WO2022015039A1 - 글루카곤-유사 펩타이드-1 및 글루카곤-유사 펩타이드-2를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

글루카곤-유사 펩타이드-1 및 글루카곤-유사 펩타이드-2를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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장명호
이경화
김지현
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Definitions

  • the present invention relates to a dimer protein including glucagon-like peptide-1 (GLP-1) and glucagon-like peptide-2 (GLP-2), further comprising IL-10, and degenerative brain disease using the same, specifically To a composition for treating Alzheimer's disease.
  • GLP-1 glucagon-like peptide-1
  • GLP-2 glucagon-like peptide-2
  • Degenerative brain disease is a disease in which degenerative changes appear in nerve cells of the central nervous system, causing various symptoms such as impairment of motor and sensory functions, and inhibition of higher-order functions such as memory, learning, and computational reasoning.
  • Representative diseases include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and memory disorders.
  • Alzheimer's disease is largely classified into hereditary Alzheimer's disease (FAD) and sporadic Alzheimer's disease (SAD).
  • Hereditary Alzheimer's disease accounts for 5-10% of all Alzheimer's disease patients, and presenilin 1 (PS1), amyloid precursor protein (APP) and presenilin 2 ( If a mutation occurs in presenilin 2, PS2), Alzheimer's disease occurs.
  • Sporadic Alzheimer's disease accounts for most of Alzheimer's disease patients, and it is known that a mutation in apolipoprotein E (ApoE) or alpha-2 macroglobulin (A2M) increases the probability of progression to Alzheimer's disease (Maowen Ba et.al. , Transl Neurodegener. , 5(20):1-4, 2016).
  • ApoE apolipoprotein E
  • A2M alpha-2 macroglobulin
  • Alzheimer's disease pathological features include senile plaques that accumulate on the outside of nerve cells, neurofibrillary tangles that look like bundles of threads tangled in the cell body of nerve cells, and neuronal loss. can be heard These pathological features appear in all cases of hereditary Alzheimer's disease and sporadic Alzheimer's disease. Among them, a toxic protein called aggregated amyloid beta peptide (A ⁇ ) has been identified as a major component of senile plaque. Necrosis of cranial nerve cells occurs due to amyloid beta peptide, which leads to Alzheimer's disease (Reisa Sperling et.al. , Neuron , 84(3):608-622, 2014).
  • a ⁇ aggregated amyloid beta peptide
  • Alzheimer's disease drugs are mostly neurodegenerative mitigating substances that relieve symptoms. Most of these are anti-inflammatory drugs and have side effects such as hepatotoxicity and damage to the mucous membrane of the digestive system.
  • the above therapeutic agents have a limitation in that they are limited to symptomatic therapy rather than ultimate cause treatment. Therefore, there is a need to discover a new concept of treatment through a revolutionary idea change.
  • the present inventors studied to effectively treat and prevent degenerative brain diseases, particularly Alzheimer's disease.
  • the dimer protein which includes glucagon-like peptide 1 (GLP-1) and glucagon-like peptide 2 (GLP-2), and additionally includes IL-10, has anti-inflammatory and autophagy ( was found to be associated with the enhancement of autophagy).
  • the above-described dimer protein improved amyloid beta plaque deposition in the brain of an animal model of Alzheimer's disease and had a significant effect in cognitive function and behavioral tests. Accordingly, the present invention was completed by revealing that a dimer protein including GLP-1/GLP-2 and IL-10 can be used as a novel treatment for degenerative brain disease.
  • a first monomer comprising GLP-1 or a variant thereof; and a second monomer comprising GLP-2 or a variant thereof.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative brain disease comprising the dimer protein.
  • Another aspect of the present invention provides a polynucleotide encoding the first monomer, a vector including the polynucleotide, and a transformed cell into which the vector is introduced.
  • Another aspect of the present invention comprises the steps of i) culturing the transformed cell; And ii) recovering the first monomer; provides a method for producing a first monomer comprising a.
  • Another aspect of the present invention provides a polynucleotide encoding the second monomer, a vector including the polynucleotide, and a transformed cell into which the vector is introduced.
  • Another aspect of the present invention comprises the steps of i) culturing the transformed cell; And ii) recovering the second monomer; provides a method for producing a second monomer comprising a.
  • Another aspect of the present invention provides a vector including a polynucleotide encoding the first monomer, a vector including a polynucleotide encoding the second monomer, and a transformed cell into which the vector is introduced.
  • Another aspect of the present invention comprises the steps of i) culturing the transformed cell; And ii) recovering the dimer protein comprising the first monomer and the second monomer; provides a method for producing a dimer protein comprising a.
  • Another aspect of the present invention provides the use of the dimer protein for preparing a medicament for the prevention or treatment of degenerative brain disease.
  • Another aspect of the present invention provides a use for preventing or treating degenerative brain disease of the dimer protein for preventing or treating degenerative brain disease.
  • Another aspect of the present invention provides a method for preventing or treating degenerative brain disease comprising administering the dimer protein to an individual.
  • composition comprising GLP-1/GLP-2 and IL-10 dimer protein according to the present invention can inhibit the production of amyloid beta, which is known as a causative agent of Alzheimer's disease. That is, the dimer protein improves the deposition of amyloid beta plaques and has an excellent effect on improving memory and cognitive function, so a composition comprising the same can prevent or treat degenerative brain diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, and improve cognitive impairment can be effectively used for
  • FIG. 1 is a view showing a simplified structure of the dimer protein GI-210 (GLP-1 / GLP-2-IgG1 Fc knob in hole-IL-10 mutant) according to the present invention.
  • Figure 2 is a diagram showing a simplified structure of the dimer protein GI-211 (GLP-1 / GLP-2-IgG1 Fc knob in hole-IL-10 mutant) according to the present invention.
  • 3 is a diagram showing the simplified structure of the dimer protein GI-210-CN (GLP-1 / GLP-2-IgG1 Fc knob in hole) used as a control in the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing a simplified structure of the dimer protein GI-210-C1 (IgG1 Fc knob in hole-IL-10 mutant) used as a control in the present invention.
  • 5 is a view confirming the dimer protein GI-210 by SDS-PAGE.
  • FIG. 6 is a view confirming the dimer protein GI-210 by Western blot.
  • FIG. 9 is a view confirming the TNF- ⁇ secretion inhibitory ability of the dimeric protein GI-210 fusion protein in microglia.
  • 10 is a view confirming the inhibitory ability of nitrite secretion in microglia of the dimer protein GI-210 fusion protein.
  • FIG. 11 is a diagram schematically illustrating an experimental design for confirming the Alzheimer's disease treatment effect of the dimer proteins GI-210 and GI-211 according to the present invention.
  • FIG. 12 is a diagram schematically showing the administration schedule of the dimer protein GI-210 according to the present invention and the cognitive behavior evaluation schedule after administration.
  • veh is saline as a vehicle
  • GI is the dimer protein GI-210
  • WT is a normal control mouse without Alzheimer's disease
  • Tg is an experimental group mouse with Alzheimer's disease.
  • FIG. 13 is a diagram schematically showing the administration schedule of the dimer protein GI-211 according to the present invention and the cognitive behavior evaluation schedule after administration.
  • veh is saline as a vehicle
  • GI is the dimer protein GI-211
  • WT is a normal control mouse without Alzheimer's disease
  • Tg is an experimental group mouse with Alzheimer's disease.
  • FIG. 14 is a view showing the results of a new substance search experiment (NOR test) on Tg-APP/PS1 mice after administration of GI-210 according to the present invention, maintaining memory of GI-210 for Alzheimer's disease animal model; It is a drawing confirming the improvement effect.
  • WT is a normal control mouse without Alzheimer's disease
  • Tg is an experimental group mouse with Alzheimer's disease.
  • FIG. 15 is a view showing the results of performing a passive avoidance test on Tg-APP/PS1 mice after administration of GI-210 according to the present invention, and maintaining the memory of GI-210 in an animal model of Alzheimer's disease; and a drawing confirming the improvement effect.
  • WT is a normal control mouse without Alzheimer's disease
  • Tg is an experimental group mouse with Alzheimer's disease.
  • 16 is a view showing the results of performing a water maze test on Tg-APP/PS1 mice after GI-210 administration according to the present invention. Learning ability of GI-210 for Alzheimer's disease animal model It is a drawing confirming the effect of maintaining and improving memory.
  • WT is a normal control mouse without Alzheimer's disease
  • Tg is an experimental group mouse with Alzheimer's disease.
  • FIG. 17 is a view showing the results of a new substance search experiment (NOR test) on Tg-APP/PS1 mice after administration of GI-211 according to the present invention, maintaining memory of GI-211 in an animal model of Alzheimer's disease It is a drawing confirming the improvement effect.
  • WT is a normal control mouse without Alzheimer's disease
  • Tg is an experimental group mouse with Alzheimer's disease.
  • FIG. 18 is a view showing the results of performing a passive avoidance experiment on Tg-APP/PS1 mice after GI-211 administration according to the present invention. It is a drawing.
  • WT is a normal control mouse without Alzheimer's disease
  • Tg is an experimental group mouse with Alzheimer's disease.
  • FIG. 19 is a view showing the results of performing a water maze experiment on Tg-APP/PS1 mice after GI-211 administration according to the present invention. Maintaining and improving the learning ability and memory of GI-211 for an animal model of Alzheimer's disease. It is a drawing confirming the effect.
  • WT is a normal control mouse without Alzheimer's disease
  • Tg is an experimental group mouse with Alzheimer's disease.
  • FIG. 20 is a diagram showing the analysis of the effect of improving plaque deposition by GI-210 according to the present invention. Specifically, the degree of plaque deposition in the brain of Tg-APP/PS1 mice through Thioflavin S staining after GI-210 administration. is a confirmed drawing.
  • A) is a graph showing the quantification of the number of plaques per unit area
  • B) is a graph showing the quantification of the sum of plaque areas.
  • C) is an image showing thioflavin S-stained plaque deposition sites in the brains of Tg-APP/PS1 mice and GI-210-treated Tg-APP/PS1 mice.
  • Pacx is the parietal cortex
  • dHP is the dorsal hippocampus
  • Pircx is the piriform cortex region.
  • BLA is the basolateral amygdala.
  • FIG. 21 is a view showing the analysis of the effect of inhibiting amyloid beta peptide (A ⁇ ) production by GI-210 according to the present invention. Specifically, the brain of Tg-APP/PS1 mice through ELISA assay after GI-210 administration. It is a graph showing the quantification of the production level of soluble A ⁇ 1-42 and insoluble A ⁇ 1-42 in .
  • WT is a normal control mouse without Alzheimer's disease
  • Tg is an experimental group mouse with Alzheimer's disease.
  • FIG. 22 is a diagram showing the effect of improving plaque deposition by GI-211 according to the present invention. Specifically, the degree of plaque deposition in the brain of Tg-APP/PS1 mice through Thioflavin S staining after GI-211 administration. is a confirmed drawing.
  • A) is a graph showing the quantification of the number of plaques per unit area
  • B) is a graph showing the quantification of the sum of plaque areas.
  • C) is an image showing thioflavin S-stained plaque deposition sites in the brains of Tg-APP/PS1 mice and GI-211-treated Tg-APP/PS1 mice.
  • Pacx is the parietal cortex
  • dHP is the dorsal hippocampus
  • Pircx is the parietal cortex region.
  • BLA is also the basolateral amygdala.
  • FIG. 23 is the result of quantifying the Iba-1 expression level by area and fluorescence intensity through immunofluorescence staining of microglia (Iba-1) in the brain of Tg-APP/PS1 mice administered with GI-210 according to the present invention.
  • Iba-1 microglia
  • Tg-APP/PS1 mice administered with GI-210 is a diagram showing Here, WT is a normal control mouse without Alzheimer's disease, and Tg is an experimental group mouse with Alzheimer's disease.
  • FIG. 24 is a view showing the results of quantifying the GFAP expression level by area and fluorescence intensity through immunofluorescence staining of astrocytes (GFAP) in the brain of Tg-APP/PS1 mice administered with GI-210 according to the present invention.
  • WT is a normal control mouse without Alzheimer's disease
  • Tg is an experimental group mouse with Alzheimer's disease.
  • 25 is a view showing the result of quantifying the expression level of autophagy-related protein LC3 in the brain of Tg-APP/PS1 mice administered with GI-210 according to the present invention by immunofluorescence staining and quantifying the LC3 expression level with fluorescence intensity. .
  • One aspect of the present invention a first monomer comprising GLP-1 or a variant thereof; and a second monomer comprising GLP-2 or a variant thereof.
  • GLP-1 glucagon-like peptide-1
  • glucagon-like peptide-1 is an incretin derived from a transcription product of a proglucagon gene, a prohormone. , a hormone secreted by L cells of the intestine when stimulated by the concentration of nutrients or blood sugar in the intestine. Therefore, it is currently being researched and developed as a drug capable of effectively lowering blood sugar in the treatment of diabetes.
  • GLP-1 consists of 30 amino acids, and the amino acid sequence of GLP-1 is known to be 100% identical in all mammals. It is known that glucagon is produced in islet ⁇ cells and GLP-1 is produced in L-cells of the ileum and colon by a post-transcriptional process from proglucagon. Specifically, the GLP-1 may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • GLP-1 or a variant thereof is collectively referred to as "GLP-1".
  • GLP-1 and GLP-1 variants specifically bind to, for example, the GLP-1 receptor (GLP-1R, glucagon-like peptide-1 receptor). This specific binding can be confirmed by methods known to those skilled in the art.
  • GLP-1 mutant refers to a form in which a portion of the amino acid of full-length GLP-1 is substituted, deleted, added, and/or inserted. That is, the GLP-1 mutant may have an amino acid sequence different from that of wild-type GLP-1. However, the GLP-1 mutant may have an activity equivalent to or similar to that of wild-type GLP-1.
  • GLP-1 activity may refer to, for example, specific binding to a GLP-1 receptor, and this specific binding may be measured by a method known to those skilled in the art.
  • the GLP-1 mutant may include deletion, modification, substitution and/or addition of some amino acids of wild-type GLP-1, which may be prepared by a method known to those skilled in the art.
  • the GLP-1 variant may include at least 5 or more, at least 10 or more, at least 15 or more, or at least 20 or more amino acids of the wild-type GLP-1 sequence.
  • the GLP-1 mutant may be one in which some amino acids of wild-type GLP-1 are substituted and/or added.
  • the second and 30th amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are substituted with other amino acids, and a 9 amino acid sequence is added to the C-terminus can
  • An amino acid may be substituted with another amino acid, and a 9 amino acid sequence may be added to the C-terminus.
  • the 28th amino acid is substituted with another amino acid, and one amino acid sequence is added to the C-terminus.
  • the "amino acid” introduced by the substitution and/or addition is glycine (glycine, G), leucine (L), lysine (K), glutamine (Q), methionine (M) , glutamic acid (E), valine (V), arginine (R), asparagine (N), proline (P), serine (S) and alanine (A) It may be any one selected from the group consisting of.
  • the GLP-1 variant may be one in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with A2G and R30G, and the 9 amino acid sequence PSSGAPPPS (SEQ ID NO: 44) is added to the C-terminus.
  • substitutions are made in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with A2G, V10L, S12K, Y13Q, L14M, G16E, Q17E, A19V, K20R, E21L, A24E, V27K, K28N and R30G, and a 9 amino acid sequence PSSGAPPPS at the C-terminus may be added.
  • substitution may occur with K28R in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and one amino acid sequence G may be added to the C-terminus.
  • the GLP-1 variant may have an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4.
  • the GLP-1 variant may be characterized in that the action time in vivo is extended. Wild-type GLP-1 is cleaved and inactivated at a very high rate by the enzyme DPP-4 (dipeptidyl peptidase-4) in vivo, and there are many difficulties in developing it as a drug. Accordingly, the GLP-1 mutant reduced cleavage by the DPP-4 enzyme by mutating wild-type GLP-1, and has a biological half-life significantly longer than that of wild-type GLP-1 (1 to 2 minutes). may have
  • the wild-type GLP-1 is processed in vivo so that the first 6 amino acids are cleaved from the molecule. Accordingly, by practice in the art, the amino terminus of GLP-1 is designated at 7 and the carboxy-terminus at 37. According to the above processing, it can be processed from GLP-1 (1-37), which has no insulin secretion function, to GLP-1 (7-37), to become active GLP-1 (7-37), and the C-terminal It can be further modified in vivo to remove the glycine residue and replace it with an amide group to form GLP-1(7-36) amide (amino acid sequence of SEQ ID NO: 1).
  • GLP-1 or "glucagon-like peptide-1” refers to any vertebrate, including mammals, eg, primates (eg, humans) and rodents (eg, mice and rats), unless otherwise noted. means any wild-type GLP-1 obtained from a source.
  • the GLP-1 may be obtained from animal cells, but includes those obtained from recombinant cells capable of producing GLP-1.
  • the GLP-1 may be wild-type GLP-1 or a variant thereof.
  • GLP-2 glucagon-like peptide-2
  • glucagon-like peptide-2 is produced in the form of proglucagon precursors in the enteroendocrine L-cells of the intestine and specific regions of the brain, It is a peptide hormone with 33 short amino acids produced through enzymatic cleavage by enzymes. In response to nutrient digestion with food intake, it is co-secreted with glucagon-like peptide-1 (GLP-1), oxyntomodulin (OXM) and glycentin.
  • GLP-1 glucagon-like peptide-1
  • OXM oxyntomodulin
  • GLP-2 induces mucosal growth in the small intestine and large intestine, promotes growth of enterocytes and crypt cells, and inhibits apoptosis. GLP-2 also increases the absorption of nutrients from the small intestine and decreases intestinal permeability. It inhibits gastric emptying and secretion of gastric acid, increases intestinal blood flow rate, and relaxes intestinal smooth muscle. GLP-2 has shown promising potential as a therapeutic agent in experimental models of various intestinal diseases and intestinal injuries due to its characteristics such as energy absorption and protection, and activation of intestinal cell functions.
  • the GLP-2 may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, but is not limited thereto.
  • GLP-2 or a variant thereof is collectively referred to as "GLP-2".
  • GLP-2 and GLP-2 variants specifically bind to, for example, the GLP-2 receptor (GLP-1R, glucagon-like peptide-2 receptor). This specific binding can be confirmed by methods known to those skilled in the art.
  • GLP-2 variant refers to a form in which a portion of the amino acid of full-length GLP-2 is substituted, deleted, added, and/or inserted. That is, the GLP-2 variant may have an amino acid sequence different from that of wild-type GLP-2. However, the GLP-2 mutant may have an activity equivalent to or similar to that of wild-type GLP-2.
  • GLP-2 activity may refer to, for example, specific binding to a GLP-2 receptor, and the specific binding may be measured by a method known to those skilled in the art.
  • the GLP-2 mutant may be one in which a portion of the amino acid of wild-type GLP-2 is deleted, modified, substituted, or added, which may be prepared by a method known to those skilled in the art.
  • the GLP-2 variant may include at least 5 or more, at least 10 or more, at least 15 or more, or at least 20 or more amino acids of the wild-type GLP-2 sequence.
  • the GLP-2 mutant may be one in which a portion of the amino acid of wild-type GLP-2 is substituted.
  • the second amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 may be substituted with another amino acid.
  • the "amino acid" introduced by the substitution may be glycine (G).
  • the GLP-2 mutant may be one in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 is substituted with A2G.
  • the GLP-2 variant may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the GLP-2 variant may be characterized in that the action time in vivo is extended. Wild-type GLP-2 is cleaved and inactivated at a very high rate by the DPP-4 enzyme in vivo, and there are many difficulties in developing it as a drug. Accordingly, the GLP-2 mutant is mutated in wild-type GLP-2 to reduce cleavage by the DPP-4 enzyme, and has a biological half-life that is significantly longer than that of wild-type GLP-2 (about 7 minutes). it could be
  • the GLP-2 analogue disclosed in US Patent No. 7745403 B2 may be used as another example of the GLP-2 mutant. Specifically, additional substitutions of amino acids at position 2, and positions 3, 5, 7, 10 and 11, and/or deletion of amino acids at positions 31 to 33, and/or stabilization at the N-terminus or C-terminus In addition to the addition of the peptide sequence, substitutions of amino acids at positions 8, 16, 24 and 28 may be included.
  • alanine (A), an amino acid at position 2, is glycine (G), serine (S), or valine (V), and aspartic acid (D), an amino acid at position 3, is glutamic acid (E)
  • the amino acid at position 5 serine (S) is threonine (T)
  • the amino acid at position 6 phenylalanine (F) is proline (P)
  • the amino acid at position 7 serine (S) is threonine (T)
  • the amino acid at position 8 aspartic acid (D) is serine (S)
  • the amino acid at position 9 glutamic acid (E) is aspartic acid (D)
  • the amino acid at position 10 methionine (M) is leucine (L), norleucine (Nle), or an oxidatively stable Met-replacement amino acid, wherein the amino acid at position 11, asparagine (N), is alanine (A), lysine (K), or serine (S), 12 Threonine (T),
  • GLP-2 or "glucagon-like peptide-2” refers to any vertebrate, including mammals, eg, primates (eg, humans) and rodents (eg, mice and rats), unless otherwise noted. Any wild-type GLP-2 obtained from a source.
  • the GLP-2 may be obtained from animal cells, but includes those obtained from recombinant cells capable of producing GLP-2.
  • the GLP-2 may be wild-type GLP-2 or a variant thereof.
  • first monomer refers to a monomer protein including GLP-1 or a variant thereof, and more specifically, a hinge region of an immunoglobulin Fc fragment binds to the hinge region of GLP-1 or a variant thereof to form one It refers to an Ig fusion protein of a monomeric structure formed from a polypeptide.
  • second monomer is a monomer protein including GLP-2 or a variant thereof, and more specifically, a hinge region of an immunoglobulin Fc fragment binds GLP-2 or a variant thereof to form one. It refers to an Ig fusion protein of a monomeric structure formed from a polypeptide.
