TW202317607A - 融合蛋白及其應用 - Google Patents
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Abstract
本揭露關於一種融合蛋白及其應用，該融合蛋白包含人GLP-1多肽變體和免疫球蛋白Fc區；其中與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列包含至少2個胺基酸突變，該至少2個胺基酸突變位於選自下組的胺基酸位置處：W31、K26和Y19。本揭露還提供了該融合蛋白在治療疾病或病症中的應用。
Description
本揭露關於生物醫藥領域，具體的關於一種GLP-1多肽變體與免疫球蛋白Fc區的融合蛋白及其應用。
胰高血糖素樣肽(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一種由小腸上皮L-細胞分泌的腸促胰素，在健康的個體中，GLP-1能響應機體營養物質的攝取，促進胰島素釋放並抑制胰高血糖素分泌。在患有II型糖尿病的患者中，輸入超生理劑量的GLP-1可恢復內源性胰島素分泌，降低血糖。
由於二肽基肽酶IV(DPPIV)的酶解和腎臟的清除作用，天然GLP-1的血漿半衰期短。儘管已經開發了幾種修飾以延長半衰期的GLP-1R激動劑(例如，度拉糖肽(dulaglutide))用於治療II型糖尿病，但仍需開發有效的長期治療並維持最低限度的副作用的方案。
本揭露提供了一種融合蛋白，該融合蛋白包含人GLP-1多肽變體和免疫球蛋白Fc區。該融合蛋白具有優異的藥物代謝動力學性質，例如，較長的半衰期(t1/2)較長，或較高的暴露量。本揭露的融合蛋白不易被清除，顯著
提高了天然GLP-1的半衰期，有利於GLP-1多肽變體在體內發揮功能，提高藥效，降低使用量。
本揭露提供了融合蛋白，該融合蛋白包含人GLP-1多肽變體和免疫球蛋白Fc區；其中與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列包含至少2個胺基酸突變，該至少2個胺基酸突變位於選自下組的胺基酸位置處：W31、K26和Y19。
在某些實施方式中，該免疫球蛋白Fc區位於該人GLP-1多肽變體的C端。
在某些實施方式中，該免疫球蛋白Fc區為源自IgG的Fc區。
在某些實施方式中，該免疫球蛋白Fc區為源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區。
在某些實施方式中，該免疫球蛋白Fc區為源自IgG4的Fc區。
在某些實施方式中，該免疫球蛋白Fc區包含如SEQ ID NO：32-35中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該免疫球蛋白Fc區包含胺基酸突變，與未經該胺基酸突變的免疫球蛋白Fc區相比，該胺基酸突變使得該免疫球蛋白Fc區與Fc受體的結合親和力選擇性增强。
在某些實施方式中，該免疫球蛋白Fc區在根據EU編碼的M252、S254和T256位置處包含胺基酸突變。
在某些實施方式中，該免疫球蛋白Fc區包含下組的胺基酸突變：M252Y、S254T和/或T256E。
在某些實施方式中，該免疫球蛋白Fc區的胺基酸突變為M252Y、S254T和T256E。
在某些實施方式中，該免疫球蛋白Fc區包含如SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該融合蛋白包含鉸鏈區，且該鉸鏈區位於該人GLP-1多肽變體和該免疫球蛋白Fc區之間。
在某些實施方式中，該鉸鏈區源自IgG。
在某些實施方式中，該鉸鏈區源自IgG1或IgG4。
在某些實施方式中，該鉸鏈區包含如SEQ ID NO：30-31中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該鉸鏈區源自IgG1。
在某些實施方式中，該鉸鏈區包含如SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該融合蛋白還包含連接子，且該連接子位於該人GLP-1多肽變體和該鉸鏈區之間。
在某些實施方式中，該連接子為肽連接子。
在某些實施方式中，該連接子具有5-20個胺基酸長度。
在某些實施方式中，該連接子具有15個胺基酸長度。
在某些實施方式中，該連接子包含如SEQ ID NO：27-29中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該連接子包含如SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，人GLP-1多肽變體具有人GLP-1的至少部分活性。
在某些實施方式中，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列包含選自下組的胺基酸位置處的至少2個突變：W31、K26和Y19。
在某些實施方式中，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列包含W31和K26胺基酸位置處的突變。
在某些實施方式中，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列包含W31和Y19胺基酸位置處的突變。
在某些實施方式中，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列包含K26和Y19胺基酸位置處的突變。
在某些實施方式中，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列包含W31、K26和Y19胺基酸位置處的突變。
在某些實施方式中，該人GLP-1多肽變體在該W31處包含胺基酸取代，該胺基酸取代為W31Y、W31R、W31K或W31A。
在某些實施方式中，該人GLP-1多肽變體在該W31處包含胺基酸取代，該胺基酸取代為W31Y。
在某些實施方式中，該人GLP-1多肽變體在該Y19處包含胺基酸取代，該胺基酸取代為選自下組的任意一種胺基酸取代：Y19A、Y19L、Y19T、Y19F、Y19I、Y19V和Y19S。
在某些實施方式中，該人GLP-1多肽變體在該Y19處包含胺基酸取代，該胺基酸取代為選自下組的任意一種胺基酸取代：Y19A。
在某些實施方式中，該人GLP-1多肽變體在該K26處包含胺基酸取代，該胺基酸取代為K26R。
在某些實施方式中，該人GLP-1多肽變體包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該人GLP-1多肽變體包含SEQ ID NO：4-25中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列包含的胺基酸突變為W31Y、K26R和Y19A。
在某些實施方式中，該人GLP-1多肽變體包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列包含的胺基酸突變為W31Y和K26R。
在某些實施方式中，該人GLP-1多肽變體包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該融合蛋白包含該人GLP-1多肽變體和該免疫球蛋白Fc區。在某些實施方式中，該人GLP-1多肽變體包含SEQ ID NO：4或25所示的胺基酸序列，在某些實施方式中，該免疫球蛋白的Fc區為源自IgG4的Fc區。在某些實施方式中，該Fc區包含EU編碼的M252Y、S254T和T256E的胺基酸突變。在某些實施方式中，該Fc區包含如SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該融合蛋白包含該人GLP-1多肽變體和該鉸鏈區。在某些實施方式中，該人GLP-1多肽變體包含SEQ ID NO：4或25所示
的胺基酸序列。在某些實施方式中，該鉸鏈區源自IgG1。在某些實施方式中，該鉸鏈區包含如SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該融合蛋白包含該人GLP-1多肽變體、該免疫球蛋白Fc區和該鉸鏈區。在某些實施方式中，該人GLP-1多肽變體包含SEQ ID NO：4或25所示的胺基酸序列。在某些實施方式中，該免疫球蛋白Fc區為源自IgG4的Fc區。在某些實施方式中，該鉸鏈區源自IgG1。在某些實施方式中，該Fc區包含EU編碼的M252Y、S254T和T256E的胺基酸突變。在某些實施方式中，該Fc區包含如SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列。在某些實施方式中，該鉸鏈區包含如SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該融合蛋白自N端至C端，依次包含該人GLP-1多肽變體，該連接子，該鉸鏈區以及該免疫球蛋白Fc區。
