BRPI0616107A2 - peptìdeos de fusão glp-1, sua produção e uso - Google Patents

Abstract

PEPTìDEOS DE FUSãO GLP-1, SUA PRODUçãO E USO. A presente invenção refere-se a peptídeos de fusão possuindo atividade GLP-1 e estabilidade melhorada in vivo, especificamente resistência à dipeptidil peptidase IV. O peptídeo de fusão compreende, como componente (1) uma sequência GLP-1 (7-35, 7-36 ou 7-37) de término N e como componente (II) uma sequência peptídica de término O de pelo menos 9 a- minoácidos ou um fragmento funcional, variante ou derivado do mesmo. O componente (II) é preferivelmente uma versão plena ou parcial de lP2 (peptídeo de intervenção 2). Uma concretização preferida compreende a se- qúência GLP-1 (7-35, 36 ou 37)IIP2IGLP-1(7-35, 36 ou 37) ou GLP-2. O peptídeo de fusão pode ser produzido em células transformadas ou sinteticamente e pode ser usado para a preparação de um medicamento para tra- tamento de várias doenças ou distúrbios, por exemplo, diabetes do tipo 1 ou 2, doenças relacionadas à apoptose ou distúrbios neurodegenerativos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PEPTIDEOSDE FUSÃO GLP-1, SUA PRODUÇÃO E USO ".

A presente invenção refere-se ao novos peptídeos de fusãoGLP-1 que possuem término C estendido, são resistentes à inativação daendopeptidase IV, podem ser expressos em níveis altos nas células animaistransformadas, e são úteis, por exemplo, no tratamento do diabetes do tipo

Ο gene glucacon é bem-estudado, vide, por exemplo, White,J.W. e outros, 1986 Nucleic Acid Res. 14(12) 4719-4730. A molécula de pré-pró-glucagon como uma molécula precursora de peso molecular alto é sinte-tizada nas células alfa pancreáticas e nas células L do jejuno e cólon. O pré-pró-glucagon é um pró-hormônio de 180 aminoácidos de comprimento e suaseqüência contém, além do glucagon, duas seqüências de estrutura correla-ta: peptídeo-1 similar ao glucagon (GLP-1) e peptídeo-2 similar ao glucagon(GLP-2). Na molécula de pré-pró-glucagon, entre GLP-1 e GLP-2 se encon-tra uma seqüência de 17 aminoácidos (ou ao invés disso, uma seqüência de15 aminoácidos mais um sítio de clivagem RR do término C), peptídeo 2 deintervenção (IP2). A seqüência de IP2 (localizada entre GLP-1 e GLP-2 namolécula precursora) é normalmente proteoliticamente clivada após o ami-noácido 37 do GLP-1. A molécula de pré-pró-glucagon é, portanto, clivadaem vários peptídeos, dependendo da célula e do ambiente, incluindo GLP-1(1-37), um peptídeo de 37 aminoácidos em sua forma não processada. Demodo geral, esse processamento ocorre no pâncreas e no intestino. A se-qüência de GLP-1 (1-37) pode ser processada adicionalmente no GLP-1 ati-vo (7-37), a forma processada de 31 aminoácidos ou amido de GLP-1 (7-36).Conseqüentemente, a designação de GLP-1 (7-37) indica que o fragmentoem questão compreende os resíduos de aminoácido de (e incluindo) número7 ao (e incluindo) número 37, quando contados da extremidade do término Ndo peptídeo de origem, o GLP-1. A seqüência de aminoácido de GLP-1 (7- 36) amida e de GLP-1 (7-37) é fornecida na fórmula I (Seqüência de id núme-ro: 43):

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-X (I)1 que mos-tra GLP-1(7-36)amida, quando X é NH2 e GLP-1(7-37), quando X é Gly-OH.

GLP-1 é um hormônio dos intestinos e é o agente insulinotrópicoendógeno mais potente com ações que incluem estimulação da atividade daadenilato ciclase e proteína cinase na célula beta. Fisiologicamente, em con-junto com o polipeptídeo inibidor gástrico do intestino superior, ele funcionacomo um hormônio de incretina, abaixando o nível de glicose no sangue.

Conseqüentemente, o GLP-1, secretado em resposta à ingestão de alimen-tos, possui por exemplo, múltiplos efeitos no estômago, fígado, pâncreas ecérebro que trabalham em conjunto para regular o açúcar no sangue. Con-seqüentemente, a amida do peptídeo similar ao Glucagon GLP-1 (7-36), eseu análogo GLP-1 (7-37) sem amida tem atraído interesse considerável emrazão de suas ações potente no metabolismo de carboidrato e sua aplicabili-dade em potencial para tratamento do diabetes, incluindo diabetes do tipo II.

O diabetes do tipo Il é caracterizado por resistência à insulina, uma vez queas células não respondem apropriadamente quando a insulina está presente.Esse é um problema mais complexo que o do diabetes do tipo I. O diabetesdo tipo Il pode passar despercebido por anos em um paciente antes do di-agnóstico, uma vez que os sintomas são tipicamente mais brandos (nenhu-ma cetoacidose) e podem ser esporádicos. Contudo, graves complicaçõespodem resultar do diabetes tipo Il não percebido, incluindo falência renal edoenças das coronárias do coração. Isso leva a morbidez e mortalidade au-mentadas.

GLP-1 (7-36) amida ou GLP-1 (7-37) possui vida curta no soro.O peptídeo é clivado por dipeptidil peptidase IV (DPP-IV) entre os resíduos 8e 9. O peptídeo clivado é inativo. Assim, GLP-1, administrado exogenamen-te, possui vida extremamente curta e utilidade limitada em aplicações tera-pêuticas.

Várias tentativas foram feitas para sintetizar análogos estabili-zados (contra DPP-IV) de GLP-1 (GLP-1 (7-37)) ocorrendo naturalmente.Especificamente, o resíduo 8, que in vivo é Ala, foi substituído por outro re-síduo, por exemplo, Gly, Ser ou Thr (Burcelin, R., e outros (1999) Metabo-lism 48, 252-258). O análogo Gly8 ou G8 foi extensivamente testado, amboscomo molécula sintetizada e produzida por linhagens de células genetica-mente transformadas para secretar o polipeptídeo mutante (Burcelin, R., eoutros (1999) Annals of the New York Academy of Sciences 875: 277-285).

Várias outras modificações foram introduzidas no GLP-1 (7-37) para melho-rar sua estabilidade in vivo, sem comprometer sua atividade biológica. Con-tudo, todas essas abordagens não obtêm qualquer significado terapêuticoexpressivo devido aos problemas consideráveis envolvidos.

No W0/9953064, Thorens, B. descreve uma estratégia para cri-ar um cassete de expressão de GLP-1 multimérico que pode ser incorporadoa uma variedade de tipos de célula que são linhagens de células imortaliza-das, publicamente disponíveis e culturas de células primárias em divisão.Exemplos incluem, neuroesferas sensíveis a EGF, células-tronco progenito-ras neurais sensíveis a bFGF do CNS de mamíferos, enquanto o exemplotrabalhado utiliza células BHK de rim de hamster bebê. É dito que as célulastransfectadas implantadas vêm sendo usadas para tratar camundongos dia-béticos com sucesso, permitindo o controle da glicose substancialmente e-quivalente aos controles não diabéticos. Contudo, essa técnica não se ade-qua aos requisitos de um tratamento a ser administrado rotineiramente aospacientes com diabetes.

Outra abordagem para estabilizar exogenamente o nível de gli-cose se baseia em uma nova classe de medicamentos conhecidos comomiméticos de incretina sob investigação para o tratamento do diabetes dotipo II. Exenatido (Byetta®) é uma versão sintética de um composto naturalencontrado na saliva do gênero de lagarto venenoso do deserto. Em experi-mentos clínicos, um mimético de incretina (exenatido) demonstrou reduçõesno açúcar do sangue e aperfeiçoamentos nos marcadores da função da cé-lula beta. Contudo, exenatido exibe apenas determinados efeitos do peptí-deo-1 similar ao glucagon (GLP-1).

Em resumo, atualmente, não existe terapia eficiente disponívelpara o diabetes do tipo II, que permita abaixar o nível de glicose no sanguecom base no GLP-1, em outras palavras, para prover uma terapia que reflitao espectro inteiro de efeitos benéficos conhecidos do GLP-1, por exemplo,sua atividade nas concentrações fisiológicas para reduzir potencialmente ataxa de entrada de nutrientes na circulação por uma redução da taxa de es-vaziamento gástrico em indivíduos obesos ou sua atividade de estimulaçãoda insulina. Portanto, é um objetivo da presente invenção prover moléculasde peptídeo com base em GLP-1 que são biologicamente ativas e resisten-tes em relação à degradação proteolítica.

A presente invenção se refere a um peptídeo de fusão compre-endendo como componente (I) uma seqüência de GLP-1 (7-35, 7-36 ou 7-37) do término N e como componente Il uma seqüência de peptídeo do tér-mino C de pelo menos 9 aminoácidos ou um fragmento funcional, varianteou derivado do mesmo.

A presente invenção se baseia na verificação de que o peptídeoresultante da invenção é protegido contra degradação proteolítica in vivo,principalmente devido à atividade proteolítica da endopeptidase IV. O peptí-deo da invenção possuindo pelo menos dois componentes (I) e (II) exibeatividade biológica de GLP-1 e simultaneamente, confere estabilidade aoGLP-1 como seu componente (I) por um alongamento do término C.

O termo "peptídeo da invenção" conforme empregado aqui, éum peptídeo de fusão conforme definido aqui, uma variante, um análogo, umfragmento ou um derivado do mesmo, incluindo combinações, por exemplo,um fragmento derivatizado, análogo ou variante de um peptídeo de fusão. Otermo "peptídeo GLP-1" conforme empregado aqui significa GLP-1 (7-35, 36ou 37), considerando-se que "peptídeo GLP-1 modificado" pretende signifi-car qualquer análogo de GLP-1, um derivado de GLP-1, uma variante deGLP-1 ou um fragmento de GLP-1, incluindo um fragmento derivatizado, a-nálogo ou variante de GLP-1 (7-35, 36 ou 37), que pode ocorrer tanto nocomponente (I) e (III) do peptídeo da invenção. O termo "peptídeo GLP-2"conforme empregado aqui significa GLP-2 (1-33, 34 ou 35), considerando-seque "peptídeo GLP-2 modificado" significa qualquer análogo de GLP-2,fragmento ou variante, um derivado de GLP-2 ou um derivado de análogo deGLP-2, incluindo um fragmento derivatizado, análogo ou variante de GLP-2(1-33, 34 ou 35). Variantes, análogos, fragmentos e derivativos são catego-rizados como modificações à seqüência não modificada, por exemplo, GLP-1 (7-35, 36 ou 37) ou GLP-2(1-33, 34 ou 35). Dentro do significado da pre-sente invenção qualquer variante, análogo, fragmento ou derivado deve serfuncional, por exemplo, precisa exercer os mesmos efeitos biológicos ou si-milares ao peptídeo GLP-1 não modificado.

Preferivelmente, o peptídeo da invenção é um peptídeo de fusãoou uma variante, análogo, fragmento ou derivado do mesmo, onde o compo-nente (I) contém uma seqüência possuindo pelo menos 80%, mais preferi-velmente pelo menos 85% e mesmo mais preferivelmente pelo menos 90%de homologia com relação à seqüência Seqüência de id número: 1. A Se-qüência de id númerol representa a seqüência de aminoácido nativo deGLP-1 (7-37) (comprimento de 31 aminoácidos), que é estritamente conser-vada entre os mamíferos.

O segundo componente (componente (II)) do peptídeo de fusãode acordo com a invenção (ou mais geralmente qualquer peptídeo da inven-ção incluindo análogos, fragmentos, variantes ou derivados dos peptídeosde fusão) contém, tipicamente um comprimento de seqüência de pelo menosnove aminoácidos, que pode ou não formar uma estrutura similar ao β giro.Uma estrutura similar ao β giro é um elemento de estrutura secundária típicode proteínas ou peptídeos. Ela é tipicamente formada de quatro aminoáci-dos, que revertem a direção da cadeia de estrutura da proteína ou do peptí-deo. A seqüência de aminoácido do componente (II) contém pelo menos no-ve aminoácidos e, preferivelmente, contém pelo menos um resíduo de proli-na ou alanina em sua seqüência. Os resíduos de prolina são aminoácidoscomuns dentro da seqüência de aminoácido tetramérica formando um β giro.O resíduo de prolina se localiza de modo geral e tipicamente na posição 2 ou3, preferivelmente 2, da seqüência de β giro tetramética ocorrendo no com-ponente (II) do peptídeo de fusão.

Uma fusão inventiva pode ter tipicamente em seu comprimentode seqüência de componente (II) de 9 a 30, preferivelmente 9 a 20, e maispreferivelmente de 9 a 15 aminoácidos. Falando de modo geral, seqüênciasmais curtas no componente (II) podem ser preferidas devido a sua atividadede ligação superior em relação ao receptor de GLP em seqüências mais lon-gas. A seqüência do componente (II), mesmo que não seja um pré-requisito,pode preferivelmente ser neutra ou pode ter uma carga negativa em pH 7.

Peptídeo de fusão de acordo com a invenção é preferido, se seucomponente (II) contiver um motivo de seqüência selecionado do grupo con-sistindo em VAIA, IAEE, PEEV, AEEV, EELG, AAAA, AAVA, AALG, DFPE1AADX, AXDX, e XADX, onde X representa qualquer aminoácido (ocorrendonaturalmente ou um aminoácido não natural modificado). Esses motivos te-traméricos podem estar localizados em qualquer lugar na seqüência docomponente (II). Em uma modificação especificamente preferida, o peptídeode fusão da invenção o componente (II) é uma seqüência peptídica sendoligada ao término C do componente (I) por seu motivo de seqüência do tér-mino N selecionado do grupo consistindo em AA, ΧΑ, AX, RR, RX, e XR,onde X representa qualquer aminoácido (ocorrendo naturalmente ou um a-minoácido não natural modificado).

Um motivo preferido do componente (II) é um peptídeo de fusãoda invenção contendo o motivo de seqüência Seqüência de id número: 25(DFPEEVA) ou contendo uma seqüência possuindo pelo menos 80% dehomologia com relação à seqüência com o motivo de seqüência DFPEEVA,que corresponde à seqüência parcial do ser humano ou murino IP-2.

É especificamente preferido um peptídeo de fusão, onde o com-ponente (II) seja uma seqüência peptídica contendo uma seqüência de acor-do com a Seqüência de id número: 22 (RRDFPEEVAI) ou Seqüência de idnúmero: 26 (AADFPEEVAI) (todas as seqüências peptídicas fornecidas nocódigo de uma letra) ou uma seqüência possuindo pelo menos 80% de ho-mologia com relação à seqüência com a Seqüência de id número: 22 ou coma Seqüência de id número: 26. A Seqüência de id número: 22 é uma se-qüência parcial de comprimento pleno (humano ou murino) seqüência IP-2(peptídeo de intervenção 2), que contém os 10 aminoácidos do término N daseqüência IP-2 de comprimento pleno de 15 aminoácidos. A Seqüência de idnúmero: 26 é derivada da Seqüência de id número: 22 por substituição dosresíduos de término N (RR) por (AA). A IP-2 é um exemplo preferido de umaseqüência peptídica contendo β giro. Conseqüentemente, outras seqüênciaspreferidas mais fortes sendo contidas no componente (II) são mais longasque as seqüências de aminoácido parcial de IP-2, tal como a seqüência de14 aminoácidos de término N ocorrendo nos seres humanos (Seqüência deid número: 23 (RRDFPEEVAIVEEL)) ou sua contraparte de murino (Seqüên-cia de id número 24 (RRDFPEEVAIAEEL)) ou uma seqüência possuindopelo menos 80% de homologia com relação à seqüência com a Seqüênciade id número: 23 ou 24. São mais preferidas e atuando como elementoscontidos no componente (II) do peptídeo de fusão, as seqüências IP-2 decomprimento pleno possuindo 15 aminoácidos da seqüência IP-2 ocorrendonaturalmente (Seqüência de id número: 2 (RRDFPEEVAIVEELG), humana,ou Seqüência de id número 3 (RRDFPEEVAIAEELG), murino) ou uma se-qüência possuindo pelo menos 80% de homologia com relação à seqüênciaSeqüência de id número: 2 ou 3. Dentro do escopo da presente invençãoestão todas as isoformas de mamíferos de IP2 (variantes naturais de IP2entre os mamíferos). Todas as seqüências mencionadas nesse parágrafopodem também ser providas com o motivo de término N (AA), (AX) ou (XA)ao invés de ocorrerem naturalmente (RR), por exemplo Seqüência de id nú-mero: 27 (AADFPEEVAIVEEL), Seqüência de id número: 28 (AADFPEE-VAIAEEL), Seqüência de id número: 29 (AADFPEEVAIVEELG), e Seqüênciade id número: 30 (AADFPEEVAIAEELG). Pode ser provida mais de uma có-pia de uma seqüência sendo incluída no componente por exemplo, 2, 3 oumais cópias de IP2 ou um fragmento, variante, análogo ou derivado de IP2.