  • the term "dimer protein” is a fusion protein comprising a first monomer protein and a second monomer protein, and the first monomer protein and the two monomer proteins have a disulfide bond at a hinge region. refers to an Ig fusion protein of a dimeric structure bound by
  • the 'first monomer' including GLP-1 or a variant thereof may further include IL-10 or a variant thereof.
  • IL-10 is a representative cytokine having an anti-inflammatory effect, mainly secreted from monocytes and lymphocytes, and TNF- ⁇ (tumor necrosis factor- ⁇ ) ), plays a role in regulating the production and secretion of inflammatory cytokines such as IL-6 (interleukin-6).
  • IL-6 interleukin-6
  • the IL-10 may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, but is not limited thereto.
  • IL-10 or a variant thereof is collectively referred to as "IL-10 protein” or "IL-10 polypeptide”.
  • IL-10 and IL-10 variants specifically bind to, for example, the IL-10 receptor (IL-10R, interleukin-10 receptor). This specific binding can be confirmed by methods known to those skilled in the art.
  • IL-10 variant refers to a form in which a portion of the amino acid of full-length IL-10 is substituted, deleted, added and/or inserted. That is, the IL-10 mutant may have an amino acid sequence different from that of wild-type IL-10. However, the IL-10 mutant may have an activity equivalent to or similar to that of wild-type IL-10.
  • IL-10 activity may refer to, for example, specific binding to an IL-10 receptor, and this specific binding may be measured by a method known to those skilled in the art.
  • the IL-10 variant may be one in which a portion of the amino acid of wild-type IL-10 is substituted, deleted, added, and/or inserted, which may be prepared by a method known to those skilled in the art. More specifically, the IL-10 mutant may be one in which a portion of the amino acid of wild-type IL-10 is inserted.
  • the IL-10 variant by amino acid insertion the 116th amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 may be inserted.
  • the "amino acid” introduced by the insertion may be glycine (G) and serine (S).
  • the IL-10 variant may be one in which the 116th amino acid sequence, GGGSGG (SEQ ID NO: 45) is inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the IL-10 variant may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the IL-10 or IL-10 variant can regulate the secretion and production of inflammatory cytokines, such as TNF- ⁇ , and thus inflammatory bowel disease (IBD) associated with excessive activation of TNF- ⁇ , Alzheimer's disease or cerebral diseases such as polyneuritis, etc., may have characteristics that inhibit exacerbation.
  • IBD inflammatory bowel disease
  • IL-10 refers to any mammal, including primates (eg, humans) and rodents (eg, mice and rats), unless otherwise noted.
  • any wild-type IL-10 obtained from a vertebrate source of The IL-10 may be obtained from animal cells, but includes those obtained from recombinant cells capable of producing IL-10.
  • the IL-10 may be wild-type IL-10 or a mutant thereof.
  • the 'first monomer' of the dimer protein may be specifically composed of the following structural formula, (I) or (II):
  • N' is the N-terminus of the fusion protein
  • C' is the C-terminus of the fusion protein
  • X is GLP-1 or a variant thereof
  • Y is IL-10 or a variant thereof
  • linker (1) and linker (2) are peptide linkers
  • n, n and o are each independently O or 1.
  • the 'second monomer' including GLP-2 or a variant thereof may further include IL-10 or a variant thereof.
  • the 'second monomer' of the dimer protein may be specifically composed of the following structural formula (III) or (IV):
  • N' is the N-terminus of the fusion protein
  • C' is the C-terminus of the fusion protein
  • Z is GLP-2 or a variant thereof
  • Y is IL-10 or a variant thereof
  • linker (3) and linker (4) are peptide linkers
  • p, q and r are each independently O or 1.
  • the first monomer and/or the second monomer included in the 'dimeric protein' according to the present invention may include an Fc region fragment or a variant thereof.
  • Fc region fragment includes heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) of immunoglobulin, and It refers to a protein that does not include the variable regions and light chain constant regions (CL) of the heavy and light chains of globulin. It may further comprise a hinge region of the heavy chain constant region.
  • Fc region variant refers to one in which some amino acids in the Fc region are substituted or prepared by combining different types of Fc regions.
  • the Fc region variant may be modified to prevent cleavage at the hinge region.
  • a dimer or multimer means that, when forming a dimer or multimer, a polypeptide encoding a single-chain immunoglobulin constant region (specifically, an Fc region) of the same origin forms a bond with a single-chain polypeptide of a different origin. it means. That is, it is possible to prepare a dimer or multimer from two or more fragments selected from the group consisting of IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc and IgE Fc fragment.
  • the Fc region may be an Fc region of IgG, IgA, IgE, IgD or IgM, and specifically, may be derived from IgG1.
  • the Fc region may include a knob structure or a hole structure.
  • “Knob-into-hole” refers to the engineering of antibody heavy chain homodimers for heterodimerization for efficient production of bispecific antibodies, multispecific antibodies, or single arm antibodies. design strategy for Generally, this technique involves drawing a knob at the interface of a first polypeptide (eg, the first CH3 domain of a first antibody heavy chain) and at the interface of a second polypeptide (eg, the second CH3 domain of a second antibody heavy chain). ), so that the knob can be positioned within the hole to promote heterodimer formation and hinder homodimer formation.
  • a first polypeptide eg, the first CH3 domain of a first antibody heavy chain
  • a second polypeptide eg, the second CH3 domain of a second antibody heavy chain
  • a 'knob' is constructed by replacing small amino acid side chains from the interface of a first polypeptide (eg, the first CH3 domain of a first antibody heavy chain) with larger side chains (eg, arginine, phenylalanine, tyrosine or tryptophan).
  • Complementary 'holes' of the same or similar size in the knob replace large amino acid side chains with smaller side chains (eg, alanine, serine, valine) at the interface of the second polypeptide (eg, the second CH3 domain of the second antibody heavy chain). , or threonine).
  • the knobs and holes can be created by altering the nucleic acid encoding the polypeptide, eg, by site-specific mutagenesis, or by peptide synthesis.
  • the knob structure of IgG1 may be SEQ ID NO: 10, and the hole structure may be SEQ ID NO: 11.
  • the knob structure or hole structure may be a form in which amino acids at positions 117, 122, 134, 136, and 175 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 are substituted with other amino acids.
  • the knob structure or the hole structure may be substituted with Y117C, C122S, W134S, L136A, and Y175V, or C117Y, S122C, S134W, A136L, and V175Y.
  • the Fc fragment of the present invention may be in the form of wild-type sugar chains, increased sugar chains compared to wild-type, decreased sugar chains compared to wild-type, or deglycosylated.
  • the increase, decrease or removal of immunoglobulin Fc sugar chains may be performed by conventional methods known in the art, such as chemical methods, enzymatic methods, and genetic engineering methods using microorganisms. Removal of sugar chains from the Fc fragment sharply reduces the binding affinity of the primary complement component C1 to Clq, resulting in reduction or elimination of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) or complement-dependent cytotoxicity (CDC), Therefore, it does not induce an unnecessary immune response in the living body.
  • the immunoglobulin Fc fragment in a deglycosylated or aglycosylated form may be more suitable for the purpose of the present invention as a drug carrier.
  • deglycosylation means that sugars are enzymatically removed from an Fc fragment
  • amino acid sequence preferably E. It means that it is produced in an unglycosylated form by coli.
  • peptide linker refers to a peptide used for linking or distances between a domain and a domain in a fusion protein.
  • the peptide linker (1) and linker (3) may be a linker that connects GLP-1 or GLP-2 to an Fc region fragment or a variant thereof, respectively.
  • the peptide linker (1) and linker (3) may each consist of 5 to 50 consecutive amino acids, 10 to 45 consecutive amino acids, or 15 to 40 consecutive amino acids.
  • the peptide linker (1) and linker (3) may each consist of 33 amino acids.
  • the peptide linker (1) and the linker (3) may each include at least one cysteine. Specifically, it may contain one, two or three cysteines.
  • the peptide linker (1) and linker (3) may each be derived from the hinge of an immunoglobulin.
  • the peptide linker (1) and linker (3) may each include (G 4 S)n (in this case, n is an integer of 1 to 10). In this case, in (G 4 S)n, n may be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
  • the peptide linker (1) and the linker (3) may each include a sequence derived from the hinge of an immunoglobulin.
  • the peptide linker (1) and the linker (3) may each be a peptide linker consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the peptide linker (2) and linker (4) may each be a linker connecting an Fc region fragment or a variant thereof and IL-10 or a variant thereof.
  • the peptide linker (2) and linker (4) may each consist of 5 to 50 consecutive amino acids, 10 to 45 consecutive amino acids, or 15 to 40 consecutive amino acids. In one embodiment, the peptide linker (2) and linker (4) may each consist of 18 to 33 amino acids.
  • the linker may be a zip-up linker, a flexible linker, a rigid linker, a partial linker, or a self-assembling region linker, etc. can
  • the zip-up linker is a linker having a positive charge (amphiphilic), and may generally include the form of (RADA)n.
  • n in (RADA)n may be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
  • the zip-up linker may be a peptide linker consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the flexible linker is basically a linker showing flexible movement because amino acids present in the linker do not repel each other or accumulate with each other, and may include the form of (G 4 S)n.
  • n may be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
  • the flexible linker may be a peptide linker consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the non-flexible linker is a linker capable of forming a stable three-dimensional structure compared to the random coil of the flexible linker, glutamine (Q), arginine (R), histidine (H), asparagine (N), serine (S) ), leucine (L), threonine (T), proline (P), phenylalanine (F), glutamic acid (E) and tyrosine (Y) may include a peptide consisting of 5 to 50 amino acids selected from the group consisting of .
  • the inflexible linker may be a peptide linker consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • the partial linker is a linker in which the configuration of a flexible linker and a non-flexible linker is mixed, and may include a flexible linker (G 4 S)n form and a non-flexible linker (AP)n form.
  • n may be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10, respectively.
  • the partial linker may be a peptide linker consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the self-assembling regional linker is a linker having a property of spontaneously binding through a non-covalent bond, and includes the form of a flexible linker (G 4 S)n, and includes cysteine (C), tryptophan (W), and glutamic acid (E). , may include a peptide consisting of 5 to 50 amino acids selected from the group consisting of serine (S), alanine (A) and leucine (L). In this case, in (G 4 S)n, n may be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10, respectively.
  • the self-assembling regional linker may be a peptide linker consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17.
  • the peptide linker (2) and the linker (4) may each have an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 12 to 17, and preferably have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • a 'dimeric protein' is a fusion protein comprising a first monomer protein and a second monomer protein, and specifically comprises monomers of structural formulas (I) and (III), or structural formulas (II) and and a monomer of formula (IV).
  • a dimeric protein comprising monomers of structural formula (I) and structural formula (III) is as follows:
  • N' is the N-terminus of the fusion protein
  • C' is the C-terminus of the fusion protein
  • X is GLP-1 or a variant thereof
  • Z is GLP-2 or a variant thereof
  • Y is IL-10 or a variant thereof
  • linker (1), linker (2), linker (3) and linker (4) are peptide linkers
  • n, o, p, q and r are each independently O or 1.
  • GLP-1 or a variant thereof GLP-2 or a variant thereof
  • IL-10 or a variant thereof is as described above.
  • X may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, or 4.
  • Z may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6.
  • Y may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or 8.
  • X, Z and Y are 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, It may comprise a polypeptide having 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity.
  • identity for example, percent homology, may be determined through homology comparison software such as BlastN software of the National Center of Biotechnology Information (NCBI).
  • linker (1), linker (2), linker (3), and linker (4) are the same as described above.
  • linker (1) and the linker (3) may each have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • linker (2) and the linker (4) may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16 or 17, respectively.
  • Fc region fragment or variant thereof is as described above.
  • the Fc region fragment or variant thereof may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or 11.
  • the dimeric protein is sequentially from the N-terminus, SEQ ID NO: 2 (GLP-1 variant), SEQ ID NO: 9 (linker), SEQ ID NO: 10 (Fc region fragment variant; knob structure), the sequence a first monomer having a sequence comprising SEQ ID NO: 12 (linker) and SEQ ID NO: 8 (a variant of IL-10); and SEQ ID NO: 6 (variant of GLP-2), SEQ ID NO: 9 (linker), SEQ ID NO: 11 (variant of Fc region fragment; hole structure), SEQ ID NO: 12 (linker) and SEQ ID NO: 8 ( It may include; a second monomer having a sequence including a variant of IL-10).
  • the dimeric protein comprises SEQ ID NO: 2 (mutant of GLP-1), SEQ ID NO: 9 (linker), SEQ ID NO: 10 (variant of Fc region fragment; knob structure), sequence sequentially from the N-terminus a first monomer having a sequence comprising SEQ ID NO: 12 (linker) and SEQ ID NO: 8 (a variant of IL-10); and a second monomer having a sequence comprising SEQ ID NO: 6 (variant of GLP-2), SEQ ID NO: 9 (linker) and SEQ ID NO: 11 (variant of Fc region fragment; hole structure) sequentially from the N-terminus; may be doing
  • dimer protein comprising the monomers of structural formula (II) and structural formula (IV) is as follows:
  • N' is the N-terminus of the fusion protein
  • C' is the C-terminus of the fusion protein
  • X is GLP-1 or a variant thereof
  • Z is GLP-2 or a variant thereof
  • Y is IL-10 or a variant thereof
  • linker (1), linker (2), linker (3) and linker (4) are peptide linkers
  • n, o, p, q and r are each independently O or 1.
  • the dimeric protein is sequentially from the N-terminus to SEQ ID NO: 8 (mutant of IL-10), SEQ ID NO: 9 (linker), SEQ ID NO: 10 (variant of Fc region fragment; knob structure), sequence a first monomer having a sequence comprising SEQ ID NO: 12 (linker), and SEQ ID NO: 2 (a variant of GLP-1); and SEQ ID NO: 8 (mutant of IL-10), SEQ ID NO: 9 (linker), SEQ ID NO: 11 (variant of Fc region fragment; hole structure), SEQ ID NO: 12 (linker), and SEQ ID NO: 6 sequentially from the N-terminus
  • a second monomer having a sequence including (a variant of GLP-2); may be included.
  • the dimeric protein comprises SEQ ID NO: 8 (mutant of IL-10), SEQ ID NO: 9 (linker), SEQ ID NO: 10 (variant of Fc region fragment; knob structure), sequentially from the N-terminus a first monomer having a sequence comprising SEQ ID NO: 12 (linker), and SEQ ID NO: 2 (a variant of GLP-1); and a second monomer having a sequence comprising SEQ ID NO: 11 (variant of Fc region fragment; hole structure), SEQ ID NO: 12 (linker), and SEQ ID NO: 6 (variant of GLP-2) sequentially from the N-terminus; may include.
  • a signal peptide may be further included at the N-terminus of the first monomer and/or the second monomer included in the dimer protein.
  • the signal peptide may be a tissue-type plasminogen activator (tPA) signal peptide, which is a secretion signal peptide, but is not particularly limited thereto.
  • the signal peptide may be many other signal peptides found in the signal sequence database (http://signalpeptide.de/index.php).
  • the signal peptide may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • Preferred dimer proteins according to one embodiment of the present invention are sequentially from the N-terminus, SEQ ID NO: 18 (tPA signal peptide), SEQ ID NO: 2 (GLP-1 variant), SEQ ID NO: 9 (linker), SEQ ID NO: 10 ( a first monomer having a sequence comprising a variant of an Fc region fragment; a knob structure), SEQ ID NO: 12 (linker), and SEQ ID NO: 8 (a variant of IL-10); and sequentially from the N-terminus, SEQ ID NO: 18 (tPA signal peptide), SEQ ID NO: 6 (mutant of GLP-2), SEQ ID NO: 9 (linker), SEQ ID NO: 11 (variant of Fc region fragment; hole structure), SEQ ID NO: 12 (linker), and a second monomer having a sequence comprising SEQ ID NO: 8 (mutant of IL-10); may include one.
  • the dimer protein is referred to as 'GI-210', which may have the amino acid sequences of SEQ
  • preferred dimer proteins are sequentially from the N-terminus, SEQ ID NO: 18 (tPA signal peptide), SEQ ID NO: 2 (GLP-1 variant), SEQ ID NO: 9 (linker), SEQ ID NO: a first monomer having a sequence comprising 10 (variant of Fc region fragment; knob structure), SEQ ID NO: 12 (linker), and SEQ ID NO: 8 (mutant of IL-10); and SEQ ID NO: 18 (tPA signal peptide), SEQ ID NO: 6 (variant of GLP-2), SEQ ID NO: 9 (linker), and SEQ ID NO: 11 (variant of Fc region fragment; hole structure) sequentially from the N-terminus
  • a second monomer having a sequence to In the present specification, the dimeric protein is referred to as 'GI-211', which may have the amino acid sequences of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 21.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative brain disease comprising the above-described dimer protein.
  • the dimeric protein comprises a first monomer comprising GLP-1 or a variant thereof; and a second monomer including GLP-2 or a variant thereof.
  • the first monomer and/or the second monomer may further include IL-10 or a variant thereof.
  • the degenerative brain disease is Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, mild cognitive impairment, cerebral amyloid angiopathy, Down syndrome, amyloid stroke (stroke), systemic amyloid disease, Dutch type Amyloidosis, Niemann-Pick disease, senile dementia, amyotrophic lateral sclerosis, Spinocerebellar Atrophy, Tourette's Syndrome, Friedrich's Ataxia, Machado-Joseph's disease -Joseph's disease), Lewy Body Dementia, Dystonia, Progressive Supranuclear Palsy and Frontotemporal Dementia may be any one selected from the group consisting of.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition varies depending on the condition and weight of the patient, the degree of disease, the drug form, the route and duration of administration, but may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the dimer protein exhibits degenerative brain disease therapeutic activity, or, in particular, as long as it can exhibit a therapeutic effect on Alzheimer's disease, it is optional depending on use, formulation, compounding purpose, etc. It may be included in an amount (effective amount) of, a typical effective amount may be determined within the range of 0.001 wt% to 20.0 wt% based on the total weight of the composition.
  • the "effective amount” refers to an amount of the dimer protein capable of inducing an effect of improving or treating a disease state, in particular, an improvement or therapeutic effect of Alzheimer's disease. Such an effective amount can be determined empirically within the ordinary ability of one of ordinary skill in the art.
  • treatment may be used to include both therapeutic treatment and prophylactic treatment. In this case, prevention may be used in the sense of alleviating or reducing a pathological condition or disease of an individual.
  • treatment includes any form of administration or application for treating a disease in a mammal, including a human. The term also includes inhibiting or slowing the progression of a disease; restoring or repairing damaged or missing function, thereby partially or completely alleviating the disease; or stimulate inefficient processes; It includes the meaning of alleviating serious diseases.
  • Pharmacokinetic parameters such as bioavailability and underlying parameters such as clearance rate may also affect efficacy.
  • "enhanced efficacy” e.g., improvement in efficacy
  • improved efficacy by comparing parameters such as clearance rate and treating or ameliorating degenerative brain disease in a test animal or human subject. can be measured.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a therapeutically effective amount.
  • the term “administration” refers to introducing a predetermined substance to an individual by an appropriate method, and the administration route of the composition may be administered through any general route as long as it can reach a target tissue.
  • Intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration may be administered intrarectally, but is not limited thereto.
  • terapéuticaally effective amount refers to an amount of a compound or composition effective for preventing or treating a target disease, which is sufficient to treat the disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and It means an amount that does not cause side effects.
  • the level of the effective amount may be determined by the patient's health condition, disease type, severity, drug activity, drug sensitivity, administration method, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, factors including the combination or concurrently used drugs; It may be determined according to factors well known in the medical field.
  • a therapeutically effective amount refers to an amount of a drug effective for treating degenerative brain disease.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be any non-toxic material suitable for delivery to a patient. Distilled water, alcohol, fats, waxes and inert solids may be included as carriers. Pharmaceutically acceptable adjuvants (buffers, dispersants) may also be included in the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition may be prepared as a parenteral formulation according to the route of administration by a conventional method known in the art, including a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the dimer protein.
  • pharmaceutically acceptable means that it does not inhibit the activity of the dimer protein and does not have toxicity beyond which the application (prescription) target is adaptable.
  • the pharmaceutical composition When the pharmaceutical composition is prepared for parenteral use, it may be formulated in the form of injections, transdermal administrations, nasal inhalants and suppositories together with suitable carriers according to methods known in the art.
  • a suitable carrier may be sterile water, ethanol, polyol such as glycerol or propylene glycol, or a mixture thereof, preferably Ringer's solution, PBS (phosphate buffered saline) containing triethanolamine, or sterilized for injection. Water, an isotonic solution such as 5% dextrose, etc. may be used.
  • Formulation of pharmaceutical compositions is known in the art, and specifically, reference may be made to the literature [Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)] and the like. This document is considered a part of this specification.
  • a preferred dosage of the pharmaceutical composition is in the range of 0.01 ⁇ g/kg to 10 g/kg, or 0.01 mg/kg to 1 g/kg per day, depending on the patient's condition, weight, sex, age, severity of the patient, and the route of administration. can be Administration may be performed once or divided into several times a day. These dosages should not be construed as limiting the scope of the invention in any respect.
  • compositions of the present invention may further include any compound or natural extract known to have a therapeutic effect on degenerative brain disease, in addition to the dimer protein.
  • the compound or natural extract may be administered simultaneously or sequentially with the pharmaceutical composition.
  • polynucleotide encoding a first monomer comprising GLP-1 or a variant thereof.
  • one embodiment of the polynucleotide may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33.
  • GLP-1 or a variant thereof included in the first monomer is the same as described above.
  • the first monomer may further include IL-10 or a variant thereof.
  • the polynucleotide may further include a nucleic acid encoding a signal sequence or a leader sequence.
