JP2009514508A - Ｇｌｐ−２ミメティボディ、ポリペプチド、組成物、方法および用途 - Google Patents

Abstract

哺乳動物ＧＬＰ−２ミメティボディ、ポリペプチドおよび核酸が開示される。ＧＬＰ−２に関連する疾患を処置するための該ミメティボディおよびポリペプチドの利用方法もまた開示される。

Description

本発明は、哺乳動物ＧＬＰ−２ポリペプチドおよびミメティボディ（ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ）、ならびに治療薬としてのそれらの使用に関する。

グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）は、プログルカゴンの翻訳後プロセシングを介して生成される３３アミノ酸の腸栄養性（ｉｎｔｅｓｔｉｎｏｔｒｏｐｈｉｃ）ペプチドホルモンである（非特許文献１；非特許文献２）。哺乳動物では、ＧＬＰ−２は、消化管内分泌細胞中のプロホルモン転換酵素の細胞特異的発現の結果として、腸および脳でプログルカゴンから遊離されるがしかし膵ではされない（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。高速液体クロマトグラフィーおよび部位特異的ＧＬＰ−２抗血清の組合せを使用するラットおよびヒト血漿の分析は、２種の主要な循環分子形態、ＧＬＰ−２^１−３３およびＧＬＰ−２^３−３３の存在を示す（非特許文献２；非特許文献７；非特許文献８）。ＧＬＰ−２^１−３３は、最初の２残基ヒスチジンおよびアラニン（ＨＡ）を除去するプロテアーゼ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ）によりｉｎ ｖｉｖｏで切断される。生じるペプチドＧＬＰ−２^３−３３は本質的に不活性である。

ＧＬＰ−２は、胃運動性、胃酸分泌、腸六炭糖輸送を調節し、そして消化管上皮の障壁機能を増大させる（非特許文献９に総説されている）。それは、腺窩細胞増殖の刺激ならびに腸細胞および腺窩区画でのアポトーシスの阻害を介して粘膜上皮の表面積を有意に増大させる。（非特許文献１０）。ＧＬＰ−２は死亡率を低下させ、かつ、小腸および大腸の炎症における粘膜傷害、サイトカイン発現および細菌敗血症を低下させる（非特許文献１１；非特許文献１２）。ＧＬＰ−２はまた、短腸症候群（ＳＢＳ）を伴うげっ歯類若しくはヒトで栄養吸収および腸管順応も高める（非特許文献１３）。

ＧＬＰ−２の作用は、胃、小腸、結腸の消化管内分泌細胞、ならびに腸ニューロンおよび内皮下筋線維芽細胞で発現されるＧタンパク質共役型受容体、ＧＬＰ−２受容体（ＧＬＰ−２Ｒ）により変換される（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）。ＧＬＰ−２受容体を発現するトランスフェクトしたベビーハムスター腎臓線維芽細胞（ＢＨＫ−ＧＬＰ−２Ｒ細胞）中でのＧＬＰ−２Ｒシグナル伝達の直接活性化は、シクロヘキシミド誘発性のアポトーシスに対する抵抗性を賦与する（非特許文献１８）。

ＧＬＰ−２の細胞保護的、修復的およびエネルギー保持的特性は、ＧＬＰ−２が、腸粘膜上皮の傷害および／若しくは機能不全を特徴とするヒト障害の処置に潜在的に有用でありうることを示唆する。腸上皮の傷害は、クローン病および潰瘍性大腸炎を包含する炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を伴う患者、ならびにセリアック病のような腸での炎症応答を伴う自己免疫疾患を伴う患者で見られる（非特許文献１９に総説されている）。加えて、数種の化学療法薬は、用量を制限する毒性の副作用をもたらす腸上皮に対する傷害を引き起こす（非特許文献２０）。増大された腸浸透性は急性膵炎の症例でもまた報告されており（非特許文献２１）、そして、巨大分子を内皮下区画に接近させることにより食物アレルギーに寄与し得る（非特許文献２２）。

栄養吸収で重要な調節ホルモンとして、ＧＬＰ−２は短腸症候群（ＳＢＳ）を伴う患者の処置でもまた有望である（非特許文献９；非特許文献２３；非特許文献２４）。ＳＢＳは、小腸のかなりの長さの解剖学的若しくは機能の喪失から生じる吸収不良と定義される
（非特許文献２５に総説されている）。短腸症候群の原因は成人と小児の間で異なる。すなわち、成人では、それは最もしばしばクローン病若しくは腸間膜梗塞に対する手術後に生じる一方、小児では、該原因は最も一般的には壊死性腸炎、胃壁破裂、閉鎖および腸軸捻症を包含する（非特許文献２６）。

ＤＰＰ−ＩＶ抵抗性のＧＬＰ−２ペプチドアナログ（アラニン−２がグリシンで置換されている（Ａ２Ｇ））、テズグルチド（ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅ）が、ＳＢＳ、クローン病および小児の胃腸（ＧＩ）障害を包含するＧＩ疾患の潜在的処置のため開発中である。テズグルチドは、癌化学療法およびＩＢＤと関連する粘膜炎の処置に対する潜在性もまた有する。しかしながら、該ペプチドの低分子量により、テズグルチドは３０分未満の半減期で急速に消失される。従って、治療レベルを維持するために連日の投薬が必要とされる（非特許文献２７）。従って、その機能を保持しつつ短い半減期を克服しかつ容易な開発および製造を提供することができる改変ＧＬＰ−２に対する必要性が存在する。

炎症腸閉塞すなわち侵襲的外科手術若しくは外傷性傷害後の協調胃腸運動性の一時的損傷は、大きな臨床上の問題のままであり、入院を延長しかつしばしば回復期の間の内科的合併症に寄与する（非特許文献２８）。腸閉塞は、遅延された胃排出、小腸および結腸の拡張、腹部膨満、正常な推進性収縮パターンの喪失、ならびにガス若しくは糞便を排出することの不能を特徴とし、長期の患者不快感（腹部膨満、吐き気、嘔吐）に至る。

高齢者若しくは心肺傷害（ｃａｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）を伴う患者のような感受性の個体において、腸閉塞は、急性胃拡張、心不整脈、呼吸窮迫症、吸引性肺炎、および外科的吻合の失敗を包含するより重篤な合併症につながり得る。重篤な症例では、ＧＩ管の正常な「ハウスキーピング」収縮活動の長期喪失が、細菌の過成長および腸障壁機能の崩壊、次いで細菌の転移および全身循環への進入に寄与し得る（非特許文献２９）。これは、順に、内毒素血症、敗血症、多臓器不全、および究極的には死亡（高齢患者が最も受けやすい転帰）につながり得る。合併症の非存在下でさえ、正常な腸機能の復帰は病院からの患者の解放の第一の制限因子であり、炎症性腸閉塞は入院を３ないし５日延長する。従って、増大される罹患率および延長された入院から発生する費用はかなりになる可能性がある。

腸閉塞の発症および維持に寄与する因子は、腸壁にノルエピネフリンを遊離する中枢性交感神経阻害性反射の活性化、阻害性体液剤、麻酔および鎮痛薬、ならびに炎症メディエーターを包含する（非特許文献３０；非特許文献３１）。げっ歯類の研究からの結果は、ＧＩ管の壁内の炎症が腸閉塞の開始および維持において中心的役割を演じていることを示唆する。

術後腸閉塞のげっ歯類モデルを使用する研究は、外筋層が高度に免疫学的に活性の区画であることを示す。普遍的白血球の印象的一群が外筋層内に通常常在する（非特許文献３２；非特許文献３３）。これらの最も豊富なものは、食道から結腸まで細胞の広範囲のネットワークを形成しかつ胃腸管を潜在的傷害および疾患から防御する態勢を整えている常在性マクロファージである。腹部手術の間の腸への混乱は、このマクロファージネットワークを活性化し、局所分子炎症応答を開始する。活性化されたマクロファージは、筋層内の神経筋通信を抑制しかつ血管内皮細胞上での接着分子（ＩＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン）の発現を誘導する炎症前サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦα）およびケモカイン（ＭＣＰ−１）を遊離する（非特許文献３４；非特許文献３５、非特許文献３６；非特許文献３７；非特許文献３８）。これは、順に、炎症性細胞浸潤物の規模と腸閉塞の重症度の間に正の相関が存在する、全身循環からの白血球（単球、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞）の動員を特徴とする細胞性免疫応答につながる（非特許文献３９）。浸潤する白血球は付加的なサイトカイン、ならびに神経筋機能不全にさらに寄与するプロスタグランジン、一酸化窒素、プロテアーゼおよび反応性酸素種を遊離する（非特許文献４０；非特許文献４１）。

今日まで、炎症性腸閉塞の管理に診察室で利用可能な選択肢はほとんど存在しない。シサプリドおよびネオスチグミンのような消化管運動機能調整薬は術後の腸運動性を改善することが示された（非特許文献４２）。しかしながら、結果は一貫せず、また、これらの薬物は、重症度および患者の感受性に関して予測することが困難と判明した心血管系副作用の増大された危険を有する。ＣＯＸ−２阻害剤は、小腸の術後運動不全に対し保護的であることが動物研究で示された（非特許文献４３）が、しかし結腸運動不全に対しほとんど効果を有しなかった（非特許文献４４）。セレコキシブおよびロフェコキシブを比較するヒトでの第Ｉ相臨床試験が完了し（非特許文献４５）、そしていずれの剤も術後運動性を改善することが見出されなかった。

手術後の経口摂食への迅速な復帰は、運動性パターンの正常なホルモン調節を刺激するための手段として奨励されてきた。これは、腸のリハビリテーションへの多様なアプローチの一部として使用される場合に患者のあるサブセットで腸機能の復帰を早めかつ快適さを改善することが見出された（非特許文献４６）。しかしながら、この処置は入院の長さの有意の短縮をもたらさなかった。さらに、ホルモンパターンの十分な刺激は、多くの患者が耐えることが不可能である閾値熱量負荷を必要とする。