Conseqüentemente, um peptídeo da invenção é preferido, con-tendo as seqüências de acordo com a Seqüência de id número: 8(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELG), isto éGLP-1(7-37) ligado sem qualquer seqüência Iigante através de seu términoC ao IP2 de murino ou de acordo com a Seqüência de id número: 12(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELG), isto éGLP-1(7-37) ligado sem qualquer seqüência Iigante através de seu términoC ao IP2 humano. Variantes da invenção adicionalmente preferidas dos pep-tídeos da invenção da Seqüência de id número: 8 e Seqüência de id número:12 são Seqüência de id número: 31(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADFPEEVAIAEELG), Se-qüência de id número: 32(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFAEEVAIAEELG), Se-qüência de id número: 33(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDAAAAVAIAEELG), Se-qüência de id número: 34(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADAAAAVAIAAALG), Se-qüência de id número: 35 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGR-RDFP), Seqüência de id número: 36 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIA-WLVKGRGRRDFPEEVA), Seqüência de id número: 37(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELGRRHAC), Seqüência de id número: 38(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADFPEEVAIVEELG), Se-qüência de id número: 39(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFAEEVAIVEELG), Se-qüência de id número: 40(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDAAAAVAIVEELG), Se-qüência de id número: 41(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADAAAAVAIVAALG)I Se-qüência de id número: 42(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELGRRHAC), isto é, GLP-1(7-37) ligado sem qualquer seqüência Iigante através deseu término C aos análogos ou variantes específicos da seqüência de IP2.Variantes, análogos ou fragmentos da mesma possuindo uma homologiacom relação à seqüência de pelo menos 80% com as Seqüência de ID Nú-meros: 8 e 12 ou derivados das mesmas sendo englobados e preferidos.

Sem estar ligado a qualquer teoria, é concluído pelos inventoresda presente invenção que a instabilidade de GLP-1(7-35, 36 ou 37), se ad-ministrado a qualquer paciente que precise do mesmo, se deve a sua estru-tura tridimensional não protegida. As proteases podem clivar o peptídeoGLP-1 (7-35, 36 ou 37) e abolir sua atividade fisiológica rapidamente in vivo.

Por ligação de uma seqüência peptídica ao término C de GLP-1 (7-35, 36 ou37) sua estrutura ganha estabilidade com relação à degradação enzimática.O ganho em estabilidade parece ser melhorado, se a seqüência peptídica detérmino C adicional (estando contida no componente (II) do peptídeo de fu-são de acordo com a invenção) dobrar de volta devido à presença de umelemento estrutural de β giro, formado por sua estrutura primária e provendorigidez ao componente (II). Contudo, uma estrutura de β giro no componente(II) do peptídeo da invenção não parece ser um pré-requisito para se estabe-lecer a seqüência de GLP-1 do componente (I) com relação à degradaçãoenzimática. Foi verificado que o peptídeo da invenção, em virtude de suaextensão de peptídeo de término C, por exemplo, contendo um elementoestrutural β giro, possui resistência aperfeiçoada em relação à inativação deDPP-IV. O peptídeo de término C tanto não é clivado da seqüência de GLP-1 (7-35, 36 ou 37) antes de atuar em seu receptor nas células-alvo quantopode ser clivado enzimaticamente para formar GLP-1 (7-35, 36 ou 37) in vi-vo. Independente da forma exata do peptídeo da invenção ligado no sítio doreceptor GLP-1, um peptídeo da invenção exerce sua função como um com-posto insulinotrópico ativo.

As seqüências peptídicas, que são consideradas como sendoapropriadas para serem contidas no componente (II) devido à estrutura pri-mária que forma um elemento de β giro podem prontamente ser identifica-das por métodos adequados, por exemplo, espectroscópicos, por exemplo,dicroidismo circular ou outros métodos conhecidos de um versado na técnica.

O componente (II) e o componente (I) podem ser ligados dire-tamente ou ligados através de uma seqüência ligante. Preferivelmente, taiscomponentes são ligados diretamente um ao outro. No caso deles seremligados através de um ligante (ou espaçador), o ligante é preferivelmente umligante peptídico ou um ligante orgânico. Um ligante peptídico possui tipica-mente um comprimento de 1 a 10 aminoácidos, preferivelmente 1 a 5, mes-mo mais preferivelmente 1 a 3 aminoácidos, em alguns casos a seqüêncialigante pode ser mesmo mais longa compreendendo 11 a 50 aminoácidos.Um Iigante peptídico pode ser composto de várias seqüências de aminoáci-do. Preferivelmente, um Iigante peptídico introduzirá alguma flexibilidade es-trutural entre os componentes a serem ligados. A flexibilidade estrutural éobtida, por exemplo, por um Iigante peptídico contendo vários resíduos deglicina ou prolina, preferivelmente pelo menos 30%, mais preferivelmentepelo menos 40% e mesmo mais preferivelmente pelo menos 60% resíduosde prolina e glicina dentro da seqüência ligante. Independente da seqüênciaespecífica, o ligante peptídico pode ser preferível e imunologicamente inati-vo.

Em uma concretização preferida da presente invenção, um pep-tídeo da invenção, isto é, um peptídeo de fusão ou seus análogos, fragmen-to, variantes ou derivados, contém um terceiro componente (componente(III)) que é tanto ligado ao término C do componente (II) e/ou ao término Ndo componente (I). Preferivelmente, o componente (III) está localizado notérmino C do componente (II). Independente se o componente (III) está liga-do ao término N do componente (I) (por seu término C) ou ao término C docomponente (II) (por seu término Ν), o acoplamento pode ser direto ou indi-reto através de uma seqüência ligante. Com relação à seqüência ligante, ela é referida na descrição acima para um ligante conectando o componente (I)e o componente (II). De modo geral, o componente (III) compreende pelomenos quatro resíduos de aminoácido, preferivelmente pelo menos 10 resí-duos de aminoácido adicionais, mais preferivelmente pelo menos 20 ou pelomenos 30. Em termos funcionais, o componente (III) é provido para melhoraradicionalmente a estabilidade de um peptídeo da invenção. Espera-se que ocomponente (III) não interfira com a função biológica do peptídeo da inven-ção que é aproximadamente comparável à atividade biológica de GLP-1(7- 37).

Preferivelmente, o componente (III) do peptídeo da invençãocompreende pelo menos 4, preferivelmente pelo menos 10, mais preferivel-mente pelo menos 20 resíduos de aminoácido adicionais da seqüência detérmino N de uma isoforma de GLP-2 de qualquer organismo mamífero (ou-tra variante de GLP-2 ocorrendo naturalmente entre os mamíferos), por e-xemplo, isoformas de murino ou seres humanos, conforme mostrado nasSEQ ID Nos: 4 e 5. GLP-2 ocorre no pró-glucagon e também está envolvidono mebabolismo do carboidrato. Como com a seqüência biologicamente ati-va incluída no componente (I) (peptídeo GLP-1), o componente (III) tambémpode compreender análogos, variantes ou derivados de formas de GLP-2ocorrendo naturalmente. Alternativamente, o componente (III) também podecompreender pelo menos 4, preferivelmente pelo menos 10, mais preferi-velmente pelo menos 20 resíduos de aminoácido adicionais da seqüência detérmino N de GLP-1 (7-37), correspondentemente incluindo todas as isofor-mas de mamíferos ou - conforme descrito aqui - todas variantes funcionais,análogos ou derivados do mesmo. De modo geral, o componente (III) podeconter qualquer forma de um peptídeo GLP-1 ou um peptídeo GLP-1 modifi-cado, que é revelada aqui como apropriada para o componente (I) do peptí-deo da invenção. Em uma alternativa adicional, o componente (III) tambémpode conter formas quiméricas de GLP-1 (7-37) e GLP-2. Uma forma quimé-rica pode ser produzida por acoplamento de GLP-1 (7-37) e GLP-2 (ou frag-mentos, análogos, variantes ou derivados de ambos) um com o outro e porintrodução subseqüente dessa forma quimérica como o componente (III) nopeptídeo da invenção. Preferivelmente, a forma quimérica é composta deuma seqüência parcial de GLP-1 (7-37) e uma seqüência parcial de GLP-2ligadas. Por exemplo, a forma quimérica pode incluir o término N de 5 a 30aminoácidos de GLP-1 e o término C de 5 a 30 aminoácidos de GLP-2 ouvice-versa, por exemplo, aminoácidos 7 ou 8 a 22, 23, 24, 25, 26, 27, ou 28de GLP-1 (7-37) e seqüência de aminoácido da posição 15, 16, 17, 18, 19,20, 21 , 22, 23 ou 24 para por exemplo, o término C de GLP-2.

Se modificações das formas de GLP-2 ou GLP-1 (7-37) ocor-rendo naturalmente, forem usadas, respectivamente, como o componente(III), o componente (III) preferivelmente conterá a seqüência da Seqüênciade id número: 4 ou 5 ou Seqüência de id número: 1, respectivamente, ouuma seqüência possuindo pelo menos 80% de homologia com relação à se-qüência Seqüência de id número: 4 ou 5 ou Seqüência de id número: 1. De-rivados dessas seqüências preferidas, por exemplo, devido às modificaçõesde cadeia lateral ou modificações de estrutura de peptídeo, etc. (conformedescrito aqui com relação aos "derivados"), também são englobados como ocomponente (III) da presente invenção.

Em outra concretização, o componente (III) pode conter váriasseqüências conforme descrito acima. Por exemplo, o componente (III) podeconter pelo menos duas, preferivelmente 2, 3 ou 4 cópias de GLP-1 (7-37)e/ou GLP-2 ou pelo menos duas cópias de seqüências possuindo pelo me-nos 80% de homologia com relação à seqüência SEQ ID No: 1,4 ou 5.Também o componente (III) pode conter mais de uma cópia de uma versãoquimérica de GLP-1 (7-37) ou GLP-2, conforme descrito acima, por exemploformando eventualmente uma combinação de versão(s) quimérica (s) emconjunto com GLP-1 (7-37) e/ou GLP-2 ou suas modificações, com pelo me-nos 80% de homologia de seqüência. Dentro do escopo da presente inven-ção também se encontram dois ou mais, preferivelmente dois componentes(III), que podem ser, por exemplo, (1) ligados por seu término N ao término Cdo componente (II) e (2) ligados por seu término C ao término N do compo-nente (I) através de um Iigante ou diretamente. Se forem providos dois com-ponentes (III) eles poderão ser idênticos ou diferentes.

Conseqüentemente, peptídeos de fusão da invenção contendotrês componentes (I), (II) e (III) são especificamente preferidos. Quatro con-cretizações específicas contendo todos esses componentes são seleciona-das de um grupo consistindo em: Seqüência de id número 6 (N-GLP-1(7-37)-IP2(murino)-RR-GLP- 1(7-37)-C, também denominado aqui, murino CM1),Seqüência de id número 7 (N-GLP-1(7-37)-IP2(murino)-RR-GLP2-C, tam-bém denominado aqui murino CM2), Seqüência de id número 10 (N-GLP-1 (7-37)-IP2(humano)-RR-GLP-1 (7-37)-C, também denominado aqui humanoCM1) e Seqüência de id número 11 (N-GLP-1(7-37)-IP2(humano)-RR-GLP-2-C), também denominado aqui humano CM2) ou uma seqüência possuindopelo menos 80% de homologia com relação à seqüência Seqüência de idnúmero: 6, 7, 10, ou 11 ou um derivado da mesma. Todas seqüências 6, 7,10 e 11 contêm um Iigante RR (dois resíduos de arginina) no término C deΙΡ2 (componente (II)), que pode ser alternativamente descartado. O compo-nente (I) em cada uma das concretizações de acordo com a SEQ ID No: 6,7, 10 ou 11 é GLP-1(7-37), considerando-se que o componente (III) (em ca-da uma dessas concretizações ligado ao término C do componente (II) é tan-to GLP-1 (7-37) quanto GLP-2.

Os peptídeos da invenção podem ocorrer em várias formas mo-dificadas. Essas formas modificadas são reveladas a seguir e descritas emmaiores detalhes.

O termo "sais" aqui se refere a ambos os sais dos grupos car-boxila e aos sais de adição de ácido dos grupos amino dos peptídeos defusão descritos acima ou análogos, fragmentos, derivados ou variantes dosmesmos. Sais de um grupo carboxila podem ser formados por meios conhe-cidos na técnica e incluem sais inorgânicos, por exemplo, sais de sódio, cál-cio, amônio, ferro ou zinco e similares e sais com bases orgânicas como a-queles formados, por exemplo, com aminas, tais como, elanolamina, argini-na ou lisina, piperidina, procaína e similares. Os sais de adição ácidos inclu-em, por exemplo, sais com ácidos minerais, tais como, por exemplo, ácidoclorídrico ou ácido sulfúrico e sais com ácidos orgânicos, tais como, por e-xemplo, ácido acético ou oxálico. Naturalmente, qualquer tal sal deve reter aatividade biológica dos peptídeos da invenção relevantes para a presenteinvenção, isto é, a capacidade de reduzir a taxa de entrada de nutrientes nacirculação. Conforme descrito a seguir, as formas de peptídeo de sal podemestar contidas em uma formulação farmacêutica.

Um "fragmento" de um peptídeo de fusão, de acordo com a pre-sente invenção, se refere a qualquer subconjunto de moléculas, isto é, umpeptídeo mais curto que mantém a atividade biológica desejada. Os frag-mentos podem ser preparados prontamente por remoção dos aminoácidosda extremidade da molécula e teste do resultante quanto a suas proprieda-des como uma incretina. As proteases para remoção de um aminoácido porvez tanto do término N e/ou término C de um polipeptídeo são conhecidas eassim os fragmentos determinantes que retém a atividade biológica deseja-da envolvem apenas experimentação de rotina. Conclusivamente, os frag-mentos podem ser devidos aos apanhamentos de aminoácidos no términodo peptídeo e/ou de aminoácidos posicionados dentro da seqüência de pep-tídeo.

Adicionalmente, o peptídeo da invenção que possui atividadeantidiabetes do tipo 2, será propriamente um peptídeo de fusão, um análogoou variante, sal, derivado funcional e/ou fragmento do mesmo, pode conterresíduos de aminoácido adicionais flanqueando o peptídeo da invenção. Àmedida que a molécula resultante mantém sua resistência ou estabilidadecom relação às proteases e sua capacidade de agir como incretina, pode-sedeterminar se quaisquer tais resíduos de flanqueamento afetam as caracte-rísticas novas e básicas do peptídeo de núcleo, por exemplo, por seus efei-tos nas células pancreáticas, por experimentação de rotina. O termo "consis-tindo essencialmente em, quando se refere a uma seqüência específica, sig-nifica que os resíduos de flanqueamento adicionais podem estar presentes,não afetando as características novas e básicas do peptídeo da invençãoespecificado. Esse termo não compreende substituições, apagamentos ouadições dentro da seqüência específica.

Uma "variante" de acordo com a presente invenção se refere auma molécula que é substancialmente similar tanto ao peptídeo da invençãocompleto definido acima quanto um fragmento do mesmo. Peptídeos varian-tes podem ser convenientemente preparados por síntese química direta dopeptídeo variante, usando métodos bem-conhecidos na técnica. Naturalmen-te, tal variante de um peptídeo da invenção teria atividade antidiabética simi-lar, por exemplo, de estimulação da insulina como o peptídeo de GLP-1 cor-rendo naturalmente correspondente.

Alternativamente, as variantes de seqüência de aminoácido dospeptídeos definidos acima podem ser preparadas por mutações nos DNAsque codificam derivados sintetizados. Tais variantes incluem, por exemplo,apagamentos ou inserções ou substituições de resíduos dentro da seqüên-cia de aminoácido. Qualquer combinação de apagamento, inserção e substi-tuição pode também ser feita para se chegar à construção final, contantoque a construção final possua a atividade desejada. Obviamente, as muta-ções que serão feitas na codificação do DNA do peptídeo variante não de-vem alterar a estrutura de leitura e preferivelmente não criarão regiões com-plementares que poderiam produzir estrutura de mRNA secundária.

Um "análogo" dos peptídeos definidos acima, de acordo com apresente invenção, se refere a uma molécula não natural que é substancial-mente similar tanto à molécula completa quanto a um fragmento ativo damesma. Tal análogo exibiria a mesma atividade que o peptídeo GLP-1 ocor-rendo naturalmente correspondente.

Os tipos de substituições que podem ser feitas no peptídeo dainvenção, de acordo com a presente invenção, podem ser basear na análisedas freqüências de alterações de aminoácidos entre proteína/peptídeo ho-mólogos de espécies diferentes. Com base em tal análise, substituições deconservação podem ser definidas aqui como trocas dentro de um dos cincogrupos que se seguem:

I. Resíduos pequenos, alifáticos, não polares ou ligeiramentepolares: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly; II. Resíduos polares, carregados negativa-mente e suas amidas: Asp, Asn, Glu, Gln; III. Resíduos polares, carregadospositivamente: His, Arg, Lys; IV. Resíduos grandes, alifáticos, não polares:Met, Leu, He, Vai, Cys; V. Resíduos aromáticos, grandes: Phe, Try, Trp.

Dentro dos grupos precedentes, as substituições que se se-guem são consideradas como sendo "altamente conservadoras": Asp/GIu;His/Arg/Lys; Phe/Tyr/Trp; Met/Leu/lle/Val. Substituições semiconservadorassão definidas como sendo as trocas entre dois dos grupos (I)-(IV) acima quesão limitados ao supergrupo (A), compreendendo (I), (II), e (III) acima, ou aogrupo (B), compreendendo (IV) e (V) acima. As substituições não estão limi-tadas aos aminoácidos geneticamente codificados ou mesmo ocorrendo na-turalmente.

Em geral, os análogos ou variantes do peptídeo da invençãotambém podem conter substituições de aminoácido, feitas por exemplo coma intenção de aperfeiçoar a solubilidade (substituição de aminoácidos hidró-fobos com aminoácidos hidrófilos). Em uma concretização das varian-tes/análogos do peptídeo GLP-1 do peptídeo da invenção (ocorrendo nocomponente (I) e/ou (III) do peptídeo da invenção) o peptídeo (modificado)GLP-1 é caracterizado por uma ou mais substituições) nas posições 7, 8,11,12, 16, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 33, 34, 35, 36, ou 37 do peptídeo GLP-1. Co-mo um exemplo da nomenclatura que se segue [Arg34-GLP-1 (7-37)] desig-na um análogo de GLP-1 onde a Iisina ocorrendo naturalmente na posição34 foi substituída por arginina.

