하기 위하여, 5' 말단에서 Ndel 제한 부위 및 그 이후로 변형 modified OmpT (OmpT AWA의 아미노산 서열은 도 1(q)의 SEQ ID NO 28에 도시되어 있음) 시그널 펩티드 및 3' 말단에서 BamHI 부위를 갖는 조립 assembly PCR 형태로 융합체를 제조했다. OmpT AWA 시그널 펩티드는 야생형으로부터, SFA 대신에 AWA를 엔코딩하는 'OCITGGGCC' (도 2(p)의 SEQ ID NO 33에 도시됨)로 변화된 마지막 3개의 코돈을 갖는다. 이러한 변화는 이.콜라이(E.coli)의 시그널 펩티다제에 의한 올바른 부위의 처리를 개선한다. 게다가, 그 융합체의 서열은 펩티다제 절단 부위 이후로 직선으로 나아간다. 단일 펩티드의 마지막 코돈 및 엑센딘-4 서열의 처음 2개의 아미노산과 중첩되는 Ncol 절단 부위를 도입했다. 이러한 변화는 이후의 서브클로닝을 촉진하는 외에도, 엑센딘-4의 자유 N-말단과의 융합체의 제조를 초래한다. 상기 나열한 변화를 포함하는 변형된 pET12a 발현 벡터(EMD Biosciences사로부터 얻은 pET 벡터)는 pDOM35라 명명했다. 벡터 및 조립 PCRs를 Ndel 및 BamHI 제한 엔도뉴클레아제로 절단한 다음, Quick Ligation Kit (NEB)를 이용하여 벡터내로 라이게이션했다. 2 마이크로리터의 이러한 라이게이션을 MachI 세포의 형질전환에 사용했다. 회수 성장 기간 후, 세포를 카르베니실린을 함유하는 아가 플레이트에 도말하고 37 ℃에서 밤새 배양했다. 콜로니를 서열분석하고, 올바른 서열을 함유하는 것들을 플라스미드 증식 및 분리에 사용했다(Plasmid Mini Prep kit, Qiagen). BL21(DE3) 세포를 플라스미드 DNA로 형질전환하고, 얻어지는 콜로니를 발현 배양물의 접종에 사용했다. 4 x 0.5 리터의 TB Onex 배지(Overnight Express™ 자기유도 용액이 첨가됨), 1 방울의 거품방지제 및 100 ㎍/ml의 카바베니실린을 접종하여 발현을 수행했다. 배양물을 250 rpm으로 교반하면서 30 ℃에서 3일 밤 동안 배양한 후, 그 배양 상청액을 3700xg에서 1 시간 동안 원심분리했다. 다음에, 발현된 단백질을 단백질 L 스트림라인 (GE Healthcare, Cat.No. 28-4058-03, 단백질 L이 결합됨)을 이용하여 상청액으로부터 정제하고, 0.1M 글리신 pH2.0을 이용하여 단백질 L로부터 정제한 다음, 0.1배 부피의 1M Tris pH8.0을 이용하여 중화시켰다. 다음에, 단백질을 농축하고, 완충액 A (2OmM 초산나트륨-초산 pH 5.0)으로 투석하고, AktaXpress (GE healthcare) 상에서 이온 크로마토그래피로 정제했다. 단백질을 완충액 Buffer A (무염 완충액)에서 Resource S 6ml 컬럼에 로딩한 다음, 0-68% 구배로 65분내에 분획으로(DMS7139의 경우) 완충액 B (2OmM 초산나트륨-아세트산 pH 5.0 1M NaCl)을 이용하여 용리시켰다. 분획을 SDS-PAGE 및 질량 분광 분석으로 분석하고 올바른 질량의 것들을 풀링했다. 최종 단백질을 2OmM 구연산염 0.1M NaCl 완충액으로 투석하고, SDS-PAGE 및 질량 분광분석으로 정체를 다시 확인했다.
실시예 17. 표면 플라즈몬 공명을 이용하는 분석에서 엑센딘-4 AlbudAb 융합체인 DMS7139 및 DMS7143는 혈청 알부민에 결합한다
DMS7139 및 DMS7143를 발현시키고, 전술한 바와 같이 분석하고, 표면 플라즈몬 공명(Biacore, GE Healthcare)으로 분석하여 친화성에 대한 정보를 얻었다. 그 분석은 혈청 알부민이 코팅된 두 개의 CM5 칩(카르복시메틸화 덱스트란 매트릭스)를 이용하여 수행했다. 약 500 공명 단위(RU)의 각 혈청 알부민을 아세테이트 완충액 pH 4.5에 고정화했다. 제1 칩은 코팅되지 않고 블로킹된 유동 셀 1을 가졌고, 유동셀 2는 MSA (560RU)로 코팅했다. 제 2 칩은 코팅되지 않고 블로킹된 유동 셀 1을 가졌고, 유동 샐 2는 HSA로 코팅했고, 유동 셀 3은 CSA로 코팅하고, 유동 셀 4 는 RSA로 코팅했다. 모든 형철 알부민의 경우, 그 목적은 칩상에 350 RU의 단백질 영역을 코팅하는 것이었다. BIACORE HBS-EP 완충액 (0.01M HEPES, pH7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)에 희석하여 다양한 농도의 융합체를 제조하고 (DMS7139의 경우 55 nM 내지 1 μM, DMS7143의 경우 24 nM 내지 4.4 μM) by dilution into BIACORE HBS-EP buffer (0.01M HEPES, pH7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% surfactant P20) BIACORE 칩을 가로질러 유동시켰다. KD의 영역에서 dAb의 농도에 의해 발생된 기록에 온속도 및 오프속도 커브를 합치시켜서 BIACORE 기록으로부터 친화성 (KD)을 계산했다. 친화성 (KD)는 하기 표 11에 요약되어 있다:
DMS7139(M) DMS7143(M)
HSA 2.69E-08 1.48E-08
RSA 3.15E-08 2.19E-08
CSA 4.23E-08 3.89E-08
MSA 7.37E-08 8.93E-08
DMS7139 및 DMS7143는 10-9OnM의 범위인 혈청 알부민에 대하여 높은 친화성을 가진 것으로 확인되었다(RSA에 대한 DMS7143 친화성은 제외). 이는 이전의 융합체의 SA(예를 들어, 글리신 세린 링커에 의해 DOM7h-14 AlbudAb에 연결된 엑센딘-4인 DATO115로서, 수백 nM의 범위에서 혈청 알부민에 친화성을 갖는 DATO115)에 대한 친화성보다 상당히 높다. 혈청 알부민에 대한 상기 새로운 융합체의 더욱 높은 친화성은 생체내에서 더욱 긴 혈장 반감기로 이어질 수 있으므로, 상기 융합체는 동일한 효능을 위해 덜 자주 투여될 수 있고, 시간에 따라 혈청내에서 약물의 더욱 일정한 수준을 유지하여 부작용에 대한 원치않는 cMax 관련 독성을 감소시킨다.
실시예 18
DMS7139 및 DMS7143 융합체는 GLP-1 수용체 결합 분석에서 활성이 있다
GLP-1R은 7TM G-단백질 결합된 수용체로서, 본 분석의 목적은 그 단백질을 CHO 세포상에서 발현시킴에 있다. GLP-1 또는 유사체에 의한 수용체의 활성화는 그 수용체에 결합되는 아데닐화 시클라제에 의해 ATP에서 cAMP로의 전환을 초래한다. CHO 세포는 6CRE/luc 리포터 유전자에 의해 안정적으로 형질전환된다. 따라서, 리포터의 GLP-1 활성화 후 cAMP의 제조 시, 그 프로모터 유전자(cAMP 반응 요소의 6 카피, 즉 6CRE 함유)는 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 유도한다. 다음에, 이는 루시페린과의 반응을 촉매하여, 발광분석기상에서 측정될 수 있는 빛을 생성한다.
방법
CHO 6CRE GLP1R 세포를, 그 바이알(들)을 37 ℃ 물중탕에 절반 침적시켜서 해동하고, 그 바이알의 내용물을 50ml 팔콘 튜브에 옮기고, 10ml RPMI (phenol red free) 분석 배지 (Sigma, cat#R7509) + 2mM L-글루타민(Gibco, cat # 25030) + 15mM HEPES (Sigma, cat # H0887)를 각 바이알에 첨가했다. 계수하고 1200rpm 에서 5 분간 원심분리한 후, 세포를 적당한 부피의 RPMI 분석 배지에 재현탁하여 1x106개 세포/ml를 얻고, 50μl를 백색 96웰 편평 바닥 조직배양 플라스크의 각 웰에 분주했다(Costar 96 well tissue culture plate, white sterile, cat # 3917). 세포를 37 ℃/5%CO2에서 밤새 배영했다. 다음날, 배양기로부터 세포를 제거하고 50 ㎕의 이전에 제조한 대조군/샘플을 웰에 첨가하고, 플레이트를 37 ℃ 및 5% CO2에서 3 시간 배양했다.
엑센딘-4 대조군 (Sigma, cat # E7144)의 재조
V-바닥부의 96 웰 플레이트에서, 2μl의 l mg/ml 엑센딘-4를 198μl RPMI 분석 배지에 첨가하여 2.39μM 용액을 얻는다. 2μl의 2.39μM 용액을 237μl RPMI 분석 배지에 첨가하여 2OnM 용액을 얻는다(1OnM의 분석에서 최종 농도). 대조군 플레이트를 1:10으로 연속 희석하여 (15μl 대조군 + 135μl RPMI 분삭 배지) 8 점 곡선을 얻는다.