遷延性腸閉塞の発症に寄与する最も一般的な因子の１つは、術後鎮痛のためのオピオイド鎮痛薬の投与である。オピオイドは、脳の疼痛処理中枢のニューロンに存在する３種の受容体サブタイプの１種若しくはそれ以上と相互作用することによりそれらの鎮痛効果を発揮する。モルヒネのような最近のオピオイド鎮痛薬は、主としてμおよびδ−オピオイド受容体を活性化することにより作用する。しかしながら、これらの同一の受容体は、腸運動性を制御する胃腸管内のニューロンでもまた発現される。受容体の活性化は、炎症性腸閉塞の存在下であろうと非存在下であろうと、胃腸収縮機能を有意に抑制して、腸の静止および便秘を引き起こす。Ａｄａｌｏｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、血液脳関門を横断しない、末梢に限定されかつ選択的なμ−ＯＲアンタゴニスト、Ａｌｖｉｍｏｐａｎを使用する第ＩおよびＩＩ相臨床試験を実施した。オピオイド鎮痛薬とともに与えられる場合、Ａｌｖｉｍｏｐａｎは腸運動性のオピオイド誘発性の抑制を予防した（非特許文献４７）。プラセボと比較した場合、Ａｌｖｉｍｏｐａｎは、腹部手術を受けた後に軽度ないし中等度の術後腸閉塞を経験していた患者で腸機能の復帰を早めかつ入院を短縮することが見出された（非特許文献４８）。Ａｌｖｉｍｏｐａｎは炎症を変えない。

今日まで、炎症性腸閉塞の処置に利用可能な安全かつ確実な処置の選択肢は存在しない。現在利用可能な最も効果的な治療薬は、性質が支持的であるか、若しくはオピオイド鎮痛薬のいっそうひどくする効果を改善する。それらは炎症を腸閉塞の根本原因として扱わない。従って、重大な満たされていない医学的必要性が存続する。
Ｏｒｓｋｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２４７：１９３−１９６（１９８９） Ｈａｒｔｍａｎｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２１：７３−８０（２０００） Ｄｈａｎｖａｎｔａｒｉら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１０：３４２−３５５（１９９６） Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１０：３３４−３４１（１９９６） Ｄａｍｈｏｌｔら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０：４８００−４８０８（１９９９） Ｈｏｌｓｔ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．１０：２２９−２３５（１９９９） Ｂｒｕｂａｋｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３８：４８３７−４８４３（１９９７） Ｈａｒｔｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８５：２８８４−２８８８（２０００） Ｄｒｕｃｋｅｒ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｍｅｔａｂ．８６：１７５９−１７６４（２００１） Ｄｒｕｃｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：７９１１−７９１６（１９９６） Ｂｏｕｓｈｅｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７７：Ｅ９３７−Ｅ９４７（１９９９） Ｐｒａｓａｄら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．３５：３５７−３５９（２０００） Ｊｅｐｐｅｓｅｎら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２０：８０６−８１５（２００１） Ｍｕｎｒｏｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：１５６９−１５７３（１９９９） Ｙｕｓｔａら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１９：７４４−７５５（２０００） Ｂｊｅｒｋｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：１２４９７−１２５０２（２００１） Ｏｒｓｋｏｖら、Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．１２４；１０５−１１２（２００５） Ｙｕｓｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３５３４５−３５３５２（２０００） Ｈａｎａｕｅｒ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：８４１−８４８（１９９６） Ｏｓｔｅｒ、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １３：４１（１９９９） Ｋｏｕｒｉｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１８１：５７１−５７５（２００１） Ｔｒｏｎｃｏｎｅら、Ａｌｌｅｒｇｙ ４９：１４２−１４６（１９９４） Ｒｕｂｉｎ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１１７：２６１−２６３（１９９９） Ｎｉｇｈｔｉｎｇａｌｅ、Ｇｕｔ ４５：４７８−４７９（１９９９） Ｊｅｐｐｅｓｅｎ、Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３３：３７２１−３７２４（２００３） Ｐｌａｔｅｌｌら、Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．８：１３−２０（２００２） Ｓｈｉｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ １２；６３−７１（２００５） ＨｏｌｔｅとＫｅｈｌｅｔ、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．８７：１４８０−１４９３（２０００） ＡｎｕｐとＢａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．９２：２９１−３００（２０００） ＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎとＰａｓｓａｒｏ、Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．３５：１２１−１３２（１９９０） Ｂａｕｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ ８：１５２−１５７（２００２） Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ、Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１０：７１９−７３６（１９９５） Ｋａｌｆｆら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２２８：６５２−６６３（１９９８） Ｋａｌｆｆら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６３：６８３−６９１（１９９８） Ｊｏｓｅｐｈｓら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．８６：５０−５４（１９９９） Ｋａｌｆｆら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１７：３７８−３８７（１９９９） Ｋａｌｆｆら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１８：３１６−３２７（２０００） Ｗｅｈｎｅｒら、Ｓｕｇｅｒｙ １３７：４３６−４６（２００５） Ｋａｌｆｆら、Ｓｕｒｇｅｒｙ １２６：４９８−５０９（１９９９） ｖｏｎ Ｒｉｔｔｅｒら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９７：６０５−６０９（１９８９） ＢｉｅｌｅｆｅｌｄｔとＣｏｎｋｌｉｎ、Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．４２：８７８−８８４（１９９７） ＳｈｉｂａｔａとＴｏｙｏｄａ、Ｓｕｒｇ．Ｔｏｄａｙ ２８：７８７−７９１（１９９８） Ｓｃｈｗａｒｚら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２１：１３５４−１３７１（２００１） Ｔｕｒｌｅｒら、Ａｎａｌ．Ｓｕｒｇ．、２３１（１）：５６−６６（２００２） Ｂｏｕｒａｓら、Ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｍｏｔｉｌ．１６：７２９−７３５（２００４） ＨｏｌｔｅとＫｅｈｌｅｔ、Ｍｉｎｅｒｖａ．Ａｎｅｓｔｅｓｉｏｌ．、６８（４）：１５２−１５６（２００２） Ｇｏｎｅｎｎｅら、Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３：７８４−７９１（２００５） Ｖｉｓｃｕｓｉら、Ｓｕｒｇ．Ｅｎｄｏｓｃ．２０：６４−７０（２００６）

［発明の要約］
本発明の一局面は、一般式（ＩＩ）：
（ＧＬＰ２ＲＡｇ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３）_（ｔ）
（ＩＩ）
［式中、ＧＬＰ２ＲＡｇは哺乳動物ＧＬＰ−２Ｒアゴニストであり、Ｌｋはポリペプチド若しくは化学結合であり、Ｖ２は免疫グロブリン可変領域のＣ末端の一部分であり、Ｈｇは免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分であり、Ｃ_Ｈ２は免疫グロブリンＨ鎖Ｃ_Ｈ２定常領域であり、およびＣ_Ｈ３は免疫グロブリンＨ鎖Ｃ_Ｈ３定常領域であり、ならびにｔは独立に１から１０までの整数である］
を有するミメティボディである。

本発明の別の局面は、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、４２、４３、４４、４５、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、７５若しくは７７に示される配列を有するポリペプチドを含んでなるミメティボディである。

本発明の別の局面は、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、４６、４７、４８、４９、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７６若しくは７８に示される配列または相補配列を有するポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである。

本発明の別の局面は、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、４２、４３、４４、４５、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、７５若しくは７７に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである。

本発明の別の局面は、配列番号５２、５４、５５若しくは７４に示される配列を有するポリペプチドを含んでなるポリペプチドである。

本発明の別の局面は、配列番号５２、５４、５５若しくは７４に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである。

本発明の別の局面は、ＧＬＰ−２ポリペプチド組成物若しくはＧＬＰ−２ミメティボディ組成物をそれの必要な患者に投与することを含んでなる、腸粘膜上皮の傷害および／若しくは機能不全を特徴とする障害の症状の低減若しくはその処置方法である。

本発明の別の局面は、ＧＬＰ−２ポリペプチド組成物若しくはＧＬＰ−２ミメティボディ組成物をそれの必要な患者に投与することを含んでなる、炎症性腸閉塞の予防、その症状の低減若しくはその治療方法である。

［発明の詳細な記述］
本明細で引用される、限定されるものでないが特許および特許出願を挙げることができる全刊行物は、完全に示されるかのように引用することにより本明細書に組み込まれる。一文字アミノ酸記号を本明細書で当業者により理解されるとおり使用する。免疫グロブリン定常領域のアミノ酸残基の番号付けは、野生型ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４ ＦｃドメインのＮ末端アミノ酸である残基１に基づく。

本発明は、哺乳動物ＧＬＰ−２の特性および活性を有するタンパク質構築物を提供する。本発明の一態様は、下で「ＧＬＰ−２ミメティボディ」若しくは単に「ミメティボディ」と称される、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭのような異なるタイプの免疫グロブリン分子、およびＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４のようなそれらのいずれかのサブクラス、またはそれらの組合せを模倣するタンパク質構築物である。本発明の別の態様は、ＧＬＰ−２バリアントであるポリペプチドであり、該ポリペプチドは野生型分子の特性および活性を有する。本発明は、ＧＬＰ−２ミメティボディ、ポリペプチドをコードする核酸、これらの核酸を含有するベクター、宿主細胞、組成物、ならびにＧＬＰ−２ミメティボディおよびポリペプチドの作成および使用方法もまた提供する。
ＧＬＰ−２ミメティボディ、ポリペプチドおよび組成物
本発明は、全般として、一般式（Ｉ）：
（Ｐｅｐ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３）_（ｔ）
（Ｉ）
［式中、Ｐｅｐは所望の生物学的特性を有するポリペプチドであり、Ｌｋはポリペプチド若しくは化学結合であり、Ｖ２は免疫グロブリン可変領域のＣ末端の一部分であり、Ｈｇは免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分であり、Ｃ_Ｈ２は免疫グロブリンＨ鎖Ｃ_Ｈ２定常領域であり、およびＣ_Ｈ３は免疫グロブリンＨ鎖Ｃ_Ｈ３定常領域であり、ならびにｔは独立に１ないし１０の整数である］
を有するミメティボディポリペプチドに関する。