  • signal sequence refers to a signal peptide that directs secretion of a target protein.
  • the signal peptide is cleaved after translation in the host cell.
  • the signal sequence is an amino acid sequence that initiates the movement of the protein through the ER (endoplasmic reticulum) membrane.
  • the signal sequence may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • the signal sequence is well-known in the art, and typically contains 16 to 30 amino acid residues, but may include more or fewer amino acid residues.
  • a typical signal peptide consists of three regions: a basic N-terminal region, a central hydrophobic region, and a more polar C-terminal region.
  • the central hydrophobic region contains 4 to 12 hydrophobic residues that anchor the signal sequence through the membrane lipid bilayer during migration of the immature polypeptide.
  • the signal sequence is cleaved in the lumen of the ER by cellular enzymes commonly known as signal peptidases.
  • the signal sequence may be tissue plasminogen activation (tPa), a signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D (HSV gDs), or a secretion signal sequence of growth hormone.
  • tPa tissue plasminogen activation
  • HSV gDs Herpes simplex virus glycoprotein D
  • a secretion signal sequence of growth hormone a secretion signal sequence used in higher eukaryotic cells, including mammals, may be used.
  • the polynucleotide is at least about 70%, at least about 75%, at least about 80%, at least about 85%, at least about 86%, at least about 87%, at least about 88%, at least about 89%, at least about 90%, at least about 91%, at least about 92%, at least about 93%, at least about 94%, at least about 95%, at least about 96%, at least about 97%, at least about 98%, at least It may comprise a nucleic acid sequence having about 99%, or at least about 100% identity.
  • the polynucleotide may be mutated by substitution of one or more bases, deletion, insertion, or a combination thereof.
  • a synthesis method well known in the art for example, a method described in the literature (Engelsnd Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl, 37:73-127, 1988) can be used, and ester, phosphite, phosphoramidite and H-phosphate methods, PCR and other autoprimer methods, and oligonucleotide synthesis methods on a solid support.
  • Another aspect of the present invention provides a vector comprising a polynucleotide encoding the first monomer comprising the GLP-1 or a variant thereof.
  • the first monomer including GLP-1 or a variant thereof is the same as described above.
  • the term "vector” refers to a recombinant vector capable of expressing a target protein in a target host cell, and refers to a gene construct including essential regulatory elements operatively linked to express a gene insert.
  • the vector may include expression control elements such as a start codon, a stop codon, a promoter, and an operator.
  • the start codon and stop codon are generally considered to be part of the nucleotide sequence encoding the polypeptide, and must be functional in the subject when the gene construct is administered and must be in frame with the coding sequence.
  • the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • the vector may include a linear nucleic acid, a plasmid, a phagemid, a cosmid, an RNA vector, a viral vector, a mini-chromosome, and analogs thereof.
  • viral vectors include, but are not limited to, retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses.
  • the plasmid may contain a selectable marker such as an antibiotic resistance gene, and host cells maintaining the plasmid may be cultured under selective conditions.
  • operably linked refers to a state in which a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a target protein or RNA are functionally linked to perform a general function.
  • a promoter and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA may be operably linked to affect expression of the coding sequence.
  • the operative linkage with the vector may be prepared using a genetic recombination technique well known in the art, and for site-specific DNA cleavage and ligation, an enzyme generally known in the art may be used.
  • the vector may include a signal sequence for the release of the fusion polypeptide in order to promote the separation of the protein from the cell culture medium.
  • a specific initiation signal may also be required for efficient translation of the inserted nucleic acid sequence. These signals include the ATG initiation codon and adjacent sequences.
  • an exogenous translational control signal which may include an ATG initiation codon, must be provided. These exogenous translational control signals and initiation codons can be from a variety of natural and synthetic sources. Expression efficiency can be increased by introduction of appropriate transcriptional or translational enhancing factors.
  • the vector may include a nucleotide sequence encoding the first monomer protein of the present invention.
  • the vector used is not particularly limited as long as it can produce the first monomer protein of the present invention.
  • the vector may be plasmid DNA, phage DNA, or the like.
  • the vector is a commercially developed plasmid (pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP, etc.), Escherichia coli-derived plasmid (pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119, etc.), Bacillus subtilis-derived plasmid (pUB110, pTP5, etc.) , yeast-derived plasmids (YEp13, YEp24, YCp50, etc.), phage DNA (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, ⁇ gt10, ⁇ gt11, ⁇ ZAP, etc.), animal viral vectors (retroviruses, adenoviruses, vaccinia) nia virus (vaccinia virus, etc.), insect virus vectors (baculovirus, etc.). Since the vector exhibits different protein expression levels and modifications depending on the host cell, it is preferable to select and use a host cell
  • Another aspect of the present invention provides a transformed cell into which a vector comprising a polynucleotide encoding a first monomer comprising the GLP-1 or a variant thereof is introduced.
  • the first monomer including GLP-1 or a variant thereof is the same as described above.
  • the transformed cell may be prepared by introducing a vector into a host cell and transforming it.
  • the first monomer protein of the present invention can be produced by expressing the polynucleotide included in the vector.
  • the transformation can be performed by various methods. As long as it can produce the first monomer protein of the present invention, it is not particularly limited thereto. Specifically, the transformation method is CaCl 2 precipitation method, CaCl 2 The efficiency is improved by using a reducing material called DMSO (dimethyl sulfoxide) in the precipitation method. Elevated Hanahan method, electroporation, calcium phosphate precipitation, protoplast fusion, agitation using silicon carbide fibers, agrobacterium-mediated transformation, transformation using PEG, dextran sulfate, lipofectamine and drying/suppression mediated transformation methods, etc. may be used.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the host cell used for the production of the transformed cell can also produce the first monomer protein of the present invention, it is not particularly limited thereto.
  • the host cell may include, but is not limited to, a cell of prokaryotic, eukaryotic, mammalian, plant, insect, fungal or cellular origin.
  • the prokaryotic cell E. coli may be used.
  • yeast may be used as an example of eukaryotic cells.
  • the mammalian cells include CHO cells, F2N cells, CSO cells, BHK cells, Bowes melanoma cells, HeLa cells, 911 cells, AT1080 cells, A549 cells, SP2/0 cells, and human lymphoblastoid cells.
  • NSO cells HT-1080 cells, PERC.6 cells, HEK 293 cells or HEK293T cells
  • NSO cells HT-1080 cells, PERC.6 cells, HEK 293 cells or HEK293T cells
  • the present invention is not limited thereto, and any cell available as a mammalian host cell known to those skilled in the art may be used.
  • Another aspect of the present invention provides a method for producing a first monomer comprising the GLP-1 or a variant thereof.
  • the method for producing the first monomer comprises the steps of i) culturing the transformed cell; and ii) recovering the first monomer comprising GLP-1 or a variant thereof of the present invention.
  • culture refers to a method of growing microorganisms in an appropriately artificially controlled environmental condition.
  • the method of culturing the transformed cells can be performed using a method well known in the art.
  • the culture is not particularly limited as long as it can be produced by expressing the first monomer protein of the present invention.
  • the culture may be continuously cultured in a batch process or in a fed batch or repeated fed batch process.
  • the medium used for culture can satisfy the requirements of a specific strain in an appropriate manner while controlling temperature, pH, etc. under aerobic conditions in a conventional medium containing an appropriate carbon source, nitrogen source, amino acid, vitamin, and the like.
  • a usable carbon source a mixed sugar of glucose and xylose may be used as the main carbon source.
  • Other carbon sources include sugars and carbohydrates such as sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, and cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, palmitic acid, stearic acid, and linoleic acid. Fatty acids, glycerol, alcohols such as ethanol, and organic acids such as acetic acid may be included.
  • the carbon sources may be used individually or as a mixture.
  • nitrogen source examples include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, and organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or its degradation products, defatted soybean cake or its degradation products, etc. can The above nitrogen sources may be used alone or in combination.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine
  • organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydro
  • the medium may contain monopotassium phosphate, dipotassium phosphate and the corresponding sodium-containing salt as phosphorus.
  • the phosphorus that may be used may include potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salt.
  • sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, etc. may be used as the inorganic compound.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins may be further added to the medium.
  • precursors suitable for the culture medium may be used.
  • the above-mentioned raw materials may be added in a batch, fed-batch or continuous manner by an appropriate method to the culture during the culturing process, but is not particularly limited thereto.
  • Basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or acid compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid may be used in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • an antifoaming agent such as a fatty acid polyglycol ester may be used to inhibit the formation of bubbles.
  • Oxygen or oxygen-containing gas eg air
  • the temperature of the culture is usually 27°C to 37°C, preferably 30°C to 35°C.
  • the step of recovering the first monomer protein from the culture may be performed by a method known in the art.
  • the recovery method is not particularly limited as long as it can recover the produced first monomer protein of the present invention.
  • the recovery method is centrifugation, filtration, extraction, spraying, drying, evaporation, precipitation, crystallization, electrophoresis, fractional dissolution (eg ammonium sulfate precipitation), chromatography (eg ion exchange, affinity , hydrophobicity and size exclusion) and the like.
  • polynucleotide encoding a second monomer comprising GLP-2 or a variant thereof.
  • one embodiment of the polynucleotide may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 34 or 35.
  • GLP-2 or a variant thereof included in the second monomer is the same as described above.
  • the second monomer may further include IL-10 or a variant thereof.
  • the polynucleotide may additionally include a nucleic acid encoding a signal sequence or a leader sequence, as described above.
  • the polynucleotide is at least about 70%, at least about 75%, at least about 80%, at least about 85%, at least about 86%, at least about 87%, at least about 88% with SEQ ID NO: 34 or 35 , at least about 89%, at least about 90%, at least about 91%, at least about 92%, at least about 93%, at least about 94%, at least about 95%, at least about 96%, at least about 97%, at least about 98% , a nucleic acid sequence having at least about 99% identity, or at least about 100% identity.
  • Another aspect of the present invention provides a vector comprising a polynucleotide encoding a second monomer comprising the GLP-2 or a variant thereof.
  • the second monomer and vector including the GLP-2 or a variant thereof are the same as described above.
  • the vector may include a nucleotide sequence encoding the second monomer protein of the present invention.
  • the vector is not particularly limited as long as it can produce the second monomer protein of the present invention.
  • pcDNA3.4 vector was used.
  • Another aspect of the present invention provides a transformed cell into which a vector comprising a polynucleotide encoding a second monomer comprising the GLP-2 or a variant thereof is introduced.
  • the second monomer and the transformed cell comprising the GLP-2 or variant thereof are the same as described above.
  • the transformed cell may be produced by introducing a vector into a host cell to transform it, and by expressing the polynucleotide contained in the vector, the second monomer protein of the present invention may be produced.
  • the transformation can be carried out by various methods as described above, and is not particularly limited as long as it can produce the second monomer protein of the present invention.
  • the host cell used for the preparation of the transformed cell is as described above, and is not particularly limited as long as it can produce the second monomer protein of the present invention.
  • Another aspect of the present invention provides a method for producing a second monomer comprising the GLP-2 or a variant thereof.
  • the method for producing the second monomer comprises the steps of: i) culturing the transformed cell; and ii) recovering a second monomer comprising GLP-2 or a variant thereof of the present invention.
  • the method for culturing the transformed cells can be performed using a method well known in the art, and the culture is not particularly limited as long as it can be produced by expressing the second monomer protein of the present invention. .
  • the medium not used for the culture is also the same as described above, and the step of recovering the second monomer protein from the culture may be performed by a method known in the art. Specifically, the recovery method is not particularly limited as long as it can recover the produced second monomer protein of the present invention.
  • Another aspect of the present invention provides a transformed cell into which the vector including the polynucleotide encoding the first monomer and the vector including the polynucleotide encoding the second monomer are introduced.
  • the transformed cell may be produced by introducing a vector into a host cell and transformed, and the polynucleotide contained in the vector may be expressed to produce the dimeric protein of the present invention.
  • the transformation can be performed by various methods as described above, and is not particularly limited as long as it can produce the dimer protein of the present invention,
  • the host cell used for the production of the transformed cell is as described above, and is not particularly limited as long as it can produce the dimer protein of the present invention.
  • Another aspect of the present invention provides a method for producing a dimer including the first monomer and the second monomer.
  • the method for producing the dimer comprises the steps of i) culturing the transformed cell; ii) recovering the dimer protein comprising the first monomer and the second monomer.
  • the method for culturing the transformed cells can be performed using a method well known in the art, and the culture is not particularly limited as long as it can be produced by expressing the dimer protein of the present invention.
  • the medium not used for the culture is also the same as described above, and the step of recovering the dimer protein from the culture may be performed by a method known in the art. Specifically, the recovery method is not particularly limited as long as it can recover the produced dimer protein of the present invention.
  • Another aspect of the present invention provides the use of the dimer protein for preparing a medicament for the prevention or treatment of degenerative brain disease.
  • the dimer protein, degenerative brain disease, prevention and treatment are the same as described above.
  • Another aspect of the present invention provides a use for preventing or treating degenerative brain disease of the dimer protein for preventing or treating degenerative brain disease.
  • the dimer protein, degenerative brain disease, prevention and treatment are the same as described above.
  • Another aspect of the present invention provides a method for preventing or treating degenerative brain disease comprising administering the dimer protein to an individual.
  • the dimer protein, administration, degenerative brain disease, prevention and treatment are the same as described above.
  • the subject may be a mammal, preferably a human.
  • the subject may be a patient suffering from degenerative brain disease or an individual with a high probability of suffering from degenerative brain disease.
  • the administration route, dosage and frequency of administration of the dimer protein may be administered to a subject in various ways and amounts depending on the patient's condition and presence or absence of action, and the optimal administration method, dosage, and frequency of administration may be determined by those skilled in the art. can be selected within an appropriate range.
  • the dimer protein may be administered in combination with any compound or natural extract known to have a therapeutic effect on degenerative brain disease, or formulated in the form of a combination preparation with other drugs.
  • a fusion protein comprising human GLP-1, GLP-2, an IgG1 Fc domain in the form of a knob into hole and an IL-10 variant
  • tPA signal peptide SEQ ID NO: 18
  • hGLP-1 variant SEQ ID NO: 2
  • Ig hinge SEQ ID NO: 9
  • knob-shaped hIgG1 Fc domain SEQ ID NO: 10
  • linker SEQ ID NO: 12
  • hIL-10 variant SEQ ID NO: 8
  • tPA signal peptide SEQ ID NO: 18
  • hGLP-2 variant SEQ ID NO: 6
  • Ig hinge SEQ ID NO: 9
  • hole-form hIgG1 Fc domain SEQ ID NO: 11
  • linker SEQ ID NO: 12
  • each of the vectors was introduced into a CHO cell (ExpiCHO-S cell) to express a dimeric protein composed of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • a CHO cell ExpiCHO-S cell
  • a serum-free ExpiCHO TM expression medium (Thermo Fisher Scientific) at 37° C., CO 2 8% condition.
  • the culture medium was collected, and the dimer protein was purified using affinity chromatography (Affinity purification column).
  • the purified dimer protein was named "GI-210 (also referred to as GI-210_26V)". It was confirmed that the concentration of the purified dimer protein was 23 mg/L (FIG. 1).
  • a fusion protein comprising human GLP-1, GLP-2, an IgG1 Fc domain in the form of a knob into hole and an IL-10 variant
  • tPA signal peptide SEQ ID NO: 18
  • hGLP-1 variant SEQ ID NO: 2
  • Ig hinge SEQ ID NO: 9
  • knob-shaped hIgG1 Fc domain SEQ ID NO: 10
  • linker SEQ ID NO: 12
  • hIL-10 variant SEQ ID NO: 8
  • tPA signal peptide SEQ ID NO: 18
  • hGLP-2 mutant SEQ ID NO: 6
  • Ig hinge SEQ ID NO: 9
  • hole-type hIgG1 Fc domain SEQ ID NO: 11
  • the vector was introduced into a CHO cell (ExpiCHO-S cell) to express a dimeric protein composed of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.
  • a CHO cell ExpiCHO-S cell
  • a serum-free ExpiCHO TM expression medium (Thermo Fisher Scientific) at 37° C., CO 2 8% condition.
  • the culture medium was collected, and the dimer protein was purified using affinity chromatography (Affinity purification column).
  • the purified dimer protein was named "GI-211 (also referred to as GI-211_26V1)" (FIG. 2).
  • binding conditions were 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.4. After binding, it was eluted with a solution of 100 mM NaCl and 100 mM acetic acid, pH 3 . After putting 1.5 M Tris-HCl of 10% of pH 7.4 into a collection tube, the dimer protein was collected. The collected dimer protein was dialyzed against PBS buffer for 16 hours.
  • the tPA signal peptide, the hGLP-1 variant, and the hIgG1 Fc domain in the form of an Ig hinge and a knob were N- fusion protein comprising the sequence from the end (SEQ ID NO: 36) the nucleotide sequence encoding through (SEQ ID NO: 37) polynucleotide [first monomer] a Thermo Fisher's GeneArt TM Gene Synthesis service containing the pcDNA3.4 vector ( vector) was loaded.
  • nucleotide sequence (SEQ ID NO: 39) encoding a fusion protein (SEQ ID NO: 38) including tPA signal peptide, hGLP-2 mutant, Ig hinge and hole-type hIgG1 Fc domain from the N-terminus in this order
  • the polynucleotide [second monomer] was loaded into pcDNA3.4 vector through Thermo Fisher's GeneArtTM Gene Synthesis service.
  • each of the vectors was introduced into a CHO cell (ExpiCHO-S cell) to express a dimeric protein composed of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 and a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38.
  • a CHO cell ExpiCHO-S cell
  • a serum-free ExpiCHO TM expression medium Thermo Fisher Scientific
  • the culture medium was collected, and the dimer protein was purified using affinity chromatography (Affinity purification column).
  • the purified dimer protein was named "GI-210-CN".
  • a fusion protein comprising an IgG1 Fc domain and an IL-10 variant as a control, a tPA signal peptide, an Ig hinge, a knob-type hIgG1 Fc domain, a linker, and a hIL-10 variant comprising in this order from the N-terminus
  • the polynucleotide [first monomer] including the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 41) encoding the fusion protein (SEQ ID NO: 40) was loaded into pcDNA3.4 vector (vector) through Thermo Fisher's GeneArtTM Gene Synthesis service.
  • nucleotide sequence encoding the fusion protein (SEQ ID NO: 42) comprising the tPA signal peptide, hGLP-2 variant, Ig hinge, hole-shaped hIgG1 Fc domain, linker and hIL-10 variant in this order from the N-terminus ( The polynucleotide [second monomer] including SEQ ID NO: 43) was loaded into pcDNA3.4 vector through GeneArt TM Gene Synthesis service of Thermo Fisher.
  • each of the vectors was introduced into a CHO cell (ExpiCHO-S cell) to express a dimeric protein composed of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 and a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42.
  • a CHO cell ExpiCHO-S cell
  • a serum-free ExpiCHO TM expression medium Thermo Fisher Scientific
  • the culture medium was collected, and the dimer protein was purified using affinity chromatography (Affinity purification column).
  • the purified dimer protein was named "GI-210-C1".
  • Microglia are known as cells that play a role in regulating the growth and survival of neurons (Neuroscience, 2019, 405:103-117). Immunologically activated microglia produce and secrete inflammatory cytokines (TNF- ⁇ , IL-1, IL-6, etc.), glutamate, cathepsin B, or NO, thereby increasing the efficiency of neurons distributed around microglia. It has been reported to induce damage and death (Brain Research, 1992, 587:250-256, Brain Research, 2015, 1628:288-297, Annals of Translational Medicine, 2015, 3(10):136-150), which and is known to affect the pathogenesis of neurological disorders such as Parkinson's.
  • GI-210 inhibits TNF- ⁇ secretion in microglia
  • TNF- ⁇ secretion ability was measured.
  • BV2 cells mouse microglia
  • DMEM + 10% FBS + 1% penicillin/streptomycin For TNF- ⁇ measurement, BV2 cells were inoculated into a 24 well plate (2.5 x 10 5 cells/well).
  • GI-210, GI-210-C1, and GI-210-CN were mixed in the medium to suit each concentration and treated with LPS (O55:B5, final 1 ⁇ g/ml) 1 hour after the treatment.
  • TNF- ⁇ was measured using the Mouse TNF- ⁇ ELISA kit (R&D systems, SMTA00B). 50 ⁇ l of assay diluent RD1-63 was added to 96 wells enclosed in the kit, and then 50 ⁇ l of standard material or sample (supernatant) was added to each well and incubated at room temperature for 2 hours. After washing each well 4 times using wash buffer, 100 ⁇ l Mouse TNF- ⁇ conjugate was added to each well and incubated at room temperature for 2 hours. After washing each well 4 times using wash buffer, 100 ⁇ l of the substrate solution was added. After incubation for 30 minutes at room temperature/light blocking condition, 100 ⁇ l Stop solution was added to stop the reaction. Absorbance was measured at a wavelength of 450 nm using a plate reader.
  • GI-210 fusion protein inhibited LPS-induced TNF- ⁇ secretion of microglia in a concentration-dependent manner.
  • the GI-210 fusion protein effectively inhibited TNF- ⁇ secretion compared to the control groups GI-210-C1 and GI-210-CN.
  • GI-210-CN did not inhibit TNF- ⁇ secretion ( FIG. 9 ).
  • the GI-210 fusion protein exhibited superior TNF- ⁇ secretion inhibitory ability compared to the control group in microglia induced by TNF- ⁇ secretion due to LPS treatment, and accordingly, the GI-210 fusion protein It was found that nerve cell damage can be effectively suppressed through secretion inhibition.
  • GI-210 inhibits nitrite secretion in microglia
  • BV2 cells mouse microglia cell line
  • DMEM + 10% FBS + 1% penicillin/streptomycin + no phenol red For nitrite measurement, BV2 cells were inoculated into a 24 well plate (2.5 x 10 5 cells/well).