Especificamente, o componente (I) e/ou (III) de um peptídeo dainvenção pode compreender variantes e análogos de GLP-1 (7-35, 36 ou 37)incluindo, por exemplo, Gln9-GLP-1 (7-37), D-Gln9-GLP-1(7-37), acetil-Lys9-GLP-1 (7-37), Thr16-Lys18-GLP-1 (7-37), e Lys18-GLP-1 (7- 37), Arg34-GLP-1 (7-37), Lys38-Arg26-GLP-1 (7-38)-OH, Lys36-Arg26-GLP-1 (7-36),Arg26,34-Lys38-GLP-1 (7-38), Arg26,34-Lys38-GLP-1(7-38), Arg26,34-Lys38-GLP-1 (7-38), Arg26,34-Lis38-GLP-1 (7-38), Arg26,34-Lys38-GLP-1(7-38), Arg26-Lys38-GLP-1 (7-38), Arg26-Lys38-GLP-1(7-38), Arg26-Lys38-GLP-1 (7-38), Arg34-Lys38-GLP-1 (7-38), Ala37-Lys38-GLP-1 (7-38), eLys37-GLP-1 (7-37).

Em outra concretização da invenção, o peptídeo da invençãocontém como o componente (I) ou (III) um peptídeo GLP-1 modificado com-preendendo a seqüência de aminoácido da fórmula Il que se segue (Se-qüência de id número: 44):

Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,

onde Xaa7 é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, 3-hidróxi-histidina, homo-histidina, N-acetil-histidina, a-flúormetil-histidina, a-metil-histidina, 3- piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina; Xaa8 é Alai Gly, Vai, Leu, He, Lys, Aib, ácido carboxílico (1-aminociclopropila), ácido carboxílico (1-aminociclobutila), ácido carboxílico(1-aminociclopentila), ácido carboxílico (1-aminociclohexila), ácido carboxíli-co (1-aminocicloheptila), ou ácido carboxílico (1-aminociclooctila), pelo queGly é especificamente preferido; Xaa16 é Val ou Leu; Xaa é Ser, Lys ou Arg;Xaa 19 é Tyr ou Gln ; Xaa20 é Leu ou Met; Xaa22 é Gly, Glu ou Aib; Xaa23 éGlnl Glu, Lys ou Arg ; Xaa25 é Ala ou Val ; Xaa26 é Lys1 Glu ou Arg; Xaa27é Glu ou Leu; Xaa30 é Ala1 Glu ou Arg; Xaa33 é Val ou Lys; Xaa34 é Lys1Glu, Asn ou Arg; Xaa35 é Gly ou Aib; Xaa36 é Arg, Gly ou Lys ou amida ouausente; Xaa37 é Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, amida ou está ausente.

Em outra concretização da invenção, o componente (I) e/ou (III)do peptídeo da invenção contém um peptídeo GLP-1 modificado compreen-dendo a seqüência de aminoácido da fórmula Ill que se segue (Seqüênciade id número:45):

Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa8-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,

onde Xaa7 é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, -hidróxi-histidina, homo-histidina, N-acetil-histidina, a-flúormetil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina; Xaa8 é Ala, Gly, Vai, Leu, lie, Lys, Aib, ácido carboxílico (1-aminociclopropila), ácido carboxílico (1-aminociclobutila), ácido carboxílico(1-aminociclopentila), ácido carboxílico (1-aminociclohexila), ácido carboxíli-co (1-aminocicloheptila), ou ácido carboxílico (1-aminociclooctila); Xaa18 éSer, Lys ou Arg; Xaa22 é Gly, Glu ou Aib; Xaa23 é Gln, Glu, Lys ou Arg; Xa-a26 é Lys, Glu ou Arg; Xaa30 é Ala, Glu ou Arg; Xaa34 é Lys, Glu ou Arg;Xaa35 é Gly ou Aib; Xaa36 é Arg ou Lys, amida ou está ausente; Xaa37 éGly, Ala, Glu ou Lys, amida ou está ausente.

Em uma concretização especificamente preferida da invenção ocomponente (I) e/ou (III) do peptídeo da invenção contém um peptídeo GLP-1 (modificado), que é selecionado de GLP-1 (7-35), GLP-1 (7-36), GLP-1 (7-36)-amida, GLP-1 (7-37) ou uma variante, um análogo ou derivado do mes-mo. Também são preferidos os peptídeos da invenção compreendendo emseus componentes (I) e/ou (III) um peptídeo GLP-1 modificado possuindo umresíduo Aib na posição 8 ou um resíduo de aminoácido na posição 7 do pep-tídeo GLP-1, que é selecionado do grupo consistindo em D-histidina, desa-mino-histidina, 2-amino-histidina, hidróxi-histidina, homohistidina, N-acetil-histidina, a-fluormetil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina e 4-piridilalanina.

Exemplos de produção de substituições de aminoácido nas pro-teínas que podem ser usadas para obtenção de análogos para uso na pre-sente invenção incluem quaisquer etapas de método conhecidas, tais comoas apresentadas nas Patentes U.S. RE 33.653; 4.959.314; 4.588.585 e4.737.462 de Mark e outros; 5.116.943 de Koths e outros; 4.965.195 de Na-men e outros; e 5.017.691 de Lee e outros e proteínas substituídas com Iisi-na apresentadas na patente U.S. 4.904.584 (Shaw e outros).

Preferivelmente, a variante ou análogo, conforme definido acimae contido no componente (I), (II) e/ou (III), terá uma seqüência de núcleo,que é a mesma que aquela da seqüência "nativa", por exemplo, GLP-1 (7-37) ou GLP-2 ou fragmento biologicamente ativo dos mesmos ou qualquerisoforma IP2, que possui uma seqüência de aminoácido possuindo pelo me-nos 70% de identidade em relação à seqüência de aminoácido nativa e man-tém a atividade biológica da mesma. Mais preferivelmente, tal seqüênciapossui pelo menos 80% de identidade, pelo menos 90% de identidade, oumais preferivelmente pelo menos 95% de identidade em relação à seqüêncianativa. Quando um peptídeo específico possui uma porcentagem de identi-dade específica em relação a um polipeptídeo de referência de um compri-mento definido, a porcentagem de identidade é relativa ao peptídeo de refe-rência. Assim, um peptídeo que é 50% idêntico a um polipeptídeo de refe-rência que possui 100 aminoácidos de comprimento pode ser um polipeptí-deo de 50 aminoácidos que é completamente idêntico a uma porção de 50aminoácidos de comprimento do polipeptídeo de referência. Ele também po-de ser um polipeptídeo de 100 aminoácidos de comprimento, que é 50% i-dêntico ao polipeptídeo de referência por todo seu comprimento. Natural-mente, outros polipeptídeos satisfarão os mesmos critérios. O termo "identi-dade da seqüência" conforme empregado aqui, significa que as seqüênciassão comparadas como se segue. As seqüências são alinhadas usando aVersão 9 do Genetic Computing Group1S GAP (programa de alinhamentoglobal), usando a matriz de padrão (BLOSUM62) (valores -4 a +11) comuma penalidade aberta da fenda de -12 (para o primeiro nulo de uma fenda)e uma penalidade de extensão de fenda de -4 (para cada nulo consecutivoadicional na fenda). Após o alinhamento, a porcentagem de identidade é cal-culada por expressão do número de combinações como uma porcentagemdo número de aminoácidos na seqüência reivindicada.

Derivados de um peptídeo de fusão ou um análogo, fragmentoou variante do mesmo são também englobados pela presente invenção. Otermo "derivados" de um peptídeo da invenção pretende incluir apenas a-queles peptídeos da invenção modificados que não alteram um aminoácidoem outro dos vinte aminoácidos naturais ocorrendo naturalmente. Corres-pondentemente, um aminoácido geneticamente codificado pode ser modifi-cado por reação do mesmo com um agente de derivatização orgânico que écapaz de reação com cadeias laterais selecionadas de resíduos ou gruposamino ou carbóxi de resíduos terminais (preferivelmente por modificaçãocovalente) ou por introdução de aminoácidos não naturais (fabricados porsíntese química, isto é, isômeros D dos aminoácidos codificados pelo códigogenético, Aib (a-ácidoamino isobutírico), Abu (a-ácidoamino butírico), Tie (t-butilglicina), p-aianina, ácido 3-aminometil benzóico, ácido antranílico) ouaminoácidos naturais que não são codificados pelo código genético, por e-xemplo, hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ornitina, fosfoserina, D-alalina eD-glutamina ou por uma modificação da estrutura do peptídeo por disposi-ções alternativas da estrutura do peptídeo.

Nas modificações preferidas que se seguem, os aminoácidos dopeptídeo da invenção (que - conforme definido acima - também compreen-dem variantes, análogos ou fragmentos do peptídeo de fusão) são descritos,os quais podem ocorrer em um peptídeo da invenção em qualquer lugar(qualquer aminoácido), por exemplo, posicionado no componente (I), (II)e/ou (III).

Os resíduos de cisteinila, caso presentes em qualquer forma deum peptídeo da invenção, por exemplo, um análogo de um peptídeo da in-venção, mais comumente são reagidos com alfa-haloacetatos (e aminas cor-respondentes), tais como, ácido cloroacético ou cloroacetamida, para forne-cer derivados de carboxiemetil ocarboxiamidometila. Os resíduos de cisteini-la também são derivatizados por reação com bromotrifluoracetona, ácidoalfa-bromo-beta-(5-imidazoil)propiônico, fosfato de cloroacetila, N-alquilmaleimidas, dissulfeto de 3-nitro-2-piridila, dissulfeto de metil-2-piridila,p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, orcloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Resíduos de histidila em um peptídeo da invenção podem serderivatizados por reação com procarbonato de dietila em pH 5,5-7,0 em ra-zão desse agente ser relativamente específico para a cadeia lateral de histi-dila. Brometo de parabromofenacila também é útil; a reação é preferivelmen-te realizada em cacodilato de sódio a 0,1 M em pH 6,0. Especificamente, oresíduo de histidina de término N (His7) de GLP- 1(7-37) quando contido nocomponente (I) e/ou (III) do peptídeo da invenção é muito importante para aatividade insulinotróica dos peptídeos de GLP-1, conforme mostrado por Su-zuki e outros (Diabetes Res.; Clinicai Practice 5 (Supp. 1): S30 (1988)). Cor-respondentemente, o peptídeo da invenção pode ser modificado no His7 deseu GLP-1 como parte do componente (I) e/ou (III) pelos grupos alquila ouacila (C1-C6) ou substituição de His por estruturas de anel C5-C6 de funcio-nalidade equivalente. Uma modificação preferida é a introdução de uma por-ção hidrófoba no término amino de His ou sua cadeia lateral histidila.

A Iisinila e resíduos de término amino de um peptídeo da inven-ção podem ser, por exemplo, reagidos com ácido succínico ou outros anidri-dos de ácido carboxílico. A derivatização com esses agentes possui o efeitode reverter a carga dos resíduos de lisinila. Por modificações de acila (C12-C18) do grupo épsilon-amino do(s) resíduo(s) de Iisina no peptídeo da in-venção, sua meia via na circulação é aumentada. Os resíduos de arginilapodem ser, por exemplo, modificados por reação com um ou vários reagen-tes convencionais, entre eles fenilglioxal; e ninhidrina. A derivatização dosresíduos de arginina requer que a reação seja realizada nas condições alca-linas de pKa alto do grupo funcional de guanidina. Adicionalmente, essesreagentes podem interagir com os grupos de lisina, bem como o grupo argi-nina épsilon-amino.

A modificação específica dos resíduos de tirosila propriamentefoi estudada extensivamente. Mais geralmente, N-acetilimidazol e tetranitro-metano podem ser usados para formar espécies O-acetil tirosila e derivadose-nitro, respectivamente.

Grupos laterais carboxila (aspartila ou glutamila) podem ser se-letivamente modificados por reação com carbodiimidas (R1N-C-N-R1)1 taiscomo, 1 -cicloexil-3-[2-morfolinil-(4-etil)]cardodiimida ou 1 -etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida.

Adicionalmente, resíduos de aspartila e glutamila podem serconvertidos em resíduos de asparaginila e glutaminila por reação com íonsamônio.

Resíduos de glutaminila e asparaginila podem ser desaminadosnos resíduos de glutamina e aspartila correspondentes. Alternativamente,esses resíduos podem ser desaminados sob condições ácidas brandas. Ca-da forma desses resíduos se encontra dentro do escopo dessa invenção.

Peptídeos da invenção desaminados podem sofrer uma suscetibilidade alte-rada à proteólise com enzimas de protease ou peptidase, sugerindo que adesaminação pode ter significado fisiológico no direcionamento da clivagemproteolítica de um peptídeo da invenção. É observado que os peptídeos bi-ossintéticos da invenção podem degradar sob determinadas condições dearmazenamento, resultando em desaminação em uma ou mais posições dopeptídeo da invenção. Resíduos de metionina nos peptídeos da invençãopodem ser suscetíveis à oxidação, primariamente ao sulfóxido. Como os ou-tros derivados mencionados acima, ambos os peptídeos da invenção desa-mida e/ou peptídeos da invenção sulfóxido podem ser empregados para exi-bir atividade biológica plena.

Outros reagentes apropriados para derivatização de resíduoscontendo aminoácido alfa incluem imidoésteres, tais como, picolinimidato demetila; fosfato de piridoxal; piridoxal; clorobromoidreto; ácido trinitrobenze-nossulfônico; O-metiliosuréia; 2,4-pentanodiona e reação catalisada de tran-saminase com glioxilato.

Os resíduos de aminoácido terminais de um peptídeo da inven-ção com seus grupos carbóxi (término C) e amina (término N) (bem comogrupos carbóxi ou cadeia lateral de ácido aminoácido, vide acima) pode es-tar presente em sua forma protegida e/ou não protegida (por exemplo, otérmino C por um grupo amida), usando grupos de proteção amino ou car-boxila apropriados. Também, os sais de adição de ácido do peptídeo da in-venção podem ser providos. Sais de adição de ácido comuns são sais áci-dos halídricos, isto é, HBr, Hl ou mais preferivelmente, HCI.

PEGilação de grupos carboxila de cadeia lateral ou terminal ouo grupo de épsilon-amino da Iisina ocorrendo no peptídeo da invenção, con-fere resistência à oxidação e também está dentro do escopo da presenteinvenção.

Outras modificações resultando nos derivados dos peptídeos dainvenção se baseiam nos carboidratos e/ou lipídeos que podem ser covalen-temente acoplados ao peptídeo da invenção. É preferido acoplar lipídeose/ou carboidratos à serina, treonina, asparagina, glutamina ou tirosina ouglutamato ou aspartato via suas porções de cadeia lateral reativas. Alternati-vamente, os carboidratos e/ou lipídeos podem também ser ligados às por-ções terminais do peptídeo da invenção. Adicionalmente, um peptídeo dainvenção pode ser acoplado a um peptídeo funcionalmente diferente, quepode também estabilizar o peptídeo da invenção e/ou pode servir para me-lhorar as propriedades de transporte de um peptídeo da invenção em fluidoscorpóreos, especificamente sangue. Os peptídeos ou proteínas apropriadospodem ser selecionados, por exemplo da Albumina, Transferrina, etc., quesão diretamente acoplados (como componente IV) ao peptídeo da invençãoou através de um peptídeo ou seqüência Iigante orgânica. Preferivelmente,esses peptídeos ou proteínas são ligados a um dos terminais do peptídeo dainvenção.

A fim de eliminar o problema de degradação do peptídeo da in-venção, outra concretização da presente invenção provê um isômero retroin-verso do peptídeo da invenção, composto de aminoácidos D ou pelo menosparcialmente composto de aminoácidos D. O termo "isômero retroinverso" serefere a um isômero de um peptídeo linear onde a direção da seqüência érevertida e a quiralidade do resíduo de cada resíduo de aminoácido é inver-tida (vide, por exemplo, Jameson e outros, Nature, 368, 744-746 (1994);Brady e outros, Nature, 368, 692-693 (1994)). Com relação ao peptídeo deorigem, o peptídeo retroinverso é montado na ordem reversa dos aminoáci-dos, tipicamente com derivados de aminoácido F-moc. Tipicamente, os pep-tídeos brutos podem ser purificados por HPLC de fase reversa.

Outras modificações, que podem ser introduzidas nos peptídeosda invenção se referem às modificações da estrutura do peptídeo. Preferi-velmente, os peptídeos da invenção modificados são construções miméticas.Sua estrutura é diferente da estrutura que ocorre naturalmente, embora suasestruturas de cadeia lateral sejam idênticas aos peptídeos da invenção ouseus fragmentos, variantes, derivados ou análogos. Em geral, construçõesmiméticas exibem uma modificação de um ou mais dos elementos da cadeiade estrutura (NH, CH, CO), tanto como substituição (preferivelmente) ou co-mo uma inserção. Substituintes são, por exemplo, (I) -O-, -S-, ou -CH2- aoinvés de -NH-; (II) -N-, C-Aquil-, ou -BH- ao invés de -CHR- e (III) -CS-, -CH2-, -SOn-, -P=O(OH)-, ou -B(OH)- ao invés de -C0-. Um mimético de peptídeode um peptídeo da invenção pode ser uma combinação de cada uma dessasmodificações. Especificamente, as modificações de cada um dos grupos I, Ile III podem ser combinadas. Em um mimético de peptídeo, cada elementode cadeia de estrutura pode ser modificado ou alternativamente, apenas umdeterminado número de elementos de cadeia pode ser alterado para umaporção não ocorrendo naturalmente. Preferivelmente, todos os elementos dacadeia de estrutura de um peptídeo da invenção de cada um de -NH-, -CHR-ou CO são alterados em outro grupo não ocorrendo naturalmente. No caso25 da ligação amida (-NH-CO-) do peptídeo da invenção a estrutura é substituí-da (em toda a molécula ou pelo menos em uma posição simples), preferi-velmente as porções de substituição são bioisoestéricas, por exemplo, liga-ções de amida retroinversa (-CO-NH-), hidróxi etileno (-CH(OH)-CH2-), alce-no (CH2=CH-), carba (CH2-CH2-) e/ou -P=O(OH)-CH2-). Alternativamente, oalongamento da cadeia de estrutura pelas inserções pode ocorrer em umaconstrução mimética do peptídeo da invenção, por exemplo, porções flan-queando o átomo de carbono alfa. Em outro lado do átomo de carbono alfa,por exemplo, -O-, -S-, -CH1-NH- pode ser inserido.

