KR102349717B1 - 신규 대사증후군 및 그와 관련된 질환 치료용 약학 조성물 - Google Patents

신규 대사증후군 및 그와 관련된 질환 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 대사증후군 및 그와 관련된 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

신규 대사증후군 및 그와 관련된 질환 치료용 약학 조성물{A novel pharmaceutical composition for treating metabolic syndrome and diseases related thereto}
본 발명은 신규 약학적 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 대사증후군 및 그와 관련된 질환 예컨대 비알코올성 지방간염 등의 치료를 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
대사증후군(metabolic syndrome)은 심장병, 중풍 및 제2형 당뇨병의 발병 위험도를 높이는 다양한 신체현상이 동시다발적으로 나타나는 현상들의 집합체로서, 이러한 현상에는 증가된 혈압, 고혈당, 허리 주위의 과도한 체지방, 비정상적인 혈중 콜레스테롤 또는 트리글리세리드의 농도 등을 포함한다. 이러한 대사증후군은 명확한 징후나 증상을 동반하지 않는다는 점에서 위협적일 수 있다. 이러한 상태를 방치하거나 악화시킬 경우 결국 동맥경화증, 뇌졸중 등의 심혈관계 질환으로 발전하거나 제2형 당뇨병, 비알코올성 지방간 등 난치성 질환으로 발전하게 된다는 점에서 반드시 치료나 개선이 요구되는 상태라고 할 수 있다.
비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, 이하, 'NASH'로 지칭함)은 진행 단계에 따라 특징적인 병인이 존재한다. 즉 인슐린 저항성, 당/지질의 조절기능 저하(dysregulation)에서 시작해 지방축적(steatosis), 염증(inflammation) 및 섬유화(fibrosis), 세포사멸 등의 병인들이 점차 관련되어 비알코올성 지방간(non-alcoholic fatty liver disease, 이하, 'NAFLD'로 약칭함)에서 NASH(F0, F1, F2, F3, F4 단계로 구분)로 진행하고 더 나아가 간경변(compensated→ decompensated)으로 진행되는 것이다.
비알코올성 지방간(non-alcoholic fatty liver disease, 이하, 'NAFLD'로 약칭함)는 비만, 당뇨병, 고혈압 등을 동반한 대사증후군과 더불어 급격하게 증가되고 있는 간질환으로, 간경변이나 간암으로 진행될 수 있고, 최근 NAFLD의 중증(severe) 염증 형태인 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, 이하, 'NASH'로 지칭함)의 발생률, NASH-관련 간경변이 빠르게 증가하고 있어 이에 대한 치료제 개발을 위한 많은 연구들이 이루어지고 있다.
NASH는 진행 단계에 따라 특징적인 병인이 존재하는 것으로 알려지고 있다. 즉 인슐린 저항성, 당/지질의 조절기능 저하(dysregulation)에서 시작해 지방축적(steatosis), 염증(inflammation) 및 섬유화(fibrosis), 세포사멸 등의 병인들이 점차 관련되어 비알코올성 지방간(non-alcoholic fatty liver disease, 이하, 'NAFLD'로 약칭함)에서 NASH(F0, F1, F2, F3, F4 단계로 구분)로 진행하고 더 나아가 간경변(compensated → decompensated)으로 진행되는 것이다.
그러나, 불행하게도 현재까지 NASH 치료제로 승인된 약물이 없고, 질병의 부담을 고려하면 치료제 선택권에 대한 환자의 요구가 충족되지 못하고 있는 미충족 수요(unmet needs)가 높은 약물이다. NAFLD와 NASH의 발생과 진행에 기여하는 기본적인 병태생리학적 기전은 매우 복잡하고, 이러한 작용기전은 현재 연구가 진행되는 여러 표적들에 대한 다양한 치료제 개발에서 확인되고 있다. 광범위한 범위에서 약물 개발은 대사경로, 염증 연쇄반응, 섬유화에 영향을 주는 작용기전의 조절에 초점을 맞추고 있다. 비록 NAFLD 발병에 대한 작용기전이 상당부분 규명되고 있지만, 임상시험 설계의 복잡성으로 인한 치료제 개발에 많은 어려움이 발생하고 있다. 현재 임상3상으로 진행되는 후보물질들이 치료제로서의 가능성을 제시하는 가운데, 간지방증, 괴사염증, 섬유화 감소 측면에서 좋은 결과를 보이고 있다. 다양한 코호트 연구를 통해 장기적인 안전성과 유효성이 확립된다면, 잠재적인 이환율과 사망률을 경감시키는데 도움이 될 것이다.
한편, 장은 해부학적 및 생리적으로 연결되어 간 병리에 다양한 영향을 미치고 있어, 장-간 축의 적절한 관리는 알코올성 및 비알코올성 지방간염에서 섬유증 예방에 효과적이고, 이는 간경변 자체를 줄이는 근본적 치료법으로 제시되었다. 장 누수(leaky gut)는 독소(toxin), 항원 또는 세균이 체내에 통과하는 최첨단(cutting edge)일 수 있으며 진행성 간경변에 병원성 역할을 한다고 제안되었고, 간질환 분야에서 장내 미생물 및 생균제(프로바이오틱스, 프리바이오틱스 등)와 같은 장내 유익균의 역할에 많은 관심이 모아지고 있다. 최근 장내 세균총은 장-간 축의 매개인자로 부상하고, 과도한 고지방식 섭취에 의한 장 장벽의 기능 약화는 다량의 장내 미생물(미생물 관련 분자 패턴: LPS, LTA와 같은 MAMPs)을 생성하고 장내 세균총 자체가 간으로 전이되어 간염증, 간 섬유증과 같은 간질환을 촉진할 수 있다. 담즙산은 능동적으로 흡수되어 결장상피로 들어가는데, 2차 담즙산은 독성이 있어 DNA 손상을 유발하여 HSC(hepatic stellate cell) 세포에서 SASP(senescence-associated secretory phenotype) 분비인자를 생성한다. 장내 세균총은 콜린 대사에 관여하여 TMA(trimethylamine)로 변환시키는데 간으로 옮겨 TAMO(trimethylamine oxide)로 전환되어 간염증을 유발한다. 장내 세균총은 인체의 항상성 유지역할을 하는데, 그 항상성에 장애가 생기면 장내 세균총에서 추출한 대사산물과 성분이 간으로 이동하여 간에서 병리학적 영향을 유발하며 장내 대사산물에 의해 간염증과 섬유증, 간암 등을 유발한다. NASH 치료를 위해 개발된 분자(molecule)-기반 치료제는 NASH의 진행기전을 이해할 수 있게 하였으며, FXR agonist, ACC 저해제, ASK-1 저해제의 작용기전에 장-간 축 및 장내 세균총이 적어도 부분적으로 관여하고 있음이 제시되었다.
아울러, GLP-1 수용체를 NAFLD 또는 NASH 치료제로 사용하고자 하는 시도가 이루어지고 있다. 이와 관련하여, WO2016043533A1는 반감기기 증가된 GLP-1/글루카곤 수용체 이중 작용제인 옥신토뮬린 유도체를 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 치료제를 개시하고 있고, US9938335 역시 글루카곤 수용체/GLP-1 수용체 이중 작용제로 사용되는 글루카곤 유사 펩타이드 및 이를 이용한 NAFLD 및 NASH 치료방법을 개시하고 있다.
이러한 선행기술에 기재된 물질들은 동물모델에서 일부 효과가 확인되었으나, 아직까지 최종적으로 임상시험을 통과한 물질은 존재하지 않는 실정이다.
본 발명은 상술한 문제점을 포함하여 여러 가지 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 보다 효율적으로 NASH를 포함한 다양한 대사증후군을 치료할 수 있는 신규 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나, 본 발명의 보호범위가 상기 목적으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 대사증후군 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 비만 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 제2형 당뇨병 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 간 섬유증 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 대사증후군에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 대사증후군 치료방법이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 비만에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 비만 치료방법이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 제2형 당뇨병에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 제2형 당뇨병 치료방법이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염 치료방법이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 간 섬유증에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 간 섬유증 치료방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질은 소장 내에서 GLP-1 수용체 및 GLP-2 수용체에 결합하여 소장의 융모 길이 및 크립트 깊이를 증가시키고 장내 균총을 개선시키는 등 소장 내 환경을 개선시키는 효과를 갖는다. 뿐만 아니라, 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질은 인슐린 저항성의 감소와 함께 체중 감소의 효과를 갖는다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질의 개략적인 구조를 나타내는 개요도이다.
도 2는 다양한 GLP-1 및/또는 GLP-2 유사체와 GLP-1 수용체, GLP-2 수용체 및 다른 글루카곤 수용체 사이의 상호작용 관계를 나타내는 개요도이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 이중 특이성 융합 단백질을 정제한 후 비환원(좌측) 및 환원(우측) 조건에서 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 일련의 겔 사진이다:
M: size marker
1: MG12-1(5 ㎍);
2: MG12-2(5 ㎍);
3: MG12-3(5 ㎍);
4: MG12-4(5 ㎍); 및
5: MG12-5(5 ㎍).
도 3b는 GLP-2 동형 이량체(GLP-2-Fc homodimer, 좌측)와 Knob into Holes(KiH) 구조를 포함한 MG12-5(우측)을 정제한 후 비환원(NR) 및 환원(R) 조건에서 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 일련의 겔 사진이다:
M: size marker;
1 & 2: GLP-2-Fc homo(10 ㎍); 및
3 & 4: MG12-5(10 ㎍).
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-1-Fc 동형 이량체 단백질과 GLP-1 펩타이드의 생물학적 활성을 루시퍼레이즈 리포터 어세이로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-1의 생물학적 활성을 GLP-1 펩타이드와 비교하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-3의 생물학적 활성을 GLP-1 펩타이드와 비교하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4d는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-4의 생물학적 활성을 GLP-1 펩타이드와 비교하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4e는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-5의 생물학적 활성을 GLP-1 펩타이드와 비교하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-2-Fc 동형 이량체 단백질의 GLP-2 활성을 GLP-2 펩타이드와 비교하여 형광분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-1 단백질의 GLP-2 활성을 GLP-2 펩타이드와 비교하여 형광분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-3 단백질의 GLP-2 활성을 GLP-2 펩타이드와 비교하여 형광분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5d는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-4 단백질의 GLP-2 활성을 GLP-2 펩타이드와 비교하여 형광분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5e는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-5 단백질의 GLP-2 활성을 GLP-2 펩타이드와 비교하여 형광분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 이중 특이성 융합단백질을 동물(랫트) 투여 시 약물동력학(pharmacokinetics, PK) 프로파일을 GLP-1-Fc를 이용한 ELISA 분석으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 이중 특이성 융합단백질을 동물(랫트) 투여 시 약물동력학(pharmacokinetics, PK) 프로파일을 GLP-2-Fc를 이용한 ELISA 분석으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 반감기가 증가된 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 단백질(GLP1/2-Fc)의 실험동물에서의 다양한 생리학적 효과를 측정한 결과들로서, A 및 B는 융합단백질 4주 동안 주 2회 피하투여한 후 체중(A) 및 체중 변화(B)를 측정한 그래프이고, C는 부고환 지방량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, D 내지 F는 총 혈청 콜레스테롤(D), HDL(E) 및 트리글리세라이드 수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프들이고, G 및 I는 3 내지 4주간 수행된 IPITT(G) 및 IPGTT(I) 결과를 나나타내는 그래프이며, J는 펩타이드 처리 후 0 내지 4 주간 혈당 수준을 모니터링 한 결과를 나타내는 그래프이며, K 및 L은 인슐린 수준을 4 주간 측정한 결과(K) 및 HOMO-IR를 계산한 결과(M)를 나타내는 그래프들이다. 데이터는 평균±SEM (n = 6-12/그룹)이며, 일원 또는 이원 분산 분석으로 분석한 후 터키 또는 Dunnett 검정을 수행하였다. 각 그룹에서 투여 전과 투여 후 사이의 혈당 수치 변화에 대하여 대응 스튜던트 t-검정(paired student's t-test)을 수행하였다. * p < 0.05 ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 대 음성대조군. IPITT: 복강 내 인슐린 부하 시험. IPGTT: 복강 내 포도당 저항성 검사. HOMO-IR: 인슐린 저항성에 대한 항상성 모델 평가.