  • GI-210, GI-210-C1, and GI-210-CN were mixed in the medium to suit each concentration and treated with LPS (O55:B5, final 1 ⁇ g/ml) 1 hour after the treatment.
  • Nitrite was measured using the Griess Reagent system (Promega, G2930). After adding 50 ⁇ l of Nitrite standard or sample (supernatant) to a 96 well plate, 50 ⁇ l of sulfanilamide solution was added and incubated at room temperature/light blocking condition for 5-10 minutes. After adding 50 ⁇ l NED solution, it was incubated at room temperature/light-shielding condition for 5-10 minutes. Absorbance was measured at 530 nm wavelength using a plate reader.
  • the GI-210 fusion protein inhibited nitrite secretion in LPS-induced microglia in a concentration-dependent manner.
  • the GI-210 fusion protein effectively inhibited the secretion of nitrite under the treatment condition of 1 ⁇ M compared to the control groups GI-210-C1 and GI-210-CN ( FIG. 10 ).
  • the GI-210 fusion protein exhibited superior nitrite secretion inhibitory ability compared to the control group in microglia induced nitrite secretion due to LPS treatment. It was found that damage can be effectively suppressed.
  • Tg-APPswe/PS1dE9 mice an animal model of Alzheimer's disease, are mating cages set in a standard SPF (specific pathogen free) level animal room at Ewha Mans University approved as a living modified organism (LMO) treatment facility. They were prepared by mating in a mating cage.
  • SPF specific pathogen free
  • TG-APP/PS1 mice show visible plaque deposition from the age of 6.5 months, and cognitive deficits at about 7 months of age or older.
  • TG-APP/PS1 mice can provide face validity, construct validity and predictive validity in deriving therapeutic candidate drugs for Alzheimer's disease.
  • mice were maintained at the level of 2-3 in standard plastic cages, and standard laboratory food and water were provided ad libitum.
  • the animal room was maintained at a humidity of 50-60% and a temperature of 22-23°C, and was operated with a normal light-dark cycle (lights up at 7 am).
  • the mortality rate of Tg-APP/PS1 mice differs according to sex, and the mortality rate of female Tg-APP/PS1 mice is about twice that of male Tg-APP/PS1 mice. Accordingly, there is a possibility that female APP/PS1 mice show increased sensitivity to drugs.
  • test subject Tg-APP/PS1 mouse is a known Alzheimer's disease experimental animal model showing age-dependent plaque deposition and cognitive deficits, which clearly detects amyloid beta plaque deposition at 7-8 months of age and exhibits cognitive behavioral deficits. .
  • GI-210 and GI-211 which are the dimer proteins of the present invention, for Alzheimer's disease. This is because the usable space of the animal room facility cannot be expanded quickly, and drug handling and behavioral tests are carried out within the scheduled time and timeframe.
  • GI-210 and GI-211 of the present invention were treated in Tg-APP/PS1 mice from the age of 6.5 months when Alzheimer's disease (AD)-like pathology appeared, and the behavioral test was planned to be applied between 7.5 and 8.0 months of age. (Fig. 11). After the behavioral test evaluation, the experimental animals were sacrificed at the age of 8.0 months, and biochemical and histological analyzes were performed.
  • AD Alzheimer's disease
  • GI-210 and GI-211 obtained in Preparation Examples 1 and 2 were diluted with saline, and this was injected intraperitoneally 4 times for 2 weeks from 6.5 months of age to Tg at a concentration of 1.2 mg/kg.
  • -APP/PS1 was administered to mice (FIGS. 12 and 13).
  • GI-210 was injected at a concentration of 1.2 mg/kg during intraperitoneal injection a total of 4 times, for example, 24 ⁇ g per head based on a 20 g mouse was injected.
  • GI-211 administration was administered in the same manner as GI-210 administration so as to have a concentration of 1.2 mg/kg when intraperitoneally injected a total of 4 times based on the mouse body weight.
  • the animal behavior is generally performed compared to that of the control experimental animal. Since the animal behavior is easily affected by the animal's previous experience and treatment conditions, the same behavior is repeatedly performed for a given animal. Measuring should be avoided. Therefore, all experiments were performed considering that the behavioral tests of animals are affected by many factors including the experimenter and circadian rhythms.
  • each person can handle a maximum of 50 animals in each behavioral test trial (typically 50 animals per day is too much; measured on animals, which requires a set time), (ii) animal behavior is affected by the experimenter, which requires the same person to collect a series of behavioral tests, (iii) animal behavior with circadian rhythm (animal behavior must be collected within a given time per day)
  • mice In general, mice have a preference for new objects. This is a behavioral characteristic that is possible only when a familiar old substance and a new substance are presented, and it is necessary to distinguish and remember the old familiar substance from the new substance. Therefore, as a means for evaluating the presence or absence of cognitive deficits, it is possible to evaluate material detection memory through a new material search experiment. Cognitive functions for new substances are regulated in areas such as the prefrontal cortex, dorsal striatum, and hippocampus.
  • GI-210-treated Tg-APP/PS1 mice showed improved memory in the new substance discovery experiment (NOR test). Specifically, it was confirmed that GI-210 maintained memory even after 2 hours and 24 hours. Accordingly, it was found that GI-210 had an excellent effect in restoring short-term and long-term memory, that is, maintaining and improving memory.
  • the passive avoidance test is a cognitive behavioral evaluation experiment performed to check the presence or absence of memories related to spatial cues and contextual cues, specifically fear and anxiety.
  • Fear and anxiety-related memories are dependent on the amygdala, hippocampus, and prefrontal cortex regions of the brain, and are associated with improved learning and memory for fear and anxiety-evoking stimuli.
  • the Tg-APP/PS1 mice treated with GI-210 showed improved memory in the passive avoidance experiment.
  • GI-210 had a favorable effect on cognitive deficits in Tg-APP/PS1 mice.
  • the long-term memory retention effect of GI-210 was excellent.
  • the water maze test is a cognitive behavioral evaluation experiment performed to measure spatial perception learning ability and memory dependent on the hippocampus region of the brain.
  • GI-210 did not improve learning ability and memory in the water maze experiment as shown in FIG. 16 .
  • GI-210 may have limitations in reaching important brain regions, such as the hippocampus. That is, it suggests that hippocampal function is not sufficiently restored by GI-210.
  • GI-211-treated Tg-APP/PS1 mice showed improved memory in the new substance discovery test (NOR test). Specifically, it was confirmed that GI-211 maintained memory even after 2 hours and 24 hours. Accordingly, it was found that GI-211 had an excellent effect in maintaining and improving short-term and long-term memory.
  • a passive avoidance experiment was performed to confirm the effect of GI-211 on memories associated with fear and anxiety.
  • the GI-211-treated Tg-APP/PS1 mice showed improved memory in the passive avoidance experiment.
  • GI-211 not only had a favorable effect on cognitive deficits in Tg-APP/PS1 mice, but also had an excellent effect on maintaining long-term memory.
  • a major component of the senile plaque is aggregated amyloid beta peptide (A ⁇ ), which causes necrosis of brain nerve cells by the amyloid beta peptide, which causes Alzheimer's disease.
  • a ⁇ amyloid beta peptide
  • mice were first perfused with 4% paraformaldehyde and the brain was removed, and then the brain was incubated overnight at 4°C in 4% It was further fixed with paraformaldehyde.
  • Brain sections were prepared by cutting the fixed brain tissue with a vibratome to a thickness of 40 ⁇ m. The prepared brain sections were stained by a known method using Thioflavin S. At this time, the stained image was analyzed using MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis software (Molecular device).
  • Tg-A ⁇ -plaques in the parietal cortex, hippocampus, and piriform cortex regions in the brain of Tg-APP/PS1 mice As a result of analyzing A ⁇ -plaques in the parietal cortex, hippocampus, and piriform cortex regions in the brain of Tg-APP/PS1 mice, as shown in FIG. 20, Tg- It was confirmed that the amount of plaque deposited in the brain of APP/PS1 mice tends to decrease. In this case, the amount of plaque was quantified and expressed as the number of plaques per unit area and the sum of the plaque area.
  • GI-210 had the effect of reducing A ⁇ -plaque deposition in the brain of Tg-APP/PS1 mice. Therefore, the GI-210 can be usefully used for the treatment or prevention of degenerative brain diseases, particularly Alzheimer's disease.
  • a ⁇ amyloid beta peptide
  • GI-210 had the effect of reducing the level of A ⁇ 42 in the brain of Tg-APP/PS1 mice. Therefore, the GI-210 can be usefully used for the treatment or prevention of Alzheimer's disease.
  • Tg-APP/PS1 mice were administered with GI-211. It was confirmed that the amount of plaque deposited in the brain of In this case, the amount of plaque was quantified and expressed as the number of plaques per unit area and the sum of the plaque area.
  • GI-211 had the effect of reducing A ⁇ -plaque deposition in the brain of Tg-APP/PS1 mice. Therefore, the GI-211 can be usefully used for the treatment or prevention of degenerative brain diseases, particularly Alzheimer's disease.
  • Autophagy occurs through the fusion of autophagosomes and lysosomes.
  • AV autophagic vacuole
  • the purpose of this study was to analyze whether the dimer protein according to the present invention functions as an autophagy modulator to control abnormal autophagy in degenerative brain diseases, thereby exhibiting a significant therapeutic effect in terms of mechanism of action.
  • GI-210 can regulate neuroinflammatory responses such as microgliosis in the brain of Tg-APP/PS1 mice. Therefore, it was found that the GI-210 can be applied as an anti-inflammatory agent that reduces the response to Alzheimer's disease-related neuroinflammation.
  • GI-210 works in the autophagy-related pathway
  • the expression level of LC3, an autophagy marker was checked in brain tissue samples after intraperitoneal administration of GI-210 to an animal model of Alzheimer's disease.
  • GI-210 As a result of confirming the expression level of LC3 in the parietal cortex, hippocampus, and parietal cortex in the brain of Tg-APP/PS1 mice administered intraperitoneally with GI-210, as shown in FIG. 25 , when GI-210 was administered, Tg-APP/PS1 Although no significant changes were observed in the parietal and parietal cortex regions of mice, it was confirmed that the expression level of LC3 significantly increased in the hippocampal region. Therefore, since autophagy by GI-210 is increased, GI-210 as an autophagy regulator can be usefully used as a new concept treatment for degenerative brain disease, especially Alzheimer's disease.

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Abstract

본 발명은 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1) 및 글루카곤-유사 펩타이드-2(GLP-2)를 포함하되, IL-10을 추가로 더 포함하는 이량체 단백질 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환, 구체적으로 알츠하이머병 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 이량체 단백질은 아밀로이드베타 플라크 침착을 개선하고, 기억력 및 인지기능 개선 효과가 뛰어나므로, 퇴행성 뇌질환, 특히 알츠하이머병의 치료 및 예방에 효과적으로 활용할 수 있어 산업적 활용 가능성이 높다.

Description

글루카곤-유사 펩타이드-1 및 글루카곤-유사 펩타이드-2를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도
본 발명은 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1) 및 글루카곤-유사 펩타이드-2(GLP-2)를 포함하되, IL-10을 추가로 더 포함하는 이량체 단백질 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환, 구체적으로 알츠하이머병 치료용 조성물에 관한 것이다.
퇴행성 뇌질환은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 운동 및 감각기능의 손상, 기억, 학습, 연산 추리 등의 고차적 원인 기능의 저해와 같은 여러 가지 증상을 유발하는 질환이다. 대표적인 질환으로는 알츠하이머병, 파킨슨병 및 기억장애 등이 있다.
알츠하이머병은 크게 유전성 알츠하이머병(familiar Alzheimer's disease, FAD)과 산발성 알츠하이머병(sporadic Alzheimer's disease, SAD)으로 분류된다. 유전성 알츠하이머병은 전체 알츠하이머병 환자의 5~10% 정도를 차지하며, 원인 유전인자로 알려진 프레세닐린 1(presenilin 1, PS1), 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein, APP) 및 프레세닐린 2(presenilin 2, PS2)에 돌연변이가 일어났을 경우 알츠하이머병이 발병하게 된다. 산발성 알츠하이머병은 알츠하이머병 환자의 대부분을 차지하며, ApoE(apolipoprotein E)나 A2M(Alpha-2 macroglobulin)에 돌연변이가 일어났을 때 알츠하이머병으로 진전할 확률이 높아지는 것으로 알려져 있다(Maowen Ba et.al., Transl Neurodegener., 5(20):1-4, 2016). 그러나, 현재까지 베타아밀로이드 단백질, 타우 단백질 및 ApoE 단백질 등의 관련성이 보고된 것 이외에 알츠하이머병에 대한 정확한 발병 원인은 알려지지 않았다.
알츠하이머병의 병리학적 특징으로는 신경세포의 외부에 축적되는 노인성 플라크(senile plaques), 신경세포의 세포체 내에 엉켜진 실 뭉치처럼 보이는 신경섬유 다발(neurofibrillary tangles) 및 신경세포의 손실(neuronal loss) 등을 들 수 있다. 이러한 병리학적 특징은 유전성 알츠하이머병 및 산발성 알츠하이머병의 모든 경우에 나타나며, 이 중 노인성 플라크의 주요 구성 요소로는 응집된 아밀로이드 베타 펩타이드(amyloid beta peptide, Aβ)라는 독성단백질이 밝혀져 있다. 아밀로이드 베타 펩타이드에 의해 뇌신경세포의 괴사가 일어나며, 이로 인해 알츠하이머병이 발병하게 된다(Reisa Sperling et.al., Neuron, 84(3):608-622, 2014).
현재까지 알츠하이머병의 원인과 치료법에 대한 광범위하고 다양한 연구가 진행되어 왔으나, 원인규명이 미비하고 효과적인 치료법의 개발이 아직 미진한 수준이다. 알츠하이머병의 치료제로서 타크린, 리바스티그민, 갈란타민, 도네페질, 메만틴이 FDA로부터 인가되었지만, 현재 사용되는 알츠하이머병 치료제는 대부분 증상을 완화시키는 신경퇴행 완화 물질에 불과하다. 이들 중 대부분은 소염작용을 하는 약물로서 간독성과 소화기관의 점막을 손상시키는 등의 부작용이 있다. 또한, 상기 치료제들은 궁극적인 원인 치료보다는 대증적인 요법에 국한되어 있다는 한계가 있다. 따라서 획기적인 아이디어 전환을 통한 신개념의 치료제 발굴이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 퇴행성 뇌질환, 특히 알츠하이머병을 효과적으로 치료 및 예방하기 위하여 연구하였다. 그 결과, GLP-1(glucagon-like peptide 1) 및 GLP-2(glucagon-like peptide 2)를 포함하되, IL-10을 추가적으로 더 포함하는 이량체 단백질이 작용 메커니즘 면에서 항염증 및 자가포식(autophagy) 증진과 관련이 있다는 점을 밝혀내었다. 또한, 상술한 이량체 단백질이 알츠하이머병 동물 모델의 뇌에서 아밀로이드베타 플라크 침착을 개선하고, 인지기능 행동 검사에서도 유의한 효과가 있음을 확인하였다. 이에 GLP-1/GLP-2 및 IL-10을 포함하는 이량체 단백질을 신개념의 퇴행성 뇌질환 치료제로 활용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적 달성을 위해, 본 발명의 일 측면은, GLP-1 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체; 및 GLP-2 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 단량체를 포함하는 이량체 단백질을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 이량체 단백질을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 제1 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 i) 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및 ii) 제1 단량체를 회수하는 단계;를 포함하는 제1 단량체의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 i) 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및 ii) 제2 단량체를 회수하는 단계;를 포함하는 제2 단량체의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 제1 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 i) 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및 ii) 제1 단량체 및 제2 단량체를 포함하는 이량체 단백질을 회수하는 단계;를 포함하는 이량체 단백질의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 상기 이량체 단백질의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 퇴행성 뇌질환을 예방하거나 치료하기 위한 상기 이량체 단백질의 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 이량체 단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 GLP-1/GLP-2 및 IL-10 이량체 단백질을 포함하는 조성물은 알츠하이머병의 원인 물질로 알려진 아밀로이드베타의 생성을 억제할 수 있다. 즉, 상기 이량체 단백질은 아밀로이드베타 플라크 침착을 개선하고, 기억력 및 인지기능 개선 효과가 뛰어나므로, 이를 포함하는 조성물은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병과 같은 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 및 인지장애 개선에 효과적으로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 이량체 단백질 GI-210(GLP-1/GLP-2-IgG1 Fc knob in hole-IL-10 변이체)의 간략한 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 이량체 단백질 GI-211(GLP-1/GLP-2-IgG1 Fc knob in hole-IL-10 변이체)의 간략한 구조를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명에서 대조군으로 사용된 이량체 단백질 GI-210-CN(GLP-1/GLP-2-IgG1 Fc knob in hole)의 간략한 구조를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명에서 대조군으로 사용된 이량체 단백질 GI-210-C1(IgG1 Fc knob in hole-IL-10 변이체)의 간략한 구조를 나타낸 도면이다.
도 5는 이량체 단백질 GI-210을 SDS-PAGE로 확인한 도면이다.
도 6은 이량체 단백질 GI-210을 웨스턴 블롯으로 확인한 도면이다.
도 7은 이량체 단백질 GI-211을 SDS-PAGE로 확인한 도면이다.
도 8은 이량체 단백질 GI-211을 웨스턴 블롯으로 확인한 도면이다.
도 9는 이량체 단백질 GI-210 융합단백질의 미세아교세포에서의 TNF-α 분비 억제능을 확인한 도면이다.
도 10은 이량체 단백질 GI-210 융합단백질의 미세아교세포에서의 Nitrite 분비 억제능을 확인한 도면이다.
도 11은 본 발명에 따른 이량체 단백질 GI-210 및 GI-211의 알츠하이머병 치료 효과를 확인하기 위한 실험 설계를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명에 따른 이량체 단백질 GI-210의 투여 일정 및 투여 후 인지행동 평가 일정을 개략적으로 나타낸 도면이다. 여기에서, veh는 비히클인 식염수이고, GI는 이량체 단백질 GI-210을 나타낸 것이며, WT는 알츠하이머병이 없는 정상 대조군 마우스이고, Tg는 알츠하이머병을 지닌 실험군 마우스를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명에 따른 이량체 단백질 GI-211의 투여 일정 및 투여 후 인지행동 평가 일정을 개략적으로 나타낸 도면이다. 여기에서, veh는 비히클인 식염수이고, GI는 이량체 단백질 GI-211을 나타낸 것이며, WT는 알츠하이머병이 없는 정상 대조군 마우스이고, Tg는 알츠하이머병을 지닌 실험군 마우스를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명에 따른 GI-210 투여 후 Tg-APP/PS1 마우스를 대상으로 신물질탐색실험(NOR test)을 수행한 결과를 나타낸 도면으로, 알츠하이머병 동물 모델에 대한 GI-210의 기억력 유지 및 개선 효과를 확인한 도면이다. 여기에서, WT는 알츠하이머병이 없는 정상 대조군 마우스이고, Tg는 알츠하이머병을 지닌 실험군 마우스를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명에 따른 GI-210 투여 후 Tg-APP/PS1 마우스를 대상으로 수동회피실험(passive avoidance test)을 수행한 결과를 나타낸 도면으로, 알츠하이머병 동물 모델에 대한 GI-210의 기억력 유지 및 개선 효과를 확인한 도면이다. 여기에서, WT는 알츠하이머병이 없는 정상 대조군 마우스이고, Tg는 알츠하이머병을 지닌 실험군 마우스를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명에 따른 GI-210 투여 후 Tg-APP/PS1 마우스를 대상으로 수중미로실험(water maze test)을 수행한 결과를 나타낸 도면으로, 알츠하이머병 동물 모델에 대한 GI-210의 학습 능력과 기억력 유지 및 개선 효과를 확인한 도면이다. 여기에서, WT는 알츠하이머병이 없는 정상 대조군 마우스이고, Tg는 알츠하이머병을 지닌 실험군 마우스를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명에 따른 GI-211 투여 후 Tg-APP/PS1 마우스를 대상으로 신물질탐색실험(NOR test)을 수행한 결과를 나타낸 도면으로, 알츠하이머병 동물 모델에 대한 GI-211의 기억력 유지 및 개선 효과를 확인한 도면이다. 여기에서, WT는 알츠하이머병이 없는 정상 대조군 마우스이고, Tg는 알츠하이머병을 지닌 실험군 마우스를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명에 따른 GI-211 투여 후 Tg-APP/PS1 마우스를 대상으로 수동회피실험을 수행한 결과를 나타낸 도면으로, 알츠하이머병 동물 모델에 대한 GI-211의 기억력 유지 및 개선 효과를 확인한 도면이다. 여기에서, WT는 알츠하이머병이 없는 정상 대조군 마우스이고, Tg는 알츠하이머병을 지닌 실험군 마우스를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명에 따른 GI-211 투여 후 Tg-APP/PS1 마우스를 대상으로 수중미로실험을 수행한 결과를 나타낸 도면으로, 알츠하이머병 동물 모델에 대한 GI-211의 학습 능력과 기억력 유지 및 개선 효과를 확인한 도면이다. 여기에서, WT는 알츠하이머병이 없는 정상 대조군 마우스이고, Tg는 알츠하이머병을 지닌 실험군 마우스를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명에 따른 GI-210에 의한 플라크 침착 개선 효과를 분석하여 나타낸 도면으로, 상세하게는 GI-210 투여 후 티오플라빈 S 염색을 통해 Tg-APP/PS1 마우스의 뇌에서 플라크 침착 정도를 확인한 도면이다. A)는 단위 면적당 플라크의 수를 정량화하여 나타낸 그래프이고, B)는 플라크 면적 합을 정량화하여 나타낸 그래프이다. C)는 Tg-APP/PS1 마우스 및 GI-210이 처리된 Tg-APP/PS1 마우스의 뇌에서 티오플라빈 S가 염색된 플라크 침착 부위를 나타낸 이미지이다. 여기에서, Pacx는 두정엽 피질(parietal cortex)이고, dHP는 배측 해마(dorsal hippocampus)이며, Pircx는 이상엽 피질(piriform cortex) 영역이다. 또한, BLA는 기저외측 편도체(basolateral amygdala)이다.