Especificamente preferida é a estrutura do peptídeo de oligocar-bamato dos peptídeos da invenção. A ligação de amida é substituída poruma porção de carbamato. Os carbonatos de amino alquila N-protegidosmonoméricos são acessíveis através dos aminoácidos correspondentes ouamino álcoois. Eles são convertidos em ésteres ativos, por exemplo, éster p-nitro fenila por emprego da porção F-moc ou um grupo nitroatriloxicarbonilafotossensível por síntese de fase sólida.

Os peptídeos da invenção são protegidos contra clivagem pro-teolítica conforme ressaltado acima. Eles são especificamente protegidoscontra dipeptidil aminopeptidase-4 (DPP-IV). O termo "protegido por DPP-IV"conforme empregado aqui se refere a um peptídeo de acordo com a reivindi-cação 1. Peptídeos da invenção bem como seus derivados, análogos, frag-mentos e variantes renderem GLP-1(7-35, 36 ou 37) como parte do compo-nente (I) e/ou (III) do peptídeo da invenção resistente à peptidase plasmática(DPP-IV).

A resistência de um peptídeo à degradação por dipeptidil ami-nopeptidase IV é determinada, por exemplo, pelo ensaio de degradação quese segue: alíquotas de peptídeos são incubadas a 37°C com uma alíquotade dipeptidil aminopeptidase IV purificada por 4-22 horas em um tampãoapropriado em pH 7-8 (tampão não sendo albumina). As reações enzimáti-cas são terminadas por adição de ácido trifluoracético e os produtos de de-gradação de peptídeo são separados e quantificados empregando análisede HPLC ou LC-MS. Um método para realizar essa análise é: as misturassão aplicadas a um Zorbax300SB-C18 (poros de 30 nm, partículas de 5 μιτι)coluna de 150 χ 2,1 mm e eluídas em uma razão de fluxo de 0,5 mL/min comum gradiente linear de acetonitrila em 0,1% de ácido trifluoracético (0%-100% de acetonitrila por 30 minutos). Os peptídeos e seus produtos de de-gradação podem ser monitorados por sua absorvência em 214 nm (ligaçõesde peptídeo) ou 280 nm (aminoácidos aromáticos) e são quantificados porintegração de suas áreas máximas. O padrão de degradação pode ser de-terminado por emprego de LC-MS onde os espectros EM da máxima sepa-rada podem ser determinados. Porcentagem intacta/composto degradadoem um dado momento é usada para estimativa da estabilidade a DPP-IV dospeptídeos.

Um peptídeo da invenção é definido como estabilizado em DPP-IV quando ele é dez vezes mais estável que GLP-1 (7-37) com base nocomposto de porcentagem intacta em um dado momento. Assim, um peptí-deo da invenção com DPPV-IV estabilizada é preferivelmente pelo menos10, mais preferivelmente, pelo menos 20 vezes mais estável que GLP-1 (7-37) como tal. A estabilidade pode ser avaliada por qualquer método conhe-cido de um versado na técnica, por exemplo, por adição de DPP-IV a umasolução do peptídeo a ser testada e por determinação da degradação dopeptídeo, por exemplo, com o tempo, por exemplo, por um método espec-troscópico, análise Western-Blot, classificação de anticorpo, etc. Em parale-lo, um peptídeo da invenção é definido como um composto que exerce oefeito de GLP-1 (7-37) por exemplo, por ligação ao seu receptor nativo (re-ceptor de GLP-1). Preferivelmente, um peptídeo da invenção possui umaafinidade de ligação ao receptor GLP-1, que corresponde a pelo menos10%, preferivelmente pelo menos 50% da afinidade de ligação do peptídeoGLP-1 ocorrendo naturalmente. A afinidade de ligação pode ser determinadapor qualquer método apropriado, por exemplo, ressonância de plasmon desuperfície, etc. Além disso, é preferido, se o peptídeo da invenção evocar aformação de AMPc intracelular por sua ligação ao seu receptor extracelular,que transmita o sinal dentro da célula.

Os peptídeos da invenção podem ser produzidos sinteticamen-te, empregando técnicas de síntese de peptídeo de fase sólida, similares aomodo de produção de amida GLP-1 (7-36) e GLP-1 (7-37) na técnica e po-dem ser purificados após isso em uma escala laboratorial, por exemplo, poruma etapa de purificação simples em uma coluna de HPLC de fase inversaou métodos de cromatografia apropriados.

Contudo, é preferivelmente formado em células transformadasgeneticamente, tanto em linhagens de células microbianas quanto em célu-las animais para produzir o peptídeo da invenção. O peptídeo da invençãopode ser isolado de células das quais é expresso, por exemplo, usando téc-nicas de separação convencionais. Assim, as células podem se desenvolverem condições apropriadas, por exemplo, incluindo suporte e nutrientes, invitro e proteína secretada, isto é, o peptídeo da invenção, é recuperado domeio extracelular. As seqüências transformadas geneticamente nas célulasassim incluem preferivelmente, seqüências líder e seqüências peptídicas desinal direcionado a secreção do peptídeo da invenção. As células preferivel-mente expressam protease capaz de clivar as seqüências líder e de sinaltanto endogenamente quanto por seqüências genéticas transformadas. Emuma alternativa, as seqüências genéticas transformadas codificando umpeptídeo da invenção não incluem tais seqüências líder e de sinal, pelo que,o peptídeo da invenção expresso intracelularmente não será secretado eserá recuperado das células por processos envolvendo Iise celular. Em taismétodos, as seqüências de codificação podem incluir marcadores de purifi-cação permitindo a extração eficiente do peptídeo produto do meio, os mar-cadores podendo ser clivados para liberar o peptídeo da invenção isolado.

A invenção provê, adicionalmente, um ácido nucléico, que codi-fica o peptídeo da invenção, sendo o mesmo um peptídeo de fusão ou umfragmento, análogo ou variante do mesmo. Qualquer codificação de ácidonucléico para um peptídeo da invenção está englobada pela presente inven-ção. Devido à degeneração do código genético, várias seqüências de ácidonucléico podem codificar um peptídeo da invenção. Uma molécula de ácidonucléico dentro do escopo da presente invenção também pode conter a codi-ficação de ácido nucléico para o peptídeo da invenção e, adicionalmente,seqüências de nucleotídeo adicionais (funcionais). Em uma concretizaçãopreferida da presente invenção, tal molécula de ácido nucléico pode codificar(a) toda a seqüência GLP-1 aa (GLP-1(1-37) ou a seqüência GLP-1(7-35, 36ou 37) funcional, (b) uma seqüência de clivagem no término N da seqüênciaGLP-1 de acordo com (a) para qualquer protease, a montante de 9(b) podecodificar uma seqüência líder. Em outra concretização preferida, a montanteda seqüência de ácido nucléico codificando (b), a molécula de ácido nucléicopode compreender adicionalmente (c) uma seqüência codificando um peptí-deo de sinal. Alternativamente, a molécula de ácido nucléico a invenção po-de possuir uma seqüência (c) fundida a montante de (a) sem qualquer se-qüência codificando uma seqüência líder (b) entre as mesmas. Preferivel-mente, a seqüência líder e a seqüência de peptídeo de sinal são heterólogasao pré-pró-glucagon.

A invenção provê, adicionalmente, um vetor compreendendo umácido nucléico da invenção (molécula) e outros componentes funcionais paraexpressão do ácido nucléico da invenção (molécula). Tipicamente, o ácidonucléico da invenção (molécula) será fundido a uma seqüência promotora e,eventualmente, combinado com outras seqüências reguladoras, por exem-plo, uma seqüência melhoradora. Para replicação, o plasmídeo pode conteruma origem de replicação. A fim de selecionar as células transfectadas como vetor da invenção, um ou mais genes de resistência antibiótica (por exem-plo, canamicina, ampicilina) podem ser providos no vetor. O vetor pode serum plasmídeo que inclua promotor original bacteriano e genes de resistênciaantibiótica e promotor de origem, e genes de resistência antibiótica para re-plicação e expressão nas células de mamíferos. A invenção adicionalmenteprovê uma célula hospedeira compreendendo DNA da invenção introduzidoexogenamente, capaz de traduzir a proteína precursora. A célula hospedeirapode ser tanto uma célula hospedeira procariótica quanto uma célula hospe-deira eucariótica, por exemplo, uma célula de mamífero.

De acordo com um aspecto adicional da invenção é provido ummétodo para tratamento de um animal, preferivelmente um ser humano, poradministração de um peptídeo da invenção compreendendo os componentes(I) e (II) e eventualmente o componente (III). É também provido o uso cor-respondente de tais peptídeos da invenção na fabricação de um produto pa-ra o tratamento ou prevenção de uma doença ou condição associada ao me-tabolismo da glicose. Exemplos não Iimitantes de distúrbio da glicose inclu-em: diabetes melito tipo I ou tipo Il (NIDDM) ou resistência à insulina, distúr-bios de peso e doenças ou condições associadas ao mesmo, onde tais dis-túrbios de peso ou condições associadas incluem obesidade, condições as-sociadas ao peso em excesso, desregulação da saciedade, níveis de insuli-na no plasma reduzidos, níveis aumentados de glicose no sangue ou massacelular beta pancreática reduzida. Preferivelmente, o uso de peptídeos dainvenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento do diabe-tes do tipo Il (NIDDM) é descrito aqui. Como uma conseqüência, a presenteinvenção se refere ao uso do peptídeo da invenção, por exemplo, para abai-xar o peso de um indivíduo, para reduzir a saciedade de um indivíduo, paraaumento dos níveis pós-prandiais de insulina no plasma em um indivíduo,para reduzir o nível de glicose no sangue em jejum em um indivíduo, paraaumentar a massa de célula beta pancreática em um indivíduo ou para tratardiabetes do tipo I ou Il em um indivíduo.

Os pacientes com outras doenças ou distúrbios podem ser tra-tados pelos peptídeos da invenção, isto é, peptídeos de fusão ou seus aná-logos, fragmentos, variantes ou derivados. Os peptídeos da invenção podemser usados para a preparação de um medicamento para o tratamento dedistúrbios neurodegenerativos e doenças ou condições associadas ao mes-mo e para o tratamento de distúrbios e doenças ou condições associadas àapoptose. O uso do peptídeo da invenção para tratar esses distúrbios resultado que se segue: receptores de GLP-1, que são acoplados à segunda via demensageiro AMP cíclica, são expressos através de todo os cérebros do roe-dores e seres humanos. A quimioarquitetura da distribuição de receptor nocérebro não apenas se correlaciona a uma norma central para GLP-1 naregulação da ingestão de alimentos e resposta ao estresse aversivo. Tam-bém foi mostrado que a ligação de GLP-1 ao seu receptor GLP-1 exercepropriedades neurotróficas, e oferece proteção contra apoptose induzida porglutamato e lesão oxidativa nas células neuronais cultivadas. Adicionalmen-te, GLP-1 mostrou modificar o processamento do precursor da proteína β-amilóide na cultura da célula e reduz dependente da dose os níveis de β-peptídeo amilóide no cérebro in vivo. GLP-1 é portanto, também conhecidocomo regulador do sistema nervoso central. Os peptídeos da invenção mi-metizando a atividade biológica de GLP-1 fisiologicamente ativo, possuemrelevância terapêutica no tratamento, por exemplo, da doença de Alzheimer(AD) e outras condições neurodegenerativas centrais e periféricas (por e-xemplo, esclerose lateral amiotrófica (ALS), doença de Alexander, doençade Alper1 Ataxia telangiectasia, doença de Canavan, síndrome de Cockayne1doença de Creutzfeldt-Jakob, Esclerose Múltipla, doença de Sandhoff, doen-ça de Pick1 Ataxia Espinocerebelar, doença de Schilder e doença de Parkinson).

Além disso, foi mostrado que GLP-1 fisiologicamente ativo exer-ce ação antiapoptótica em várias células, por exemplo, GLP-1 é benéfico àpreservação da massa e função de ilhotas humanas isoladas recentementeou outros tipos de célula. O peptídeo da invenção biologicamente ativo tam-bém pode ser usado para tratar distúrbios que são causados por apoptosecelular ou tecidual.

O emprego de um peptídeo da invenção pode ser para a fabri-cação de uma composição que é administrada exogenamente e compreendeo peptídeo da invenção isolado. A composição resultante pode ser usada,bem como para o tratamento dos distúrbios acima. Os distúrbios descritosaqui podem também ser tratados pelas células hospedeiras da invenção,ácido nucléico (moléculas) ou vetores ou ao invés disso, as células hospe-deiras da invenção, ácido nucléico (moléculas) ou vetores podem ser usadospara preparação de um medicamento para o tratamento desses distúrbios.

A preparação das formulações que contêm seqüências de pep-tídeo da invenção como ingredientes ativos é geralmente bem entendida natécnica, conforme exemplificado pelas Patentes U.S. números 4.608.251;4.601.903; 4.599.231; 4.599.230; 4.596.792; e 4.578.770 todas incorporadasaqui como referência. Tipicamente, tais formulações são preparadas comoinjetáveis, tanto como soluções ou suspensões líquidas, preferivelmentecontendo água (formulação aquosa) ou pode ser emulsionadas. O termo"formulação aquosa" é definido como uma formulação compreendendo pelomenos 50% em peso/peso de água. Da mesma forma, o termo "solução a-quosa" é definido como uma solução compreendendo pelo menos 50% pe-so/peso de água e o termo "suspensão aquosa" é definido como uma sus-pensão compreendendo pelo menos 50% peso/peso de água.

Para injeção intravenosa, cutânea ou subcutânea ou injeção nosítio de aflição, o ingrediente ativo estará na forma de uma solução aquosaparenteralmente aceitável, que é isenta de pirogênio e possui pH apropriado,isotonicidade e estabilidade. As composições farmacêuticas líquidas geral-mente incluem um veículo líquido, tal como água. Preferivelmente, o veículo5 líquido incluirá uma solução de salmoura fisiológica, dextrose etanol ou outrasolução de sacarídeo ou glicóis, tais como, etileno glicol, propileno glicol oupolietileno glicol ou combinações dos mesmos podem ser incluídas. Exem-plos adicionais são outros veículos isotônicos, tais como, injeção de Ringerou injeção de Ringer lactada.

Se a invenção se referir a uma formulação farmacêutica com-preendendo uma solução aquosa do composto de acordo com a presenteinvenção, e um tampão, onde o composto está presente em uma concentra-ção de 0,1 mg/mL ou acima, e onde a formulação possui um pH de cerca de2,0 a cerca de 10,0, preferivelmente de cerca de 7,0 a cerca de 8,5. Preferi-velmente, o pH da formulação é pelo menos uma unidade de pH do pontoisoelétrico do composto, de acordo com a presente invenção, mesmo maispreferível, o pH a formulação é de pelo menos 2 unidades de pH do pontoisoelétrico do composto, de acordo com a presente invenção.

Formas sólidas apropriadas para solução, ou suspensão emlíquido antes da injeção podem também ser preferidas. A formulação farma-cêutica pode ser uma formulação liofilizada, pelo que, o médico ou o pacien-te adiciona solventes e/ou diluentes antes do uso. Em outras palavras, aformulação, uma vez preparada, não é administrada imediatamente a umindivíduo. Ao invés disso, seguindo-se a preparação, ela é embalada paraarmazenamento em um estado congelado ou em uma forma seca para re-constituição posterior em uma forma líquida ou outra forma apropriada paraadministração a um indivíduo. Em outra concretização, a formulação farma-cêutica é uma formulação seca (por exemplo, liofilizada ou seca por pulveri-zação) pronta para uso, sem qualquer dissolução anterior. O termo "formaseca" se refere à composição farmacêutica líquida ou formulação sendo se-ca tanto por liofilização; vide, por exemplo, Williams e Polli (1984) J. Parente-ral Sei. Technol. 38: 48-59), secagem por pulverização (vide, Masters (1991)em Spray-Drying Handbook (5§ edição; Longman Scientific e Technical, Es-sez, Reino Unido), pp. 491-676; Broadhead e outros (1992) Drug Devei. Ind.Pharm. 18: 1169-1206; e Mumenthalere outros (1994) Pharm. Res. 11 : 12-20), ou secagem ao ar (Carpenter e Crowe (1988) Cryobiology 25: 459-470;e Roser (1991) Biopharm. 4: 47-53). A formação de agregados por um poli-peptídeo durante o armazenamento da composição farmacêutica líquida po-de afetar adversamente a atividade biológica daquele polipeptídeo, resultan-do em perda da eficácia terapêutica da composição farmacêutica. Adicio-nalmente, a formação de agregado por causar outros problemas, tais como,bloqueio da tubulação, membranas ou bombas quando a composição farma-cêutica contendo polipeptídeo é administrada usando um sistema de infusão.

