KR20080064840A - 펩티다아제 저항성이 증가된 ｇｌｐ―1（글루카곤 유사펩티드―1） 융합 폴리펩티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 GLP-1 활성 및 생체 내에서의 향상된 안정성을 가지고, 특히, 디펩티딜 펩티타아제 IV에 대한 저항성을 가지는 융합 펩티드를 제공한다. 그 융합 펩티드는 성분 (I)로서 N-말단의 GLP-1 (7-35, 7-36 또는 7-37) 서열과, 성분 (II)로서 C-말단의 9개 이상의 아미노산의 펩티드 서열 또는 그의 기능적 단편, 변이체 또는 유도체를 포함한다. 성분 (II)는 좋기로는 IP2 (중간(intervening) 펩티드 2)의 전체 또는 부분형이다. 양호한 실시 상태는 서열 GLP-1(7-35, 36 또는 37)/IP2/GLP-1(7-35, 36 또는 37) 또는 GLP-2를 포함한다. 융합 펩티드는 조작된 세포에서 또는 합성적으로 생산될 수 있고, 다양한 질병 또는 질환, 예컨대 제1형 또는 제2형 당뇨병, 세포자멸사 관련 질병 또는 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 약제의 제조용으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 연장된 C 말단을 가지고, 엔도펩티다아제 IV 불활성화에 대해 저항성이 있으며, 형질전환된 동물 세포에서 높은 수준으로 발현될 수 있고, 예컨대, 제2형 당뇨(type 2 diabetes)에 유용한 신규의 GLP-1 융합 펩티드에 관한 것이다.
글루카곤 유전자는 잘 연구되어 있다 (예컨대, 문헌 [White, J.W. et al., 1986 Nucleic Acid Res. 14(12) 4719-4730을 참조). 높은 분자량의 전구체 분자로서 프리프로글루카곤(preproglucagon) 분자가 췌장 알파 세포에서 및 공장(jejunum) 및 결장 L 세포에서 합성된다. 프리프로글루카곤은 180개 아미노산 길이의 프로호르몬(prohormone)이고, 그의 서열은 글루카곤 이외에도 관련된 구조의 2개의 서열, 즉 글루카곤 유사 펩티드-1 (GLP-1) 및 글루카곤 유사 펩티드-2 (GLP-2)을 함유한다. 상기 프리프로글루카론 분자 중에, GLP-1과 GLP-2 사이에는 17개 아미노산의 펩티드 서열 (또는 15개 아미노산 서열 + C-말단 RR 절단 자리)인 중간(intervening) 펩티드 2 (IP2)가 있다. IP2 서열 (상기 전구체 분자의 GLP-1 및 -2 사이에 위치하는 것)은 GLP-1의 aa 37 뒤에서 단백질분해로 일반적으로 절단된 다. 따라서, 상기 프리프로글루칸 모듈(module)은 세포 및 환경에 따라 그의 가공되지 않은 형태 중의 GLP-1 (1-37)의 37개 아미노산 펩티드를 포함하는 다양한 펩티드로 절단된다. 일반적으로, 이러한 가공(processing)은 췌장 및 장(腸)에서 일어난다. GLP-1 (1-37) 서열은 활성 GLP-1 (7-37), 즉 31개 아미노산의 가공된 형태 또는 GLP-1 (7-36) 아미드로 추가적으로 단백질분해로 가공될 수 있다. 따라서, GLP-1(7-37)라는 명칭은 그의 모(母) 펩티드인 GLP-1의 N-말단으로부터 세었을 때, 7번부터(이를 포함함) 37번까지(이를 포함함)의 아미노산 잔기를 포함하는 문제의 단편을 지칭하는 것이다. GLP-1 (7-36) 아미드 및 GLP-1 (7-37)의 아미노산 서열은 다음의 식 I (서열 번호 43)로 표시된다: His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-X (I), 여기서 X가 NH2인 경우 GLP-1 (7-36) 아미드를 나타내고, X가 Gly-OH인 경우 GLP-1 (7-37)을 나타낸다.
GLP-1은 창자(gut) 호르몬이고, 베타 세포에서 아데닐레이트 사이클라제(adenylate cyclase) 및 단백질 키나아제 활성을 자극하는 것을 포함하는 작용을 가지는 가장 강력한 내인성 인슐린자극제(insulinotropic agent)이다. 생리학적으로, 상부 창자(upper gut)로부터의 위 억제(gastric inhibitory) 폴리펩티드와 함께, 그것은 혈액 글루코스 수준을 낮추는 인크레틴(incretin) 호르몬으로서 작용한다. 따라서, 음식 섭취에 반응하여 분비되는 GLP-1은, 예컨대 혈액 중의 당을 조절하기 위해 협동적으로 작용하는 위, 간, 췌장 및 뇌에 대한 다중 효과를 가진다. 결론적으로, 글루카곤 유사 펩티드 GLP-1 (7-36) 아미드 및 그의 비아미드화 유사체 GLP-1 (7-37)은 탄수화물 대사에 대한 그들의 강력한 작용 및 제2형 당뇨를 포함하는 당뇨병의 치료에 대한 그의 잠재적인 적용가능성 때문에 상당한 관심을 가지게 한다. 제2형 당뇨는 인슐린이 존재하는 경우 세포가 적절하게 반응하지 않기 때문에, 인슐린 저항성을 특징으로 한다. 이것은 제1형 당뇨보다 더 복잡한 문제이다. 제2형 당뇨는 그 증상이 일반적으로 더 경증이고 (케톤산증이 없음), 산발성(sporadic)일 수 있기 때문에, 진단 전에는 환자에게 수년 동안 인식되지 않고 진행될 수 있다. 그러나, 신부전 및 관상동맥 심장질환을 포함하는 심각한 합병증이 인식되지 않은 제2형 당뇨로부터 유발될 수 있다. 이것은 이환률(騫肩蹇) 및 사망률을 증가를 가져온다.
GLP-1 (7-36) 아미드 또는 GLP-1 (7-37)은 혈청에서 단명(short-lived)한다. 그 펩티드는 8번과 9번 잔기 사이에서 디펩티딜 펩티다아제 IV (DPP-IV)에 의하여 절단된다. 그 절단된 펩티드는 불활성이다. 따라서, 외부에서 투여된 GLP-1은 매우 짧은 기간 존재하고, 치료적인 응용에 있어서 유용성이 한정되었다.
자연적으로 발생하는 GLP-1의 (DPP-IV에 대하여) 안정한 유사체 (GLP-1 (7-37))를 합성하려는 다양한 시도들이 행해져 왔다. 구체적으로, 생체 내에서 Ala인 8번 잔기가 또 다른 잔기, 예컨대 Gly, Ser 또는 Thr로 치환되었다 (Burcelin, R., et al. (1999) Metabolism 48, 252-258). Gly8 또는 G8 유사체가 합성된 분자 및 그 돌연변이 폴리펩티드를 분비하도록 유전자 조작된 세포주에 의하여 생산되는 것 양쪽 모두로서 광범위하게 테스트된 바 있다 (Burcelin, R., et a1 (1999) Annals of the New York Academy of Sci-ences 875: 277-285). 그의 생물학적 활성을 떨어뜨리지 않고 그의 생체 내 안정성을 향상시키기 위하여 다양한 기타의 변형들이 GLP-1(7-37)로 도입된 바 있다. 그러나, 이와 같은 모든 접근법들은 포함된 상당한 문제점 때문에 어떠한 유의미한 치료적 중요성을 달성하지 못했다.
WO/9953064에서, 토렌스 비(Thorens, B.)는 공개적으로 입수가능한 무한증식(immortalised) 세포주 및 분화 제1 세포 배양물(dividing primary cell cultures)인 다양한 종류의 세포로 혼입될 수 있는 다합체성(multimeric) GLP-1 발현 카세트(cassette)을 만들기 위한 전략을 개시하고 있다. 예로서 EGF 반응성 신경구(EGF-responsive neurospheres), 포유류의 CNS 유래의 bFGF 반응성 신경 전구 줄기 세포를 포함하는 한편, 실시된 예에서는 유아 햄스터 신장(baby hamster kidney), BHK 세포를 사용한다. 이식된 트랜스펙션된 세포가 사용되어 당뇨 마우스를 성공적으로 치료하여, 비당뇨 대조군과 실질적으로 동등하게 글루코스를 조절하게 하였다고 기술되어 있다. 그러나, 이러한 기술은 당뇨병 환자에게 정례적으로(routinely) 투여될 치료법의 필요성에 응하지 못한다.
외인적으로 글루코스 수준을 안정화하기 위한 또 다른 접근법은 제2형 당뇨병의 치료를 위한 연구에서 인크레틴 모방체(mimetics)로 알려진 새로운 종류의 약물을 기초로 한다. 엑세나티드 (Byetta®)는 길라 몬스터 도마뱀(Gila monster lizard)의 타액에서 발견된 천연 화합물이 합성 형태이다. 임상 실험에서, 인크레틴 모방체 (엑세나티드)는 혈중 당의 감소 및 베타 세포 기능의 마커의 향상을 보여준바 있다. 그러나, 엑세나티드는 인간 인크레틴 호르몬 글루카곤 유사 펩티드-1 (GLP-1)의 단지 특정의 효과만을 나타낸다.
요약하면, GLP-1에 근거하여 혈중 당 수준을 낮추도록 하는, 다시 말하면 GLP-1에 대하여 알려진 유익한 효과 (예컨대, 비만 대상체에서의 위 배출 속도의 감소에 의하여 순환(혈행) 속으로 영양분의 유입의 속도를 강력하게 감소시키는 생리학적 농도에서 그의 활성 또는 그의 인슐린 자극 활성)의 전 범위를 반영하는 치료법을 제공하는 현재 이용가능한 효과적인 제2형 당뇨병 치료법은 없다. 따라서, 생물학적으로 활성이고, 단백질분해성 파괴에 저항하는 GLP-1 기초 펩티드 분자를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명은 성분 (I)로서 N-말단에서의 GLP-1 (7-35, 7-36 또는 7-37) 서열과, 성분 (II)로서 C-말단에서의 9개 이상의 아미노산의 펩티드 서열 또는 그의 기능적 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 융합 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 얻어진 본 발명의 펩티드가 단백질 분해성 엔도펩티다아제 IV 활성에 주로 기인한 생체 내의 단백질 분해성 파괴에 대해 보호된다는 발견을 기초로 한다. 적어도 2개의 성분 (I) 및 (II)를 가진 본 발명의 펩티드는 GLP-1의 생물학적 활성을 나타내고, 동시에 C-말단 신장(elongation)에 의한 그의 성분 (I)으로 GLP-1에 안정성을 부여한다.
본 명세서에서 사용되는 "본 발명의 펩티드(inventive peptide)"라는 용어는 본 명세서에서 정의된 것과 같은 융합 펩티드, 그의 변이체, 유사체, 단편 또는 유도체 (예컨대 융합 펩티드의 유도화된 단편, 유사체 또는 변이체와 같은 조합을 포함함)를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "GLP-1 펩티드"라는 용어는 GLP-1 (7-35, 36 또는 37)을 의미하고, "변형된(modified) GLP-1 펩티드"는 본 발명의 펩티드의 성분 (I) 및 (III) 중 어느 하나에서 일어날 수 있는 GLP-1 (7-35, 36 또는 37)의 유도화된 단편, 유사체 도는 변이체를 포함하는 임의의 GLP-1 유사체, GLP-1 유도체, GLP-1 변이체 또는 GLP-1 단편을 의미하도록 의도된 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "GLP-2 펩티드"라는 용어는 GLP-2 (1-33, 34 또는 35)를 의미하고, "변형된 GLP-2 펩티드"는 GLP-2 (1-33, 34 또는 35)의 유도화된 단편, 유사체 또는 변이체를 포함하는 임의의 GLP-2 유사체, 단편 또는 변이체, GLP-2 유도체 또는 GLP-2 유사체의 유도체를 의미하도록 의도된 것이다. 변이체, 유사체, 단편 및 유도체는 변형되지 않은 서열, 예컨대 GLP-1 (7-35, 36 또는 37) 또는 GLP-2 (1-33, 34 또는 35)의 변형(modifications)에 따라 분류된다. 본 발명의 의미 내의 임의의 변이체, 유사체, 단편 또는 유도체는 기능적(functional)이어야 하는데, 예컨대, 변형되지 않은 GLP-1 펩티드와 동일하거나 또는 유사한 생물학적 효과를 발휘하여야 한다.
좋기로는, 본 발명의 펩티드는 융합 펩티드 또는 그의 변이체, 유사체, 단편 또는 유도체인데, 여기서 성분 (I)은 서열 번호 1과의 서열 동일성이 80% 이상, 더욱 좋기로는 85% 이상, 더욱더 좋기로는 90% 이상인 서열을 함유한다. 서열 번호 1은 포유류들 사이에서 엄격하게 보존된 GLP-1 (7-37)의 천연 아미노산 서열 (31개 아미노산 길이)이다.
본 발명에 따른 융합 펩티드 (또는 더욱 일반적으로는 융합 펩티드의 유사체, 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 임의의 본 발명의 펩티드)의 두 번째 성분 (성분 (II))은 β-턴 유사 규조를 형성할 수 있거나 그렇지 않은 적어도 9개 아미노산의 길이의 서열을 일반적으로 함유한다. β-턴 구조는 단백질 또는 펩티드의 전형적인 2차 구조 요소(element)이다. 그것은 일반적으로 그 펩티드 또는 단백질의 골격 사슬의 방향과 방향이 역전된 4개의 아미노산에 의하여 만들어진다. 성분 (II)의 아미노산 서열은 적어도 9개의 아미노산을 함유하고, 좋기로는 그의 서열 중에 적어도 1개의 프롤린 또는 알라닌 잔기를 함유한다. 프롤린 잔기는 4합체성(tetrameric) 아미노산 서열을 만드는 β 턴 내에서의 공통적인 아미노산이다. 프롤린 잔기는 상기 융합 펩티드의 성분 (II)에 존재하는 4합체성 β-턴 서열의 2 또는 3번 위치에, 좋기로는 2번 위치에 일반적으로 위치한다.
본 발명의 융합은 9 내지 30개, 좋기로는 9 내지 20개, 가장 좋기로는 9 내지 15개 아미노산 길이의 그의 성분 (II) 서열에서 일반적으로 가질 수 있다. 일반적으로 말하자면, 성분 (II)에서 더 짧은 서열은 더 긴 서열에 비한 그들의 GLP 수용체에 대한 더 우수한 결합 능력 때문에 양호할 수 있다. 성분 (II)의 서열은, 비록 그것이 필수 조건은 아니지만, 좋기로는 중성일 수 있거나 또는 pH 7에서 음전하를 가질 수 있다.
본 발명에 따른 융합 펩티드는 그의 성분 (II)가 VAIA, IAEE, PEEV, AEEV, EELG, AAAA, AAVA, AALG, DFPE, AADX, AXDX 및 XADX으로 이루어지는 군에서 선택되는 서열 모티프(sequence motif)를 함유하는 경우 바람직한데, 여기서 X는 임의의 아미노산 (자연적으로 발생하는 것 또는 변형된 비천연 아미노산)을 의미한다. 이들 4합체성 모티프는 성분 (II)의 서열 중에 어디든 위치할 수 있다. 특히 양호한 실시 상태에서, 본 발명의 융합 펩티드 성분 (II)는 AA, XA, AX, RR, RX 및 XR로 이루어지는 군에서 선택되는 그의 N-말단 서열 모티프에 의하여 성분 (I)의 C-말단에 연결되어 있는 펩티드 서열이다 (여기서, X는 임의의 아미노산 (자연적으로 발생하는 것 또는 변형된 비천연 아미노산)을 의미함).
본 발명의 융합 펩티드 중의 성분 (II)의 양호한 모티프는 서열 번호 25 (DFPEEVA)의 서열 모티프를 함유하거나 또는 인간 또는 마우스 IP-2의 부분 서열에 상응하는 서열 모티프 DFPEEVA와 서열 상동성이 80% 이상인 서열을 함유한다.
성분 (II)가 서열 번호 22 (RRDFPEEVAI) 또는 서열 번호 26 (AADFPEEVAI) (모든 펩티드 서열들은 1문자 코드로 표시됨)에 따른 서열 또는 서열 번호 22 또는 서열 번호 26과 서열 상동성이 80% 이상인 서열을 함유하는 펩티드 서열인 것인 융합 단백질이 특히 양호하다. 서열 번호 22는 15개 아미노산 길이의 전장 IP-2 서열의 N-말단의 10개 아미노산을 함유하는 전장 (인간 또는 마우스) IP-2 (중간 펩티드 2) 서열의 부분 서열이다. 서열 번호 26은 N-말단 (RR) 잔기의 (AA)로의 치환에 의하여 서열 번호 22로부터 유도된다. IP-2는 β-턴 함유 펩티드 서열의 양호한 예이다. 따라서, 성분 (II) 중에 함유되는 다른 더 강한 양호한 서열은 IP-2의 더 긴 부분 아미노산 서열, 예컨대, 인간에서 존재하는 N-말단 14개 아미노산 서열 (서열 번호 23 (RRDFPEEVAIVEEL)) 또는 그것의 마우스의 대응물 (서열 번호 24 (RRDFPEEVAIAEEL)) 또는 서열 번호 23 또는 24와 서열 상동성이 80% 이상인 서열이다. 융합 펩티드의 성분 (II) 중에 함유되는 성분으로서 가장 양호한 것은 자연 발생 IP-2 서열의 모든 15개 아미노산 (서열 번호 2 (RRDFPEEVAIVEELG) (인간) 또는 서열 번호 3 (RRDFPEEVAIAEELG) (마우스))을 가지는 전장 IP-2 서열 또는 서열 번호 2 또는 3과 서열 상동성이 80% 이상인 서열이다. IP2의 모든 포유류 이소폼 (isoforms) (포유류 중의 IP2의 천연 변이체)이 역시 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이 단락에서 언급된 모든 서열은 또한 자연적으로 존재하는 (RR) 대신에 N-말단 모티프 (AA), (AX) 또는 (XA)를 가질 수 있는데, 예컨대 서열 번호 27 (AADFPEEVAIVEEL), 서열 번호 28 (AADFPEEVAI-AEEL), 서열 번호 29 (AADFPEEVAIVEELG) 및 서열 번호 30 (AADFPEEVAI-AEELG)을 들 수 있다. 예컨대, IP2 또는 단편, 변이체 또는 유사체 또는 IP2의 유도체의 2개, 3개 또는 그 이상의 카피와 같이, 성분 (II)에 포함되는 서열의 1개 초과의 카피(copy)가 제공될 수 있다.
따라서, 서열 번호 8 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELG), 즉 어떠한 링커(linker) 서열 없이 그의 C-말단을 통해 마우스 IP2에 연결된 GLP-1 (7-37) 또는 서열 번호 12 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELG), 즉 어떠한 링커 서열 없이 그의 C-말단을 통해 인간 IP2에 연결된 GLP-1 (7-37)에 따른 서열을 함유하는 본 발명의 펩티드가 바람직하다. 서열 번호 8 및 서열 번호 12의 본 발명의 펩티드의 더욱 양호한 본 발명의 변이체는 서열 번호 31 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADFPEEVAIAEELG), 서열 번호 32 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFAEEVAIAEELG), 서열 번호 33 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDAAAAVAIAEELG), 서열 번호 34 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADAAAAVAIAAALG), 서열 번호 35 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFP), 서열 번호 36 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVA), 서열 번호 37 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELGRRHAC), 서열 번호 38 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADFPEEVAIVEELG), 서열 번호 39 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFAEEVAIVEELG), 서열 번호 40 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDAAAAVAIVEELG), 서열 번호 41 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADAAAAVAIVAALG), 서열 번호 42 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELGRRHAC), 즉, 어떠한 링커 서열 없이 그의 C-말단을 통해 IP2 서열의 특정 유사체 또는 변이체에 연결된 GLP-1 (7-37)이다. 서열 번호 8 및 12와 서열 상동성이 80% 이상인 그의 변이체, 유사체 또는 단편 또는 그의 유도체가 역시 포함되며 양호하다.
GLP-1 (7-35, 36 또는 37)의 불안정성은 그것이 필요한 임의의 환자에게 투여되는 경우 그의 보호되지 않은 3차원 구조에 기인한다는 것이, 어떠한 이론에 의한 제한 없이, 본 발명의 발명자들에 의하여 결론지어졌다. 프로테아제는 GLP-1 (7-35, 36 또는 37) 펩티드를 절단하여, 그것의 생리학적 활성을 생체 내에서 재빨리 무효화시킬 수 있다. 펩티드 서열을 GLP-1 (7-35, 36 또는 37)의 C-말단에 연결시킴으로써, 그 구조는 효소성 분해에 대한 안정성을 얻는다. 추가적인 C-말단 펩티드 서열 (본 발명에 따른 융합 펩티드의 성분 (II) 중에 함유되어 있음)이 그의 1차 구조에 의하여 생성되고 성분 (II)에 경직성을 제공하는 β-턴 구조 성분의 존재에 기인하여 뒤로 접히는(folds back) 경우, 안정성의 획득은 향상될 수 있는 것으로 나타난다. 그러나, 본 발명의 펩티드의 성분 (II) 중의 β-턴 구조는 성분 (I)의 GLP-1 서열의 효소성 분해에 대한 안정화를 위한 필수적인 것으로는 보이지 않는다. 그 C-말단 펩티드의 신장(extension) (예컨대, β-턴 구조 성분을 함유하는 것)에 의하여 본 발명의 펩티드는 DPP-IV 불활성화에 대한 저항성을 향상시켰다는 것이 발견된다. 상기 C-말단 펩티드는 표적 세포에서의 수용체에 대한 작용 전에 GLP-1 (7-35, 36 또는 37) 서열로부터 절단되지 않거나, 또는 효소적으로 절단되어 생체 내에서 GLP-1 (7-35, 36 또는 37)을 형성할 수 있다. GLP-1 수용체의 자리에 결합된 본 발명의 펩티드의 정확한 형태와 상관없이, 본 발명의 펩티드는 활성의 인슐린자극(insulinotropic) 화합물로서의 그의 기능을 발휘한다.