도 21은 본 발명에 따른 GI-210에 의한 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ) 생성 억제 효과를 분석하여 나타낸 도면으로, 상세하게는 GI-210 투여 후 ELISA 어세이 수행을 통해 Tg-APP/PS1 마우스의 뇌에서 가용성 Aβ1-42 및 불가용성 Aβ1-42의 생성 수준을 정량화하여 나타낸 그래프이다. 여기에서, WT는 알츠하이머병이 없는 정상 대조군 마우스이고, Tg는 알츠하이머병을 지닌 실험군 마우스를 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명에 따른 GI-211에 의한 플라크 침착 개선 효과를 분석하여 나타낸 도면으로, 상세하게는 GI-211 투여 후 티오플라빈 S 염색을 통해 Tg-APP/PS1 마우스의 뇌에서 플라크 침착 정도를 확인한 도면이다. A)는 단위 면적당 플라크의 수를 정량화하여 나타낸 그래프이고, B)는 플라크 면적 합을 정량화하여 나타낸 그래프이다. C)는 Tg-APP/PS1 마우스 및 GI-211이 처리된 Tg-APP/PS1 마우스의 뇌에서 티오플라빈 S가 염색된 플라크 침착 부위를 나타낸 이미지이다. 여기에서, Pacx는 두정엽 피질이고, dHP는 배측 해마이며, Pircx는 이상엽 피질 영역이다. 또한, BLA는 기저외측 편도체이다.
도 23은 본 발명에 따른 GI-210을 투여한 Tg-APP/PS1 마우스의 뇌에서 미세아교세포(Iba-1)의 면역형광염색을 통해 Iba-1 발현 수준을 면적 및 형광세기로 정량화한 결과를 나타낸 도면이다. 여기에서, WT는 알츠하이머병이 없는 정상 대조군 마우스이고, Tg는 알츠하이머병을 지닌 실험군 마우스를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명에 따른 GI-210을 투여한 Tg-APP/PS1 마우스의 뇌에서 성상교세포(GFAP)의 면역형광염색을 통해 GFAP 발현 수준을 면적 및 형광세기로 정량화한 결과를 나타낸 도면이다. 여기에서, WT는 알츠하이머병이 없는 정상 대조군 마우스이고, Tg는 알츠하이머병을 지닌 실험군 마우스를 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명에 따른 GI-210을 투여한 Tg-APP/PS1 마우스의 뇌에서 자가포식 관련 단백질 LC3의 발현 정도를 면역형광염색을 통해 LC3 발현 수준을 형광세기로 정량화한 결과를 나타낸 도면이다.
GLP-1 및 GLP-2를 포함하는 이량체 단백질
본 발명의 일 측면은, GLP-1 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체; 및 GLP-2 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 단량체를 포함하는 이량체 단백질을 제공한다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "GLP-1(glucagon-like peptide-1)" 또는 "글루카곤 유사 펩타이드-1"은 전구호르몬인 전구글루카곤(proglucagon) 유전자의 전사 산물로부터 유래한 인크레틴(incretin)으로서, 장의 L 세포에서 장관 내 영양분 또는 혈당 농도에 자극을 받아 분비되는 호르몬이다. 이에, 현재 당뇨병 치료에 있어서 효과적으로 혈당을 낮출 수 있는 약제로서 연구, 개발되고 있다.
GLP-1은 30개의 아미노산으로 구성되어 있으며 GLP-1의 아미노산 서열은 모든 포유류에서 100% 동일한 것으로 알려져 있다. 전구글루카곤으로부터 전사 후 과정에 의해, 췌도 α 세포에서는 글루카곤이 만들어지며 회장과 대장의 L-세포에서는 GLP-1이 만들어지는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 상기 GLP-1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서는 GLP-1 혹은 이의 변이체를 총칭하여 "GLP-1"의 용어로 표현하기도 한다. GLP-1 및 GLP-1 변이체는 예를 들어 GLP-1 수용체(GLP-1R, glucagon-like peptide-1 receptor)에 특이적으로 결합한다. 이 특이적인 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 확인할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "GLP-1 변이체"는 전장(full-length) GLP-1의 아미노산 일부가 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 형태를 의미한다. 즉, GLP-1 변이체는 야생형 GLP-1과 다른 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러나, 상기 GLP-1 변이체는 야생형 GLP-1과 동등하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 여기에서, "GLP-1 활성"은 예를 들어 GLP-1 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 의미할 수 있으며, 이 특이적 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 측정할 수 있다.
구체적으로, 상기 GLP-1 변이체는 야생형 GLP-1의 아미노산 일부가 결실, 변형, 치환 및/또는 부가된 것일 수 있으며, 이는 당업자에게 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 상기 GLP-1 변이체는 야생형 GLP-1 서열의 적어도 5개 이상, 적어도 10개 이상, 적어도 15개 이상, 또는 적어도 20개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 GLP-1 변이체는 야생형 GLP-1의 아미노산 일부가 치환 및/또는 부가된 것일 수 있다. 아미노산 치환 및/또는 부가에 의한 GLP-1 변이체의 일 구체예로는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 2번째 및 30번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, C-말단에 9개의 아미노산 서열이 부가된 것일 수 있다. 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 2번째, 10번째, 12번째, 13번째, 14번째, 16번째, 17번째, 19번째, 20번째, 21번째, 24번째, 27번째, 28번째 및 30번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, C-말단에 9개의 아미노산 서열이 부가된 것일 수 있다. 더 나아가, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 28번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, C-말단에 1개의 아미노산 서열이 부가된 것일 수 있다.
이때, 상기 치환 및/또는 부가에 의해 도입되는 "아미노산"은 글리신(glycine, G), 류신(leucine, L), 리신(lysine, K), 글루타민(glutamine, Q), 메티오닌(methionine, M), 글루탐산(glutamic acid, E), 발린(valine, V), 아르기닌(arginine, R), 아스파라긴(asparagine, N), 프롤린(proline, P), 세린(serine, S) 및 알라닌(alanine, A)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구체예로, 상기 GLP-1 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 A2G 및 R30G로 치환이 일어나고, C-말단에 9개의 아미노산 서열 PSSGAPPPS(서열번호 44)가 부가된 것일 수 있다. 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 A2G, V10L, S12K, Y13Q, L14M, G16E, Q17E, A19V, K20R, E21L, A24E, V27K, K28N 및 R30G로 치환이 일어나고, C-말단에 9개의 아미노산 서열 PSSGAPPPS가 부가된 것일 수 있다. 더 나아가, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 K28R로 치환이 일어나고, C-말단에 1개의 아미노산 서열 G가 부가된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 GLP-1 변이체는 서열번호 2 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 GLP-1 변이체는 생체 내에서 작용 시간이 연장된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 야생형 GLP-1은 생체 내에서 DPP-4(dipeptidyl peptidase-4) 효소에 의해 매우 빠른 속도로 절단되어 불활성화되는 등 약물로 개발하는 데에 많은 어려움이 있다. 이에, 상기 GLP-1 변이체는 야생형 GLP-1에 변이를 일으켜 DPP-4 효소에 의한 절단을 줄인 것으로, 야생형 GLP-1의 생물학적 반감기(1 내지 2분)에 비하여 현저히 길어진 생물학적 반감기를 갖는 특징을 지닌 것일 수 있다.
한편, 상기 야생형 GLP-1은 처음 6개의 아미노산이 분자로부터 절단되도록 생체 내에서 가공된다. 따라서, 당업계에서의 관행에 의해, GLP-1의 아미노 말단은 7번으로, 카르복시-말단은 37번으로 지정된다. 상기 가공에 따라 인슐린 분비 기능이 없는 형태인 GLP-1(1-37)에서 GLP-1(7-37) 형태로 프로세싱되어 활성형 GLP-1(7-37)이 될 수 있으며, C-말단 글리신 잔기가 제거되고 아미드기로 대체되도록 생체 내에서 추가로 변형되어 GLP-1(7-36) 아미드(서열번호 1의 아미노산 서열)의 형태가 될 수 있다.
상기 "GLP-1" 또는 "글루카곤 유사 펩타이드-1"은 달리 언급되지 않는 한, 포유동물, 예를 들어, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)를 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득한 임의의 야생형 GLP-1을 의미한다. 상기 GLP-1은 동물 세포에서 수득된 것일 수도 있으나, GLP-1을 생산할 수 있는 재조합 세포로부터 수득된 것도 포함한다. 또한, 상기 GLP-1은 야생형 GLP-1 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "GLP-2(glucagon-like peptide-2)" 또는 "글루카곤 유사 펩타이드-2"는 장의 장내분비 L-세포 및 뇌의 특정 영역에서 프로글루카곤 전구체 형태로 생성되어, 장내 효소에 의한 효소 절단을 통해 생성되는 33개의 짧은 아미노산을 갖는 펩타이드 호르몬이다. 음식의 섭취와 함께 영양분 소화에 반응하여, 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 옥신토모듈린(oxyntomodulin, OXM) 및 글리센틴(glicentin)과 함께 동시 분비된다.
GLP-2는 소장, 대장에서 점막 성장을 유도하고, 장세포와 선와세포(crypt cell)의 성장 촉진 및 세포사멸(apoptosis)을 억제한다. 또한 GLP-2는 소장에서 영양분의 흡수를 증가시키고 장 투과성을 감소시킨다. 위 배출(gastric emptying) 및 위산 분비를 억제하고, 장 혈류 속도를 증가시키며, 장 평활근을 이완시킨다. GLP-2는 에너지 흡수 및 보호, 장 세포 기능의 활성화 등의 특징으로 다양한 장 질환과 장손상의 실험모델에서 치료제로서 유망한 가능성을 보여왔다.
구체적으로, 상기 GLP-2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서는 GLP-2 혹은 이의 변이체를 총칭하여 "GLP-2"의 용어로 표현하기도 한다. GLP-2 및 GLP-2 변이체는 예를 들어 GLP-2 수용체(GLP-1R, glucagon-like peptide-2 receptor)에 특이적으로 결합한다. 이 특이적인 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 확인할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "GLP-2 변이체"는 전장(full-length) GLP-2의 아미노산 일부가 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 형태를 의미한다. 즉, GLP-2 변이체는 야생형 GLP-2와 다른 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러나, 상기 GLP-2 변이체는 야생형 GLP-2와 동등하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 여기에서, "GLP-2 활성"은 예를 들어 GLP-2 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 의미할 수 있으며, 이 특이적 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 측정할 수 있다.
구체적으로, 상기 GLP-2 변이체는 야생형 GLP-2의 아미노산 일부가 결실, 변형, 치환, 또는 부가된 것일 수 있으며, 이는 당업자에게 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 상기 GLP-2 변이체는 야생형 GLP-2 서열의 적어도 5개 이상, 적어도 10개 이상, 적어도 15개 이상, 또는 적어도 20개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 GLP-2 변이체는 야생형 GLP-2의 아미노산 일부가 치환된 것일 수 있다. 아미노산 치환에 의한 GLP-2 변이체의 일 구체예로는 서열번호 5의 아미노산 서열에서 2번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 치환에 의해 도입되는 "아미노산"은 글리신(glycine, G)일 수 있다.
일 구체예로, 상기 GLP-2 변이체는 서열번호 5의 아미노산 서열에서 A2G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 GLP-2 변이체는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 GLP-2 변이체는 생체 내에서 작용 시간이 연장된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 야생형 GLP-2는 생체 내에서 DPP-4 효소에 의해 매우 빠른 속도로 절단되어 불활성화되는 등 약물로 개발하는 데에 많은 어려움이 있다. 이에, 상기 GLP-2 변이체는 야생형 GLP-2에 변이를 일으켜 DPP-4 효소에 의한 절단을 줄인 것으로, 야생형 GLP-2의 생물학적 반감기(약 7분)에 비하여 현저히 길어진 생물학적 반감기를 갖는 특징을 지닌 것일 수 있다.
한편, 상기 GLP-2 변이체는 다른 한가지 예로, 미국등록특허 US 7745403 B2에 개시된 GLP-2 유사체를 사용할 수 있다. 구체적으로, 2번 위치, 및 3, 5, 7, 10 및 11번 위치의 아미노산의 추가 치환, 및/또는 31 내지 33번 위치의 아미노산의 결실, 및/또는 N-말단 또는 C-말단에 안정화 펩타이드 서열의 부가와 함께, 8, 16, 24 및 28번 위치의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는, 2번 위치의 아미노산인 알라닌(A)은 글라이신(G), 세린(S), 또는 발린(V)으로, 3번 위치의 아미노산인 아스파르트산(D)은 글루탐산(E)으로, 5번 위치의 아미노산인 세린(S)은 트레오닌(T)으로, 6번 위치의 아미노산인 페닐알라닌(F)은 프롤린(P)으로, 7번 위치의 아미노산인 세린(S)은 트레오닌(T)으로, 8번 위치의 아미노산인 아스파르트산(D)은 세린(S)으로, 9번 위치의 아미노산인 글루탐산(E)은 아스파르트산(D)으로, 10번 위치의 아미노산인 메티오닌(M)은 류신(L), 노르류신(Nle), 또는 산화적으로 안정한 Met-대체 아미노산으로, 11번 위치의 아미노산인 아스파라긴(N)은 알라닌(A), 라이신(K), 또는 세린(S)으로, 12번 위치의 아미노산인 트레오닌(T)은 라이신(K)으로, 13번 위치의 아미노산인 이소류신(I)은 글루탐산(E) 또는 글루타민(Q)으로, 14번 위치의 아미노산인 류신(L)은 메티오닌(M) 또는 노르류신(Nle)으로, 15번 위치의 아미노산인 아스파르트산(D)은 글루탐산(E)으로, 16번 위치의 아미노산인 아스파라긴(N)은 알라닌(A)으로, 17번 위치의 아미노산인 류신(L)은 글루탐산(E)으로, 19번 위치의 아미노산인 알라닌(A)은 트레오닌(T)으로, 20번 위치의 아미노산인 아르기닌(R)은 라이신(K)으로, 21번 위치의 아미노산인 아스파르트산(D)은 이소류신(I)으로, 24번 위치의 아미노산인 아스파라긴(N)은 알라닌(A) 또는 글루탐산(E)으로, 28번 위치의 아미노산인 글루타민(Q)은 알라닌(A) 또는 아스파라긴(N)으로 치환될 수 있으며, 31번 위치의 아미노산인 이소류신(I)은 프롤린(P)으로 치환되거나 결실될 수 있고, 32번 위치의 아미노산인 트레오닌(T)은 결실될 수 있으며, 33번 위치의 아미노산인 아스파르트산(D)은 아스파라긴(N)으로 치환되거나 결실될 수 있다.
상기 "GLP-2" 또는 "글루카곤 유사 펩타이드-2"는 달리 언급되지 않는 한, 포유동물, 예를 들어, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)를 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득한 임의의 야생형 GLP-2를 의미한다. 상기 GLP-2는 동물 세포에서 수득된 것일 수도 있으나, GLP-2를 생산할 수 있는 재조합 세포로부터 수득된 것도 포함한다. 또한, 상기 GLP-2는 야생형 GLP-2 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "제1 단량체"는 GLP-1 또는 이의 변이체를 포함하는 단량체 단백질로, 보다 상세하게는 면역글로불린 Fc 단편의 힌지 부위에 GLP-1 또는 이의 변이체 부위가 결합하여 하나의 폴리펩타이드로 형성된 단량체 구조의 Ig 융합 단백질을 가리킨다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "제2 단량체"는 GLP-2 또는 이의 변이체를 포함하는 단량체 단백질로, 보다 상세하게는 면역글로불린 Fc 단편의 힌지 부위에 GLP-2 또는 이의 변이체 부위가 결합하여 하나의 폴리펩타이드로 형성된 단량체 구조의 Ig 융합 단백질을 가리킨다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "이량체 단백질"은 제1 단량체 단백질 및 제2 단량체 단백질을 포함하는 융합 단백질로, 상기 제1 단량체 단백질과 제2 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 이황화결합(disulfide bond)에 의해 결합된 이량체 구조의 Ig 융합 단백질을 가리킨다.
제1 단량체의 구조
GLP-1 또는 이의 변이체를 포함하는 '제1 단량체'는 IL-10 또는 이의 변이체를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "IL-10" 또는 "인터루킨-10(interleukin-10)"은 항염증 효과를 갖는 대표적인 사이토카인으로, 주로 단핵구와 림프구에서 분비되어 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6)와 같은 염증성 사이토카인의 생성 및 분비를 조절하는 역할을 담당한다. 체내의 각종 내독소에 의해 자극을 받은 단핵구에서 염증성 사이토카인이 분비되면 IL-10의 분비를 유발하게 되고, 증가된 IL-10은 단핵구에서 염증성 사이토카인 분비 및 활성 정도를 감소시키는 역할을 하게 된다. 구체적으로, 상기 IL-10은 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서는 IL-10 혹은 이의 변이체를 총칭하여 "IL-10 단백질" 혹은 "IL-10 폴리펩티드"의 용어로 표현하기도 한다. IL-10 및 IL-10 변이체는 예를 들어 IL-10 수용체(IL-10R, interleukin-10 receptor)에 특이적으로 결합한다. 이 특이적인 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 확인할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "IL-10 변이체"는 전장(full-length) IL-10의 아미노산 일부가 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 형태를 의미한다. 즉, IL-10 변이체는 야생형 IL-10과 다른 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러나, 상기 IL-10 변이체는 야생형 IL-10과 동등하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 여기에서, "IL-10 활성"은 예를 들어 IL-10 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 의미할 수 있으며, 이 특이적 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 측정할 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-10 변이체는 야생형 IL-10의 아미노산 일부가 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 것일 수 있으며, 이는 당업자에게 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 IL-10 변이체는 야생형 IL-10의 아미노산 일부가 삽입된 것일 수 있다. 아미노산 삽입에 의한 IL-10 변이체의 일 구체예로는 서열번호 7의 아미노산 서열의 116번째에 6개의 아미노산 서열이 삽입된 것일 수 있다. 이때, 상기 삽입에 의해 도입되는 "아미노산"은 글리신(glycine, G) 및 세린(serine, S)일 수 있다.
일 구체예로, 상기 IL-10 변이체는 서열번호 7의 아미노산 서열에서 116번째에 6개의 아미노산 서열, GGGSGG(서열번호 45)가 삽입된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-10 변이체는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 IL-10 또는 IL-10 변이체는 염증성 사이토카인, 예컨대 TNF-α의 분비 및 생성을 조절할 수 있으며, 이에 따라 TNF-α의 과도한 활성화와 관련있는 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD), 알츠하이머병이나 다발성신경염과 같은 뇌질환 등의 질환을 치료하거나 악화를 저해하는 특징을 지닐 수 있다.
상기 "IL-10" 또는 "인터루킨-10(interleukin-10)"은 달리 언급되지 않는 한, 포유동물, 예를 들어, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)를 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득한 임의의 야생형 IL-10을 의미한다. 상기 IL-10은 동물 세포에서 수득된 것일 수도 있으나, IL-10을 생산할 수 있는 재조합 세포로부터 수득된 것도 포함한다. 또한, 상기 IL-10은 야생형 IL-10 또는 이의 변이체일 수 있다.
상기 이량체 단백질의 '제1 단량체'는 구체적으로 하기 구조식, (I) 또는 (II)로 이루어진 것일 수 있다:
N'-X-[링커(1)]n-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(2)]m-(Y)o-C' (I)
N'-(Y)o-[링커(1)]n-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(2)]m-X-C' (II)
이때, 상기 구조식 (I) 및 (II)에 있어서,
상기 N'은 융합 단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합 단백질의 C-말단이며,
상기 X는 GLP-1 또는 이의 변이체이고,
상기 Y는 IL-10 또는 이의 변이체이며,
상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이고,
상기 m, n 및 o는 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
제2 단량체의 구조
GLP-2 또는 이의 변이체를 포함하는 '제2 단량체'는 IL-10 또는 이의 변이체를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 "IL-10" 및 "IL-10 변이체"는 전술한 바와 같다.
상기 이량체 단백질의 '제2 단량체'는 구체적으로 하기 구조식 (III) 또는(IV)로 이루어진 것일 수 있다:
N'-Z-[링커(3)]p-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(4)]q-(Y)r-C' (III)
N'-(Y)r-[링커(3)]p-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(4)]q-Z-C' (IV)
이때, 상기 구조식 (III) 및 (IV)에 있어서,
상기 N'은 융합 단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합 단백질의 C-말단이며,
상기 Z는 GLP-2 또는 이의 변이체이고,
상기 Y는 IL-10 또는 이의 변이체이며,
상기 링커(3) 및 링커(4)는 펩타이드 링커이고,
상기 p, q 및 r는 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
Fc 영역
본 발명에 따른 '이량체 단백질'에 포함되는 제1 단량체 및/또는 제2 단량체는 Fc 영역 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "Fc 영역 단편", "Fc 영역", "Fc 단편" 또는 "Fc"란 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역(CL)은 포함하지 않는 단백질을 말한다. 이것은 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "Fc 영역 변이체"는 Fc 영역 중 일부 아미노산이 치환되거나, 서로 다른 종류의 Fc 영역을 조합하여 제조된 것을 의미한다. 상기 Fc 영역 변이체는 힌지 부위에서 절단되는 것을 예방하기 위해 변형될 수 있다.
상기 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 불변영역(구체적으로는 Fc 영역)을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
상기 Fc 영역은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역일 수 있으며, 구체적으로, IgG1에서 유래한 것일 수 있다.