É possível que outros ingredientes possam estar presentes naformulação farmacêutica do peptídeo da presente invenção. Tais ingredien-tes adicionais podem incluir agentes de umectação, emulsionantes, antioxi-dantes, agentes de volume, agentes de tamponamento de pH (por exemplo,tampões de fosfato ou citrato ou tampões), preservantes, agentes tensoati-vos, estabilizadores, modificadores de tonicidade, agentes quelantes, íonsmetálicos, veículos oleaginosos, proteínas (por exemplo, albumina de sorohumano, gelatina ou proteínas) e/ou um zwitteríon (por exemplo, um amino-ácido, tal como, betaína, taurina, arginina, glicina, Iisina e histidina).

Com relação aos estabilizadores para formulações da invençãoesses podem ser preferivelmente selecionados do grupo de polímeros depeso molecular alto ou compostos de peso molecular baixo. Em uma concre-tização adicional da invenção, o estabilizador é selecionado de polietilenoglicol (por exemplo, PEG 3350), álcool polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona,carbóxi-hidroxicelulose ou derivados da mesma (por exemplo, HPC, HPC-SL, HPC-L e HPMC), ciclodextrinas, substâncias contendo enxofre, tais co-mo, monotioglicerol, ácido tioglicólico e 2-metiltioetanol e sais diferentes (porexemplo, cloreto de sódio). Cada um desses estabilizadores específicosconstitui uma concretização alternativa da invenção. As composições farma-cêuticas podem também compreender agentes estabilizadores adicionais,que adicionalmente melhorar a estabilidade de um polipeptídeo ativo tera-pêutico. Os agentes estabilizadores de interesse específico da presente in-venção incluem, porém não estão limitados a metionina e EDTA1 que prote-gem o polipeptídeo contra oxidação por metionina e um agente tensoativonão iônico que protege o polipeptídeo contra agregação associada ao con-gelamento-descongelamento ou cisalhamento mecânico.

Com relação aos agentes tensoativos para formulações da in-venção, esses podem ser preferivelmente selecionados de um detergente,óleo de rícino etoxilado, glicerídeos poliglicolizados, monoglicerídeos aceti-lados, ésteres do ácido graxo sorbitano, polímeros de polioxipropileno-polioxietileno em bloco (por exemplo, poloxâmeros, tais como, Pluronie F68,poloxâmero 188 e 407, Triton X-100), ésteres do ácido graxo polioxietilenosorbitano, PEO e forma de estrela, derivados de polioxietileno e polietileno,tais como, derivados alquilados e alcoxilados (tweens, por exemplo, Tween-20, Tween-40, Tween-80 e Brij-35), polioxietilenohidroxiestearato, monogli-cerídeos ou derivados etoxilados dos mesmos, diglicerídeos ou derivados depolioxietileno dos mesmos, álcoois, glicerol, Iecitinas e fosfolipídeos (por e-xemplo, fosfatidil serina, fosfatidil colina, fosfatidil etanolamina, fosfatidil iso-nitol, difosfatidil glicerol e esfingomielina), derivados de fosfolipídeos (porexemplo, ácido dipalmitoilfosfatídico) e lisofosfolipídeos (por exemplo, palmi-toil lisofosfatidil-L-serina e ésteres de 1-acil-sn-glicero-3-fosfato de etanola-mina, colina, serina e treonina) e derivados de alquila, alcóxi (éster alquílico),alcóxi (éter alquílico) de Iisofosfatidila e fosfatidilcolinas, por exemplo, deri-vados de lauroíla e miristoíla de lisofosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolinae modificações do grupo principal polar, isto é, colinas, etanolaminas, ácidofosfatídico, serinas, treoninas, glicerol, inositol e DODAC, DOTMA, DCP,BISHOP carregados positivamente, Iisofosfatidilserina e Iisofosfatidiltreoninae glicerofosfolipídeos (por exemplo, cefalinas), gliceroglicolipídeos (por e-xemplo, galactopiransóide), esfingoglicolipídeos (por exemplo, ceramidas,gangliosídeos), dodecilfosfocolina, Iisolecitina de ovos de galinha, derivadosde ácido fusídico (por exemplo, tauro-dihidrofusidato de sódio), ácidos gra-xos de cadeia longa e sais dos mesmos C6-C12 (por exemplo, ácido oléico eácido caprílico), acilcarnitinas e derivados, derivados Ν'Χ-acilados de lisina,arginina ou histidina ou derivados acilados de cadeia lateral de Iisina ou deri-vados N-acilados de arginina de dipeptídeos compreendendo qualquer com-binação de lisina, arginina ou histidina e um aminoácido neutro ou ácido,derivado N-acilado de um tripeptídeo compreendendo qualquer combinação de aminoácido neutro e dois aminoácidos carregados, DSS (docusato desódio, registro CAS número [577-11-7]), docusato de sódio, registro CASnúmero [128- 49-4]), docusato de potássio, registro CAS número [7491-09-0]), SDS (dodecil sulfato de sódio ou Iauril sulfato de sódio), caprilato de só-dio, ácido cólico ou derivados do mesmo, ácidos biliares e sais dos mesmose glicina ou conjugados de taurina, ácido ursodesoxicólico, colato de sódio,desoxicolato de sódio, taurocolato de sódio, glicocolato de sódio, N-hexadecil-N,N-dimetil-3-amônio-1 -propanossulfonato, agentes tensoativosmonovalentes aniônicos (alquil-aril-sulfonatos), tensoativos zwitteriônicos(por exemplo, N-alquil-N,N-dimetilamônio-1 -propanossulfonatos, 3-colamido-1-propildimetilamônio-1 -propanossulfonato, agentes tensoativos catiônicos(bases amônio quaternário) (por exemplo, brometo de cetil-trimetilamônio,cloreto de cetilpiridínio), agentes tensoativos não iônicos (por exemplo, Do-decil-D-glicopiranosídeo), poloxaminas (por exemplo, Tetronic's) que sãocopolímeros de bloco tetrafuncionais derivados da adição seqüencial de óxi-do de propileno e óxido de etileno à etilenodiamina, ou o agente tensoativopode ser selecionado do grupo de derivados de imidazolina ou misturas dosmesmos. Cada um desses agentes tensoativos específicos constitui umaconcretização alternativa da invenção. O uso de um agente tensoativo nasformulações farmacêuticas é bem-conhecido de um versado na técnica. Pa-ra conveniência, é feita referência a Remington: The Science e Practice ofPharmacy, 19-edição, 1995.

Com relação aos preservantes farmaceuticamente aceitáveis,esses podem ser selecionados, preferivelmente, do grupo consistindo emfenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metila, p-hidroxibenzoato de propila, 2-fenoxietanol, p-hidroxibenzoato de butila, 2-feniletanol, álcool benzílico, etanol, clorobutanol e tiomerosal, bronopol, áci-do benzóico, imiduréia, clorexidina, desidroacetato de sódio, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etila, cloreto de benzetônio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropano-1,2-diol) ou misturas dos mesmos.

Com relação aos agentes isotônicos, esses podem ser preferi-velmente selecionados do grupo consistindo em um sal (por exemplo, cloretode sódio), um açúcar ou álcool de açúcar, um aminoácido (por exemplo, L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, tre-onina), um alditol (por exemplo, glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propile-noglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietilenoglicol (por exemplo,PEG400) ou misturas dos mesmos. Qualquer açúcar, tal como, mono, di oupolissacarídeo ou glucanos solúveis em água, incluindo, por exemplo, fruto-se, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose, lactose, sacarose, trehalose,dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, amido solúvel, amido hidroxietilae carboximetilcelulose-Na pode ser usado. Em uma concretização, o aditivode açúcar é sacarose. O álcool de açúcar é definido como hidrocarbonetoC4-C8 possuindo, pelo menos, um grupo OH e inclui, por exemplo, manitol,sorbitol, inositol, galacititol, dulcitol, xilitol e arabitol. Em uma modalidade, oaditivo de álcool de açúcar é manitol. Os açúcares, ou álcoois de açúcarmencionados acima podem ser usados individualmente ou em combinação.Não existe limite fixo para a quantidade usada, à medida que o açúcar ouálcool de açúcar seja solúvel na preparação líquida e não afete adversamen-te os efeitos de estabilização obtidos usando os métodos da invenção.

Com relação aos agentes quelantes, esses podem ser preferi-velmente selecionados de sais de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA),ácido cítrico e ácido aspártico e misturas dos mesmos.

Com relação aos tampões, esses são preferivelmente selecio-nados do grupo consistindo em acetato de sódio, carbonato de sódio, citrato,glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, fosfato de sódio diidrogenado,fosfato de dissódio hidrogenado, fosfato de sódio e tris(hidroximetil)-aminometano, hepes, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maléico,ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico ou misturas dos mesmos.Cada um desses tampões específicos constitui uma concretização alternati-va da invenção.O uso de todos os aditivos mencionados acima nas composi-ções farmacêuticas contendo o peptídeo terapêutico da invenção é bem-conhecido dos versados na técnica, especificamente com relação às faixasde concentração dos mesmos. Para conveniência, é feita referência à Re-mington: The Science e Practice of Pharmacy, 19ê edição, 1995.

As formulações contendo o peptídeo da invenção são conven-cionalmente administradas parenteralmente, por injeção, por exemplo, tantosubcutânea, intradérmica, subdérmica ou intramuscularmente. Uma compo-sição para administração parenteral do peptídeo da invenção pode ser pre-parada, por exemplo, conforme escrito no WO 03/002136.

Formulações adicionais que são apropriadas para outros modosde administração incluem supositórios e, em alguns casos, formulações o-rais, bucais, sublinguais, intraperitoneais, intravaginais, anais e intracrania-nas. Para os supositórios, os aglutinantes e veículos tradicionais podem in-cluir, por exemplo, polialquileno glicois ou triglicerídeos; tais supositórios po-dem ser formados de misturas contendo o ingrediente ativo na faixa de 0,5%a 10%, preferivelmente 12%. As formulações orais incluem os excipientesempregados normalmente, tais como, por exemplo, classificações farmacêu-ticas de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio,celulose, carbonato de magnésio e similares. Essas composições tomam aforma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulaçõesde liberação prolongada ou pós e contêm 10-95% do ingrediente ativo, pre-ferivelmente 25-70%.

Conforme mencionado acima, os métodos farmacêuticos adicio-nais podem ser empregados para controlar a duração da ação. As prepara-ções de liberação controlada podem ser obtidas por emprego de polímerospara complexação ou absorção de um peptídeo da presente invenção. Aliberação controlada do ingrediente ativo (peptídeo) pode ser exercida porseleção das macromoléculas apropriadas (por exemplo, poliésteres, poliami-noácidos, polivinilpirrolidona, copolímeros de acetato etileno vinila, metilcelu-lose, carboximetilcelulose e sulfato de protamina), a concentração das ma-cromoléculas bem como os métodos de incorporação. Tais ensinamentossão descritos em Remington1S Pharmaceutical Sciences (vide acima). Outrométodo possível para controlar a duração da ação por preparações de libe-ração controlada é a incorporação de um peptídeo da presente invenção àspartículas do material polimérico, tais como, poliésteres, poliaminoácidos,hidrogéis, poli(ácido láctico) ou copolímeros de acetato etileno vinila.

Os peptídeos da invenção podem ser formulados como formasneutras ou de sal. Um peptídeo da presente invenção pode ser suficiente-mente ácido ou suficientemente básico para reagir com qualquer uma devárias bases orgânicas e inorgânicas e ácidos orgânicos e inorgânicos, paraformar um sal (de adição), por exemplo, formado com os grupos amino livresdo peptídeo. Os ácidos geralmente empregados para formar os sais de adi-ção de ácido são ácidos inorgânicos, tais como, ácido clorídrico, ácido bro-mídrico, ácido iodrídico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico e similares e ácidosorgânicos, tais como, tartárico, ácido asp-toluenossulfônico, ácido metanos-sulfônico, ácido oxálico, ácido mandélico, ácido p-bromofenil-sulfônico, ácidocarbônico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzóíco. Exemplos de taissais incluem sulfato, pirossulfato, bissufato, sulfito, bissulfito, fosfato, mono-hidrogenfosfato, dihidrogenfosfato, metafosfato, pirofosfato, cloreto, brometo,iodeto, acetato, propionato, decanoato, caprilato, acrilato, formato, isobutira-to, caproato, heptanoato, propiolato, oxalato, malonato, succinato, suberato,sebacato, fumarato, maleato, butina-1,4-dioato, hexina-1,6-dioato, benzoato,clorobenzoato, metilbenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxiben-zoato, ftalato, sulfonato, xilenossulfonato, fenilacetato, fenilpropionato, fenil-butirato, citrato, lactato, gama-hidroxibutirato, glicolato, tartrato, metanossul-fonato, propanossulfonato. Os sais formados com os grupos carboxila livrepodem também ser derivados de bases inorgânicas, tais como, por exemplo,hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férricos e bases orgânicas,tais como, isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procai-na e similares. Os sais de adição de ácido, sais de carboxilato, ésteres alqui-Ia inferiores e amidas dos peptídeos da invenção podem ser formulados deacordo com WO 91/11457 (1991); EP O 733 644 (1996); e U.S. 5.512.549(1996).Formulações contendo as seqüências do peptídeo da invençãosão administradas de modo compatível com a formulação de dosagem, e emtal quantidade que seja terapeuticamente eficaz. A quantidade a ser adminis-trada depende do indivíduo a ser tratado, incluindo, por exemplo, a gravida-de da doença do paciente. Faixas de dosagem apropriadas são, por exem-plo, da ordem de várias centenas de microgramas de ingrediente ativo pordose terapêutica com uma faixa preferida de cerca de 0,1 μg a 2.000 μg(mesmo que quantidades maiores na faixa de 1-10 mg sejam contempla-das), tais como na faixa de cerca de 0,5 μg a 1.000 μg) preferivelmente nafaixa de 1 μg a 500 μg e especialmente na faixa de cerca de 10 μg a 100 μg.

Formulações contendo os peptídeos da invenção mais por e-xemplo, excipientes adicionais, por exemplo, glicina e manitol ou outros adi-tivos, podem ser comercializados em uma forma Iiofilizada como ampolas.Uma ampola anexa contendo diluente é provida, o que permite ao pacientereconstituir o produto a uma concentração desejada antes da administraçãoda dose. As formulações da invenção podem também ser comercializadasde outros modos conhecidos, tais como, seringas pré-enchidas.

A invenção é ilustrada adicionalmente pelos exemplos anexos.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Criação de construções genéticas

A seqüência de codificação para DNAc de GLP-1(7-37) foi sinte-tizada sinteticamente, em uma seqüência incluindo sítios Hincll e EcoRI con-forme indicado na figura 1 a. Separadamente o cDNA ilustrado na figura 1 bfoi sintetizado, incluindo as seqüências de codificação para GLP-1(7-37), IP2e sítios de restrição para Sfol, EcoRI e Xbal, conforme ilustrado na figura 1b.De modo a direcionar GLP-1 para a via secretora, foi empregada a seqüên-cia de sinal heteróloga de estromelisina 3 (Número de acesso NM_005940).Portanto o DNAc, codificando a seqüência de sinal e seqüência líder de es-tromelisina foi PCR de transcriptase inversa ampliada de RNA humano eempregada com a construção da figura 1 a ou figura 1 b para formar a cons-trução mostrada na figura 1c e figura 1d, respectivamente.O fragmento Hincll/EcoRI da construção da figura 1a é clonadono sítio Sfol da seqüência da figura 1d para formar a construção da figura1e. De modo similar, o fragmento EcoRI da figura 1d é clonado no sítio Eco-Rl de um plasmídeo de expressão eucariótico, para produzir a construçãomostrada na figura 1f. Para formar a construção mostrada na figura 1 g, ofragmento Hincl l/Xbal da construção mostrada na figura 1b é clonado repeti-tivamente no sítio Sfol/Xabl da construção mostrada na figura 1d. A figura 1hmostra uma seqüência otimizada de códon, sintetizada, codificando as se-qüências líder e de sinal de estromelisina interrompidas pela seqüência deíntron endógena encurtada, fundida às seqüências codificando [GLP-1 (7-37), IP2 e GLP-2(1-35) humanos. A seqüência de DNA da construção figura1h é a Seqüência de id número: 16, enquanto a Seqüência de id número: 15também mostra a seqüência do peptídeo traduzido.

Também são sintetizadas as seqüências nas figuras 1i e 1j. Es-sas são então empregadas para formar a construção da figura 1 k, por clona-gem do fragmento Nael/BssHII da figura 1j na seqüência Nael/BssHII Iineari-zada da figura 1h. A seqüência de DNA da construção figura 1k é a Seqüên-cia de id número: 14, enquanto a Seqüência de id número: 13 também mos-tra a seqüência do peptídeo traduzido. A construção da figura 11 é formadapor digestão de BssHII e religação da seqüência da figura 1h. A seqüênciade DNA da construção da figura 11 é Seqüência de id número: 18, enquantoa Seqüência de id número:17 também mostra a seqüência do peptídeo tra-duzido. A construção da figura 1 m é formada por clonagem o fragmento A-fel/BssHII da seqüência da figura 1i na seqüência Iinearizada de Afel/BssHIIda figura 1 h. A seqüência de DNA da construção da figura 1 m é a Seqüênciade id número: 20, enquanto a Seqüência de id número:19 também mostra aseqüência do peptídeo traduzido.

As construções acima podem ser fabricadas por um versado natécnica usando técnicas de rotina.

EXEMPLO 2

Transfecção, seleção clonal e expressão de GLP-1 das célulasde mamíferosFonte das células: HEK293 (linhagem de células dos rins, em-brionárias, humanas, N9 ACC 305, DSMZ Cell Culture Collection, Alema-nha), AtT20 (linhagem de células tumorais da glândula pituitária de Camun-dongo LAF1, N987021902, European Cell Culture Collection, Reino Unido),células hTERT-MSC geradas pelo Prof. Kassem1 University Hospital of O-dense, Dinamarca.