도 8은 용량 의존적 방식으로 체중 및 포도당 항상성에 미치는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(GLP1/2-Fc)의 효과를 나타낸 것으로서. A 및 B는 약물을 4주 동안 주 2회 피하투여한 후 투여기간 동안 매주 체중(A), 및 체중 변화(B)를 모니터링한 결과를 나타내는 그래프이고. C는 4주 경과 후 부고환 지방 질량(C)을 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, D 내지 H는 약물 투여시작 후 4주 경과 후 측정된 혈청 트리글리세라이드 농도(D), 총 콜레스테롤 농도(E), HDL 농도(F) 및 총 빌리루빈 농도(G 및 H)를 나타내는 그래프이고, I 및 J는 약물 투여 시작 후 3 내지 4주 사이에 수행된 IPITT(I) 및 IPGTT(J) 결과를 나타내는 그래프이며, K 및 L는 약물 투여 전(K) 및 실험 종료 시(L)의 기저 혈당 수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 데이터는 평균±SEM(n=6-12/군)이 일원 또는 이원 ANOVA에 이어 tukey 또는 Dunnett 검정에 의해 분석되었다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 대 음성대조군.
도 9는 반감기가 향상된 본 발명의 일실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(GLP1/2-Fc)의 간 지질 축적 및 염증을 감소의 효과를 나타내는 것으로서, A 및 B는 각 실험군에서 적출된 간을 촬영한 사진(A) 및 간 조직절편에 대한 H&E 염색 결과(B)이고, C 내지 E는 시험 종료 후 적출된 간 중량(C) 및 간 대 체중(D)을 측정한 결과 및 간 조직을 사용하여 간 TG(E)의 양을 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, F 및 G는 혈청 ALT(F) 및 AST(G) 수준을 측정함으로써 간 손상을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다. 데이터는 평균±SEM (n=6-12/그룹)이며 일원 분산 분석에 이어 Dunnett 검정으로 분석하였다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 대 음성대조군. H&E: 헤마톡실린 및 에오신, TG: 트리글리세라이드, ALT: 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈, AST: 아스파르테이트 아미노트랜스퍼레이즈.
도 10은 용량 의존적 방식으로 간 지질 축적에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP1/2-Fc의 효과를 나타낸 것으로서, A 및 B는 시험 종료 후 적출된 동물의 전체 간을 촬영한 사진(A) 및 간 지질 침착을 분석하기 위해 촬영된 간 조직 절편에 대한 H&E 염색 사진(B)이고, C 및 D는 간 중량(C) 및 간 TG 수준(D)을 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, E 및 F는 간 손상 정도를 확인하기 위해 혈청 ALT(E) 및 AST(F) 수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 데이터는 일원 분산 분석에 이어 Dunnett 검정으로 분석하였다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 대 음성대조군. H&E: 헤마톡실린 및 에오신, TG: 트리글리세라이드, ALT: 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈, AST: 아스파르테이트 아미노트랜스퍼레이즈.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(GLP1/2-Fc)이 간 섬유증을 개선시킬 수 있는 여부를 분석한 결과를 나타내는 것으로서, A는 간 섬유증 평가를 위해 Sirius red 염색을 수행한 결과를 나타내고, B는 A에서 촬영된 영상을 Image J 소프트웨어를 사용하여 정량화한 결과를 나타내는 그래프이며(데이터는 일원 분산 분석에 이어 Dunnett 검정으로 분석하였으며, 평균±SEM으로 표시되었다. *** p < 0.001 대 음성대조군), C 및 D는 Pearson의 상관 분석에 의해 간 TG의 상관관계 및 Sirius red 염색의 면적을 개체(C) 또는 실험군(D)으로 평가한 결과를 나타내는 그래프이고, E는 대표 사진으로서 간에서 제3형 콜라겐 침착을 나타낸다. 스케일바: 200 ㎛
도 12는 간 섬유증에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(GLP1/2-Fc)의 농도 의존적인 효과를 조사한 결과로서, A는 음성대조군(vehicle) 및 처리농도를 달리하여 GLP1/2-Fc를 투여한 동물의 간 조직에 대한 Sirius red 염색 결과를 나타내는 일련의 사진이고, B는 상기 A의 이미지를 Image J 소프트웨어를 사용하여 정량화한 그래프이다. 데이터는 일원 분산 분석에 이어 Dunnett 검정에 의해 분석하였으며, 평균±SEM(n=7-9/그룹)으로 나타냈다. **** p < 0.0001 대 음성대조군, 스케일바: 200 ㎛
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(GLP1/2-Fc)의 장에 미치는 영향을 조사한 결과를 나타내는 것으로서, A는 사진은 각 실험군에서 적출된 장을 촬영한 사진이고, B 내지 E는 전체 장의 무게(B), 전체 장의 길이(C), 소장(D) 및 결장(E)의 길이를 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, F는 장의 횡단 절편을 H&E 염색한 결과를 촬영한 일련의 사진들이고, G는 Ki-67 단백질(녹색)을 면역형광 염색으로 염색한 결과를 나타내는 사진으로서 핵을 DAPI 염색에 의해 시각화 하였으며, H 내지 J는 십이지장(H), 공장(I) 및 회장(J)의 Crypt 깊이를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, K 내지 M은 십이지장(K), 공장(L) 및 회장(M)의 융모 높이를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 데이터는 평균±SEM이며 일원 분산 분석에 이어 Dunnett 검정으로 분석하였다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 대 음성대조군.
도 14는 위장관에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP1/2-Fc의 농도의존적인 효과를 나타낸 것으로서, A 내지 D는 상이한 용량의 GLP1/2-Fc를 투여한 마우스에서 전체 장 무게(A) 및 전체 장 길이(B), 소장의 길이(C) 및 결장의 길이(D)를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, E는 각 실험군의 결장에서의 Crypt 깊이를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 데이터는 일원 ANOVA에 이어 Dunnett 검정으로 분석하였다. ** p < 0.01, **** p < 0.0001 대 음성대조군.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(GLP1/2-Fc)의 장 투과성 및 혈청 내 독소 수준에 미치는 영향을 조사한 결과로서, A는 FITC-덱스 트란의 경구투여 후 혈청 형광 강도를 측정함으로써 장 투과성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이고(n=3-4/그룹), B는 혈청 내 내독소(endotoxin) 수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, C는 대표 사진으로서, 회장에서의 zo-i 단백질(녹색) 및 핵(파란색)을 나타내며, D는 횡단된 장 절편에 대하여 PAS 염색을 수행한 결과를 나타내는 일련의 사진이고, E 내지 G는 회장에서의 뮤신 층의 두께(E), 융모 당 술잔세포의 수(F) 및 술잔세포의 풍부도(G)를 측정한 결과를 나타내는 그래프이이다(n=6-10/그룹). 데이터는 일원 분산 분석에 이어 Dunnett 검정으로 분석하였다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 대 음성대조군. 스케일바: 200 ㎛.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(GLP1/2-Fc)이 장내 균총 조성에 미치는 영향을 조사한 결과로서, A 및 B는 PCoA(weighted unifrac)에 의해 분석된 베타 다양성(A) 및 UPGMA 계통수 비교 그룹(B)이고, C 및 D는 문(C) 및 속(D) 수준에서 계통분류학적 상대적 풍부도를 막대그래프로 나타낸 것이며, E는 음성대조군 및 GLP1/2-Fc 투여군에서의 미생물 종의 18개 작동 분류학적 단위(OTU)를 나타내는 히트맵으로서, 각 그룹에서 상대적 풍부도가 적어도 0.1% 이상인 OTU를 통계 분석에 이용하였으며, 컬러 키는 로그비율로 상대적 풍부도를 나타내고, X축 상의 알파벳은 각 그룹에서의 개체를 나타내며, F 내지 L은 Akkermansia muciniphila(F), Mailhella massiliensis(G), Alistipes senegalensis(H), Lactobacillus intestinalis(I) Prevotellamassilia timonensis(J), Faecalibaculum rodentium(K) 및 Acetatifactor의 muris(L)의 상대 존재비를 나타내는 일련의 그래프이다. 데이터는 평균±SEM으로 나타냈으며, 일원 분산 분석에 이어 Dunnett 검정으로 분석하였다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001 대 음성대조군, PCoA: 주요 좌표분석, UPGMA: 비가중평균결합법.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "GLP-1"은 "글루카곤-유사 펩타이드-1(glucagon-like peptide-1)"의 약어로서 프로글루카곤 펩타이드의 조직특이적인 번역 후 가공에 의해 유도되는 30 또는 31 아미노산 길이의 펩타이드 호르몬이다. GLP-1은 음식 섭취 시 소장의 장내분비(enteroendocrine) L-세포 및 뇌간(brain stem)의 고립속(solitary tract) 핵 내의 특정 신경세포에서 생산되어 분비된다. 최초 산물인 GLP-1(1-37)은 쉽게 아마이드화되며 절단에 의해 두 가지의 동등한 생물학적 활성을 가진 절단된 형태(GLP-1(7-36) 아마이드 및 GLP-1(7-37))로 전환된다. 활성 GLP-1은 아미노산 위치 13-20 및 24-35의 두 개의 알파-나선 부위와 상기 두 알파-나선 부위를 연결하는 링커 지역을 포함한다. GLP-1은 포도당-의존적으로 혈당 수준을 낮추는 역할을 수행하기 때문에, 제2형 당뇨병 치료제로 개발되어 사용되고 있다. 그러나, 생체 내에서 GLP-1은 디펩티딜 펩티데이즈-4(DPP-4)에 의해 신속하게 분해되기 때문에 생체 내 반감기가 2분에 불과하여, 자연상태의 펩타이드로는 그 효과가 극히 제한적이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "GLP-2"는 GLP-1과 마찬가지로 프로글루카곤의 특별한 번역 후 절단 공정에 의해 생성되는 33 아미노산 길이의 펩타이드로서 소장의 장내분비 L 세포와 중추신경계의 다양한 신경세포에서 생산이 된다. GLP-2는 음식 섭취 시 GLP-1과 함께 분비가 된다. GLP-2의 경우 투여 시 소장 성장 및 기능을 향상시키고, 뼈의 파괴를 감소시키며 신경보호작용을 하는 것으로 알려지고 있어, 현재 단장증후군이나 크론병, 골다공증과 같은 질환의 치료제로 개발되고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "GLP-1 유사체"는 생물학적으로 GLP-1의 기능을 수행하는 단백질로서 GLP-1/exendin-4 수용체에 결합하여 하류 신호전달을 매개할 수 있는 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "GLP-2 유사체"는 생물학적으로 GLP-2의 기능을 수행하는 단백질로서 GLP-2 수용체에 결합하여 하류 신호전달을 매개할 수 있는 단백질을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "융합단백질"은 둘 이상의 단백질 또는 단백질 내 특정 기능을 담당하는 도메인이 각각의 단백질 또는 도메인이 본연의 기능을 담당하도록 연결된 재조합 단백질(recombinant protein)을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "반감기 증가 모이어티"는 재조합 단백질에 연결되어, 당해 재조합 단백질의 체내 반감기를 향상시키기 위한 기능기를 의미한다. 이러한 "반가기 증가 모이어티"로는 항체 Fc 영역(Capon et al., Nature. 337: 525-531, 1989), PEG(Caliceti and Veronese, Adv. Drug Delivery Rev. 55: 1261-1277, 2003), XTEN(Schellenberger et al., Nat. Biotechnol. 27: 1186-1190, 2009), PAS(Pro-Ala-Ser, Schlapschy et al., Protein Eng. Des. Sel. 26: 489-501, 2013), ELP(elastine-like peptide, Floss et al., Trends Biotechnol. 28: 37-45, 2010), 글리신-풍부 HAP(homo-amino-acid polymer, Schlapschy et al., Protein Eng. Des. Sel. 20: 273-284, 2007), GLK(gelatine-like protein, Huang et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 74(3): 435-441, 2010), 및 혈청 알부민(Sheffield et al., Cell Physiol. Biochem., 45(2): 772-782, 2018) 등이 사용될 수 있으며, 이와 같은 단백질에 부가되는 "반감기 증가 모이어티"에 대하여는 리뷰논문 등을 통해 잘 알려져 있다(Strohl, W. R., BioDrugs, 29(4): 215-239, 2015). 