또한, 상기 Fc 영역은 놉 구조 또는 홀 구조를 포함할 수 있다.
"놉-인투-홀(knob-into-hole)"은 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 또는 단일 아암(arm) 항체의 효율적 생성을 위한 이종이량체화를 위해 항체 중쇄 동종이량체를 조작하기 위한 설계 전략이다. 일반적으로, 이러한 기술은 제1 폴리펩타이드의 경계면(가령, 제1 항체 중쇄의 제1 CH3 도메인)에 놉(knob)을 그리고 제2 폴리펩타이드의 경계면(가령, 제2 항체 중쇄의 제2 CH3 도메인)에 상응하는 홀(hole)을 도입하는 것을 포함하고, 그리하여 놉을 홀 내 위치시켜 이종이량체 형성을 촉진시키고 동종이량체 형성을 방해하도록 할 수 있다.
'놉'은 제1 폴리펩타이드의 경계면(가령, 제1 항체 중쇄의 제1 CH3 도메인)으로부터의 소형 아미노산 측쇄들을 보다 큰 측쇄들(예컨대, 아르기닌, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 구축된다. 상기 놉에 동일하거나 유사한 크기의 상보적 '홀'은 제2 폴리펩타이드의 경계면(가령, 제2 항체 중쇄의 제2 CH3 도메인)에서 대형 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄들(예컨대, 알라닌, 세린, 발린, 또는 트레오닌)로 대체함으로써 생성된다. 상기 놉 및 홀은 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을, 예컨대, 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해, 또는 펩타이드 합성에 의해 변경함으로써 생성될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 IgG1의 놉 구조는 서열번호 10일 수 있고, 홀 구조는 서열번호 11일 수 있다. 상기 놉 구조 또는 홀 구조는 상기 서열번호 11의 아미노산 서열에서 117번째, 122번째, 134번째, 136번째 및 175번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서 놉 구조는 또는 홀 구조는 Y117C, C122S, W134S, L136A 및 Y175V, 또는 C117Y, S122C, S134W, A136L 및 V175Y로 치환된 형태일 수 있다.
본 발명의 Fc 단편은 야생형 당쇄, 야생형에 비해 증가된 당쇄, 야생형에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거된(deglycosylated) 형태일 수 있다. 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 면역글로불린 Fc 당쇄의 증가, 감소 또는 제거가 수행될 수 있다. Fc 단편으로부터 당쇄의 제거는 1차 보체 구성요소 C1의 C1q에의 결합 친화력을 급격하게 감소시키고, ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 또는 CDC(complement-dependent cytotoxicity)의 감소 또는 소실을 가져오며, 그로 인하여 생체 내의 불필요한 면역반응을 유도하지 않는다. 이런 점에서, 당쇄가 제거되거나(deglycosylated) 비당쇄화된(aglycosylated) 형태에서의 면역글로불린 Fc 단편은, 약물의 담체로서 본 발명의 목적에 더 적합할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "당쇄의 제거(deglycosylation)"는 Fc 단편으로부터 효소적으로 당이 제거됨을 의미하고, 용어 "비당쇄화(aglycosylation)"는 Fc 단편이 원핵 생물, 바람직하게는 E.coli에 의하여 당쇄화 되지 않은(unglycosylated) 형태로 생성됨을 의미한다.
펩타이드 링커
본 명세서에서 사용하는 용어, "펩타이드 링커"는 융합 단백질 내에서 도메인과 도메인 사이에 물리 화학적 거리를 두거나, 혹은 연결을 위하여 사용되는 펩타이드이다.
상기 펩타이드 링커(1) 및 링커(3)은 각각 GLP-1 또는 GLP-2를 Fc 영역 단편 또는 이의 변이체와 연결하는 링커일 수 있다. 상기 상기 펩타이드 링커(1) 및 링커(3)은 각각 5 내지 50개의 연속된 아미노산, 10 내지 45개의 연속된 아미노산, 또는 15 내지 40개의 연속된 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 펩타이드 링커(1) 및 링커(3)은 각각 33개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 펩타이드 링커(1) 및 링커(3)은 각각 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 한 개, 두 개 또는 세 개의 시스테인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커(1) 및 링커(3)은 각각 면역글로불린의 힌지에서 유래된 것일 수 있다. 일 구체예로 상기 펩타이드 링커(1) 및 링커(3)은 각각 (G4S)n(이때, n은 1 내지 10의 정수)을 포함할 수 있다. 이때, (G4S)n에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커(1) 및 링커(3)은 각각 면역글로불린의 힌지에서 유래된 서열을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 펩타이드 링커(1) 및 링커(3)은 각각 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
상기 펩타이드 링커(2) 및 링커(4)는 각각 Fc 영역 단편 또는 이의 변이체와 IL-10 또는 이의 변이체를 연결하는 링커일 수 있다. 상기 펩타이드 링커(2) 및 링커(4)는 각각 5 내지 50개의 연속된 아미노산, 10 내지 45개의 연속된 아미노산, 또는 15 내지 40개의 연속된 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 펩타이드 링커(2) 및 링커(4)는 각각 18개 내지 33개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 상기 링커는 집업 링커(zip-up linker), 유연성 링커(flexible linker), 비유연성 링커(rigid linker), 부분성 링커(partial linker), 또는 자가-조립 영역성 링커(self-aseembling resion linker) 등일 수 있다.
구체적으로, 상기 집업 링커는 양전하(amphiphilic)를 가지는 링커로, 일반적으로 (RADA)n의 형태를 포함할 수 있다. 이때, (RADA)n에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 집업 링커는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
상기 유연성 링커는 기본적으로 링커에 존재하는 아미노산끼리 서로 반발하거나 집적하는 성질이 없어 유연한 움직임을 보이는 링커로, (G4S)n의 형태를 포함할 수 있다. 이때, (G4S)n에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 유연성 링커는 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
상기 비유연성 링커는 유연성 링커의 불규칙 코일(random coil)에 비해 안정한 입체 구조를 형성할 수 있는 링커로, 글루타민(Q), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 아스파라긴(N), 세린(S), 류신(L), 트레오닌(T), 프롤린(P), 페닐알라닌(F), 글루탐산(E) 및 티로신(Y)으로 구성된 군에서 선택되는 5 내지 50개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 비유연성 링커는 서열번호 14 또는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어질 펩타이드 링커일 수 있다.
상기 부분 링커는 유연성 링커와 비유연성 링커의 구성이 혼합된 링커로, 유연성 링커 (G4S)n의 형태 및 비유연성 링커 (AP)n의 형태를 포함할 수 있다. 이때, (G4S)n 및 (AP)n에서 n은 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 부분 링커는 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
상기 자가-조립 영역성 링커는 자발적으로 비공유 결합을 통해 결합되는 특성을 갖는 링커로, 유연성 링커(G4S)n의 형태를 포함하고, 시스테인(C), 트립토판(W), 글루탐산(E), 세린(S), 알라닌(A) 및 류신(L)으로 구성된 군에서 선택되는 5 내지 50개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 포함할 수도 있다. 이때, (G4S)n에서 n은 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 자가-조립 영역성 링커는 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
종합하면, 상기 펩타이드 링커(2) 및 링커(4)는 각각 서열번호 12 내지 17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다.
이량체 단백질의 구조
전술한 바와 같이, '이량체 단백질'은 제1 단량체 단백질 및 제2 단량체 단백질을 포함하는 융합 단백질로, 상세하게는 구조식 (I) 및 구조식 (III)의 단량체를 포함하거나, 구조식 (II) 및 구조식 (IV)의 단량체를 포함할 수 있다.
구체적으로, 구조식 (I) 및 구조식 (III)의 단량체를 포함하는 이량체 단백질은 하기와 같다:
N'-X-[링커(1)]n-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(2)]m-(Y)o-C' (I)
N'-Z-[링커(3)]p-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(4)]q-(Y)r-C' (III)
이때, 상기 구조식 (I) 및/또는 (III)에 있어서,
상기 N'은 융합 단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합 단백질의 C-말단이며,
상기 X는 GLP-1 또는 이의 변이체이고,
상기 Z는 GLP-2 또는 이의 변이체이며,
상기 Y는 IL-10 또는 이의 변이체이고,
상기 링커(1), 링커(2), 링커(3) 및 링커(4)는 펩타이드 링커이고,
상기 m, n, o, p, q 및 r은 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
상기 GLP-1 또는 이의 변이체; GLP-2 또는 이의 변이체; IL-10 또는 이의 변이체는 전술한 바와 같다.
구체적으로, 상기 X는 서열번호 1, 2, 3, 또는 4의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 Z는 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 Y는 서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
더 나아가, 상기 X, Z 및 Y는 각각의 해당 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 혹은 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 이때, 동일성은, 예를 들어, 퍼센트 상동성, NCBI(National Center of Biotechnology Information)의 BlastN software과 같은 상동성 비교 소프트웨어를 통해 결정될 수 있다.
또한, 상기 링커(1), 링커(2), 링커(3) 및 링커(4)는 전술한 바와 같다.
구체적으로, 상기 링커(1) 및 링커(3)은 각각 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 링커(2) 및 링커(4)는 각각 서열번호 12, 13, 14, 15, 16 또는 17의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 Fc 영역 단편 또는 이의 변이체는 전술한 바와 같다.
구체적으로, 상기 Fc 영역 단편 또는 이의 변이체는 서열번호 10 또는 11의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 이량체 단백질은 N-말단으로부터 순차적으로 서열번호 2(GLP-1의 변이체), 서열번호 9(링커), 서열번호 10(Fc 영역 단편의 변이체; 놉 구조), 서열번호 12(링커) 및 서열번호 8(IL-10의 변이체)을 포함하는 서열을 갖는 제1 단량체; 및 N-말단으로부터 순차적으로 서열번호 6(GLP-2의 변이체), 서열번호 9(링커), 서열번호 11(Fc 영역 단편의 변이체; 홀 구조), 서열번호 12(링커) 및 서열번호 8(IL-10의 변이체)을 포함하는 서열을 갖는 제2 단량체;를 포함하는 것일 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 상기 이량체 단백질은 N-말단으로부터 순차적으로 서열번호 2(GLP-1의 변이체), 서열번호 9(링커), 서열번호 10(Fc 영역 단편의 변이체; 놉 구조), 서열번호 12(링커) 및 서열번호 8(IL-10의 변이체)을 포함하는 서열을 갖는 제1 단량체; 및 N-말단으로부터 순차적으로 서열번호 6(GLP-2의 변이체), 서열번호 9(링커) 및 서열번호 11(Fc 영역 단편의 변이체; 홀 구조)을 포함하는 서열을 갖는 제2 단량체;를 포함하는 것일 수 있다.
한편, 구조식 (II) 및 구조식 (IV)의 단량체를 포함하는 이량체 단백질은 하기와 같다:
N'-(Y)o-[링커(1)]n-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(2)]m-X-C' (II)
N'-(Y)r-[링커(3)]p-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(4)]q-Z-C' (IV)
이때, 상기 구조식 (II) 및/또는 (IV)에 있어서,
상기 N'은 융합 단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합 단백질의 C-말단이며,
상기 X는 GLP-1 또는 이의 변이체이고,
상기 Z는 GLP-2 또는 이의 변이체이며,
상기 Y는 IL-10 또는 이의 변이체이고,
상기 링커(1), 링커(2), 링커(3) 및 링커(4)는 펩타이드 링커이고,
상기 m, n, o, p, q 및 r은 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
일 구현예에 있어서, 상기 이량체 단백질은 N-말단으로부터 순차적으로 서열번호 8(IL-10의 변이체), 서열번호 9(링커), 서열번호 10(Fc 영역 단편의 변이체; 놉 구조), 서열번호 12(링커), 및 서열번호 2(GLP-1의 변이체)를 포함하는 서열을 갖는 제1 단량체; 및 N-말단으로부터 순차적으로 서열번호 8(IL-10의 변이체), 서열번호 9(링커), 서열번호 11(Fc 영역 단편의 변이체; 홀 구조), 서열번호 12(링커), 및 서열번호 6(GLP-2의 변이체)을 포함하는 서열을 갖는 제2 단량체;를 포함하는 것일 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 상기 이량체 단백질은 N-말단으로부터 순차적으로 서열번호 8(IL-10의 변이체), 서열번호 9(링커), 서열번호 10(Fc 영역 단편의 변이체; 놉 구조), 서열번호 12(링커), 및 서열번호 2(GLP-1의 변이체)를 포함하는 서열을 갖는 제1 단량체; 및 N-말단으로부터 순차적으로 서열번호 11(Fc 영역 단편의 변이체; 홀 구조), 서열번호 12(링커), 및 서열번호 6(GLP-2의 변이체)를 포함하는 서열을 갖는 제2 단량체;를 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 이량체 단백질에 포함되는 제1 단량체 및/또는 제2 단량체의 N-말단에 시그널 펩타이드가 더 포함될 수 있다.
상기 시그널 펩타이드는 분비 신호 펩타이드인 tPA(Tissue-type plasminogen activator) 시그널 펩타이드일 수 있으나, 이에 특별히 제한되지 않는다. 상기 시그널 펩타이드는 시그널 서열 데이터베이스(signal sequence database; http://signalpeptide.de/index.php)에서 발견되는 많은 다른 시그널 펩타이드일 수 있다.
구체적으로, 상기 시그널 펩타이드는 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 바람직한 이량체 단백질은 N-말단으로부터 순차적으로 서열번호 18(tPA 시그널 펩타이드), 서열번호 2(GLP-1의 변이체), 서열번호 9(링커), 서열번호 10(Fc 영역 단편의 변이체; 놉 구조), 서열번호 12(링커), 및 서열번호 8(IL-10의 변이체)을 포함하는 서열을 갖는 제1 단량체; 및 N-말단으로부터 순차적으로 서열번호 18(tPA 시그널 펩타이드), 서열번호 6(GLP-2의 변이체), 서열번호 9(링커), 서열번호 11(Fc 영역 단편의 변이체; 홀 구조), 서열번호 12(링커), 및 서열번호 8(IL-10의 변이체)을 포함하는 서열을 갖는 제2 단량체;를 포함하는 것일 수 있다. 본 명세서에서 상기 이량체 단백질을 'GI-210'으로 칭하였으며, 이는 서열번호 19 및 20의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 구현예에 따른 바람직한 이량체 단백질은 N-말단으로부터 순차적으로 서열번호 18(tPA 시그널 펩타이드), 서열번호 2(GLP-1의 변이체), 서열번호 9(링커), 서열번호 10(Fc 영역 단편의 변이체; 놉 구조), 서열번호 12(링커), 및 서열번호 8(IL-10의 변이체)을 포함하는 서열을 갖는 제1 단량체; 및 N-말단으로부터 순차적으로 서열번호 18(tPA 시그널 펩타이드), 서열번호 6(GLP-2의 변이체), 서열번호 9(링커), 및 서열번호 11(Fc 영역 단편의 변이체; 홀 구조)을 포함하는 서열을 갖는 제2 단량체;를 포함하는 것일 수 있다. 본 명세서에서 상기 이량체 단백질을 'GI-211'로 칭하였으며, 이는 서열번호 19 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
GLP-1/GLP-2 및 IL-10을 포함하는 이량체 단백질의 용도
본 발명의 다른 측면은, 전술한 이량체 단백질을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
전술한 바와 같이, 상기 이량체 단백질은 GLP-1 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체; 및 GLP-2 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 단량체를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 제1 단량체 및/또는 제2 단량체는 IL-10 또는 이의 변이체를 추가적으로 더 포함할 수 있다.
상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병, 헌팅턴병, 경도인지장애(mild cognitive impairment), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 다운증후근, 아밀로이드성 뇌졸증(stroke), 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증, 니만-픽병, 노인성 치매, 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증(Spinocerebellar Atrophy), 뚜렛 증후군(Tourette's Syndrome), 프리드리히 보행실조(Friedrich's Ataxia), 마차도-조셉 병(Machado-Joseph's disease), 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 근육긴장이상(Dystonia), 진행성 핵상 마비(Progressive Supranuclear Palsy) 및 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 퇴행성 뇌질환 치료용 또는 예방용 약학 조성물에서 상기 이량체 단백질은 퇴행성 뇌질환 치료 활성을 나타내거나, 특히, 알츠하이머병에 치료 효과를 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량% 내지 20.0 중량% 범위 내에서 결정될 수 있다. 여기서 "유효량"이란 질환의 상태 개선 또는 치료(treatment) 효과, 특히 알츠하이머병의 상태 개선 또는 치료 효과를 유도할 수 있는 상기 이량체 단백질의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "치료"는 치료학적 처리 및 예방적 처리를 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 이때, 예방은 개체의 병리학적 상태 또는 질환을 완화시키거나 감소시키는 의미로 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 용어 "치료"는 인간을 포함한 포유류에서 질환을 치료하기 위한 적용이나 어떠한 형태의 투약을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 질환의 진행을 억제하거나 늦추는 것을 포함하며; 손상되거나, 결손된 기능을 회복시키거나, 수리하여, 질환을 부분적이거나 완전하게 완화시키거나; 또는 비효율적인 프로세스를 자극하거나; 심각한 질환을 완화하는 의미를 포함한다.
생체이용률과 같은 약동학적 파라미터(Pharmacokinetic parameters) 및 클리어런스율(clearance rate)과 같은 기본적인 파라미터(underlying parameters)도 효능에 영향을 줄 수 있다. 따라서, "향상된 효능"(예를 들어, 효능의 개선)은 향상된 약동학적 파라미터 및 향상된 효능에 기인할 수 있으며, 시험 동물 또는 인간 대상체에서 클리어런스율 및 퇴행성 뇌질환 치료 또는 개선과 같은 파라미터를 비교하여 측정될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 치료학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
여기서 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 구현예에서 치료학적으로 유효한 양은 퇴행성 뇌질환을 치료하는데 효과적인 약물의 양을 의미한다.
이때, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 상기 이량체 단백질 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 상기 이량체 단백질의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.01 ㎍/㎏ 내지 10 g/㎏ 범위, 또는 0.01 ㎎/㎏ 내지 1 g/㎏ 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
상기 약학 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 이량체 단백질 이외에, 퇴행성 뇌질환 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 화합물이나 천연 추출물은 상기 약학 조성물과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
GLP-1 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 또 다른 측면은, GLP-1 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이때, 상기 폴리뉴클레오티드의 일 구체예는 서열번호 33의 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 제1 단량체에 포함되는 GLP-1 또는 이의 변이체는 전술한 바와 같다.
한편, 상기 제1 단량체는 IL-10 또는 이의 변이체를 추가적으로 더 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 신호서열(signal sequence) 또는 리더 서열(leader sequence)을 코딩하는 핵산을 추가적으로 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "신호서열"은 목적 단백질의 분비를 지시하는 신호펩타이드를 의미한다. 상기 신호펩타이드는 숙주세포에서 번역된 후에 절단된다. 구체적으로, 상기 신호서열은 ER(endoplasmic reticulum) 막을 관통하는 단백질의 이동을 개시하는 아미노산 서열이다. 일 실시예로, 상기 신호서열은 서열번호 18의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
신호서열은 당업계에 그 특징이 잘 알려져 있으며, 통상 16 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하나, 그보다 더 많거나 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 신호 펩타이드는 기본 N-말단 영역, 중심의 소수성 영역, 및 보다 극성인(polar) C-말단 영역의 세 영역으로 구성된다. 중심 소수성 영역은 미성숙 폴리펩타이드가 이동하는 동안 막지질 이중층을 통하여 신호서열을 고정시키는 4 내지 12개의 소수성 잔기를 포함한다.
개시 이후에, 신호서열은 흔히 신호 펩티다아제(signal peptidases)로 알려진 세포 효소에 의하여 ER의 루멘(lumen) 내에서 절단된다. 이때, 상기 신호서열은 tPa(tissue Plasminogen Activation), HSV gDs(signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D), 또는 성장 호르몬(growth hormone)의 분비신호서열일 수 있다. 바람직하게, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵세포에서 사용되는 분비 신호서열을 사용할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 33과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 동일성을 가지는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engelsnd Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl, 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오티드 합성법 등을 들 수 있다.
GLP-1 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적재된 벡터
본 발명의 또 다른 측면은 상기 GLP-1 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 GLP-1 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체는 전술한 바와 같다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함할 수 있다. 상기 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 이때, 상기 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터, 미니-염색체 및 이의 유사체들을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 플라스미드는 항생제 내성 유전자와 같은 선별 마커를 포함할 수 있고, 플라스미드를 유지하는 숙주 세포는 선택적인 조건하에서 배양될 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.
상기 벡터는 상기 본 발명의 제1 단량체 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이때, 사용되는 벡터는 본 발명의 제1 단량체 단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 벡터는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 벡터는 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등) 등이 될 수 있다. 상기 벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시예에서는 pcDNA3.4 벡터를 사용하였다.
GLP-1 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체를 발현하는 형질전환된 세포
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 GLP-1 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
상기 GLP-1 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체는 전술한 바와 같다.
상기 형질전환 세포는 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환시켜서 제작될 수 있다. 또한, 상기 벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 본 발명의 제1 단량체 단백질을 생산할 수 있다.
상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있다. 본 발명의 제1 단량체 단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다, 구체적으로, 상기 형질전환 방법은 CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 형질전환 세포의 제작에 사용되는 숙주세포 역시 본 발명의 제1 단량체 단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 숙주세포는 원핵세포, 진핵세포, 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 상기 원핵세포의 일 예로는 대장균을 사용할 수 있다. 또한, 진핵세포의 일 예로는 효모를 사용할 수 있다. 또한, 상기 포유동물 세포로 CHO 세포, F2N 세포, CSO 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, SP2/0 세포, 인간 림프아구(human lymphoblastoid), NSO 세포, HT-1080 세포, PERC.6 세포, HEK 293 세포 또는 HEK293T 세포 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
GLP-1 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체의 생산방법
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 GLP-1 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체의 생산방법을 제공한다.