在某些實施方式中，該融合蛋白包含如SEQ ID NO：37-45中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該融合蛋白包含如SEQ ID NO：43-44中任一項所示的胺基酸序列。
另一方面，本揭露提供了分離的核酸分子，該核酸分子編碼該融合蛋白。
另一方面，本揭露提供了載體，該載體包含該分離的核酸分子。
另一方面，本揭露提供了細胞，其包含或表達該融合蛋白、該分離的核酸分子或該載體。
另一方面，本揭露提供了醫藥組成物，該組成物包含該融合蛋白、該分離的核酸分子、該載體和/或該細胞，以及視需要地藥學上可接受的載劑。
另一方面，本揭露提供了免疫偶聯物，該免疫偶聯物包含該融合蛋白。
另一方面，本揭露提供了該融合蛋白、該分離的核酸分子、該載體、該細胞、該醫藥組成物和/或該免疫偶聯物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防和/或治療代謝性疾病或病症。
在某些實施方式中，該代謝性疾病或病症包括GLP-1相關代謝性病症。
在某些實施方式中，該代謝性疾病或病症包括糖尿病。
另一方面，本揭露提供了預防和/或治療代謝性疾病或病症的方法，該方法包括向有需要的受試者施用該融合蛋白、該分離的核酸分子、該載體、該細胞、該醫藥組成物和/或該免疫偶聯物。
在某些實施方式中，該代謝性疾病或病症包括GLP-1相關代謝性病症。
在某些實施方式中，該代謝性疾病或病症包括糖尿病。
另一方面，本揭露提供了該融合蛋白、該分離的核酸分子、該載體、該細胞、該醫藥組成物和/或該免疫偶聯物，其用於預防和/或治療代謝性疾病或病症。
在某些實施方式中，該代謝性疾病或病症包括GLP-1相關代謝性病症。
在某些實施方式中，該代謝性疾病或病症包括糖尿病。
另一方面，本揭露提供了增加或促進有需要的受試者中胰島素表達的方法，該方法包括向該受試者施用有效量的該融合蛋白、該分離的核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物。
所屬技術領域具有通常知識者能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本揭露的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本揭露的示例性實施方式。如所屬技術領域具有通常知識者將認識到的，本揭露的內容使得所屬技術領域具有通常知識者能夠對所揭露的具體實施方式進行改動而不脫離本揭露所涉及發明的精神和範圍。相應地，本揭露的圖式和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。
本揭露所涉及的發明的具體特徵如所附請求項書所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和圖式能夠更好地理解本揭露所涉及發明的特點和優勢。對圖式簡要說明如下：
圖1顯示的是不同連接子的本揭露所述融合蛋白GM-RY-L1H2-Fc4、GM-RY-L2H2-Fc4和GM-RY-L3H2-Fc4的藥物代謝動力學檢測結果。
圖2顯示的是不同鉸鏈區的本揭露所述融合蛋白GM-ARY-L2H2-Fc4和GM-ARY-L2H1-Fc4的藥物代謝動力學檢測結果。
圖3顯示的是Fc區包含YTE突變的本揭露所述融合蛋白GM-RY-L2H1-Fc4m的藥物代謝動力學檢測結果。
圖4顯示的是Fc區包含YTE突變的本揭露所述融合蛋白GM-ARY-L2H1-Fc4m和GM-RY-L2H1-Fc4m的藥物代謝動力學檢測結果。
圖5顯示的是不同鉸鏈區且包含YTE突變的本揭露所述融合蛋白GM-ARY-L2H2-Fc4m、GM-RY-L2H2-Fc4m、GM-ARY-L2H1-Fc4m和GM-RY-L2H1-Fc4m的藥物代謝動力學檢測結果。
圖6顯示的是本揭露融合蛋白中任GLP-1多肽變體的胺基酸序列的編號示例。
圖7顯示的是本揭露的融合蛋白具備與度拉糖肽同等水平的GLP-1受體活化能力的檢測結果。
圖8A顯示的是K26R-W31Y、K26R-Q23T、K26R-Q23S、K26R-Q23N、K26R-Y19L、K26R-Y19T和K26R-Y19F雙突變的融合蛋白與GLP-1受體的結合活性。
圖8B顯示的是K26R-W31Y、K26R-Q23E、K26R-Y19I、K26R-Y19V、K26R-Y19A和K26R-Y19S雙突變的融合蛋白與GLP-1受體的結合活性。
圖8C顯示的是K26R-W31Y、K26R-Q23N、K26R-Q23S和K26R-Q23T雙突變的融合蛋白與GLP-1受體的結合活性。
圖8D顯示的是W31Y和Y19處胺基酸突變的雙突變的融合蛋白與GLP-1受體的結合活性。
圖8E顯示的是W31Y-Y19A和W31Y-Q23E的胺基酸雙突變的融合蛋白與GLP-1受體的結合活性。
圖8F顯示的是GM-WY和GM-WYFL與GLP-1受體的結合活性。
圖9A顯示的是K26R-W31Y雙突變和K26R-W31Y-Q23處胺基酸突變的三突變的融合蛋白均能夠激活GLP-1受體。
圖9B和圖9C顯示的是K26R-W31Y-Y19處胺基酸突變的三突變的融合蛋白均能夠激活GLP-1受體。
圖9D和圖9F顯示的是K26R-W31Y-Q23處胺基酸突變的三突變的融合蛋白和K26R-W31Y-Y19處胺基酸突變的三突變的融合蛋白均能夠激活GLP-1受體。
圖9E顯示的是K26R-W31Y-Q23處胺基酸突變的三突變的融合蛋白能夠激活GLP-1受體。
圖10A顯示的是本揭露的融合蛋白GM-KRWY的藥物代謝動力學效果。
圖10B顯示的是本揭露的融合蛋白GM-KRWYYL、GM-KRWYYA和GM-KRWYYI的藥物代謝動力學效果。
圖10C顯示的是本揭露的融合蛋白GM-KRWYQN、GM-KRWYQE和GM-KRWYYA的藥物代謝動力學效果。
圖11A-11B顯示的是本揭露的融合蛋白GM-KRWY在口服糖耐量試驗中的降血糖活性。
圖11C-11D顯示的是本揭露的融合蛋白GM-KRWYYA和GM-KRWYQE在口服糖耐量試驗中的降血糖活性。
以下由特定的具體實施例說明本揭露發明的實施方式，所屬技術領域具有通常知識者可由本說明書所揭露的內容容易地瞭解本揭露發明的其他優點及效果。
術語定義
在本揭露中，術語“GLP-1”通常是指胰高血糖素樣肽-1(glucagon like peptide 1)。天然GLP-1分子在體內經過加工，切割了前6個胺基酸，因此本領域習慣將GLP-1的胺基酸序列的N端第一個胺基酸定為第7位，C端最後一個胺基酸定為第37位。經過加工的肽可以在體內得到進一步修飾，去除C端的甘胺酸殘基並以醯胺基替代。GLP-1通常有兩種生物活性形式，分別為GLP-1(7-37)OH和GLP-1(7-36)NH2。本揭露所述的“GLP-1”包含天然的、人工合成的或經修飾的GLP-1蛋白，還包含完整的GLP-1蛋白或其功能性片段，以及不同生物活性形式的GLP-1蛋白。例如，野生型的人GLP-1可包含如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，其N末端的胺基酸殘基H記為第7位。因此，本揭露的術語“K26”通常是指從GLP-1蛋白N端第7位的H起算，第26位胺基酸的位置，在SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列中，第26位的胺基酸為K；術語“W31”通常是指從GLP-1蛋白N端第7位的H起算，第31位胺基酸的位置，在SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列中，第31位的胺基酸為W。在本揭露中，在描述胺基酸突變和/或取代時，對於GLP-1多肽變體的胺基酸殘基的編號描述區別於Fc區的胺基酸殘基的編號描述，Fc區的胺基酸殘基編號根據EU編碼。
該人GLP-1可以被改造，改造後的GLP-1的變體可以具有改造前的人GLP-1的至少部分活性。例如，示例性的野生型人GLP-1改造後的胺基酸序列可以如SEQ ID NO：2所示。
在本揭露中，術語“人GLP-1的至少部分活性”通常是指具有人GLP-1蛋白的一種或多種活性，或具有人GLP-1蛋白的至少20%(例如，至少25%、30%、35%、40%、45%、或50%或更高)的活性。該“人GLP-1的至少部