β-턴 성분을 형성하는 1차 구조 때문에 성분 (II)에 함유되기에 적합할 것으로 생각되는 펩티드 서열은 적합한 방법, 예컨대 분광법, 예컨대 원형 광이색성(circular dichroism) 또는 숙련자에게 알려진 기타의 방법에 의하여 용이하게 동정될 수 있다.
성분 (II) 및 성분 (I)은 직접적으로 연결되거나 또는 링커 서열을 통해 연결될 수 있다. 좋기로는, 양쪽 성분은 서로 직접적으로 연결된다. 이들이 링커 (또는 스페이서)를 통하여 연결되는 경우, 그 링커는 좋기로는 펩티드 링커 또는 유기(organic) 링커이다. 일반적으로 펩티드 링커는 1 내지 10개 아미노산, 좋기로는 1 내지 5개, 더욱 좋기로는 1 내지 3개 아미노산 길이를 가지고, 일부 경우에는 그 링커 서열은 11 내지 50개 아미노산을 포함하는 더 긴 서열일 수도 있다. 펩티드 링커는 다양한 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 좋기로는, 펩티드 링커는 결합될 성분들 사이에 약간의 구조적 유연성을 도입시킬 것이다. 구조적 유연성은 예컨대 다수의 글리신 또는 프롤린 잔기를 함유하는 펩티드 링커를 가짐으로써 얻어지는데, 좋기로는 30% 이상, 더욱 좋기로는 40% 이상, 더욱더 좋기로는 60% 이상의 프롤린 및 글리신 잔기를 그 링커 서열 내에 함유하는 것이다. 구체적인 서열과 무관하게, 상기 펩티드 링커는 좋기로는 면역학적으로 불활성일 수 있다.
본 발명의 양호한 실시 상태에서, 본 발명의 펩티드, 즉 융합 펩티드 또는 그의 유사체, 단편, 변이체 또는 유도체는 성분 (II)의 C-말단 및/또는 성분 (I)의 N-말단에 연결되는 제3의 성분 (성분 (III))을 함유한다. 좋기로는, 성분 (III)은 성분 (II)의 C-말단에 위치된다. 성분 (III)이 성분 (I)의 N-말단 (그의 C-말단에 의해)에 연결되는지 또는 성분 (II)의 C-말단 (그의 N-말단에 의해)에 연결되는지와 무관하게, 그 결합(coupling)은 직접적이거나 또는 링커 서열을 통한 간접적일 수 있다. 그 링커 서열에 관하여는 성분 (I) 및 성분 (II)를 연결하는 링커에 대한 전술한 기재가 참조된다. 일반적으로, 성분 (III)은 4개 이상의 아미노산 잔기를 포함하고, 좋기로는 10개 이상의 추가적인 아미노산 잔기, 더욱 좋기로는 20개 이상, 또는 30개 이상을 포함한다. 기능적으로는, 성분 (III)은 본 발명의 펩티드의 안정성을 더욱 향상시키기 위해 제공된다. 성분 (III)은 GLP-1 (7-37)의 생물학적 활성에 필적하는 본 발명의 펩티드의 생물학적 기능을 간섭하지 않을 것으로 예상된다.
좋기로는, 본 발명의 펩티드의 성분 (III)은, 예컨대 서열 번호 4 및 5에 나타낸 마우스 또는 인간 이소폼과 같은, 임의의 포유 동물의 GLP-2의 이소폼(isoform) (포유류 중의 GLP-2의 기타의 자연적으로 발생하는 변이체)의 N-말단의 4개 이상, 좋기로는 10개 이상, 더욱 좋기로는 20개 이상의 추가적인 아미노산 잔기를 포함한다. GLP-2는 프로-글루카곤(pro-glucagon) 중에 존재하고, 또한 탄수화물 대사에 관련된다. 성분 (I) (GLP-1 펩티드) 중에 포함된 생물학적으로 활성인 서열에 관한 것과 마찬가지로, 성분 (III)은 GLP-2의 자연적으로 존재하는 형태의 유사체, 변이체 또는 유도체를 또한 포함할 수 있다. 그 대신에, 성분 (III)은 GLP-1 (7-37)의 N-말단 서열의 4개 이상, 좋기로는 10개 이상, 더욱 좋기로는 20개 이상의 추가적인 아미노산 잔기를 역시 포함할 수 있고, 그에 따라서 모든 포유류의 이소폼 또는 (본 명세서에서 개시된 바와 같은) 이들의 모든 기능적 변이체, 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 일반적으로 말하면, 성분 (III)은 본 발명의 펩티드의 성분 (I)에 대해 적합한 것으로서 본 명세서에서 개시된 GLP-1 펩티드 또는 변형된 GLP-1 펩티드의 임의의 형태를 함유할 수 있다. 또 다른 경우, 성분 (III)은 GLP-1 (7-37) 및 GLP-2의 키메라 형태(chimeric form)를 역시 함유할 수 있다. 키메라 형태는 GLP-1 (7-37) 및 GLP-2 (또는 그 양쪽의 단편, 유사체, 변이체 또는 유도체)의 서로의 결합에 의하여 그리고 이어서 본 발명의 펩티드에 성분 (III)으로서 이러한 키메라 형태를 도입시킴으로써 생성될 수 있다. 좋기로는, 상기 키메라 형태는 서로 함께 연결된 GLP-1(7-37)의 부분 서열 및 GLP-2의 부분 서열로 구성된다. 예컨대, 상기 키메라 형태는 GLP-1의 N-말단 5 내지 30개 아미노산 및 GLP-2의 C-말단의 5 내지 30개 아미노산 또는 그 반대, 예컨대, GLP-1 (7-37)의 아미노산 7 또는 8번 내지 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28번 및 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24번 위치부터 예컨대 GLP-2의 C-말단 까지의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
자연적으로 존재하는 형태의 GLP-2 또는 GLP-1 (7-37) 각각의 변형체가 성분 (III)으로서 사용되는 경우, 성분 (III)은 좋기로는 각각 서열 번호 4 또는 5 또는 서열 번호 1의 서열 또는 서열 번호 4 또는 5 또는 서열 번호 1과 서열 상동성이 80% 이상인 서열을 함유한다. 예컨대 측쇄 변형 또는 펩티드 골격 변형 등 ("유도체"에 속하는 것으로 본 명세서에 개시된 바와 같이)에 기인한 이들 양호한 서열의 유도체가 성분 (III)로서 본 발명에 역시 포함된다.
또 다른 실시 상태에서, 성분 (III)은 다수의 전술한 바와 같은 서열을 함유할 수 있다. 예컨대, 성분 (III)은 2개 이상, 좋기로는 2, 3 또는 4개 카피의 GLP-1 (7-37) 및/또는 GLP-2 또는 2개 이상 카피의 서열 번호 1, 4 또는 5와 서열 상동성이 80% 이상인 서열을 함유할 수 있다. 또한, 성분 (III)은 전술한 바와 같은 키메라 형태의 GLP-1(7-37) 또는 GLP-2, 예컨대 GLP-1 (7-37) 및/또는 GLP-2 또는 서열 상동성이 80% 이상인 그의 변형체와 함께 키메라 형태(들)의 조합을 최종적으로 형성하는 1개 이상의 카피를 함유할 수 있다. 2개 이상, 좋기로는, 2개의 성분 (III), 예컨대 링커를 통하여 또는 직접적으로 (1) 그의 N-말단이 성분 (II)의 C-말단에 연결된 것과, (2) 그의 C-말단이 성분 (I)의 N-말단에 연결된 것일 수 있는 것이 역시 본 발명의 범위 내에 속한다. 2개의 성분 (III)가 제공되는 경우, 이들은 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
따라서, 3가지 성분 (I), (II) 및 (III)을 함유하는 본 발명의 융합 펩티드가 특히 바람직하다. 이들 성분 모두를 함유하는 4가지 구체적인 실시 상태는 서열 번호 6 (N-GLP-1(7-37)-IP2(마우스)-RR-GLP-1(7-37)-C, 또는 본 명세서에서 마우스 CM1으로 지칭됨), 서열 번호 7 (N-GLP-1(7-37)-IP2(마우스)-RR-GLP2-C, 또는 본 명세서에서 마우스 CM2로 지칭됨), 서열 번호 10 (N-GLP-1(7-37)-IP2(인간)-RR-GLP-1(7-37)-C, 또는 인간 CM1으로 지칭됨) 및 서열 번호 11 (N-GLP-1(7-37)-IP2(인간)-RR-GLP-2-C), 또는 본 명세서에서 인간 CM2로 지칭됨) 또는 서열 번호 6, 7, 10 또는 11 또는 그의 유도체와 서열 상동성이 80% 이상인 서열로 이루어지는 군에서 선택된다. 서열 번호 6, 7, 10 및 11 모두는 IP2 (성분 (II))의 C-말단에서 RR 링커 (2개의 아르기닌 잔기)를 함유한다 (그 대신에 또한 이것은 폐기(discarded)될 수도 있다). 서열 번호 6, 7, 10 또는 11에 따른 각 실시 상태에서 성분 (I)은 GLP-1 (7-37)이고, 성분 (III) (이들 각 실시 상태에서 성분 (II)의 C-말단에 연결됨)은 GLP-1 (7-37) 또는 GLP-2 중 하나이다.
본 발명의 펩티드는 다양한 변형된 형태로 존재할 수 있다. 이들 변형된 형태는 아래에서 개시하고 있으며 더욱 상세하게 설명한다. 본 명세서에서 "염(salts)"이라는 용어는 카르복실기의 염 및 전술한 융합 펩티드 또는 그의 유사체, 단편, 유도체 또는 변이체의 아미노기의 산 첨가 염(acid addition salts) 양쪽 모두를 의미한다. 카르복실기의 염은 당해 기술 분야에 알려진 수단에 의하여 생성될 수 있고, 무기염, 예컨대 나트륨, 칼슘, 암모늄, 철 또는 아연 염 등 및 유기 염기, 예컨대, 아민, 예컨대 에탄올아민, 아르기닌 또는 리신, 피페리딘, 프로카인 등으로 생성되는 염을 포함한다. 산 첨가 염은 예를 들어, 예컨대 염산 또는 황산과 같은 무기산을 가진 염 및 예컨대 아세트산 또는 옥살산과 같은 유기산을 가진 염을 포함한다. 물론, 모든 그러한 염은 본 발명의 펩티드의 생물학적 활성, 즉 순환 속으로 영양분의 진입 속도를 감소시키는 능력을 보유하여야 한다. 아래에 개시되는 것처럼, 염 펩티드 형태는 약학적 제형 중에 함유될 수 있다.
본 발명에 따른 융합 펩티드의 "단편"은 그 분자의 임의의 부분 집합, 즉 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 더 짧은 펩티드를 지칭한다. 단편은 그 분자의 양쪽 말단 중 하나로부터 아미노산을 제거하여 인크레틴으로서 그의 특성에 대한 결과를 테스트함으로써 용이하게 제조될 수 있다. 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 중 하나로부터 한번에 1개의 아미노산을 제거하기 위한 프로테아제는 알려져 있고, 따라서 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 단편을 결정하는 것은 단지 반복적인 실험을 포함한다. 결론적으로, 단편은 펩티드 말단의 아미노산 및/또는 펩티드 서열 내에 위치한 아미노산의 결실에 기인할 수 있다.
또한, 융합 펩티드 그 자체, 그의 유사체 또는 변이체, 염, 기능적 유도체 및/또는 단편인, 항 제2형 당뇨 활성(anti-diabetes type 2 activity)을 가진 본 발명의 펩티드는 본 발명의 펩티드의 측면에 추가적인 아미노산 잔기를 또한 함유할 수 있다. 그 최종 분자가 프로테아제에 대한 저항성 또는 안정성 및 인크레틴으로서 작용하는 능력을 보유하고 있는 한, 임의의 그러한 측면 잔기가 핵심 펩티드의 기본적이고 신규한 특성에 영향을 미치는지 여부를 반복적인 실험에 의하여, 예컨대 췌장 세포에 대한 그 효과에 의하여 결정할 수 있다. 특정 서열을 언급할 때 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"이라는 용어는 특정의 본 발명의 펩티드의 기본적이고 신규한 특성에 영향을 미치지 않는 추가적인 측면 잔기가 존재할 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 용어는 그 특정 서열 내에 치환, 결실 또는 첨가를 포함하는 것이 아니다.
본 발명에 따른 "변이체"는 전술한 본 발명의 펩티드 전체 또는 그의 단편 중 하나와 실질적으로 유사한 분자를 말한다. 변이체 펩티드는 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법을 사용한 그 변이체 펩티드의 직접적인 화학적 합성에 의하여 편리하게 제조될 수 있다. 물론, 본 발명의 펩티드의 그러한 변이체는 유사한 항당뇨 특성, 예컨대 상응하는 자연적으로 존재하는 GLP-1 펩티드에서와 같은 인슐린 자극 활성을 가질 것이다.
또한, 전술한 펩티드의 아미노산 서열 변이체는 합성된 유도체를 코딩하는 DNA들에서의 돌연변이에 의하여 제조될 수 있다. 그러한 변이체는 예컨대 그 아미노산 서열 내의 잔기의 결실 또는 삽입 또는 치환을 포함한다. 또한, 최종 구조물(construct)이 목적하는 활성을 가진다면, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 최종 구조물에 이르도록 할 수 있다. 그 변이체 펩티드를 코딩하는 DNA 중에서 만들어질 돌연변이는 해독틀을 변경시키지 않아야하고, 좋기로는 2차 mRNA 구조를 생산할 수 있는 상보적인 영역을 만들지 않을 것이라는 점은 명백하다.
전술한 본 발명에 따른 펩티드의 "유사체(analog)"는 그 전체 분자 또는 그의 활성 단편과 실질적으로 유사한 비천연(non-natural) 분자를 말한다. 그러한 유사체는 상응하는 자연적으로 존재하는 GLP-1 펩티드와 동일한 활성을 나타낼 것이다.
본 발명에 따른 본 발명의 펩티드에 만들어질 수 있는 치환의 종류는 상이한 종의 상동 단백질/펩티드 사이에서의 아미노산 변경의 빈도의 분석에 기초할 수 있다. 그러한 분석에 기초하여, 보존적 치환이 다음의 5가지 군 중의 한가지 내의 교환으로서 본 명세서에서 규정될 수 있다:
I. 작은, 지방족, 비극성 또는 약한 극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly; II. 극성, 음전하 잔기 및 이들의 아미드: Asp, Asn, Glu, Gln; III. 극성, 양전하 잔기: His, Arg, Lys; IV. 큰, 지방족 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val, Cys ; V. 큰 방향족 잔기: Phe, Try, Trp.
전술한 군 중에서, 다음의 치환이 "매우 보존적(highly conservative)"인 것으로 간주된다: Asp/Glu; His/Arg/Lys; Phe/Tyr/Trp; Met/Leu/Ile/Val. 반보존적(semi-conservative) 치환은 전술한 (I), (II) 및 (III) 군을 포함하는 슈퍼그룹(supergroup) (A) 또는 전술한 (IV) 및 (V)를 포함하는 슈퍼그룹 (B)로 한정되는 전술한 (I) 내지 (IV) 군 중의 2가지 사이에서의 교환으로 규정된다. 치환은 유전적으로 코딩된 또는 자연적으로 발생하는 아미노산에 한정되지 않는다.
일반적으로, 본 발명의 펩티드의 유사체 또는 변이체는 또한 예컨대 용해도를 향상시킬 목적으로 만들어진 아미노산 치환 (소수성 아미노산을 친수성 아미노산으로 치환)을 함유한다. 본 발명의 펩티드의 GLP-1 펩티드의 변이체/유사체 (본 발명의 펩티드의 성분 (I) 및/또는 (III)에 존재하는 것)의 한가지 실시 상태에서, 그 (변형된) GLP-1 펩티드는 그 GLP-1 펩티드의 7, 8, 11, 12, 16, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 33, 34, 35, 36 또는 37번 위치에서의 1개 이상의 치환(들)을 특징으로 한다. 다음의 명명법에 대한 예로서, [Arg34-GLP-1 (7-37)]는 34번 위치의 자연적으로 존재하는 리신이 아르기닌으로 치환된 GLP-1 유사체를 지칭한다.
구체적으로, 본 발명의 펩티드의 성분 (I) 및/또는 (III)은, 예컨대 Gln9-GLP-1 (7-37), D-Gln9-GLP-1(7-37), acetyl-Lys9-GLP-1 (7-37), Thr16-Lys18-GLP-1 (7-37) 및 Lys18-GLP-1 (7-37), Arg34-GLP-1 (7-37), Lys38-Arg26-GLP-1 (7-38)-OH, Lys36-Arg26-GLP-1 (7-36), Arg26,34-Lys38-GLP-1 (7-38), Arg26,34-Lys38-GLP-1(7-38), Arg26,34-Lys38-GLP-1 (7-38), Arg26,34-Lys38-GLP-1 (7-38), Arg26,34-Lys38-GLP-1 (7-38), Arg26-Lys38-GLP-1(7-38), Arg26-Lys38-GLP-1(7-38), Arg26-Lys38-GLP-1 (7-38), Arg34-Lys38-GLP-1 (7-38), Ala37-Lys38-GLP-1 (7-38) 및 Lys37-GLP-1 (7-37)을 포함하는 GLP-1 (7-35, 36 또는 37)의 변이체 및 유사체을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시 상태에서, 본 발명의 펩티드는 성분 (I) 또는 (III)으로서 다음의 식 II의 아미노산 서열 (서열 번호 44)을 포함하는 변형된 GLP-1 펩티드를 함유한다:
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa3o-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,
식 중, Xaa7은 L-히스티딘, D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, 3-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, N-아세틸-히스티딘, a-플루오로메틸-히스티딘, a-메틸-히스티딘, 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌 또는 4-피리딜알라닌이고; Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, (1-아미노시클로프로필) 카르복실산, (1-아미노시클로부틸) 카르복실산, (1-아미노시클로펜틸) 카르복실산, (1-아미노시클로헥실) 카르복실산, (1-아미노시클로헵틸) 카르복실산 또는 (1-아미노시클로옥틸) 카르복실산이고, Gly에 의한 것이 특히 양호하며; Xaa16은 Val 또는 Leu; Xaa는 Ser, Lys 또는 Arg이고; Xaa19는 Tyr 또는 Gln이며; Xaa20은 Leu 또는 Met이고; Xaa22는 Gly, Glu 또는 Aib이며; Xaa23은 Gln, Glu, Lys 또는 Arg이고; Xaa25는 Ala 또는 Val이며; Xaa26은 Lys, Glu 또는 Arg이고; Xaa27은 Glu 또는 Leu이며; Xaa30은 Ala, Glu 또는 Arg이고; Xaa33은 Val 또는 Lys이며; Xaa34는 Lys, Glu, Asn 또는 Arg이고; Xaa35는 Gly 또는 Aib이며; Xaa36은 Arg, Gly 또는 Lys 또는 아미드이거나 또는 결여(absent)된 것이고; Xaa37은 Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, 아미드이거나 또는 결여된 것이다.
본 발명의 또 다른 실시 상태에서, 본 발명의 펩티드의 성분 (I) 및/또는 (III)은 다음의 식 III의 아미노산 서열 (서열 번호 45)을 포함하는 변형된 GLP-1 펩티드를 함유한다:
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa8-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,
식 중, Xaa7은 L-히스티딘, D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, -히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, N-아세틸-히스티딘, a-플루오로메틸-히스티딘, a-메틸-히스티딘, 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌 또는 4-피리딜알라닌이고; Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, (1-아미노시클로프로필) 카르복실산, (1-아미노시클로부틸) 카르복실산, (1-아미노시클로펜틸) 카르복실산, (1-아미노시클로헥실) 카르복실산, (1-아미노시클로헵틸) 카르복실산 또는 (1-아미노시클로옥틸) 카르복실산이며; Xaa18은 Ser, Lys 또는 Arg이고; Xaa22는 Gly, Glu 또는 Aib이며; Xaa23은 Gln, Glu, Lys 또는 Arg이고; Xaa26은 Lys, Glu 또는 Arg이며; Xaa30은 Ala, Glu 또는 Arg이고; Xaa34은 Lys, Glu 또는 Arg이며; Xaa35는 Gly 또는 Aib이고; Xaa36은 Arg 또는 Lys, 아미드이거나 또는 결여된 것이고; Xaa37은 Gly, Ala, Glu 또는 Lys, 아미드이거나 또는 결여된 것이다.