상기 제1 단량체의 생산방법은 i) 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및 ii) 본 발명의 GLP-1 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다.
상기 형질전환 세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 본 발명의 제1 단량체 단백질을 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족시킬 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용할 수 있다. 이외에 탄소원으로는 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함될 수 있다. 또한, 상기 탄소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 상기 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다.
상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 배지에 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질을 더 첨가할 수 있다.
또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다.
아울러, 배양물로부터 상기 제1 단량체 단백질을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 제1 단량체 단백질을 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 회수 방법은 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법일 수 있다.
GLP-2 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 또 다른 측면은, GLP-2 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이때, 상기 폴리뉴클레오티드의 일 구체예는 서열번호 34 또는 35의 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 제2 단량체에 포함되는 GLP-2 또는 이의 변이체는 전술한 바와 같다.
한편, 상기 제2 단량체는 IL-10 또는 이의 변이체를 추가적으로 더 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 신호서열 또는 리더 서열을 코딩하는 핵산을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이는 전술한 바와 같다.
일 구현예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 34 또는 35와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 동일성을 가지는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
GLP-2 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적재된 벡터
본 발명의 또 다른 측면은 상기 GLP-2 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 GLP-2 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 단량체와 벡터에 관한 것은 전술한 바와 같다. 이때, 상기 벡터는 본 발명의 제2 단량체 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 벡터는 본 발명의 제2 단량체 단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시예에서는 pcDNA3.4 벡터를 사용하였다.
GLP-2 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 단량체를 발현하는 형질전환된 세포
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 GLP-2 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
상기 GLP-2 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 단량체와 형질전환 세포에 관한 것은 전술한 바와 같다. 이때, 상기 형질전환 세포는 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환시켜서 제작될 수 있으며, 상기 벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 본 발명의 제2 단량체 단백질을 생산할 수 있다.
상기 형질전환은 전술한 바와 같은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있으며, 본 발명의 제2 단량체 단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다,
또한, 상기 형질전환 세포의 제작에 사용되는 숙주세포는 전술한 바와 같으며, 본 발명의 제2 단량체 단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다.
GLP-2 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 단량체의 생산방법
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 GLP-2 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 단량체의 생산방법을 제공한다.
상기 제2 단량체의 생산방법은 i) 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및 ii) 본 발명의 GLP-2 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 단량체를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이, 상기 형질전환 세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 상기 배양은 본 발명의 제2 단량체 단백질을 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다.
상기 배양에 사용되지 배지 또한 전술한 바와 같으며, 배양물로부터 상기 제2 단량체 단백질을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수도 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 제2 단량체 단백질을 회수할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다.
제1 단량체 및 제2 단량체를 발현하는 형질전환된 세포
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 제1 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
상기 제1 단량체 및 제2 단량체와 형질전환 세포에 관한 것은 전술한 바와 같다. 이때, 상기 형질전환 세포는 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환시켜서 제작될 수 있으며, 상기 벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 본 발명의 이량체 단백질을 생산할 수 있다.
상기 형질전환은 전술한 바와 같은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있으며, 본 발명의 이량체 단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다,
또한, 상기 형질전환 세포의 제작에 사용되는 숙주세포는 전술한 바와 같으며, 본 발명의 이량체 단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다.
제1 단량체 및 제2 단량체를 포함하는 이량체의 생산방법
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 제1 단량체 및 제2 단량체를 포함하는 이량체의 생산방법을 제공한다.
상기 이량체의 생산방법은 i) 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계; ii) 제1 단량체 및 제2 단량체를 포함하는 이량체 단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이, 상기 형질전환 세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 상기 배양은 본 발명의 이량체 단백질을 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다.
상기 배양에 사용되지 배지 또한 전술한 바와 같으며, 배양물로부터 상기 이량체 단백질을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수도 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 이량체 단백질을 회수할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면은, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 상기 이량체 단백질의 용도를 제공한다. 이때, 상기 이량체 단백질, 퇴행성 뇌질환, 예방 및 치료는 전술한 바와 동일하다.
본 발명의 또 다른 측면은, 퇴행성 뇌질환을 예방하거나 치료하기 위한 상기 이량체 단백질의 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 용도를 제공한다. 여기서 이량체 단백질, 퇴행성 뇌질환, 예방 및 치료는 전술한 바와 동일하다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 이량체 단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
여기서 이량체 단백질, 투여, 퇴행성 뇌질환, 예방 및 치료는 전술한 바와 동일하다. 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다. 또한, 상기 개체는 퇴행성 뇌질환을 앓는 환자이거나 퇴행성 뇌질환을 앓을 가능성이 큰 개체일 수 있다.
상기 이량체 단백질의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 바작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 이량체 단백질은 퇴행성 뇌질환 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
I. 이량체 단백질의 제조
제조예 1. GLP-1/GLP-2-IgG1 Fc knob in hole-IL-10 변이체의 제조: GI-210
인간 GLP-1, GLP-2, knob into hole 형태의 IgG1 Fc 도메인 및 IL-10 변이체를 포함하는 융합 단백질을 생산하기 위하여, tPA 시그널 펩타이드(서열번호 18), hGLP-1 변이체(서열번호 2), Ig 힌지(서열번호 9), knob 형태의 hIgG1 Fc 도메인(서열번호 10), 링커(서열번호 12) 및 hIL-10 변이체(서열번호 8)를 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드[제1 단량체]를 Thermo Fisher사의 GeneArtTM Gene Synthesis 서비스를 통해 pcDNA3.4 벡터에 적재하였다. 한편, tPA 시그널 펩타이드(서열번호 18), hGLP-2 변이체(서열번호 6), Ig 힌지(서열번호 9), hole 형태의 hIgG1 Fc 도메인(서열번호 11), 링커(서열번호 12) 및 hIL-10 변이체(서열번호 8)를 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드[제2 단량체]를 Thermo Fisher사의 GeneArtTM Gene Synthesis 서비스를 통해 pcDNA3.4 벡터에 적재하였다.
또한, 상기 각각의 벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-S cell)에 도입하여 서열번호 19의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드로 구성되는 이량체 단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, CO2 8% 조건에서 무혈청(serum-free) ExpiCHOTM 발현 배지(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 14일간 배양하였다. 배양 후 배양액을 수거하고, 이를 친화크로마토그래피(Affinity purification column)를 이용하여 이량체 단백질을 정제하였다. 상기 정제한 이량체 단백질을 "GI-210(GI-210_26V로도 칭함)"으로 명명하였다. 상기 정제한 이량체 단백질의 농도는 23 ㎎/L인 것으로 확인되었다(도 1).
제조예 2. GLP-1/GLP-2-IgG1 Fc knob in hole-IL-10 변이체의 제조: GI-211
인간 GLP-1, GLP-2, knob into hole 형태의 IgG1 Fc 도메인 및 IL-10 변이체를 포함하는 융합 단백질을 생산하기 위하여, tPA 시그널 펩타이드(서열번호 18), hGLP-1 변이체(서열번호 2), Ig 힌지(서열번호 9), knob 형태의 hIgG1 Fc 도메인(서열번호 10), 링커(서열번호 12) 및 hIL-10 변이체(서열번호 8)를 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드[제1 단량체]를 Thermo Fisher사의 GeneArtTM Gene Synthesis 서비스를 통해 pcDNA3.4 벡터에 적재하였다. 한편, tPA 시그널 펩타이드(서열번호 18), hGLP-2 변이체(서열번호 6), Ig 힌지(서열번호 9) 및 hole 형태의 hIgG1 Fc 도메인(서열번호 11)을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드[제2 단량체]를 Thermo Fisher사의 GeneArtTM Gene Synthesis 서비스를 통해 pcDNA3.4 벡터에 적재하였다.
또한, 상기 벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-S cell)에 도입하여 서열번호 19의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드로 구성되는 이량체 단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, CO2 8% 조건에서 무혈청(serum-free) ExpiCHOTM 발현 배지(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 14일간 배양하였다. 배양 후 배양액을 수거하고, 이를 친화크로마토그래피(Affinity purification column)를 이용하여 이량체 단백질을 정제하였다. 상기 정제한 이량체 단백질을 "GI-211(GI-211_26V1로도 칭함)"으로 명명하였다(도 2).
한편, 상기 정제시 결합 조건은 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.4의 조건으로 하였다. 결합 후, 100 mM NaCl 및 100 mM의 아세트산(pH 3) 용액으로 용출하였다. pH 7.4의 10%의 1.5 M Tris-HCl를 수거용 튜브에 넣은 후, 이량체 단백질을 수거하였다. 수거된 이량체 단백질을 16시간 동안 PBS 버퍼로 투석하였다.
그 후, TSKgel G3000SWXL column(TOSOH Bioscience)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용하여 정제하였다. 시간에 따른 280 ㎚ 파장에서의 흡광도를 측정하여 고농도 이량체 단백질을 확보하였다. 이때, 분리 정제된 이량체 단백질은 reduced(R) 또는 non-reduced(NR) 조건하에서 SDS-PAGE를 실행하고, 코마시블루(coomassie blue)로 염색하여 그 순도를 확인하였다(도 5 및 도 7). NanoDrop을 사용하여 검출시 0.77 ㎎/㎖의 농도로 이량체 단백질이 포함된 것을 확인하였다. 상기 수득한 이량체 단백질의 총량은 20.3 ㎎(26.4 ㎖의 PBS 중 0.77 ㎎/㎖)이었다. 또한, 웨스턴 블롯을 수행하여 분석한 결과는 도 6 및 도 8에 나타낸 바와 같다.
제조예 3. GLP-1/GLP-2-IgG1 Fc knob in hole의 제조: GI-210-CN
대조군으로서 인간 GLP-1, GLP-2 및 knob into hole 형태의 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질을 생산하기 위하여, tPA 시그널 펩타이드, hGLP-1 변이체, Ig 힌지 및 knob 형태의 hIgG1 Fc 도메인을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합 단백질(서열번호 36)을 코딩하는 염기서열(서열번호 37)을 포함하는 폴리뉴클레오티드[제1 단량체]를 Thermo Fisher사의 GeneArtTM Gene Synthesis 서비스를 통해 pcDNA3.4 벡터(vector)에 적재하였다. 한편, tPA 시그널 펩타이드, hGLP-2 변이체, Ig 힌지 및 hole 형태의 hIgG1 Fc 도메인을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합 단백질(서열번호 38)을 코딩하는 염기서열(서열번호 39)을 포함하는 폴리뉴클레오티드[제2 단량체]를 Thermo Fisher사의 GeneArtTM Gene Synthesis 서비스를 통해 pcDNA3.4 벡터에 적재하였다.
또한, 상기 각각의 벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-S cell)에 도입하여 서열번호 36의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드로 구성되는 이량체 단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, CO2 8% 조건에서 무혈청(serum-free) ExpiCHOTM 발현 배지(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 14일간 배양하였다. 배양 후 배양액을 수거하고, 이를 친화크로마토그래피(Affinity purification column)를 이용하여 이량체 단백질을 정제하였다. 상기 정제한 이량체 단백질을 "GI-210-CN"으로 명명하였다.
제조예 4. IgG1 Fc knob in hole-IL-10 변이체의 제조: GI-210-C1
대조군으로서 IgG1 Fc 도메인 및 IL-10 변이체를 포함하는 융합 단백질을 생산하기 위하여, tPA 시그널 펩타이드, Ig 힌지, knob 형태의 hIgG1 Fc 도메인, 링커 및 hIL-10 변이체를 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합 단백질(서열번호 40)을 코딩하는 염기서열(서열번호 41)을 포함하는 폴리뉴클레오티드[제1 단량체]를 Thermo Fisher사의 GeneArtTM Gene Synthesis 서비스를 통해 pcDNA3.4 벡터(vector)에 적재하였다. 한편, tPA 시그널 펩타이드, hGLP-2 변이체, Ig 힌지, hole 형태의 hIgG1 Fc 도메인, 링커 및 hIL-10 변이체를 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합 단백질(서열번호 42)을 코딩하는 염기서열(서열번호 43)을 포함하는 폴리뉴클레오티드[제2 단량체]를 Thermo Fisher사의 GeneArtTM Gene Synthesis 서비스를 통해 pcDNA3.4 벡터에 적재하였다.
또한, 상기 각각의 벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-S cell)에 도입하여 서열번호 40의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드로 구성되는 이량체 단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, CO2 8% 조건에서 무혈청(serum-free) ExpiCHOTM 발현 배지(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 14일간 배양하였다. 배양 후 배양액을 수거하고, 이를 친화크로마토그래피(Affinity purification column)를 이용하여 이량체 단백질을 정제하였다. 상기 정제한 이량체 단백질을 "GI-210-C1"으로 명명하였다.
II. 이량체 단백질의 신경염증 매개인자 억제 효과 확인
미세아교세포(Microglia)는 신경세포의 성장과 생존을 조절하는 역할을 하는 세포로 알려져 있다(Neuroscience, 2019, 405:103-117). 면역학적으로 활성화된 미세아교세포는 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1, IL-6 등), 글루타메이트, 카텝신 B 또는 NO를 생성 및 분비함으로써 미세아교세포 주위에 분포하고 있는 신경세포의 손상과 사멸을 유도한다고 보고되어 있으며(Brain Research, 1992, 587:250-256, Brain Research, 2015, 1628:288-297, Annals of Translational Medicine, 2015, 3(10):136-150) 이는 알츠하이머와 파킨슨 같은 뇌신경계 질환의 발병에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
실험예 1. GI-210 융합단백질의 미세아교세포에서의 TNF-α 분비 억제 확인
GI-210이 미세아교세포에서 TNF-α 분비를 억제하는지 확인하기 위해 TNF-α 분비능을 측정하였다. BV2 세포(마우스 미세아교세포주)는 배양배지(DMEM + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신)에서 배양하였다. TNF-α 측정을 위해 BV2 세포를 24 well plate(2.5 x 105 cells/well)에 접종하였다. GI-210, GI-210-C1 및 GI-210-CN은 각각의 농도에 맞게 배지에 혼합하여 처리하였으며, 처리 1시간 후 LPS(O55:B5, 최종 1 ㎍/㎖)를 처리하였다.
LPS 처리 24 시간 후, 세포 상층액을 회수하여 TNF-α를 측정하였다. 이때, TNF-α는 Mouse TNF-α ELISA 키트(R&D systems, SMTA00B)를 이용하여 측정하였다. 50 ㎕의 assay diluent RD1-63을 키트에 동봉된 96 well에 추가한 다음 50 ㎕의 스탠다드 물질 또는 샘플(상층액)을 각 웰(well)에 첨가하여 2시간 동안 실온에서 배양하였다. Wash buffer를 이용하여 각 웰을 4회 세척한 후, 100 ㎕ Mouse TNF-α conjugate를 각 웰에 추가하여 2시간 동안 실온에서 배양하였다. Wash buffer를 이용하여 각 웰을 4회 세척한 후 100 ㎕ Substrate solution을 첨가하였다. 30분 동안 실온/차광 조건에서 배양한 후 100 ㎕ Stop solution을 추가하여 반응을 멈추었다. 흡광도는 플레이트 판독기를 이용하여 450 nm의 파장에서 측정하였다.
그 결과, GI-210 융합단백질이 농도 의존적으로 LPS에 의해 유도된 미세아교세포의 TNF-α 분비를 억제함을 확인하였다. 또한, GI-210 융합단백질이 대조군인 GI-210-C1 및 GI-210-CN과 비교하여 TNF-α 분비를 효과적으로 억제함을 확인하였다. GI-210-CN(GLP-1/GLP-2-Fc)은 TNF-α분비를 억제하지 못하였다(도 9). 상기 결과를 통해 GI-210 융합단백질이 LPS 처리로 인해 TNF-α 분비가 유도된 미세아교세포에서 대조군 대비 우수한 TNF-α 분비 억제능을 나타냄을 확인하였고, 그에 따라 GI-210 융합단백질이 TNF-α 분비 억제를 통해 신경세포 손상을 효과적으로 억제할 수 있음을 규명하였다.
실험예 2. GI-210 융합단백질의 미세아교세포에서의 Nitrite 분비 억제 확인
GI-210이 미세아교세포에서 Nitrite 분비를 억제하는지 확인하기 위해 GI-210의 Nitrite 분비능을 측정하였다. BV2 세포(마우스 미세아교세포주)는 배양배지(DMEM + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 페놀레드 무함유)를 이용하여 배양하였다. Nitrite 측정을 위해 BV2 세포를 24 well plate(2.5 x 105 cells/well)에 접종하였다. GI-210, GI-210-C1 및 GI-210-CN은 각각의 농도에 맞게 배지에 혼합하여 처리하였으며, 처리 1 시간 후 LPS(O55:B5, 최종 1 ㎍/㎖)를 처리하였다.
LPS 처리 24 시간 후, 세포 상층액을 회수하여 Nitrite를 측정하였다. 이때, Nitrite는 Griess Reagent system(Promega, G2930)을 이용하여 측정하였다. 50 ㎕의 Nitrite 스탠다드 또는 샘플(상층액)을 96 well plate에 첨가한 후, 50 ㎕ Sulfanilamide solution을 추가하여 5~10분 동안 실온/차광 상태에서 배양하였다. 이후 50 ㎕ NED solution을 추가한 후 5~10분 동안 실온/차광 상태에서 배양하였다. 흡광도는 플레이트 판독기를 이용하여 530 nm 파장에서 측정하였다. 그 결과, GI-210 융합단백질이 농도 의존적으로 LPS에 의해 유도된 미세아교세포에서의 Nitrite 분비를 억제함을 확인하였다. GI-210 융합단백질은 1 μM 처리 조건에서 대조군인 GI-210-C1 및 GI-210-CN과 비교하여 효과적으로 Nitrite 분비를 억제시켰다(도 10).
상기 결과를 통해 GI-210 융합단백질이 LPS 처리로 인해 Nitrite 분비가 유도된 미세아교세포에서 대조군 대비 우수한 Nitrite 분비 억제능을 나타냄을 확인하였고, 그에 따라 GI-210 융합단백질이 Nitrite 분비 억제를 통해 신경세포 손상을 효과적으로 억제할 수 있음을 규명하였다.
III. 이량체 단백질의 퇴행성 뇌질환 치료 효과 확인
준비예 1. 퇴행성 뇌질환 동물 모델의 준비
준비예 1.1. 알츠하이머병 동물 모델로서 Tg-APP/PS1 마우스의 준비
알츠하이머병의 동물 모델인 Tg-APPswe/PS1dE9(TG-APP/PS1) 마우스는 LMO(living modified organism) 처리 시설로 인가된 이화여자대학교의 표준 SPF(specific pathogen free) 수준의 동물실에서 정해진 교미 케이지(mating cage)에서 교미시켜 준비하였다.
상기 TG-APP/PS1 마우스는 6.5개월령부터 가시적인 플라크 침착을 나타내며, 약 7개월령 이상에서는 인지적 결함을 나타내는 것이 알려져 있다. 이에, TG-APP/PS1 마우스는 알츠하이머병에 대한 치료 후보 약물을 도출하는 데 있어 안면 타당도(face validity), 구성 타당도(construct validity) 및 예측 타당도(predictive validity)를 제공할 수 있다.
상기 Tg-APP/PS1 마우스는 표준 플라스틱 케이지에서 2~3 마리 수준으로 유지하였으며, 표준 실험실 사료 및 물은 자유롭게 식이하도록 하였다. 또한, 동물실은 50~60%의 습도 및 22~23℃의 온도 조건으로 유지되었으며, 정상적인 명암주기(오전 7시 점등)로 운영되었다.
한편, Tg-APP/PS1 마우스는 성별에 따라 치사율에 차이가 있는데, 암컷 Tg-APP/PS1 마우스의 치사율은 수컷 Tg-APP/PS1 마우스보다 약 2배가량 높다. 이에, 암컷 APP/PS1 마우스의 경우 약물에 대한 증가된 민감도를 보일 가능성이 존재한다.
준비예 1.2. Tg-APP/PS1 알츠하이머병 마우스를 대상으로 이량체 단백질의 치료 효과 확인을 위한 실험 설계
실험 대상인 Tg-APP/PS1 마우스는 연령-의존적 플라크 침착 및 인지적 결함을 나타내는 공지된 알츠하이머병 실험 동물 모델로서, 이는 7~8개월령에서 확실하게 아밀로이드베타 플라크 침착이 검출되고 인지적 행동 결함을 보인다.
이에, 본 발명의 이량체 단백질인 GI-210 및 GI-211의 알츠하이머병 치료 효과 검증을 위해서는 철저한 10개월 이상의 장기적인 계획이 필요하다. 이는 동물실 시설의 가용 공간을 신속하게 확장할 수 없으며, 약물 처리 및 행동 시험을 예정된 시간과 시간 내에 수행하기 위해서이다.
본 발명의 GI-210 및 GI-211은 알츠하이머병(AD)-유사 병리가 나타나는 시점인 6.5개월령부터 Tg-APP/PS1 마우스에 처리하고, 행동 시험은 7.5~8.0개월령 사이에 적용하는 것으로 계획하였다(도 11). 이후 행동 시험 평가 후, 실험 동물들을 8.0개월령 시점에 희생시켜 생화학적 및 조직학적 분석을 수행하였다.
실험예 1. 알츠하이머병 동물 모델을 이용한 이량체 단백질의 치료 효과
실험예 1.1. 이량체 단백질 GI-210 및 GI-211의 복강 투여
시험물질로서 제조예 1 및 2에서 수득한 GI-210 및 GI-211을 식염수(saline)를 이용하여 희석하고, 이를 6.5개월령부터 2주 동안 각각 4회 복강 주사하여 1.2 mg/㎏의 농도로 Tg-APP/PS1 마우스에 투여되도록 하였다(도 12 및 도 13).