分活性”的人GLP-1可以是野生型的，如，SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。該“人GLP-1的至少部分活性”中的人GLP-1可以是野生型人GLP-1改造後的GLP-1變體，如，SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。例如，本揭露的人GLP-1多肽變體可以具有胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示的人GLP-1的至少部分活性。在另一些情形中，本揭露的人GLP-1多肽變體可以具有胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示的人GLP-1的至少部分活性。
該活性不要求與人GLP-1蛋白具有相同水平的活性，可以是高於、相近或低於人GLP-1蛋白的活性。在某些情形中，“人GLP-1的至少部分活性”可以指選自下組中的一種或多種：與GLP-1受體結合的活性、活化GLP-1受體的活性、活化腺苷酸環化酶、促進細胞內環磷酸腺苷(cAMP)水平升高的活性、正性調節細胞內Ca2+水平的活性、刺激胰島素分泌的活性、增加肝糖原儲存量的活性、延緩胃排空的活性、抑制胃動力的活性、降低食欲的活性、抑制β細胞雕亡的活性、抑制餐後胰高血糖素的分泌的活性、緩解低血糖的活性和减輕體重的活性。例如，其可以藉由檢測與GLP-1受體結合的能力、cAMP的表達水平來檢測。例如，其可以藉由螢光素酶法檢測對cAMP/PKA訊號通路的活化水平來檢測。該“人GLP-1的至少部分活性”可以是包含人GLP-1的融合蛋白(例如，與Fc區的融合蛋白)的至少部分活性。
在本揭露中，術語“多肽”通常是指由藉由醯胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接的單體(胺基酸)構成的分子。術語“多肽”可以是具有兩個或更多個胺基酸的任意鏈，並且不指特定長度的産物。本揭露該多肽包括肽、二肽、三肽、寡肽、蛋白質、胺基酸鏈或任何其它用於指具有兩個或更多個胺基酸的鏈，而且術語“多肽”可以代替這些術語中任一個或與其交換使用。術語“多肽”還可以指多
肽的表達後修飾的産物，包括但不限於糖基化、乙醯化、磷酸化、醯化、藉由已知的保護性/封閉性基團衍生化、蛋白水解分裂、或藉由非天然存在的胺基酸修飾。多肽可以自天然的生物學來源衍生或藉由重組技術生成。
在本揭露中，術語“變體”通常是指與天然生物活性蛋白質具有序列同源性的蛋白質分子。本揭露所述的多肽變體包括藉由添加(包含插入)、缺失、修飾和/或取代一個或多個胺基酸殘基而具有改變的胺基酸序列的多肽，其同時保留親本序列(例如，SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列)的至少一種治療和/或生物活性而與親本序列不同。例如，變體可與親本蛋白具有至少0%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。變體可以天然存在或者是非天然存在的。可以使用本領域已知的技術來生成非天然存在的變體。本揭露的多肽變體可以包含保守的或非保守的胺基酸替代、删除或添加。
在本揭露中，術語“突變”通常包括對序列(核酸或胺基酸序列)的任何類型的改變或修飾，包括胺基酸或核苷酸的缺失、截短、失活、破壞、取代或易位。在本揭露中，胺基酸突變可以是胺基酸取代，術語“取代”通常是指用不同的“替換”胺基酸殘基來替換預先確定的親本胺基酸序列中的至少一個胺基酸殘基。該一個或多個被替換的胺基酸殘基可以是“天然存在的胺基酸殘基”(即由遺傳密碼編碼)。
術語““胺基酸取代”是指用另一個胺基酸殘基替代存在於親本序列中的一個胺基酸殘基。親本序列中的胺基酸可以是例如經由化學肽合成或藉由本領域已知的重組方法來取代。
在本揭露中，術語“Fc區”通常是指源自免疫球蛋白重鏈C端區域的結構域，該C端區域可以藉由木瓜蛋白酶消化完整的抗體而産生。Fc區可以是天然序列Fc區或變體Fc區，其中，“未經該胺基酸突變的免疫球蛋白Fc區”是指SEQ ID NO：32-35中任一項所示的胺基酸序列，其分別對應人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc序列。本揭露所述免疫球蛋白的Fc區通常包含2個恆定域(CH2結構域和CH3結構域)，如無特別說明，不包含鉸鏈區，且視需要地可以包含CH4結構域。
在本揭露中，術語“YTE突變”是指IgG的Fc區中的一組突變。YTE突變可以導致Fc區與人類FcRn的結合增加，且可能改變包含該YTE突變的Fc區的融合蛋白的血清半衰期。包含YTE突變的Fc區包括下述三種胺基酸突變的組合：M252Y、S254T和T256E，其中根據在Kabat中的EU索引進行編號。
在本揭露中，術語“鉸鏈區”通常是指一種長度在15-30個胺基酸之間的柔性胺基酸序列，其允許其N端或C端的多肽部分獨立地移動。鉸鏈區通常來自免疫球蛋白重鏈CH1和CH2功能區之間的區域。鉸鏈區通常來源於IgG，例如，可來源於IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。相對於天然的源自IgG的鉸鏈區，本揭露的鉸鏈區的N端或C端可以增加一個或多個胺基酸殘基，也可以删减一個或多個胺基酸殘基，還可以替換一個或多個胺基酸殘基，只要仍保持鉸鏈區的功能即可。
在本揭露中，術語“免疫球蛋白”通常是指基本上由免疫球蛋白基因編碼的一個或多個多肽組成的蛋白質。公認的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恆定區基因，以及衆多
的免疫球蛋白可變區基因。一般來說，免疫球蛋白可以是約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，其由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成。全長免疫球蛋白“輕鏈”(約25KD和214個胺基酸)的NH2-末端(約110個胺基酸)由可變區基因編碼，COOH-末端由κ或λ恆定區基因編碼。天然的免疫球蛋白基本上由經由免疫球蛋白鉸鏈區連接的兩個Fab分子和Fc區組成。
在本揭露中，術語“連接子”通常是指連接兩個異源性多肽或其片段的胺基酸序列。在本揭露中，連接子可以是共價連接多肽以形成融合多肽的胺基酸序列。連接子的長度可以具有10-20個胺基酸長度。連接子可以是柔性的或剛性的。
在本揭露中，該“選擇性增强”通常是指在特定條件下增强，該特定條件可以是特定的pH範圍、特定的溫度範圍、特定的連接方式、特定的樣品來源或特定的反應時間等。例如，Fc區的胺基酸突變使得Fc區在特定pH範圍內與Fc受體的結合能力增强，但不顯著改變Fc區在該特定範圍內以外與Fc受體的結合能力，可以稱為“選擇性增强”。
在本揭露中，術語“融合蛋白”通常是指包含或者由下述這樣的多肽組成的更長的多肽，該多肽的胺基酸序列可以直接或間接地(藉由連接子，例如，連接肽)融合至一異源多肽(例如，前一多肽或其結構域無關的多肽)的胺基酸序列。
在本揭露中，術語“免疫偶聯物”通常是指多肽或蛋白質和感興趣的活性物質(例如，蛋白質、核酸、藥物或標記分子等)直接或間接連接(例如，藉由連接子共價連接)而形成的偶聯物。
在本揭露中，術語“核酸分子”通常是指從其天然環境中分離的或人工合成的任何長度的分離形式的核苷酸、脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。
在本揭露中，術語“載體”通常是指能夠在合適的宿主細胞中自我複製的核酸分子，其將插入的核酸分子轉移到宿主細胞中和/或宿主細胞之間。該載體可包括主要用於將DNA或RNA插入細胞中的載體、主要用於複製DNA或RNA的載體，以及主要用於DNA或RNA的轉錄和/或轉譯的表達的載體。該載體還可以包括具有多種上述功能的載體。該載體可以是當引入合適的宿主細胞時能夠轉錄並轉譯成多肽的多核苷酸。通常，藉由培養包含該載體的合適的宿主細胞，該載體可以産生期望的表達産物。
在本揭露中，術語“細胞”通常是指可以或已經含有包括本揭露所述的核酸分子的質粒或載體，或者能夠表達本揭露所述的抗體或其抗原結合片段的個體細胞，細胞系或細胞培養物。該宿主細胞可以包括單個宿主細胞的子代。由於天然的，意外的或故意的突變，子代細胞與原始親本細胞在形態上或在基因組上可能不一定完全相同，但能夠表達本揭露所述的抗體或其抗原結合片段即可。該宿主細胞可以藉由使用本揭露所述的載體體外轉染細胞而得到。該宿主細胞可以是原核細胞(例如大腸杆菌)，也可以是真核細胞(例如酵母細胞，例如COS細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，HeLa細胞，HEK293細胞，COS-1細胞，NS0細胞或骨髓瘤細胞)。該重組宿主細胞不僅包括某種特定的細胞，還包括這些細胞的後代。
在本揭露中，術語“代謝性疾病或病症”通常是指破壞體內正常代謝過程，使得機體無法正常利用和/或貯存能量的疾病或病症。該代謝性疾病或