본 발명의 특히 양호한 실시 상태에서, 본 발명의 펩티드의 성분 (I) 및/또는 (III)은 GLP-1 (7-35), GLP-1 (7-36), GLP-1 (7-36)-아미드, GLP-1 (7-37) 또는 그의 변이체, 유사체 또는 유도체에서 선택되는 (변형된) GLP-1 펩티드를 함유한다. 또한, 그들의 성분 (I) 및/또는 (III)에 상기 GLP-1 펩티드의 8번 위치에 Aib 잔기 또는 7번 위치에 D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, 히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, N-아세틸-히스티딘, a-플루오로메틸-히스티딘, a-메틸-히스티딘, 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌 및 4-피리딜알라닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 잔기를 가지는 변형된 GLP-1 펩티드를 포함하는 본 발명의 펩티드가 양호하다.
본 발명에서의 사용을 위한 유사체를 얻기 위해 사용될 수 있는 단백질 내에 아미노산 치환의 생성의 예로는 임의의 알려진 방법의 단계를 포함하는데, 예컨대 미국 특허 RE 33,653; 4,959,314; 4,588,585 및 4,737,462 (Mark 외); 5,116,943 (Koths 외); 4,965,195 (Namen 외); 및 5,017,691 (Lee 외)에 기재되어 있는 것과, 미국 특허 4,904,584 (Shaw 외) 중에 기재되어 있는 리신 치환된 단백질을 들 수 있다.
좋기로는, 전술한 성분 (I), (II) 및/또는 (III) 중에 함유된 변이체 또는 유사체는 "천연(native)" 서열 핵심 서열과 동일한 핵심(core) 서열 (예컨대, GLP-1 (7-37) 또는 GLP-2 또는 이들의 생물학적으로 활성인 단편 또는 상기 천연 아미노산 서열에 대해 70% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지고 그의 생물학적 활성을 보유하는 임의의 IP2 이소폼)을 가질 것이다. 더욱 좋기로는, 그러한 서열은 그 천연 서열에 대해 80% 이상의 동일성, 90% 이상의 동일성 또는 가장 좋기로는 95% 이상의 동일성을 가진다. 특정 펩티드가 소정의 길이의 기준 폴리펩티드에 대해 특정 백분율의 동일성을 가진다고 일컬어지는 경우, 그 백분율의 동일성은 기준 펩티드에 상대적이다. 따라서, 100개 아미노산 길이의 기준 폴리펩티드에 50% 동일한 펩티드는 그 기준 폴리펩티드의 50개 아미노산 길이의 부분에 완전히 동일한 50개 아미노산 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 그것은 그의 전장에 걸쳐서 그 기준 폴리펩티드에 50% 동일한 100개 아미노산 길이의 폴리펩티드일 수 있다. 물론, 다른 폴리펩티드도 동일한 기준에 적합할 수 있을 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "서열 동일성(sequence identity)"이라는 용어는 그 서열이 다음과 같이 비교된다는 것을 의미한다. 그 서열들은 제네틱 컴퓨팅 그룹의 GAP (글로벌 얼라인먼트 프로그램)의 버전 9를 사용하여, (갭(gap)의 첫 번째 0(null)에 대해) -12의 갭(gap) 오픈 페널티 및 (갭 중의 각각의 추가의 연속적인 0(null) 마다) -4의 갭 익스텐션 페널티를 가진 디폴트 (BLOSUM62) 매트릭스 (값-4 내지 +11)를 사용하여 정렬된다. 정렬 후에, 백분율 동일성은 청구된 서열에서 아미노산의 개수의 백분율로서 일치(matches)의 개수를 표현함으로써 계산된다.
융합 펩티드의 유도체 또는 그의 유사체, 단편 또는 변이체는가 역시 본 발명에 포함된다. 본 발명의 펩티드의 "유도체"라는 용어는 1개의 아미노산이 20개의 일반적으로 존재하는 천연 아미노산 중의 또 다른 것으로 변화된 것이 아닌 변형된 본 발명의 펩티드만을 포함하는 것으로 의도된 것이다. 그에 따라, 유전적으로 코딩된 아미노산은 선택된 잔기의 측쇄 또는 말단 잔기의 아미노 또는 카르복시기와 반응할 수 있는 (좋기로는 공유적 변형에 의하여) 유기 유도화제와 반응시킴으로써; 또는 비천연 아미노산 (화학적 합성에 의하여 제조되는 것, 즉, 유전 코드에 의하여 코딩된 아미노산의 D-이성질체, Aib (a-아미노이소부티르산), Abu (a-아미노부티르산), Tie (tert-부틸글리신), p-알라닌, 3-아미노메틸 벤조산, 안트라닐산) 또는 유전적 코드에 의해 코딩되지 않는 천연 아미노산 (예컨대, 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 오르니틴, 포스포세린, D-알라닌 및 D-글루타민)을 도입시킴으로써; 또는 대체(alternative) 펩티드 골격 배열에 의한 그 펩티드 골겨의 변형에 의하여 변형될 수 있다.
아래에, 본 발명의 펩티드 중의 (예컨대, 성분 (I), (II) 및/또는 (III) 중에 위치하는) 임의의 위치 (임의의 아미노산)에서 존재할 수 있는, 본 발명의 펩티드 (전술한 바와 같이, 그 융합 펩티드의 변이체, 유사체 또는 단편을 역시 포함함)의 양호한 아미노산의 변형이 기재되어 있다.
시스텐이닐(cysteinyl) 잔기는, 그것이 본 발명의 펩티드의 임의의 형태, 예컨대 본 발명의 펩티드의 유사체 중에 존재한다면, 알파-할로아세테이트 (및 상응하는 아민), 예컨대 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 가장 일반적으로 반응하여 카르복실메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 생성한다. 또한, 시스테이닐 잔기는 브로모트리플루오로아세톤, 알파-브로모-베타-(5-이미다조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디설피드, 메틸-2-피리딜 디설피드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과의 반응에 의하여 유도화된다
본 발명의 펩티드 중의 히스티딜(histidyl) 잔기는 pH 5.5∼7.0에서 디에틸프로카르보네이트와의 반응에 의하여 유도화될 수 있는데, 이 시약이 히스티딜 측쇄에 대해 상대적으로 특이적이기 때문이다. 파라브로모펜아실 브로마이드(Parabromophenacyl bromide)가 또한 유용하고, 그 반응은 좋기로는 pH 6.0에서 0.1 M 카코딜산나트륨 중에서 수행된다. 특히, 본 발명의 펩티드의 성분 (I) 및/또는 (III) 중에 함유되는 GLP-1 (7-37)의 N-말단 히스티딘 잔기 (His7)는 스즈키(Suzuki) 등의 문헌 [Diabetes Res.; Clinical Practice 5 (Supp. 1): S30 (1988)]에 기재되어 있는 것처럼 GLP-1 펩티드의 인슐린자극 활성에 매우 중요하다. 그에 따라서, 본 발명의 펩티드는 성분 (I) 및/또는 (III)의 일부분으로서 그의 GLP-1의 His7에서 알킬 또는 아실 (C1∼C6)기에 의하여 또는 기능적으로 등가의 C5∼C6 고리 구조물로 His의 치환에 의하여 변형될 수 있다. 양호한 변형은 His7의 아미노 말단에 또는 그의 히스티딜 측쇄에 소수성 모이어티의 도입이다.
본 발명의 펩티드의 리시닐(lysinyl) 및 아미노 말단 잔기는 예컨대 숙신산 또는 기타의 카르복실산 무수물과 반응될 수 있다. 이들 시약으로의 유도체화는 리시닐 잔기의 전하를 역전식키는 효과가 있다. 본 발명의 펩티드 중의 리신 잔기(들)의 입실론-아미노기의 아실 (C12∼C18) 변형에 의하여, 순환(circulation)에서 그들의 반감기가 증가한다. 아르기닐(arginyl) 잔기는 예컨대 페닐글리옥살 및 닌히드린을 포함하는 1종 또는 수종의 통상의 시약과 반응하여 변형될 수 있다. 아르기닌 잔기의 유도체화는 구아니딘 작용기의 높은 pKa 때문에 그 반응이 알칼리 조건에서 수행되는 것을 필요로 한다. 더욱이, 이들 시약은 리신의 작용기 및 아르기닌 입실론-아미노기와 반응할 수 있다.
티로실(tyrosyl) 잔기의 특이적 변형은 그 자체로 광범위하게 연구되어 왔다. 가장 일반적으로, N-아세틸이미다졸 및 테트라니트로메탄이 각각 O-아세틸 티로실 종 및 e-니트로 유도체를 생성하는데 사용될 수 있다.
카르복실 측기 (아스파르틸 또는 글루타밀)는 카르보디이미드 (R'N-C-N-R'), 예컨대 1-시클로헥실-3-[2-모르폴리닐-(4-에틸)]카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸)카르보디이미드와의 반응에 의하여 선택적으로 변형될 수 있다.
더욱이, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과 반응하여 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환될 수 있다.
글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 탈아미드화될 수 있다. 또한, 이들 잔기는 온화한 산성 조건하에서 탈아미드화될 수 있다. 이들 잔기의 어느 한쪽의 형태는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 탈아미드화 펩티드는 프로테아제 또는 펩티다제 효소로의 단백질분해(proteolysis)에 대한 변형된 민감성을 받을 수 있고, 이는 탈아미드화가 본 발명의 펩티드의 단백질 분해적 절단을 지시하는데 있어서 생리학적 중요성을 가질 수 있다는 것을 제안한다. 본 발명의 생합성 펩티드는 그 펩티드 중의 1개 이상의 자리에서의 탈아미드화에 기인하여 특정 보관 조건하에서 분해될 수 있다는 것이 주목된다. 본 발명의 펩티드 중의 메티오닌 잔기는 산화 (주로 설폭사이드) 될 수 있다. 전술한 나머지 유도체로서, 본 발명의 데스아미드 펩티드 및/또는 본 발명의 설폭사이드 펩티드는 완전한 생물학적 활성을 나타내기 위하여 사용될 수 있다.
알파-아미노산-함유 잔기를 유도체화하기 위한 기타의 적합한 시약으로는 이미도데스테르, 예컨대 메틸 피콜린이미데이트; 피리독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로하이드라이드; 트리니트로벤젠술폰산; O-메틸이소우레아(O-methyliosurea); 2,4-펜탄디온; 및 글리옥실레이트로의 트란스아미나아제-촉매 반응을 들 수 있다.
그들의 카르복시기 (C-말단) 및 그들의 아민기 (N-말단) (뿐만 아니라, 카르복시 또는 아미드 아미노산 측쇄기, 상기 참조)를 가진 본 발명의 펩티드의 말단 아미노산 잔기는 적합한 아미노 또는 카르복실 보호기를 사용한 그들의 보호된 형태 (예컨대, 아미드기에 의한 C-말단) 및/또는 보호되지 않은 형태로 존재할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩티드의 산 첨가 염이 제공될 수 있다. 공통적인 산 첨가 염은 할로겐화수소산(hydrohalic acid) 염 즉, HBr, HI 또는 더욱 좋기로는 HCl이다.
본 발명의 펩티드 중에 존재하는 말단 또는 측쇄 카르보닐기 또는 리신의 입실론 아미노기의 PEG화(PEGylation)는 산화에 대한 저항성을 부여하고, 또한 이는 본 발명의 범위 내에 속한다.
본 발명의 펩티드의 유도체를 생성하는 다른 변형은 본 발명의 펩티드에 공유 결합될 수 있는 탄수화물 및/또는 지질에 기초한다. 지질 및/또는 탄수화물은 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민 또는 티로신 또는 글루타메이트 또는 아스파테이트에 그들의 반응성 측쇄 모이어티를 통하여 결합되는 것이 좋다. 그 대신에, 탄수화물 및/또는 지질은 본 발명의 펩티드의 말단 모이어티에 연결될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 펩티드는 본 발명의 펩티드를 역시 안정화시킬 수 있고/있거나 본 발명의 펩티드의 체액 (특히, 혈액) 중에서의 이동(trasnport) 특성의 향상을 제공할 수 있는 기능적으로 상이한 펩티드 또는 단백질 모이어티에 결합될 수 있다. 적합한 펩티드 또는 단백질은 예컨대 알부민, 트란스페린 등에서 선택될 수 있고, 이들은 본 발명의 펩티드에 (성분 IV로서) 직접적으로 결합되거나 또는 펩티드 또는 유기 링커 서열을 통하여 결합된다. 좋기로는, 이들 펩티드 또는 단백질은 본 발명의 펩티드의 말단 중 한쪽에 결합된다.
본 발명의 펩티드의 분해의 문제를 회피하기 위하여, 본 발명의 또 다른 실시 상태는 본 발명의 펩티드의 D-아미노산으로 구성되거나 적어도 부분적으로 D-아미노산으로 구성된 레트로-인버소(retro-inverso) 이성질체를 제공한다. "레트로-인버소 이성질체"라는 용어는 그 서열의 방향이 역전되고, 각 아미노산 잔기의 키랄성(chirality)이 반대로된 선형 펩티드의 이성질체를 의미한다 (예컨대, Jameson et al., Nature, 368, 744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368, 692-693 (1994) 참조). 모(母) 펩티드와 관련하여, 그 레트로-인버소 펩티드는 일반적으로 F-moc 아미노산 유도체로 아미노산의 역전된 순서로 합성된다. 일반적으로, 그 비가공(crude) 펩티드는 역상 HPLC에 의하여 정제될 수 있다.
본 발명의 펩티드에 도입될 수 있는 다른 변형은 펩티드 골격의 변형에 관한 것이다. 좋기로는, 그 변형된 본 발명의 펩티드는 스캐폴드 모방체(scaffold mimetics)이다. 그들의 골격은 자연적으로 존재하는 골격과 상이하지만, 그들의 측쇄 구조는 본 발명의 펩티드 또는 그 단편, 변이체, 유도체 또는 유사체와 동일하다. 일반적으로, 스캐폴드 모방체는 (좋기로는) 치환으로 또는 삽입으로, 1개 이상의 골격 사슬의 일원 (NH, CH, CO)의 변형을 보인다. 치환체는 예컨대 (I) -NH- 대신 -O-, -S- 또는 -CH2-; (II) -CHR- 대신 -N-, C-알킬- 또는 -BH-; (III) -CO- 대신 -CS-, -CH2-, -SOn-, -P=O(OH)- 또는 -B(OH)-이다. 본 발명의 펩티드의 펩티드 모방체는 이들 변형 각각의 조합일 수 있다. 특히, 각각의 I, II 및 III 군의 변형이 조합될 수 있다. 펩티드 모방체에서, 각각의 골격 사슬의 일원은 변형될 수 있거나, 또는 그 대신에 소정 수의 사슬의 일원만이 자연적으로 존재하지 않는 모이어티로 교환될 수 있다. 좋기로는, -NH-, -CHR- 또는 CO 중의 하나인 본 발명의 펩티드의 모든 골격 사슬의 일원은 또 다른 자연적으로 존재하는 것이 아닌 작용기로 교체된다. 본 발명의 펩티드 골격의 아미드 결합 (-NH-CO-)이 치환되는 경우 (전체 분자에서 또는 적어도 1개의 단일 위치에서), 양호한 치환 모이어티는 바이오이소스테릭(bioisosteric), 예컨대 레트로-인버스 아미드 결합 (-CO-NH-), 히드록실 에틸렌 (-CH(OH)-CH2-), 알켄 (CH2=CH-), 카르바 (CH2-CH2-) 및/또는 -P=O(OH)-CH2- 이다. 그 대신에, 삽입에 의한 골격 사슬 신장이 예컨대 C-알파 원자의 측면의 모이어티에 의하여 본 발명의 펩티드의 스캐폴드 모방체 중에서 일어날 수 있다. C-알파 원자의 양쪽 측면 중 하나에서, 예컨대 -O-, -S-, -CH-, -NH-가 삽입될 수 있다.
본 발명의 펩티드의 올리고카르바메이트 펩티드 골격 구조가 특히 양호하다. 아미드 결합은 카르바메이트 모이어티에 의하여 치환된다. 단량체 N-보호 아미노 알킬 카르보네이트가 상응하는 아미노산 또는 아미노 알콜을 통하여 접근할 수 있다. 이들은 F-moc 모이어티 또는 고상 합성에 의한 감광성(photo sensitive) 니트로아트릴옥시카르보닐기의 사용에 의하여, 예컨대 p-니트로 페닐 에스테르와 같은 활성 에스테르로 변환된다.
본 발명의 펩티드는 전술 것처럼 단백질분해성 절단에 대해 보호된다. 이들은 특히 디펩티딜 아미노펩티다제-4 (DPP-IV)에 대해 보호된다. 본 명세서에서 사용되는 "DPP-IV 보호(protected)"라는 용어는 청구항 제1항에 기재된 펩티드를 말한다. 본 발명의 펩티드뿐만 아니라 그들의 유도체, 유사체, 단편 및 변이체는 본 발명의 펩티드의 성분 (I) 및/또는 (III)의 일부로서의 GLP-1 (7-35, 36 또는 37)을 혈장 펩티다제 (DPP-IV)에 대한 저항성이 되게 한다.
디펩티딜 아미노펩티다제 IV에 의한 분해에 대한 펩티드의 저항성은 예컨대 다음의 분해 분석법에 의하여 측정될 수 있다: 펩티드의 일정부분(Aliquots)을 정제된 디펩티딜 아미노펩티다제 IV의 일정부분(aliquot)와 함께 pH 7∼8에서의 적절한 버퍼 (버퍼는 알부민이 없음) 중에서 37℃에서 4∼22 시간 동안 인큐베이션한다. 효소 반응을 트리불루오로아세트산을 첨가하여 종결시키고, 그 펩티드 분해 산물을 분리하여 HPLC 또는 LC-MS 분석을 사용하여 정량한다. 이러한 분석법을 수행하는 한가지 방법은, 그 혼합물을 Zorbax300SB-C18 (30 nm 구멍, 5 μm 입자) 150 x 2.1 mm 칼럼 상에 두고, 유속 0.5 ml/분에서 0.1% 트리플루오로아세트산 중의 아세토니트릴의 선형 구배 (30분 동안 0%∼100% 아세토니트릴)로 용리시키는 것이다. 펩티드 및 이들의 분해 산물은 214 nm (펩티드 결합) 또는 280 nm (방향성 아미노산)에서의 그들의 흡광도에 의하여 모니터될 수 있고, 그들의 피크(peak) 영역의 적분에 의하여 정량된다. 그 분해 패턴은 LC-MS를 사용하여 측정될 수 있고, 여기서 그 분리된 피크의 MS 스펙트라가 측정될 수 있다. 주어진 시간에서의 무손상(intact)/분해 화합물의 백분율이 그 펩티드 DPP-IV 안정성의 평가에 사용된다.
본 발명의 펩티드는, 그것이 주어진 시점에 무손상 화합물의 백분율에 기초하여 GLP-1 (7-37)보다 10배 안정한 경우, DPP-IV 안정화된 것으로 규정된다. 따라서, DPP-IV 안정화된 본 발명의 펩티드는 GLP-1 (7-37) 보다 좋기로는 10배 이상, 더욱 좋기로는 20배 이상 더 안정하다. 안정성은 숙련자에게 알려진 임의의 방법에 의하여, 예컨대 DPP-IV를 테스트될 펩티드의 용액에 첨가하여 예컨대 시간에 대한 그 펩티드의 분해를 예컨대 분광학적 방법, 웨스턴 블롯 분석, 항체 스크리닝 등에 의하여 측정함으로써 평가될 수 있다. 동시에, 본 발명의 펩티드는 예컨대 그 천연 수용체 (GLP-1 수용체)에 결합함으로써 GLP-1 (7-37)의 효과를 발휘하는 화합물로서 정의된다. 좋기로는, 본 발명의 펩티드는 자연적으로 존재하는 GLP-1 펩티드의 결합 친화도의 10% 이상, 좋기로는 50% 이상에 상응하는 GLP-1 수용체에 대한 결합 친화도를 가진다. 그 결합 친화도는 임의의 적합한 방법 (예컨대, 표면 플라즈몬 공명 등)에 의하여 측정될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 펩티드가 세포 내로 신호를 전달하는 그의 세포외 수용체에 대한 결합에 의하여 세포내 cAMP의 형성을 일으키는 경우가 바람직하다.
본 발명의 펩티드는 GLP-1 (7-36) 아미드 및 GLP-1 (7-37)의 생산 방식과 유사한 고상 펩티드 합성 기술을 사용하여 합성적으로 생산될 수 있고, 그 후 역상 HPLC 칼럼에서의 단일 정제 단계 또는 적합한 크로마토그레피 방법에 의하여 실험실 규모로 정제될 수 있다.