구체적으로, GI-210을 복강 투여한 알츠하이머병 동물 모델의 경우 6.5개월령부터 실험 시작 전에 일부 마우스가 사망하였으며, 실험 시작 후(6.5개월령 기준) Tg-GI-210 그룹 2마리, Tg-Veh 그룹 중 2마리가 사망하였다. 이에, 실질적으로 GI-210 복강 주사와 연관된 사망 가능성은 없는 것으로 추정되었다.
실험에 사용된 Tg-APP/PS1 마우스의 경우 6~7개월령 시기에 몸무게가 28~40 g에 도달하였다. 이에, 총 4회 복강 주사시 1.2 ㎎/㎏의 농도로 GI-210이 주사되도록, 예컨대 20 g의 마우스를 기준으로 마리당(head) 24 ㎍을 주사하였다.
또한, GI-211을 복강 투여한 알츠하이머병 동물 모델의 경우 실험 시작 전 및 실험 시작 후에 사망하는 마우스가 존재하지는 않았다. GI-211 투여는 상기 GI-210 투여와 동일한 방식으로 마우스 체중 기준으로 총 4회 복강 주사시 1.2 ㎎/㎏의 농도가 되도록 투여하였다.
실험예 1.2. GI-210 및 GI-211의 복강 투여에 따른 Tg-APP/PS1 마우스의 행동 평가
상기 실험예 1.1에서 6.5개월령 시기에 GI-210 및 GI-211을 각각 복강 투여한 Tg-APP/PS1 마우스를 대상으로 7.5~8.0개월령 시기에 인지 기능에 대한 행동 특성을 평가하였다. 인지 기능에 대한 행동 특성을 평가하고자, 신물질탐색실험(novel object recognition test), 수동회피실험(passive avoidance test) 및 수중미로실험(water maze test)을 수행하였다(도 12 및 도 13). 이때, 상기 행동 평가를 위한 세 가지 실험은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행하였다.
한편, 실험 동물 행동 평가시 동물 행동은 일반적으로 대조군 실험동물의 행동과 비교하여 수행하는데, 동물 행동은 동물의 이전 경험과 처리 조건에 의해 쉽게 영향을 받으므로, 주어진 동물에 대해 동일한 행동을 반복적으로 측정하는 것은 피해야 한다. 이에, 모든 실험은 동물의 행동 시험이 실험자와 일주기 리듬(circadian rhythms)을 포함한 많은 요인의 영향을 받는다는 점을 고려하여 수행하였다.
모든 행동 평가는 컴퓨터화된 비디오-추적 시스템(SMART; Panlab S.I., Barcelona, Spain) 및 웹캠 레코딩 시스템(HD Webcam C210, Logitech, Newark, CA, USA)으로 기록하였다. 이때, 시험실의 배경음은 65dB의 백색 소음으로 설정하였으며, 모든 행동 시험은 광주기(오전 9시-오후 3시) 동안 수행하였다.
아울러, 일련의 행동 시험을 받을 수 있는 동물의 수는 (i) 각 사람이 각 행동 시험 시도에서 최대 50마리의 동물을 다룰 수 있고(일반적으로 하루에 50마리의 동물은 너무 많음; 행동은 각 동물에 대해 측정되며, 이는 정해진 시간이 필요함), (ii) 동물 행동은 실험자에 의해 영향을 받고, 이에 동일한 사람이 일련의 행동 시험을 수집할 필요가 있으며, (iii) 동물 행동은 일주기 리듬에 의해 영향(동물 행동은 하루에 주어진 시간 내 수집해야 함)을 받기 때문에 제한하여 수행하였다.
한편, 모든 동물은 이화여자대학교 동물 관리 지침에 따라 처리되었으며, 이화여자대학교 동물실험윤리위원회(IACUC, Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받아 수행되었다.
실험예 1.2.1. 신물질탐색실험을 통한 GI-210의 기억력 개선 효과 확인
일반적으로 마우스는 새로운 물질(object)을 선호하는 특성이 있다. 이는 익숙한 오래된 물질과 새로운 물질을 제시할 시, 오래된 익숙한 물질과 새로운 물질을 구분하고 기억할 수 있어야 가능한 행동 특성이다. 이에, 인지적 결함 여부를 평가하기 위한 수단으로서 신물질탐색실험을 통해 물질 탐지 기억력을 평가할 수 있다. 신물질에 대한 인지기능은 전액골 피질(prefrontal cortex), 배측 선조체(dorsal striatum), 해마(hippocampus) 등의 영역에서 조절된다.
물질 탐지 기억력과 관련하여 GI-210에 의한 효과를 확인해 본 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이 GI-210이 처리된 Tg-APP/PS1 마우스는 신물질탐색실험(NOR test)에서 기억력이 향상된 것으로 나타났다. 구체적으로, GI-210이 2시간 및 24시간 경과 후에도 기억력을 유지시킴을 확인하였다. 이에 따라, GI-210이 단기(short-term) 및 장기(long-term) 기억을 회복하는 효과, 즉, 기억력을 유지 및 개선하는데 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 1.2.2. 수동회피실험을 통한 GI-210의 기억력 개선 효과
수동회피실험(passive avoidance test)은 공간 단서(spatial cue) 및 정황상의 단서(contextual cue), 상세하게는 공포 및 불안과 연관된 기억 여부를 확인하고자 수행한 인지행동 평가 실험이다. 공포 및 불안과 연관된 기억은 뇌의 편도체(amygdala), 해마, 전액골 피질 영역에 의존적이며, 공포 및 불안 유발 자극에 대한 학습 및 기억 개선과 관련 있다.
공포 및 불안과 연관된 기억과 관련하여 GI-210에 의한 효과를 확인해 본 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이 GI-210이 처리된 Tg-APP/PS1 마우스는 수동회피실험에서 기억력이 향상된 것으로 나타났다. 상기 결과를 통해 GI-210이 Tg-APP/PS1 마우스에서 인지적 결함에 있어 유리한 효과를 보임을 알 수 있었다. 더욱이 GI-210에 의한 장기 기억 유지 효과가 우수함을 알 수 있었다.
실험예 1.2.3. 수중미로실험을 통한 GI-210의 기억력 개선 효과 확인
수중미로실험(water maze test)은 뇌의 해마 영역에 의존적인 공간지각 학습 능력 및 기억력을 측정하기 위해 수행한 인지행동 평가 실험이다.
공간지각 학습 능력 및 기억력과 관련하여 GI-210에 의한 효과를 확인해 본 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이 수중미로실험에서는 GI-210이 학습 능력과 기억력을 향상시키지 않는 것으로 확인되었다. 이는 GI-210이 중요한 뇌 영역, 예컨대 해마에 도달하는 데 제한이 있을 수 있음을 시사한다. 즉, 해마 기능이 GI-210에 의해 충분히 회복되지 않음을 시사한다.
실험예 1.2.4. 신물질탐색실험을 통한 GI-211의 기억력 개선 효과 확인
인지적 결함 여부를 평가하기 위한 수단으로서 신물질탐색실험을 통해 물질 탐지 기억력을 평가하고자 하였다. 물질 탐지 기억력과 관련하여 GI-211에 의한 효과를 확인해 본 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이 GI-211이 처리된 Tg-APP/PS1 마우스는 신물질탐색실험(NOR test)에서 기억력이 향상된 것으로 나타났다. 구체적으로, GI-211이 2시간 및 24시간 경과 후에도 기억력을 유지시킴을 확인하였다. 이에 따라, GI-211이 단기 및 장기간 기억력을 유지 및 개선하는데 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 1.2.5. 수동회피실험을 통한 GI-211의 기억력 개선 효과 확인
공포 및 불안과 연관된 기억과 관련하여 GI-211에 의한 효과를 확인하고자 수동회피실험을 수행하였다. 그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이 GI-211이 처리된 Tg-APP/PS1 마우스는 수동회피실험에서 기억력이 향상된 것으로 나타났다. 상기 결과를 통해 GI-211이 Tg-APP/PS1 마우스에서 인지적 결함에 있어 유리한 효과를 보일 뿐 아니라 장기 기억을 유지하는데 있어서도 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 1.2.6. 수중미로실험을 통한 GI-211의 기억력 개선 효과 확인
공간지각 학습 능력 및 기억력과 관련하여 GI-211에 의한 효과를 확인하고자 수중미로실험을 수행하였다. 그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이 수중미로실험에서는 GI-211이 학습 능력과 기억력 모두 향상시키는 것으로 확인되었다. 이는 GI-211에 의해 해마 기능이 회복됨을 시사한다.
실험예 1.3. GI-210 및 GI-211의 복강 투여에 따른 Tg-APP/PS1 마우스 뇌의 생화학적 및 조직학적 검사
실험예 1.3.1. GI-210에 의한 뇌 조직 내 플라크 침착 개선 효과 확인
알츠하이머병의 병리학적 특징 중 하나로 노인성 플라크(senile plaques) 침착을 들 수 있다. 상기 노인성 플라크의 주요 구성 요소는 응집된 아밀로이드 베타 펩타이드(amyloid beta peptide, Aβ)로, 아밀로이드 베타 펩타이드에 의해 뇌신경세포의 괴사가 일어나며, 이로 인해 알츠하이머병이 발병하게 된다.
이에, GI-210의 복강 투여에 의한 알츠하이머병 치료 효과를 확인하고자, Aβ-플라크를 염색하는 티오플라빈 S(Thioflavine S)를 이용하여 플라크 침착 정도를 분석하였다.
구체적으로, 티오플라빈 S 염색을 사용한 플라크 침착의 면역조직화학적 분석을 위해, 우선 4% 파라포름알데히드를 이용하여 마우스를 관류(perfusion) 시키고 뇌를 제거한 후, 상기 뇌를 4℃에서 밤새 4% 파라포름알데히드로 추가 고정시켰다. 진동마이크로톰(Vibratome)으로 고정된 뇌 조직을 40 ㎛ 두께로 절단하여 뇌 섹션(section)을 준비하였다. 상기 준비된 뇌 섹션은 티오플라빈 S를 이용하여 공지된 방법으로 염색하였다. 이때, 염색된 이미지는 메타모프 현미경 자동화 및 이미지 분석 소프트웨어(MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis software, Molecular device)를 사용하여 분석하였다.
Tg-APP/PS1 마우스의 뇌에서 두정엽 피질(parietal cortex), 해마(hippocampus), 이상엽 피질(piriform cortex) 영역의 Aβ-플라크를 분석해 본 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이 GI-210 투여시 Tg-APP/PS1 마우스의 뇌에 침착되는 플라크의 양이 감소되는 경향을 나타냄을 확인하였다. 이때, 플라크의 양은 단위 면적당 플라크의 수 및 플라크 면적 합으로 정량화하여 나타내었다.
상기 결과를 통해 GI-210이 Tg-APP/PS1 마우스의 뇌에서 Aβ-플라크 침착을 감소시키는 효과가 있음을 알 수 있었다. 따라서, 상기 GI-210을 퇴행성 뇌질환, 특히 알츠하이머병의 치료 또는 예방에 유용하게 사용할 수 있다.
실험예 1.3.2. GI-210에 의한 아밀로이드 베타 펩타이드 생성 억제 효과
아밀로이드 베타 펩타이드(amyloid beta peptide, Aβ)에 의해 뇌신경세포의 괴사가 일어나며, 이로 인해 알츠하이머병이 발병하게 된다. 이에, GI-210의 복강 투여에 의한 알츠하이머병 치료 효과를 확인하고자, ELISA 어세이를 수행하여 Tg-APP/PS1 마우스의 뇌에서 Aβ1-42의 생성 수준을 확인하였다.
Tg-APP/PS1 마우스의 뇌에서 두정엽 피질, 배측 해마, 이상엽 피질 영역에서 가용성(souble) Aβ42 및 불가용성(insouble) Aβ42의 생성 수준을 정량해 본 결과, 상기 실험예 1.3.1에서 티오플라빈 S 염색 분석 결과와 유사하게 특히 두정엽 피질 영역에서 Aβ42의 생성이 억제됨을 확인하였다(도 21).
상기 결과를 통해 GI-210이 Tg-APP/PS1 마우스의 뇌에서 Aβ42의 수준을 감소시키는 효과가 있음을 알 수 있었다. 따라서, 상기 GI-210을 알츠하이머병의 치료 또는 예방에 유용하게 사용할 수 있다.
실험예 1.3.3. GI-211에 의한 뇌 조직 내 플라크 침착 개선 효과 확인
본 발명에 따른 GI-211의 알츠하이머병 치료 효과를 확인하고자, Aβ-플라크를 염색하는 티오플라빈 S를 이용하여 플라크 침착 정도를 분석하였다. 상기 실험예 1.3.1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.
GI-211을 복강 투여한 Tg-APP/PS1 마우스의 뇌에서 두정엽 피질, 해마, 이상엽 피질 영역의 Aβ-플라크를 분석해 본 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이 GI-211 투여시 Tg-APP/PS1 마우스의 뇌에 침착되는 플라크의 양이 감소되는 경향을 나타냄을 확인하였다. 이때, 플라크의 양은 단위 면적당 플라크의 수 및 플라크 면적 합으로 정량화하여 나타내었다.
상기 결과를 통해 GI-211이 Tg-APP/PS1 마우스의 뇌에서 Aβ-플라크 침착을 감소시키는 효과가 있음을 알 수 있었다. 따라서, 상기 GI-211을 퇴행성 뇌질환, 특히 알츠하이머병의 치료 또는 예방에 유용하게 사용할 수 있다.
실험예 1.4. GI-210 투여에 따른 신경염증 변화 및 자가포식 관련 유전자에 대한 효과 확인
현재까지 알츠하이머병과 같은 퇴행성 뇌질환에서 비정상적이고 감소된 자가포식(autophagy) 현상에 대해 많은 연구가 되어 왔으며, 자가포식 조절제가 알츠하이머병의 치료 타겟이 될 수 있다고 보고되어 왔다.
자가포식은 자가포식소체(autophagosome)와 리소좀(lysosome)의 융합 과정을 통해 일어난다. 퇴행성 뇌질환 상태에서는 자가포식액포(autophagic vacuole, AV)의 턴오버(turnover)에서 이상적인 변화를 나타내며, 자가포식소체(autophagosome)가 분해되지 못하고 계속 축적되는 이상변화가 일어난다.
이에, 본 발명에 따른 이량체 단백질이 자가포식 조절제로서 기능하여 퇴행성 뇌질환에서 나타나는 비정상적인 자가포식을 조절함에 따라 유의한 치료 효과를 보이는지를 작용 메커니즘 측면에서 분석하고자 하였다.
실험예 1.4.1. GI-210에 의한 신경염증 변화 확인
알츠하이머병 동물 모델에 GI-210 투여시 신경염증 변화에 미치는 영향을 확인하기 위해서, 뇌에서 미세아교세포(Iba-1를 마커로 사용) 및 성상교세포(GFAP를 마커로 사용)의 변화를 관찰하였다.
GI-210을 복강 투여한 Tg-APP/PS1 마우스의 뇌에서 두정엽 피질, 해마, 이상엽 피질 영역에서 Iba-1의 발현 정도를 확인해 본 결과, 도 23에 나타낸 바와 같이 GI-210 투여시 Tg-APP/PS1 마우스의 두정엽 피질, 해마, 이상엽 피질 영역, 특히 두정엽 피질 및 이상엽 피질 영역에서 Iba-1의 발현 수준이 현저히 감소되는 경향을 나타냄을 확인하였다.
한편, GFAP의 발현 정도를 확인해 본 결과, 도 24에 나타낸 바와 같이 GI-210 투여시 Tg-APP/PS1 마우스의 두정엽 피질, 해마, 이상엽 피질 영역에서 GFAP의 발현 수준이 감소되는 경향을 나타내지는 않음을 확인하였다.
상기 결과를 통해 GI-210이 Tg-APP/PS1 마우스의 뇌에서 미세아교세포증(microgliosis)과 같은 신경염증 반응을 조절할 수 있음을 알 수 있었다. 따라서, 상기 GI-210을 알츠하이머병 관련 신경염증에 대한 반응을 감소시키는 항염증제로서도 적용 가능함을 알 수 있었다.
실험예 1.4.2. GI-210에 의한 자가포식 관련 유전자에 대한 효과 확인
GI-210이 자가포식 관련 경로에서 어떻게 작용하는지 확인하기 위하여, 알츠하이머병 동물 모델에 GI-210 복강 투여 후 뇌조직 시료에서 자가포식(autophagy) 마커인 LC3의 발현 정도를 확인하였다.
GI-210을 복강 투여한 Tg-APP/PS1 마우스의 뇌에서 두정엽 피질, 해마, 이상엽 피질 영역에서 LC3의 발현 정도를 확인해 본 결과, 도 25에 나타낸 바와 같이 GI-210 투여시 Tg-APP/PS1 마우스의 두정엽 피질 및 이상엽 피질 영역에서는 뚜렷한 변화를 보이지 않았으나, 해마 영역에서는 LC3의 발현 수준이 현저히 증가되는 경향을 보임을 확인하였다. 따라서, GI-210에 의한 자가포식 증가 양상을 보이므로, 자가포식 조절제로서 GI-210을 신개념의 퇴행성 뇌질환 치료제, 특히 알츠하이머병 치료제로서 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (31)

  1. GLP-1 또는 이의 변이체를 포함하는 제1 단량체; 및
    GLP-2 또는 이의 변이체를 포함하는 제2 단량체를 포함하는 이량체 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    제1 단량체는 IL-10 또는 이의 변이체를 추가적으로 더 포함하는 것인, 이량체 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    제2 단량체는 IL-10 또는 이의 변이체를 추가적으로 더 포함하는 것인, 이량체 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    제1 단량체 및/또는 제2 단량체는 Fc 영역 단편 또는 이의 변이체를 포함하는 것인, 이량체 단백질.
  5. 제2항 및 제3항에 있어서,
    상기 IL-10은 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것인, 이량체 단백질.
  6. 제2항 및 제3항에 있어서,
    상기 IL-10의 변이체는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 것인, 이량체 단백질.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 제1 단량체는 하기 구조식 (I) 또는 (II)로 이루어진 것인, 이량체 단백질:
    N'-X-[링커(1)]n-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(2)]m-(Y)o-C' (I)
    N'-(Y)o-[링커(1)]n-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(2)]m-X-C' (II)
    이때, 상기 구조식 (I) 및 (II)에 있어서,
    상기 N'은 융합 단백질의 N-말단이고,
    상기 C'는 융합 단백질의 C-말단이며,
    상기 X는 GLP-1 또는 이의 변이체이고,
    상기 Y는 IL-10 또는 이의 변이체이며,
    상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이고,
    상기 m, n 및 o는 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 제2 단량체는 하기 구조식 (III) 또는 (IV)로 이루어진 것인, 이량체 단백질:
    N'-Z-[링커(3)]p-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(4)]q-(Y)r-C' (III)
    N'-(Y)r-[링커(3)]p-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(4)]q-Z-C' (IV)
    이때, 상기 구조식 (III) 및 (IV)에 있어서,
    상기 N'은 융합 단백질의 N-말단이고,
    상기 C'는 융합 단백질의 C-말단이며,
    상기 Z는 GLP-2 또는 이의 변이체이고,
    상기 Y는 IL-10 또는 이의 변이체이며,
    상기 링커(3) 및 링커(4)는 펩타이드 링커이고,
    상기 p, q 및 r는 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 이량체 단백질은 구조식 (I) 및 구조식 (III)의 단량체를 포함하는 것인, 이량체 단백질.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 이량체 단백질은 구조식 (II) 및 구조식 (IV)의 단량체를 포함하는 것인, 이량체 단백질.
  11. 제7항 및 제8항에 있어서,
    상기 링커(1) 및 링커(3)은 각각 5 내지 50개의 아미노산으로 구성된 펩타이드인 것인, 이량체 단백질.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 링커(1) 및 링커(3)은 각각 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지는 것인, 이량체 단백질.
  13. 제7항 및 제8항에 있어서,
    상기 링커(2) 및 링커(4)는 각각 5 내지 50개의 아미노산으로 구성된 펩타이드인 것인, 이량체 단백질.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 링커(2) 및 링커(4)는 각각 서열번호 12 내지 17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 것인, 이량체 단백질.
  15. 제4항에 있어서,
    상기 제1 단량체 및/또는 제2 단량체의 Fc 영역은 인간 IgG1 유래인 것인, 이량체 단백질.
  16. 제4항에 있어서,
    상기 제1 단량체 및/또는 제2 단량체의 Fc 영역은 놉 구조 또는 홀 구조를 포함하는 것인, 이량체 단백질.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 GLP-1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인, 이량체 단백질.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 GLP-1의 변이체는 서열번호 2 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것인, 이량체 단백질.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 GLP-2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 것인, 이량체 단백질.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 GLP-2의 변이체는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 것인, 이량체 단백질.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 이량체 단백질을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병, 헌팅턴병, 경도인지장애(mild cognitive impairment), 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 다운증후근, 아밀로이드성 뇌졸증(stroke), 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증, 니만-픽병, 노인성 치매, 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증(Spinocerebellar Atrophy), 뚜렛 증후군(Tourette's Syndrome), 프리드리히 보행실조(Friedrich's Ataxia), 마차도-조셉 병(Machado-Joseph's disease), 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 근육긴장이상(Dystonia), 진행성 핵상 마비(Progressive Supranuclear Palsy) 및 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  23. 제1항 또는 제7항의 제1 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  24. 제23항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  25. 제1항 또는 제8항의 제2 단량체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  26. 제25항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  27. 제24항 및 제26항의 벡터가 도입된 형질전환 세포.
  28. i) 제27항의 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및
    ii) 제1 단량체 및 제2 단량체를 포함하는 이량체 단백질을 회수하는 단계;를 포함하는 이량체 단백질의 생산방법.
  29. 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 이량체 단백질의 용도.
  30. 퇴행성 뇌질환을 예방하거나 치료하기 위한 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 이량체 단백질의 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 용도.
  31. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 이량체 단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료 방법.
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