이에, 상기 개별 인자들에 대한 선행논문 및 상기 리뷰논문들은 본 문서에 참조로 삽입이 된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "항체 Fc 영역"은 항체를 파파인으로 절단하였을 때 생성되는 단편 중 결정화되는 단편(crystalized fragment)을 의미하며, Fc 수용체라고 지칭되는 세포 표면 수용체 및 보체계(complement system)의 몇몇 단백질과 상호작용을 한다. Fc 영역은 중쇄의 두 번째 및 세 번째 불변 영역(CH2 및 CH3)을 포함하는 단편이 힌지 부분에서 분자 간 이황화 결합에 의해 연결된 동형 이량체 구조를 나타낸다. IgG의 Fc 영역은 다수의 N-글리칸 부착 부위를 가지고 있으며, 이는 Fc 수용체-매개 작용에 있어서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "하이브리드 Fc 영역"은 다양한 서브타입의 Ig Fc 영역의 부분들의 조합에 의해 생성된 Fc 영역 펩타이드를 의미하며, 이러한 Fc 영역의 부분들의 조합에 의해 Fc 수용체 및 보체와의 결합능에 있어서 야생형 Fc 영역과 차이를 나타낼 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Exendin"은 도마뱀 Heloderma suspectum의 독에서 분리된 39 아미노산으로 구성된 펩타이드이다. Exendin 4는 GLP-1과 아미노산 서열상 50% 동일하며, 글루카곤 펩타이드 패밀리의 일원으로, GLP-1 수용체의 작용제로서 GLP-1과 동등한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. Exendin-4는 최근 및 "extenatide"로도 불린다. Exendin 3는 상기 Exendin 4에서 두 번째 및 세 번째 아미노산이 각각 세린 및 아스파르트산으로 치환된 변이체이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Lixisenatide"는 GLP-1 수용체 작용제 중 하나로서, Sanofi사에 의해 제조되어, 유럽에서는 Lyxumia라는 상표명으로, 미국에서는 Adlyxin이라는 상표명으로 제2형 당뇨병 치료를 위한 일일 투여 주사제로 판매되고 있는 약물이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Albiglutide"는 GSK사에 의해 유럽에서는 Eperzan이라는 상표명으로, 미국에서는 Tanzeum이라는 상표명으로 제2형 당뇨병 치료제로 판매되고 있는 GLP-1 수용체 작용제 중의 하나이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Liraglutide"는 Novo Nordisk사에 의해 "Victoza"라는 상표명으로 제2형 당뇨병 및 비만 치료제로 판매되고 있는 피하주사형 GLP-1 수용체 작용제이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Taspoglutide"는 Ipsen사와 Roche사에 의해 공동개발된 GLP-1 수용체 작용제로 제2형 당뇨병 치료제로, GLP-1(7-36) 펩타이드의 8번째 및 35번째 아미노산인 알라닌이 메틸화되어 있고 마지막 아미노산이 아마이드화되어 있는 GLP-1 유도체이다. 단, 다른 펩타이드와 융합단백질의 형태로 제조될 경우에는 C-말단이 아마이드화되지 않고 일반적인 카르복실기인 경우도 무방하다.
본 문서에서 사용되는 용어 "XTEN"은 Amunix사에 의해 개발된 단백질 의약품의 생체 내 반감기를 향상시키기 위해 부가되는 6개의 아미노산을 포함하는 비구조화된(unstructed) 저면역원성 펩타이드로서 통상 144 a.a를 단위로 하여 그의 배수의 아미노산으로 구성되어 있다(US20100239554A1).
본 문서에서 사용되는 용어 "Teduglutide"는 GLP-2의 2번째 아미노산인 알라닌(A)이 글라이신(G)로 치환된 돌연변이체로서 미국에서는 Gattex라는 상표명으로, 유럽에서는 Revestive라는 상표명으로 단장증후군 치료제로 판매되고 있는 GLP-2 유사체이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Glepaglutide"는 반감기가 향상된 GLP-2 유사체로 단장증후군 치료제로 개발되어 현재 단장증후군에 대하여 임상 3상시험을 진행 중인 약물이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "GLP-2 analogue 10"는 GLP-2 유사체 중 하나로서 GLP-2의 11번째 및 18번째 아미노산을 시스테인으로 치환하여 두 치환된 시스테인의 티올기를 통해 지질화된 분자 내 가교제가 연결됨으로써 안정화된 구조를 갖게 되고, C-말단에 Exendin 4의 C-말단의 9개 아미노산을 부가한 것을 특징으로 한다(Yang et al., J. Med. Chem. 61: 3218-3223, 2018).
본 문서에서 사용되는 용어 "링커 펩타이드"는 둘 이상의 다른 생물학적 활성을 가진 단백질 또는 펩타이드를 연결하여 융합단백질을 제조할 사용되는 비구조화된 펩타이드이다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, i) GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체가 융합된 이중 특이성 융합단백질 또는 ii) GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 대사증후군 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, i) GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체가 융합된 이중 특이성 융합단백질 또는 ii) GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 비만 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, i) GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체가 융합된 이중 특이성 융합단백질 또는 ii) GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 제2형 당뇨병 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, i) GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체가 융합된 이중 특이성 융합단백질 또는 ii) GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, i) GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체가 융합된 이중 특이성 융합단백질 또는 ii) GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 간 섬유증 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 GLP-1 유사체는 GLP-1, 엑센딘 3(Exendin 3), 엑센딘 4(Exendin 4), GLP-1/Exendin 4 하이브리드 펩타이드, GLP-1-XTEN, Exendin 4-XTEN, Lixisenatide, Albiglutide, Liraglutide, 또는 Taspoglutide일 수 있다. 선택적으로, 상기 GLP-1 유사체는 두 개의 GLP-1이 링커 펩타이드에 의해 연결된 GLP-1 연속 반복체일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 i)의 이중 특이성 융합단백질은 반감기 증가 모이어티를 추가로 포함할 수 있고, 상기 반감기 증가 모이어티는 상기 GLP-1 유사체와 GLP-2 유사체 사이에 삽입이 되거나 전체 융합단백질의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있으며, 상기 반감기 증가 모이어티는 항체 Fc 영역, PEG, XTEN, PAS(Pro-Ala-Ser), ELP(elastin-like peptide), 글리신-풍부 HAP(homo-amino-acid polymer), GLP(gelatine-like protein), 또는 혈청 알부민일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 GLP-1은 서열번호 1 또는 2로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 Exendin 3는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 Exendin 4는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 GLP-1/Exendin 4 하이브리드는 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 Lixisenatide는 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 Exendin 4-XTEN은 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 Albiglutide는 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 Liraglutide는 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 Taspoglutide는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 GLP-1 연속 반복체는 서열번호 11로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 항체 Fc 영역은 하이브리드 항체 Fc 영역일 수 있고, 상기 하이브리드 항체 Fc 영역은 서열번호 12 내지 16으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 것일 수 있다. 아울러, 상기 하이브리드 항체 Fc 영역은 ADCC(antibody-dependent cell cytotoxicity)나 CDC(complement-dependent cytotoxicity)와 같은 체내 투여 시 원하지 않은 부작용을 유발하지 않도록 추가적으로 변이된 것일 수 있다. 이러한 하이브리드 항체 Fc 영역은 대한민국 특허 제897938호에 기재된 것일 수 있고, 서열번호 13로 기재되는 아미노산 서열로 구성이 되는 하이브리드 Fc 영역의 18번째 아미노산인 트레오닌(T)가 글루타민(Q)로 치환되고, 196번째 아미노산인 메티오닌(M)이 류신(L)으로 치환된 서열번호 14로 기재되는 하이브리드 Fc 영역 변이체 또는 서열번호 12로 기재되는 아미노산 서열로 구성이 되는 하이브리드 Fc 영역의 18번째 아미노산인 트레오닌(T)가 글루타민(Q)로 치환되고, 196번째 아미노산인 메티오닌(M)이 류신(L)으로 치환된 서열번호 15로 기재되는 아미노산 서열로 구성이 되는 하이브리드 Fc 영역 변이체일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 GLP-2 유사체는 GLP-2, Teduglutide, Glepaglutide, 또는 GLP-2 analogue 10일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 GLP-2는 서열번호 17 내지 20 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 18로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드는 인간 GLP-2 야생형 펩타이드이고, 서열번호 17로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 GLP-2 변이체는 2번째 아미노산인 알라닌이 글라이신으로 치환된 것으로서 Teduglutide로도 불린다. 한편, 서열번호 19로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 GLP-2 변이체는 2번째 아미노산인 알라닌(A)이 글라이신(G)로 변이되었을 뿐만 아니라 16번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 글라이신(G)으로 변이되고 17번째 아미노산인 류신(L)이 글루타민(Q)로 변이가 된 GLP-2 변이체(GLP-2 A2G, N16G, L17Q)로서 GLP-2로서의 기능은 그대로 유지하면서도 재조합 생산 시 GLP-2의 이량체화나 그로 인한 응집체 형성을 억제하는 것으로 알려지고 있다(Baker et al., J. Mol. Recognit. 25: 155-164, 2012). 선택적으로 GLP-2 야생형 펩타이드에서 2번째 아미노산인 알라닌이 글라이신으로 치환되고 17번째 아미노산인 류신이 글루타민으로 치환된 것(A2G, L17Q, 서열번호 20)도 상기 서열번호 19로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 GLP-2 유사체와 동등한 기능을 발휘할 수 있으므로, 본 발명에서 GLP-2 유사체로 사용하는 것이 가능하다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 Teduglutide는 서열번호 21으로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 Glepaglutide는 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 GLP-2 analogue 10는 서열번호 23로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 제1융합단백질은 서열번호 24 내지 30으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 제2융합단백질은 서열번호 31 내지 36으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 제1융합단백질은 하이브리드 Fc 영역 중 CH3 도메인의 10번째 아미노산인 세린이 시스테인(C)으로 치환되고, 22번째 아미노산인 트레오닌(T)이 트립토판(W)으로 치환된 것(Knob 구조)일 수 있고, 제2융합단백질은 Fc 영역 중 CH3 도메인의 5번째 아미노산인 타이로신(Y)이 시스테인(C)로, 22번째 아미노산인 트레오닌이 세린(S)로, 24번째 아미노산인 류신(L)이 알라닌(A)로, 63번째 아미노산인 타이로신(Y)이 발린(V)로 치환된 것(Hole 구조)일 수 있고, 반대로 상기 제1융합단백질은 Fc 영역 중 CH3 도메인의 5번째 아미노산인 타이로신(Y)이 시스테인(C)로, 22번째 아미노산인 트레오닌이 세린(S)로, 24번째 아미노산인 류신(L)이 알라닌(A)로, 63번째 아미노산인 타이로신(Y)이 발린(V)로 치환된 것(Hole 구조)일 수 있고, 상기 제2융합단백질은 하이브리드 Fc 영역 중 CH3 도메인의 10번째 아미노산인 세린이 시스테인(C)으로 치환되고, 22번째 아미노산인 트레오닌(T)이 트립토판(W)으로 치환된 것(Knob 구조)일 수 있다.