그러나, 본 발명의 펩티드를 생산하도록 조작된(engineered) 세포 (미생물 세포 또는 동물 세포주)에서 생성되는 것이 좋다. 본 발명의 펩티드는 예컨대 통상적인 분리 기술을 사용하여 발현되는 세포로부터 분리될 수 있다. 따라서, 세포는 예컨대, 시험관 내에서 지지체(support) 및 영양분을 포함하는 적절한 조건하에서 생장될 수 있고, 분비된 단백질, 즉 본 발명의 펩티드는 그 세포외 배지로부터 회수된다. 따라서, 세포 내로 들어가도록 조작된 서열은 본 발명의 펩티드의 분비를 지시하는 선도(leader) 서열 및 신호 펩티드 서열을 포함하는 것이 좋다. 좋기로는, 그 세포는 내인성으로(endogenously) 또는 조작된 유전자 서열에 의하여 그 선도 서열 및 신호 서열을 절단할 수 있는 프로테아제를 발현한다. 그 대신 본 발명의 펩티드를 코딩하는 조작된 유전자 서열이 그러한 선도 및 신호 펩티드 서열을 포함하지 않는 경우, 세포 내로 발현되는 본 발명의 펩티드는 분비되지 않을 것이고, 세포 용해를 포함하는 공정에 의하여 세포로부터 회수된다. 그러한 방법에서 그 코딩 서열은 배지로부터 그 생성된 펩티드의 효율적은 추출을 가능하게 하는 정제 태그(tags)를 포함할 수 있고, 태그가 절단되어 분리된 본 발명의 펩티드를 방출할 수 있다.
또한, 본 발명은 융합 펩티드 또는 그의 단편, 유사체 또는 변이체인 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 발명의 펩티드를 코딩하는 모든 핵산은 본 발명에 포함된다. 유전자 코드의 축퇴(degeneracy)때문에 다수의 핵산 서열이 본 발명의 펩티드를 코딩할 수 있다. 본 발명의 범위 내의 핵산 분자는 또한 본 발명의 펩티드와, 추가적으로, (기능적) 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 핵산을 함유할 수 있다. 본 발명의 양호한 실시 상태에서, 그러한 핵산 분자는 (a) 전체 GLP-1 aa 서열 (GLP-1 (1-37) 또는 기능적인 GLP-1 (7-35, 36 또는 37) 서열), (b) 임의의 프로테아제에 대한 (a)에 따른 GLP-1 서열의 N-말단에서의 절단 서열 ((b)의 상류(upstream)는 선도 서열을 코딩할 수 있다)을 코딩할 수 있다. 또 다른 양호한 실시 상태에서, (b)를 코딩하는 핵산 서열의 상류에서, 그 핵산 분자는 추가적으로 (c) 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 그 대신에, 본 발명의 핵산 분자는 그 사이에 선도 서열 (b)을 코딩하는 어떠한 서열도 없이 (a)의 상류에 융합된 서열 (c)를 가질 수 있다. 좋기로는, 상기 선도 서열 및 신호 펩티드 서열은 프리프로글루카곤에 대한 이종유래이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 핵산 (분자)과, 본 발명의 핵산 (분자)의 발현을 위한 기타의 기능적 성분을 포함하는 벡터를 제공한다. 일반적으로, 본 발명의 핵산 (분자)는 프로모터 서열에 융합될 것이고, 최후에는 기타의 조절 서열 (예컨대, 인헨서 서열)과 결합될 것이다. 복제를 위하여, 그 플라스미드는 복제 원점을 함유할 수 있다. 본 발명의 벡터로 트랜스펙션된 세포의 선택을 위하여, 1개 이상의 항생제 저항 유전자(들) (예컨대, 카나마이신, 암피실린)이 벡터 내에 제공될 수 있다. 그 벡터는 박테리아 유래 프로모터, 및 항생제 저항 유전자 및 기원(origin) 프로모터, 및 포유류 세포에서의 복제 및 발현을 위한 항생제 저항 유전자를 포함하는 플라스미드일 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 전구체 단백질을 번역하는 것이 가능한 외인성으로 도입된 본 발명의 DNA를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 그 숙주 세포는 원핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포 (예컨대, 포유류 세포) 중 하나일 수 있다.
본 발명의 추가적인 측면에 따르면, 성분 (I) 및 (II) 및 마지막으로 성분 (III)을 포함하는 본 발명의 펩티드의 투여에 의하여 동물, 좋기로는 인간의 치료 방법이 제공된다. 또한, 글루코스 대사와 관련된 질병 또는 상태의 치료 또는 예방을 위한 제품의 생산에 있어서 그러한 본 발명의 펩티드의 상응하는 용도가 제공된다. 글루코스 질환의 비제한적인 예는 제1형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병 (NIDDM), 또는 인슐린 저항성, 체중 이상 및 이와 관련된 질병 또는 상태를 포함하고, 그러한 체중 이상 또는 관련된 상태는 비만, 과체중 관련 상태, 포만 탈조절(satiety deregulation), 혈장 인슐린 수준 감소, 혈중 글루코스 수준 증가 또는 췌장 베타 세포량(cell mass) 감소를 포함한다. 좋기로는, 제2형 당뇨병 (NIDDM)의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 펩티드의 용도가 본 명세서에 함께 개시되어 있다. 따라서, 본 발명은 예컨대 대상체의 체중 감소를 위한, 대상체의 포만 감소를 위한, 대상체의 식후 혈장 인슐린 수준의 증가를 위한, 대상체의 공복(fasting) 혈중 글루코스 수준 감소를 위한, 대상체의 췌장 베타 세포량 증가를 위한 또는 대상체의 제1형 또는 제2형 당뇨병의 치료를 위한 본 발명의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
다른 질병 또는 이상을 가진 환자가 본 발명의 펩티드 (즉, 융합 펩티드 또는 그의 유사체, 단편, 변이체 또는 유도체)에 의하여 치료될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 신경퇴행성 질환 및 질병 또는 그와 관련된 상태의 치료 및 세포자멸사와 관련된 질환 및 질병 또는 상태의 치료를 위한 약제의 제조를 위하여 사용될 수 있다. 이들 질환의 치료를 위한 본 발명의 펩티드의 용도는 고리 AMP 2차 메신저 경로와 결합된 GLP-1 수용체가 설치류 및 인간의 뇌의 전체에 걸쳐 발현된다는 것에 기인한다. 뇌 내의 수용체 분포의 케모아키텍처(chemoarchitecture)는 단지 음식 섭취 및 유해 스트레스에 대한 반응의 조절에 있어서의 GLP-1을 위한 중심 역할만 관련이 있는 것은 아니다. 그것은 GLP-1 수용체에 GLP-1의 결합이 향신경(neurotrophic) 특성을 발휘하고, 글루타메이트 유도 세포자멸사 및 배양된 신경 세포 중의 산화적 손상에 대한 보호를 제공한다는 것을 또한 보여주었다. 더욱이, GLP-1는 세포 배양 중에서 아밀로이드 β-단백질 전구체의 가공(processing)을 변화시키고, 생체 내에서 뇌에서의 아밀로이드 β-펩티드 수준을 용량 의존적으로 감소시킨다는 것이 보여졌다. 따라서, GLP-1은 또한 중추 신경계의 조절자(regulator)로서 알려져 있다. 생리학적으로 활성인 GLP-1의 생물학적 활성을 모방하는 본 발명의 펩티드는, 예컨대 알츠하이머병 (AD) 및 다른 중추 및 말초 신경 퇴행 상태 (예컨대, 근위축성 측삭경화증 (ALS), 알렉산더병, 알퍼병(Alper's disease), 혈관확장성 운동실조증, 카나반병, 코케인 증후군, 크로이츠펠트-야콥병, 다발 경화증, 샌드호프병, 피크병, 척수소뇌성 실조증, 실더병 및 파킨슨병)의 치료에 대한 치료적인 적합성을 가진다.
또한, 생리학적으로 활성인 GLP-1은 다양한 세포에서 항세포자멸사(anti-apoptotic) 작용을 발휘한다는 것이 보여졌는데, 예컨대, GLP-1은 새롭게 분리된 인간 섬(islets) 세포 또는 기타의 세포 종류의 질량(mass) 및 기능의 보존에 유익하다. 그러한 범위에서, 생물학적 활성인 본 발명의 펩티드는 세포 또는 조직의 세포자멸사에 기인한 질환을 치료하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드의 용도는 외인성으로 투여되고, 분리된 본 발명의 펩티드를 포함하는 조성물의 제조를 위한 것일 수 있다. 그 최종 조성물은 또한 전술한 질환의 치료를 위하여 이용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 질환들은 본 발명의 숙주 세포, 핵산 (분자) 또는 벡터에 의하여 또한 치료될 수 있거나, 또는 본 발명의 숙주 세포, 핵산 (분자) 또는 벡터는 이들 질환의 치료용 약제의 제조를 위해 이용될 수 있다.
활성 성분으로서 본 발명의 펩티드 서열을 함유하는 제형의 조제는, 예컨대 미국 특허 4,608,251, 4,601,903, 4,599,231, 4,599,230, 4,596,792 및 4,578,770 (이들 모두는 본 명세서에 참조 통합됨)에서와 같이 일반적으로 당해 기술 분야에 잘 이해되어 있다. 일반적으로, 그러한 제형은 주사제(injectables)로서 또는 액상 용액 또는 현탁액으로서, 좋기로는 물을 함유하는 것 (수성(水性) 제형)으로 조제되거나, 또는 유화된 것(emulsified)일 수 있다. "수성 제형(aqueous formulation)"이라는 용어는 50% w/w 이상의 물을 포함하는 제형으로 정의된다. 이와 유사하게, "수용액(水溶液)"이라는 용어는 50% w/w 이상의 물을 포함하는 용액으로 정의되고, "수성 현탁액(aqueous suspension)"이라는 용어는 50% w/w 이상의 물을 포함하는 현탁액으로 정의된다.
정맥내 주사, 피부 주사 또는 피하 주사 또는 환부(site of affliction) 주사, 활성 성분은 발열원이 없고(pyrogen-free), 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 가진 비경구적으로 허용가능한 수용액의 형태일 것이다. 액상의 약학적 조성물은 일반적으로 액상 운반체 (예컨대, 물)을 포함한다. 좋기로는, 그 액상 운반체는 생리 식염수, 덱스트로스 에탄올 또는 기타의 당 용액 또는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 또는 이들의 조합을 포함할 것이다. 추가적인 예로 기타의 등장 운반체, 예컨대 링거 주사액(Ringer's Injection) 또는 락테이트를 가한 링커 주사액(Lactated Ringer's Injection)이 있다.
본 발명이 본 발명에 따른 화합물의 수용액 및 버퍼를 포함하는 약학 제형에 관한 것인 경우, 여기서 상기 화합물은 0.1 mg/ml 또는 그 이상의 농도로 존재하고, 상기 제형은 pH가 약 2.0 내지 약 10.0, 좋기로는 약 7.0 내지 약 8.5이다. 좋기로는, 상기 제형의 pH는 본 발명에 따른 화합물의 등전점(isoelectric point)으로 부터 적어도 1 pH 단위 이상이고, 더욱 좋기로는 상기 제형의 pH는 본 발명에 따른 화합물의 등전점으로 부터 적어도 2 pH 단위 이상이다.
주사 전에 액체 중의 용액 또는 현탁액으로 적합한 고체형이 또한 조제될 수 있다. 그 약학 제형은 의사 또는 환자가 사용 전에 용매 및/또는 희석제를 첨가하는 동결 건조(freeze-dried) 제형일 수 있다. 바꿔 말하면, 일단 제조된 상기 제형이 대상체(subject)에게 즉시 투여되지 않는다. 오히려, 조제에 이어, 액체 형태 또는 대상체 투여에 적합한 기타의 형태로 추후에 재구성(reconstitution)하기 위한 동결된 상태로 또는 건조 형태로의 보관을 위해 포장된다. 또 다른 실시 상태에서, 상기 약학 제형은 어떠한 사전 용해 없는 즉시 사용을 위한 건조(dried) 제형 (예컨대, 동결 건조 또는 분무 건조(spray-dried))이다. "건조형(dried form)"은 액상 약학 조성물 또는 제형이 동결 건조에 의하여 (즉, 리오필리제이션(lyophilization); 예컨대, Williams and Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38: 48-59 참조) 또는 분무 건조에 의하여 (Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U. K. ), pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18: 1169-1206; 및 Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11: 12-20 참조) 또는 공기 건조(air drying)에 의하여 (Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25: 459-470; 및 Roser (1991) Biopharm. 4: 47-53) 건조되는 것을 의미한다. 액상 약학 제형의 보관 중의 폴리펩티드에 의한 응집 형성(aggregate formation)은 그 폴리펩티드의 생물학적 활성에 역효과를 주어 그 약학 조성물의 치료적 효능의 상실을 가져올 수 있다. 더욱이, 응집 형성은 폴리펩티드 함유 약학 조성물이 주입 장치(infusion system)를 사용하여 투여되는 경우 관류(tubing), 막(membranes) 또는 펌프의 폐색(blockage)과 같은 다른 문제를 야기할 수 있다.
기타의 성분들이 본 발명의 펩티드 약학 제형 중에 존재하는 것이 가능하다. 그러한 추가적인 성분들은 습윤제(wetting agents), 유화제, 항산화제, 충전제(bulking agents), pH 완충제 (예컨대, 포스페이트 또는 시트레이트 또는 말레이트 버퍼), 보존제, 표면활성제, 안정화제, 장성 조절제(tonicity modifiers), 치팅 제제(cheating agents), 금속 이온, 유질 운반체(oleaginous vehicles), 단백질 (예컨대, 인간 혈청 알부민, 젤라틴 또는 단백질) 및/또는 양성이온 (예컨대, 아미노산, 예컨대 베타인, 타우린, 아르기닌, 글리신, 리신 및 히스티딘)을 포함할 수 있다.
본 발명의 제형을 위한 안정화제의 경우, 이들은 좋기로는 고분자량의 중합체 또는 저분자 화합물의 군 중에서 선택될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시 상태에서, 상기 안정화제는 올리에틸렌 글리콜 (예컨대, PEG 3350), 폴리비닐알콜 (PVA), 폴리비닐피롤리돈, 카르복시-히드록시셀룰로스 또는 이들의 유도체 (예컨대, HPC, HPC-SL, HPC-L 및 HPMC), 시클로덱스트린, 모노티오글리세롤, 티오글리콜산 및 2-메틸티오에탄올과 같은 황 함유 물질, 다양한 염 (예컨대, 염화나트륨) 중에서 선택된다. 이들 구체적인 안정화제 각각은 본 발명의 또 다른 실시 상태를 구성한다. 또한, 상기 약학 조성물은 그 중의 약학적 활성 폴리펩티드의 안정성을 더욱 개선시키는 추가적인 안정화제를 포함할 수 있다. 본 발명에 대한 특히 흥미있는 안정화제는 메티오닌 산화에 대해 폴리펩티드를 보호하는 메티오닌 및 EDTA와, 동결-해동 또는 기계적 전단(shearing)과 관련된 응집에 대해 폴리펩티드를 보호하는 비이온성 표면활성제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 제형을 위한 표면활성제(surfactant)의 경우, 이들은 좋기로는 계면활성제(detergent), 에톡시화(ethoxylated) 캐스터 오일, 폴리글리콜화(polyglycolyzed) 글리세리드, 아세틸화(acetylated) 모노글리세리드, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 중합체 (예를 들어, 폴록사머, 예컨대 플루로니(Pluronie) F68, 폴록사머 188 및 407, 트리톤 X-100), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 별모양(starshaped) PEO, 폴리옥시에틸렌 및 폴리에틸렌 유도체, 예컨대 알킬화 및 알콕시화 유도체 (트윈(tweens), 예컨대, Tween-20, Tween-40, Tween-80 및 Brij-35), 폴리옥시에틸렌히드록시스테아레이트, 모노글리세리드 또는 이들의 에톡시화 유도체, 디글리세리드 또는 이들의 폴리옥시에틸렌 유도체, 알콜, 글리세롤, 레시틴 및 포스포리피드 (예컨대, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 이노시톨, 디포스파티딜 글리세롤 및 스핑고미엘린), 포스포리피드의 유도체 (예컨대, 디팔미토일 포스파티딕 에시드) 및 리소포스포리피드 (예컨대, 팔미토일리소포스파티딜-L-세린 및 에탄올아민, 콜린, 세린 또는 트레오닌의 1-아실-sn-글리세로-3-포스페이트 에스테르) 및 리소포스파티딜 및 포스파티딜콜린의 알킬, 알콕실 (알킬 에스테르), 알콕시 (알킬 에테르) 유도체, 예컨대 리소포스파티딜콜린의 라우릴 및 미리스토일 유도체, 디팔미토일포스파티딜콜린, 및 콜린, 에탄올아민, 포스파티딕 에시드, 세린, 트레오닌, 글리세롤, 이노시톨의 극성의 머리 기(polar head group)의 변형체, 및 양전하(positively charged) DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, 리소포스파티딜세린 및 리소포스파티딜트레오닌, 및 글리세로포스포리피드 (예컨대, 세팔린), 글리세로글리코리피드 (예컨대, 갈락토피라노사이드(galactopyransoide)), 스핑고글리코리피드 (예컨대, 세라미드, 강글리오사이드), 도데실포스포콜린, 계란 리소레시틴, 후시딕 에시드 유도체 (예컨대, 소듐 타우로-디히드로후시데이트 등), 장쇄(long-chain) 지방산 및 이들의 C6∼C12 염 (예컨대, 올레산 및 카프릴산), 아실카르니틴 및 유도체, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘의 N'X-아실화 유도체 또는 리신 또는 아르기닌의 측쇄 아실화 유도체 또는 리신, 아르기닌 또는 히스티딘 및 중성 또는 산성 아미노산의 임의의 조합을 포함하는 디펩티드의 N-아실화 유도체, 1개의 중성 아미노산 및 2개의 전하를 띤(charged) 아미노산의 임의의 조합을 포함하는 트리펩티드의 N-아실화 유도체, DSS (도큐세이트 소듐, CAS 등록 번호 [577-11-7]), 도큐세이트 칼슘 (CAS 등록 번호 [128-49-4]), 도큐세이트 포타슘 (CAS 등록 번호 [7491-09-0]), SDS (소튬 도데실 설페이트 또는 소듐 라우릴 설페이트), 소듐 카프릴레이트, 콜산 또는 그의 유도체, 담즙산 및 그의 염 및 글리신 또는 타우린 접합체(conjugates), 우르소데옥시콜산, 콜산나트륨, 데옥시콜산나트륨, 타우로콜산나트륨, 글리코콜산나트륨, N-헥사데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, 음이온성 (알킬-아릴-설포네이트) 단가(monovalent) 표면활성제, 양성이온성 표면활성제 (예컨대, N-알킬-N,N-디메틸암모니오-1-프로판설포네이트, 3-콜아미도-1-프로필디메틸암모니오-1-프로판설포네이트), 양이온성 표면활성제 (4차 암모늄 염기) (예컨대, 브롬화 세틸-트리메틸암모늄, 염화 세틸피리디늄), 비이온성 표면활성제 (예컨대, 도데실-D-글루코피라노사이드), 에틸렌디아민에 산화 프로필렌 및 산화 에틸렌의 순차적 첨가로부터 유도되는 4 관능성(tetrafunctional) 블록 공중합체인 폴록사민 (예컨대, Tetronic's) 중에서 선택될 수 있거나, 또는 이미다졸린 유도체들 또는 이들의 혼합물의 군에서 선택될 수 있다. 이들 구체적인 표면활성제 각각은 본 발명의 또 다른 실시 상태를 구성한다. 약학 조성물 중에 표면활성제의 용도는 숙련자에게 잘 알려져 있다. 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995]이 편의상 참조된다.
약학적으로 허용가능한 보존제의 경우, 이들은 좋기로는 페놀, o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸, 메틸 p-히드록시벤조에이트, 프로필 p-히드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 부틸 p-히드록시벤조에이트, 2-페닐에탄올, 벤질 알콜, 에탄올, 클로로부탄올, 및 티오메로살(thiomerosal), 브로노폴, 벤조산, 이미드우레아, 클로로헥시딘, 소듐 데히드로아세테이트, 클로로크레졸, 에틸 p-히드록시벤조에이트, 벤즈에토늄 클로라이드, 클로르페네신 (3p-클로로페녹시프로판-1,2-디올) 또는 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.
등장제(isotonic agents)의 경우, 이들은 좋기로는 염 (예컨대, 염화나트륨), 당(糖) 또는 당알콜(sugar alcohol), 아미노산 (L-글리신, L-히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소루신, 아스파트산, 트립토판, 트레오닌), 알디톨 (예컨대, 글리세롤 (글리세린), 1,2-프로판디올 (프로필렌글리콜), 1,3-프로판디올, 1,3-부탄디올), 폴리에틸렌글리콜 (예컨대, PEG400), 또는 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다. 프럭토스, 글루코스, 만나스, 소르보스, 자일로스, 말토스, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 덱스트란, 풀루란, 덱스트린, 시클로덱스트린, 가용성(可溶性) 전분, 히드록시에틸 전분 및 카르복시메틸셀룰로스-Na를 포함하는 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 임의의 당 또는 수용성(水溶性) 글루칸이 사용될 수 있다. 한 가지 실시 상태에서, 상기 당 첨가물은 수크로스이다. 당알콜은 1개 이상의 -OH 기를 가지는 C4∼C8 탄수화물로서 정의되고, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락시티톨, 둘시톨, 자일리톨 및 아라비톨을 포함한다. 한 가지 실시 상태에서, 상기 당알콜 첨가물은 만니톨이다. 전술한 당 또는 당알콜은 각각 별개로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 당 또는 당알콜이 액체 조제물에서 용해되고, 본 발명의 방법을 사용하여 달성되는 안정화 효과에 역효과를 주지 않는 한 사용되는 양에 고정된 한계는 없다.