より具体的には、本発明は、結合に際してＧＬＰ−２Ｒを活性化することが可能であるＧＬＰ−２ミメティボディポリペプチドに関する。該ポリペプチドは一般式（ＩＩ）：
（ＧＬＰ２ＲＡｇ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３）_（ｔ）
（ＩＩ）
［式中、ＧＬＰ２ＲＡｇは哺乳動物ＧＬＰ−２Ｒアゴニストであり、Ｌｋはポリペプチド若しくは化学結合であり、Ｖ２は免疫グロブリン可変領域のＣ末端の一部分であり、Ｈｇは免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部分であり、Ｃ_Ｈ２は免疫グロブリンＨ鎖Ｃ_Ｈ２定常領域であり、およびＣ_Ｈ３は免疫グロブリンＨ鎖Ｃ_Ｈ３定常領域であり、ならびにｔは独立に１ないし１０の整数である］
を有する。

本明細書で使用されるところの「ＧＬＰ−２Ｒアゴニスト」は、結合に際してＧＬＰ−２Ｒを活性化するいかなる分子も包含する。ＧＬＰ−２Ｒアゴニストは野生型哺乳動物ＧＬＰ−２およびＧＬＰ−２のペプチドアナログを包含する。例示的一野生型ＧＬＰ−２ペプチドは配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。天然に存在するＧＬＰ−２中のあるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基の代わりに用いることができ、該アナログは野生型ＧＬＰ−２のＧＬＰ−２Ｒ結合特性を維持することが既知である。例えば、野生型ヒトＧＬＰ−２ペプチドのＡｌａ２をＳｅｒ（Ａ２Ｓ）若しくはＧｌｙ（Ａ２Ｇ）で置換し得る。生じるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２および３に示す。

本発明において、ＧＬＰ−２Ｒアゴニストとして機能する野生型ヒトＧＬＰ−２の新規アナログが開発された。これらのアナログのアミノ酸配列を、下に示される配列番号５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７および７４に示す（突然変異は野生型ＧＬＰ−２に対し示す）。これらのアナログはミメティボディのＧＬＰ２ＲＡｇ成分として有用である。

ＧＬＰ−２ペプチドが自己会合し得そして均質な治療薬候補の開発および製造について問題を提起し得ることが観察された。米国特許出願公開第２００４０１２２２１０ Ａ１号明細書を参照されたい。下の実施例に記述されるとおり、配列番号５２、５４、５５および７４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ｐＨ７．５で単量体でありかつ低下されたらせんの傾向を有するように設計した。従って、これらのヒトＧＬＰ−２ペプチドアナログは、ミメティボディ構築物中で、若しくは裸の治療的ペプチドとして、とりわけ有用であるとみられる。

本発明のミメティボディ中で、リンカー部分（Ｌｋ）は、ミメティボディに代替の方向および結合特性を有させることにより構造の柔軟性を提供する。例示的リンカーは、ペプチド以外の化学結合、若しくはペプチド結合により連結された１ないし２０個のアミノ酸を包含し、該アミノ酸は２０種の天然に存在するアミノ酸から選択される。リンカー部分は、大多数の、グリシン、アラニンおよびセリンのような立体的に障害されないアミノ酸を包含し得、そしてＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号１９）、ＧＳＧＧＧＳ（配列番号２０）およびそれらのポリマー若しくは組合せを包含する。本発明の範囲内の他の例示的リンカーは２０残基より長いことができ、そしてグリシン、アラニンおよびセリン以外の残基を包含しうる。

本発明のミメティボディ中で、Ｖ２はＨ鎖可変領域のような免疫グロブリン可変領域のＣ末端ドメインの一部分である。例示的Ｖ２アミノ酸配列はＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２１）である。

Ｏ−グリコシル化がＶ２領域の２個のＴｙｒ残基で起こり得ることが示されたとは言え、グリコシル化の程度は宿主細胞株に高度に依存し、そして培養条件によってもまた影響されうる。Ｏ−グリカンは凝集およびタンパク質分解を阻害するよう作用して、より大きなｉｎ ｖｉｖｏ安定性をもたらしうる。しかしながら、不均質性および乏しい再現性により、Ｏ−グリコシル化を排除することが望ましいかもしれない。従って、代替の一例示的Ｖ２アミノ酸配列はＧＡＬＶＡＶＳＳ（配列番号２２）である。

本発明のミメティボディ中で、ＨｇはＨ鎖可変領域のような免疫グロブリン可変領域のヒンジドメインの一部分である。例示的Ｈｇアミノ酸配列は、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２３）、ＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２４）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号２５）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号２６）およびＣＰＰＣＰ（配列番号２７）を包含する。

本発明のミメティボディ中で、Ｃ_Ｈ２は免疫グロブリンＨ鎖Ｃ_Ｈ２定常領域である。例示的Ｃ_Ｈ２アミノ酸配列は：
ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号２８），
ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号２９），
ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号３０）および
ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号３１）
を包含する。

本発明のミメティボディ中で、Ｃ_Ｈ３は免疫グロブリンＨ鎖Ｃ_Ｈ３定常領域である。例示的Ｃ_Ｈ３アミノ酸配列は：
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３２）および
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号３３）
を包含する。本発明のミメティボディのＣ_Ｈ３領域は、ある種の組換え系で発現される場合にそのＣ末端アミノ酸を切断分離させうることが、当業者により認識されるであろう。

本発明のミメティボディ中で、免疫グロブリン分子のＦｃＲｎスカベンジャー受容体結合部位がＣ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３領域の結合部に保存されている。ＦｃＲｎ結合は、飲作用された免疫グロブリンの細胞外空隙への戻しを可能にするため、ＧＬＰ−２ミメティボディの半減期がＧＬＰ−２ペプチドに関して有意に延長されるであろうことが期待される。

本発明のミメティボディの一態様において、単量体構造（ＧＬＰ２−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３）は、共有結合以外で、若しくは限定されるものでないがＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を挙げることができる共有結合により、他の単量体に連結され得る。

ＩｇＧ１およびＩｇＧ４サブクラスはヒンジ領域のシステインの数が異なる。ＩｇＧ１サブクラスのように、Ｈ鎖間のジスルフィド結合に参画するＩｇＧ４ヒンジ中の２個のシステインが存在する。しかしながら、Ｌ鎖へのジスルフィド結合に通常関与しているＩｇＧ１ヒンジ中のシステインはＩｇＧ４ヒンジ中で非存在である。従って、ＩｇＧ４ヒンジはＩｇＧ１ヒンジより少なく柔軟性である。

加えて、該２アイソタイプは、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性傷害（ＡＤＣＣ）を媒介するそれらの能力が異なる。ＣＤＣは補体の存在下での標的の溶解である。補体活性化経路は、補体系の第一の成分（Ｃ１ｑ）の、同族の抗原と複合体形成した分子への結合により開始される。ＩｇＧ１は補体カスケードおよびその後のＣＤＣ活性の強力な誘導因子である一方、ＩｇＧ４は補体誘導活性をほとんど有しない。

ＡＤＣＣは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）が標的細胞上の結合した抗体を認識しかつその後該標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性の反応である。ＩｇＧ１サブクラスはＦｃ受容体に高アフィニティーで結合しかつＡＤＣＣに寄与する一方、ＩｇＧ４は弱くのみ結合する。エフェクター機能を活性化することのＩｇＧ４の相対的不能は、細胞死滅を伴わない細胞へのミメティボディの送達が可能であるため、望ましい。

さらに、ＦｃＲｎスカベンジャー受容体の結合部位がＩｇＧ４およびＩｇＧ１アイソタイプに存在し、そして双方は類似の結合の特徴を有する。従って、本発明のＩｇＧ１およびＩｇＧ４ミメティボディの薬物動態は類似であると期待される。

免疫グロブリン領域のヒンジ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３部分（Ｈｇ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３）もまた、本発明のバリアントを形成するように広範囲に改変しうる。例えば、ミメティボディ分子により必要とされない構造の特徴若しくは機能的活性を提供する１個若しくはそれ以上の天然の部位を除去し得る。これらの部位は、例えば、残基を置換若しくは欠失すること、残基を該部位に挿入すること、または該部位を含有する部分を切断することにより除去しうる。例示的Ｈｇ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３バリアントを下述する。

１．ジスルフィド結合形成に関与する部位を、欠失若しくは他のアミノ酸での置換により本発明のミメティボディ中で除去し得る。典型的には、これらのモチーフ中に存在するシステイン残基を除去若しくは置換する。これらの部位の除去は、非共有的に一緒に保持される二量体のＣＨ３−ＣＨ２−ヒンジドメインをなお見込む一方で、ミメティボディ産生宿主細胞に存在する他のシステイン含有タンパク質とのジスルフィド結合、若しくはＩｇＧ４に基づく構築物中でのＨ鎖内ジスルフィド結合を回避しうる。

ＩｇＧ１のような大部分のＩｇＧタイプ抗体は、２本の同一のＨ鎖および２本の同一のＬ鎖から構成されるホモ二量体分子であり、典型的にＨ_２Ｌ_２と略記される。従って、これらの分子は抗原結合に関して一般に二価である。すなわち、ＩｇＧ分子の双方の抗原結合（Ｆａｂ）アームは同一の結合特異性を有する。

ＩｇＧ４アイソタイプＨ鎖は、Ｈ鎖間若しくはＨ鎖内いずれかのジスルフィド結合を形成することが可能な、それらのヒンジ領域中にＣＰＳＣ（配列番号３４）モチーフを含有する。すなわち、ＣＰＳＣモチーフ中の２個のＣｙｓ残基は、他のＨ鎖中の対応するＣｙｓ残基とジスルフィド結合を形成しうる（間）か、若しくは所定のＣＰＳＣモチーフ内の２個のＣｙｓ残基が相互とジスルフィド結合しうる（内）。ｉｎ ｖｉｖｏで異性化酵素がＩｇＧ４分子のＨ鎖間結合をＨ鎖内結合に転換することが可能であり、そして逆もまた真であると考えられる（ＡａｌｂｅｒｓｅとＳｃｈｕｕｒｍａｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
１０５、９−１９（２００２））。従って、ヒンジ領域にＨ鎖内結合をもつＩｇＧ４分子中のＨＬ対は相互と共有会合してないため、それらはＨＬ単量体に解離されることができ、それらはその後他のＩｇＧ４分子由来のＨＬ単量体と再会合して二特異性のヘテロ二量体ＩｇＧ４分子を形成しうる。二特異性ＩｇＧ抗体中で、抗体分子の２個のＦａｂはそれらが結合するエピトープが異なる。ＩｇＧ４のヒンジ領域のＳｅｒ２２８をＰｒｏで置換することは、「ＩｇＧ１様挙動」をもたらす。すなわち、該分子はＨ鎖間で安定なジスルフィド結合を形成し、そして従って他のＩｇＧ４分子とのＨＬ交換に対し感受性でない。