미지 샘플의 제조
미지 샘플의 제조를 위해 대조군 제조의 경우와 동일 가이드 라인을 사용한다. 필요한 최종 분석 농도의 2배 농도를 만들고 대조군 플레이트를 1:10으로 희석한다.
루시퍼라제(Promega, cat # E2620)의 제조
동결기로부터 필요한 수의 Bright-Glo 루시퍼라제 분취액을 제거하고 암소에서 실온으로 해동시킨다. 하나의 5ml 바이알은 하나의 분석 플레이트에 충분하다.
배양 시간 후, 50 ㎕의 Bright-Glo 루시퍼라제 시약을 모든 웰에 첨가하고, 그 플레이트를 실온에서 3 분간 배양하여 세포 용해를 일으켰다. 발광(초당 계수)을, M5e 마이크로플레이트 리더를 이용하여 판독했는데, 각 웰 마다 0.1초간 판독했다. 세포만을 함유하는 배경 웰의 CPS를 모든 다른 웰로부터 감했다. 대조 웰(GLP-1(7-36) 또는 엑센딘-4)은 최고 농도에서 최대 자극을 나타낸다. 미지 샘플의 농도 효과 곡선을 합치시키고, 이로부터 GraphPad Prism 또는 ExcelFit 소프트웨어를 이용하여 EC50을 계산한다.
도 개의 엑센딘-4 AlbudAb 융합체 (DMS7139 및 DMS7143)를, 엑센딘-4를 이용한 GLP-1R BA에서 활성의 분석시 테스트했다. 그 결과는 다음 표 12에서 보여진다.
GLP-1R BA EC50(pM) GLP-1R BA (10 μM 알부민) EC50(pM)
DMS7139 265.1 1488
DMS7143 186.8 871.1
엑센딘 4 72.18 확인안됨
DAT0115 대조군 211.8 607.6
상기 결과로부터, DMS7139 및 DMS7143은 GLP-1R BA에서 예상된 활성을 나타내므로, 생체내에서 GLP-1에 대한 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, DMS7139 및 DMS7143는 추가의 전임상 연구를 위한 양호한 후보이다.
실시예 19
DATO115 또는 DATO117를 발현하는 벡터를 이.콜라이(E. coli) 균주 B121-(DE3) (Novagen)에 형질전환했다. 50 ml의 변형된 테라픽 브로쓰 배지(Sigma cat-no. T0918)를 함유하는 250 ml 플라스크를 OD=O.1에서 접종한 다음, 50 mg/1 카나마이신의 존재하에 30 ℃에서 성장시켰다. A600=0.5-1에서, 세포를 50μM 최종 농도의 IPTG로 유도하고, 동일 온도에서 밤새 계속 성장시켰다. 그 배양액을 하강시키고, DATO115 또는 DATO117을 ProteinL 수지(자사 제조)를 이용하여 배양 상청액의 밖으로 포착했다. 배치 결합이 8 ℃에서 밤새 일어났고, 그 수지를 10배 부피의 PBS로 세척하고, DATO115 또는 DATO117을, 3배 컬럼 부피의 0.1 M 글리신 pH=2를 이용하여 수지로부터 용리시켰다. 그 단백질을 1/5 부피의 1M Tris pH8.0을 첨가하여 중화시켰다. 다음에, 그 단백질을 SDS-겔 및 질량 분광분석(MS) 또는 Edman 분해(Edman)를 통해 분석했다.
별표(*)로 나타낸 DATO117을 발현하는 벡터를 실시예 16에서 나타낸 조건을 이용하여 형질전환, 배양 및 분석했다.
리더 명칭 작제물 전장%
MS(Edmin)		 2개 아미노산 결실의%
MS(Edmin)
OmpA DAT1105 77 23%
OmpA-AMA DAT1105 100 0%
OmpA-AWA DAT1105 84 16%
OmpT DAT1107*
DAT1107		 46%(42%)
41%		 54%(58%)
59%
OmpT-AMA DAT1107* 86%(83%) 14%(17%)
OmpT-AWA DAT1107* 100%(100%) 0%(0%)
GAS DAT1107 13% 87%
GAS-AMA DAT1105 72% 28%
실시예 20: MalE/pET30 벡터를 이용한 DMS7139 (엑센딘-4 및 DOM7hl4-10의 유전자 융합체) AlbudAb의 발현 및 정제
DMS7139 유전자를 올리고뉴클레오티드 번호 l (GGAATTCCATATGAAAATCAAAACCGGTGCTCGCATCCTGGCTCTGTCCGC TCTGACCACTATGATGTTCTCCGCTTCCGCGCTGGCTCATGGTGAAGGAACA TTTACCAGTGAC) (도 2s: SEQ ID NO 47) 및 올리고뉴클레오티드 번호 2(GTTCAGAATTCTTATTACCGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTG (도 2t: SEQ ID NO 48)를 이용하여 DMS7139를 함유하는 플라스미드로부터 PCR로 증폭했다. 그 증폭 생성물은 N-말단 MaIE 시그널 서열 MKIKTGARILALS ALTTMMFSASALA (도 9j: SEQ ID NO 49)를 갖는 DMS7139 작제물을 함유하고, 그의 5' 및 3' 말단에서 Ndel 및 EcoRI 에 대한 인식 서열을 각각 갖는다. 얻어지는 유전자 단편을 NdeVEcoRI로 절단하고, NdeVEcoRI 절간 pET30 벡터(Invitrogen)에 라이게이션했다. 삽입물을 확인하기 위하여, 그 클론을 T7-정방향 및 T7-역방향 프라이머를 이용하여 서열분석했다.
DMS7139를 발현하는 벡터를, pECO-pgl 벡터(Aon et al. applied and environmental microbiology feb. 2008 vol.74, No.2, pg 950-958 참조)를 함유하는 이.콜라이(E. coli) 균주 BL21-(DE3) (Novagen)에 형질전환하고, 그 배양물을 50 mg/1의 카나마이신 및 37.5 mg/L의 클로람페니콜이 첨가된 최소 배지(see Korz DJ. et al J.Biotechnol. 1995 39 pg 59-65.참조)에서 30 ℃에서 성장시켰다. 0.25 내지 0.5의 A600에서(실제값은 0.347), 세포를 70 μM 최종 농도의 IPTG로 유도하고, 28 ℃에서 밤새 계속 성장시켰다. 다음에, 그 배양물을 하강시키고, DMS7139를 ProteinL 수지(자사 제조)를 이용하여 배양 상청액의 외부에서 포착했다. 배치 결합이 4 ℃에서 밤새 발생했고, 그 수지를 10배 컬럼 부피의 PBS로 세척하고, DMS7139를 3배 컬럼 부피의 0.1 M 글리신 pH=2를 이용하여 수지로부터 용리시켰다. 다음에, 그 단백질을 SDS-겔 및 질량 분광분석으로 분석했다. 도 10에서 도시한 바와 같이, 질량 분석 결과 매우 순수한 DMS7139가 있다.
또한, DMS7139 단백질을 엔코딩하는 DNA 의 서열은 이.콜라이(E. coli) 발현을 위하여 코돈 최적화될 수 있고, 이러한 서열은 도 2(u)의 SEQ ID NO 50에서 도시되어 있다.
실시예 21: DMS7139는 마우스, 래트, 시노몰구스 고양이 및 인간 GLP-IR에 유사한 능력으로 결합한다.
인간, 마우스, 래트 및 시노몰구스 고양이에서 DMS7139의 상대 능력을 확인하기 위하여, 멜라닌보유 세포 작용성 GLP-1R 생물학적 분석을 사용했다(Jayawickreme et. al., Curr Protocols in Pharmacol. 2005 참조). 7TM 활성화를 통한 멜라노좀 전좌가 잘 정의되어 왔고, 멜라닌보유 세포내의 G 단백질은 포유동물 세포계와 유사한 방식으로 GPCRs에 결합하는 것으로 확인되어왔다(Gross et al., J Cell Biol 2002; 156:855-865). 이러한 생물학적 분석은 멜라노좀으로 알려진 유기소체를 함유하는 흑색색소 (멜라닌)을 갖는 개구리인 Xenopus laevis의 피부 세포 유래의 멜라닌보유 세포주를 이용한다(Lerner, Trends Neurosci. 1994; 17: 142-146). 세포내 cAMP 수준의 변화는 멜라노좀이 세포 도처에 통해 응집 및 분산되는 정도를 조절하므로, 멜라닌보유 세포 색밀도는 cAMP 수준과 직접 관련이 있다. 더욱 상세한 사항은 아래와 같다.
래트, 마우스 및 인간 GLP-1 수용체를 엔코딩하는 전장 오픈 리딩 프레임 cDNA를, 표준 분자 생물학 기법을 이용하여 발현 벡터인 pJG3.6 또는 pcDNA3에 클로닝했다. 유전자 은행 기탁 번호가 하기 표 14에서 보여진다.