선택적으로, 상기 제1융합단백질은 하이브리드 Fc 영역 중 CH3 도메인의 22번째 아미노산인 트레오닌(T)가 타이로신(Y)로 치환되고, 상기 제2융합단백질은 하이브리드 Fc 영역 중 CH3 도메인의 63번째 아미노산인 타이로신(Y)이 트레오닌(T)로 치환된 것이고, 상기 제2융합단백질은 하이브리드 Fc 영역 중 CH3 도메인의 63번째 아미노산인 타이로신(Y)이 트레오닌(T)로 치환된 것이고, 상기 제1융합단백질은 하이브리드 Fc 영역 중 CH3 도메인의 63번째 아미노산인 타이로신(Y)이 트레오닌(T)로 치환된 것일 수 있다. 다만 상기 63번째 아미노산의 변이는 서열번호 69로 기재되는 인간 IgG1의 CH3 도메인의 아미노산 서열이 기준이 아니라 IMGT(international ImMunoGeneTics information system)의 numbering 규칙에 따르면(Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 27: 55-77, 2003), Y86T로 표시 될 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 융합단백질의 융합파트너들 사이, 즉 펩타이드 또는 도메인 사이에는 하나 이상의 링커 펩타이드가 삽입이 될 수 있다. 즉, 상기 i)의 GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체가 융합된 이중 특이성 융합단백질의 경우 GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체 사이에 링커 펩타이드가 삽입이 될 수 있고, 상기 ii)의 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질의 경우 제1융합단백질 내부의 GLP-1 유사체와 항체 Fc 영역 사이에 링커 펩타이드가 삽입이 될 수 있고, 마찬가지로 제2융합단백질 내의 GLP-2 유사체와 항체 Fc 영역 사이에 링커 펩타이드가 삽입이 될 수 있다. 이 때, 상기 링커 펩타이드는 N-글리칸 부착 부위를 포함하거나 포함하지 않는 것일 수 있고, 더 바람직하게는 상기 제1융합단백질은 상기 링커 펩타이드에 N-글리칸 부착 부위를 포함하지 않고 상기 제2융합단백질은 상기 링커 펩타이드에 N-글리칸 부착 부위를 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 제1융합단백질 및 상기 제2융합단백질 모두 N-글리칸 부착 부위를 포함하지 않는 것일 수도 있다.
상기 링커 펩타이드는 EPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 37), EPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 38), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 39), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 40), AKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECP(서열번호 41), GGGGSGGGGSGGGGSEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 42), GGGGSGGGGSGGGGSAKNTTAPATTRNTTRGGEEKKKEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 43), AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 44), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 45), GGSGG(서열번호 46), GGSGGSGGS(서열번호 47), GGGSGG(서열번호 48), 서열번호 (G4S)n(단위체: 서열번호 49, n은 1 내지 10의 정수), (GGS)n(n은 1 내지 10의 정수), (GS)n(n은 1 내지 10의 정수), (GSSGGS)n(단위체: 서열번호 50, n은 1 내지 10의 정수), KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 51), EGKSSGSGSESKST(서열번호 52), GSAGSAAGSGEF(서열번호 53), (EAAAK)n(단위체: 서열번호 54, n은 1 내지 10의 정수), CRRRRRREAEAC(서열번호 55), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 56), GGGGGGGG(서열번호 57), GGGGGG(서열번호 58), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 59), PAPAP(서열번호 60), (Ala-Pro)n(n은 1 내지 10의 정수), VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 61, PLGLWA(서열번호 62), TRHRQPRGWE(서열번호 63), AGNRVRRSVG(서열번호 64), RRRRRRRR(서열번호 65), GFLG(서열번호 66), GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 67), 또는 GSTSGSGKPGSGEGS(서열번호 68)일 수 있다.
상기 조성물은 악학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있고, 상기 담체 외에 약학적으로 허용가능한 보조제, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 포유동물에 투여 시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들면, 경구, 비경구, 예를 들면 좌제, 경피, 정맥, 복강, 근육내, 병변내, 비강, 척추관내 투여로 투여될 수 있으며, 또한 서방형 또는 연속적 또는 반복적 방출을 위한 이식장치를 사용하여 투여될 수 있다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
상기 조성물의 환자에 대한 투여량은 환자의 신장, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물들을 포함하는 많은 요소들에 따라 다르다. 약학적으로 활성인 단백질은 100 ng/체중(kg) - 10 ㎎/체중(㎏)의 양으로 투여될 수 있고, 더 바람직하게는 1 내지 500 ㎍/kg(체중)으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 5 내지 50 ㎍/kg(체중)으로 투여될 수 있는데, 상기 요소들을 고려하여 투여량이 조절될 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 i) GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체가 융합된 이중 특이성 융합단백질 또는 ii) GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 대사증후군에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 대사증후군 치료방법이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 i) GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체가 융합된 이중 특이성 융합단백질 또는 ii) GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 비만에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 비만 치료방법이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 i) GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체가 융합된 이중 특이성 융합단백질 또는 ii) GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 제2형 당뇨병에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 제2형 당뇨병 치료방법이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 i) GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체가 융합된 이중 특이성 융합단백질 또는 ii) GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염 치료방법이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 i) GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체가 융합된 이중 특이성 융합단백질 또는 ii) GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 간 섬유증에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 간 섬유증 치료방법이 제공된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "치료적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg일 수 있으나, 유효 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
상기 둘 이상의 펩타이드 또는 도메인 사이에는 통상적으로 유연한 구조를 갖는 링커 펩타이드(linker peptide)가 삽입될 수 있다. 상기 링커 펩타이드는 EPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 37), EPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 38), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 39), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 40), AKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECP(서열번호 41), GGGGSGGGGSGGGGSEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 42), GGGGSGGGGSGGGGSAKNTTAPATTRNTTRGGEEKKKEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 43), AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 44), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 45), GGSGG(서열번호 46), GGSGGSGGS(서열번호 47), GGGSGG(서열번호 48), 서열번호 (G4S)n(단위체: 서열번호 49, n은 1 내지 10의 정수), (GGS)n(n은 1 내지 10의 정수), (GS)n(n은 1 내지 10의 정수), (GSSGGS)n(단위체: 서열번호 50, n은 1 내지 10의 정수), KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 51), EGKSSGSGSESKST(서열번호 52), GSAGSAAGSGEF(서열번호 53), (EAAAK)n(단위체: 서열번호 54, n은 1 내지 10의 정수), CRRRRRREAEAC(서열번호 55), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 56), GGGGGGGG(서열번호 57), GGGGGG(서열번호 58), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 59), PAPAP(서열번호 60), (Ala-Pro)n(n은 1 내지 10의 정수), VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 61, PLGLWA(서열번호 62), TRHRQPRGWE(서열번호 63), AGNRVRRSVG(서열번호 64), RRRRRRRR(서열번호 65), GFLG(서열번호 66), GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 67), 및 GSTSGSGKPGSGEGS(서열번호 68) 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 이중 특이성 융합단백질은 상기 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1유전자 컨스트럭트 및 상기 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 발현벡터를 숙주세포에 형질도입한 후 재조합 방식으로 발현함으로써 생산이 가능하다.
이 경우, 상기 제1유전자 컨스트럭트 및 제2유전자 컨스트럭트는 하나의 발현벡터에 삽입되어 발현되거나, 두 개의 개별적인 발현벡터에 삽입되어 발현이 될 수 있다. 전자의 경우 두 개의 별개의 조절서열에 각각의 유전자 컨스트럭트가 작동가능하게 연결되도록 벡터를 고안하거나 두 유전자 컨스트럭트가 하나의 조절서열에 작동가능하게 연결이 되고, 양 유전자 컨스트럭트를 내부 리보좀 진입 부위(internal ribosome entry site, IRES)가 연결하는 방식을 사용할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked to)"이란 목적으로 하는 핵산서열(예컨대, 시험관 내 전사/번역 시스템에서 또는 숙주세포에서)이 그의 발현이 이루어질 수 있도록 하는 방식으로 상기 조절서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다.