病症可以是指糖類代謝障礙的疾病、脂肪類代謝障礙的疾病和/或細胞線粒體障礙的疾病。該代謝性疾病或病症可以是與飲食、毒素或感染相關的，也可以是遺傳性疾病。該代謝性疾病或病症可以包括由缺少代謝相關的酶、或代謝相關的酶功能異常引起的疾病或病症。本揭露所述代謝性疾病或病症可以選自糖尿病和其他GLP-1相關代謝性病症。
在申請中，“度拉糖肽(dulaglutide)”通常是指一種包含GLP-1類似物的異源融合蛋白質，由GLP-1類似物(胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示)與源自人IgG4的Fc區藉由小分子肽共價連接形成。度拉糖肽也可稱為杜拉魯肽或度拉魯肽，商品名為TRULICITY®，或度易達®。度拉糖肽包含如SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列(參見PCT專利WO2009009562和美國專利US7452966)。
在本揭露中，術語“包含”通常是指包括明確指定的特徵，但不排除其他要素。
在本揭露中，術語“約”通常是指在指定數值以上或以下0.5%-10%的範圍內變動，例如在指定數值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的範圍內變動。
發明詳述
GLP-1多肽變體
一方面，本揭露提供了一種融合蛋白，該融合蛋白包含人GLP-1多肽變體，其具有人GLP-1的至少部分活性。在某些情形中，人GLP-1多肽變體可以具有選自下組中的一種或多種活性：與GLP-1受體結合的活性、激活GLP-
1受體的活性、激活腺苷酸環化酶、促進細胞內環磷酸腺苷(cAMP)水平升高的活性、正性調節細胞內Ca2+水平的活性、刺激胰島素分泌的活性、增加肝糖原儲存量的活性、延緩胃排空的活性、抑制胃動力的活性、降低食欲的活性、抑制β細胞雕亡的活性、抑制餐後胰高血糖素的分泌的活性、緩解低血糖的活性和减輕體重的活性。例如，其可以藉由檢測與GLP-1受體結合的能力、cAMP的表達水平來檢測。該人GLP-1多肽變體的活性可以為人GLP-1活性的至少20%(例如，至少25%、30%、35%、40%、45%、或50%或更高)。
與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比：HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGG(SEQ ID NO：2)，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列可包含至少2個胺基酸突變，例如，可包含2個、3個或更多個胺基酸突變。例如，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列可包含2-4個(例如，2-3個、3個或2個)胺基酸取代。該至少2個胺基酸突變可以位於選自下組的胺基酸位置處：K26、W31和Y19。
在本揭露中，該胺基酸位置“Xn”是指在相應於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列中第n位的殘基X處發生胺基酸取代，其中n為正整數(對於GLP-1，n從7開始起算)，X為任意胺基酸殘基的縮寫。例如，胺基酸位置“W31”表示相應於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列的第31位胺基酸的位置。對於SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，胺基酸殘基X和位置n的對應關係如圖6所示。
在本揭露中，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列可包含選自下組的胺基酸位置處的至少2個突變：W31、K26和Y19。
例如，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列可包含W31和K26胺基酸位置處的2個胺基酸突變。例如，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列有2個胺基酸突變，可以位於W31和K26胺基酸位置處。例如，該人GLP-1多肽變體可包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列。
例如，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列可包含W31和Y19胺基酸位置處的2個胺基酸突變。例如，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列有2個胺基酸突變，可以位於W31和Y19胺基酸位置處。例如，該人GLP-1多肽變體可包含SEQ ID NO：12-18中任一項所示的胺基酸序列。
例如，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列可包含K26和Y19胺基酸位置處的2個胺基酸突變。例如，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列有2個胺基酸突變，可以位於K26和Y19胺基酸位置處。例如，該人GLP-1多肽變體可包含SEQ ID NO：5-11中任一項所示的胺基酸序列。
例如，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列可包含W31、K26和Y19胺基酸位置處的3個胺基酸突變。例如，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列有3個胺基酸突變，可以位於W31、K26和Y19胺基酸位置處。例如，該人GLP-1多肽變體可包含SEQ ID NO：19-25中任一項所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該胺基酸突變可以包含胺基酸取代。該胺基酸突變使該GLP-1多肽變體仍具有人GLP-1(例如，胺基酸序列如SEQ ID NO：1或2
中任一項所示的人GLP-1蛋白)的至少部分活性。該胺基酸突變可以使該GLP-1多肽變體的融合蛋白仍具有人GLP-1(例如，胺基酸序列如SEQ ID NO：1或2中任一項所示的人GLP-1蛋白)的融合蛋白的至少部分活性。該胺基酸突變可以使該GLP-1多肽變體與Fc區的融合蛋白仍具有人GLP-1(例如，胺基酸序列如SEQ ID NO：1或2中任一項所示的人GLP-1蛋白)與Fc區的融合蛋白的至少部分活性。
在本揭露中，該K26處可以包含胺基酸取代，該胺基酸取代可以為K26R。
在本揭露中，該W31處可以包含胺基酸取代，該胺基酸取代可以為W31Y、W31A、W31R或W31K。在本揭露中，該W31處可以包含胺基酸取代，該胺基酸取代可以為W31Y、W31K或W31R。例如，該W31處可以包含胺基酸取代，該胺基酸取代可以為W31Y。
在本揭露中，該Y19處可以包含胺基酸取代，該胺基酸取代可以為Y19A、Y19L、Y19T、Y19F、Y19I、Y19V或Y19S。例如，該Y19處可以包含胺基酸取代，該胺基酸取代可以為Y19A。
在本揭露中，胺基酸取代“XnY”是指相應於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列中第n位的殘基X被取代為胺基酸殘基Y，其中n為正整數(對於GLP-1，n從7開始起算)，X和Y分別獨立地為任意胺基酸殘基的縮寫，且X不同於Y。例如，胺基酸取代“W31Y”是指相應於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列中第31位的胺基酸殘基W被取代為胺基酸殘基Y。
在本揭露中，與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列可包含至少2個胺基酸取代，該胺基酸取代可以選自下組：1)K26R，2)選自W31Y、W31R、W31K和W31A中的任意一個，和3)選自Y19A、Y19L、Y19T、Y19F、Y19I、Y19V和Y19S中的任意一個。
例如，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列可包含選自下組的至少2個胺基酸突變：1)K26R，2)選自W31Y、W31R和W31K和W31A中的任意一個，和3)選自Y19A、Y19L、Y19T、Y19F、Y19I、Y19V和Y19S中的任意一個。
在本揭露中，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列可包含W31和K26胺基酸位置處的2個胺基酸取代，該K26處的胺基酸取代可以為K26R，且該W31處的胺基酸取代可以為W31Y、W31R和W31K和W31A。例如，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列可包含W31Y和K26R的胺基酸取代。