２．Ｈ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３は、選択された宿主細胞とより適合性の本発明のミメティボディを作成するように改変し得る。例えば、本発明のミメティボディを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞中で組換え発現する場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）酵素プロリンイミノペプチダーゼによる消化を予防するために、ヒンジ中のＰｒｏ−Ａｌａ配列を除去しうる。

３．ヒンジ領域の一部分を、選択した宿主細胞で発現される生成物の不均一性を予防するために、本発明のミメティボディ中で欠失若しくは他のアミノ酸で置換し得る。

４．１個若しくはそれ以上のグリコシル化部位を本発明のミメティボディ中で除去し得る。典型的にグリコシル化される残基（例えばＡｓｎ）は、Ｆｃ依存性の細胞媒介性傷害活性をミメティボディに賦与しうる。こうした残基は、欠失しても、若しくはＡｌａのようなグリコシル化されない残基で置換してもよい。

５．Ｃ１ｑ結合部位のような補体との相互作用に関与する部位を、本発明のミメティボディ中で除去する。

６．ＦｃＲｎサルベージ受容体（ｓａｌｖａｇｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）以外のＦｃ受容体への結合に影響を及ぼす部位を、本発明のミメティボディ中で除去し得る。例えば、ＡＤＣＣ活性に関与するＦｃ受容体を本発明のミメティボディ中で除去し得る。例えば、ＩｇＧ１のヒンジ領域のＬｅｕ２３４／Ｌｅｕ２３５のＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａへの、若しくはＩｇＧ４のヒンジ領域のＰｈｅ２３４／Ｌｅｕ２３４のＰ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａへの突然変異は、ＦｃＲ結合を最小限にし、そして補体依存性細胞傷害およびＡＤＣＣを媒介する免疫グロブリンの能力を低下する。

本発明の一態様は、Ｈｇ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３がＩｇＧ４サブクラスからでありかつＳｅｒ２２８Ｐｒｏ（Ｓ２２８Ｐ）置換およびＰ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異を含有する、式（ＩＩ）のＧＬＰ−２ミメティボディである。ＧＬＰ−２ペプチド配列中のこれらの突然
変異ならびにＡ２ＳおよびＡ２Ｇを有する例示的ＧＬＰ−２ミメティボディの完全なポリペプチド配列をそれぞれ配列番号４および５に示す。これらの配列は、ミメティボディ構築物のドメインの全部、すなわちＧＬＰ２ＲＡｇ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３ドメインを含有する。これらのミメティボディ構築物は、ＦｃＲ媒介性のエフェクター機能を誘発しない均質かつ安定な集団であると期待される。ここで示される置換および突然変異は例示的であり；本発明の範囲内のＨｇ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３ドメインは、他の置換、突然変異および／若しくは欠失を包含しうる。

変動可能なリンカー長さをもつ本発明の他の例示的なＡ２Ｇに基づくＧＬＰ−２ミメティボディの部分的ポリペプチド配列を、配列番号６、７、８、９、１０および１１に示す。これらの配列はＣ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインを除く全ドメインを示す。Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインが機能的ミメティボディに含有されるとみられることが当業者により理解されるであろう。

配列番号５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７に示されるアミノ酸配列を有するＧＬＰ−２アナログに基づく本発明の他の例示的ＧＬＰ−２ミメティボディの部分的ポリペプチド配列を、それぞれ配列番号５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４および６５に示す。これらの配列はＣ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインを除く全ドメインを示す。Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインが機能的ミメティボディに含有されるとみられることが当業者により理解されるであろう。

本発明は、結合に際してＧＬＰ−２Ｒを活性化することが可能であるＧＬＰ−２ミメティボディを包含する。本発明のミメティボディは広範なアフィニティーでＧＬＰ−２Ｒを結合し得る。ＧＬＰ−２Ｒに対するＧＬＰ−２ミメティボディのアフィニティーは、いずれの適する方法、例えばＢｉａｃｏｒｅ若しくはＫｉｎＥｘａ装置を使用する方法、ＥＬＩＳＡおよび競合結合アッセイを使用しても実験で測定し得る。

本発明のＧＬＰ−２ミメティボディおよびポリペプチドは、腸粘膜上皮の炎症、傷害および／若しくは機能不全を特徴とする障害若しくは症状の処置において有用である。ＧＬＰ−２の効果は、骨形成および維持、ならびに中枢性満腹因子としてのその役割により中枢神経系媒介性の障害でもまた示される。本発明のＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドを使用して処置し得る疾患若しくは症状は、限定されるものでないが、ＳＢＳ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、結腸炎、膵炎、回腸炎、炎症性腸閉塞（術後および他の原因からの双方）、癌化学療法および／若しくは放射線治療に伴う粘膜炎、完全非経口栄養法若しくは虚血により引き起こされる腸萎縮を包含するＧＩ疾患、骨粗鬆症のような骨関連障害、肥満を包含する栄養関連障害、ならびに新生児における壊死性全腸炎による腸不全を包含する小児のＧＩ障害を挙げることができる。本発明のＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドは、炎症性腸閉塞を予防、その症状を低減かつそれを処置するのにもまた使用し得る。

従って、本発明の別の局面は、本発明の最低１種のＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドおよび当該技術分野で既知の製薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤を含んでなる製薬学的組成物である。担体若しくは希釈剤は溶液、懸濁液、乳液、コロイド若しくは粉末であり得る。

本発明のＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドは、治療上若しくは予防上有効な量で製薬学的組成物として処方される。「有効な量」という用語は、一般に、効果的な治療、すなわちそのために処置が探索された症状若しくは障害の部分的若しくは完全な軽減に必要なミメティボディ若しくはポリペプチドの量を指す。前述の症状若しくは障害の発生の見込みを低下させることを意図している予防的処置が効果的な治療の定義内に包
含される。

該組成物は、場合によっては、本明細書で論考される疾患状態を処置するのに有用な最低１種のさらなる化合物、タンパク質若しくは組成物を含み得る。例えば、本発明のミメティボディ若しくはポリペプチドは、体重を増加させる、腸の治癒で補助する、若しくは栄養吸収を改善することを企図しているグルタミン若しくは他の栄養補助物質と組合せで使用し得る。さらに、抗炎症薬との組合せもまた企図している。本明細書および請求の範囲で使用されるところの「と組合せの」という用語は、記述される剤を、混合物で、単一の剤として同時に、若しくは単一の剤としていずれかの順序で連続して一緒に哺乳動物に投与し得ることを意味している。

核酸、ベクターおよび細胞株
本発明の別の局面は、本発明の最低１種のＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる、それに相補的な、若しくはそれとの有意の同一性を有する単離された核酸分子である。本発明の他の局面は、本発明の最低１種の単離されたＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドをコードする核酸分子を含んでなる組換えベクター、ならびに、該核酸分子を発現することが可能である細胞株および生物体を包含する。該核酸、発現ベクターおよび細胞株は、一般に、本発明のミメティボディを製造するのに使用しうる。

一態様において、本発明の核酸組成物は、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、４２、４３、４４、４５、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、７４、７５および７７のいずれか１種に同一若しくは実質的に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、４２、４３、４４、４５、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、７５および７７に示されるポリペプチド配列をコードする例示的核酸配列を、それぞれ配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、４６、４７、４８、４９、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７６および７８に示す。前述の核酸の対立遺伝子変異もまた提供される。

典型的には、本発明の核酸は、本発明のＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドの製造のための発現ベクター中で使用する。本発明の範囲内のベクターは、ＣＭＶプロモーターに駆動されるベクターのようなウイルスプロモーターに駆動されるベクター、例えばｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＥＰ４およびそれらの誘導体、バキュロウイルス発現ベクター、ショウジョウバエ発現ベクター、ならびにヒトＩｇ遺伝子プロモーターのような哺乳動物遺伝子プロモーターにより駆動される発現ベクターを包含する、真核生物発現のための必要な要素を提供する。他の例は、Ｔ７プロモーターに駆動されるベクター、例えばｐＥＴ４１、乳糖プロモーターに駆動されるベクター、およびアラビノース遺伝子プロモーターに駆動されるベクターのような原核生物発現ベクターを包含する。

本発明は、本発明のＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドを発現する細胞株にもまた関する。宿主細胞は原核生物若しくは真核生物細胞であり得る。例示的真核生物細胞は、限定されるものでないがＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、ＨｅｐＧ２、６５３、ＳＰ２／０、ＮＳ０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫細胞、若しくはそれらのいずれかの誘導体を挙げることができる哺乳動物細胞である。最も好ましくは、宿主細胞はＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＳＰ２／０若しくはＣＨＯ細胞である。本発明の細胞株は最低１種のＧＬＰ−２ミメティボディを安定に発現しうる。細胞株は、当該技術分野で公知である安定若しくは一過性トランスフェクション手順により生成しうる。

本発明は、さらに、ＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドが検出可能若しくは回収可能な量で発現される条件下で該細胞株を培養することを含んでなる、最低１種のＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドの発現方法を提供する。本発明はまた、ＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドが検出可能若しくは回収可能な量で発現されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｓｉｔｕの条件下で、ＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドをコードする核酸を翻訳することを含んでなる、最低１種のＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドの生成方法も提供する。本発明は、上の方法により製造されるＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドもまた包含する。