CLP1R 유전자은행 기탁번호
래트 NM 012728
마우스 NM 021332
인간 NM 002062
시노몰구스 원숭이 GLP-1R을 엔코딩하는 클론을 시노몰구스 원숭이의 폐, 간 및 뇌로부터 분리한 전체 RNA로부터 역 전사된 cDNA로부터 증폭하고 pcDNA3.2DGW에 서브클로닝했다. 전장 cDNA 서열을 확인했다. 멜라닌보유 세포를 27 ℃ 및 0% CO2에서 L-15 배지에서 T225 플라스크(Costar Cat. No. 3000)에 유지하고 0.7x 트립신을 이용하여 유착점 플라스크로 부터 1주일에 1회 분열시킨 다음(1:10), 1주일에 2회 급여했다. 시노몰구스 원숭이에 대한 cDNA는 도 2(r)의 SEQ ID NO 45에 도시되어 있다.
평가 목적을 위하여, 세포를 세척하고, 트립신화하고, 15xlO6 세포/ml의 농도로 0.7x EPG PBS에 재현탁했다. 800μl의 세포를 20-40μg의 cDNA와 부드럽게 혼합하고 얼음위에서 20분간 배양했다. 배양 후, 800μl의 세포/cDNA 혼합물을 큐벳에 피페팅하고 500V, 725uF 및 950 ohms에서 전기천공했다. 다음에, 세포를 큐벳으로부터 RFM (regular frog media)을 함유하는 T75 플라스크에 직접 옮기고 실온에서 3 시간 동안 교반한 다음, 인큐베이터(25 ℃, 0% CO2)에서 밤새 배양했다. 다음날, 세포를 트립신화하고, 계수하고, 300,000개 세포/ml의 밀도로 Costar 96 하프 웰 플레이트(Cat. # 3697)에 첨가했다. 2 시간 후, 배양기 (25 ℃, 0% CO2)내의 밀폐 용기내에 밤새 위치시켰다. 다음날, 배지를 흡입시키고, 1% DMSO 및 1OnM 멜라토인을 함유하는 25μl MAB (Melanophore Assay Buffer)를 각각의 웰에 첨가했다. 세포를 한 시간 동안 배양하고, 기저 투과율을 620nm에서 SLT 스펙트라 플레이트 리더 상에서 측정했다. 다음에, 25μl의 2x 농도 펩티드를 함유하는 희석액(MAB에서 3배 희석배수를 이용한 12점 시리즈) 및 기준물을 각각의 웰에 직접 첨가했다. 기준물은 멜라토인 1OnM, MSH 20OnM 및 MAB를 포함했고, 이를 이용하여 분석 장치 최소, 최대, 및 기저 수준을 설정했다. 펩티드 및 기준물의 첨가 후, 플레이트를 1 시간 동안 배양하고, 투과율을 위와 같이 측정했다. (1-Tf/Ti) (여기서, Ti는 초기 기선 판독치이고, Tf는 반응 판독치임)를 계산함으로써 Robosage (version 7.3.2)를 이용하여 데이터를 분석했다. Gs-결합 7TM 수용체 활성화 (즉, GLP-1R)는 세포내 cAMP의 증가로 이어져서, 멜라토인을 이용하여 응집되어 더욱 분산되는 멜라노좀을 초래한다. 그렇지 않으면, cAMP를 감소시키는 조건하에서, 멜라노좀은 응집되어 세포를 통한 빛 투과율을 증가시킨다. 따라서, GLP-1R cDNA 함유 플라스미드 작제물의 멜라닌보유 세포에의 형질감염 및 일시적 발현 후, GLP-1R 활성화를 위한 DMS7139의 상대적 능력을 투여량-반응 곡선으로부터 계산할 수 있다. 결과는 다음 표 15에서 보여진다.
멜라닌 보유세포 분석에서 DMS7139의 능력
클론 명칭 시노몰구스원숭이
CLP-IR
pEC50		 래트 CLP-IR
pEC50		 마우수 CLP-IR
pEC50		 인간 CLP-IR
pEC50
DMS7139 10.62 10.78 9.97 10.63
DMS7139 10.63 11.11 10.50 11.39
DMS7139 10.79
DMS7139 11.07 11.17 11.43
CLP-1(7-36) 11.03 11.16 11.47 11.40
CLP-1(7-36) 11.09
CLP-1(7-36) 10.97
DMS7139를, 인간, 마우스, 래트 및 시노몰구스 원숭이 GLP-1R로 형질감염시킨 멜라닌보유세포를 이용한 분석에서 각 종마다 적어도 중복하여 능력을 테스트했다. 중복 분석을 위한 pEC50s이 표 15에서 나타나있다. 시노몰구스 원숭이, 인간 및 래트 수용체의 능력은 마우스 수용체보다 약간 더 낮다. 표 15에서 나타낸 이러한 결과는 이러한 약물을 이용한 마우스 모델에서 확인된 효능이 가능한 독물 종(래트 및 시노몰구스 원숭이) 및 인간에서 복제되는 경향이 있다는 양호한 신뢰를 제공한다.
실시예 22: 제2형 당뇨병의 db/db 마우스 모델에서 DAT0115 및 DMS7139의 효능 및 작용 기간
본 연구의 목적은 10-11 주령의 db/db 마우스(Jackson Labs사로부터 입수)에서 경구 글루코스 내성에 대한 DATO115 및 DMS7139의 작용 기간을 측정 및 비교하기 위한 것이다. 동물들을 실험을 출발하기 3일전에 혈중 글루코스 수준에 따라 무작위로 여러 그룹으로 나누었다. 이로써, 각각의 연구 그룹에서 유사한 평균 출발 글루코스 수준을 확보했다. 경구 글루코스 투여전 12O 시간, 96 시간, 72 시간 또는 48 시간째에 1mg/kg의 양으로 DATO115 및 DMS7139를 피하 투여했다(도 11A 참조).
글루코스 AUC는 DMS7139의 경우 12O 시간까지의 시점에서 DATO115의 경우 96시간까지의 시점에서 비히클 처리된 db/db 마우스와 비교하여 경구 글루코스 내성 시험의 2시간 이후에 상당히 저하되었다(도 11B 참조). 72 시간, 96 시간 또는 12O 시간에서 투여된 DATO115 및 DMS7139 사이에는 유의적인 차이가 없었지만, DATO115는 48 시간째에 DMS7139와 비교하여 글루코스 AUC를 상당히 저하시켰다. DMS7139이 나타낸 글루코스 AUC 의 더욱 일관적인 저하는 이러한 부류의 약물에 대한 더욱 바람직한 프로필을 대표하는 것으로 판단되었다. 따라서, 본 연구가 명백한 우수성을 확인하지는 않았지만, DMS7139가 이러한 데이터 및 다른 데이트에 기초하여 최선인 것으로 선택되었다.
실시예 23: DMS7139의 반복 투여는 DOM7h-14 대조군과 비교하여 HbAIc의 투여량 의존적인 저하를 나타낸다.
본 연구의 목적은 10-11 주령 db/db 마우스(Jackson labs)에서 DMS7139의 반복 투여 후의 HbA1c 저하를 조사하는 것이다. HbA1c는 그 농도가 장기간에 걸쳐서 혈장 글루코스 농도의 척도로서 사용되는 헤모글로불린의 당화 형태이다. 각각의 연구 그룹에서 유사한 평균 출발 HbA1c 수준을 확보하기 위하여, db/db 마우스를 실험의 출발 3일전에 HbA1c 수준을 기준으로 무작위로 나누었다. 동물에게 DMS7139 (0.01, 0.03, 0.1, 0.3mg/kg), Byetta™ (0.0001, 0.001, 0.01, 0.1mg/kg) 또는 DOM7h-14 (0.3mg/kg)를 피하로 2주간 투여했다. 14일의 종료시에 취한 HbA1c 측정치와 함께 본 연구 동안 체중, 음식물 섭취량 및 글루코스의 측정치를 취했다.
급여한 글루코스 및 HbA1c는 대조군(DOM7h-14)과 비교하여 0.03, 0.1 and 0.3mg/kg 투여량의 DMS7139 처리 그룹의 경우 상당히 감소하였지만, 식염 대조군과는 유의적인 차이가 없었다(도 12 참조). 식염 대조군에 대하여 얻은 데이터는 낮은 투여량의 엑센딘-4 또는 DMS7139으로 얻은 데이터를 기준으로 예상한 것보다 더욱 낮았다. 식염 대조군과 비교하여 엑센딘-4의 경우에는 차이가 관찰되지 않았다.
또한, DMS7139의 경우 체중 및 음식물 섭취량에 유의적인 감소가 있었다. 엑센딘-4는 최고 투여량에서 음식물 섭취량의 유의적인 증가를 나타냈다.
DMS7139의 반복 투여는 db/db 마우스의 경우 HbA1c의 저하로 이어지는 외에도, 음식물 섭취 및 체중에 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 이러한 변화는 GLP-1R 작용제에 대하여 예상된 것과 일치한다.
실시예 24: DAT0115 및 DMS7139는 비만의 식이 유도 비만(DIO) 마우스 모델에서 DOM7h-14 대조군과 비교하여 음식물 소모량 및 체중의 투여량 의존적 감소를 나타냈다.
본 연구의 목적은 음식물 소비 및 이에 따른 10일간의 체중이 DATO115 및 DMS7139를 이용한 처리에 영향을 받는 지의 여부를 확인하고, 이러한 화합물중 어느 것이 더욱 긴 작용 기간을 갖는 지를 확인하기 위한 것이다. 이는 인간의 경우에도 적용된다. DATO115, Byetta 및 DMS7139 투여 그룹의 경우 식이 유도 비만(DIO) 급여 모델에서 실험을 수행했다. 수컷 C57B1/6 마우스(Taconic)를 12주간 60% kcal 고지방 조사 식이(Research Diets D 12492)를 이용하여 살찌운 다음, 자사에 설비로 옮겼다.