상기 "조절서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 조절서열에는 많은 숙주세포에서 목적으로 하는 핵산이 항상적으로 발현될 수 있도록 지시하는 것, 특정한 조직세포에서만 목적으로 하는 핵산이 발현될 수 있도록 지시하는 것(예, 조직특이적 조절서열), 그리고 특정 신호에 의해 발현이 유도되도록 지시하는 것(예, 유도성 조절서열)이 포함된다. 발현벡터의 설계는 형질전환될 숙주세포의 선택 및 원하는 단백질 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것은 당업자라면 이해할 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 숙주 세포에 도입되어 상기 융합 단백질을 발현할 수 있다. 상기 진핵세포 및 원핵세포에서 발현을 가능하게 하는 조절서열들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상술한 바와 같이, 이들은 보통 전사개시를 담당하는 조절서열들 및, 선택적으로 전사물의 전사종결 및 안정화를 담당하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가적인 조절서열들은 전사조절인자 외에도 번역 증진인자 및/또는 천연-조합 또는 이종성 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 포유류 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 가능한 조절서열들은 CMV-HSV 티미딘 키나아제 프로모터, SV40, RSV-프로모터(로우스 육종 바이러스), 인간 신장 요소 1α-프로모터, 글루코코르티코이드-유도성 MMTV-프로모터(몰로니 마우스 종양 바이러스), 메탈로티오네인-유도성 또는 테트라사이클린-유도성 프로모터 또는, CMV 증폭제 또는 SV40-증폭제와 같은 증폭제를 포함한다. 신경 세포 내 발현을 위해, 신경미세섬유-프로모터(neurofilament-promoter), PGDF-프로모터, NSE-프로모터, PrP-프로모터 또는 thy-1-프로모터들이 사용될 수 있다는 것이 고려되고 있다. 상기 프로모터들은 당 분야에 알려져 있으며, 문헌(Charron, J. Biol. Chem. 270: 25739-25745, 1995)에 기술되어 있다. 원핵세포 내 발현을 위해, lac-프로모터, tac-프로모터 또는 trp 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터들이 개시되어 있다. 전사를 개시할 수 있는 인자들 외에, 상기 조절서열들은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 하류(downstream)에 SV40-폴리-A 부위 또는 TK-폴리-A 부위와 같은 전사 종결 신호를 포함할 수도 있다. 본 문서에서, 적당한 발현 벡터들은 당 분야에 알려져 있으며, 그 예로는 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1(Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(Invitrogene), pSPORT1(GIBCO BRL), pGX-27(특허 제1442254호), pX(Pagano et al., Science 255: 1144-1147, 1992), 효모 2-혼성(two-hybrid) 벡터, 가령 pEG202 및 dpJG4-5(Gyuris et al., Cell 75: 791-803, 1995) 또는 원핵 발현 벡터, 가령 람다 gt11 또는 pGEX(Amersham Pharmacia)가 있다. 본 발명의 핵산 분자들 외에, 벡터는 분비 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분비신호들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그리고, 사용된 발현 시스템에 따라, 융합단백질을 세포 구획으로 이끌 수 있는 리더서열(leader sequence)이 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 코딩 서열에 조합되며, 바람직하게는 해독된 단백질 또는 이의 단백질을 세포질 주변 또는 세포외 매질로 직접 분비할 수 있는 리더 서열이다.
또한, 본 발명의 벡터는 예를 들면, 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 제조될 수 있으며, 표준 재조합 DNA 기술에는 예를 들면, 평활말단 및 접착말단 라이게이션, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 처리, 부적합한 결합을 방지하기 위하여 알칼리 포스테이즈 처리에 의한 인산기 제거 및 T4 DNA 라이게이즈에 의한 효소적 연결 등이 포함된다. 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 신호 펩타이드를 코딩하는 DNA, 본 발명의 이중 특이성 융합단백질을 암호화하는 DNA를 적절한 조절서열이 포함되어 있는 벡터에 재조합함으로써 본 발명의 벡터가 제조될 수 있다. 상기 조절 서열이 포함되어 있는 벡터는 상업적으로 구입 또는 제조할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 pBispecific backbone vector(Genexine, Inc., 대한민국)또는 pAD15 vector를 골격 벡터로 사용하였다.
상기 발현벡터는 분비 신호서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 분비 신호서열은 세포내에서 발현되는 재조합 단백질의 세포 밖으로의 분비를 유도하며, tPA(tissue plasminogen activator) 신호서열, HSV gDs(단순포진 바이러스 당단백질 Ds) 신호서열 또는 성장호르몬 신호서열일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 발현벡터는 숙주세포에서 상기 단백질을 발현하도록 할 수 있는 발현벡터일 수 있으며, 상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 벡터, 파지미드 벡터, 인공 인간 염색체 등 그 어떠한 형태를 나타내더라도 무방하다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 이중 특이성 융합단백질을 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 이중 특이성 융합단백질을 간 섬유증에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간 섬유증의 치료방법이 제공된다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예: 이중 특이성 융합단백질의 고안
본 발명자들은 GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체를 모두 포함하는 다양한 이중 특이성 융합단백질을 하기 도 1 및 표 1과 같이 고안하였다.
상기 이중 특이성 융합단백질을 고안함에 있어서, 중점적으로 고려한 사항은 도 2에 기재된 바와 같이, GLP-1 수용체인 GLP-1R에는 GLP-1 외에도 Exendin 4(Ex4), 옥신토모듈린(OXM), GLP-2가 모두 결합하는 반면, GLP-2R에는 GLP-2만 결합한다는 점이다. 뿐만 아니라, GLP-1R의 경우 위장관(gastrointestinal tract, GI tract) 외에도 뇌, 심장, 간, 근육 및 췌장 등 다양한 장기에서 발현이 되기 때문에, 위장관 특이적으로 GLP-1이 작용될 수 있도록 하기 위해서는 GLP-1R과의 친화도를 다소 낮출 필요가 있다. 이에, 본 발명자들은 GLP-1 유사체의 GLP-1R와의 결합력을 다소 낮추기 위해, GLP-1 유사체의 링커 부분에 글리칸이 부착될 수 있도록 글리칸 부착 도메인이 부가된 것을 사용하였다. 반대로 GLP-2를 포함하는 제2융합단백질에 글리칸 링커가 포함되도록 하고 반대로 GLP-1 유사체를 포함하는 제1융합단백질에 글리칸 부착부위를 포함하지 않는 비변형 링커가 포함되도록 한 이중 특이성 융합단백질(MG12-6)도 고안하였다. 아울러, 본 발명자들은 GLP-2의 17번째 알라닌이 글루타민으로 추가로 치환된 GLP-2 유사체를 사용한 이중 특이성 융합단백질 MG12-7 및 MG12-8을 고안하였다. 이 때 MG12-7 및 MG12-8의 차이점은 MG12-7은 GLP-1로 서열번호 1로 기재되는 A2G 변이체를 사용하는 반면 MG12-8은 상기 A2G 변이체 두 개가 (G4S)6 링커로 연결된 연속 반복체(tandem repeat)를 사용한다는 점이다.
실시예 명칭 GLP-1/2 유사체(서열번호) 링커(서열번호) Fc 영역 전체구성(서열번호)
1 MG12-1 1. GLP-1(1)
2. GLP-2(17)		 글리칸 링커(43)
비변형(42)		 knob
hole		 제1융합단백질(24)
제2융합단백질(32)
2 MG12-2 1. GLP-2(17)
2. GLP-1(1)		 글리칸 링커(43)
비변형(42)		 knob
hole		 제2융합단백질(33)
제1융합단백질(25)
3 MG12-3 1. Exendin 4(4)
2. GLP-2(17)		 글리칸 링커(43)
비변형(42)		 knob
hole		 제1융합단백질(26)
제2융합단백질(32)
4 MG12-4 1. GLP-1/Exendin 4 hybrid(5)
2. GLP-2(17)		 글리칸 링커(43)
비변형(42)		 knob
hole		 제1융합단백질(27)
제2융합단백질(34)
5 MG12-5 1. GLP-1/Exendin 4 hybrid(5)
2. GLP-2(17)		 비변형(42)
비변형(42)		 knob
hole		 제1융합단백질(28)
제2융합단백질(34)
6 MG12-6 1. GLP-2(17)
2. GLP-1/Exendin 4 hybrid(5)		 글리칸 링커(43)
비변형(42)		 knob
hole		 제2융합단백질(35)
제1융합단백질(28)
7 MG12-7 1. GLP-1/Exendin 4 hybrid(5)
2. GLP-2(19)		 글리칸 링커(43)
비변형(39)		 knob
hole		 제1융합단백질(29)
제2융합단백질(36)
8 MG12-8 1. GLP-1(11)
2. GLP-2(19)		 비변형(39)
비변형(39)		 knob
hole		 제1융합단백질(30)
제2융합단백질(36)
아울러, 상기 이중 특이성 융합단백질의 경우 이종 이량체(heterodimer)가 우선적으로 생성되도록 하기 위해서 Knob-into-holes 기술을 적용시켰다. 즉, 제1융합단백질은 하이브리드 Fc 영역 중 CH3 도메인의 10번째 아미노산인 세린(S)이 시스테인(C)으로 치환되고, 22번째 아미노산인 트레오닌(T)이 트립토판(W)으로 치환된 것(Knob)일 수 있고, 제2융합단백질은 Fc 영역 중 CH3 도메인의 5번째 아미노산인 타이로신(Y)이 시스테인(C)로, 22번째 아미노산인 트레오닌(T)이 세린(S)로, 24번째 아미노산인 류신(L)이 알라닌(A)으로, 63번째 아미노산인 타이로신(Y)이 발린(V)으로 치환된 것(Hole)일 수 있다. 이때, 상기 변이가 일어난 아미노산의 위치는 기준서열(서열번호 69의 인간 IgG1 CH3 도메인의 아미노산 서열)을 기준으로 한다. 만일 상기 CH3 도메인 상에 Knob-into-Holes 구조와 무관한 부위에서 아미노산의 부가, 결실 또는 치환 등의 추가적인 변이가 발생한 경우라도 상기 기준서열을 기준으로 하여 해당 위치에 상응하는 아미노산이 변이된 것을 사용하면 된다. 선택적으로, 상기 Knob-into-Holes 구조는 당업계에 잘 알려진 다른 아미노산 변이를 통해 도입될 수 있다. 이러한 변이는 선행문헌(Wei et al., Oncotarget 2017, 8(31): 51037-51049; Ridgway et al., Protein Eng. 1996, 9(7): 617-621; Carter, P., J. Immunol. Methods 2001, 48(1-2): 7-15; Merchant et al., Nat. Biotechnol. 1998, 16(7): 677-681)에 잘 기술되어 있다. 이러한 선택적인 변이로는 예컨대 제1융합단백질의 CH3 도메인의 22번째 아미노산인 트레오닌이 타이로신으로 치환된 Knob 구조 및 제2융합단백질의 CH3 도메인의 63번째 아미노산인 타이로신이 트레오닌으로 치환된 Hole 구조의 조합을 통해 이중 특이성 이량체 융합단백질이 생성될 수 있다. 상기 Knob-into-Holes 구조는 반대로 상기 제1융합단백질에 Hole 구조가 도입되고, 상기 제2융합단백질에 Knob 구조가 도입되어 형성될 수 있다.
상기와 같이 고안한 실시예 1 내지 8의 이중 특이성 융합단백질의 제1융합단백질 및 제2융합단백질을 암호화하는 유전자 컨스트럭트를 PCR 및 위치지정 돌연변이 유도 프라이머를 이용하여 증폭함으로써 각각 합성한 후, 이를 각각 pAD15 벡터(Genexine, Inc., 대한민국)에 삽입함으로써, 발현벡터를 제조하였다.
상기와 같이 제조된 벡터 컨스트럭트들을 Thermo Fisher사의 ExpiCHO kit를 이용하여 일시적 발현을 수행하였다. 구체적으로 ExpiCHO-S cell에 상기와 같이 제조된 벡터 컨스트럭트와 키트 내에 포함되어 있는 ExpiFectamine 시약을 혼합한 후 8% CO2 및 37℃의 조건을 갖춘 배양기에서 1일간 배양 후 온도를 32℃로 낮춰서 7일 차까지 배양을 진행하였다.