ＧＬＰ−２ミメティボディは、限定されるものでないが、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム若しくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアトパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを挙げることができる公知の方法により回収かつ精製し得る。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）もまた精製に使用し得る。

あるいは、本発明のＧＬＰ−２由来ポリペプチドは、当業者に公知の化学合成技術により製造し得る。組換え若しくは化学的いずれの方法により製造された本発明のポリペプチドも、当業者に公知の方法により回収かつ精製し得る。

使用方法
ＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドは、とりわけ、研究試薬および治療薬として有用である。一局面において、本発明は、最低１種のＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドをそれの必要な哺乳動物に提供することを含んでなる、ＧＬＰ−２の生物学的活性の改変方法に関する。ＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドはＧＬＰ−２Ｒを通じて細胞のシグナル伝達カスケードを活性化しうる。とりわけ、ＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドはＧＬＰ−２Ｒのアゴニストとして機能しうる。「アゴニスト」という用語は最も広範な意味で使用され、そして、ＧＬＰ−２Ｒの１種若しくはそれ以上の生物学的活性を直接若しくは間接的に、部分的に若しくは完全に活性化、増大若しくは促進することが可能である分子を包含する。

本発明は、治療上有効な量の最低１種のＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドの製薬学的組成物をそれの必要な患者に投与することを含んでなる、最低１種のＧＬＰ−２関連の状態若しくは疾患の症状の低減若しくはその処置方法もまた提供する。本発明の方法を使用する処置に適する状態および疾患は、限定されるものでないが、ＳＢＳ、クローン病、および小児ＧＩ障害、癌化学療法に伴う粘膜炎、ＩＢＤ、炎症性腸閉塞を包含するＧＩ疾患、ならびに上述された他の疾患および状態を挙げることができる。

ＧＬＰ−２は腸神経系のニューロン、およびＧＬＰ−２を含有する腸内分泌細胞で主に見出されるＧＬＰ−２Ｒと優先的に相互作用する（Ｇｕａｎら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３０：１５０−１６４（２００６））。ＧＬＰ−２の主機能の１つは腺窩絨毛での円柱細胞増殖を促進することであり、そこでそれは上皮細胞ターンオーバーおよび粘膜創傷治癒を高め（Ｂｕｌｕｔら、Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．１２１：１３７−４３（２００４））、粘膜障壁機能を高め（Ｂｅｎｊａｍｉｎら、Ｇｕｔ ４７：１１２−１１９（２０００））、そしてアポトーシスによる細胞死を阻害する（ＢｒｕｂａｋｅｒとＤｒｕｃｋｅｒ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４５：２６５３−２６５９（２００４））。これらの効果は、ＧＬＰ−２Ｒが腺窩円柱上皮細胞で発現されないため、神経に依存することが示されている（ＢｊｅｒｋｎｅｓとＣｈｅｎｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：１２４９７−１２５０２（２００１））。腸ニューロンでのＧＬＰ−２Ｒの存在は、ＧＬＰ−２が、運動性、ならびに腸炎症である役割を演じている神経−免疫相互作用を改変しうることを示唆する。

従って、本発明は、ＧＬＰ−２ポリペプチド組成物若しくはＧＬＰ−２ミメティボディ組成物をそれの必要な患者に投与することを含んでなる、炎症性腸閉塞の予防、その症状の低減若しくはその処置方法をさらに提供する。本明細書で使用されるところの「炎症性腸閉塞」は、胃腸管、例えば胃、小腸および／若しくは結腸のいずれの部分のイレウスでもあり得る。加えて、「炎症性腸閉塞」は、腸閉塞を引き起こすいずれの要因、例えば、移植手術のような腹部外科手術、若しくは移植手術以外の腹部外科手術、腸切除のような腸外科手術、および整形外科手術を包含する外科手術；外傷性傷害、例えば転落、交通事故、個人的暴行、若しくは外傷性傷害、例えば四肢骨折、肋骨骨折、脊椎の骨折、胸部損傷、虚血、腹膜後血腫から生じるいずれかの続発症；腹腔内炎症、例えば腹腔内敗血症、急性虫垂炎、胆嚢炎、膵炎、尿管疝痛、基底部肺炎（ｂａｓａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）；心筋梗塞；代謝障害；またはそれらのいずれかの組合せからも生じ得る。

上述されたとおり、ＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドの製薬学的組成物は、有効量の最低１種のＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチド、および製薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤を含んでなる。所定の治療の有効量は、治癒的であろうと予防的であろうと、一般に、投与手段、標的部位および投与される他の医薬品を包含する多くの異なる因子に依存することができる。従って、処置用量は安全性および有効性を至適化するように滴定される必要があることができる。

本発明の方法は、場合によっては、上に列挙された疾患を処置するのに使用されるいずれかの標準的治療との共投与若しくは併用療法をさらに含み得る。

投与の様式は、本発明のＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドの製薬学的に有効な量を宿主に送達するためのいかなる適する経路でもあり得る。例えば、ＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはポリペプチドは、皮下、筋肉内、皮内、静脈内若しくは鼻内投与のような非経口投与、または当該技術分野で既知のいずれの他の手段を介しても送達し得る。

本発明は以下の実施例を参照してさらに記述する。これらの実施例は単に本発明の局面を具体的に説明するためであり、そして本発明の制限として意図していない。

実施例

哺乳動物細胞でのＧＬＰ−２ミメティボディのクローニング、発現および精製
Ａ２Ｓ ＧＬＰ−２をコードする核酸配列は２段階ＰＣＲ増幅で生成した。第１回の増幅は、フォワードプライマー
５’−ＣＣＡＡＡＧＴＡＴＡＣＡＧＧＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣＡＴＴＣＴＴＧ−３’（配列番号３７）およびリバースプライマー５’−ＴＴＧＧＴＣＴＧＡＡＴＣＡＡＣＣＡＧＴＴＴＡＴＡＡＡＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＡＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＧＡＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＣ−３’（配列番号３８）を使用して実施した。融解、アニーリングおよび伸長温度はそれぞれ９６℃、４８℃および７２℃に設定した。３サイクルの反応を実施した。

第２回の増幅については、フォワードプライマーはＮｏｔＩ制限酵素認識部位を包含し、また、リバースプライマーはＢａｍＨＩ部位を包含した。フォワードプライマーの配列は、５’−ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＡＡＡＧＴＡＴＡＣＡＧＧＣＧ−３’（配列番号３９）であり、そしてリバースプライマーは５’−ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＧＡＡＴＣＡＡＣＣＡＧ−３’（配列番号４０）である。融解、アニーリングおよび伸長温度はそれぞれ９６℃、４８℃および６０℃に設定した。３０サイクルの反応を実施した。

Ａ２Ｇ ＧＬＰ−２をコードする核酸配列は、第１回の増幅で使用したフォワードプライマーが５’−ＣＣＡＡＡＧＴＡＴＡＣＡＧＧＣＧＣＡＴＧＧＣＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣＡＴＴＣＴＴＧ−３’（配列番号４１）であることを除き、同一手順で生成した。

増幅したＰＣＲ産物（Ａ２ＳおよびＡ２Ｇ ＧＬＰ−２）を、標準的クローニング手順を使用して、ＣＭＶプロモーターに駆動されるヒトＩｇＧ４ ΔＣＨ１、Ｓｅｒ ｔｏ Ｐｒｏ、Ａｌａ／Ａｌａ発現ベクターのＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローン化した。

Ａ２ＳおよびＡ２Ｇ ＧＬＰ−２ ＩｇＧ４ミメティボディをＨＥＫ ２９３Ｅ細胞で一過性に発現させ、そして標準的手順に従ってプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して馴化培地から精製した。プロテインＡアフィニティーカラムからの溶離された物質を、さらなる精製のためサイズ排除カラムにさらにかけた。

精製したＡ２ＳおよびＡ２Ｇ ＧＬＰ−２ミメティボディを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、および静的光散乱分析と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＳＬＳ）により分析した。還元および非還元双方の変性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥでの精製したミメティボディの移動は期待された範囲にあった。ＳＥＣ−ＳＬＳによる分析は、該ミメティボディの二量体に対応するおよそ１２３ＫＤの分子量をもつタンパク質を示した。ＧＬＰ−２ミメティボディはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で単量体として移動するため、二量体化は非共有相互作用を介する。

ｃＡＭＰ発現アッセイ
ＧＬＰ−２ミメティボディのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を評価するため、ｃＡＭＰ発現アッセイを開発した。この目標を達成するため、変異ヒトＧＬＰ−２Ｒを発現するクローン細胞株を、ＨＥＫ ２９３Ｅ細胞をトランスフェクトすることにより生成した。変異ヒトＧＬＰ−２Ｒは、Ｃ末端の細胞内領域（配列番号３６）内の３アミノ酸位置で野生型ヒトＧＬＰ−２Ｒ（配列番号３５）と異なる。ＧＬＰ−２ペプチドはこの細胞株でｃＡＭＰ発現を刺激し、そして、対照ペプチドはｃＡＭＰ発現を刺激しなかったため、該刺激は特異的であった。

Ａ２ＳおよびＡ２Ｇ ＩｇＧ４ ＧＬＰ−２ミメティボディを、組換え細胞株中のｃＡＭＰ発現を刺激するそれらの能力について、対応するＧＬＰ−２ペプチド（Ａ２ＳおよびＡ２Ｇ）と比較した。簡潔には、細胞を個々のＧＬＰ−２ミメティボディ若しくはＧＬＰ−２ペプチドと３０分間インキュベートした。ｃＡＭＰ発現を、ｃＡＭＰ Ｄｉｒｅｃｔ
Ｓｃｒｅｅｎ装置（カタログ番号ＣＳＤ ２００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を使用して定量化した。Ａ２ＳおよびＡ２ＧペプチドのＥＣ_５０はそれぞれ０．５ｎＭおよび０．８ｎＭであり；Ａ２ＳおよびＡ２ＧミメティボディのＥＣ_５０はそれぞれ２．２ｎＭおよび３．８ｎＭである。従って、このアッセイでのＧＬＰ−２ミメティボディの効力は、ペプチドより約４倍より小さかった。