在本揭露中，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列可包含胺基酸取代W31Y。
在本揭露中，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列可包含胺基酸取代K26R。
在本揭露中，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列可包含胺基酸取代Y19A。
在本揭露中，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列可包含胺基酸取代W31Y和Y19A。
在本揭露中，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列可包含胺基酸取代W31Y和K26R。例如，該人GLP-1多肽變體可包含SEQ ID NO：4和19-25中任一項所示的胺基酸序列。
例如，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列的胺基酸取代可以為W31Y和K26R，例如，該人GLP-1多肽變體可包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列。
在本揭露中，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列可包含胺基酸取代K26R，胺基酸取代W31Y和Y19處的胺基酸取代。例如，該GLP-1多肽變體可包含SEQ ID NO：19-25中任一項所示的胺基酸序列。
在本揭露中，與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列可包含胺基酸取代K26R，胺基酸取代W31Y和胺基酸取代Y19A。例如，該人GLP-1多肽變體可包括SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。
本揭露中，該人GLP-1多肽變體可以包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列：HGEGTFTSDVSSX19LEEQAAREFIAX31LVKGGG；其中，X19=Y、A、L、T、F、I、V或S；X31=W、A、R、K或Y。
申請號PCT/CN2021/141606和PCT/CN2021/141608的PCT國際專利申請分別涉及人GLP-1多肽變體及其融合蛋白，在此將其作為整體併人本文作為參考。
Fc區
在本揭露中，該融合蛋白包含免疫球蛋白Fc區。在本揭露中，免疫球蛋白Fc區可以源自IgG，例如，源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。該IgG1的Fc區可包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列。該IgG2的Fc區可包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。該IgG3的Fc區可包含SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。該IgG4的Fc區可包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該Fc區可以包含胺基酸突變，與未經該胺基酸突變的免疫球蛋白Fc區(例如，SEQ ID NO：32-35中任一項所示的胺基酸序列)相比，該胺基酸突變可以使得該免疫球蛋白Fc區與Fc受體的結合親和力選擇性增强。
在本揭露中，該Fc區可以是源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區，且在M252、S254和/或T256位置處包含一種或多種胺基酸突變(例如，該胺基酸位置根據Kabat的EU編碼)。例如，該Fc區可以是源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區，且在M252、S254和T256位置處包含胺基酸突變(例如，該胺基酸位置根據Kabat的EU編碼)。
例如，該M252處的胺基酸突變可以為M252Y。例如，該S254T處的胺基酸突變可以為S254T。例如，該T256處的胺基酸突變可以為T256E。
在本揭露中，該Fc區可以是源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區，且可包含M252Y、S254T和T256E的胺基酸突變。
例如，該Fc區可以是源自IgG1的Fc區，且可包含M252Y、S254T和T256E的胺基酸突變。例如，該Fc區可以是源自IgG2的Fc區，且可包含M252Y、S254T和T256E的胺基酸突變。例如，該Fc區可以是源自IgG3的Fc
區，且可包含M252Y、S254T和T256E的胺基酸突變。例如，該Fc區可以是源自IgG4的Fc區，且可包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列。
鉸鏈區
在本揭露中，該融合蛋白可包含鉸鏈區。在本揭露中，該鉸鏈區可以源自IgG。
在本揭露中，該鉸鏈區可以源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在本揭露中，該鉸鏈區可以源自IgG1。在本揭露中，該鉸鏈區可以源自IgG4。
在本揭露中，與天然存在的IgG1鉸鏈區相比，該融合蛋白中的鉸鏈區可以包含一個或多個胺基酸突變，以去除鏈間二硫鍵。這樣的胺基酸突變是本領域已知的技術。
在本揭露中，與天然存在的IgG鉸鏈區相比，該融合蛋白中的鉸鏈區可以在N端增加一個或多個胺基酸。在本揭露中，與天然存在的IgG鉸鏈區相比，該融合蛋白中的鉸鏈區可以在C端增加一個或多個胺基酸。在本揭露中，與天然存在的IgG鉸鏈區相比，該融合蛋白中的鉸鏈區可以在N端减少一個或多個胺基酸。在本揭露中，與天然存在的IgG鉸鏈區相比，該融合蛋白中的鉸鏈區可以在C端减少一個或多個胺基酸。
在本揭露中，與天然存在的IgG4鉸鏈區相比，該融合蛋白中的鉸鏈區可以在N端增加一個或多個胺基酸，例如，增加Ala。在本揭露中，與天然存在的IgG4鉸鏈區相比，該融合蛋白中的鉸鏈區可以包含一個或多個胺基酸突變，以避免不期望的蛋白形成。這樣的胺基酸突變是本領域已知的技術。
在本揭露中，該鉸鏈區可以包含如SEQ ID NO：30或31所示的胺基酸序列。
連接子
在本揭露中，該融合蛋白可包含連接子。該連接子連接該人GLP-1多肽變體和該免疫球蛋白Fc區。在本揭露中，該連接子可以是肽連接子。在本揭露中，該肽連接子可以是剛性的或柔性的。示例性的連接子可包括但不限於SEQ ID NO：27-29或47-70中任一項所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該連接子可以具有12-15個胺基酸長度。在本揭露中，該連接子可以具有15個胺基酸長度，對於上述列舉的不足15個胺基酸長度的連接子，可以藉由添加胺基酸使得其長度達到15個胺基酸，例如，添加Gly。
例如，本揭露所述的連接子可包含SEQ ID NO：27-29中任一項所示的胺基酸序列。
融合蛋白
在本揭露中，該融合蛋白可包含該人GLP多肽變體、該連接子、該鉸鏈區和該免疫球蛋白Fc區。
在本揭露中，該融合蛋白中的該人GLP多肽變體可以包含SEQ ID NO：4或25所示的胺基酸序列，該免疫球蛋白Fc區可以是源自IgG的Fc區。例如，該免疫球蛋白Fc區可以是包含M252Y、S254T和T256E的胺基酸突變的IgG的Fc區。
在本揭露中，該融合蛋白中的該人GLP多肽變體可以包含SEQ ID NO：4或25所示的胺基酸序列，該鉸鏈區可以源自IgG1或IgG4的鉸鏈區，該免疫球蛋白Fc區可以是源自IgG的Fc區。例如，該免疫球蛋白Fc區可以是包含M252Y、S254T和T256E的胺基酸突變的IgG的Fc區。
在本揭露中，該融合蛋白中的該人GLP多肽變體可以包含SEQ ID NO：4或25所示的胺基酸序列，該連接子可以包含SEQ ID NO：27-29中任一項所示的胺基酸序列，該鉸鏈區可以源自IgG1或IgG4的鉸鏈區，該免疫球蛋白Fc區可以是源自IgG的Fc區。例如，該免疫球蛋白Fc區可以是包含M252Y、S254T和T256E的胺基酸突變的IgG的Fc區。
在本揭露中，自N端至C端，該融合蛋白可依次包含該人GLP多肽變體、該連接子、該鉸鏈區和該免疫球蛋白Fc區。