치팅 제제(cheating agents)의 경우, 이들은 좋기로는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 시트르산 및 아스파트산의 염, 및 이들의 혼합물 중에서 선택된다.
버퍼의 경우, 이들은 좋기로는 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 시트레이트, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 리신, 아르기닌, 인산이수소나트륨, 인산수소이나트륨, 인산나트륨, 및 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 헤페스(hepes), 비신(bicine), 트리신(tricine), 말산, 숙시네이트, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 아스파트산 또는 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택된다. 이들 구체적인 버퍼 각각은 본 발명의 또 다른 실시 상태를 구성한다.
본 발명의 치료 펩티드를 함유하는 약학 조성물 중의 전술한 모든 첨가물의 이용은, 특히 이들의 농도 범위와 관련하여, 숙련자에게 잘 알려져 있다. 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995]이 편의상 참조된다.
본 발명의 펩티드를 함유하는 제형은 통상적으로 주사에 의하여 비경구적 (예컨대 피하, 피내 또는 근육내로)으로 투여된다. 본 발명의 펩티드의 비경구 투여용 조성물은, 예컨대 WO 03/002136에 기재되어 있는 바에 따라 제조될 수 있다.
다른 투여 방식에 적합한 또 다른 제형들로는 좌약(suppositories)과, 경우에 따라서, 경구, 협측(buccal), 설하(sublinqual), 복강내, 질내, 항문 및 두개내(intracranial) 투여 제형을 포함한다. 좌약의 경우, 통상적인 결합제(binders) 및 담체(carriers)는 예컨대 폴리알칼렌 글리콜 또는 트리글리세리드를 할 수 있고, 그러한 좌약은 0.5% 내지 10%, 좋기로는 12%의 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 제조될 수 있다. 경구 제형은, 예컨대 의약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카르보네이트 등과 같은 일반적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제(tablet), 환제(pill), 캡슐, 지연 방출 제형 또는 분말의 형태를 취하고, 10∼95%, 좋기로는 25∼70%의 활성 성분을 함유한다.
전술한 바와 같이, 추가적인 약학적 방법 작용의 기간을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 조절된 방출 조제(controlled release preparations)는 본 발명의 펩티드와 복합체를 형성하거나 그를 흡수하는 중합체를 사용하여 얻을 수 있다. 활성 성분 (펩티드)의 조절된 전달은 적합한 거대 분자 (예컨대, 폴리에스테르, 폴리아미노산, 폴리비닐피롤리돈, 에틸렌 비닐아세테이트, 공중합체, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 및 프로타민 설페이트), 그 거대 분자의 농도 및 혼입의 방법의 선택에 의하여 수행될 수 있다. 그러한 내용은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (상기 참조)]에 개시되어 있다. 조절된 방출 조제에 의하여 작용 기간을 조절하기 위한 또 다른 가능한 방법은, 예컨대 폴리에스테르, 폴리아미노산, 히드로겔, 폴리(락트산) 또는 에틸렌 비닐아세테이트 공중합체와 같은 중합체 물질의 입자 속으로 본 발명의 펩티드를 혼입시키는 것이다.
본 발명의 펩티드는 중성 형태 또는 염(salt) 형태로서 조제될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 임의의 다수의 유기 및 무기 염기, 및 유기 및 무기산과 반응하여 (첨가) 염 (예컨대, 그 펩티드의 자유(free) 아미노기와 형성됨)을 형성하기에 충분히 산성이거나 충분히 염기성일 수 있다. 산 첨가 염(acid addtion salts)을 만들기 위해 통상적으로 사용되는 산은 무기산 (예컨대, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 인산 등) 및 유기산 (타르타르산, asp-톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 옥살산, 만델산, p-브로모페닐술폰산, 탄산, 숙신산, 시트르산, 벤조산)이다. 그러한 염의 예에는 황산염, 피로황산염, 중황산염, 아황산염, 중아황산염, 포스페이트, 모노하이드로젠포스페이트, 디하이드로젠포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포르메이트, 이소부티레이트, 카프로에이트, 헵타노에이트, 프로피오레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말레이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥신-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 하디록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 술포네이트, 자일렌술포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 감마-하이드로시부티레이트, 글리코레이트, 타르타레이트, 메탄술포네이트, 프로판술포네이트를 포함한다. 또한, 자유(free) 카르복실기와 형성되는 염은 무기 염기 (예컨대, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화 철) 및 유기 염기 (예컨대, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인) 등으로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 펩티드의 산 첨가 염, 카르복실화 염, 저금(lower) 알킬 에스테르 및 아미드는 WO 91/11457 (1991); EP 0 733 644 (1996); 및 U.S. 5,512,549 (1996)에 기재되어 있는 바에 따라 조제될 수 있다.
본 발명의 펩티드 서열을 함유하는 제형은 투여 제형에 적합한 방식으로 및 치료적으로 유효할 양으로 투여된다. 투여되는 양은, 예컨대 환자의 질병의 중증도를 포함하여, 치료되는 대상체에 의존한다. 적합한 투여량(dosage)의 범위는, 예컨대 치료 용량(dose) 당 수백 마이크로그램의 활성 성분의 방식으로, 좋기로는 약 0.1 μg 내지 2000 μg의 범위 (심지어 1∼10 mg의 더 많은 양도 고려됨), 예컨대, 약 0.5 μg 내지 1000 μg, 좋기로는 1 μg 내지 500 μg 및 특히 약 10 μg 내지 100 μg의 범위이다.
본 발명의 펩티드 및 예컨대 추가적인 부형제 (예컨대, 글리신 및 만니톨) 또는 기타의 첨가물을 함유하는 제형은 바이알(vials)로서 동결 건조된 형태로 시판될 수 있다. 동반(companion) 희석 바이알이 제공되어, 환자가 그 용량의 투여에 앞서 목적하는 농도로 그 제품을 재구성하게 할 수 있다. 또한, 본 발명의 제형은 기타의 잘 알려진 방식 (예컨대, 사전충전형 주사기(prefilled syringes))으로 시판될 수 있다.
본 발명을 다음의 실시예에서 더 설명한다.
실시예
1
유전자 구조물의 제조
도 1a에 표시한 것처럼 Hincll 및 EcoRl 자리를 포함하는 서열에서 GLP-1 (7-37) cDNA에 대한 코딩 서열을 합성적으로 합성하였다. 별도로, 도 1b에 도해된 것처럼 GLP-1 (7-37), IP2 및 Sfol, EcoRl 및 Xbal을 위한 제한효소 자리를 코딩하는 서열을 포함하는 도 1b에 도해된 cDNA를 합성하였다. 분비 경로로 GLP-1을 지시하기 위하여, 스트로멜리신 3 (Acc.No. NM_005940)의 이종유래 신호 서열을 사용하였다. 그에 따라, 스트로멜리신 신호 및 선도 서열을 코딩하는 cDNA를 인간 RNA로부터 역전사효소 PCR로 증폭시키고, 도 1a 또는 도 1b의 구조물과 함께 사용하여 각각 도 1c 및 도 1d에 나타낸 구조물을 만들었다.
도 1a 구조물의 HincII/EcoRI 단편을 도 1d의 SfoI 자리로 클로닝하여 도 1e의 구조물을 만들었다. 이와 유사하게, 도 1d의 EcoRI 단편을 진핵성 발현 플라스미드의 EcoRI 자리로 클로닝하여 도 1f에 나타낸 구조물을 만들었다. 도 1g에 나타 낸 구조물을 만들기 위하여, 도 1b에 나타낸 구조물의 HincII/XbaI 단편을 도 1d에 나타낸 구조물의 SfoI/XbaI 자리에 반복적으로 크로닝하였다. 도 1h는 인간 인간 GLP-1(7-37), IP2 및 GLP-2(1-35)를 코딩하는 서열에 융합된, 짧은 내인성 인트론 서열에 의하여 단속된(interrupted) 스트로멜리신 선도 및 신호 서열을 코딩하는 합성된 코돈 최적화 서열을 나타낸다. 도 1h의 구조물의 DNA 서열은 서열 번호 16이고, 서열 번호 15는 또한 그의 번역된 펩티드 서열을 나타낸다.
도 1i 및 도 1j에 나타낸 서열을 또한 합성하였다. 이들은 도 1j의 NaeI/BssHII 단편을 도 1h의 NaeI/BssHII 선형화(linearised) 서열 속으로 클로닝함으로써 도 1k의 구조물을 만들기 위하여 사용된다. 도 1k의 구조물의 DNA 서열은 서열 번호 14이고, 서열 번호 13은 또한 그의 번역된 펩티드 서열을 나타낸다. 도 1l의 구조물은 BssHII 분해(digest) 및 도 1h의 서열의 재연결(religation)에 의하여 만들어진다. 도 1l의 구조물의 DNA 서열은 서열 번호 18이고, 서열 번호 17은 또한 그의 번역된 펩티드 서열을 나타낸다. 도 1m의 구조물은 도 1i의 서열의 AfeI/BssHII 단편을 도 1h의 AfeI/BssHII 선형화 서열 속으로 클로닝함으로써 만들어진다. 도 1m의 구조물의 DNA 서열은 서열 번호 20이고, 서열 번호 19는 또한 그의 번역된 펩티드 서열을 나타낸다.
전술한 구조물들은 통상적인 기술을 사용하여 당해 기술분야의 숙련자에 의하여 만들어질 수 있다.
실시예
2
트랜스펙션
, 클론 선택 및 포유류 세포의
GLP
-1 발현
세포 출처: HEK293 (인간 배아 신장 세포주, # ACC 305, DSMZ Cell Culture Collection, 독일), AtT20 (마우스 LAF1 뇌하수체 종양 세포주, #87021902, European Cell Culture Collection, 영국), hTERT-MSC 세포가 카셈(Kassem) 교수 (University Hospital of Odense, 덴마크)에 의하여 생성되었다.
106개의 세포의 트랜스펙션을 위하여, 상이한 GLP-1 구조물을 가진 0.5∼2 μg의 플라스미드 DNA를 사용하였다. 실시예 1에서 기재한 바와 같이 그 구조물들을 만들었다. HEK293 세포를 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. 1994ff Harvard Medical School Vol2., Unit 9.1)]에 기재되어 있는 바와 같이 표준 칼슘 포스페이트 공침법(co-precipitation method)에 의하여 트랜스펙션시켰다. AtT20 세포를 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et. al. 1994ff, Harvard Medical School Vol 2., Unit 9.4)]에 기재되어 있는 바와 같이 FuGene (Roche)을 사용하여 트랜스펙션시켰다. hTERT-MSC의 트랜스펙션을 전기적 변수(electrical parameters) 및 세포 종류 특이적 용액(cell-type specific solutions)의 조합에 기초한 비바이러스 방법(non-viral method)인 뉴클레오펙터 기술(Nucleofector technology, Amaxa)을 사용하여 수행하였다. 뉴클레오펙터 장치 (프로그램 C17) 및 뉴클레오펙터 용액 VPE-1001을 사용하여, >60%의 트랜스펙션 효율을 얻었다. 트랜스펙션 48시간 후, 그 배양 배지 내로 선택 시약 블라스티시딘(2 μg/ml)을 첨가하여, 크로모좀 내로 안정적으로 DNA가 통합(integration)된 세포 클론의 선택을 수행하였다. 12∼15일 후, 안정적으로 트랜 스펙션된 세포 클론을 분리하고, 그 특성분석(characterisation)을 위하여 확장시켰다.
hTERT-MSC 및 HEK293 세포에서 상이한 GLP-1 구조물의 일시적 발현을 측정하였다. hTERT-MSC 및 HEK293 세포 양쪽 모두에서, 단량체성 GLP-1 구조물 #103 및 #107 (1개 카피의 GLP-1(7-37)만을 가짐)에서 단지 한계적인(marginal) 활성 GLP-1 수준이 발견될 수 있었고, 반면 이합체성 GLP-1 구조물 #217 (성분 (I)로서 및 성분 (III)으로서 GLP-1(7-37)을 가짐)에서는 엄청난 발현의 획득을 발견할 수 있었다. 결과를 도 2에 요약하였다. GLP-1 구조물 #159 (성분 (II)로서 4개의 IP2 카피를 가짐)에 상기 구조물의 연장(elongation)은 추가적인 유의미한 증가를 가져오지 않았다 (나타내지 않음). 상이한 구조물들을 가진 hTERT-MSC 세포의 트렌스펙션 후, GLP-1을 안정적으로 발현하는 클론을 선택하였다. 그 발현 수준을 표 I에 나타내었다.
실시예
3
포유류 세포로부터 분비된
GLP
-1 펩티드의
웨스턴
블롯
분석
GLP-1 분비 세포로부터의 세포 배양 상청액을 10%∼20% 구배 SDS PAGE (120V, 90분)에서 분리하여, 반건조(semi-dry) 블롯팅 (2.0 mA/cm2, 60분)에 의하여 PVDF 막 (Immobilon-P Membrane 0.45 μm Millipore IPVH 00010)으로 전달시켰다. 메탄올 고정 및 브로킹(blocking) (TBS 중 3% (w:v) BSA, 0.1% (v:v) Tween-20) 후, 그 막을 4℃ o/n에서 1 μg/ml 항GLP-1 항체 (HYB 147-12, Antibody-shop)로 면역블롯팅시켰다. 세척 및 4시간 동안 RT에서 0.02 μg/ml 검출 항체 (항 마우스 IgG, HRP 접합됨, Perkin Elmer PC 2855-1197)와 함께 인큐베이션한 후, 화학발광 검출로 그 단백질의 위치를 나타내었다.
웨스턴 블롯 분석을 도 3에 나타내었다 (1: 모의(mock) 트랜스펙션된 hTERT-MSC 세포의 상청액 중에 용해된 100 ng의 합성 GLP-1(7-37), 2: 구조물 #217로부터의 이합체성 GLP-1를 분비하는 hTERT-MSC 세포 (클론 79TM217/13)의 상청액, 3: 구조물 #217로부터의 이합체성 GLP-1을 분비하는 AtT20 세포 (클론 81-A-217/3)의 상청액, M: 미리 염색된 단백질 마커 [kDa]). 결과는 GLP-1(7-37) 및 C-말단 부가물(appendix)을 함유하는 본 발명의 펩티드 (도 3의 2 및 3)가 트랜스펙션된 세포주로부터 분비되고, GLP-1(7-37)의 중간분자(mid-molecular) 에피토프에 결합하는 항GLP-1 항체를 사용하여 검출될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예
4
인간 세포로부터 분비된
GLP
-1 펩티드의 시험관 내 혈장 안정성
HEK293 및 hTERT-MSC 세포를 다음의 펩티드를 코딩하는 GLP-1 변이체에 연결되어 있는 이종유래 스트로멜리신 신호 서열을 코딩하는 구조물로 일시적으로 트랜스펙션시켰다.
1: GLP-1(7-37)
2: GLP-1(7-37)-IP2-11 AA으로 확장
3: GLP1(7-37)-IP2-GLP1(7-37)
세포로부터 분비된 GLP-1 펩티드 또는 합성 GLP-1(7-37) (Bachem)을 함유하는 세포 배양 상청액을 펩티딜펩티다제 활성을 함유하는 인간 림프구 강화 혈청과 함께 3 또는 4시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션시켰다.
모의 트랜스팩션된 세포로부터의 상청액 중의 합성 GLP-1(7-37)를 DPP-IV 억제제 (#DPP4, Biotrend)의 첨가에 의하여 억제되는 것으로 보여지는 DPP-IV 활성에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. DPP-IV 분해된 불활성 GLP-1(9-37) 펩티드를 구별할 수 있는 GLP-1(7-37)의 N-말단 에피토프에 결합하는 항체를 사용하는 GLP-1 (활성) ELlSA (#EGLP-35K, Biotrend)를 사용하여 활성 GLP를 측정하였다.
그 결과를 도 4 (HEK293 세포) 및 5 (hTERT-MSC 세포)에 나타내었다. HEK293 및 hTERT-MSC 세포는 양쪽 모두 상기 유전자 구조물을 위한 효과적인 숙주이다. 트랜스펙션된 세포의 종류 1 내지 3에 대한 결과에서의 번호는 실시예 3에서와 마찬가지이다 (1: 모의 트랜스펙션된 hTERT-MSC 세포의 상청액 중에 용해된 100 ng의 합성 GLP-1(7-37), 2: 구조물 #217로부터의 이합체성 GLP-1를 분비하는 hTERT-MSC 세포 (클론 79TM217/13)의 상청액, 3: 구조물 #217로부터의 이합체성 GLP-1을 분비하는 AtT20 세포 (클론 81-A-217/3)의 상청액). 구조물 1이 합성 GLP-1과 유사한 방식으로 DPP-IV에 의하여 불활성화되는 야생형 GLP-1을 생산하는 반면, 본 발명의 C-말단 연장된 GLP-1 형태 (도 4의 2 및 3, 도 5의 3)는 분해에 더욱 저항성이며 40% 이상의 활성을 유지하였다. 상기 C-말단 연장된 GLP-1 펩티드는 시험관 내 인간 혈장 내에서 상당히 안정하였다. 이합체성 GLP-1 서열 (3)을 가진 펩티드는 시험관 내 DPP-IV 분해에 대해 거의 완전히 안정하였다.
실시예
5
GLP
-1 펩티드의
웨스턴
블롯
분석
다양한 GLP-1 펩티드를 고체상(solid phase)에 의하여 합성적으로 (syn) 또는 대장균을 사용한 재조합으로 (rec) 생산하였다. GLP-1 펩티드 (31 ng의 서열 번호 1과, 10 ng의 각각 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8)를 10%∼20% 구배 SDS PAGE (120V, 90분)에서 분리하고, 반건조 블롯팅에 의하여 (2.0 mA/cm2, 60 분) PVDF 막 (Immobilon-P Membran 0.45 μm Milli-pore IPVH 00010)으로 전달시켰다. 메탄올 고정 및 블로킹 (TBS 중의 3% (w:v) BSA, 0.1% (v:v) Tween-20) 후에, 그 막을 4℃ o/n에서 1 μg/ml 항-GLP-1 항체 (HYB 147-12, Antibodyshop)으로 면역블롯팅시켰다. 세척 및 4시간 동안 RT에서 0.02 μg/ml 검출 항체 (항 마우스 IgG, HRP 접합됨, Perkin Elmer PC 2855-1197)와 함께 인큐베이션한 후, 화학발광 검출로 그 단백질의 위치를 나타내었다. 도 6에서 표시된 펩티드에 대한 웨스턴 블롯을 나타내었다. 다음의 값이 주어질 수 있다: GLP-1(7-37), 31 aa, 3,3 kD에 상응하는 서열 번호 1 (ID1syn); GLP-1(7-37)-IP2, 46 aa, 5,1 kD에 상응하는 서열 번호 8 (ID8 syn, CM3); GLP-1(7-37)-IP2-RR-GLP2, 83 aa, 9,4 kD에 상응하는 서열 번호 7 (ID7rec, CM2); GLP-1(7-37)-IP2-RR-GLP1(7-37), 79 aa, 8,7 kD에 상응하는 서열 번호 6 (ID6syn, CM1).
실시예
6
GLP
-1
CM
펩티드의 시험관 내 인간 혈장 안정성
합성 GLP-1 펩티드 (서열 번호 1syn, 서열 번호 6syn, 서열 번호 7rec, 서열 번호 8syn)를 37℃ 및 5% CO2에서 3 시간 동안 인간 혈장과 함께 20 ng/ml의 농도로 인큐베이션시켰다. 혈장의 디펩티딜펩티다제 활성은 DPP-IV 억제제 (#DPP4, Biotrend)에 의하여 억제되었다. 활성 GLP를 GLP-1 (활성) ELISA (#EGLP-35K, Biotrend)를 사용하여 측정하였다.
천연(native) GLP-1(7-37) (서열 번호 1)과 대조적으로, 본 발명의 C-말단 신장된 GLP-1 펩티드 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 서열 번호 8은 시험관 내 인간 혈장에서 상당하게 안정하였다 (도 7). 대조군으로서 (오른쪽에) DPP-IV를 첨가한 실험에 대해서 얻어진 결과를 나타내었다. GLP-1 활성은 이들 대조군 실험에서 완전하게 유지되었다.
실시예
7
시험관 내 생물학적 분석(
Bioassay
in
vitro
)
고리 AMP 생산
RIN-5F 세포 (쥐 섬세포종양; ECACC No. 95090402)를 70% 합류(confluence)에 도달하도록 4일 동안 24-웰 플레이트에서 성장시켰다. 세포를 DMEM (E15-009, PAA)으로 2번 세척한 후, 1% HSA (Aventis), 0.2 mM IBMX (858455, Sigma) 및 테스트 펩티드로 보충된 0.5 ml DMEM (E15-009, PAA)을 첨가하였다. 25℃에서 20분간의 인큐베이션 후, 세포를 얼음처럼 찬 PBS로 2번 세척하였다. 세포성 cAMP를 0.5% Triton X-100을 함유한 0.1N HCl의 첨가에 의하여 추출하였다. 고리 AMP를 cAMP (낮은 pH) EIA (Cat. DE0355, R&D)를 사용하여 정량하였다. 자극(stimulation)을 위하여 3*10-8 M의 서열 번호 1, 서열 번호 6syn, 서열 번호 6rec, 서열 번호 7rec, 서열 번호 8syn를 사용하였다.