ＧＬＰ−２ミメティボディバリアント
ＧＬＰ−２ミメティボディのリンカー長さの影響を検討するため、多様なリンカー長さをもつ多様な構築物を生成した。コア領域の配列を下に表１に示す。

これらのバリアントをＨＥＫ ２９３細胞で一過性に発現させ、精製しかつＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＳＥＣ−ＳＬＳによる分析は、該ミメティボディの二量体に対応するものに加えて該ミメティボディの単量体に対応する６５〜７０ｋＤａの分子量をもつピークを示した。リンカー長さが長くなるほど、単量体集団の比率が高くなることが観察された。

リンカー長さおよびＶ２領域のバリアントを、実施例２に記述されたｃＡＭＰ発現アッセイで試験した。該データは、ＥＣ_５０により評価されるところのＧＬＰ−２ミメティボディの活性が、リンカー長さと直接相関した（すなわち、より長いリンカーをもつミメティボディがより高い活性を有する）ことを示した（表１）。

ＧＬＰ−２ミメティボディの安定性を増大させるため、Ｖ２若しくはＨｇ領域のタンパク質分解性切断感受性部位のアミノ酸残基をＰｒｏで置換した一連のバリアントを構築した。該ＧＬＰ−２ミメティボディバリアントのコア領域の配列を下に表２に示す。

Ｐｒｏ置換バリアントをＨＥＫ ２９３細胞で一過性に発現させ、精製しかつＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ｃＡＭＰ発現アッセイからのデータは、ＥＣ_５０により評価されるところのこれらのＧＬＰ−２ミメティボディバリアントの活性がＡ２Ｇ ＧＬＰ−２ミメティボディ（配列番号５）のものに匹敵することを示した。

精製したＰｒｏ置換バリアントを、ＣｏｍｐｌｅｔｅＭｉｎｉプロテアーゼ阻害剤錠剤（カタログ番号１ ８３６ １５３、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、インジアナ州インジアナポリス）の存在下でＵ９３７細胞ライセートと０、１２若しくは２４時間インキュベートした。その後、ＧＬＰ−２ミメティボディバリアントをプロテインＡビーズを使用して精製し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。図１に示されるとおり、Ａ２Ｇ ＧＬＰ−２ミメティボディ（配列番号５）と比較して、２４時間の試験時間でＰｒｏ置換バリアント（配列番号４３若しくは４４）でより少ない分解が存在した。結論すれば、Ｐｒｏ置換バリアントはｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質分解に対しより抵抗性である。

ＧＬＰ−２ミメティボディは小腸での粘膜重量増加を刺激する
ＧＬＰ−２ミメティボディのｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すため、ＣＤ１マウスにＧＬＰ−２ミメティボディを注入し、そして小腸内のエンドポイントを評価した。簡潔には、雌性ＣＤ１マウスに、Ａ２Ｇ ＧＬＰ−２ペプチド（配列番号３）、Ａ２Ｇ ＡＬＰ−２ ＩｇＧ４ミメティボディ（配列番号５）若しくは対照ミメティボディの連日の皮下注入を１０日間与えた。その後、マウスを安楽死させ、そして、小腸を取り出し、生理的食塩水で洗い流し、そして下述されるとおり処理した。

具体的には４ｃｍ切片を収集した。すなわち（１）幽門に対しすぐ遠位（十二指腸）、（２）トライツ靱帯の２ｃｍ遠位で開始する（空腸）、および（３）盲腸に対しすぐ近位（回腸）。トライツ靱帯の約６ｃｍ遠位から盲腸に対し４ｃｍ近位までの残存する小腸を使用して粘膜擦過標本を調製した。残部の近位および遠位端から、１５ｃｍ切片が残存するまで等距離を除去し、残部を長軸方向に切断し、すすぎ、そして、ガラス製顕微鏡用スライドガラスの短端を使用して粘膜層を除去した。無傷の小腸区分および粘膜の湿重量を測定した。

異なるマウスからの空腸と回腸の間の１５ｃｍ区分から採取した粘膜擦過標本の重量を図２に示す。Ａ２Ｇ ＧＬＰ−２ミメティボディを注入したマウスについて、粘膜湿重量の重量依存性の増大が観察された。０．８および８ｍ／ｋｇ（それぞれ０．２６および２．６ｎモル）で、増大は対照ミメティボディと比較して統計学的に有意であった（それぞれｐ＜０．０００１およびｐ＜０．０００４）。

統計学的に有意の増大（ｐ＜０．０００１）は、２．５ｍｇ／ｋｇ（１３．３ｎモル）のＡ２Ｇ ＧＬＰ−２ペプチドを注入したマウスでもまた見られた。比較して、Ａ２Ｇ ＧＬＰ−２ミメティボディは、Ａ２Ｇ ＧＬＰ−２ペプチドより５０倍より低い用量（モル濃度基準で）でｉｎ ｖｉｖｏで有効である。

ＧＬＰ−２ミメティボディの薬物動態
ＧＬＰ−２ミメティボディの薬物動態を測定するため、ＣＤ１マウスに３ｍｇ／ｋｇのＡ２Ｇ ＧＬＰ−２ミメティボディ（配列番号５）を静脈内若しくは皮下投与した。血液を、ｅｘ ｖｉｖｏ分解の可能性を最小限にするためのプロテアーゼ阻害剤を含有するクエン酸緩衝液に異なる時点で収集し、そして血漿を遠心分離により分離した。

時間分解蛍光（ＴＲＦ）アッセイを使用して活性のミメティボディを測定した。活性のミメティボディは、該ミメティボディのＦｃ領域になお結合されている該ペプチドの無傷のＮ末端を反映する。

ＴＲＦ実験に基づき、マウスでのＡ２Ｇ ＧＬＰ−２ミメティボディの計算された半減
期は２６．５時間であった。対照的に、ヒトでのＧＬＰ−２ペプチドの報告された半減期は７．２±２分である（Ｈａｒｔｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８５：２８８４−２８８８（２０００））。従って、Ａ２Ｇ ＧＬＰ−２ミメティボディの半減期は、ＧＬＰ−２ペプチドのものより２００倍以上より高い。

類似の実験で、カニクイザルに１ｍｇ／ｋｇのＡ２Ｇ ＧＬＰ−２ミメティボディを静脈内投与した。ＴＲＦデータに基づけば、カニクイザルでのＡ２Ｇ ＧＬＰ−２ミメティボディの計算された半減期は４．８日であった。

ＧＬＰ−２ミメティボディの薬動力学
その延長された薬物動態に基づき、ＧＬＰ−２ミメティボディはより長い応答期間を有すると期待される。Ａ２Ｇ ＧＬＰ−２ミメティボディの薬動力学を評価するため、マウスに、連日、１日おき、週１回、若しくは試験の開始時に１回のみ投与した。動物の取り扱いについて制御するため、マウスがＡ２Ｇ ＧＬＰ−２ミメティボディを受領しなかった日に、それらに陰性対照ミメティボディ、すなわちＧＬＰ−２ペプチドを含まないミメティボディ免疫グロブリン足場構造を注入した。Ａ２Ｇ ＧＬＰ−２ミメティボディおよび陰性対照の用量は全群について４ｍｇ／ｋｇ（１．３ｎモル／ｋｇ）であった。試験期間は１１日であり、そして組織を実施例４で記述したとおり処理した。

Ａ２Ｇ ＧＬＰ−２ミメティボディを週あたり１回投与されたマウスは、対照ミメティボディに比較して有意に増大した粘膜重量を有した。該差違は、Ａ２Ｇ ＧＬＰ−２ミメティボディを毎日若しくは１日おきに投与した場合により顕著であった。類似のパターンが小腸切片湿重量に関して観察された。十二指腸および空腸双方で、対照ミメティボディを上回る重量の有意の増加が、単回投与実験を除く全レジメンで見られた。

ＧＬＰ−２中の突然変異はペプチド二量体化を予防する
野生型ＧＬＰ−２ペプチド（配列番号１）は高濃度で二量体化する。例えば、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中で、ＧＬＰ−２は０．４ｍｇ／ｍＬで単量体として、しかし２ｍｇ／ｍＬで単量体（約２０％）および可逆的に自己会合した二量体（約８０％）の混合物として存在する（データは示されない）。自己会合は、均質な治療薬の開発および製造に対する挑戦を課す。

野生型ＧＬＰ−２の生物学的活性を保持しかつ高濃度で単量体として存在するペプチドアナログ（配列番号５２、５４、５５および７４）を設計した。ＧＬＰ−２（Ａ２Ｇ、Ｌ１７Ｑ）（配列番号５４）およびＧＬＰ−２（Ａ２Ｇ、Ｎ１６Ｇ、Ｌ１７Ｑ）（配列番号５５）を合成し、そして＞９５％純度まで精製した。ペプチドＧＬＰ−２（配列番号１）、ＧＬＰ−２（Ａ２Ｇ）（配列番号３）およびＧＬＰ−１（配列番号７９）を、アナログの特徴付けで対照として包含した。

ペプチドの溶液分子量をＳＥＣ−ＳＬＳにより測定した。簡潔には、０．４ないし２．０ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．５）中のペプチド溶液をＳｕｐｅｒｄｅｘペプチドカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で分画した。溶離されるピークは６９０ｎｍでの静的光散乱によりモニターし、そして、Ａｓｔｒａソフトウェアパッケージ（Ｗｙａｔｔ Ｉｎｃ．）を使用して、溶液分子量をＵＶ２８０ｎｍで測定した。

１ｍｇ／ｍｌで、ＧＬＰ−１は期待された単量体の大きさ内の分子量を伴う単一ピークとして溶離した。ＧＬＰ−２およびＧＬＰ−２（Ａ２Ｇ）は、重なる二量体および単量体のピークの同様の分布を表した。アナログペプチドＧＬＰ−２（Ａ２Ｇ、Ｌ１７Ｑ）およ
びＧＬＰ−２（Ａ２Ｇ、Ｎ１６Ｇ、Ｌ１７Ｑ）双方は、主に単量体のペプチドと一致した分子量を伴う単一ピークとして溶離した。