도착 시, 마우스를 온도 및 습도가 조절된 룸(70-72 ℉, 습도 = 48-50%, 5 AM/5 PM 명 주기)의 알파 드라이 깔깃(bedding)상에 개별적으로 수용했다. 식이를 45% 고지방 식이(Research Diets D 12451)로 변화시키고, 그 동물들을 18일간 순화시켰다. 시험 화합물의 투여 전, 마우스에게 염수를 3일간 피하주사하고 음식 소모량을 모니터링했다. 마우스를 그룹들로 나누어서 체중 및 음식 소모량이 그룹들 간에 차이가 없도록 하였다. 이러한 그룹에는 DATO115 또는 DMS7139를 O.O1mg/kg, O.1mg/kg 및 1mg/kg의 투여량으로 투여하고, 하나의 그룹에는 음성 대조 분자 (DOM7h-14 AlbudAb™, 1mg/kg 투여량)를 투여하고, 하나의 그룹에는 엑세딘-4 양성 대조군(0.01mg/kg)을 투여했다. 하루 음식 소모량 및 체중을 10일간 측정했다.
DATO115 및 DMS7139는 DOM7h-14 대조군과 비교하여 음식물 소모량 및 체중의 투여량 의존적인 감소를 나타냈다(도 13의 결과 참조). 도 13에서 나타낸 엑센딘은 Byetta™ 이다. 이러한 마우스 연구로부터의 제이터는 이들의 효능 사이에 차이가 없다는 통계적인 차이가 없다는 것을 나타낸다.
실시예 25: 마우스, 래트 및 시노몰구스 원숭이에서 DMS7139의 PK 분석
3개의 모델 종(db/db 마우스, 래트 및 시노몰구스 원숭이)에 DSM7139를 피하 및 정맥내 주사하여 연구를 수행했다. 적절한 시점에서 분석에 의해 검출가능한 것으로 예상된 혈장 농도를 달성하는 목적으로 투여량을 선택했다: 마우스의 경우 1mg/kg 정맥 및 피하, 래트의 경우 1mg/kg 피하 및 0.3mg/kg 정맥내, 시노몰구스 원숭이의 경우 O.1mg/kg 정맥 및 피하.
PK 샘플채취를 위한 시점은 다음과 같았다: db/db 마우스(0.17, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120 및 168 시간), 래트(0.17, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 및 120 시간) 및 시노몰구스 원숭이(0.083 (정맥 그룹의 경우만), 0.5, 4, 8, 24, 48, 96, 144, 192, 288, 336, 504 및 672 시간 (4 주)). 마우스의 경우를 제외하고, 혈액의 샘플을 채취하였는데, 데이터 수집시마다 동물을 희생시켰다. 혈장 샘플을 제조하고, DMS7139 수준의 분석을 위해 동결시켰다. 다음과 같은 2 가지의 정량 분석법을 이용하여 여러 연구에서 PK 샘플을 분석했다: 분자의 엑센딘-4 및 AlbudAb 부분을 검출하는 ELISA 방법, 및 엑센딘-4로부터 N-말단 펩티드를 검출하는 HPLC-MS/MS 방법. ELISA 기반 방법으로부터의 데이터를 여기에 나타낸다.
ELISA
시노몰구스 원숭이에서 DATO115 및 DMS7139의 수준을 ELISA 분석법을 이용하여 측정했다. 간략히 말해서, 96-웰 fluoroNunc 플레이트(Nunc #437796)를, 5OmM 탄산나트륨 완충액 pH 9.4 (lOOμL/웰)에서 5μg/mL의 항-엑센딘-4 항체(Abeam cat # ab26263)로 냉장고에서 밤새 코팅했다. 다음날, 플레이트를 1OmM Tris, 15OmM NaCl pH7.5 + 0.1% tween-20 (300μL/웰)으로 5회 세척한 다음, 37 ℃에서 약 1 시간 동안 흔들면서 200μL의 블로킹 완충액(superb lock, thermoscientific # 37535, TBS에서)으로 블로킹했다. 웰들을 위와 같이 세척한 다음, 37 ℃에서 약 2 시간 동안 웰당 lOOul의 대조군, 기준물 및 샘플와 함께 흔들면서 배양했다. 다시 웰들을 세척한 다음, 37 ℃에서 1 시간 동안 흔들면서 분석 완충액(10 mM Tris, 15OmM NaCl, 0.1% BSA, 0.1% Tween 20 pH 7.5)에서 토끼 항-인간 카파 경쇄 항체의 1:2000 최종 희석액과 함께 배양한 다음, 위와 같이 세척했다. 다음에, 웰들을 37 ℃로 분석 완충액에서 웰당 lOOμl의 리포터 태그 용액(염소 항-토끼 IgG 컨쥬게이트, 1/500,000)과 함께 흔들면서 배양하고, 위와 같이 세척했다. 약 1 분간 일정하게 흔들면서 웰당 lOOμL의 발색 기질(upersignal ELISA femto (thermoscientific #37075))을 첨가하여 결합된 DATO115 또는 GSK2374697A를 검출한 다음, 화학발광 플레이트 리더(Wallac 1420 Victor Mulyilabel Counter (Perkin Elmer Life Sciences))를 이용하여 판독했다.
측정한 혈장 수준에 대하여 WinNonLin 소프트웨어 버젼 X TBC를 이용하여 구획적 및 비구획적 약물동력학적 분석을 수행했다(하기 표 16 참조). 비구획적 결과의 경우, DATO115 및 DMS7139에 대한 모든 pK 데이터는 같은 날에 연구들 사이의 일치성에 대하여 컴파일링 및 피팅했다. 따라서, 나타난 데이터는 컴파일된 데이터, NCA 결과, 및 DATO115 및 DMS7139에 대한 도면이다.
시노몰구스 원숭이의 경우, 반감기는 구획적 및 비구획적 방법으로 계산시 각각 106.4 시간 112.8 시간 (정맥) 및 113.8h 시간 113 시간 (피하)인 것으로 계산되었다. 상기 세 종 모두의 경우, DMS7139는 혈청 알부민 그 자체에 근접하는 혈장 반감기를 가지므로, DMS7139이 인간 혈청 알부민에 대하여 유사한 친화성(예를 들어 시노몰구스 원숭이 혈청 알부민과 비교하여)을 갖는 것을 가정하면, DMS7139가 일주간격(또는 덜 빈번한) 투여가 적합하게 되는 인간의 경우 반감기를 갖게 된다는 신뢰가 제공된다.
A) db/db 마우스 데이터 (ELISA 데이터)
비구획적 방법 구획적 방법
분자 ROA 투여량(mg/kg) AUC 0-inf (hr*ng/ml) CL/CL-F (mL/hr/kg) F(s.c.)(%) T1 /2 (hr) CL/CL-F (mL/hr/kg) T1 /2 (hr)
DMS7139
 IV 1 815813 1.2 n/a 32.8 1.24 33.7
SC 1 270107 3.7 33.1 24.9 3.66 26.2
B) 래트 데이터(ELISA 데이터)
Figure pct00011
C) 시노몰구스 원숭이 데이터(ELISA 데이터)
Figure pct00012
실시예 26: 시노몰구스 원숭이에서 DMS7139 및 DAT0115의 PK 분석의 비교
인간의 경우에 사용하기 위한 가장 바람직한 분자를 선택하기 위해, 시노몰구스 원숭이의 경우의 약물동력학적 데이터를 DATO115 및 DMS7139 사이에 비교했다(표 17 참조). 본 발명자들은 이러한 표에서의 데이터는 DMS7139가 DATO115 보다 더욱 바람직한 PK 파라미터를 가지므로, 피하 또는 정맥내 투여시 시노몰구스 원숭이에서 반감기가 더욱 길다는 것을 확인했다. 이러한 더욱 긴 반감기는 나중에 DMS7139가 DATO115 보다 혈장 농도가 더욱 높은 효과를 제공한다(데이터 미도시).