在本揭露中，該融合蛋白中的該人GLP多肽變體可以包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，該連接子可以包含SEQ ID NO：27-29中任一項所示的胺基酸序列，該鉸鏈區可以源自IgG1或IgG4的鉸鏈區，該免疫球蛋白Fc區可以是源自IgG4的Fc區。例如，該融合蛋白可包含SEQ ID NO：37-39中任一項所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該融合蛋白中的該人GLP多肽變體可以包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，該連接子可以包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列，該鉸鏈區可以源自IgG1或IgG4的鉸鏈區，該免疫球蛋白Fc區可以是源自IgG4的Fc區，且可選地包含M252Y、S254T和T256E的胺基酸突變。例如，該融合蛋白可包含SEQ ID NO：40-42和44中任一項所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該融合蛋白中的該人GLP多肽變體可以包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，該連接子可以包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列，該鉸鏈區可以源自IgG1或IgG4的鉸鏈區，該免疫球蛋白Fc區可以是源自IgG4的Fc區，且包含M252Y、S254T和T256E的胺基酸突變。例如，該融合蛋白可包含SEQ ID NO：43和45中任一項所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該融合蛋白中的該人GLP多肽變體可以包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，該連接子可以包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列，該鉸鏈區可以源自IgG1的鉸鏈區，該免疫球蛋白Fc區可以是源自IgG4的Fc區，且包含M252Y、S254T和T256E的胺基酸突變。例如，該融合蛋白可包含SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列。
在本揭露中，該融合蛋白中的該人GLP多肽變體可以包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，該連接子可以包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列，該鉸鏈區可以源自IgG1的鉸鏈區，該免疫球蛋白Fc區可以是源自IgG4的Fc區，且包含M252Y、S254T和T256E的胺基酸突變。例如，該融合蛋白可包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列。
核酸分子、載體、細胞和製備方法
在另一個方面，本揭露還提供了分離的一種或多種核酸分子，該一種或多種核酸分子可編碼本揭露該融合蛋白。例如，該一種或多種核酸分子中的每一個核酸分子可以編碼完整的融合蛋白，也可以編碼其中的一部分。
本揭露所述的核酸分子可以為分離的。例如，其可以是藉由以下方法産生或合成的：(i)在體外擴增的，例如藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增産生的，(ii)藉由選殖重組産生的，(iii)純化的，例如藉由酶切和凝膠電泳分級分離，或者(iv)合成的，例如藉由化學合成。在某些實施方式中，該分離的核酸是藉由重組DNA技術製備的核酸分子。重組DNA和分子選殖技術包括由Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor,(1989)(Maniatis)和由T.J.Silhavy,M.L.Bennan和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,
Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1984)以及由Ausubel,F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology,pub.by Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)描述的那些技術。簡而言之，可從基因組DNA片段、cDNA和RNA製備該核酸，所有這些核酸可直接從細胞中提取或藉由各種擴增方法(包括但不限於PCR和RT-PCR)重組産生。
在另一個方面，本揭露提供了一種或多種載體，其包含該核酸分子。例如，該載體中可包含一種或多種該核酸分子。此外，該載體中還可包含其他基因，例如允許在適當的宿主細胞中和在適當的條件下選擇該載體的標記基因。此外，該載體還可包含允許編碼區在適當宿主中正確表達的表達控制元件。這樣的控制元件為所屬技術領域具有通常知識者所熟知的，例如，可包括啟動子、核糖體結合位點、增强子和調節基因轉錄或mRNA轉譯的其他控制元件等。本揭露所述的一種或多種核酸分子可以與該表達控制元件可操作地連接。
該載體可以包括，例如質粒、黏粒、病毒、噬菌體或者在例如遺傳工程中通常使用的其他載體。例如，該載體為表達載體。
在另一方面，本揭露提供了一種細胞，該細胞可包含本揭露所述的一種或多種核酸分子和/或本揭露所述的一種或多種載體。在某些實施方式中，每種或每個宿主細胞可包含一個或一種本揭露所述的核酸分子或載體。在某些實施方式中，每種或每個宿主細胞可包含多個(例如，2個或以上)或多種(例如，2種或以上)本揭露所述的核酸分子或載體。例如，可將本揭露所述的載體引入該細胞中，例如原核細胞(例如，細菌細胞)、CHO細胞、NS0細胞、HEK293T細胞或HEK293A細胞，或者其他真核細胞，如來自植物的細胞、真菌或酵母細
胞等。可藉由本領域已知的方法將本揭所述的載體引入該細胞中，例如電穿孔、脂質體轉染等。
在另一個方面，本揭露提供了製備本揭露所述融合蛋白的方法。該方法可包括，在使得該融合蛋白表達的條件下，培養本揭露所述的細胞。例如，可藉由使用適當的培養基、適當的溫度和培養時間等。
在某些情形中，該方法還可包括收穫(例如分離和/或純化)，本揭露所述融合蛋白的步驟。例如，可以採用蛋白G-瓊脂糖或蛋白A-瓊脂糖進行親和層析，還可藉由凝膠電泳和/或高效液相色譜等來純化和分離本揭露所述融合蛋白。
醫藥組成物和用途
另一方面，本揭露提供了一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含該融合蛋白，該核酸分子，該載體，或該細胞，以及視需要地藥學上可接受的佐劑。
例如，該藥學上可接受的佐劑可以包括緩衝劑、抗氧化劑、防腐劑、低分子量多肽、蛋白質、親水聚合物、胺基酸、糖、螯合劑、反離子、金屬複合物和/或非離子表面活性劑等。
在本揭露中，該醫藥組成物可被配製用於口服給藥，靜脉內給藥，肌肉內給藥，在腫瘤部位的原位給藥，吸入，直腸給藥，陰道給藥，經皮給藥或藉由皮下儲存庫給藥。
本揭露所述的醫藥組成物可以用於治療代謝性疾病或病症。例如，該代謝性疾病或病症可以選自糖尿病和其他GLP-1相關代謝性病症。
該醫藥組成物的給藥頻率和劑量可以藉由多個相關因素被確定，該因素包括要被治療的疾病類型，給藥途徑，病人年齡，性別，體重和疾病的嚴
重程度以及作為活性成分的藥物類型。由於該醫藥組成物具有優良的體內功效和濃度的持續時間，它可以顯著地减少該藥物的給藥頻率和劑量。
另一方面，本揭露提供了增加或促進有需要的受試者中胰島素表達的方法，該方法包括向該受試者施用有效量的該融合蛋白、該分離的核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物。
不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本揭露發明的各個技術方案，而不用於限制本揭露發明的範圍。
實施例
實施例1融合蛋白的製備
製備人GLP-1多肽變體和Fc的融合蛋白，從N端至C端依次包含GLP-1多肽變體(胺基酸序列如SEQ ID NO：4-25中任一項所示)、連接肽(胺基酸序列如SEQ ID NO：27-29中任一項所示)、鉸鏈區(胺基酸序列如SEQ ID NO：30-31中任一項所示)和源自IgG的Fc區(胺基酸序列如SEQ ID NO：32-36中任一項所示)。將包含編碼融合蛋白的核酸序列的載體轉入細胞，表達純化得融合蛋白。示例性的融合蛋白全長序列和各部分序列如下表1所示。
表1示例性融合蛋白的結構和胺基酸序列
實施例2使用不同連接子的融合蛋白的藥物代謝動力學檢測