결과를 도 8에 나타내었다. 100% cAMP 생산은 GLP-1이 없는 경우의 기준 생산에 상응한다. GLP-1은 G 단백질-결합 수용체에 결합하여, cAMP 생산을 자극한다. 테스트된 모든 분자는 세포성 cAMP 생산을 증가시켰다.
실시예
8
생체 내 생물활성(
in
vivo
bioactivity
)
11주 된 제2형 당뇨 마우스 (C57BL/Ks-Leprdb/db, Harlan)를 하루 2번 (9 a.m. 및 5 p.m) 피하 주사에 의하여 5 μg 펩티드로 처리하였다 (그룹당 n=5). 혈중 글루코스를 GLPCM 펩티드로의 처리 전 (0일) 및 후 (2, 4, 7, 10일)에 밤샘 고정(fastening) 기간 후 10 a.m.에 측정하였다. 데이터를 0일에 측정된 혈중 글루코스 수준과 비교하여 나타내었다.
테스트된 모든 본 발명의 펩티드 (서열 번호 6 (합성 또는 재조합) 및 서열 번호 7 (합성 또는 재조합))는 항고당혈증(anti-hyperglycemia) 효과를 가진다. 재조합 서열 번호 6 (CM1) 및 합성 서열 번호 8 (CM3)으로 최선의 결과가 얻어졌다. 도 9 (y 축)에 처리의 상대적 효과를 나타내었다. 0일째에 혈중 글루코스를 1로 설정하였다. 비처리 동물은 시간에 따른 혈중 글루코스 수준의 계속적인 증가를 겪었지만, 본 발명의 펩티드로 처리된 동물은 대략(grosso modo) 시간에 따른 혈중 글루코스의 연속적인 감소를 나타내었다.
실시예
9
GLP1
CM
펩티드의 시험관 내 혈장 안정성의 측정 (
속도론적
(
kinetic
) 테스트 방법)
인큐베이션 버퍼 (50 mM 트리에탄올아민-HCl (pH 7.8), 0.2% HSA) 중에서 CM3, 알라닌 치환된 CM3 유사체 (CM3-ANA01, CM3-ANA02, CM3-ANA03, CM3-ANA04), C-말단 단축된(shortened) CM3 유사체 (CM3-ANA06, CM3-ANA07) 또는 C-말단 신장된(elongated) CM3 유사체 (CM3-ANA09)로부터의 1 μM 펩티드 부분표본(aliquots)을 37℃ 및 5% CO2에서 0, 3, 6 및 9 시간 동안 10% 인간 혈장과 함께 인큐베이션하였다. 디펩티딜펩티다제 활성은 DPP-IV 억제제 (#DPP4, Biotrend)의 첨가로 정지되고, 활성 GLP 수준을 GLP-1 (활성) ELISA (#EGLP-35K, Linco)를 사용하여 측정하였다. 적어도 2번의 독립적인 실험에서 3번의 반복으로부터 결과를 얻었다.
GLP-1의 C-말단에 첨가된 적어도 9개 아미노산을 가지는 본 발명의 펩티드는 CM3 (마우스, GLP-1(7-37)-IP2) 및 성분 (II) (IP2)에서의 변화된 서열을 가지는 그의 유도체, 즉 CM3-ANA01, CM3-ANA01, CM3-ANA02, CM3-ANA03, CM3-ANA04, CM3-ANA05, CM3-ANA07, CM3-ANA07이다. 펩티드 GLP-1 및 CM3-ANA06은 대조군 또는 참조 물질을 나타낸다.
도 10은 0h 값 (0h = 100%)의 %로서 활성 GLP-1의 활성 부분(portion)을 나타낸다. GLP-1은 혈장 노출 9시간 후에 단지 9%만 남아 최저의 혈장 안정성을 가졌다. CM3-ANA01는 9시간 후에 84% 물질이 남아 최상의 안정성 수치를 보여주었다. 본 발명의 펩티드는 9시간 후에 적어도 30%의 잔존물을 가진지만, 더 짧은 신장(extensions)을 가진 펩티드는 이러한 수치에 도달하지 못하였다. 반응 속도론(kinetic)으로부터, 테스트된 물질에 있어서 활성 GLP-1을 0시간의 값의 80%까지 분해시키는데 필요한 시간 (DT80: 80% 분해 시간)을 측정할 수 있다.
본 발명의 물질들은 참조 물질과 비교할 때 상당히 더 긴 시험관 내 혈장 안정성을 보여주었다. 어떠한 이론에 한정되지 않고, GLP-1의 C 말단 신장이 입체 장애를 도입하여 이들 유사체가 DPPIV의 활성 자리에 진입하는 것을 막고 따라서 분해를 회피하는 반면, 더 짧은 참조 물질은 이러한 GLP-1 안정성을 위한 보호 효과를 보이지 않는다. 이러한 가설은 펩티드 CM3-ANA06 (36aa), CM3-ANA07 (40aa) 및 CM3 (46aa)의 누적되는 C 말단 신장에 따라 계속적으로 증가하는 안정성에 의하여 지지된다. 비록 이러한 현상이 아미노산의 순 개수(pure number)에만 의존하는 것이 아니며, CM3의 IP2 영역에서의 알라닌 치환에 의하여서도 나타난다. CM3와 동일한 수의 아미노산을 가지는 CM3-ANA03 펩티드는 CM3와 비교하여 더 강하게 감소된 안정성을 가진다. 반면, 또한 46개 아미노산으로 구성되는 CM3-ANA01는 CM3에 비해 더 높은 혈장 안정성을 가진다. 이러한 것은 아미노산의 개수 이외에 추가적인 입체적 효과가 그 안정성에 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타낼 수 있다. GLP-1의 C-말단에서 IP2를 포함하는 신장 또는 IP2와 어느 정도의 상동성을 가지는 신장을 가지는 펩티드가 특히 바람직한데, 이는 N 말단 영역이 DPPIV의 활성 자리로의 진입하는 것을 막는 특이적 입체형태(conformation)로부터의 결과일 수 있다.
실시예
10
생체 내 연구 - 면역원성(
immunogenicity
)
테스트 물질 CM1의 잠재적인 면역원성을 밝히기 위해, 파라바이오사이언스(Parabioscience; Groningen, Germany)에서 마우스 연구를 수행하였다. 22일에 걸쳐 5번 반복된 주사 (70 μg 펩티드/투여량, i.v.)를 투여받은 BALB/c 마우스 (n=5)로 실험을 수행하였다.
CM1syn은 독성을 도입시키지 않았고, 다음 도면에서 나타낸 바와 같이 단지 최소한의 T세포 항체 반응 및 항체가(antibody titer)를 일으켰다. 부산물 (펩티드의 순도는 단지 95%임)의 면역 효과를 배재 시킬 수 없었다. 도 11은 CM1syn의 잠재적인 면역원성 효과의 평가를 위한 연구를 나타낸다. 왼쪽에서는 (도 11A), T 세포 기억(recall) 반응 분석의 결과를 보여준다. 처리된 마우스 및 대조군 마우스의 지라를 체외이식(explanted)하고, T세포를 분리하고, 항원의 양을 증가시켜 자극하였다. 급증하는(proliferative) 기억 반응을 측정하였다. 오른쪽에서는 (도 11B), 그 동물의 면역 혈청(immune sera) 중의 항원 특이적 IgG 항체가(antibody titer)를 측정하였다.
실시예
11
당뇨 마우스에서의 용량-효율(
dose
-
efficacy
) 연구
2 시간 고정 기간(fastening period) 후, 당뇨 C57BL/KsJ@Rj-db (db/db) 마우스를 5가지의 상이한 농도의 GLP-1, CM1, CM3, CM3-ANA01 및 엑센딘-4로 처리하였다. 6번재 그룹은 식염수만으로 처리하였다. 그룹당 7마리의 동물을 처리하였다. 주사 직전, 1시간 후 및 4시간 후에, 꼬리 채혈(tail bleeds)로부터 혈중 글루코스를 측정하였다.
그 결과를 도 12에서의 용량-반응 곡선으로 나타내었다 (도 10A (GLP-1), 도 12B (CM1), 도 12C (CM3) 및 도 12D (CM3-ANA01)). 각각의 테스트 물질에 대하여, 상이한 농도에 대한 출발 값과 비교한 혈중 글루코스의 백분율의 차이로 그래프를 만들었다. 기준 값과 비교한 백분율 감소로서 1h 측정값으로 용량 반응 곡선을 만듦으로써, 상이한 테스트 물질에 대한 ED50 값을 결정하였다. ED50 값을 측정하기 위하여, GLP-1, CM3-ANA01, CM3rec 및 엑센딘-4에 대해서는 모르간-머서-플로딘(Morgan-Mercer-Flodin; MMF) 모델을 사용하고, CM1에 대해서는 리차드(Richards) 모델을 사용하였다. 그 양쪽 모델 모두 용량 반응 평가에 적합한 S자형 맞춤 모델 (sigmoidal fit models)이다. 각각의 펩티드에 대하여, 혈중 글루코스의 백분율 감소로부터 혈장 글루코스 ED50 값 (μg/마우스로 단일 s.c. 투여)을 측정하였다. 이를 아래 표 1에 요약하였다.
ED50 값으로부터 연역하면, GLP-1 유사체 CM1, CM3 및 CM3-ANA01은 생체 내 생물활성이 20배 이상 더 좋다는 것이 나타나고, 이는 아마 증가된 혈장 안정성의 결과일 것이다.
테스트된 모든 펩티드들은, 적어도 그 최고 농도에 대하여 높은 혈중 글루코스(hyperglycaemic) db/db 마우스에서 혈중 글루코스 수준의 상당한 감소를 이끌었다. 1.1 ∼ 3.0 nmol 펩티드 단일 s.c. 주사 후, 혈장 글루코스의 감소를 (대조군과 대비) 표 2에 요약하여 나타내었다. 표 2는 (대조군에 대한) 테스트 물질의 글루코스 저하 효과를 나타낸다. 혈장 글루코스의 저하 및 상응하는 중요성 수준(corresponding significance levels)이 펩타이드 주사 후 1 시간 (@1h) 및 4 시간 (@4h)의 기간에 대해 주어졌다. 그 펩티드의 장기간 효율에서의 상이점들을 관찰하였다. 단지 엑센딘-4 및 CM3만이 4시간 후 혈중 글루코스 수준의 상당한 감소를 나타내었다.
실시예
12
db
/
db
마우스의 장기간 처리
n=12의 다음의 4개 그룹의 C57BL/KsJ@Rj-db (db/db) 마우스를 연구하였다:
그룹 A 운반체 (0.9% 식염수)로 매일 한번 처리
그룹 B 24 nmol/kg의 테스트 물질 1: CM1rec으로 매일 한번 처리
그룹 C 24 nmol/kg의 테스트 물질 2: CM3 - ANA01으로 매일 한번 처리
그룹 D 24 nmol/kg의 참조 물질 엑센딘 -4 (당해 기술분야에 알려져있고, 승인됨 (그러나, 엑센딘-4는 GLP-1 유사체가 아님))로 매일 한번 처리
펩티드 또는 운반체를 2°°∼ 3°°p.m. 사이에 매일 한번 (그룹 A∼D) 등의 피부 주름에 피하적으로 주어졌다. 18주 동안 상기 처방을 계속하였다. 12주에서 18주까지는, 그룹당 12 마리 동물 중 6 마리에게 하루에 두 번 수행하였다.
마우스의 다양한 변수, 즉, 건강 상태 (1), 체중 (2), 음식 소비 (3), 혈중 글루코스 (4), 글루코스 내성 테스트 (5), 인슐린 데이터 (6), 당화 헤모글로빈 (7), 병리학(pathology) (8) 및 T 세포 재자극(restimulation) (9)을 조사하였다.
건강 상태 (1)는 모든 그룹에서 양호하였고, 처리의 부작용은 발견되지 않았다.
체중 (2)은 모든 처리 그룹에서 처리 18주 후에 저하되었다 (도 13). 상대적인 체중 증가는 CM3-ANA01 그룹에서 상당히 더 낮았다. 도 13A는 db/db 마우스의 체중에 대한 식염수 (A), CM1 (B), CM3-ANA01 (C) 또는 엑센딘 (D)으로의 처리 효과를 보여준다. 그룹당 12 마리 동물의 평균값을 표시하였다. 도 13B는 db/db 마우스의 체중에 대한 식염수 (A), CM1 (B), CM3-ANA01 (C) 또는 엑센딘 (D)으로의 처리 효과를 보여준다. 처리 122일 후의 그룹당 12 마리 동물의 상대적인 체중 증가를 표시하였다. 테스트 물질 CM3-ANA01 (그룹 B)로 처리한 경우만이 상당히 낮은 체중 증가를 나타내었다 (p<0.001).
음식 소비( food comsumption ) (3)는 대조군과 비교하여 CM1 및 CM3-ANA01 그룹에서 상당히 낮았다. 도 14는 122일 처리 기간 동안의 매주 db/db 마우스의 음식 소비에 대하여 식염수 (A), CM1 (B), CM3-ANA01 (C) 또는 엑센딘 (D)으로의 처리 효과를 보여준다. 상대적인 마우스당 음식 소비는 그룹 B 및 C에서 상당히 감소하였다 (p<0.001).
혈중 글루코스 (4) 수준을 다양한 상황에서 측정하였다. 비금식(non-fasted) 혈중 글루코스 수준 (펩티드 주사 1시간 후), 즉, 비금식 혈중 글루코스 수준에 대한 식염수 (A), CM1 (B), CM3-ANA01 (C) 또는 엑센딘 (D)으로의 처리의 효과를 도 15A에 나타내었다. 혈중 글루코스를 식염수 (A) 또는 24 nmol/kg 농도의 펩티드 CM1 (B), CM3-ANA01 (C) 또는 엑센딘 (D)의 s.c. 주사 1시간 후에 꼬리 채혈로부터 측정하였다. 대조군과 비교할 때, s.c. 펩티드 주사 1시간 후의 비금식 혈중 글루코스 수준은 그룹 B에서 55%, 그룹 C에서 51% 및 그룹 D에서 60% 감소하였다 (도 15B). 처리 그룹에서의 혈중 글루코스 감소는 매우 유의적이었다 (p < 0.0001).
금식 혈중 글루코스 수준 (펩티드 주사 18 시간 후), 즉, 금식 혈중 글루코스 수준에 대한 식염수 (A), CM1 (B), CM3-ANA01 (C) 또는 엑센딘 (D)으로의 처리의 효과를 도 15C에 나타내었다. 혈중 글루코스는 12시간 금식 후 혈중 글루코스를 테스트 물질의 s.c. 주사 18시간 후에 꼬리 채혈로부터 측정하였다. 펩티드 주사 18시간 후의 금식 혈중 글루코스 수준은 CM1 및 CM3-ANA01 그룹에서 감소하였다.
i.p. 글루코스 내성 테스트 (5) (IPGTT)를 그룹 A∼D으 마우스에 대한 처리 8주 후에 수행하였다. 12 시간 금식 동물의 기준 혈중 글루코스 값 (0 분)을 꼬리 채혈에 의하여 측정한 다음, 테스트 물질의 s.c. 주사 및 20% 글루코스 용액의 i.p. 주사 (kg당 1 g 글루코스)를 하였다. 혈중 글루코스를 글루코스 주입 15, 30, 45, 60, 90 및 120분 후에 추가적으로 측정하였다. 글루코스 내성의 유의미한 정규화(significant normalization)를 모든 처리 그룹에서 나타내었다 (도 16A). 도 16A에 식염수 (A), CM1 (B), CM3-ANA01 (C) 또는 엑센딘 (D)으로의 처리 8주 후의 i.p. 글루코스 내성 테스트 (IPGTT) 동안의 절대 혈중 글루코스 수준을 나타내었다 (각 그룹 (n=12)의 평균 값).
혈중 글루코스 내성 테스트의 도 16A에 의하여 표시되는 데이터의 또 다른 표현을 도 16B에 나타내었다. 식염수 (A), CM1 (B), CM3-ANA01 (C) 또는 엑센딘 (D)으로의 처리 8주 후의 i.p. 글루코스 내성 테스트 (IPGTT) 동안의 상대적인 혈중 글루코스 수준을 출발 혈중 글루코스 수준 (100%)에 대해 표준화하였다.
인슐린 수준 (6)을 12시간 밤샘 고정(fastening) 기간 후에 마우스로부터 측정하였다. 처리 18주 후에, 처리 그룹의 모든 마우스는 비처리 대조군 보다 상당히 더 많은 인슐린을 생산하였다. 도 17은 0.9% 식염수 (그룹 A), CM1 펩티드 (그룹 B), CM3-ANA01 펩티드 (그룹 C) 또는 엑센딘-4 (그룹 D)로의 처리 18주 후에 마우스에서의 혈청 인슐린 수준에 대한 데이터를 나타낸다. 혈액 샘플을 채취한 후 즉시, 인슐린 분해를 피하기 위하여 프로테아제 억제제 칵테일로 처리하였다. 혈청을 Insulin Mouse Ultrasensitive ELISA (Cat.# EIA-3440, DRG)로 인슐린에 대해 분석하였다. 스튜던트 t-테스트 (Student's t-test)로 유의성을 측정하였다.
당화 ( glycosylated ) 헤모글로빈 (7)은 적혈구 (RBC)에서 헤모글로빈에 결합하는 과량(excess) 혈장 글루코스에 의하여 생성된다. RBC는 120일의 수명을 가지기 때문에, 당화 헤모글로빈의 측정은 글루코스 조절(control)의 장기간의 증거(indication)를 주고, 혈장 글루코스 수준보다 더 좋은 표지(indicator)로 보인다. 안구 후방 굴(retro-orbital sinus)로부터 전체(whole) 혈액을 수집하고, Enzymatic HbA1c Test Kit (#DZ121A, Diazyme)로 분석하여, 당화 헤모글로빈 수준을 측정하였다. 변수로서 당화 헤모글로빈을 사용할 때, 모든 처리 그룹에서 그 증가에서 상당한 감소가 나타났다.
도 18A는 식염수 (A), CM1 (B), CM3-ANA01 (C) 또는 엑센딘 (D)으로의 처리 6, 12 및 18주 후에 전체 혈액 샘플에서 당화 헤모글로빈 (GHb)의 상대적인 증가를 보여준다. 도 18B는 식염수 (A), CM1 (B), CM3-ANA01 (C) 또는 엑센딘 (D)으로의 처리 18주 후에 전체 혈액 샘플에서 당화 헤모글로빈 (GHb)의 상대적인 증가를 보여준다. 그룹당 모든 동물 (n=12)의 평균값을 나타내었다. 모든 처리 그룹의 당화 헤모글로빈 수준의 증가는 대조군 보다 상당히 더 낮았다.
처리된 마우스의 병리학( pathology ) (8) 분석을 수행하였다. 검시(necropsy) 결과 췌장의 부피를 제외하고 비처리 그룹 A와 비교할 때 처리 그룹의 기관에서의 차이는 없다는 것이 나타났다. 췌장 무게를 측정하여, 모든 처리 그룹에서 매우 유의적으로 더 높다는 것이 나타났다. 도 19는 0.9% 식염수 (그룹 A, n=11), CM1 펩티드 (그룹 B, n=12), CM3-ANA01 펩티드 (그룹 C, n=12) 또는 엑센딘-4 (그룹 D, n=12)로의 처리 18주 후에 그 동물들을 희생시킨 날에 측정된 췌장 무게를 나타낸다.
테스트 물질의 잠재적인 면역 효과를 평가하기 위하여, IV 형 면역원성( type IV immunogenicity ) (9)을 T 세포 재자극에 의하여 조사하였다. 따라서, 그룹당 8마리 동물의 비장을 외식(explanted)하고, T 세포를 분리하여, 다양한 농도의 상응하는 테스트 물질로 재자극하였다. 비처리 대조군과 비교하여, 팹티드 재자극된 T세포 증식에서의 유의미한 증가는 없다는 것이 밝혀졌다. 도 20은 상이한 농도의 테스트 물질 CM1 (도 20A) 및 CM3-ANA01 (도 20B) 및 참조 물질 엑센딘-4 (도 20C)에 대한 비장 세포의 시험관내 기억 반응(recall response)을 보여준다. 비방사능 세포 증식 분석 (세포 증식 ELISA, BrdU, 화학발광)을 사용하여, 50 μg/ml로 출발한 테스트 물질 CM1 및 CM3-ANA01과, 참조 물질 엑센딘-4의 3배 희석물에 대한 그룹 A 내지 D의 마우스의 비장 세포의 시험관 내 기억 반응을 각각의 마우스에 대해 3번 반복하여 측정하였다. 자극 지표(stimulation index, SI)를 각각의 펩티드가 존재하는 경우의 반응 및 펩티드가 없는 경우의 반응의 지수(quotient)로서 계산하였다. 각각의 처리 그룹 및 대조군 그룹의 평균값 ± 표준편차를 나타내었다 (그룹 A: n=3, 그룹 B: n=6, 그룹 C: n=7, 그룹 D: n=6). 평균값의 계산을 위하여, 5 μg/ml Con A를 가진 양성 대조군 배양물에서 6.5 초과의 SI를 가진 마우스만을 분석하였다.