상기 배양을 통해 얻어진 상층액을 Protein A 칼럼 및 이차 칼럼을 통해 정제된 실시예 1 내지 5의 융합단백질(각각, 'MG12-1',' 'MG12-2', 'MG12-3', 'MG12-4', 및 'MG12-5'로 명명함)을 4X LDS 시료 완충액과 주사용수로 적절히 희석하여 최종 3-10 μg/20 μL이 되도록 조제하였다. 환원조건 시료의 경우 각 분석하고자 하는 물질과 4X LDS 시료 완충액, 10X 환원제와 주사용수를 적절히 희석하여 최종 3-10 μg/20 μL이 되도록 조제하고 70℃ 가열블록에서 10분간 가열하였다. 준비된 시료를 미리 설치된 전기영동 장비에 고정된 겔의 각 웰에 20 μL씩 적재하였다. 사이즈 마커의 경우 3~5 μL/well을 적재하였다. 전원공급장치를 120 V, 90분으로 설정한 후 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 완료된 겔을 분리한 후 염색용액 및 탈-염색 용액을 이용하여 염색하고, 결과를 분석하였다.
분석결과 도 3a에서 확인되는 바와 같이, 모든 이중 특이성 융합단백질들은 비-환원 조건에서 50~75 kDa 사이, 환원 조건에서는 37 kDa 부위에서 관찰되었다. 이형 이량체 형태를 이루고 있는 본 발명의 이중 특이성 융합단백질들 중에서 한쪽의 힌지에 당쇄를 포함하고 있는 실시예 1 내지 4의 융합단백질의 경우, 환원 조건에서 두 개의 서로 다른 크기를 갖는 단량체들이 관찰되었고, 힌지에서의 당쇄를 포함하지 않는 실시예 5의 융합단백질(MG12-5)의 경우는 하나의 크기를 갖는 단량체가 관찰되었다.
아울러, 본 발명자들은 Knob into Holes(KiH) 구조를 포함하지 않는 Fc와 융합된 GLP-2 동형 이량체(GLP-2-Fc homodimer, 서열번호 25)와 Knob into Hole 구조를 포함한 MG12-5를 각각 위와 동일한 환원/비-환원 조건에서 SDS-PAGE 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 3b에서 확인되는 바와 같이, KiH 구조를 포함한 MG12-5의 경우 그렇지 않은 GLP-2-Fc 동형이량체 대비 비환원 조건에서 단량체 형태의 불순물 형성이 현저히 억제됨을 확인하였다.
결론적으로, SDS-PAGE를 통하여 본 발명의 실시예에 따른 모든 이중 특이성 융합단백질이 정상적으로 생산 및 정제될 수 있었고, 특히 MG12-5와 GLP-2-Fc 동형 이량체의 비교를 통해 증명되었듯이, KiH 구조를 적용한 이중 특이성 이중단백질의 경우 그렇지 않은 경우에 비해 단량체 형태의 불순물 형성이 현저히 저하되는 것을 확인하였다.
실험예 1: GLP-1 시험관 내 활성 확인
본 발명자들은 상기 실시예에서 제조된 이중 특이성 융합단백질의 GLP-1 시험관 내(in vitro) 활성을 cAMP 분석으로 조사하였다. 구체적으로, GLP-1 특이적인 반응에 의해 cAMP가 유도되는 정도를 평가하기 위해, cAMP 특이적으로 루시페린을 발현하는 세포주에 GLP-1 수용체를 함께 발현할 수 있도록 형질전환 세포주(GLP1R_cAMP/luc)를 제작하였다. 상기 세포를 해동 및 적절히 유지시킨 후, 0.05% TE(Trypsin EDTA)를 첨가하여 세포를 플라스크로부터 분리하고, 살아 있는 세포 수를 계수하였다. 활성 평가에 필요한 세포 수만큼 회수하여 세척하고, 0.5% FBS, DMEM/고 포도당 배지로 세포를 희석하여 2x104 cell/80 μL/well로 파종하였다. 16시간 정도 37℃, 5% CO2 배양기에서 세포를 배양한 후, 평가하고자 하는 다양한 농도의 검액을 20 μL/well로 처리하고 5시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 반응 시켰다. 반응이 완료된 플레이트에 Bright-GloTM 분석 시약을 100 μL/well로 처리한 후 2분간 상온에서 반응시켰다. 반응이 종료된 플레이트를 Luminometer에 삽입하고 생물발광 정도를 측정하였다.
분석 결과, 표 2 및 도 4a 내지 4e에서 확인되는 바와 같이 GLP-1-Fc 동형 이량체의 경우 천연 GLP-1 펩타이드 대비 약 72%의 활성을 나타내었고, 본 발명의 실시예 1, 3, 4 및 5에 따른 이중 특이성 융합단백질(각각 MG12-1, 3, 4 및 5)은 각각 9%, 118%, 39%, 35%의 상대활성을 나타내었다. DPP-4 효소에 의한 절단을 방지하기 위해 N-말단 돌연변이가 도입되고, GLP-1과 접합된 힌지에 당쇄를 포함하는 MG12-1의 경우 당쇄화에 의하여 활성이 약 11배 감소되는 현상을 보였고, MG12-1에서 GLP-1 대신 Exendin 4를 도입한 MG12-3의 경우 MG12-1 보다 약 13배 증가한 활성을 보였다. MG12-1에서 GLP-1 대신 GLP-1과 Exendin 4가 혼합된 GLP-1/Exendin 4 하이브리드가 도입된 MG12-4 및 MG12-5는 힌지의 당쇄화 유무와 상관없이 약 35-39%로 유사한 상대활성을 나타내었다.
본 발명의 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질의 시험관 내 GLP-1 활성
　 GLP-1 펩타이드 GLP-1-Fc
동형 이량체		 실시예 1 실시예 3 실시예4 실시예 5
EC50 (pM) 26 36 304 22 66 75
GLP-1 대비
상대활성(%)		 100 72 9 118 39 35
실험예 2: GLP-2 시험관 내 활성 확인
본 발명자들은 상기 실시예에서 제조된 이중 특이성 융합단백질의 GLP-2 시험관 내(in vitro) 활성을 cAMP 분석으로 조사하였다.
구체적으로, GLP-2 특이적인 반응에 의해 cAMP가 유도되는 정도를 평가하기 위해, cAMP 특이적으로 열리는 CNG 채널을 발현하는 세포주에 GLP-2 수용체를 발현하게 한 형질전환 세포주(Human GLP2R ACTOneTM)를 확보하였다. 상기 세포를 해동 및 적절히 유지시킨 후, GLP-1 시험관 내 활성 분석과 동일한 조건으로 세포를 플라스크로부터 분리하고 활성 평가에 필요한 세포 수만큼 회수하여 세척하였다. 세척한 세포를 세포배양 배지(DMEM/고포도당 배지, 10% FBS, 5% G418, 0.01% puromycin)로 희석하여 3~5x104 cell/100 μL/well로 파종한 후 20시간 정도 37℃, 5% CO2 배양기에서 세포를 배양하였다. CO2 배양기에서 플레이트를 꺼낸 후 현미경으로 세포를 관찰하고 세포의 포화도가 80% 이상이 되었을 때, 1X 염료 적재 용액 (EliteTM fluorescent membrane potential dye kit, eEnzyme)을 100 μL/well로 첨가하였다. 실온에서 차광하여 2~2.5시간 반응시키고, 검액을 첨가하기 전 ELISA를 이용하여 형광 기준치(Fluorescence baseline, F0)를 측정하였다. 그 후 평가하고자 하는 다양한 농도의 검액을 50 μL/well로 처리하고 0.5시간 동안 반응시킨 다음, ELISA를 이용하여 형광값(Ft)을 측정하였다. Ft/F0 비율을 이용하여 각 검액의 반응성을 평가하였다.
그 결과, 도 5a 내지 5e에서 확인되는 바와 같이, GLP-2-Fc 동형 이량체의 경우 천연 GLP-2 펩타이드 대비 약 132%의 활성을 나타내었고, 본 발명의 실시예 1, 3, 4 및 5에 따른 이중 특이성 융합단백질(각각 MG12-1, 3, 4, 및 5)는 각각 43%, 54%, 48%, 59%의 상대활성을 나타내었다. 모든 MG12 변이체들은 DPP-4 효소에 의한 절단을 방지하기 위해 N-말단 돌연변이가 도입되고, GLP-1의 경우와는 다르게 GLP-2가 접합된 힌지에 당쇄를 포함하지 않기 때문에 모든 변이체들은 거의 유사한 GLP-2 활성을 나타내는 것으로 확인하였다.
본 발명의 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질의 시험관 내 GLP-2 활성
　 GLP-2
펩타이드		 GLP-2-Fc
동형 이량체		 실시예 1 실시예 3 실시예 4 실시예 5
EC50 (nM) 0.58 0.44 1.35 1.07 1.22 0.99
GLP-2 대비
상대활성(%)		 100 132 43 54 48 59
실험예 3: 생체 내 약물 동역학 프로파일 분석
상기에서 제조된 실시예 1, 3 내지 5에 따른 이중 특이성 융합단백질(MG12-1, 3, 4 및 5)의 반감기 및 곡선 하 면적(AUC, Area Under the Curve), 혈중 최고 농도(Cmax) 등을 비교함으로써 약물 동역학적(PK) 프로파일을 확인하였다.
먼저, 그룹 당 3마리의 수컷 SD(Sprague Dawley) 랫트에 각각의 단백질을 1 mg/kg의 함량으로 피하(SC) 경로로 투여하였다. 주입 전, 및 주입 후 0.5, 1, 5, 10, 24, 48, 72, 120, 및 168 시간 경과 후 혈액을 수득하여, 이를 30분 동안 실온 보관하여 응집시켰다. 응집된 혈액을 3,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리한 후, 각 샘플의 혈청을 수득하였고, 초저온 냉동고에 저장하였다. 투여 단백질 중 GLP-1 부위와 Fc를 특이적으로 검출하도록 고안된 시험법(GLP-1-Fc ELISA)과 투여 단백질 중 GLP-2 부위와 Fc를 특이적으로 검출하도록 고안된 시험법(GLP-2-Fc ELISA)으로 분석하였다. 구체적으로, 마우스 기원의 인간 면역글로불린 G4(IgG4)와 결합하는 항체를 코팅한 플레이트에 생체 시료를 적재하고, 비오틴화 항-GLP-1 항체를 이용하여 목적 단백질을 검출하는 방법(GLP-1-Fc ELISA)과 GLP-2에 특이적으로 반응하는 토끼 다클론 항체가 코팅된 플레이트에 생체 시료를 적재하고 마우스 기원의 인간 면역글로불린 G4(IgG4)에 HRP가 결합된 2차 항체를 이용하여 목적 단백질을 검출하는 방법(GLP-2-Fc ELISA)을 사용하였다. 수득 및 준비된 혈청 샘플은 표준 곡선의 직선 상의 위치에서 분석되도록 적절히 희석하여 적재하였다.