시노몰구스 원숭이에서 DAT0115 및 DMS7139의 반감기의 비료
비구획적 방법 구획적 방법
분자 ROA (분석 방법 투여량(mg/kg) AUC 0-inf (hr*ng/ml) CL/CL-F (mL/hr/kg) F(s.c.)(%) T1 /2 (hr) CL/CL-F (mL/hr/kg) 말단
T1 /2 (hr)
DAT0115
 IV
(LC/MS/MS)		 0.1 34507.5 3.3 n/a 67.3 4 80.7
SC
(LC/MS/MS)		 0.1 34203.8 3.1 99.9 67.9 2.9 91.1
DMS7139


 IV
(LC/MS/MS)		 0.1 238360 0.4 n/a 110 0.4 117.6
IV
(ELISA)		 0.1 225925 0.4 n/a 106 0.5 112.8
SC
(LC/MS/MS)		 0.1 128093 0.8 53.7 97.7 0.8 82.1
SV
(ELISA)		 0.1 139657 0.7 61.8 114 0.7 113.1
실시예 27:
PYY (3-36) DOM7h-14-10 (R108C) AlbudAb ™ 펩티드 컨쥬게이트 DMS7605 (도 4에서 도시한 구조를 가짐, DOM 7h-14-10 (R108C), AlbudAb는 리신 및 4 반복 PEG 링커를 통해 PYY3-36에 결합됨)의 제조
The DOM7h-14-10 (Rl08C) albudab를 이.콜라이(E.coli)에서 전술한 바와 같이 발현 및 정제했다. DOM7h-14-10 (R108C)를 엔코딩하는 유전자를 pET30에 클로닝했다. 발현 벡터에의 클로닝을 가능하게 하기 위하여, 5' 말단에서 Ndel 제한 부위 및 다음에 PEL B 리더 서열(도 9(i)의 SEQ ID NO 46에 도시된 아미노산 서열)을 갖는 조립체 PCR 형태로 융합체를 제조했다. 벡터 및 조립체 PCR을 Ndel 및 BamHI 제한 엔도뉴클레아제로 절단한 다음, Quick Ligation Kit (NEB)를 이용하여 벡터에 라이게이션했다. 2 마이크로리터의 이러한 라이게이션을 Machl 세포의 형질전환에 사용했다. 회수 및 성장 기간 후, 세포를 카바니실린을 함유하는 아가 플레이트 상에 도말하고 37 ℃에서 밤새 배양했다. 콜로니를 서열분석하고, 올바른 서열을 갖는 것들을 플라스미드 증식 및 분리에 사용했다(Plasmid Mini Prep kit, Qiagen). BL21(DE3) 세포를 플라스미드 DNA로 형질전화하고, 얻어지는 콜로니를 발현 배양물의 접종에 사용했다. 50ml의 변형된 테리픽 브로쓰 배지(Sigma)를 함유하는 250ml 플라스크를 접종하여 발현을 수행하고, 이를 OD=O.1에서 접종한 다음, 50mg/ml 카나마이신의 존재하에 30 ℃에서 성장시켰다. A600=0.5 내지 1에서, 5OuM 최종 농도의 IPTG를 이용하여 세포를 유도하고, 23 ℃에서 밤새 계속 성장시켰다. 다음에, 배양 상청액을 3700xg에서 1 시간 동안 원심분리했다. 다음에, 발현된 단백질을 Protein L 스트림라인(GE Healthcare, Cat.No. 28-4058-03, protein L 결합됨)을 이용하여 상기 원심분리 상청액으로부터 정제하고, 0.1M 글리신 pH2.0을 이용하여 단백질 L로부터 용리시킨 다음, 1/5 용리액 부피의 1M Tris, pH8.0을 첨가하여 중화시켰다. 다음에, 그 단백질을 0.1 M 구연산을 이용하여 pH5로 조절하고, 5OmM 구연산나트륨 pH5로 평형시킨 30ml Source S 컬럼(GE Healthcare)에 적용했다. 0 내지 100 구배의 5OmM 구연산나트륨 pH5, 1M NaCl를 150 ml까지 AktaXpress FPLC (GE healthcare)에 적용했다. 분획들을 SDS-PAGE 상에서 분석하고, 가장 순수한 생성물을 함유하는 것들을 폴링했다. 최종 단백질을 5OmM 인산나트륨, pH6.5, 5mM EDTA로 탈염했다.
다음에, Dom7h-14-10 (R108C) AlbudAb를 도 4에서 도시한 PEG 링커를 이용하여 PYY 3-36 아미노산 분자(PEG linker 링커로 유도체화될 수 있는 위치 10에서 리신을 가짐)에 연결했다. PYY 및 PEG는 표준 화학적 방법으로 제조했다. 다음에, PEG 링커의 말단의 말레이미드를 이용하여 PYY 펩티드를, 전술한 바와 같이 제조한 DOM7h-14-10 (R108C) AlbudAb의 유리 시스테인에 결합했다.
DOM7h-14-10 (R108C)를 5OmM 인산나트륨, pH6.5, 5mM EDTA로 탈염시켰다. 다음에, 말레이미드 활성화 폴리펩티드를 그 단백질과 1:1 비율로 혼합하고 배양하여 결합기켰다.
컨쥬게이트를 전술한 바와 유사한 방법으로 이온 교환 크로마토그래피를 통해 미반응 DOM7h-14-10 (R108C)로부터 정제했다. 컨쥬게이트가 풍부한 분획을 전술한 바와 유사한 방법으로 단백질 L 친화성 크로마토그래피를 이용하여 유리 단백질로부터 정제했다. 최종 DMS7605 컨쥬게이트를 완충액 교환하고 SDS-PAGE 및 질량 분광 분석으로 분석했다.
실시예 28: 멜라닌보유 세포 기능성 생물학적 분석에서 엑센딘-4 AlbudAb (전술한 바와 같이 제조한 DAT0115) 및 PYY (3-36) AlbudAb 융합 펩티드 (실시예 27에 기재된 바와 같이 제조한 DMS7605, 도 14의 구조를 가짐)의 약물학적 프로필
엑센딘-4 AlbudAb (DAT0115) 및 PYY (3-36) AlbudAb 융합 펩티드 (실시예 27에 기재된 바와 같이 제조한 DMS7605, 도 14의 구조를 가짐)의 약물학적 프로필을 관련 수용체로 형질전환된 세포를 이용하여 멜라닌보유 기능성 생물학적 분석에서 확인했다. 상기 생물학적 분석은 하기의 차이를 제외하고 실시예 21에서와 본질적으로 동일한 방식으로 수행했다: 80ug의 cDNA를 인간 NPYlR에 사용하고,40ug을 마우스 NPYlR에 사용하고, 40ug을 다른 마우스 및 인간 NPY 수용체(NPY2R, NPY4R 및 NPY5R)에 사용했다.
엑센딘-4 및 PYY (3-36) AlbudAb 융합 펩티드의 약물학적 프로필(미도시)은 그 융합체가 마우스 및 인간의 NPY 수용체에 결합하여 활성화시킨다는 것을 나타냈다. DMS7605은 NPYlR, NPY2R, NPY4R 및 NPY5R에 결합하는데, NPY2R이 가장 강하게 활성화된다(데이터 미도시). NPYR 기탁번호는 다음과 같다: NPYlR: NM 00909 (인간) 및 NM 010934 (마우스); NPY2R: NM 00910 (인간) 및 NM 008731 (마우스); NPY4R: NM 005972 (인간) 및 NM 008919 (마우스); NPY5R: NM 006174 (인간) 및 NM 016708 (마우스).
실시예 29: DMS7605는 비만의 식이 유도 비만(DIO) 마우스 모델에서 비히클 대조군과 비교하여 체중의 투여량 의존적인 감소를 나타냈다.
비만의 식이 유도 비만(DIO) 마우스 모델에서 실험을 수행하여 DMS7605 (aka DMS7167:PYY3-36)의 효능을 평가했다. 본 연구의 목적은 6일에 걸친 음식물 섭취량 및 체중이 DMS7605에 의한 처리에 영향을 받는지의 여부를 확인함에 있다. 그 결과는 인간에도 적용될 수 있다.
수컷 C57B1/6J 마우스(Taconic)를 12주간 60% kcal 고지방 식이(Research Diets D 12492)를 이용하여 살찌운 다음, 자사의 시설로 옮겼다. 도착 시, 마우스를 온도 및 습도가 조절된 룸(70-72 ℉, 습도 = 48-50%, 5 AM/5 PM 명 주기)의 알파 드라이 깔깃(bedding)상에 개별적으로 수용했다. 식이를 45% 고지방 식이(Research Diets D 12451)로 변화시키고, 그 동물들을 5주간 순화시켰다. 동물들은 사료 및 물에 자유 접근이 가능하도록 하였다. 화합물의 투여 전, 마우스에게 비히클을 1일간 피하주사하고 음식 소모량을 모니터링했다. 마우스를 그룹들로 나누어서 체중 및 음식 소모량이 그룹들 간에 차이가 없도록 하였다. 이러한 그룹에는 비히클 또는 DMS7605을 3 mg/kg, 1 mg/kg, 0.3 mg/kg 또는 0.1 mg/kg의 투여량으로 매일 투여했다. 6일의 누적 음식물 흡수의 통계적으로 유의한 변화가 3 mg/kg (37.3% 감소), 1 mg/kg (31.3% 증가) 및 0.3 mg/kg (21.8% 감소)에서 관찰된 반면에, 0.1 mg/kg (8.7% 감소, p=0.07, T-test)에서는 유의적인 변화가 관찰되지 않았다. 투여 개시 후 0, 3 및 6 일째에 체중을 측정했다.
DMS7605는 비히클 대조군과 비교하여 체중의 투여량 의존적인 감소를 나타냈다(도 15). 체중의 유의적인 감소가 모든 투여량에서 관찰되었다(p<0.01, 이원분산 분석 후 Bonferroni post-hoc 분석).