考察本揭露融合蛋白GM-RY-L1H2-Fc4、GM-RY-L2H2-Fc4和GM-RY-L3H2-Fc4的體內藥物代謝動力學。實驗在SPF動物房進行，動物房環境溫度23±2℃，相對濕度40-70%，12小時明暗交替。實驗動物自由飲食，實驗前適應至少3天。體重為180-220g的SPF級SD大鼠隨機分組。皮下注射(SC)各組大鼠相對應供試品，劑量為1mg/kg，度拉糖肽(DULA)作為對照。於給藥前、給藥後6h、24h、48h、72h、96h和120h經頸靜脉採血約100ul。將採集的血液加入離心管中，室溫靜置30-60min。之後4℃，兩小時內4000rpm離心10
分鐘，迅速分離血清。-80℃保存。樣本進行ELISA檢測。使用DAS(3.2.8)軟體計算藥物代謝動力學參數。
結果如圖1和表2顯示，GM-RY-L1H2-Fc4、GM-RY-L2H2-Fc4和GM-RY-L3H2-Fc4的體內代謝性質與對照的度拉糖肽沒有顯著差異，其中使用L2連接子(SEQ ID NO：28)的GM-RY-L2H2-Fc4具有最好的半衰期，暴露量與對照相當。
表2藥物代謝動力學檢測結果
實施例3使用不同鉸鏈區的融合蛋白的藥物代謝動力學檢測
根據實施例2的方法，檢測本揭露融合蛋白GM-ARY-L2H2-Fc4和GM-ARY-L2H1-Fc4的體內藥物代謝動力學。樣本進行ELISA檢測。使用DAS(3.2.8)軟體計算藥物代謝動力學參數。
結果如圖2和表3顯示，GM-ARY-L2H2-Fc4和GM-ARY-L2H1-Fc4的體內半衰期相當，其中使用IgG1的鉸鏈區(SEQ ID NO：30)的GM-ARY-L2H1-Fc4的暴露量較好。
表3藥物代謝動力學檢測結果
實施例4使用Fc區包含YTE突變的融合蛋白的藥物代謝動力學檢測
使用食蟹猴檢測本揭露融合蛋白GM-RY-L2H1-Fc4m和GM-ARY-L2H1-Fc4m的體內藥物代謝動力學。實驗每組2隻食蟹猴，雌雄各半，每組分別單次皮下注射給予對應供試品(1mg/kg)，DULA(IgG4的Fc區未進行YTE突變的度拉糖肽)和DULA-Fc4m(IgG4的Fc區進行YTE突變的度拉糖肽)作為對照。分別於給藥前和給藥後4h、8h、24h、48h、72h、120h、168h、264h、336h、504h、672h、840h和1008h採集血樣。分離血清，ELISA法測定給予受試物後食蟹猴血清中受試物的濃度。使用DAS(3.2.8)軟體計算藥物代謝動力學參數。
結果如圖3、圖4、表4和表5顯示，其中表4的數據來自圖3的曲線，表5的數據來自圖4的曲線。與同樣包含YTE突變的度拉糖肽相比，本揭露的GM-RY-L2H1-Fc4m(圖3和圖4)和GM-ARY-L2H1-Fc4m(圖4)具有更好的體內半衰期和暴露量；而度拉糖肽的Fc區進行YTE突變的效果較弱，與未突變的度拉糖肽相比，Fc區的YTE突變並沒有提升度拉糖肽的體內半衰期和暴露量(圖4)。
結合圖1的數據，未進行Fc區YTE突變的本揭露融合蛋白的半衰期或暴露量與度拉糖肽相當，而Fc區進行YTE突變後的本揭露融合蛋白的
半衰期和暴露量均顯著高於度拉糖肽。這說明Fc區的YTE突變顯著提升了本揭露融合蛋白的藥物代謝動力學性質，且融合蛋白的人GLP-1多肽變體的胺基酸突變和Fc區的YTE突變對藥物代謝動力學性質的提升具有協同效果。
表4藥物代謝動力學檢測結果
表5藥物代謝動力學檢測結果
實施例5使用不同鉸鏈區的Fc區YTE突變的融合蛋白的藥物代謝動力學檢測
根據實施例4的方法，檢測本揭露包含Fc區YTE突變的融合蛋白GM-ARY-L2H2-Fc4m、GM-RY-L2H2-Fc4m、GM-ARY-L2H1-Fc4m和GM-RY-L2H1-Fc4m的體內藥物代謝動力學。樣本進行ELISA檢測。使用DAS(3.2.8)軟體計算藥物代謝動力學參數。
結果如圖5和表6顯示，四種融合蛋白的體內半衰期或暴露量均較好，其中使用IgG1的鉸鏈區(SEQ ID NO：30)的融合蛋白的綜合效果較好。
表6藥物代謝動力學檢測結果
實施例6螢光素酶法檢測本揭露融合蛋白對cAMP/PKA訊號通路的活化作用
利用GLP-1多肽變體的融合蛋白結合GLP-1受體，活化腺苷酸環化酶，促進細胞內環磷酸腺苷(cAMP)水平升高的原理，基於CREB(cAMP反應元件結合蛋白)報告基因檢測本揭露融合蛋白對cAMP/PKA訊號通路的活化作用。利用人GLP-1R質粒和CREB驅使的螢光素酶報告質粒轉染HER293細胞。轉染後，消化收集HER293-GLP1R-CREB-D4細胞，計數，用含有10%FBS的DMEM培養基調整細胞數至4×105細胞/ml，接種至96孔板，每孔50μl。使用含有10%FBS的DMEM培養基將待測樣品從1000ng/ml起被稀釋為9個濃度；度拉糖肽作為陽性對照。上述96孔板每孔再加入50μl一系列濃度的待測樣品，37℃培育數小時。除去上清，每孔加入螢光素酶受質。室溫放置5min後，取出50μl，使用螢光素酶分析系統Bio-GloTM Luciferase Assay System(Promega,G7940)檢測螢光素酶的活性，並且用微盤分析儀(Molecular Devices,SpectraMax M3)進行讀數。螢光强度體現cAMP的水平，從而反應GLP-1受體激活的程度。
結果如圖7所示，本揭露的融合蛋白具備與度拉糖肽相當水平的GLP-1受體激活能力。
實施例7不同突變形式的GLP-1多肽變體的檢測
本揭露的實施例中使用的陽性對照度拉糖肽(Dulaglutide)為本領域已知的糖尿病藥物，代號LY-2189265，度拉糖肽在本揭露中稱為GLP-1-Fc或DULA或KN042。
製備人GLP-1多肽變體的Fc融合蛋白，可以將包含編碼該人GLP-1多肽變體的Fc融合蛋白核酸序列的載體轉入細胞，表達純化得融合蛋白。融合蛋白從N端至C端依次包含GLP-1多肽變體(胺基酸序列如下表所示)、連接肽(G4S)3和源自IgG4的Fc區及鉸鏈區。示例性的人GLP-1多肽變體序列如下表所示。
(1)融合蛋白與GLP-1受體的結合親和力檢測
使用ELISA檢測實施例1中的融合蛋白與GLP-1受體的結合親和力。表達GLP-1受體和小鼠Fc的融合蛋白，稱為GLP1R-muFc(SEQ ID NO：3)，將GLP1R-muFc稀釋至5μg/ml，包被96孔板，室溫固定30min。PBS清洗1次後用1%BSA 37℃封閉30min，0.05%PBST20清洗3次。每孔加入50μl，
10μg/ml，4倍濃度梯度稀釋的待測樣品，KN042為陽性對照。37℃培育1小時，PBST清洗5次。每孔加入50μl用含有1%BSA的0.05%PBST20稀釋2000倍的小鼠單克隆HP6023抗人IgG4Fc-HRP(abcam,ab99817)，37℃培育1小時，PBST清洗5次。每孔加入50μl TMB顯色3min，加入50μl/孔1M H2SO4終止反應，用微盤分析儀(Molecular Devices,SpectraMax M3)進行檢測OD值。KN042作為陽性對照。
結果如圖8所示。包含雙突變的部分融合蛋白表現出與GLP-1受體良好的結合活性。
(2)融合蛋白對cAMP/PKA訊號通路的激活作用的螢光素酶法檢測
參考本揭露實施例6對於融合蛋白對cAMP/PKA訊號通路的激活作用的螢光素酶法檢測的方法，結果如圖9所示。
結果顯示，本揭露要求保護的融合蛋白均能激活GLP-1受體，從而激活cAMP/PKA訊號通路。
(3)融合蛋白的藥物代謝動力學檢測
參考本揭露實施例2對於融合蛋白的藥物代謝動力學檢測的方法，結果如圖10所示。圖10A顯示的是本揭露的融合蛋白GM-KRWY的半衰期比度拉糖肽長，為16.199h，且藥物暴露量高於度拉糖肽，且血藥濃度相近。圖10B顯示的是本揭露的融合蛋白GM-KRWYYL、GM-KRWYYA和GM-KRWYYI的半衰期比度拉糖肽長，為約13h至16.5h，且藥物暴露量和血藥濃度高於度拉糖肽。圖10C顯示的是本揭露的融合蛋白GM-KRWYQN、GM-
KRWYQE和GM-KRWYYA的半衰期比度拉糖肽長，為約22h至25h，且藥物暴露量和血藥濃度高於度拉糖肽。
(4)融合蛋白的口服糖耐量檢測
考察GLP-1-Fc融合蛋白的體內降血糖活性。小鼠禁食過夜，實驗前測量血糖和體重後隨機分組。腹腔注射各組小鼠相對應供試品，度拉糖肽作為對照。給藥後0.5h應用1.5g/kg的葡萄糖口服負荷各小鼠。小鼠於葡萄糖負荷前，負荷後10、20、30、60和120min，使用手持式羅氏血糖儀(Roche，Accu-chek)測量小鼠尾尖血糖值。切除小鼠尾尖約1mm，從尾根部向尾尖擠壓靜脉採血測量血糖值。結果如圖11所示。
結果顯示，與對照相比，本揭露的融合蛋白GM-KRWY、GM-KRWYYA和GM-KRWYQE能夠具有同等水平的體內降血糖活性。
前述詳細說明是以解釋和舉例的方式提供的，並非要限制所附請求項的範圍。目前本揭露所列舉的實施方式的多種變化對所屬技術領域具有通常知識者來說是顯而易見的，且保留在所附的請求項和其等同方式的範圍內。