Para transfêcção de 106 células, foram empregados 0,5-2 μg deDNA de plasmídeo com construções diferentes de GLP-1. As construçõesforam geradas conforme descrito no Exemplo 1. Células HEK293 foramtransfectadas pelo método padrão de coprecipitação de fosfato de cálcioconforme descrito em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel e ou-tros 1994ff Harvard Medicai School Vol 2., Unidade 9.1). Células AtT20 fo-ram transfectadas empregando FuGene (Roche) conforme descrito em Cur-rent Protocols in Molecular Biology (Ausubel e outros, 1994ff, Harvard Medi-cal School Vol 2., Unidade 9.4). A transfêcção das células hTERT-MSC foirealizada usando a tecnologia Nucleofector (Amaxa), um método não viróticoque se baseia na combinação de parâmetros elétricos e soluções especifi-cas de tipo de célula. Quando do emprego do dispositivo Nucleofector (pro-grama C17) e da solução Nucleofector VPE-1001, eficiências de transfêcçãosuperiores a 60% foram obtidas. Quarenta e oito horas após a transfêcção, aseleção dos clones de células com integração estável de DNA no cromos-soma foi realizada por adição de agente seletivo blasticidina (2 μg/mL) nomeio de cultura. Doze a quinze dias mais tarde, os clones de células trans-fectadas estáveis seriam isolados e expandidos por caracterização.

A expressão transiente das construções GLP-1 diferentes foimedida nas células hTERT-MSC e HEK293. Considerando-se que apenasum nível marginal de GLP-1 ativo pode ser encontrado nas construções mo-noméricas de GLP-1 NQ103 e NQ317 (possuindo apenas uma cópia de GLP-1(7-37) um enorme ganho na expressão pode ser encontrado na construçãode GLP-1 dimérica Ns217 (possuindo GLP-1 (7-37) como o componente (I) ecomo o componente (III)) ambos nas células hTERT-MSC e HEK293. Osresultados são resumidos na figura 2. Um alongamento da construção para aconstrução de GLP-1 N9159 (possuindo quatro cópias de IP2 como o com-ponente (II) resulta em um aumento adicionalmente significativo (não mos-trado). Após transfecção das células hTERT-MSC com diferentes constru-ções, os clones foram selecionados, o que expressa estavelmente GLP-1.

Os níveis de expressão são mostrados na Tabela 1.

TABELA 1

<table>table see original document page 41</column></row><table>

EXEMPLO 3

Análise Western Blot de peptídeos GLP-1, secretados das célu-las de mamíferos.

O sobrenadante de cultura de células das células secretandoGLP-1 foi separado em um gradiente de 10%-20% SDS PAGE (120V, 90minutos) e transferido para uma membrana PVDF (Membrana Immobilon-P0,45 μm Millipore IPVH 00010) por manchamento semi-seco (2,0 mA/cm2, 60minutos). Após fixação de metanol e bloqueio (3% (peso:volume) BSA, 0,1%(v:v) Tween-20 em TBS) a membrana foi immunoblotted com anticorpo anti-GLP-1 de 1 μg/mL (HYB 147-12, Antibodyshop) a 4°C o/n. Após lavagem eincubação com 0,02 μg/mL de anticorpo de detecção (IgG anticamundongo,HRP conjugado, Perkin Elmer PC 2855-1197) a temperatura ambiente por 4horas, a detecção de quimioluminescência mostra a localização da proteína.

A Análise Western é mostrada na figura 3 (1:100 ng de GLP-1(7-37) sintético dissolveram em sobrenadante de células hTERT-MSCtransfectadas com mock; 2: sobrenadante das células hTERT-MSC (clone79TM217/13) secretando GLP-1 dimérico da construção N9217, 3: sobrena-dante das células AtT20 (clone 81-A-217/3) secretando GLP-1 dimérico daconstrução N9217; M: marcador de proteína pré-manchado [kDa]). Os resul-tados mostram que os peptídeos da invenção contendo GLP-1 (7-37) e umapêndice de término C (2 e 3 na figura 3) são secretados das linhagens decélulas transfectadas e podem ser detectados usando um anticorpo anti-GLP-1, que se liga aos epítopos de meia molécula de GLP-1 (7-37).

EXEMPLO 4

Estabilidade do plasma in vitro para peptídeos de GLP-1 secre-tados das células humanas

Células HEK293 e hTERT-MSC foram transfectadas transien-temente com construções, codificando a seqüência de sinal de estromeisinaheteróloga, que é ligada às variantes de GLP-1 codificando os peptídeos quese seguem:

1: GLP-1 (7-37)2: GLP-1 (7-37)-IP2-estendido com 11 AA3: GLP1(7-37)-IP2-GLP1(7-37)

Sobrenadante de cultura de célula, contendo peptídeos GLP-1secretados dos células ou GLP-1 (7-37) (Bachem) sintético, foi incubado emum plasma enriquecido com linfócitos humanos contendo atividade dipepti-dilpeptidase a 37°C e CO2 a 5% por 3 ou 4 horas. GLP-1 (7-37) sintético nosobrenadante de células transfectadas mock foi usado como um controlepositivo para atividade de DPP-IV, que mostrou ser inibida por um inibidorDPP-IV (N-DPP4, Biotrend). GLP ativo foi medido usando o GLP-1 (Active)ELISA (NSEGLP-35K, Biotrend), empregando um anticorpo que se liga aoepítopo de término N de GLP-1 (7-37) discriminando o peptídeo GLP-1 (9-37) inativo, degradado por DPP-IV.

Os resultados são mostrados nas figuras 4 (células HEK293) e 5(células hTERT-MSC). As células HEK293 e hTERT-MSC são ambas hos-pedeiros eficazes para a construção de genes. A numeração dos resultadospara as células transfectadas dos tipos 1 a 3 é como no Exemplo 3 (1:1 OO ngde GLP 1(7-37) sintético dissolvido no sobrenadante das células hTERT-MSC transfectadas com mock, 2: subrenadante das células hTERT-MSC(clone 79TM217/13) secretando GLP-1 dimérico da construção NQ217, 3:sobrenadante das células AtT20 (clone 81-A-217/3) secretando GLP-1 dimé-rico da construção N9217). Enquanto a construção 1 produz GLP-1 do tiposelvagem, que é inativado por DPP-IV, em um modo similar ao GLP-1 sinté-tico, as formas de GLP-1 alongadas terminalmente em C da invenção (2 e 3na figura 4, 3 na figura 5) são mais resistentes à degradação e mantêm pelomenos 40% da atividade. Os peptídeos GLP-1 estendidos de término C sãosignificativamente estabilizados no plasma humano in vitro. O peptídeo coma seqüência GLP-1 dimérica (3) é quase que completamente estabilizadoquanto a degradação por DPP-IV in vitro.

EXEMPLO 5

Análise Western Blot dos peptídeos GLP-1Vários peptídeos GLP-1 foram produzidos sinteticamente porfase sólida (sin) ou recombinante usando E.coli (rec). Os peptídeos GLP-1(31 ng SEQ ID No:1 e 10 ng de cada SEQ ID No:6, SEQ ID No:7, SEQ IDNo:8) foram separados em um SDS PAGE de gradiente 10-20% (120V, 90minutos) e transferidos para uma membrana PVDF (Immobilon-P Membran0,45 μηη Millipore IPVH 00010) por manchamento semiseco (2,0 mA/cm2, 60minutos). Após fixação de metanol e bloqueio (3% (peso:volume) BSA1 0,1%(v:v) Tween-20 em TBS) a membrana foi imunoblotted com 1 μg/mL de anti-corpo anti-GLP-1 (HYB 147-12, Antibodyshop) a 4°C o/n. Após lavagem eincubação com 0,02 μg/mL de anticorpo de detecção (IgG anticamundongo,conjugado HRP, Perkin Elmer PC 2855-1197) a temperatura ambiente por 4horas, a detecção da quimioluminescência descreve a localização da proteí-na. A figura 6 mostra um Western Blot para os peptídeos indicados. Os valo-res que se seguem podem ser fornecidos: Seqüência de id número: 1 (ID1sin) corresponde ao GLP- 1(7-37), 31 aa, 3,3 kD; Seqüência de id número:8(ID8 sin, CM3) corresponde ao GLP-1 (7-37)-IP2, 46 a, 5,1 kD; Seqüênciade id número: 7 (ID7rec, CM2) corresponde ao GLP-1 (7-37)-IP2-RR-GLP2,83 a, 9,4 kD; Seqüência de id número: 6 (ID6 sin, CM1) corresponde aoGLP-1 (7-37)-IP2-RR-GLP1 (7- 37), 79 a, 8,7 kD.EXEMPLO 6

Estabilidade dos peptídeos GLP-Icm no plasma humano in vitro

Os peptídeos GLP-1 sintéticos (SEQ ID No:1Sin, SEQ ID No:6Sin,

SEQ ID No:7rec, SEQ ID No:8Sin) foram incubados em concentrações de 20ng/mL com plasma humano a 37°C e CO2 a 5% por 3 horas. A atividade dedipeptidilpeptidase do plasma foi inibida por um inibidor DPP-IV (NQDPP4,Biotrend). GLP ativo foi medido usando o GLP-1 (Active) ELISA (N5EGLP-35K, Biotrend).

Em contraste com o GLP-1 (7-37) nativo (SEQ ID No:1) os peptí-deos GLP-1 alongados no término C SEQ ID No:6, SEQ ID No:7, e SEQ IDNo:8 são significativamente estabilizados no plasma humano in vitro (figura7). Como controle são mostrados (no lado direito), os resultados obtidos pa-ra experimentos com a adição de DPP-IV. A atividade de GLP-1 é comple-tamente mantida nesses experimentos de controle.

EXEMPLO 7

Bioensaio in vitroProdução cíclica de AMP

Células RIN-5F (célula tumoral ilhota de rato; ECACC Número95090402) foram desenvolvidas em placas de 24 cavidades por 4 dias, al-cançando 70% de confluência. As células foram lavadas duas vezes comDMEM (E15-009, PAA) antes da adição de 0,5 mL de DMEM (E15-009, PA-A) suplementado com 1% HSA (Aventis)1 0,2 mM de IBMX (858455, Sigma)e os peptídeos de teste. Após uma incubação de 20 minutos a 25°C, as cé-lulas foram lavadas duas vezes com PBS resfriado em gelo. AMPc celular foiextraída por adição de 0,1 N HCI contendo Triton X-100 a 0,5%. AMP cíclicafoi quantificada usando AMPc (pH baixo) EIA (Cat. DE0355, R&D). Para es-timulação foram usadas 3*10 8 M SEQ ID No:1, SEQ ID No:6sin, SEQ IDNo:6rec, SEQ ID No:7rec, SEQ ID No:8sin.

Os resultados são mostrados na figura 8. A produção de AMPca 100% corresponde à produção basal na ausência de GLP-1. GLP-1 se ligaaos receptores acoplados à proteína e estimula a produção de AMPc. Todasas moléculas testadas aumentam a produção AMPc celular.

EXEMPLO 8

Bioatividade in vivo

Camundongos diabéticos do tipo Il com onze semanas de vida

(C57BL/Ks-Leprdb/db, Harlan) foram tratados com 5 μg de peptídeo por inje-ção subcutânea, duas vezes ao dia, às 9 horas da manhã e 5 horas da tarde(n=5 por grupo). A glicose no sangue foi medida antes (dia 0) e após o tra-tamento com os peptídeos GLPcm (Dia 2, 4, 7, 10) a 10 horas da manhã a-pós um período de jejum por toda a noite. Os dados foram apresentados emrelação aos níveis de glicose no sangue medidos no dia 0.

Todos os peptídeos da invenção testados (Seqüência de id nú-mero:6 (sintéticos ou recombinantes) e Seqüência de id número:7 (sintéticosou recombinantes) tiveram um efeito de anti-hiperglicemia. Os melhores re-sultados foram obtidos com Seqüência de id número:6 (CM1) e Seqüênciade id número:8 sintética (CM3). Na figura 9 (eixo y) o efeito relativo do trata-mento é mostrado. A glicose no sangue no dia 0 foi estabelecida como sen-do 1. Os animais não tratados sofreram aumento contínuo no nível de glico-se no sangue com o tempo, considerando-se que os animais tratados comos peptídeos da invenção mostram, a grosso modo, uma diminuição contí-nua do nível de glicose no sangue com o tempo.

EXEMPLO 9

Medição da estabilidade do plasma in vitro de peptídeosGLPIcm (método de teste cinético)

Alíquotas de 1 μΜ de peptídeo em tampão de incubação (50mMde TrietanoIamin-HCI (pH 7,8), 0,2% HSA) de CM3, análogos de CM3 substi-tu idos com alanina (CM3-ANA01, CM3-ANA02, CM3-ANA03, CM3-ANA04),análogos de CM3 encurtados no término C (CM3-ANA06, CM3-ANA07) ouanálogos CM3 alongados no término C (CM3-ANA09) foram incubados complasma humano a 10% a 37°C e CO2 a 5% por 0, 3, 6 e 9 horas. A atividadede dipeptidilpeptidase foi parada por adição do inibidor DPPIV (NsDPP, Bio-trend) e os níveis ativos de GLP-1 determinados usando o GLP-1 (Active)ELISA (N9EGLP-35K, Linco). Os resultados são de triplicatas em pelo menosdois experimentos independentes.

Os peptídeos da invenção possuindo pelo menos nove aminoá-cidos adicionados ao término C de GLP-1 são CM3 (murino, GLP-1 (7-37)-IP2) e derivados dos mesmos com seqüências modificadas no componente(II) (IP2), isto é, CM3-ANA01, CM3-ANA01, CM3-ANA02, CM3-ANA03,CM3- ANA04, CM3-ANA05, CM3-ANA07, CM3-ANA07. Os peptídeos GLP-1e CM3-ANA06 refletem substâncias de controle ou referência.

A figura 10 mostra a porção ativa do GLP-1 ativo como umaporcentagem do valor Oh (Oh = 100%). É claramente visto que GLP-1 possuia pior estabilidade de plasma com apenas 9% remanescentes após exposi-ção ao plasma de 9h. CM3-ANA01 mostra os melhores valores de estabili-dade com 84% do material remanescente após 9h. Os peptídeos da inven-ção possuem um restante de pelo menos 30% após 9h, considerando-seque os peptídeos com extensões menores não alcançam esses valores. Apartir da cinética, um tempo pode ser determinado, que é necessário paradegradar GLP-1 ativo a 80% do valor Oh (DT80: 80% do tempo de degrada-ção) para as substâncias testadas.

Seqüências listadas por valores DT8Q crescentes:

<table>table see original document page 46</column></row><table>

As substâncias da invenção mostram uma estabilidade do plas-ma in vitro consideravelmente mais longa quando comparadas às substân-cias de referência. Sem estar ligado a qualquer teoria, o alongamento dotérmino C de GLP-1 introduz um impedimento estérico, prevenindo essesanálogos de entrar no sítio ativo do DPPIV e assim escapam à degradação,considerando-se que substâncias de referência mais curtas não mostramesse efeito de proteção para estabilidade de GLP-1. Essa hipótese é supor-tada pela estabilidade continuamente crescente de alongamentos de términoC cumulativos dos peptídeos CM3-ANA06 (36aa), CM3-ANA07 (40aa) eCM3 (46aa). Não obstante, esse fenômeno não depende apenas do númeropuro de aminoácidos, que foi mostrado pelas substituições de Alanina naregião IP2 de CM3. O peptídeo CM3-ANA03 que possui o mesmo númerode aminoácidos como CM3, possui uma estabilidade fortemente reduzida emcomparação ao CM. Por outro lado, CM3-ANA01, que também consiste em46 aminoácidos, possui uma estabilidade do plasma superior a CM3. Issopode indicar que, além do número de aminoácidos, efeitos estéricos adicio-nais podem influenciar a estabilidade. São especificamente preferidos ospeptídeos possuindo um alongamento compreendendo IP2 no término C deGLP-1 ou um alongamento possuindo um determinado grau de homologiacom IP2, que pode resultar de uma conformação específica, que impede aregião de término N de entrar no sítio ativo de DPPIV.

EXEMPLO 10

Estudo in vivo - Imunogenicidade

Para elucidar a imunogenicidade em potencial da substância deteste CM1, um estudo sobre camundongos foi realizado em Parabioscience(Groningen, Alemanha). A experiência foi realizada em camundongosBALB/c recebendo 5 injeções repetidas (70 μg peptídeo/dose, i.v.) por 22d(n=5).

CMIsin não induziu toxicidade e apenas uma resposta de anti-corpo de célula T e titulação de anticorpo mínima conforme mostrado na fi-gura que se segue. Um efeito imunológico de subprodutos (pureza do peptí-deo apenas 95%) não pode ser excluído. A figura 11 mostra estudos de ava-liação dos efeitos imunogênicos em potencial de CMIsin. No lado esquerdo(figura 11 A), são mostrados os resultados de ensaio de resposta de chama-do de volta da célula T. Os baços dos camundongos tratados e de controleforam explicados, as células T isoladas e estimuladas com quantidadescrescentes de antígeno. A resposta de chamado de volta proliferativa é me-dida. No lado direito (figura 11B), foi determinada a titulação de anticorpoIgG específica de antígeno no imunosoro dos animais.EXEMPLO 11

Estudo de eficácia de dose no camundongo diabéticoApós um período de duas horas de repouso, camundongosC57BL/KsJ@Rj-db (db/db) diabéticos foram tratados com cinco concentra-ções diferentes de GLP-1, CM1, CM3, CM3-ANA01 e exendina-4. Um sextogrupo foi tratado apenas com salmoura. Sete animais foram tratados porgrupo. A glicose no sangue foi determinada de sangramentos na cauda dire-tamente antes, 1 hora e 4 horas após a injeção.