SEQUENCE LISTING <110> Herring, Christopher Holt, Lucy Jespers, Laurent Mayer, Sebastian Pupecka, Malgorzata <120> Drug fusions and conjugates <130> DB63558 WO <150> US 61/163917 <151> 2009-03-27 <160> 52 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2xGLP-1 A8G DOM7h-14 fusion (DAT0114) <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg His Gly 20 25 30 Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala 35 40 45 Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Asp Ile Gln Met 50 55 60 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 65 70 75 80 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ser Gln Leu Ser Trp Tyr 85 90 95 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Met Trp Arg Ser 100 105 110 Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 115 120 125 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 130 135 140 Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly Ala Ala Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gln 145 150 155 160 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 165 <210> 2 <211> 163 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin 4, (G4S)3 linker, DOM7h-14 fusion (DAT0115) <400> 2 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 50 55 60 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 65 70 75 80 Ser Gln Trp Ile Gly Ser Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 85 90 95 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln Ser Gly 100 105 110 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 115 120 125 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 130 135 140 Gln Gly Ala Ala Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 145 150 155 160 Ile Lys Arg <210> 3 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin 4 DOM7h-14 fusion (DAT0116) <400> 3 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 35 40 45 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 50 55 60 Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ser Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 65 70 75 80 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln Ser 85 90 95 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 100 105 110 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 115 120 125 Ala Gln Gly Ala Ala Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 130 135 140 Glu Ile Lys Arg 145 <210> 4 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin 4, helical linker, DOM7h-14 fusion (DAT0117) <400> 4 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala 35 40 45 Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Leu Ala Ala Lys Glu Ala Ala 50 55 60 Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Leu Ala Ala 65 70 75 80 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 85 90 95 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ser Gln 100 105 110 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 115 120 125 Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 145 150 155 160 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly Ala Ala Leu Pro Arg 165 170 175 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 180 185 <210> 5 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1 A8G, (G4S)3, linker DOM7h-14 fusion (DAT0118) <400> 5 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp 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Ser Ala Ser 35 40 45 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly 50 55 60 Ser Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 65 70 75 80 Leu Ile Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 85 90 95 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 100 105 110 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly Ala Ala Leu 115 120 125 Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 130 135 140 <210> 7 <211> 179 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1 A8G, helical linker, DOM7h-14 fusion (DAT0120) <400> 7 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys 20 25 30 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 35 40 45 Leu Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala 50 55 60 Ala Ala Lys Glu Leu Ala Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 65 70 75 80 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 85 90 95 Ser Gln Trp Ile Gly Ser Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 100 105 110 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln Ser Gly 115 120 125 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 130 135 140 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 145 150 155 160 Gln Gly Ala Ala Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 165 170 175 Ile Lys Arg <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM7h-14 <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ser Gln 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly Ala Ala Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 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Sequence <220> <223> DAT0114 - nucleic acid sequence (from mammalian construct) <400> 13 catggtgaag ggacctttac cagtgatgta agttcttatt tggaaggcca agctgccaag 60 gaattcattg cttggctggt gaaaggccga catggtgaag ggacctttac cagtgatgta 120 agttcttatt tggaaggcca agctgccaag gaattcattg cttggctggt gaaaggccga 180 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 240 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 300 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 360 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 420 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtgcggcgt tgcctaggac gttcggccaa 480 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 504 <210> 14 <211> 489 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAT0115 - nucleic acid sequence (from mammalian construct) <400> 14 catggtgaag gaacatttac cagtgacttg tcaaaacaga tggaagagga ggcagtgcgg 60 ttatttattg agtggcttaa gaacggagga ccaagtagcg gggcacctcc gccatcgggt 120 ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggcagc ggcggtggcg ggtcggacat ccagatgacc 180 cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta ggagaccgtg tcaccatcac ttgccgggca 240 agtcagtgga ttgggtctca gttatcttgg taccagcaga aaccagggaa agcccctaag 300 ctcctgatca tgtggcgttc ctcgttgcaa agtggggtcc catcacgttt cagtggcagt 360 ggatctggga cagatttcac tctcaccatc agcagtctgc aacctgaaga ttttgctacg 420 tactactgtg ctcagggtgc ggcgttgcct aggacgttcg gccaagggac caaggtggaa 480 atcaaacgg 489 <210> 15 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAT0115 - nucleic acid sequence (from E.coli construct) <400> 15 cacggtgaag gtaccttcac ctctgacctg agcaaacaga tggaggaaga agcggttcgt 60 ctgttcatcg agtggctgaa aaacggtggt ccgtcttctg gtgctccgcc accgtctggt 120 ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct ggtggtggcg gtagcgacat ccagatgact 180 cagtccccaa gctctctgtc tgcctccgtt ggcgatcgtg ttacgatcac gtgccgtgct 240 tctcagtgga tcggttccca gctgtcctgg tatcagcaga aaccgggcaa agccccgaaa 300 ctcctgatca tgtggcgtag ctctctgcag tctggtgtac cgagccgctt ctctggttct 360 ggttctggta ccgacttcac cctgaccatt tcctctctgc agccggaaga tttcgcgacc 420 tactactgtg ctcagggtgc ggcactgcca cgtacttttg gccagggtac gaaagtcgag 480 attaaacgtt aatga 495 <210> 16 <211> 444 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAT0116 - nucleic acid sequence (from mammalian construct) <400> 16 catggtgaag gaacatttac cagtgacttg tcaaaacaga tggaagagga ggcagtgcgg 60 ttatttattg agtggcttaa gaacggagga ccaagtagcg gggcacctcc gccatcgggt 120 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 180 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 240 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 300 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 360 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtgcggcgt tgcctaggac gttcggccaa 420 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 444 <210> 17 <211> 447 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAT0116 - nucleic acid sequence (from E.coli construct) <400> 17 cacggtgaag gtaccttcac ctctgacctg agcaaacaga tggaggaaga agcggttcgt 60 ctgttcatcg agtggctgaa aaacggtggt ccgtcttctg gtgctccgcc accgtctgac 120 atccagatga ctcagtcccc aagctctctg tctgcctccg ttggcgatcg tgttacgatc 180 acgtgccgtg cttctcagtg gatcggttcc cagctgtcct ggtatcagca gaaaccgggc 240 aaagccccga aactcctgat catgtggcgt agctctctgc agtctggtgt accgagccgc 300 ttctctggtt ctggttctgg taccgacttc accctgacca tttcctctct gcagccggaa 360 gatttcgcga cctactactg tgctcagggt gcggcactgc cacgtacttt tggccagggt 420 acgaaagtcg agattaaacg ttaatga 447 <210> 18 <211> 564 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAT0117 - nucleic acid sequence (from mammalian construct) <400> 18 catggtgaag gaacatttac cagtgacttg tcaaaacaga tggaagagga ggcagtgcgg 60 ttatttattg agtggcttaa gaacggagga ccaagtagcg gggcacctcc gccatcgggt 120 aaagaagcgg cggcgaaaga agcggcggcg aaagaagcgg cggcgaaaga attggccgca 180 aaagaagcgg cggcgaaaga agcggcggcg aaagaagcgg cggcgaaaga attggccgca 240 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 300 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 360 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 420 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 480 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtgcggcgt tgcctaggac gttcggccaa 540 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 564 <210> 19 <211> 567 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAT0117 - nucleic acid sequence (from E.coli construct) <400> 19 cacggtgaag gtaccttcac ctctgacctg agcaaacaga tggaggaaga agcggttcgt 60 ctgttcatcg agtggctgaa aaacggtggt ccgtcttctg gtgctccgcc accgtctaaa 120 gaagcggcgg cgaaagaagc ggcggcgaaa gaagcggcgg cgaaagaatt ggccgcaaaa 180 gaagcggcgg cgaaagaagc ggcggcgaaa gaagcggcgg cgaaagaatt ggccgcagac 240 atccagatga ctcagtcccc aagctctctg tctgcctccg ttggcgatcg tgttacgatc 300 acgtgccgtg cttctcagtg gatcggttcc cagctgtcct ggtatcagca gaaaccgggc 360 aaagccccga aactcctgat catgtggcgt agctctctgc agtctggtgt accgagccgc 420 ttctctggtt ctggttctgg taccgacttc accctgacca tttcctctct gcagccggaa 480 gatttcgcga cctactactg tgctcagggt gcggcactgc cacgtacttt tggccagggt 540 acgaaagtcg agattaaacg ttaatga 567 <210> 20 <211> 459 <212> DNA <213> DAT0118 - nucleic acid sequence (from mammalian c) <220> <223> DAT0118 - nucleic acid sequence (from mammalian construct) <400> 20 catggtgaag ggacctttac cagtgatgta agttcttatt tggaaggcca agctgccaag 60 gaattcattg cttggctggt gaaaggccga ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggcagc 120 ggcggtggcg ggtcggacat ccagatgacc cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta 180 ggagaccgtg tcaccatcac ttgccgggca agtcagtgga ttgggtctca gttatcttgg 240 taccagcaga aaccagggaa agcccctaag ctcctgatca tgtggcgttc ctcgttgcaa 300 agtggggtcc catcacgttt cagtggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc 360 agcagtctgc aacctgaaga ttttgctacg tactactgtg ctcagggtgc ggcgttgcct 420 aggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacgg 459 <210> 21 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAT0119 - nucleic acid sequence (from mammalian construct) <400> 21 catggtgaag ggacctttac cagtgatgta agttcttatt tggaaggcca agctgccaag 60 gaattcattg cttggctggt gaaaggccga ggaccaagct cggacatcca gatgacccag 120 tctccatcct ccctgtctgc atctgtagga gaccgtgtca ccatcacttg ccgggcaagt 180 cagtggattg ggtctcagtt atcttggtac cagcagaaac cagggaaagc ccctaagctc 240 ctgatcatgt ggcgttcctc gttgcaaagt ggggtcccat cacgtttcag tggcagtgga 300 tctgggacag atttcactct caccatcagc agtctgcaac ctgaagattt tgctacgtac 360 tactgtgctc agggtgcggc gttgcctagg acgttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc 420 aaacgg 426 <210> 22 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAT0120 - nucleic acid sequence (from mammalian construct) <400> 22 catggtgaag ggacctttac cagtgatgta agttcttatt tggaaggcca agctgccaag 60 gaattcattg cttggctggt gaaaggccga ggaaaagaag cggcggcgaa agaagcggcg 120 gcgaaagaag cggcggcgaa agaattggcc gcaaaagaag cggcggcgaa agaagcggcg 180 gcgaaagaag cggcggcgaa agaattggcc gcagacatcc agatgaccca gtctccatcc 240 tccctgtctg catctgtagg agaccgtgtc accatcactt gccgggcaag tcagtggatt 300 gggtctcagt tatcttggta ccagcagaaa ccagggaaag cccctaagct cctgatcatg 360 tggcgttcct cgttgcaaag tggggtccca tcacgtttca gtggcagtgg atctgggaca 420 gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa cctgaagatt ttgctacgta ctactgtgct 480 cagggtgcgg cgttgcctag gacgttcggc caagggacca aggtggaaat caaacgg 537 <210> 23 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dom7h-14 - nucleic acid sequence <400> 23 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtgcggcgt tgcctaggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 24 <211> 163 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin 4, (G4S)3, linker DOM7h-14-10 fusion (DMS7139) <400> 24 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 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<211> 108 <212> PRT <213> DOM7h-11-15Artificial Sequence <220> <223> DOM7h-11-15 <400> 27 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Pro Ile Gly Thr Met 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Leu Ala Phe Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Ala Gly Thr His Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpT AWA signal peptide (leader) <400> 28 Met Arg Ala Lys Leu Leu Gly Ile Val Leu Thr Thr Pro Ile Ala Ile 1 5 10 15 Ser Ala Trp Ala 20 <210> 29 <211> 489 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin 4, (G4S)3, linker DOM7h-14-10 fusion (DMS7139) <400> 29 catggtgaag gaacatttac cagtgacttg tcaaaacaga tggaagagga ggcagtgcgg 60 ttatttattg agtggcttaa gaacggagga ccaagtagcg gggcacctcc gccatcgggt 120 ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggcagc ggcggtggcg ggtcggacat ccagatgacc 180 cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta ggagaccgtg tcaccatcac ttgccgggca 240 agtcagtgga ttgggtctca gttatcttgg taccagcaga aaccagggaa agcccctaag 300 ctcctgatca tgtggcgttc ctcgttgcaa agtggggtcc catcacgttt cagtggcagt 360 ggatctggga cagatttcac tctcaccatc agcagtctgc aacctgaaga ttttgctacg 420 tactactgtg ctcagggttt gaggcatcct aagacgttcg gccaagggac caaggtggaa 480 atcaaacgg 489 <210> 30 <211> 489 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin 4, (G4S)3, linker DOM7h-11-115 fusion (DMS7143) <400> 30 catggtgaag gaacatttac cagtgacttg tcaaaacaga tggaagagga ggcagtgcgg 60 ttatttattg agtggcttaa gaacggagga ccaagtagcg gggcacctcc gccatcgggt 120 ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggcagc ggcggtggcg ggtcggacat ccagatgacc 180 cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta ggagaccgtg tcaccatcac ttgccgggca 240 agtcgtccga ttgggacgat gttaagttgg taccagcaga aaccagggaa agcccctaag 300 ctcctgatcc ttgctttttc ccgtttgcaa agtggggtcc catcacgttt cagtggcagt 360 ggatctggga cagatttcac tctcaccatc agcagtctgc aacctgaaga ttttgctacg 420 tactactgcg cgcaggctgg gacgcatcct acgacgttcg gccaagggac caaggtggaa 480 atcaaacgg 489 <210> 31 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dom7h-14-10 - nucleic acid <400> 31 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtttgaggc atcctaagac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 32 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dom7h-11-15 - nucleic acid <400> 32 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtcg tccgattggg acgatgttaa gttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatccttgct ttttcccgtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgcgcgcag gctgggacgc atcctacgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 33 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpAWA signal peptide - nucleic acid sequence <400> 33 atgcgggcga aactcctagg aatagtcctg acaaccccta tcgcgatcag cgcttgggcc 60 <210> 34 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ompA (E. coli derived) <400> 34 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala 20 <210> 35 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ompA-AMA (artificial sequence) <400> 35 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Met Ala 20 <210> 36 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ompA-AWA <400> 36 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Trp Ala 20 <210> 37 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ompT (E. coli derived) <400> 37 Met Arg Ala Lys Leu Leu Gly Ile Val Leu Thr Thr Pro Ile Ala Ile 1 5 10 15 Ser Ser Phe Ala 20 <210> 38 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ompT-AMA <400> 38 Met Arg Ala Lys Leu Leu Gly Ile Val Leu Thr Thr Pro Ile Ala Ile 1 5 10 15 Ser Ala Met Ala 20 <210> 39 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GAS (S. cerevisiae derived) <400> 39 Met Leu Phe Lys Ser Leu Ser Lys Leu Ala Thr Ala Ala Ala Phe Phe 1 5 10 15 Ala Gly Val Ala Thr Ala 20 <210> 40 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GAS-AMA <400> 40 Met Leu Phe Lys Ser Leu Ser Lys Leu Ala Thr Ala Ala Ala Phe Phe 1 5 10 15 Ala Gly Val Ala Met Ala 20 <210> 41 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GAS-AWA <400> 41 Met Leu Phe Lys Ser Leu Ser Lys Leu Ala Thr Ala Ala Ala Phe Phe 1 5 10 15 Ala Gly Val Ala Trp Ala 20 <210> 42 <220> <223> DOM7h-14-10R108C <400> 42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ser Gln 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly Leu Arg His Pro Lys 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Cys 100 105 <210> 43 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PYY 3-36 (with a lysine at position 10) <400> 43 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Lys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 44 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM 7h-14-10 R108C - nucleic acid sequence <400> 44 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtttgaggc atcctaagac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa atgt 324 <210> 45 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cynomolgus GLP-1 receptor cDNA sequence <400> 45 atggccggca cccccggccc gctgcgcctc gcgctcctgc tgctcggggt ggtgggcagg 60 gccggccccc gcccccaggg tgccactgtg tccctctggg agacggtgca gaaatggcga 120 gaataccgac gccagtgcca gcgctccctg actgaggacc cacctcccgc cacagacttg 180 ttctgcaacc ggaccttcga tgaatatgcc tgctggccag atggggagcc aggctccttc 240 gtgaatgtca gctgcccctg gtacctgccc tgggccagca gtgtgccgca gggccacgtg 300 taccggttct gcacagctga aggcctctgg ctgcagaagg acaactccag cctgccctgg 360 agggacttgt cggagtgtga ggagtccaag cgaggggaga gaaattcccc ggaggagcag 420 ctcctgtccc tctacatcat ctacacggtg ggctacgcac tctccttctc tgctctggtt 480 atcgcctctg cgatcctcct tggcttcaga cacctgcact gcacccggaa ctacatccac 540 ctgaacctgt ttgcatcctt catcctgcga gcattgtccg tcttcatcaa ggacgcagcc 600 ctcaagtgga tgtacagcac ggccgcccag cagcaccagt gggatgggct cctctcctac 660 caggactctc tgggctgccg cgtggtgttt ctgctcatgc aatactgtgt ggcggccaat 720 tactactggc tcttggtgga gggcgtgtac ctgtacacac tgctggcctt ctcggtcttc 780 tctgagcaac gaatcttcag gctgtatgtg agcgtaggct ggggtgttcc cctgctgttt 840 gttgtcccct ggggcattgt caagtacctc tatgaggacg agggctgctg gaccaggaac 900 tccaacatga actactggct cattatccgg ctgcccattc tctttgccat tggggtgaac 960 ttcctcatct ttgttcgggt catctgcatc gtggtatcca aactgaaggc caatctcatg 1020 tgcaagacag acatcaaatg cagacttgcc aagtccacgc tgacactcat ccccctgctg 1080 gggactcatg aggtcatctt tgcctttgtg atggacgagc atgcccgggg caccctgcgc 1140 ttcatcaagc tgttcacgga gctctccttt acctccttcc aggggctgat ggtggccatc 1200 ttgtactgct ttgtcaacaa tgaggtccag ttggaatttc ggaagagctg ggagcgctgg 1260 cggcttgagc acttgcacat ccagagggac agcagcatga agcccctcaa gtgtcccacc 1320 agcagcctga gcagtggggc cacggcgggc agcagcatgt acacagccac ttgccaggcc 1380 tcctgcagc 1389 <210> 46 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pel B <400> 46 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala 20 <210> 47 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide 1 <400> 47 ggaattccat atgaaaatca aaaccggtgc tcgcatcctg gctctgtccg ctctgaccac 60 tatgatgttc tccgcttccg cgctggctca tggtgaagga acatttacca gtgac 115 <210> 48 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide 2 <400> 48 gttcagaatt cttattaccg tttgatttcc accttggtcc cttg 44 <210> 49 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mal E signal sequence <400> 49 Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr 1 5 10 15 Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala 20 25 <210> 50 <211> 489 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DMS 7139 nucleic acid sequence for E.coli expression <400> 50 cacggtgaag gtacgttcac ctctgacctg agcaaacaga tggaggaaga agcggttcgt 60 ctgttcatcg agtggctgaa aaacggtggt ccgtcttctg gtgctccgcc gccgtctggt 120 ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct ggtggtggtg gcagcgatat ccagatgact 180 cagtccccgt cttctctctc cgcctctgtt ggcgaccgtg ttaccatcac ttgtcgtgcg 240 agccagtgga tcggttccca gctgagctgg tatcagcaga aaccgggcaa agcgccgaaa 300 ctgctgatca tgtggcgctc tagcctgcag tctggtgtac cgtctcgttt ctccggctct 360 ggttctggta cggacttcac cctcacgatc tcttccctgc agccggaaga ctttgccacc 420 tactactgcg cacagggtct gcgtcacccg aaaaccttcg gtcagggtac caaagtcgag 480 atcaaacgt 489

Claims (39)

  1. 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물 (a)를 다음 (i) 내지 (iv)로부터 선택된 혈청 알부민에 결합하는 dAb (b)와의 융합체 또는 컨쥬게이트로 포함하거나 이들로 구성되는 융합체 또는 컨쥬게이트 조성물:
    (i) DOM 7h-14 도메인 항체(dAb) (DOM 7h-14의 아미노산 서열은 도 1b(h)에 도시되어있음: SEQ ID NO 8), (ii) DOM 7h-14-10 도메인 항체(dAb) (DOM 7h-14-10의 아미노산 서열은 도 1c-d(o)에 도시되어있음: SEQ ID NO 26) 또는 DOM 7h-14-10 dAb의 서열과 4개 이하의 아미노산이 상이한 dAb, (iii) DOM 7h-11-15 dAb (DOM 7h-11-15의 아미노산 서열은 도 1d(p)에 도시되어있음: SEQ ID NO 27), 또는 (iv) DOM 7h-14-10 R108C 도메인 항체(dAb) (DOM 7h-14-10의 아미노산 서열은 도 1d(r)에 도시되어있음).