그 결과, 표 4 및 5 그리고 도 6a 및 6b에서 확인되는 바와 같이, MG12-1, 3, 4, 5는 대체적으로 GLP-1-Fc ELISA 및 GLP-2-Fc ELISA로 분석한 결과에서 서로 유사한 PK 프로파일을 보였다. Cmax에서는 두 방법 모두에서 MG12-5가 가장 높은 값을 나타내었고, 반면에 MG12-3에서 가장 낮았다. 이 경향은 AUClast에서도 거의 유사하게 나타났다. 최종 반감기의 경우, MG12-3에서 두 방법 모두 가장 길게 나타났고, GLP-1-Fc ELISA 시험법에서는 MG12-4가, GLP-2-Fc ELISA에서는 MG12-5가 가장 낮은 반감기를 나타내었다.
실시예 Cmax (ng/mL) Tmax (h) AUClast (ng*h/mL) 반감기 (h)
1 442.2±20.8 10 13919.8±824.9 16.5±6.3
3 301.0±57.4 10 9257.4±1543.3 29.5±2.7
4 328.7±34.5 10 7679.8±1228.9 9.0±0.3
5 1036.2±59.5 10 26059.6±3028.5 18.4±6.2
실시예 Cmax (ng/mL) Tmax (h) AUClast (ng*h/mL) 반감기 (h)
1 1136.7±261.0 24.0±0.0 78639.0±11205.3 43.7±1.8
3 697.4±148.0 24.0±8.1 63977.3±10131.5 56.2±7.1
4 1052.5±112.8 24.0±0.0 78983.2±6542.8 49.0±2.1
5 3201.3±95.6 24.0±0.0 188741.6±7870.5 30.6±2.1
결론적으로 MG12-1, 3, 4, 5 모두 정상 모델 랫트에 피하투여 시, 적절히 노출되는 것을 확인할 수 있었고, Cmax 및 AUClast는 MG12-5에서 가장 높은 특징을 보였다.
실험예 4: 이중 특이성 융합단백질 투여 시 NASH 모델동물에서의 생리학적 변화
에너지 대사에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(이하, 'GLP1/2-Fc'로 약칭함)의 효과를 조사하기 위해, 본 발명자들은 16주간 CD-HFD를 급이를 하여 NASH를 유도한 모델 마우스에 4주간 담체(PBS), GLP1-Fc 동형 이량체, GLP2-Fc 동형 이량체 또는 GLP1/2-Fc를 매주 2회씩 투여하였다. 그런 다음, 실험동물의 체중, 지방 축적, 혈청 콜레스테롤 농도, 혈청 고밀도 지질단백질(HDL), 혈청 트리글리세라이드(TG) 농도, 혈당 농도 및 인슐린 농도를 측정하였다. 그 결과 도 7에서 확인되는 바와 같이, GLP1/2-Fc 투여군은 음성 대조군과 비교하여 2주 경과 후에 체중이 감소된 반면, 4주 경과 시에는 체중을 유의하게 감소시켰다(도 7A). 음성 대조군과 비교하여 2주 경과 후 체중 감소는 GLP2-Fc 및 GLP1/2-Fc 모두에서 유의한 정도였다(도 7B). 또한, 체중에 대한 GLP1/2-Fc의 효과는 용량-의존적 방식으로 확인되었다(도 8A 및 8B). 체중 변화와 일관되게, GLP1/2-Fc는 고용량(20 nmol/kg) 투여 시(도 8C) 보다 효과적으로 지방 축적을 현저히 감소시켰다(도 7C). 총 혈청 콜레스테롤 및 고밀도 지질단백질(HDL)은 GLP1-Fc 및 GLP1/2-Fc(10 및 20 nmol/kg) 처리에 의해 통계적으로 유의하게 감소되었다(도 7D 및 7E, 7D 및 7E). 혈청 트리글리세라이드(TG) 수준은 고용량(20 nmol/kg)의 GLP1/2-Fc를 제외하고는 다르지 않았다(도 7F 및 도 8F). GLP-2가 담낭의 재충전에 관여하기 때문에, 외인성 GLP-2 전달은 담낭의 비정상적인 확장을 가속화할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 담낭 크기(데이터 제시되지 않음) 및 총 혈청 빌리루빈 수준을 분석하였다. 본 발명자들은 그룹 간에 차이가 없으며, 심지어 고용량 GLP1/2-Fc를 투여한 경우조차도 동일함을 확인하였다(도 7G, 및 도 8G 및 8H). 예상한 바와 같이, GLP2-Fc는 체중(도 7A 및 7B), 부고환 지방 질량(도 7C), 총 콜레스테롤(도 7D), HDL(도 7E), TG(도 7F) 및 총 빌리루빈(도 8G)에 대하여 음성 대조군과 비교하여 유의한 차이를 나타내지 않았다.
이에 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(GLP1/2-Fc)가 포도당 항상성에 미치는 역할을 평가하기 위해 인슐린 부하 시험(ITT) 및 포도당 부하 시험(GTT)을 수행하였다. 그 결과, GLP1/2-Fc 및 GLP1-Fc는 모두 인슐린 감수성을 유의하게 개선시켰다(도 7G 및 7H). 그러나, ITT 및 GTT 모두에서 GLP1/2-Fc을 고용량으로 투여한다고 하여 상가적인 효과를 나타내지 않았다(도 8I 및 8J). 투여와 함께 혈당 변화를 모니터링한 결과 GLP1/2-Fc 및 GLP1-Fc 투여군에서 유의한 혈당 감소가 확인되었으나 GLP2-Fc 투여군에서는 혈당 감소정도가 유의하지 않은 것으로 확인되었다(도 7K). GLP1/2-Fc는 고용량(20 nmol/kg)은 물론 심지어 저용량(5 nmol/kg)에서도 혈당 수준을 개선시켰다(도 8K 및 8L). 더욱 흥미롭게도, 음성 대조군과 비교하여 GLP1/2-Fc 투여군에서만 낮은 인슐린 수준이 확인되었다. 측정된 혈당 및 인슐린 수준에 따라 인슐린 저항성에 대한 항상성 모델 평가(HOMA-IR)를 도출하였다. 그 결과 GLP1/2-Fc 투여군에서 가장 낮은 지수의 감소를 확인할 수 있었다(도 7L 및 8M). 종합하면, 상기와 같은 결과들은 GLP1/2-Fc가 체중 및 혈당 조절에 잠재적인 치료효과를 가지고 있음을 시사한다.
실험예 5: 이중 특이성 융합단백질의 NASH 모델 동물에서의 간 TG 축적 및 염증의 개선 효과
본 발명자들은 간에서의 지질 축적에 대한 본 발명의 이중 특이성 융합단백질(GLP1/2-Fc)의 효과를 평가하기 위해, 간 조직의 지방 함량을 조사하였다. 융합단백질 처리 시, 간의 크기는 음성 대조군에서 관찰 된 것(도 9A 및 도 10A)에 비해 진한 적색으로 더 작았으며, 이는 간에서의 지방 침착이 적음을 나타낸다. 상기 결과와 일치되게, H&E 염색 결과, GLP1/2-Fc 투여군 및 GLP1-Fc 투여군에서 지방 방울의 감소가 확인되었다(도 9B 및 10B), 또한, 융합단백질 투여군에서 간 무게가 더 감소하였다(도 9C 및도 10C). 그러나 간 대 체중의 비율은 GLP1/2-Fc 투여군에서만 유의하게 감소하였다(도 9D). 실제 간 TG 수준은 H&E 염색과 유사하였다(그림 9E 및 도 10D). 중요하게도, GLP2-Fc 투여군은 음성대조군과 비교하여 변화가 없었지만, GLP1/2-Fc 투여군은 GLP1-Fc(도 9E 및 도 10D)에 비해 간 TG 수준과 혈청 ALT 수준이 훨씬 낮았으나(도 9F 및 9E), AST 수준은 그렇지 않았으며(도 9G 및 10F). 이는 GLP1/2-Fc가 단일 모이어티(GLP1-Fc 및 GLP2-Fc)보다 간 염증 및 지방 축적에 상승적인 효과를 갖는다는 것을 시사한다.
실험예 6: 이중 특이성 융합단백질의 NASH 모델 동물에서의 간 섬유화 및 간세포 사멸의 억제
본 발명자들은 본 발명의 일실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(GLP1/2-Fc)이 간 섬유증을 개선시키는 지 여부를 조사하기 위해, 시리우스 레드 염색(Sirius red staining)을 수행하고 콜라겐에 대한 면역염색(immunostaining)을 수행하였다. 그 결과 오직 GLP1/2-Fc만이 콜라겐 침착을 상당히 감소시켰다(도 11A 및 11B,도 12A 및 12B). 뿐만 아니라, 상기 염색 결과는 간 TG 수준과 양성의 상관관계를 나타냈다(도 11C). 시리우스 염색 강도와 TG 사이의 상관 분석에서, GLP1/2-Fc 투여군에서 TG의 간 침착 및 섬유증의 발달 정도가 가장 낮게 나타났다(도 11D). 이러한 결과와 일관되게 콜라겐 III 염색 시 GLP1/2-Fc 투여군에서 콜라겐 침착의 명백한 감소가 확인되었다(도 11E). 이러한 결과는 GLP1/2-Fc가 단일 모이어티(GLP1-Fc 또는 GLP2-Fc)와는 달리 간 섬유증의 감쇄에 대한 새로운 역할을 할 수 있음을 시사한다.
실험예 7: 이중 특이성 융합단백질의 NASH 모델 동물에서의 장 부피 및 장 환경 개선 효과
본 발명자들은 GLP1/2-Fc가 장에 영향을 줄 수 있는지 여부를 평가하기 위해 먼저 그 형태를 조사하였다. 그 결과 도 13에서 확인되는 바와 같이, GLP1/2-Fc 투여군에서는 음성대조군과 비교하여 장이 두꺼웠고 길이 역시 증가하였다(도 13A). 아울러, 장의 무게는 세 그룹 모두에서 유의하게 증가하였다(도 13B 내지 13D). 그러나, GLP1/2-Fc 투여군은 대부분 용량 의존적으로 증가하였다(도 14A 및 14B). 소장의 길이는 강한 경향이 나타났으며(p=0.0562, 도 13C), 소장은 다른 그룹보다 상당히 길었다(그림 13D). 그러나 이 효과는 결장에서는 관찰되지 않았다(도 13E). 고용량 투여 시 강력한 효과가 확인되었다(도 14B). 공장 및 회장을 절단한 한 후 조직학적 검사한 결과, GLP1/2-Fc 투여군은 더 두꺼운 상피층을 갖고 융모로 채워져 있었다(도 13F). GLP1/2-Fc가 장 부피를 증가시키는지 확인하기 위해, 회장에서 Ki-67 단백질에 대한 면역 검출을 수행하였다. 예상한 바와 같이, Ki-67 단백질 발현은 실험군 중 GLP1/2-Fc 투여군에서 주로 확인되었다(도 13G). GLP1/2-Fc 투여군의 3개의 절편 모두 음성대조군에 비해 더 깊은 소장 크립트(crypt) 깊이를 나타냈다(도 13H 내지 13J). GLP1/2-Fc 투여군 및 GLP2-Fc 투여군 모두에서 십이지장 및 회장(ileum)의 융모의 길이는 길었으나 GLP1-Fc 투여군에서는 그러한 변호가 관찰되지 않았다. 공장에서는, GLP1/2-Fc 투여군은 통계적 음성대조군과 비교 시 유의성이 없으나 더 긴 융모를 나타냈다(도 13K 내지 13M). 결장에서의 크립트 깊이는 투여군 간에 차이가 거의 없었다(도 14E). 이러한 결과는 GLP1/2-Fc가 장 상피 재생의 증가 및 조직손상의 회복에 의해 소장의 환경을 보호할 수 있음을 나타낸다.