당뇨 마우스에서의 장기간 연구는 본 발명의 C-말단 신장된 펩티드의 효능을 더욱 뒷받침하였다. 테스트된 모든 변수 (체중, 음식 소비, 혈중 글루코스 수준, 당화 헤모글로빈, 글루코스 내성, 인슐린 분비, 췌장 무게)에서, C-말단 신장된 펩티드는 상당한 치료적 효과가 있다는 것을 나타내었다. 내인성으로 발생하는 서열을 가진 C-말단 신장된 CellMed 펩티드의 상동성(homology)을 계산할 때, 이들 본 발명의 펩티드는 비포유류성(non-mammalian) 엑센딘-4와 비교하여 면역원성의 측면에서 유리하다는 것이 나타났다. 마우스에서의 면역원성 연구로부터의 데이터는 CM1 펩티드의 어떠한 임상적으로 중요한 면역원성도 없다는 것을 뒷받침한다.
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서열 번호 11
HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GRRDFPEEVA IVEELG
서열 번호 12
1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg
M A P A A W L R S A A A R A
51 ccctgctgcc acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg
L L P P M L L L L L Q P P P L L
101 gcccgggccc tgcccccggt gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg
A R A L P P
151 ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc ccagcggcgt atccggacgc
201 caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc catgtgccgg
251 tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac
301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta
351 ggcctgacca gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct
D V H H L
401 gcacgccgag aggcgcggcc ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca
H A E R R G P Q P W H A A L P S S
451 gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg cccccaggcc tgccagcagc
P A P A P A T Q E A P R P A S S
501 ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg gcctgagcgc
L R P P R C G V P D P S D G L S A
551 tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga
R N R Q K R H A E G T F T S D V S
601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg
S Y L E G Q A A K E F I A W L V
651 aagggcaggg gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga
K G R G R R D F P E E V A I V E E
701 gctgggccgg cgacacgccg agggcacctt cacctccgac gtgagcagct
L G R R H A E G T F T S D V S S Y
751 acctggaggg ccaggccgcc aaggagttca tcgcctggct ggtgaagggc
L E G Q A A K E F I A W L V K G
801 aggggctgag cgcgc
R G *
서열 번호 13
1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc
61 acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt
121 gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc
181 ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc
241 catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac
301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca
361 gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc
421 ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg
481 cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg
541 gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga
601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg
661 gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga gctgggccgg cgacacgccg
721 agggcacctt cacctccgac gtgagcagct acctggaggg ccaggccgcc aaggagttca
781 tcgcctggct ggtgaagggc aggggctgag cgcgc
서열 번호 14
1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg
M A P A A W L R S A A A R A
51 ccctgctgcc acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg
L L P P M L L L L L Q P P P L L
101 gcccgggccc tgcccccggt gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg
A R A L P P
151 ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc ccagcggcgt atccggacgc
201 caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc catgtgccgg
251 tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac
301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta
351 ggcctgacca gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct
D V H H L
401 gcacgccgag aggcgcggcc ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca
H A E R R G P Q P W H A A L P S S
451 gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg cccccaggcc tgccagcagc
P A P A P A T Q E A P R P A S S
501 ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg gcctgagcgc
L R P P R C G V P D P S D G L S A
551 tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga
R N R Q K R H A E G T F T S D V S
601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg
S Y L E G Q A A K E F I A W L V
651 aagggcaggg gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga
K G R G R R D F P E E V A I V E E
701 gctgggccgg cgacacgccg acggcagctt cagcgacgag atgaacacca
L G R R H A D G S F S D E M N T I
751 tcctggacaa cctggccgcg cgcgacttca tcaactggct gatccagacc
L D N L A A R D F I N W L I Q T
801 aagatcaccg atcggaagtg agcgcgctga tatc
K I T D R K *
서열 번호 15
1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc
61 acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt
121 gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc
181 ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc
241 catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac
301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca
361 gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc
421 ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg
481 cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg
541 gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga
601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg
661 gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga gctgggccgg cgacacgccg
721 acggcagctt cagcgacgag atgaacacca tcctggacaa cctggccgcg cgcgacttca
781 tcaactggct gatccagacc aagatcaccg atcggaagtg agcgcgctga tatc
서열 번호 16
1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg
M A P A A W L R S A A A R A
51 ccctgctgcc acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg
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101 gcccgggccc tgcccccggt gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg
A R A L P P
151 ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc ccagcggcgt atccggacgc
201 caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc catgtgccgg
251 tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac
301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta
351 ggcctgacca gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct
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401 gcacgccgag aggcgcggcc ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca
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서열 번호 17
1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc
61 acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt
121 gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc
181 ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc
241 catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac
301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca
361 gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc
421 ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg
481 cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg
541 gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga
601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg
721 acggcagctt cagcgacgag atgaacacca tcctggacaa cctggccgcg cgctgatatc
서열 번호 18
1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg
M A P A A W L R S A A A R A
51 ccctgctgcc acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg
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101 gcccgggccc tgcccccggt gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg
A R A L P P
151 ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc ccagcggcgt atccggacgc
201 caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc catgtgccgg
251 tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac
301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta
351 ggcctgacca gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct
D V H H L
401 gcacgccgag aggcgcggcc ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca
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451 gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg cccccaggcc tgccagcagc
P A P A P A T Q E A P R P A S S
501 ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg gcctgagcgc
L R P P R C G V P D P S D G L S A
551 tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga
R N R Q K R H A E G T F T S D V S
601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg
S Y L E G Q A A K E F I A W L V
651 aagggcaggg gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga
K G R G R R D F P E E V A I V E E
701 gctgggctga gcgcgc
L G *
서열 번호 19
1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc
61 acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt
121 gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc
181 ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc
241 catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac
301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca
361 gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc
421 ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg
481 cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg
541 gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga
601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg
661 gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga gctgggctga gcgcgc
서열 번호 20
HGEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR G
서열 번호 21
RRDFPEEVAI
서열 번호 22
RRDFPEEVAI VEEL
서열 번호 23
RRDFPEEVAI AEEL
서열 번호 24
Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala
서열 번호 25
Ala Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile
서열 번호 26
Ala Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu
서열 번호 27
Ala Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu
서열 번호 28
Ala Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly
서열 번호 29
Ala Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly
서열 번호 30
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ala
Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly
서열 번호 31
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
Arg Asp Phe Ala Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly
서열 번호 32
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
Arg Asp Ala Ala Ala Ala Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly
서열 번호 33
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ala
Ala Asp Ala Ala Ala Ala Val Ala Ile Ala Ala Ala Leu Gly
서열 번호 34
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
Arg Asp Phe Pro
서열 번호 35
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala
서열 번호 36
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly Arg Arg
His Ala Cys
서열 번호 37
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ala
Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly
서열 번호 38
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
Arg Asp Phe Ala Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly
서열 번호 39
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
Arg Asp Ala Ala Ala Ala Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly
서열 번호 40
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ala
Ala Asp Ala Ala Ala Ala Val Ala Ile Val Ala Ala Leu Gly
서열 번호 41
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly Arg Arg
His Ala Cys
서열 번호 42
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa
서열 번호 43 (식 (I))
Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa
Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
서열 번호 44 (식 (
II
))
Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Xaa Tyr Leu Glu Xaa
Xaa Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Xaa Trp Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa
서열 번호 45 (식 (
III
))
SEQUENCE LISTING
<110> Biocompatibles UK Limited
<120> GLP-1 fusion peptides, their production and use
<130> BI07P001WO
<140>
<141>
<150> EP050207.18.2
<151> 2005-09-22
<160> 45
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: synthetic peptide corresponding to
GLP-1(7-37) (see description p. 36)
<400> 1
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: full-length IP-2 sequence having all 15
amino acids of the naturally occurring IP-2 sequence, human;
(see description p. 36)
<400> 2
Arg Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly
1 5 10 15
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: full-length IP-2 sequence having all 15
amino acids of the naturally occurring IP-2 sequence, murine;
(see description p. 36)
<400> 3
Arg Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly
1 5 10 15
<210> 4
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: murine isoform of GLP-2
(see description p. 36)
<400> 4
His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Arg Lys
35
<210> 5
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: human isoform of GLP-2
(see description p. 36)
<400> 5
His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Ser Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Thr Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Lys Lys
35
<210> 6
<211> 79
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: SEQ ID No: 6 (ID6syn, CM1) corresponds
to GLP-1(7-37)-IP2-RR-GLP1(7-37), 79 aa, 8,7 kD
(see description p. 36)
<400> 6
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
20 25 30
Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly Arg Arg
35 40 45
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
50 55 60
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
65 70 75
<210> 7
<211> 83
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: SEQ ID No: 7 (ID7rec, CM2) corresponds
to GLP-1(7-37)-IP2-RR-GLP2, 83 aa, 9,4 kD
(see description p. 36)
<400> 7
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
20 25 30
Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly Arg Arg
35 40 45
His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Ser Thr Ile Leu Asp Asn
50 55 60
Leu Ala Thr Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
65 70 75 80
Asp Lys Lys
<210> 8
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: SEQ ID No:8 (ID8 syn, CM3) corresponds
to GLP-1(7-37)-IP2, 46 aa, 5,1 kD;
<400> 8
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
20 25 30
Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly
35 40 45
<210> 9
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: artificial
<400> 9
Met Ala Pro Ala Ala Trp Leu Arg Ser Ala Ala Ala Arg Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Met Leu Leu Leu Leu Leu Gln Pro Pro Pro Leu Leu Ala Arg
20 25 30
Ala Leu Pro Pro Asp Val His His Leu His Ala Glu Arg Arg Gly Pro
35 40 45
Gln Pro Trp His Ala Ala Leu Pro Ser Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala
50 55 60
Thr Gln Glu Ala Pro Arg Pro Ala Ser Ser Leu Arg Pro Pro Arg Cys
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Pro Ser Asp Gly Leu Ser Ala Arg Asn Arg Gln Lys
85 90 95
Arg
<210> 10
<211> 79
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: SEQ ID No: 10
(N-GLP-1(7-37)-IP2(human)-RR-GLP-1(7-37)-C, also designated human
CM1), (see description p. 36)
<400> 10
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
20 25 30
Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly Arg Arg
35 40 45
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
50 55 60
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
65 70 75
<210> 11
<211> 83
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: SEQ ID No: 11
(N-GLP-1(7-37)-IP2(human)-RR-GLP-2-C), also designated human CM2
herein), (see description p. 36)
<400> 11
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
20 25 30
Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly Arg Arg
35 40 45
His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
50 55 60
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
65 70 75 80
Asp Arg Lys
<210> 12
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: SEQ ID No: 12, GLP-1(7-37) linked
without any linker sequence via its C-terminus to human IP2
(see description p. 36)
<400> 12
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
20 25 30
Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly
35 40 45
<210> 13
<211> 815
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: (SEQ ID No:13) represents the
translated peptide sequence of the construct according to Fig. 1k
(SEQ ID No: 14), (see description p. 37);
<220>
<221> CDS
<222> (11)..(118)
<220>
<221> CDS
<222> (387)..(809)
<400> 13
gatatccacc atg gcc ccc gcc gcc tgg ctg agg agc gcc gcc gcc agg 49
Met Ala Pro Ala Ala Trp Leu Arg Ser Ala Ala Ala Arg
1 5 10
gcc ctg ctg cca ccc atg ctg ctg ctg ctg ctg cag ccc cca cct ctg 97
Ala Leu Leu Pro Pro Met Leu Leu Leu Leu Leu Gln Pro Pro Pro Leu
15 20 25
ctg gcc cgg gcc ctg ccc ccg gtgagtgccc gccactcgcc gtccgctcct 148
Leu Ala Arg Ala Leu Pro Pro
30 35
cgctgagggg gcgccgggca cgcgggctgg gcccagcggc gtatccggac gccaagaaac 208
cagagagcca gccagatgcc aaagggccct gccatgtgcc ggtgcccttt ccctctccat 268
ttgccctgcc acacagtggg ctggggttgc acgtgtgttt gctgacaggc cacatctcta 328
actgtgggcc atgtggacct taggcctgac cagaccctca tgtcttcctc cttcccag 386
gac gtg cac cac ctg cac gcc gag agg cgc ggc cct cag ccc tgg cac 434
Asp Val His His Leu His Ala Glu Arg Arg Gly Pro Gln Pro Trp His
40 45 50
gcc gcc ctg cca agc agc cct gcc cct gcc cca gcc acc cag gag gcc 482
Ala Ala Leu Pro Ser Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala Thr Gln Glu Ala
55 60 65
ccc agg cct gcc agc agc ctg agg cca ccc agg tgc ggc gtg cct gat 530
Pro Arg Pro Ala Ser Ser Leu Arg Pro Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp
70 75 80
ccc tcc gat ggc ctg agc gct cgg aat cgg cag aag agg cac gcc gag 578
Pro Ser Asp Gly Leu Ser Ala Arg Asn Arg Gln Lys Arg His Ala Glu
85 90 95 100
ggc acc ttc acc tcc gac gtg agc agc tac ctg gag ggc cag gcc gcc 626
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
105 110 115
aag gag ttc atc gcc tgg ctg gtg aag ggc agg ggc cgc agg gac ttc 674
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg Arg Asp Phe
120 125 130
cct gag gag gtg gcc atc gtg gag gag ctg ggc cgg cga cac gcc gag 722
Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly Arg Arg His Ala Glu
135 140 145
ggc acc ttc acc tcc gac gtg agc agc tac ctg gag ggc cag gcc gcc 770
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
150 155 160
aag gag ttc atc gcc tgg ctg gtg aag ggc agg ggc tga gcgcgc 815
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
165 170 175
<210> 14
<211> 815
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: DNA sequence of the construct according
to Fig. 1k, (see description p. 37);
<400> 14
gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc 60
acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt 120
gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc 180
ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc 240
catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac 300
gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca 360
gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc 420
ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg 480
cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg 540
gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga 600
gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg 660
gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga gctgggccgg cgacacgccg 720
agggcacctt cacctccgac gtgagcagct acctggaggg ccaggccgcc aaggagttca 780
tcgcctggct ggtgaagggc aggggctgag cgcgc 815
<210> 15
<211> 834
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: DNA sequence and sequence of the
translated peptide according to the construct Fig. 1h, (see
description p. 38);
<220>
<221> CDS
<222> (11)..(118)
<220>
<221> CDS
<222> (387)..(821)
<400> 15
gatatccacc atg gcc ccc gcc gcc tgg ctg agg agc gcc gcc gcc agg 49
Met Ala Pro Ala Ala Trp Leu Arg Ser Ala Ala Ala Arg
1 5 10
gcc ctg ctg cca ccc atg ctg ctg ctg ctg ctg cag ccc cca cct ctg 97
Ala Leu Leu Pro Pro Met Leu Leu Leu Leu Leu Gln Pro Pro Pro Leu
15 20 25
ctg gcc cgg gcc ctg ccc ccg gtgagtgccc gccactcgcc gtccgctcct 148
Leu Ala Arg Ala Leu Pro Pro
30 35
cgctgagggg gcgccgggca cgcgggctgg gcccagcggc gtatccggac gccaagaaac 208
cagagagcca gccagatgcc aaagggccct gccatgtgcc ggtgcccttt ccctctccat 268
ttgccctgcc acacagtggg ctggggttgc acgtgtgttt gctgacaggc cacatctcta 328
actgtgggcc atgtggacct taggcctgac cagaccctca tgtcttcctc cttcccag 386
gac gtg cac cac ctg cac gcc gag agg cgc ggc cct cag ccc tgg cac 434
Asp Val His His Leu His Ala Glu Arg Arg Gly Pro Gln Pro Trp His
40 45 50
gcc gcc ctg cca agc agc cct gcc cct gcc cca gcc acc cag gag gcc 482
Ala Ala Leu Pro Ser Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala Thr Gln Glu Ala
55 60 65
ccc agg cct gcc agc agc ctg agg cca ccc agg tgc ggc gtg cct gat 530
Pro Arg Pro Ala Ser Ser Leu Arg Pro Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp
70 75 80
ccc tcc gat ggc ctg agc gct cgg aat cgg cag aag agg cac gcc gag 578
Pro Ser Asp Gly Leu Ser Ala Arg Asn Arg Gln Lys Arg His Ala Glu
85 90 95 100
ggc acc ttc acc tcc gac gtg agc agc tac ctg gag ggc cag gcc gcc 626
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
105 110 115
aag gag ttc atc gcc tgg ctg gtg aag ggc agg ggc cgc agg gac ttc 674
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg Arg Asp Phe
120 125 130
cct gag gag gtg gcc atc gtg gag gag ctg ggc cgg cga cac gcc gac 722
Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly Arg Arg His Ala Asp
135 140 145
ggc agc ttc agc gac gag atg aac acc atc ctg gac aac ctg gcc gcg 770
Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn Leu Ala Ala
150 155 160
cgc gac ttc atc aac tgg ctg atc cag acc aag atc acc gat cgg aag 818
Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr Asp Arg Lys
165 170 175 180
tga gcgcgctgat atc 834
<210> 16
<211> 834
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: DNA sequence of the construct according
to Fig. 1h, (see description p. 38);
<400> 16
gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc 60
acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt 120
gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc 180
ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc 240
catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac 300
gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca 360
gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc 420
ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg 480
cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg 540
gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga 600
gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg 660
gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga gctgggccgg cgacacgccg 720
acggcagctt cagcgacgag atgaacacca tcctggacaa cctggccgcg cgcgacttca 780
tcaactggct gatccagacc aagatcaccg atcggaagtg agcgcgctga tatc 834
<210> 17
<211> 780
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: DNA sequence sequence and translated
peptide sequence of the construct according to Fig. 1l,
(see description p. 35, 38);
<220>
<221> CDS
<222> (11)..(118)
<220>
<221> CDS
<222> (387)..(776)
<400> 17
gatatccacc atg gcc ccc gcc gcc tgg ctg agg agc gcc gcc gcc agg 49
Met Ala Pro Ala Ala Trp Leu Arg Ser Ala Ala Ala Arg
1 5 10
gcc ctg ctg cca ccc atg ctg ctg ctg ctg ctg cag ccc cca cct ctg 97
Ala Leu Leu Pro Pro Met Leu Leu Leu Leu Leu Gln Pro Pro Pro Leu
15 20 25
ctg gcc cgg gcc ctg ccc ccg gtgagtgccc gccactcgcc gtccgctcct 148
Leu Ala Arg Ala Leu Pro Pro
30 35
cgctgagggg gcgccgggca cgcgggctgg gcccagcggc gtatccggac gccaagaaac 208
cagagagcca gccagatgcc aaagggccct gccatgtgcc ggtgcccttt ccctctccat 268
ttgccctgcc acacagtggg ctggggttgc acgtgtgttt gctgacaggc cacatctcta 328
actgtgggcc atgtggacct taggcctgac cagaccctca tgtcttcctc cttcccag 386
gac gtg cac cac ctg cac gcc gag agg cgc ggc cct cag ccc tgg cac 434
Asp Val His His Leu His Ala Glu Arg Arg Gly Pro Gln Pro Trp His
40 45 50
gcc gcc ctg cca agc agc cct gcc cct gcc cca gcc acc cag gag gcc 482
Ala Ala Leu Pro Ser Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala Thr Gln Glu Ala
55 60 65
ccc agg cct gcc agc agc ctg agg cca ccc agg tgc ggc gtg cct gat 530
Pro Arg Pro Ala Ser Ser Leu Arg Pro Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp
70 75 80
ccc tcc gat ggc ctg agc gct cgg aat cgg cag aag agg cac gcc gag 578
Pro Ser Asp Gly Leu Ser Ala Arg Asn Arg Gln Lys Arg His Ala Glu
85 90 95 100
ggc acc ttc acc tcc gac gtg agc agc tac ctg gag ggc cag gcc gcc 626
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
105 110 115
aag gag ttc atc gcc tgg ctg gtg aag ggc agg ggc cgc agg gac ttc 674
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg Arg Asp Phe
120 125 130
cct gag gag gtg gcc atc gtg gag gag ctg ggc cgg cga cac gcc gac 722
Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly Arg Arg His Ala Asp
135 140 145
ggc agc ttc agc gac gag atg aac acc atc ctg gac aac ctg gcc gcg 770
Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn Leu Ala Ala
150 155 160
cgc tga tatc 780
Arg
165
<210> 18
<211> 720
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: DNA sequence of the construct according
to Fig. 1l, (see description p. 39);
<400> 18
gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc 60
acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt 120
gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc 180
ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc 240
catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac 300
gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca 360
gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc 420
ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg 480
cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg 540
gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga 600
gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg 660
acggcagctt cagcgacgag atgaacacca tcctggacaa cctggccgcg cgctgatatc 720
<210> 19
<211> 716
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: DNA sequence and sequence of the
translated peptide according to Fig. 1m., (see description p.