試験したペプチドの二次構造を、ＰＢＳ中０．２ｍｇ／ｍＬペプチド溶液を使用して決定した。簡潔には、ＣＤスペクトルを０．１ｃｍ光路長セル中２５℃で１ｎｍ間隔で３検体で収集した。二次構造は、ＣＤスペクトルソフトウェア（ＣＤ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎソフトウェア２．１）を使用するＣＤスペクトルの当てはめにより決定した。全部の試験したペプチドは、αらせんの存在に対応するピークを含有した。しかしながら、アナログペプチドＧＬＰ−２（Ａ２Ｇ、Ｌ１７Ｑ）およびＧＬＰ−２（Ａ２Ｇ、Ｎ１６Ｇ、Ｌ１７Ｑ）のヘリックス含量は約１７％であり、ＧＬＰ−１のものに同様かつＧＬＰ−２およびＧＬＰ−２（Ａ２Ｇ）のものより低かった（表３）。

加えて、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）はペプチドでヘリックス形成を誘導することが既知である（Ｓｏｅｎｎｉｃｈｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：８７９１（１９９２））。従って、ＴＦＥを使用するらせん傾向分析を実施した。簡潔には、試験されるペプチドを、０、１、５、１５、３３若しくは５０％ＴＦＥを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．５）で０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した。ＣＤスペクトルを収集し、そして、データ平均化、緩衝液減算および曲線平滑化後にＣＤプロットを生成した。らせん傾向値を、％ＴＦＥプロットに対する２２２ｎｍの平均残基楕円率（ＭＲＥ）から得た。２２２ｎｍのＣＤスペクトルの５０％変形を遂げたＴＦＥの濃度を、らせん傾向の尺度として使用した。

該結果は、ＧＬＰ−２およびＧＬＰ−２（Ａ２Ｇ）がより大きならせん傾向を表し、最大のらせんシグナルへの変形に約１６％のＴＦＥを必要としたことを示した。比較において、ＧＬＰ−１はより低いらせん傾向を有し、らせん変形に＞２０％ＴＦＥを必要とした。重要なことに、アナログペプチドＧＬＰ−２（Ａ２Ｇ、Ｌ１７Ｑ）およびＧＬＰ−２（Ａ２Ｇ、Ｎ１６Ｇ、Ｌ１７Ｑ）双方はらせん変形に＞２０％ＴＦＥを必要とし、ＧＬＰ−２によりＧＬＰ−１へのより緊密な類似性を持つ。従って、Ｌ１７Ｑ置換は、ＧＬＰ−２ペプチドのらせん形成可能性を低下させた。

ＧＬＰ−２中の突然変異はミメティボディの二量体化を予防する
Ａ２Ｇ、Ｌ１７Ｑ（配列番号７５）およびＡ２Ｇ、Ｎ１６Ｇ、Ｌ１７Ｑ（配列番号７７）をもつＧＬＰ−２ミメティボディをコードする核酸配列を、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＸＬキットを使用して生成した。これらのミメティボディバリアントをＨＥＫ ２９３Ｅ細胞で一過性に発現させ、そして実施例１に記述された手順に従って精製した。

ＳＥＣ−ＳＬＳ分析に基づけば、ＧＬＰ−２（Ａ２Ｇ、Ｎ１６Ｇ、Ｌ１７Ｑ）ミメティボディは単量体に一致した分子量を表した一方、ＧＬＰ−２（Ａ２Ｇ、Ｌ１７Ｑ）ミメティボディは単量体および二量体の混合物を反映する分子量を表した。

ＧＬＰ−２アナログミメティボディのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
ＧＬＰ−２アナログのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性をｃＡＭＰ発現アッセイで試験した。このアッセイは、ＨＥＫ ２９３Ｅ細胞中で変異ｈｕＧＬＰ−２Ｒを発現する細胞株を利用するＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのｃＡＭＰ Ｄｉｒｅｃｔ Ｓｃｒｅｅｎ装置に基づいた。０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中０．０１ｎＭから１．０μＭまでの範囲にわたる濃度のペプチドを、９６ウェルプレート中に懸濁した約５０，０００細胞に添加した。３７℃で３０分のインキュベーション後に、溶解緩衝液、次いで発光試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造元の手順（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅプロトコル：ｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎ Ｄｉｒｅｃｔ装置）に従って添加した。ＴｏｐＣｏｕｎｔ液体シンチレーション分析機（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して発光を定量し、そしてＳｏｆｔｍａｘソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用してデータを処理した。ペプチド濃度に対するｃＡＭＰ濃度のプロットから得たＥＣ−５０値を下の表５に列挙する。

該データは、野生型ＧＬＰ−２に関して、ＧＬＰ−２_{（Ａ２Ｇ、Ｎ１６Ｇ、Ｌ１７Ｑ）}およびＧＬＰ−２_{（Ａ２Ｇ、Ｌ１７Ｑ）}のそれぞれわずか２および３倍より低い活性を示す。

Ａ２Ｇ−ＧＬＰ−２ペプチドは上部ＧＩ通過を加速する
正常マウスでの上部胃腸通過に対するＡ２Ｇ−ＧＬＰ−２の効果を試験するため、マウスを２群に無作為に割り当てた（試験群あたり１４動物）。各群はＡ２Ｇ−ＧＬＰ−２ペプチド（５０μｇ／マウス）若しくはリン酸緩衝生理的食塩水ベヒクルいずれかの連日の皮下注入（総容量２００ｍｌ）を連続１０日間受領した。

試験の日に、カーマイン色素技術を使用して上部胃腸通過を測定した。マウスに、１８ゲージ湾曲給餌チューブにより胃内に投与される、０．５％（ｗ／ｖ）メチルセルロースに混合したカーマインコチニール粉末の６％（ｗ／ｖ）溶液０．２５ｍｌの試験食を給餌した。経口試験食投与後にマウスをそれらの住居ケージに戻した。マーカー食投与２０分後に、マウスを頚部脱臼により迅速に安楽死させ、そして胃腸管全体を遠位結腸から開始しかつ胃幽門に向かって作業して摘出した。切除した消化管は、該臓器を伸展させることを回避するよう注意しつつ、直線的メートル尺定規に平行に長く配置した。小腸を通りカーマイン色素先端により移動された直線的距離を小腸の全長と一緒に測定した。上部胃腸通過は、２０分の試験時間の間にカーマイン色素先端により移動された小腸全体の比率として表した。すなわち、移動された小腸％＝［小腸を通り色素先端により移動された距離（ｃｍ）／小腸全長（ｃｍ）×１００］。図３に示されるとおり、Ａ２Ｇ−ＧＬＰ−２処置は上部胃腸通過の加速につながった。

ＧＬＰ−２ミメティボディは上部ＧＩ通過を加速する
正常マウスでの上部胃腸通過に対するＧＬＰ−２ミメティボディの効果を試験するため
、マウスを２群に無作為に割り当てた（群あたり４動物）。各群は、胃腸通過の測定４日前に、Ａ２Ｇ ＧＬＰ−２ミメティボディ（配列番号５）（４ｍｇ／ｋｇ）若しくはＩｇＧ４陰性対照の単回注入を受領した。

試験の日に、ＦＩＴＣ−デキストラン法を使用して上部胃腸通過を測定した。この方法は、胃腸通過の尺度および胃腸管に沿った試験食の分布のパターンの読み出しの双方を提供する。マウスに、１８ゲージ湾曲給餌チューブにより胃内に投与される１５０ｍｌのＦＩＴＣ−デキストラン溶液（０．５％メチルセルロース／脱イオン水中でフルオレセイン−イソチオシアネートに複合した５ｍｇ／ｍｌの７０，０００分子量のデキストラン）の試験食を給餌した。ＦＩＴＣ−デキストラン試験食の経口投与後に、マウスをそれらの住居ケージに戻した。３０分の試験時間は加速された通過を検出するための至適の時間であった一方、４５分の試験時間は遅延された通過を検出するために至適であったことが示された。適切な試験時間後にマウスを二酸化炭素曝露により殺した。下部食道括約筋から結腸末端までの胃腸管全体を取り出した。腸区分を腸間膜縁に沿って開いた。胃の組織および管腔内容物、小腸の１０個の等しい区分、盲腸、ならびに結腸の３個の等しい区分を、１ｍｌのＰＢＳを含有する個別のエッペンドルフチューブに入れた。組織を卓上ボルテックスで活発に攪拌し、そして固形物質を遠心分離によりペレットにした。澄明にした上清のアリコートを、９６ウェル蛍光プレートリーダーで２検体で読み取り、腸の各区分の蛍光シグナルの大きさを定量化した。これらの値を使用して、胃腸管に沿った蛍光シグナルの加重平均分布と定義される幾何学的中心（ＧＣ）、すなわち、ＧＣ＝Σ（区分あたりの総シグナルの％×区分数）／１００を計算した。より高い値は１ないし１５の目盛りでより速い通過速度を表す。図４に示されるとおり、ＧＬＰ−２ミメティボディ処置の１回の単一用量が上部胃腸通過の加速につながった。ＦＩＴＣ−デキストランの分布パターンのミメティボディ誘発性の移動を上図に示す。胃での低下された標識、および小腸のより遠位の区分への大量の標識の全体的移動が存在する。統計学的比較のため下図でＧＣを計算する。正常マウスは３０分の試験時間後にＧＣ＝６を表し、そしてこれはＩｇＧ４足場構造での処置により不変であった。ＧＬＰ−２ミメティボディでの処置はＧＣを７．５に増大した。

ＧＬＰ−２ミメティボディは術後炎症性腸閉塞に関連する損なわれたＧＩ運動性を減弱する
マウスでのヒトＩｇＧ４の免疫原性により、マウスＧＬＰ−２ミメティボディ、すなわち、マウスＩｇＧ２ａ足場構造中のヒトＡ２Ｇ−ＧＬＰ２ペプチド（配列番号８０）を以下の実験で使用した。