실험예 8: 이중 특이성 단백질의 장 환경 개선의 작용기전 분석
GLP1/2-Fc에 의해 회장에서 미세융모 및 크립트 깊이가 증가되었으므로, 본 발명자들은 장 투과도를 측정하였다. 그 결과, 예상한 바와 같이, GLP1/2-Fc 투여군은 GLP2-Fc 투여군 및 음성대조군에서보다 장 투과도를 효과적으로 감소시켰다(도 15A). 이러한 결과는 장에 대한 조직학적 분석 결과와 일치한다. 놀랍게도, 혈청 내 독소 수준도 GLP1/2-Fc 투여군에서 유의하게 낮았다(도 15B). 상이한 투과성 수준이 타이트 정션(tight junction)의 변화로 인한 것인지 조사기 위해, 본 발명자들은 Zo-1 타이트 정션 단백질에 대한 면역 조직화학 분석을 수행하였다. 장 투과도 분석 결과와 일치하게, Zo-1 단백질은 다른 실험군과 비교하여 GLP1/2-Fc 투여군에서 가장 풍부하게 발현되었다(도 15C). 아울러 장 환경에서 세포재생을 확인하기 위해, 본 발명자들은 각각 회장에서 뮤신 층의 두께와 술잔세포(goblet cell)의 수를 측정하였다. 본 발명자들은 음성대조군과 비교하여 세 실험군 모두 두꺼운 뮤신 층을 보여주었는데(도 15D 및 5E), GLP1/2-Fc 투여군에서 가장 효과가 뛰어난 것으로 확인되었다. 또한, GLP1/2-Fc 투여군 및 GLP2-Fc 투여군에서 술잔세포의 수가 증가함을 확인하였다(도 15D, 15F 및 15G).
실험예 9: 이중 특이성 융합단백질의 장 균총에 미치는 영향 조사
본 발명자들은 GLP1/2-Fc가 장 구조 및 장 환경을 변화시켜 장내 미생물 군총 프로파일에 영향을 줄 수 있다는 여러 증거를 관찰할 수 있었다. 이를 위해 본 발명자들은 대변 마이크로바이옴(microbiome) 조성물을 분석하였다. PCoA 및 UPGMA 트리 데이터는 GLP1/2-Fc 투여군이 다른 실험군들과 명확하게 분리된 클러스터에 배치되었음을 나타낸다(그림 16A 및 16B). 분류학적 할당 결과는 각각 백분율, 계통 및 속 수준에서 풍부하게 제시되었다(도 16C 및 16D). 그 결과 본 발명자들은 8문의 118 속을 확인하였다. 문(phylum) 수준에서, GLP1/2-Fc 투여군은 Verrucomicrobia 문을 현저하게 증가시켰고(음성대조군과 25% 차이, p < 0.0005), Proteobacteria 문을 감소시켰다(음성대조군과 10.5% 차이, p < 0.005). 속 수준에서 Akkermansia, Prevotellamassilia, Mailhella 및 Faecalibaculun은 음성대조군과 비교하여 GLP1/2-Fc 투여군에서 가장 크게 변경되었다(그림 16C 및 16D). 본 발명자들은 종 수준에서 마이크로바이옴의 분류학적 조성을 추가로 분석하였고, 비만 또는 대사 기능 장애와 관련이 있는 18 종이 크게 변한 것을 확인 하였다(도 16E). 특히, Akkermansia muciniphila는 장에서 가장 풍부한 우점종으로 알려져 있으며, 이는 대사 건강상의 이점으로 알려져 있다(도 16F). 또한 GLP-1/2-Fc 투여군에서 Mailhella massiliensis가 가장 억제됨을 알 수 있었다(도 16G). 그 외에도 Alistipes senegalensis, Lactobacillus intestinealis, Prevotellamassilia timonensis가 증가하여 건강한 장 환경에서 발견되었다(도 16H 내지 16J). 흥미롭게도, 본 발명자들은 Faecalibaculum rodentium과 Acetatifactor muris가 상당히 감소한 것을 발견하였는데(도 16K 및 16L), 이러한 결과는 GLP1/2-Fc가 장내 균총의 조성을 변화시킨다는 것을 나타낸다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질은 소장 내에서 GLP-1 수용체 및 GLP-2 수용체에 결합하여 소장의 융모 길이 및 크립트 깊이를 증가시키고 장내 균총을 개선시키는 등 소장 내 환경을 개선시키는 효과를 나타냈다. 더 나아가 이러한 본 발명의 이중 특이성 융합단백질에 의한 소장 환경 개선은 장-간 축에 영향을 주어 간의 대사 상태를 개선함으로써 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염의 증상의 개선으로 이어질 수 있음이 본 발명자들의 다양한 실험을 통해 입증되었다. 뿐만 아니라, 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질은 인슐린 저항성의 감소와 함께 체중 감소의 효과를 나타냈다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질은 비알코올성 지방간은 물론 대사증후군과 관련된 다양한 질환 예컨대, 비만, 제2형 당뇨병, 비알코올성 지방간염 및 비알코올성 지방간의 경과에 따른 간 섬유증과 같은 만성 대사성 간질환의 치료에 효율적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
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containing GLP-1 analogue <400> 23 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ala 20 25 30 Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly 35 40 45 Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu 50 55 60 Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe 65 70 75 80 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 85 90 95 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 100 105 110 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 115 120 125 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 130 135 140 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 145 150 155 160 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 165 170 175 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 180 185 190 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 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<213> Artificial Sequence <220> <223> first fusion protein of bispecific fusion protein containing GLP-1 analogue <400> 25 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Lys 35 40 45 Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 50 55 60 Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 65 70 75 80 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 85 90 95 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 100 105 110 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 115 120 125 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 130 135 140 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 145 150 155 160 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 165 170 175 Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 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peptide <400> 38 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 39 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 39 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 10 15 Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 20 25 30 <210> 40 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 40 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 10 15 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 20 25 30 <210> 41 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 41 Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly 1 5 10 15 Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg 20 25 30 Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro 35 40 <210> 42 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 42 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 10 15 Lys Glu Lys Glu 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Claims (38)

  1. GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 대사증후군 치료용 약학적 조성물.
  2. GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 비만 치료용 약학적 조성물.
  3. GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 제2형 당뇨병 치료용 약학적 조성물.
  4. GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염 치료용 약학적 조성물.
  5. GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 간 섬유증 치료용 약학적 조성물.
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  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 GLP-1 유사체는 GLP-1, 엑센딘 3(Exendin 3), 엑센딘 4(Exendin 4), GLP-1/Exendin 4 하이브리드, GLP-1-XTEN, Lixisenatide, Albiglutide, Liraglutide, Dulaglutide, Extenatide, Taspoglutide, GLP-1 연속 반복체 또는 Lixisenatide인, 약학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 GLP-1은 서열번호 1 또는 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 약학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 Exendin 3는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 약학적 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 Exendin 4는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 약학적 조성물.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 GLP-1/Exendin 4 하이브리드는 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 약학적 조성물.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 GLP-1/Exendin 4 하이브리드는 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 약학적 조성물.
  15. 제9항에 있어서,
    상기 Lixisenatide는 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 약학적 조성물.
  16. 제9항에 있어서,
    상기 Exendin 4-XTEN은 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 약학적 조성물.
  17. 제9항에 있어서,
    상기 Albiglutide는 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 약학적 조성물.
  18. 제9항에 있어서,
    상기 Liraglutide는 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 약학적 조성물.
  19. 제9항에 있어서,
    상기 Taspoglutide는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 약학적 조성물.
  20. 제9항에 있어서,
    상기 GLP-1 연속 반복체는 서열번호 11로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 약학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 항체 Fc 영역은 하이브리드 항체 Fc 영역인, 약학적 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 하이브리드 항체 Fc 영역은 둘 이상의 아이소타입의 적어도 두 개 이상부분이 혼합된 형태의 Fc 영역인, 약학적 조성물.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 하이브리드 항체 Fc 영역은 서열번호 12 내지 16으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는, 약학적 조성물.
  24. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 GLP-2 유사체는 GLP-2, Teduglutide, Glepaglutide, 또는 GLP-2 analogue 10인, 약학적 조성물.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 GLP-2는 서열번호 17 내지 20 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 약학적 조성물.
  26. 제24항에 있어서,
    상기 Glepaglutide는 서열번호 21로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 약학적 조성물.
  27. 제24항에 있어서,
    상기 GLP-2 analogue 10는 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 약학적 조성물.
  28. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1융합단백질은 서열번호 23 내지 30으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 약학적 조성물.
  29. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2융합단백질은 서열번호 31 내지 36으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 약학적 조성물.
  30. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 GLP-1 유사체 및 상기 GLP-2 유사체 사이 또는 상기 GLP-1 유사체 및 상기 항체 Fc 영역 사이 또는 상기 GLP-2 유사체 및 상기 항체 Fc 영역 사이에 링커 펩타이드가 삽입된, 약학적 조성물.
  31. 제29항에 있어서,
    상기 링커 펩타이드는 N-글리칸 부착 부위를 포함하거나 포함하지 않는, 약학적 조성물.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 제1융합단백질은 상기 링커 펩타이드에 N-글리칸 부착 부위를 포함하지 않고 상기 제2융합단백질은 상기 링커 펩타이드에 N-글리칸 부착 부위를 포함하는, 약학적 조성물.
  33. 제30항에 있어서,
    상기 링커 펩타이드는 EEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 37), EPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 38), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 39), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 40), AKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECP(서열번호 41), GGGGSGGGGSGGGGSEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 42), GGGGSGGGGSGGGGSAKNTTAPATTRNTTRGGEEKKKEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 43), AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 44), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 45), GGSGG(서열번호 46), GGSGGSGGS(서열번호 47), GGGSGG(서열번호 48), 서열번호 (G4S)n(단위체: 서열번호 49, n은 1 내지 10의 정수), (GGS)n(n은 1 내지 10의 정수), (GS)n(n은 1 내지 10의 정수), (GSSGGS)n(단위체: 서열번호 50, n은 1 내지 10의 정수), KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 51), EGKSSGSGSESKST(서열번호 52), GSAGSAAGSGEF(서열번호 53), (EAAAK)n(단위체: 서열번호 54, n은 1 내지 10의 정수), CRRRRRREAEAC(서열번호 55), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 56), GGGGGGGG(서열번호 57), GGGGGG(서열번호 58), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 59), PAPAP(서열번호 60), (Ala-Pro)n(n은 1 내지 10의 정수), VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 61, PLGLWA(서열번호 62), TRHRQPRGWE(서열번호 63), AGNRVRRSVG(서열번호 64), RRRRRRRR(서열번호 65), GFLG(서열번호 66), GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 67), 또는 GSTSGSGKPGSGEGS(서열번호 68)인, 약학적 조성물.
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