39, 40);
<220>
<221> CDS
<222> (11)..(118)
<220>
<221> CDS
<222> (387)..(710)
<400> 19
gatatccacc atg gcc ccc gcc gcc tgg ctg agg agc gcc gcc gcc agg 49
Met Ala Pro Ala Ala Trp Leu Arg Ser Ala Ala Ala Arg
1 5 10
gcc ctg ctg cca ccc atg ctg ctg ctg ctg ctg cag ccc cca cct ctg 97
Ala Leu Leu Pro Pro Met Leu Leu Leu Leu Leu Gln Pro Pro Pro Leu
15 20 25
ctg gcc cgg gcc ctg ccc ccg gtgagtgccc gccactcgcc gtccgctcct 148
Leu Ala Arg Ala Leu Pro Pro
30 35
cgctgagggg gcgccgggca cgcgggctgg gcccagcggc gtatccggac gccaagaaac 208
cagagagcca gccagatgcc aaagggccct gccatgtgcc ggtgcccttt ccctctccat 268
ttgccctgcc acacagtggg ctggggttgc acgtgtgttt gctgacaggc cacatctcta 328
actgtgggcc atgtggacct taggcctgac cagaccctca tgtcttcctc cttcccag 386
gac gtg cac cac ctg cac gcc gag agg cgc ggc cct cag ccc tgg cac 434
Asp Val His His Leu His Ala Glu Arg Arg Gly Pro Gln Pro Trp His
40 45 50
gcc gcc ctg cca agc agc cct gcc cct gcc cca gcc acc cag gag gcc 482
Ala Ala Leu Pro Ser Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala Thr Gln Glu Ala
55 60 65
ccc agg cct gcc agc agc ctg agg cca ccc agg tgc ggc gtg cct gat 530
Pro Arg Pro Ala Ser Ser Leu Arg Pro Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp
70 75 80
ccc tcc gat ggc ctg agc gct cgg aat cgg cag aag agg cac gcc gag 578
Pro Ser Asp Gly Leu Ser Ala Arg Asn Arg Gln Lys Arg His Ala Glu
85 90 95 100
ggc acc ttc acc tcc gac gtg agc agc tac ctg gag ggc cag gcc gcc 626
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala
105 110 115
aag gag ttc atc gcc tgg ctg gtg aag ggc agg ggc cgc agg gac ttc 674
Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg Arg Asp Phe
120 125 130
cct gag gag gtg gcc atc gtg gag gag ctg ggc tga gcgcgc 716
Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly
135 140
<210> 20
<211> 716
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: DNA sequence of the construct
according to Fig. 1m, (see description p. 40);
<400> 20
gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc 60
acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt 120
gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc 180
ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc 240
catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac 300
gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca 360
gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc 420
ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg 480
cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg 540
gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga 600
gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg 660
gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga gctgggctga gcgcgc 716
<210> 21
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: artificial, (see description p. 40);
<400> 21
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: artificial, (see description p. 40);
<400> 22
Arg Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile
1 5 10
<210> 23
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: artificial, (see description p. 40);
<400> 23
Arg Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu
1 5 10
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: artificial, (see description p. 40);
<400> 24
Arg Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu
1 5 10
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: partial sequence derived from IP2
<400> 25
Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala
1 5
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: sequence derived from SEQ ID NO: 22,
wherein the first two alanines have been replaced by two
arginines
<400> 26
Ala Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile
1 5 10
<210> 27
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: sequence derived from SEQ ID NO: 23,
wherein the first two alanines have been replaced by two
arginines
<400> 27
Ala Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu
1 5 10
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: sequence derived from SEQ ID NO: 24,
wherein the first two alanines have been replaced by two
arginines
<400> 28
Ala Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu
1 5 10
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: sequence derived from SEQ ID NO: 2,
wherein the first two arginines have been replaced by two
alanines
<400> 29
Ala Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly
1 5 10 15
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: sequence derived from SEQ ID NO: 3,
wherein the first two arginines have been replaced by two
alanines
<400> 30
Ala Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly
1 5 10 15
<210> 31
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: sequence derived from GLP-1-IP2-fragment
(murine)
<400> 31
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ala
20 25 30
Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly
35 40 45
<210> 32
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: sequence derived from GLP-1-IP2-fragment
(murine)
<400> 32
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
20 25 30
Arg Asp Phe Ala Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly
35 40 45
<210> 33
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: sequence derived from GLP-1-IP2-fragment
(murine)
<400> 33
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
20 25 30
Arg Asp Ala Ala Ala Ala Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly
35 40 45
<210> 34
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: sequence derived from GLP-1-IP2-fragment
(murine)
<400> 34
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ala
20 25 30
Ala Asp Ala Ala Ala Ala Val Ala Ile Ala Ala Ala Leu Gly
35 40 45
<210> 35
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: sequence derived from GLP-1-IP2-fragment
(murine)
<400> 35
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
20 25 30
Arg Asp Phe Pro
35
<210> 36
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: sequence derived from GLP-1-IP2-fragment
(murine)
<400> 36
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
20 25 30
Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala
35 40
<210> 37
<211> 51
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: sequence derived from GLP-1-IP2-fragment
(murine)
<400> 37
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
20 25 30
Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly Arg Arg
35 40 45
His Ala Cys
50
<210> 38
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: sequence derived from GLP-1-IP2-fragment
(human)
<400> 38
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ala
20 25 30
Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly
35 40 45
<210> 39
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: sequence derived from GLP-1-IP2-fragment
(human)
<400> 39
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
20 25 30
Arg Asp Phe Ala Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly
35 40 45
<210> 40
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: sequence derived from GLP-1-IP2-fragment
(human)
<400> 40
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
20 25 30
Arg Asp Ala Ala Ala Ala Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly
35 40 45
<210> 41
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: sequence derived from GLP-1-IP2-fragment
(human)
<400> 41
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ala
20 25 30
Ala Asp Ala Ala Ala Ala Val Ala Ile Val Ala Ala Leu Gly
35 40 45
<210> 42
<211> 51
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: sequence derived from GLP-1-IP2-fragment
(human)
<400> 42
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
20 25 30
Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly Arg Arg
35 40 45
His Ala Cys
50
<210> 43
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: sequence according to formula (I)
(see description, p. 1)
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Xaa = NH2, when sequence is GLP-1(7-36) amide, or Xaa = Gly-OH,
when sequence is GLP-1(7-37) amide,
<400> 43
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa
20 25 30
<210> 44
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: sequence according to formula (II)
(see description, p. 13)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is L-histidine, D-histidine, desamino-histidine,
2-amino-histidine, 3-hydroxy-histidine, homohistidine,
N-acetyl-histidine, a-fluoromethyl-histidine, a-methyl-histidine,
3-pyridylalanine, 2-pyridylalanine or 4-pyridylalanine;
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, or Aib;
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is alternatively (1-aminocyclopropyl) carboxylic acid, (1-
aminocyclobutyl) carboxylic acid, (1-aminocyclopentyl) carboxylic
acid, (1-aminocyclohexyl) carboxylic acid, (1-aminocycloheptyl)
carboxylic acid, or (1-aminocyclooctyl) carboxylic acid,
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa is Val or Leu; Xaa is is Ser, Lys or Arg;
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa is Ser, Lys or Arg;
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa is Tyr or Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa is Leu or Met;
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa is Gly, Glu or Aib;
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa is Gln, Glu, Lys or Arg ;
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa is Ala or Val ;
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Xaa is Lys, Glu or Arg;
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> Xaa is Glu or Leu;
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> Xaa is Ala, Glu or Arg;
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> Xaa is Val or Lys;
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> Xaa is Lys, Glu, Asn or Arg;
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa is Gly or Aib;
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Xaa is Arg, Gly or Lys or amide or absent;
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Xaa is Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, amide or is absent;
<400> 44
Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa
1 5 10 15
Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
<210> 45
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of sequence: sequence according to formula (III)
(see description, p. 13)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is L-histidine, D-histidine, desamino-histidine,
2-amino-histidine, -hydroxy-histidine, homohistidine,
N-acetyl-histidine, a-fluoromethyl-histidine, a-methyl-histidine,
3-pyridylalanine, 2-pyridylalanine or 4-pyridylalanine;
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys or Aib;
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is alternatively (1-aminocyclopropyl) carboxylic acid, (1-
aminocyclobutyl) carboxylic acid, (1-aminocyclopentyl) carboxylic
acid, (1-aminocyclohexyl) carboxylic acid, (1-aminocycloheptyl)
carboxylic acid, or (1-aminocyclooctyl) carboxylic acid;
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa is Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys or Aib;
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa is alternatively (1-aminocyclopropyl) carboxylic acid, (1-
aminocyclobutyl) carboxylic acid, (1-aminocyclopentyl) carboxylic
acid, (1-aminocyclohexyl) carboxylic acid, (1-aminocycloheptyl)
carboxylic acid, or (1-aminocyclooctyl) carboxylic acid;
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa is Gly, Glu or Aib;
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa is Gln, Glu, Lys or Arg;
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Xaa is Lys, Glu or Arg;
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> Xaa is Ala, Glu or Arg;
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> Xaa is Lys, Glu or Arg;
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa is Gly or Aib;
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Xaa is Arg or Lys, amide or is absent;
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Xaa is Gly, Ala, Glu or Lys, amide or is absent,
<400> 45
Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Xaa Tyr Leu Glu Xaa
1 5 10 15
Xaa Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Xaa Trp Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Claims (37)
- 성분 (I)로서 N-말단에 식 II 또는 식 III에 따른 서열과, 성분 (II)로서 C-말단에 9개 이상의 아미노산의 펩티드 서열 또는 그의 기능적 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 융합 펩티드,Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa3o-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37 (식 II)여기서, Xaa7은 L-히스티딘, D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, 3-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, N-아세틸-히스티딘, a-플루오로메틸-히스티딘, a-메틸-히스티딘, 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌 또는 4-피리딜알라닌이고; Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, (1-아미노시클로프로필) 카르복실산, (1-아미노시클로부틸) 카르복실산, (1-아미노시클로펜틸) 카르복실산, (1-아미노시클로헥실) 카르복실산, (1-아미노시클로헵틸) 카르복실산 또는 (1-아미노시클로옥틸) 카르복실산이고, Gly에 의한 것이 특히 양호하며; Xaa16은 Val 또는 Leu이고; Xaa는 Ser, Lys 또는 Arg이고; Xaa19는 Tyr 또는 Gln이며; Xaa20은 Leu 또는 Met이고; Xaa22는 Gly, Glu 또는 Aib이며; Xaa23은 Gln, Glu, Lys 또는 Arg이고; Xaa25는 Ala 또는 Val이며; Xaa26은 Lys, Glu 또는 Arg이고; Xaa27은 Glu 또는 Leu이며; Xaa30은 Ala, Glu 또는 Arg이고; Xaa33은 Val 또는 Lys이며; Xaa34는 Lys, Glu, Asn 또는 Arg이고; Xaa35는 Gly 또는 Aib이며; Xaa36은 Arg, Gly 또는 Lys 또 는 아미드이거나 또는 결여(absent)된 것이고; Xaa37은 Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, 아미드이거나 또는 결여된 것,Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa8-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37 (식 III)여기서, Xaa7은 L-히스티딘, D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, -히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, N-아세틸-히스티딘, a-플루오로메틸-히스티딘, a-메틸-히스티딘, 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌 또는 4-피리딜알라닌이고; Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, (1-아미노시클로프로필) 카르복실산, (1-아미노시클로부틸) 카르복실산, (1-아미노시클로펜틸) 카르복실산, (1-아미노시클로헥실) 카르복실산, (1-아미노시클로헵틸) 카르복실산 또는 (1-아미노시클로옥틸) 카르복실산이며; Xaa18은 Ser, Lys 또는 Arg이고; Xaa22는 Gly, Glu 또는 Aib이며; Xaa23은 Gln, Glu, Lys 또는 Arg이고; Xaa26은 Lys, Glu 또는 Arg이며; Xaa30은 Ala, Glu 또는 Arg이고; Xaa34은 Lys, Glu 또는 Arg이며; Xaa35는 Gly 또는 Aib이고; Xaa36은 Arg 또는 Lys, 아미드이거나 또는 결여된 것이고; Xaa37은 Gly, Ala, Glu 또는 Lys, 아미드이거나 또는 결여된 것이다.
- 제1항에 있어서, 성분 (I)로서 N-말단에 GLP-1(7-35, 7-36 또는 7-37) 서열과, 성분 (II)로서 C-말단에 9개 이상의 아미노산의 펩티드 서열 또는 그의 기능적 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 것인 융합 펩티드.
- 제1항에 있어서, 성분 (I)로서 N-말단에 식 I에 따른 서열과, 성분 (II)로서 C-말단에 9개 이상의 아미노산의 펩티드 서열 또는 그의 기능적 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 것인 융합 펩티드,His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-X (식 I), 여기서, X 는 NH2 또는 Gly-OH이다.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 성분 (I)은 서열 번호 1과 서열 상동성이 80% 이상인 서열을 함유하는 것인 융합 펩티드.
- 제1항 내지 제4항에 있어서, 성분 (II)는 β-턴 유사 구조를 형성하는 펩티드 서열인 것인 융합 펩티드.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 성분 (II)는 1개 이상의 알라닌 또는 프롤린 잔기를 함유하는 펩티드 서열인 것인 융합 펩티드.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 성분 (II)는 β 턴 형성 특성을 가진 4합체(tetramer) (예컨대, 상기 4합체의 2번 위치에 프롤린 잔기를 가지 는 것)를 함유하는 펩티드 서열인 것인 융합 펩티드.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 성분 (II)는 VAIA, IAEE, PEEV, AEEV, EELG, AAAA, AAVA, AALG, DFPE, AADX, AXDX 및 XADX (여기서, X는 임의의 아미노산을 의미함)로 구성되는 군에서 선택되는 서열 모티프를 함유하는 펩티드 서열인 것인 융합 펩티드.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 성분 (II)는 AA, XA, AX, RR, RX 및 XR로 구성되는 군에서 선택되는 그의 N-말단 서열 모티프에 의하여 성분 (I)의 C-말단에 연결되는 펩티드 서열인 것인 융합 펩티드.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 성분 (II)는 서열 번호 25 (DFPEEVA)의 서열 모티프를 함유하거나 또는 서열 번호 25와 서열 상동성이 80% 이상인 서열을 함유하는 펩티드 서열인 것인 융합 펩티드.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 성분 (II)는 서열 번호 22 (RRDFPEEVAI) 및 서열 번호 26 (AADFPEEVAI)로 구성되는 군에서 선택되는 서열을 함유하거나 또는 서열 번호 22 또는 서열 번호 26과 서열 상동성이 80% 이상인 서열을 함유하는 펩티드 서열인 것인 융합 펩티드.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 성분 (II)는 서열 번호 23 (RRDFPEEVAIVEEL), 서열 번호 24 (RRDFPEEVAIAEEL), 서열 번호 27 (AADFPEEVAIVEEL) 및 서열 번호 28 (AADFPEEVAIAEEL)로 구성되는 군에서 선택되는 서열을 함유하거나 또는 서열 번호 23, 24, 27 또는 28 중의 어느 하나와 서열 상동성이 80% 이상인 서열을 함유하는 펩티드 서열인 것인 융합 펩티드.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 성분 (II)는 서열 번호 2 (RRDFPEEVAIVEELG), 서열 번호 3 (RRDFPEEVAIAEELG), 서열 번호 29 (AADFPEEVAIVEELG) 및 서열 번호 30 (AADFPEEVAIAEELG)으로 구성되는 군에서 선택되는 서열을 함유하거나 또는 서열 번호 2, 3, 29, 30과 서열 상동성이 80% 이상인 서열을 함유하는 펩티드 서열인 것인 융합 펩티드.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 성분 (II)는 9 내지 30개, 좋기로는 9 내지 20개 및 가장 좋기로는 9 내지 15개 아미노산을 가지는 펩티드 서열인 것인 융합 펩티드.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 성분 (I) 및 성분 (II)는 직접적으로 연결되거나 또는 링커(linker) 서열을 통해 연결되는 것인 융합 펩티드.
- 제15항에 있어서, 상기 링커 서열은 1 내지 10개 아미노산 길이를 가지는 것인 융합 펩티드.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 융합 펩티드는 서열 번호 8 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELG), 서열 번호 12 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDF-PEEVAIVEELG), 서열 번호 31 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKE-FIAWLVKGRGAADFPEEVAIAEELG), 서열 번호 32 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFAEEVAIAEELG), 서열 번호 33 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDAAAAVAI-AEELG), 서열 번호 34 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKE-FIAWLVKGRGAADAAAAVAIAAALG), 서열 번호 35 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFP), 서열 번호 36 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVA), 서열 번호 37 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELGR-RHAC), 서열 번호 38 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAAD-FPEEVAIVEELG), 서열 번호 39 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKE-FIAWLVKGRGRRDFAEEVAIVEELG), 서열 번호 40 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDAAAAVAIVEELG), 서열 번호 41 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKE-FIAWLVKGRGAADAAAAVAIVAALG) 및 서열 번호 42 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELGRRHAC)로 구성되는 군에서 선택되는 서열 또는 서열 번호 8, 12와 서열 상동성이 80% 이상인 서열을 함유하는 것인 융합 펩티드.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 융합 펩티드는 성분 (II)의 C-말단 및/또는 성분 (I)의 N-말단에 연결된 또 다른 성분 (III)을 함유하는 것인 융합 펩티드.
- 제18항에 있어서, 성분 (III)은 4개 이상의 아미노산 잔기, 좋기로는 10개 이상의 추가적인 아미노산 잔기, 더욱 좋기로는 20개 이상 또는 30개 이상의 추가적인 아미노산 잔기를 포함하는 것인 융합 펩티드.
- 제17항 또는 제19항에 있어서, 상기 성분 (III)은 프로글루카곤에서처럼 GLP-2의 또는 GLP-1(7-37)의 N-말단의 4개 이상, 좋기로는 10개 이상, 더욱 좋기로는 20개 이상의 추가적인 아미노산 잔기를 포함하는 것인 융합 펩티드.
- 제18항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 성분 (III)은 서열 번호 4 또는 5의 서열 또는 서열 번호 4 또는 5와 서열 상동성이 80% 이상인 서열을 함유하는 것인 융합 펩티드.
- 제18항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 융합 펩티드는 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 10 및 서열 번호 11로 구성되는 군에서 선택되는 펩티드 서열 또는 서열 번호 6, 7, 10 또는 11과 서열 상동성이 80% 이상인 서열을 함유하는 것인 융합 펩티드.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아미노산 중 1개 이상이 자연적으로 존재하는 아미노산의 측쇄의 공유 변형에 의하여, 펩티드 골격의 변형에 의하여, NH2 또는 카르복시 말단기의 변형에 의하여 유도체화(derivatize)되는 것인 융합 펩티드.
- 제23항에 있어서, 아미노산 중 1개 이상이 리필(lipyl) 또는 탄수화물(carbohydrate)기에 의하여 유도체화되는 것인 융합 펩티드.
- 제23항 또는 제24항에 있어서, GLP-1 (GLP-1(7))의 N-말단 His 잔기는 그의 NH2 말단에서 및/또는 그의 히스티딜 측쇄에서 특히 소수성 모이어티에 의하여 화학적으로 변형되는 것인 융합 펩티드.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 융합 펩티드는 성분 (IV)로서 담체 단백질, 특히 트란스페린 또는 알부민을 포함하는 것인 융합 펩티드.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 성분 (I), (II) 및/또는 (III)의 아미노산 서열이 역전되고, 여기서 상기 아미노산 서열(들)은 적어도 부분적으로 D 아미노산 이성질체로 구성되는 것인 융합 펩티드.
- 고체상 펩티드 합성에 의하여 제1항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 기재된 융합 펩티드를 생산하는 방법.
- 제1항 내지 제22항 또는 제26항 중 어느 하나의 항에 기재된 융합 펩티드를 코딩하는 핵산.
- 제29항에 기재된 핵산을 포함하는 벡터.
- 상기 융합 펩티드를 발현하는 것이 가능한 외인성으로(exogenously) 도입된 제29항에 기재된 DNA, 특히 제30항에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제1항 내지 제22항 또는 제26항 중 어느 하나의 항에 기재된 융합 펩티드를 생산하는 방법으로서, 융합 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하도록 형질전환된 미생물이 발효되고, 단백질이 회수되는 것인 방법.
- 제32항에 있어서, 동물 세포가 단백질이 세포로부터 방출되는 조건하에서 성장되는 것인 단백질을 생산하는 방법.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 인간 또는 동물 치료에 사용하기 위한 약물로서의 융합 펩티드.
- 제1형 또는 제2형 당뇨병, 인슐린 저항성, 체중 장애 및 질병 또는 이들과 관련된 상태의 치료용 약제를 제조하기 위한 제1항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 기재된 융합 펩티드, 제29항에 기재된 핵산, 제30항에 기재된 벡터 또는 제31항에 기재된 숙주 세포의 용도.
- 신경퇴행성 질환 및 그와 관련된 질병 또는 상태의 치료용 약제를 제조하기 위한 제1항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 기재된 융합 펩티드, 제29항에 기재된 핵산, 제30항에 기재된 벡터 또는 제31항에 기재된 숙주 세포의 용도.
- 세포자멸사와 관련된 질환 및 질병 또는 상태의 치료용 약제를 제조하기 위한 제1항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 기재된 융합 펩티드, 제29항에 기재된 핵산, 제30항에 기재된 벡터 또는 제31항에 기재된 숙주 세포의 용도.
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