術後炎症性腸閉塞に関連した損なわれたＧＩ運動性に対するＧＬＰ−２ミメティボディの効果を試験するため、マウスを３群に無作為化し（群あたり８動物）、そして２ｍｇ／ｋｇのマウスＡ２Ｇ−ＧＬＰ−２ミメティボディ、ＩｇＧ２ａ若しくはＰＢＳで処置した。１時間後にマウスを開腹および小腸の操作にかけた。簡潔には、雄性ＣＤ−１マウスを吸入イソフルランにより麻酔し、そして外科手術のため準備した。腹部を剃毛しそして無菌溶液で処置した。動物をその後外科用ドレープで覆った。正中腺開腹術を介して腹部を開放し、そして小腸全体を無菌ドレープ上に体外露出した。２個の湿らせた無菌の綿棒を使用して、小腸をその後、その長さに沿って、トライツ靱帯から回盲結合部まで穏やかに圧迫した。小腸をその後腹腔に戻し、そして切開を縫合閉鎖した。その後、マウスをそれらの住居ケージに戻した。８動物の第四の群がナイーブな対照としてはたらいた。

全マウスが手術の４８時間後にＦＩＴＣ−デキストランの経口試験食を受領した。胃腸通過を経口給餌４５分後に測定した。図５に示されるとおり、ナイーブな対照は正常の４５分の通過（ＧＣ＝８．２）を表した。腹部外科手術は、ＰＢＳ処置動物で胃腸通過の有意の遅延につながった。ＩｇＧ２ａでの処置は、通過の外科的に誘発した遅延に対する影響を有しなかった一方、マウスＡ２Ｇ−ＧＬＰ−２ミメティボディでの処置は通過の有意の改善につながった。

ＧＬＰ−２ミメティボディは術後炎症性腸閉塞に関連した細胞性炎症を低下させる
細胞性炎症に対するＧＬＰ−２ミメティボディの効果を試験するため、術後炎症性腸閉塞を実施例１２に記述されたとおりマウスで誘発した。ミエロペルオキシダーゼ組織化学を、術後４８時間のマウスの中央小腸から収集した組織で実施した。

簡潔には、実施例１２に記述される遠心管から中央小腸の区分を収集した。組織をＳｙｌａｇａｒｄ^（Ｒ）内張したペトリ皿に平らにピンで止めること、および組織をその長さを２倍およびその幅を１．５倍に伸展することにより、筋層のホールマウントを調製した。粘膜を微細切開により除去した。筋層のホールマウントをその後１００％エタノールで１時間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、そして０．１％過酸化水素および１ｍｇ／ｍｌ Ｈａｎｋｅｒ−Ｙａｔｅｓ試薬を含有するＰＢＳ中で２０分間インキュベートした。ＰＢＳでの第二の洗浄後に、ホールマウントをスライドガラスに載せ、カバーガラスで覆い、そして光学顕微鏡で見た。ミエロペルオキシダーゼを含有する白血球を、６ないし８個の隣接する２００倍光学的視野中で計数し、そして平均細胞数を計算かつ記録した。

Ｈａｎｋｅｒ−Ｙａｔｅｓ試薬を使用してミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性について染色した腸筋層の代表的ホールマウントを図６に示す。黒点は小腸筋層に浸潤するＭＰＯ陽性白血球を表す。ナイーブなマウスから収集した組織中でＭＰＯ陽性細胞がほとんど見出されなかった。浸潤する白血球の数の顕著な増加が、小腸の外科的操作を受ける前にＰＢＳで処置したマウスで見出された。ＩｇＧ２ａでの処置は浸潤細胞数に対する影響を有しなかった。対照的に、マウスＡ２Ｇ−ＧＬＰ−２ミメティボディでの処置は浸潤細胞数を有意に低下させた。細胞数を統計学的比較のため図７にまとめる。

本発明は今や完全に記述されたため、付随する請求の範囲の技術思想若しくは範囲から離れることなく多くの変更および改変がそれに対しなされ得ることが、当業者に明らかであろう。

Ｕ９３７細胞ライセートとのインキュベーション後のＧＬＰ−２ミメティボディＰｒｏ置換バリアント（配列番号４３および４４）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの像を示す。 Ａ２Ｇ ＧＬＰ−２ミメティボディで処置したマウスからの粘膜擦過標本の湿重量の用量依存性の増大を示す。 Ａ２Ｇ−ＧＬＰ−２ペプチドで処置したマウスでの腸通過の有意の加速を示す。統計学的有意性は対応のないスチューデントのＴ検定により決定した。 Ａ２Ｇ−ＧＬＰ−２ミメティボディで処置したマウスでの腸通過の有意の加速を示す。統計学的有意性は対応のないスチューデントのｔ検定により決定した。 マウスＡ２Ｇ ＧＬＰ−２ミメティボディで処置したマウスでの術後炎症性腸閉塞と関連する胃腸通過の遅延の有意の減弱を示す。統計学的有意性は、ＡＮＯＶＡ、次いでボンフェロニの事後検定により決定した。 腹部手術後のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）含有白血球の増大された数を伴う腸筋層のホールマウントを示す。マウスＡ２Ｇ ＧＬＰ−２ミメティボディでの処置は浸潤する細胞の数を有意に低下した一方、ＩｇＧ２ａは影響を有しなかった。 図６からの集めた細胞数でのヒストグラムを示す。統計学的有意性は、ＡＮＯＶＡ、次いでボンフェロニの事後検定により決定した。

Claims (31)

1. 式（ＩＩ）：
   （ＧＬＰ２ＲＡｇ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３）_（ｔ）
   （ＩＩ）
   ［式中、ＧＬＰ２ＲＡｇは哺乳動物ＧＬＰ−２Ｒアゴニストであり、Ｌｋはポリペプチド若しくは化学結合であり、Ｖ２は免疫グロブリン可変領域のＣ末端の一部分であり、Ｈｇは免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分であり、Ｃ_Ｈ２は免疫グロブリンＨ鎖Ｃ_Ｈ２定常領域であり、およびＣ_Ｈ３は免疫グロブリンＨ鎖Ｃ_Ｈ３定常領域であり、ならびにｔは独立に１から１０までの整数である］
   のミメティボディ。
2. ＧＬＰ２ＲＡｇが、配列番号２、３、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７若しくは７４のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のミメティボディ。
3. Ｈｇ、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３がＩｇＧ１サブクラスのものである、請求項１に記載のミメティボディ。
4. ＨｇのＣｙｓ２２０がＡｌａで置換されており、また、Ｃ_Ｈ２のＬｅｕ２３４およびＬｅｕ２３５がＡｌａ２３４およびＡｌａ２３５に突然変異されている、請求項３に記載のミメティボディ。
5. ＨｇがＩｇＧ４サブクラスのものであり、かつ、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３がＩｇＧ１サブクラスのものである、請求項１に記載のミメティボディ。
6. Ｈｇ、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３がＩｇＧ４サブクラスのものである、請求項１に記載のミメティボディ。
7. ＨｇのＳｅｒ２２８がＰｒｏで置換されており、また、Ｃ_Ｈ２のＰｈｅ２３４およびＬｅｕ２３５がＡｌａ２３４およびＡｌａ２３５に突然変異されている、請求項６に記載のミメティボディ。
8. ミメティボディがＧＬＰ−２受容体に結合する、請求項１に記載のミメティボディ。
9. 配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、４２、４３、４４、４５、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、７５若しくは７７に示される配列を有するポリペプチドを含んでなるミメティボディ。
10. 請求項１ないし９のいずれか１つに記載のミメティボディをコードするポリヌクレオチド。
11. 配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、４６、４７、４８、４９、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７６若しくは７８に示される配列または相補配列を有するポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド。
12. 配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、４２、４３、４４、４５、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、７５若しくは７７に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド。
13. 請求項１１若しくは１２に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
14. 請求項１ないし９のいずれか１つに記載のミメティボディを発現する細胞株。
15. 請求項１３に記載のベクターを含んでなる細胞株。
16. 細胞株が、ＨＥＫ２９３、ＮＳＯ、ＳＰ２／０若しくはＣＨＯ細胞である、請求項１５に記載の細胞株。
17. 請求項１６に記載の細胞株を培養する段階、および発現されたポリペプチドを精製する段階を含んでなる、ポリペプチドの製造方法。
18. 請求項１ないし９のいずれか１つに記載の最低１種のミメティボディの有効量、および製薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤を含んでなる、製薬学的組成物。
19. 請求項１８に記載の製薬学的組成物を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物におけるＧＬＰ−２の生物学的活性の改変方法。
20. 請求項１８に記載の製薬学的組成物をそれの必要な患者に投与することを含んでなる、最低１種のＧＬＰ−２関連の状態若しくは障害の症状の低減若しくはその処置方法。
21. ＧＬＰ−２関連の状態若しくは障害が、胃腸障害、骨関連障害若しくは栄養関連障害である、請求項２０に記載の方法。
22. 胃腸障害が、短腸症候群、炎症性腸疾患、クローン病、結腸炎、膵炎、回腸炎、粘膜炎若しくは腸萎縮である、請求項２１に記載の方法。
23. 胃腸障害が小児の胃腸障害である、請求項２１に記載の方法。
24. 骨関連障害が骨粗鬆症である、請求項２１に記載の方法。
25. 栄養関連障害が肥満である、請求項２１に記載の方法。
26. 請求項１８に記載の製薬学的組成物をそれの必要な患者に投与することを含んでなる、炎症性腸閉塞の予防、その症状の低減若しくはその処置方法。
27. 配列番号５２、５４、５５若しくは７４に示される配列を有するポリペプチドを含んでなるポリペプチド。
28. 請求項２７に記載のポリペプチドの有効量、および製薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤を含んでなる製薬学的組成物。
29. 請求項２８に記載の製薬学的組成物を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物におけるＧＬＰ−２の生物学的活性の改変方法。
30. 請求項２８に記載の製薬学的組成物をそれの必要な患者に投与することを含んでなる、最低１種のＧＬＰ−２関連の状態若しくは障害の症状の低減若しくはその処置方法。
31. 請求項２８に記載の製薬学的組成物をそれの必要な患者に投与することを含んでなる、炎症性腸閉塞の予防、その症状の低減若しくはその処置方法。