Os resultados são mostrados em curvas de resposta de dose deacordo com a figura 12 (figura 10A (GLP-1), figura 12B (CM1), figura 12C(CM3) e figura 12D (CM3-ANA01)). Para cada substância de teste, foi prepa-rado um gráfico com diferença de porcentagem da glicose no sangue emrelação aò valor de partida das concentrações diferentes. O valor ED50 paraas substâncias de teste diferentes foi determinado por preparação de umacurva de resposta de dose com os valores de medições de 1h como umaredução da porcentagem, em comparação ao valor basal. Para avaliar o va-lor de ED50 para GLP-1, CM3-ANA01, CM3rec e Exendina-4, o modelo Mor-gan-Mercer-Flodin (MMF) foi usado, para CM1 o modelo Richards foi usado.Ambos os modelos são modelos de fixação sigmóide para avaliação de res-posta de dose. Para cada peptídeo os valores ED50 de glicose no plasma(dose s.c. simples em μg/camundongo) foram determinados da diminuiçãode porcentagem da glicose no sangue. Eles são resumidos na Tabela 1.

TABELA 1:

<table>table see original document page 48</column></row><table>

Deduzidos dos valores de ED50, os análogos de GLP-1 CM1,CM3 e CM3-ANA01 se descrevem mais de cerca de 20 vezes melhores nabioatividade in vivo, que é mais provavelmente um resultado da estabilidadedo plasma melhorado.Todos peptídeos testados conduzem a uma diminuição significa-tiva dos níveis de glicose no sangue no camundongo db/db hiperglicêmicopelo menos para as maiores concentrações. A diminuição da glicose noplasma após uma injeção s.c. simples de 1,1 a 3,0 nmols de peptídeo (ver-sus controle) é resumida na Tabela 2. A tabela 2 exibe os efeitos de diminui-ção da glicose das substâncias de teste (versus controle). A queda na glico-se do plasma e os níveis significativos correspondentes são fornecidos peloperíodo de tempo de 1 hora (@1h) e 4 horas (@4h), após injeção do peptí-deo. As diferenças foram observadas na eficácia de longo prazo dos peptí-deos. Apenas exendina-4 e CM3 revelaram uma diminuição significativa dosníveis de glicose no sangue após 4 horas.

TABELA 2:

<table>table see original document page 49</column></row><table>

EXEMPLO 12

Tratamento de longo prazo do camundongo db/db

Quatro grupos com camundongos n=12 C57BL/KsJ@ Rj-db(db/db) foram investigados:

Grupo A: tratamento com veículo (0,9% salmoura) uma vez ao dia

Grupo B: tratamento com 24 nmols/kg de substância de teste 1:CMIrec uma vez ao dia

Grupo C: tratamento com 24 nmols/kg de substância de teste 2:CM3-ANA01 uma vez ao diaGrupo D: tratamento com 24 nmols/kg de substância de referên-cia exendina-4 (conhecida na técnica e aprovada (contudo, a exendina-4 nãoé um análogo de GLP-1) uma vez ao dia.

Os peptídeos ou veículo serão fornecidos uma vez ao dia (grupoA-D) entre 14 e 15 horas, subcutaneamente, na dobra da pele das costas. Oregime continuou por 18 semanas. Da décima segunda à décima oitava se-manas, o tratamento foi realizado duas vezes ao dia em 6 de 12 animais porgrupo.

Vários parâmetros dos camundongos foram investigados, isto é,estado da doença (1), peso corpóreo (2), consumo de alimentos (3), glicoseno sangue (4), teste de tolerância à glicose (5), dados da insulina (6), hemo-globina glicosilada (7), patologia (8) e reestimulação das células T (9).Estado de saúde (1) era bom em todos os grupos, nenhum efeito colateraldo tratamento foi observado.

Peso corpóreo (2) era mais baixo e todos os grupos tratados,após 18 semanas de tratamento (figura 13). O aumento do peso corpóreorelativo é significativamente menor no grupo CM3-ANA01. A figura 13A mos-tra o efeito de um tratamento com salmoura (A), CM1 (B), CM3-ANA01 (C)ou exendina (D) no peso corpóreo do camundongo db/db. Os valores médiosde 12 animais por grupo foram colocados em gráfico. A figura 13B mostra oefeito de um tratamento com salmoura (A), CM1 (B), CM3-ANA01 (C) ouexendina (D) no peso corpóreo dos camundongos db/db. O aumento de pe-so corpóreo relativo de 12 animais por grupo após um tratamento de 122dias foi colocado em gráfico. Apenas o tratamento com substância de testeCM3-ANA01 (grupo B) revelou um aumento de peso significativamente me-nor (p<0,001).

Consumo de alimentos (3) foi significativamente inferior no gru-po CM1 e CM3-ANA01 em comparação ao controle. A figura 14 mostra oefeito de um tratamento com salmoura (A), CM1 (B), CM3-ANA01 (C) ouexendina (D) no consumo de alimentos semanal dos camundongos db/dbdurante um período de tratamento de 122 dias. O consumo de alimentosrelativo por camundongo é significativamente aumentado no grupo B ou C(ρ< 0,001).

Níveis de glicose no sangue (4) foram determinados em váriassituações. O nível de glicose no sangue quando não em jejum (1 hora apósinjeção de peptídeo) é mostrado na figura 15A, isto é, o efeito de um trata-mento com salmoura (A), CM1 (B), CM3-ANA01 (C) ou exendina (D) nosníveis de glicose no sangue quando não em jejum. A glicose no sangue foimedida com um sangramento na cauda 1 hora após injeção subcutânea desalmoura (A) ou os peptídeos CM1 (B), CM3-ANA01 (C) ou exendina (D) emuma concentração de 24 nmols/kg. Em comparação ao controle, o nível deglicose no sangue quando não em jejum, 1 hora após injeção de peptídeos.c. é reduzido para 55% no grupo B, 51% no grupo C e 60% no grupo D(figura 15B). A diminuição da glicose no sangue dos grupos tratados é alta-mente significativa (p < 0,0001).

O nível de glicose no sangue em jejum (18 horas após injeçãode peptídeo) é mostrado na figura 15C, isto é, o efeito de um tratamento comsalmoura (A), CM1 (B), CM3-ANA01 (C) ou exendina (D) nos níveis de glico-se no sangue em jejum. A glicose no sangue foi medida com um sangramen-to na cauda após um jejum de 12 horas por toda a noite, 18 horas após inje-ção subcutânea das substâncias de teste. O nível de glicose no sangue emjejum 18 horas após injeção de peptídeo é reduzido no grupo CM1 e CM3-ANA01.

Um teste de tolerância a glicose (5) i.p. (IPGTT) foi conduzidoapós 8 semanas de tratamento em camundongos dos grupos A-D. O valorda glicose basal no sangue (0 min) de animais a 12 horas em jejum foi de-terminado por sangramento na cauda, seguido por uma injeção subcutâneada substância de teste e uma injeção i.p. de solução de glicose a 20% (1 gde glicose por kg). A glicose no sangue foi adicionalmente determinada em15, 30, 45, 60, 90 e 120 minutos após a injeção de glicose. Uma normaliza-ção significativa de tolerância à glicose foi mostrada em todos os grupos tra-tados (figura 16A). Na figura 16A, são mostrados níveis absolutos de glicoseno sangue durante um teste i.p. de tolerância a glicose (IPGTT) após 8 se-manas de tratamento com salmoura (A), CM1 (B), CM3-ANA01 (C) ou exen-dina (D) (valores médios de cada grupo (n=12)).

Outra apresentação dos dados mostrados pela figura 16A doteste de tolerância a glicose no sangue é fornecida na figura 16B. Níveis re-lativos de glicose no sangue durante um teste i.p. de tolerância a glicose(IPGTT) após 8 semanas de tratamento com salmoura (A), CM1 (B), CM3-ANA01 (C) ou exendina (D) normalizaram no nível de partida de glicose nosangue (100%).

Níveis de insulina (6) foram determinados de camundongos a-pós um período de jejum de 12 horas durante toda a noite. Após 18 sema-nas de tratamento, todos os camundongos dos grupos tratados produziramsignificativamente mais insulina que o controle não tratado. A figura 17 apre-senta os dados para os níveis de insulina no soro em camundongos apóstratamento de 18 semanas com salmoura a 0,9% (Grupo A), peptídeo CM1(grupo B), peptídeo CM3-ANA01 (grupo C) ou exendina-4 (grupo D). Direta-mente após amostragem, as amostras de sangue foram tratadas com coque-tel inibidor de protease para evitar degradação da insulina. O soro foi anali-sado por insulina com o Insulin Mouse Ultrasensitive ELISA (Número CATEIA-3440, DRG). O significado foi determinado com o teste t de Student.

A hemoglobina glicosilada (7) é formada por excesso de glicoseno plasma ligando à hemoglobina nas hemácias (RBC). Uma vez que asRBCs possuem um intervalo de vida de 120 dias, as medições da hemoglo-bina glicosilada fornecem uma indicação a longo prazo de controle da glico-se e são vistas como um indicador melhor que os níveis de glicose no plas-ma. Sangue integral foi coletado do sino retroorbital e analisados com o Kitde Teste HbAIc enzimático (número DZ121A, Diazyme) para determinar osníveis de hemoglobina glicosilada. Com o emprego da hemoglobina glicosi-lada como um parâmetro, foi observada uma redução significativa no au-mento em todo os grupos tratados.

A figura 18A mostra o aumento relativo da hemoglobina glicosi-lada (GHb) nas amostras de sangue integral após 6, 12 e 18 semanas detratamento com salmoura (A), CM1 (B), CM3-ANA01 (C) ou exendina (D). Afigura 18B mostra o aumento relativo de hemoglobina glicosilada (GHb) nasamostras de sangue integral após 18 semanas de tratamento com salmoura(A), CM1 (B), CM3-ANA01 (C) ou exendina (D). É fornecido o valor médio detodos os animais por grupo (n=12). O aumento dos níveis da hemoglobinaglicosilada de todos os grupos tratados é significativamente menor que ocontrole.

A patologia (8) dos camundongos tratados foi realizada. A ne-cropsia não revelou diferenças nos órgãos dos grupos tratados, em compa-ração ao grupo não tratado A, exceto no volume do pâncreas. O peso dopâncreas foi determinado e descrito como sendo altamente significativo emtodos os grupos tratados. A figura 19 apresenta o peso do pâncreas deter-minado no dia do sacrifício dos animais após 18 semanas de tratamentocom salmoura a 0,9%, (Grupo A, n=11), peptídeo CM1 (grupo B, n=12), pep-tídeo CM3-ANA01 (grupo C, n=12) ou exendina-4 (grupo D1 n=12).

De modo a avaliar os efeitos imunológicos em potencial dassubstâncias testadas, a imunogenicidade tipo IV (9) foi examinada por rees-timulação da célula T. Portanto, o baço de 8 animais por grupo foi explanta-do, as células T isoladas e reestimuladas com concentrações diferentes dasubstância de teste correspondente. Em comparação aos controles não tra-tados, nenhum aumento significativo na proliferação da célula T reestimula-da por peptídeo foi observado. A figura 20 mostra a resposta de chamado devolta in vitro das células do baço às diferentes concentrações das substân-cias de teste CM1 (figura 20A) e CM3-ANA01 (figura 20B) e a substância dereferência exendina-4 (figura 20C). Empregando o ensaio de proliferação decélula não radioativa (Cell Proliferation ELISA, BrdU, quimioluminescência) aresposta de chamado de volta in vitro das células do baço de camundongosdo grupo AaDa diluições de 3 vezes das substâncias de teste CM1 e CM3-ANA01 e a substância de referência exendina-4, iniciando em 50 μg/mL, fo-ram medidas em triplicatas de camundongos individuais. O índice de estimu-lação (SI) foi calculado como o quociente da resposta na presença do res-pectivo peptídeo e a resposta na ausência dos peptídeos. Valores médios ±desvios padrão do respectivo grupo tratado e grupo de controle são mostra-dos (grupo A: n=3, grupo B: n=6, grupo C: n=7, grupo D: n=6). Para o cálculodos valores médios foram analisados apenas camundongos com um Sl su-perior a 6,5 nas culturas de controle positivo com 5 μςι/ηηΙ. Con A.

O estudo de longo prazo em camundongos diabéticos adicio-nalmente sustenta a eficácia dos peptídeos alongados no término C da in-venção em todos parâmetros testados (peso corpóreo, consumo de alimen-tos, níveis de glicose no sangue, hemoglobina glicosilada, tolerância à glico-se, secreção de insulina, peso do pâncreas) os peptídeos alongados no tér-mino C revelaram um efeito terapêutico significativo. Levando-se em consi-deração a homologia dos peptídeos CeIIMed alongados terminalmente emC, com a seqüência ocorrendo endogenamente, foi verificado que essespeptídeos da invenção são vantajosos em termos de imunogenicidade, emcomparação a exendina-4 de não mamíferos. Os dados do estudo de imu-nogenicidade em camundongos sustentam a ausência de qualquer imuno-genicidade clinicamente relevante do peptídeo CM1.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS:

HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR G

Seqüência ID N0.: 1

RRDFPEEVAI VEELG

Seqüência ID N°.:2

RRDFPEEVAI AEELG

Seqüência ID N°.:3

HADGSFSDEM NTILDNLAAR DFINWLIQTK ITDRK

Seqüência ID N°.:4

HADGSFSDEM STILDNLATR DFINWLIQTK ITDKK

Seqüência ID N°.:5

HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GRRDFPEEVA IAEELGRRHAEGTFTSDVSS YLEGQAAKEF IAWLVKGRG

Seqüência ID N°.:6

HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GRRDFPEEVA IAEELGRRHADGSFSDEMST ILDNLATRDF INWLIQTKIT DKK

Seqüência ID N°.:7

HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GRRDFPEEVA IAEELG

Seqüência ID N0.:8

MAPAAWLRSA AARALLPPML LLLLQPPPLL ARALPPDVHH LHAERRGPQPWHAALPSSPA PAPATQEAPR PASSLRPPRC GVPDPSDGLS ARNRQKR

Seqüência ID N°.:9

HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GRRDFPEEVA IVEELGRRHAEGTFTSDVSS YLEGQAAKEF IAWLVKGRG

Seqüência ID N°.:10

HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GRRDFPEEVA IVEELGRRHADGSFSDEMNT ILDNLAARDF INWLIQTKIT DRK

Seqüência ID N°.:11

HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GRRDFPEEVA IVEELG

Seqüência ID N°.:121 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg MAPA AWL RSA AARA51 ccctgctgcc acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg LLP PML LLLL QPP PLL101 gcccgggccc tgcccccggt gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ARAL P P 151 ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc ccagcggcgt atccggacgc201 caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc catgtgccgg251 tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta351 ggcctgacca gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct D V HHL401 gcacgccgag aggcgcggcc ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca HAE RRGP QPW HAA LPSS451 gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg cccccaggcc tgccagcagc PAP APA TQEA PRP ASS501 ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg gcctgagcgc LRPP RCG VPD PSDG LSA551 tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga RNR QKRH AEG TFT SDVS601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg SYL EGQ AAKE FIA WLV651 aagggcaggg gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga KGRG R R D FPE EVAI VEE701 gctgggccgg cgacacgccg agggcacctt cacctccgac gtgagcagct LGR RHAE GTF TSD VSSY751 acctggaggg ccaggccgcc aaggagttca tcgcctggct ggtgaagggc L E G QAA KEFI AWL VKG801 aggggctgag cgcgc

RG*

Seqüência ID N0.: 13

1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc

61 acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt

121 gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc

181 ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc

241 catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac

301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca

361 gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc

421 ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg

481 cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg

541 gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga

601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg

661 gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga gctgggccgg cgacacgccg

721 agggcacctt cacctccgac gtgagcagct acctggaggg ccaggccgcc aaggagttca

781 tcgcctggct ggtgaagggc aggggctgag cgcgc

Seqüência ID N0.: 141 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg

MAPA AWL RSA AARA51 ccctgctgcc acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg

LLP PML LLL L QPP PLL101 gcccgggccc tgcccccggt gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg

ARALPP151 ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc ccagcggcgt atccggacgc201 caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc catgtgccgg251 tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta351 ggcctgacca gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct

DV HHL

401 gcacgccgag aggcgcggcc ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca

HAE RRGP QPW HAA LPSS

451 gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg cccccaggcc tgccagcagc

PAP APA TQEA PRP ASS

501 ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg gcctgagcgc

LRPP RCG VPD P SDG LSA

551 tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga

RNR QKRH AEG TFT SDVS

601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg

SYL EGQ AAKE FIA WLV

651 aagggcaggg gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga

KGRG RRD FPE EVAI VEE

701 gctgggccgg cgacacgccg acggcagctt cagcgacgag atgaacacca

LGR RHAD GSF SDE MNTI

751 tcctggacaa cctggccgcg cgcgacttca tcaactggct gatccagacc

LDN LAA RD FI NWL IQT801 aagatcaccg atcggaagtg agcgcgctga tatcK I T D R K *

Seqüência ID N0.: 15

1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc61 acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt

121 gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc

181 ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc

241 catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac

301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca

361 gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc

421 ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg

481 cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg

541 gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga

601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg

661 gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga gctgggccgg cgacacgccg

721 acggcagctt cagcgacgag atgaacacca tcctggacaa cctggccgcg cgcgacttca

781 tcaactggct gatccagacc aagatcaccg atcggaagtg agcgcgctga tatc

Seqüência ID N0.: 16

1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccagggMAPA AWL RSA AARA

51 ccctgctgcc acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctgLLP PML LLLL QPP PLL101 gcccgggccc tgcccccggt gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg

ARAL PP151 ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc ccagcggcgt atccggacgc201 caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc catgtgccgg251 tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta351 ggcctgacca gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct

DV HHL

401 gcacgccgag aggcgcggcc ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagcaHAE RRGP QPW HAA LPSS451 gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg cccccaggcc tgccagcagc