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 약물은 엑센딘-4, GLP-1 분자, 또는 PYY 분자, 또는 상기 본래의 분자의 결합 활성을 유지하는 이의 돌연변이체 또는 유도체인 융합체 또는 컨쥬게이트.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 약물은 (a) 도 1b(i)에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO 9)를 갖는 GLP-1 (7-37) A8G 돌연변이체, 또는 (b) 도 1b-c(j)에 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO 10)을 갖는 엑센딘-4 분자, 또는 (c) 위치 10에서 리신을 갖고 도 1d(s)에 도시된 아미노산 서열을 갖는 PYY3-36 또는 PYY 3-36로부터 선택되는 융합체 또는 컨쥬게이트.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 및 dAb를 연결하는 아미노산 또는 화학적 링커를 포함하는 융합체 또는 컨쥬게이트.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 아미노산 링커는 도 1c(k)에서 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO 11)을 갖는 나선형 링커, 또는 도 1c(l)에서 도시된 아미노산 서열(SEQ ID NO 12)을 갖는 gly-ser 링커인 융합체 또는 컨쥬게이트.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물은 dAb의 N-말단 또는 C-말단에서 융합체의 일부로서 존재하는 융합체 또는 컨쥬게이트.
  7. 제 6 항에 있어서, 다음 (a) 내지 (c)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지는 융합체 또는 컨쥬게이트:
    (a) 엑센딘 4, (G4S)3, 링커 DOM7h-14-10 융합체 (DMS7139)
    Figure pct00013

    (SEQ ID NO 24);
    (b) 엑센딘 4, (G4S)3, 링커 DOM7h-l1-15 융합체 (DMS7143)
    Figure pct00014

    (SEQ ID NO 25); 및
    (c) 리신(PYY의 위치 10에 도입됨) 및 도 14에서 도시한 4개 반복 PEG 링커를 통해, C-말단에서 아미드화된 PYY3-36에 컨쥬게이션된 DOM 7h-14-10 (R108C) AlbudAb인 펩티드 컨쥬게이트.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 dAb는 PEG 기, 혈청 알부민, 트렌스페린, 트렌스페린 수용체 또는 이의 적어도 트렌스페린 결합 부분, 항체 Fc 영역으로부터 선택된 분자(들)을 상기 dAb에 부착하거나 항체 도메인으로의 컨쥬게이션에 의해 그의 유체역학적 크기를 증가시키도록 추가로 포맷되는(formatted) 융합체 또는 컨쥬게이트.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항에 있어서, 추가의 펩티드 또는 폴리펩티드 부분을 포함하는 융합체 또는 컨쥬게이트.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중의 어느 한 항에 있어서, DOM 7h-14-10 또는 DOM 7h-11-15 dAb에 대하여 동일 또는 상이한 결합 특이성을 갖는 추가의 dAb 부분들을 포함하는 융합체 또는 컨쥬게이트.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중의 어느 한 항에 있어서, 12 시간 이상, 예를 들어, 12시간 내지 21일의 제거 반감기를 갖는 융합체 또는 컨쥬게이트.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중의 어느 한 항에 있어서, 약 5 마이크로몰 내지 약 1 피코몰의 KD로 인간 혈청 알부민에 결합하는 융합체 또는 컨쥬게이트.
  13. 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 제 1 항 내지 제 12 항 중의 어느 한 항에 따른 융합체 또는 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 추가의 치료제 또는 활성제를 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 개체에게 개별 투여, 순차 투여 또는 동시 투여되는, (a) 제 1 항 내지 제 12 항 중의 어느 한 항에 따른 융합체 또는 컨쥬게이트 및 (b) 추가의 치료제 또는 활성제를 포함하는 조성물.
  16. 제 13 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항에 있어서, 대사성 질병 또는 장애를 치료하기 위한 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 질병 또는 장애는 고혈당증, 내당능 장애, 베타 세포 결핍, 당뇨병(제1형 또는 제2형 당뇨병 또는 임신성 당뇨병), 비만, 또는 과식에 특징이 있는 질병으로부터 선택되는 조성물.
  18. 대사성 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약물의 제조에서, 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  19. 피하, 정맥내 또는 근육내 주사를 통해 개체에게 전달하기 위한 약물의 제조에서, 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  20. 비경구, 경구, 직장, 경점막, 안내, 폐내 또는 위장관 전달을 위한 약물의 제조에서, 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  21. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 예방 또는 치료적 유효량의 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 대사성 질병을 치료 또는 예방하는 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 경구용, 주사가능하거나, 흡입가능하거나 분무가능한(nebulisable) 제제.
  23. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 예를 들어 좌약 형태의 지속 방출 제제.
  24. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 동결 건조 제제.
  25. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 전달 기구.
  26. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 융합체, 예를 들어 SEQ ID NO 50, 30, 29 및 15 내지 22에서 선택된 서열의 융합체를 엔코딩하는 분리된 핵산 또는 재조합 핵산.
  27. 제 7 항 또는 제 8 항의 융합체 중 어느 하나를 엔코딩하는 핵산.
  28. 제 27 항 또는 제 28 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  29. 제 27 항 또는 제 28 항의 핵산 또는 제 28 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  30. (a) 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물과, (b) 상기 (a)와 융합체로서 존재하는 것으로, DOM 7h-14-10, DOM 7h-14-10 R108C, 또는 DOM 7h-11-15 도메인 항체(dAb)로부터 선택된 dAb를 포함하거나 그것들로 이루어지는 융합 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 제 29 항의 숙주 세포를 상기 핵산 또는 벡터의 발현에 적당한 조건하에서 유지시켜 융합 폴리펩티드를 제조하는 것을 포함하는 방법.
  31. 환자, 예를 들어, 인간 환자에서 혈중 글루코스 상승과 관련된 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 치료적 또는 예방적 유효량의 조성물을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  32. 환자, 예를 들어, 인간 환자에서 인슐린 생성을 자극 및/또는 인슐린 민감성을 증가시키는 방법으로서, 적어도 1회 용량의 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  33. C 말단 끝에서 아미노산 서열 AMA 또는 AWA를 지니는, 야생형 서열이 아닌 변형된 리더 서열.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 서열은 OmpA-AMA 또는 -AWA; 또는 OmpT-AMA 또는 -AWA; 또는 GAS-AMA 또는 -AWA로부터 선택되는 변형된 리더 서열.
  35. 숙주 세포에서 이종 폴리펩티드의 발현을 위한, 제 33 항 또는 제 34 항의 변형된 리더 서열의 용도.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 이종 폴리펩티드는 도메인 항체(dAb), 예를 들어 혈청 알부민에 결합하는 dAb를 포함하는 용도.
  37. 제 35 항 또는 36 항에 있어서, 상기 이종 폴리펩티드는 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물을 포함하거나 그것으로 구성되는 용도.
  38. (i) 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물 및 (ii) 상기 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물의 N-말단에서 2개의 아미노산이 결실된 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물의 혼합물을 제조하는 방법으로서, 상기 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물의 위치 1 앞 절단 및 위치 3 앞 절단을 초래하는 리더 서열을 이용하여 숙주 세포에서 상기 (i)을 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
  39. 제 38 항의 방법에 의해 얻어지거나 얻어질 수 있는 혼합물로서, (i) 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물 및 (ii) 상기 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물의 N-말단에서 2개의 아미노산이 결실된 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 약물의 혼합물.
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