PAP APA TQEA PRP ASS501 ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg gcctgagcgc

L RPP RCG VPD PSDG LSA551 tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtgaRNR QKRH AEG TFT SDVS601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc otggctggtg

SYL EGQ AAKE FIA WLV651 aagggcaggg gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga

KGRG RRD FPE EVAI VEE701 gctgggccgg cgacacgccg acggcagctt cagcgacgag atgaacaccaLGR RHAD GSF SDE HN TI751 tcctggacaa cctggccgcg cgctga tat cLDN LAA R *

Seqüência ID N0.: 17

1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc

61 acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt

121 gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc

181 ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc

241 catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac

301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca

361 gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc

421 ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg

481 cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg

541 gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga

601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg

721 acggcagctt cagcgacgag atgaacacca tcctggacaa cctggccgcg cgctgatatc

Seqüência ID N0.: 18

1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccagggMAPA AWL RSA AARA51 ccctgctgcc acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg

LLP PML LLLL QPP PLL101 gcccgggccc tgcccccggt gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg

ARAL PP151 ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc ccagcggcgt atccggacgc201 caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc catgtgccgg251 tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta351 ggcctgacca gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct

DV HHL401 gcacgccgag aggcgcggcc ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca H A ε RRGP QPW HAA LPSS451 gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg cccccaggcc tgccagcagc PAP APA TQEA PRP ASS501 ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg gcctgagcgc LRPP RCG VPD PSDG LSA551 tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga RNR QKRH AEG TFT SDVS601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg SYL EGQ AAKE FIA WLV651 aagggcaggg gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga KGRG RRD FPE EVAI VEE701 gctgggctga gcgcgc

LG*

Seqüência ID N0.: 19

1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc61 acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt

121 gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc

181 ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc

241 catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac

301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca

361 gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc

421 ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg

481 cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg

541 gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga

601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg

661 gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga gctgggctga gcgcgc

Seqüência ID N0.: 20

HGEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GSeqüência ID N0.: 21

RRDFPEEVAISeqüência ID N0.: 22

RRDFPEEVAI VEEL

Seqüência ID N0.: 23

RRDFPEEVAI AEEL

Seqüência ID N0.: 24Asp Phe Pro Glu Glu Val AlaSeqüência ID N0.: 25

Ala Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala IleSeqüência ID N0.: 26

Ala Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala De Val Glu Glu LeuSeqüência ID N0.: 27

Ala Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu LeuSeqüência ID N0.: 28

Ala Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu GlySeqüência ID N0.: 29

Ala Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ue Ala Glu Glu Leu GlySeqüência ID N0.: 30

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GlyGln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys GIy Arg Gly AlaAla Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly

Seqüência ID N0.: 31

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GlyGln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly ArgArg Asp Phe Ala Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly

Seqüência ID N0.: 32

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GlyGln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly ArgArg Asp Ala Ala Ala Ala Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu GlySeqüência ID N0.: 33

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GlyGln Ala Ala Lys Glu Phe Ue Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly AlaAla Asp Ala Ala Ala Ala Val Ala Ile Ala Ala Ala Leu Gly

Seqüência ID N0.: 34

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GlyGln Ala Ala Lys Glu Phe De Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly ArgArg Asp Phe Pro

Seqüência ID N0.: 35

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GlyGln Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly ArgArg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala

Seqüência ID N0.: 36

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GlyGln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu VaI Lys Gly Arg Gly ArgArg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala De Ala Glu Glu Leu Gly Arg ArgHis Ala Cys

Seqüência ID N0.: 37

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GlyGln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly AlaAla Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala He Val Glu Glu Leu Gly

Seqüência ID N0.: 38

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GlyGln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly ArgArg Asp Phe Ala Glu Glu Val Ala De Val Glu Glu Leu Gly

Seqüência ID N0.: 39

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GlyGln Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly ArgArg Asp Ala Ala Ala Ala Val Ala De Val Glu Glu Leu Gly

Seqüência ID N0.: 40

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GlyGln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys GIy Arg Gly AlaAla Asp Ala Ala Ala Ala Val Ala Ile Val Ala Ala Leu Gly

Seqüência ID N0.: 41

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GlyGln Ala Ala Lys Glu Phe De Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly ArgArg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly Arg ArgHis Ala Cys

Seqüência ID N0.: 42

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GlyGln Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa

Seqüência ID N0.: 43 (Fórmula (I))

Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu XaaXaa Ala Xaa Xaa Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

Seqüência ID N0.: 44 (Fórmula (II))

Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Xaa Tyr Leu Glu XaaXaa AIa Ala Xaa Glu Phe Ile Xaa Trp Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa

Seqüência ID N0.: 45 (Fórmula (III))

Claims (37)

1. Peptídeo de fusão compreendendo como o componente (I)uma seqüência de término N de acordo com a fórmula II:Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34- Xaa35-Xaa36-Xaa37,em que Xaa7 é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, 3-hidróxi-histidina, homo-histidina, N-acetil-histidina, a-flúormetil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina; Xaa8 é Ala, Gly, Vai, Leu, lie, Lys, Aib, ácido carboxílico (1-aminociclopropila), ácido carboxílico (1-aminociclobutila), ácido carboxílico(1-aminociclopentila), ácido carboxílico (1-aminociclohexila), ácido carboxíli-co (1-aminocicloheptila), ou ácido carboxílico (1-aminociclooctila), pelo queGly é especificamente preferido; Xaa16 é Vai ou Leu; Xaa é Ser, Lys ou Arg;Xaa 19 é Tyr ou Gln; Xaa20 é Leu ou Met; Xaa22 é Gly, Glu ou Aib; Xaa23 éGln, Glu, Lys ou Arg; Xaa25 é Ala ou Vai; Xaa26 é Lys, Glu ou Arg; Xaa27 éGlu ou Leu; Xaa30 é Ala, Glu ou Arg; Xaa33 é Val ou Lys; Xaa34 é Lys, Glu,Asn ou Arg; Xaa35 é Gly ou Aib; Xaa36 é Arg, Gly ou Lys ou amida ou estáausente; Xaa37 é Gly, Ala, Glu1 Pro, Lys, amida ou está ausente.ou fórmula III:Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa8-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,em que Xaa7 é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, -hidróxi-histidina, homo-histidina, N-acetil-histidina, a -flúormetil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina; Xaa8 é Ala, Gly, Vai, Leu, Me, Lys, Aib, ácido carboxílico (1-aminociclopropila), ácido carboxílico (1-aminociclobutila), ácido carboxílico(1-aminociclopentila), ácido carboxílico (1-aminociclohexila), ácido carboxíli-co (1-aminocicloheptila), ou ácido carboxílico (1-aminociclooctila); Xaa18 éSer, Lys ou Arg; Xaa22 é Gly, Glu ou Aib; Xaa23 é Gln, Glu, Lys ou Arg ;Xaa26 é Lys, Glu ou Arg; Xaa30 é Ala, Glu ou Arg; Xaa34 é Lys, Glu ou Arg;Xaa35éGly ou Aib; Xaa36 é Arg ou Lys, amida ou está ausente; Xaa37 é Gly, Ala,Glu ou Lys, amida ou está ausente.e como o componente (II) de término C1 uma seqüência peptídi-ca de pelo menos 9 aminoácidos ou um fragmento funcional, variante ouderivado do mesmo.

2. Peptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 1, compre-endendo como o componente (I), uma seqüência GLP-1(7-35, 7-36 ou 7-37)de término N, e como o componente (II), uma seqüência de término C, depelo menos 9 aminoácidos ou um fragmento funcional, variante ou derivadodo mesmo.

3. Peptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 1, compre-endendo como o componente (I) uma seqüência de término N1 de acordocom fórmula I:His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala- Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-X (I), em queX é NH2 ou Gly-OH,e como o componente (II), uma seqüência peptídica de términoC, de pelo menos 9 aminoácidos ou um fragmento funcional, variante ou de-rivado do mesmo.

4. Peptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 2 ou 3, emque o componente (I) contém uma seqüência possuindo pelo menos 80% dehomologia com relação à seqüência Seqüência de id número: 1.

5. Peptídeo de fusão de acordo com as reivindicações 1 a 4, emque o componente (II) é uma seqüência peptídica formando uma estruturasimilar ao β giro.

6. Peptídeo de fusão de acordo com qualquer uma das reivindi-cações precedentes 1 a 5, em que o componente (II) é uma seqüência pep-tídica contendo pelo menos um resíduo alanina ou prolina.

7. Peptídeo de fusão de acordo com qualquer uma das reivindi-cações precedentes 1 a 6, em que o componente (II) é uma seqüência pep-tídica contendo um tetrâmero com propriedades de formação de β giro, porexemplo, possuindo um resíduo prolina na posição 2 daquele tetrâmero.

8. Peptídeo de fusão de acordo com qualquer uma das reivindi-cações precedentes 1 a 7, em que o componente (II) é uma seqüência pep-tídica contendo um motivo de seqüência selecionado do grupo consistindoem VAIA, IAEE, PEEV, AEEV, EELG, AAAA, AAVA, AALG, DFPE, AADX,AXDX, e XADX, em que X representa qualquer aminoácido.

9. Peptídeo de fusão de acordo com qualquer uma das reivindi-cações precedentes 1 a 8, em que o componente (II) é uma seqüência pep-tídica sendo ligada ao término C do componente (I) por seu motivo de se-qüência do término N selecionado do grupo consistindo em AA, ΧΑ, AX, RR,RX, e XR.

10. Peptídeo de fusão de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedentes 1 a 9, em que o componente (II) é uma seqüênciapeptídica contendo o motivo de seqüência da Seqüência de id número: 25.

11. Peptídeo de fusão de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedentes 1 a 10, em que o componente (II) é uma seqüênciapeptídica contendo uma seqüência selecionada do grupo consistindo nasSeqüência de id número: 22 (RRDFPEEVAI) e Seqüência de id número: 26(AADFPEEVAI) ou contendo uma seqüência possuindo pelo menos 80% dehomologia com relação à seqüência Seqüência de id número: 22 ou Se-qüência de id número:26.

12. Peptídeo de fusão de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedentes 1 a 11, em que o componente (II) é uma seqüênciapeptídica contendo uma seqüência selecionada de um grupo consistindo emSeqüência de id número: 23 (RRDFPEEVAIVEEL), Seqüência de id número-24 (RRDFPEEVAIAEEL), Seqüência de id número: 27 (AADFPEEVAIVEEL),e Seqüência de id número: 28 (AADFPEEVAIAEEL), ou uma seqüência pos-suindo pelo menos 80% de homologia de seqüência com qualquer uma dasNúmeros de ID da Seqüência: 23, 24, 27 ou 28.

13. Peptídeo de fusão de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedentes 1 a 12, em que o componente (II) é uma seqüênciapeptídica contendo uma seqüência selecionada do grupo consistindo nasSeqüência de id número: 2 (RRDFPEEVAIVEELG), Seqüência de id número-3 (RRDFPEEVAIAEELG), Seqüência de id número: 29 (AADFPEEVAIVE-ELG), e Seqüência de id número: 30 (AADFPEEVAIAEELG), ou uma se-qüência possuindo pelo menos 80% de homologia com relação às seqüên-cias Números de ID da Seqüência: 2, 3, 29 ou 30.

14. Peptídeo de fusão de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedentes 1 a 13, em que o componente (II) é uma seqüênciapeptídica possuindo 9 a 30, preferivelmente 9 a 20, e mais preferivelmente 9a 15 aminoácidos.

15. Peptídeo de fusão de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedentes 1 a 14, em que o componente (I) e o componente (II)são diretamente ligados ou ligados através de uma seqüência ligante.

16. Peptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 15, emque a seqüência ligante possui um comprimento de 1 a 10 aminoácidos.

17. Peptídeo de fusão de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1 a 16, em que o peptídeo de fusão contém uma seqüência sele-cionada do grupo consistindo na Seqüência de id número: 8(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELG), Se-qüência de id número 12(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELG), Se-qüência de id número: 31 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKE-FIAWLVKGRGAADFPEEVAIAEELG), Seqüência de id número: 32(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFAEEVAIAEELG), Se-qüência de id número: 33(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDAAAAVAIAEELG), Se-qüência de id número: 34 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKE-FIAWLVKGRGAADAAAAVAIAAALG), Seqüência de id número: 35 (HA-EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFP), Seqüência de id núme-ro: 36 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVA), Se-qüência de id número: 37(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELGR-RHAC), Seqüência de id número: 38(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADFPEEVAIVEELG), Se-qüência de id número: 39 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKE-FIAWLVKGRGRRDFAEEVAIVEELG), Seqüência de id número: 40(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDAAAAVAIVEELG), Se-qüência de id número: 41(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADAAAAVAIVAALG), andSeqüência de id número: 42 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKE-FIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELGRRHAC),ou uma seqüência possuindo pelo menos 80% de homologiacom relação às seqüências Números de ID da Seqüência: 8 e 12.

18. Peptídeo de fusão de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedentes 1 a 17, em que o peptídeo de fusão contém outrocomponente (III) ligado ao término C do componente (II) e/ou ao término Ndo componente (I).

19. Peptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 18, emque o componente (III) compreende pelo menos quatro resíduos de aminoá-cido, preferivelmente pelo menos 10 resíduos de aminoácido adicionais,mais preferivelmente pelo menos 20 ou pelo menos 30.

20. Peptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 17 ou 19,em que o componente (III) compreende pelo menos 4, preferivelmente pelomenos 10, mais preferivelmente pelo menos 20 resíduos de aminoácido adi-cionais da seqüência de término N de GLP-2 como no pró-glucagon ou deGLP-1(7-37).

21. Peptídeo de fusão de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 18 a 20, em que o componente (III) contém a seqüência da Se-qüência de id número: 4 ou 5 ou uma seqüência possuindo pelo menos 80%de homologia com relação às seqüências Números de ID da Seqüência: 4 ou 5.

22. Peptídeo de fusão de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 18 a 21, em que o peptídeo de fusão contém uma seqüência peptí-dica selecionada de um grupo consistindo nas Seqüência de id número 6,Seqüência de id número 7, Seqüência de id número 10 e Seqüência de idnúmero 11 ou uma seqüência possuindo pelo menos 80% de homologia comrelação às seqüências Números de ID da Seqüência: 6, 7, 10 ou 11.

23. Peptídeo de fusão de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedentes 1 a 22, em que pelo menos um dos aminoácidos éderivatizado de uma modificação covalente de uma cadeia lateral de um a-minoácido ocorrendo naturalmente, por modificação da estrutura do peptí-deo, por modificação de Nhfe ou grupos terminais carbóxi.

24. Peptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 23, emque pelo menos um dos aminoácidos é derivatizado de um grupo Iipila oucarboidrato.

25. Peptídeo de fusão de acordo com a reivindicação 23 ou 24,em que o resíduo His de término N de GLP-1 (GLP-1(7)) é quimicamentemodificado em seu término NH2 e/ou em sua cadeia lateral de histidila, es-pecificamente por uma porção hidrofóbica.

26. Peptídeo de fusão de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedentes 1 a 25, em que o peptídeo de fusão compreende umaproteína veículo, especificamente transferina ou albumina como o compo-nente (IV).

27. Peptídeo de fusão de acordo com qualquer uma das reivin-dicações precedentes 1 a 26, em que a seqüência de aminoácido dos com-ponentes (I), (II) e/ou (III) é invertida e em que a seqüência de aminoácido(s)é pelo menos parcialmente composta de isômeros de aminoácido D.

28. Método para produção de peptídeo de fusão como definidaem qualquer uma das reivindicações precedentes 1 a 27, por síntese depeptídeo de estado sólido.

29. Ácido nucléico codificando peptídeo de fusão como definidaem qualquer uma das reivindicações precedentes 1 a 22 ou 26.

30. Vetor compreendendo um ácido nucléico como definida nareivindicação 29.

31. Célula hospedeira compreendendo DNA introduzido exoge-namente, como definida na reivindicação 29, especificamente um vetor deacordo com a reivindicação 30, sendo capaz de expressar o peptídeo defusão.

32. Método para produção de peptídeo de fusão como definidoem qualquer uma das reivindicações precedentes 1 a 22 ou 26, em que ummicroorganismo transformado para incluir um ácido nucléico codificando opeptídeo de fusão é fermentado e a proteína é recuperada.

33. Método para produção de uma proteína como definido nareivindicação 32, no qual as células animais crescem sob condições em quea proteína é exportada das células.

34. Peptídeo de fusão como definida em qualquer uma das rei-vindicações precedentes 1 a 27 como um medicamento para uso na terapiade seres humanos ou animais.

35. Uso de peptídeo de fusão como definido em qualquer umadas reivindicações precedentes 1 a 27, um ácido nucléico de acordo com areivindicação 29, um vetor como definido na reivindicação 30 ou uma célulahospedeira como definido na reivindicação 31, para a fabricação de um me-dicamento para o tratamento do diabetes melito do tipo I ou tipo II, resistên-cia à insulina, distúrbios de peso e doenças ou condições associadas aomesmo.

36. Uso de peptídeo de fusão como definido em qualquer umadas reivindicações precedentes 1 a 27, um ácido nucléico como definido nareivindicação 29, um vetor como definido na reivindicação 30 ou uma célulahospedeira como definido na reivindicação 31, para a fabricação de um me-dicamento para o tratamento de distúrbios neurodegenerativos e doenças oucondições associadas aos mesmos.

37. Uso de peptídeo de fusão como definido em qualquer umadas reivindicações precedentes 1 a 27, um ácido nucléico como definido nareivindicação 29, um vetor como definido na reivindicação 30 ou uma célulahospedeira como definido na reivindicação 31, para a fabricação de um me-dicamento para o tratamento de distúrbios e doenças ou condições associa-dos à apoptose.