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Claims (60)
- 一種融合蛋白，其包含人GLP-1多肽變體和免疫球蛋白Fc區；其中與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列包含至少2個胺基酸突變，該至少2個胺基酸突變位於選自下組的胺基酸位置處：W31、K26和Y19。
- 如請求項1所述的融合蛋白，其中該免疫球蛋白Fc區位於該人GLP-1多肽變體的C端。
- 如請求項1或2所述的融合蛋白，其中該免疫球蛋白Fc區為源自IgG的Fc區。
- 如請求項1至3中任一項所述的融合蛋白，其中該免疫球蛋白Fc區為源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區。
- 如請求項1至4中任一項所述的融合蛋白，其中該免疫球蛋白Fc區為源自IgG4的Fc區。
- 如請求項1至5中任一項所述的融合蛋白，其中該免疫球蛋白Fc區包含如SEQ ID NO：32-35中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至6中任一項所述的融合蛋白，其中該免疫球蛋白Fc區包含胺基酸突變，與未經該胺基酸突變的免疫球蛋白Fc區相比，該胺基酸突變使得該免疫球蛋白Fc區與Fc受體的結合親和力選擇性增强。
- 如請求項1至7中任一項所述的融合蛋白，其中該免疫球蛋白Fc區在如EU編碼的M252、S254和T256位置處包含胺基酸突變。
- 如請求項8所述的融合蛋白，其中該免疫球蛋白Fc區包含下組的胺基酸突變：M252Y、S254T和/或T256E。
- 如請求項9所述的融合蛋白，其中該免疫球蛋白Fc區的胺基酸突變為M252Y、S254T和T256E。
- 如請求項7至10中任一項所述的融合蛋白，其中該免疫球蛋白Fc區包含如SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至11中任一項所述的融合蛋白，其包含鉸鏈區，且該鉸鏈區位於該人GLP-1多肽變體和該免疫球蛋白Fc區之間。
- 如請求項12所述的融合蛋白，其中該鉸鏈區源自IgG。
- 如請求項12或13所述的融合蛋白，其中該鉸鏈區源自IgG1或IgG4。
- 如請求項12至14中任一項所述的融合蛋白，其中該鉸鏈區包含如SEQ ID NO：30-31中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項12至15中任一項所述的融合蛋白，其中該鉸鏈區源自IgG1。
- 如請求項16所述的融合蛋白，其中該鉸鏈區包含如SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至17中任一項所述的融合蛋白，其還包含連接子，且該連接子位於該人GLP-1多肽變體和該鉸鏈區之間。
- 如請求項18所述的融合蛋白，其中該連接子為肽連接子。
- 如請求項18或19所述的融合蛋白，其中該連接子具有5-20個胺基酸長度。
- 如請求項18至20中任一項所述的融合蛋白，其中該連接子具有15個胺基酸長度。
- 如請求項18至21中任一項所述的融合蛋白，其中該連接子包含如SEQ ID NO：27-29中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項18至22中任一項所述的融合蛋白，其中該連接子包含如SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至23中任一項所述的融合蛋白，其中該人GLP-1多肽變體具有人GLP-1的至少部分活性。
- 如請求項1至24中任一項所述的融合蛋白，其中與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列包含W31和K26胺基酸位置處的突變。
- 如請求項1至25中任一項所述的融合蛋白，其中與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列包含W31和Y19胺基酸位置處的突變。
- 如請求項1至26中任一項所述的融合蛋白，其中與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列包含K26和Y19胺基酸位置處的突變。
- 如請求項1至27中任一項所述的融合蛋白，其中與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列包含W31、K26和Y19胺基酸位置處的突變。
- 如請求項1至28中任一項所述的融合蛋白，其中該人GLP-1多肽變體在該W31處包含胺基酸取代，該胺基酸取代為W31Y、W31R、W31K或W31A。
- 如請求項29所述的融合蛋白，其中該人GLP-1多肽變體在該 W31處包含胺基酸取代，該胺基酸取代為W31Y。
- 如請求項1至30中任一項所述的融合蛋白，其中該人GLP-1多肽變體在該Y19處包含胺基酸取代，該胺基酸取代為選自下組的任意一種胺基酸取代：Y19A、Y19L、Y19T、Y19F、Y19I、Y19V和Y19S。
- 如請求項31所述的融合蛋白，其中該人GLP-1多肽變體在該Y19處包含胺基酸取代，該胺基酸取代為選自下組的任意一種胺基酸取代：Y19A。
- 如請求項1至32中任一項所述的融合蛋白，其中該人GLP-1多肽變體在該K26處包含胺基酸取代，該胺基酸取代為K26R。
- 如請求項1至33中任一項所述的融合蛋白，其中該人GLP-1多肽變體包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至34中任一項所述的融合蛋白，其中該人GLP-1多肽變體包含SEQ ID NO：4-25中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至35中任一項所述的融合蛋白，其中與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列包含的胺基酸突變為W31Y、K26R和Y19A。
- 如請求項36所述的融合蛋白，其中該人GLP-1多肽變體包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至35中任一項所述的融合蛋白，其中與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列相比，該人GLP-1多肽變體的胺基酸序列包含的胺基酸突變為W31Y和K26R。
- 如請求項38所述的融合蛋白，其中該人GLP-1多肽變體包含 SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至39中任一項所述的融合蛋白，其包含該人GLP-1多肽變體和該免疫球蛋白Fc區。
- 如請求項12至40中任一項所述的融合蛋白，其包含該人GLP-1多肽變體和該鉸鏈區。
- 如請求項12至41中任一項所述的融合蛋白，其包含該人GLP-1多肽變體、該免疫球蛋白Fc區和該鉸鏈區。
- 如請求項18至42中任一項所述的融合蛋白，其自N端至C端，依次包含該人GLP-1多肽變體，該連接子，該鉸鏈區以及該免疫球蛋白Fc區。
- 如請求項1至43中任一項所述的融合蛋白，其包含如SEQ ID NO：37-45中任一項所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至44中任一項所述的融合蛋白，其包含如SEQ ID NO：43-44中任一項所示的胺基酸序列。
- 一種分離的核酸分子，其編碼請求項1至45中任一項所述的融合蛋白。
- 一種載體，其包含如請求項46所述的分離的核酸分子。
- 一種細胞，其包含或表達如請求項1至45中任一項所述的融合蛋白、如請求項46所述的分離的核酸分子或如請求項47所述的載體。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至45中任一項所述的融合蛋白、如請求項46所述的分離的核酸分子、如請求項47所述的載體和/或如請求項48所述的細胞，以及視需要地藥學上可接受的載劑。
- 一種免疫偶聯物，其包含如請求項1至45中任一項所述的融合蛋白。
- 一種如請求項1至45中任一項所述的融合蛋白、如請求項46所述的分離的核酸分子、如請求項47所述的載體、如請求項48所述的細胞、如請求項49所述的醫藥組成物和/或如請求項50所述的免疫偶聯物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防和/或治療代謝性疾病或病症。
- 如請求項51所述的用途，其中該代謝性疾病或病症包括GLP-1相關代謝性病症。
- 如請求項51或52所述的用途，其中該代謝性疾病或病症包括糖尿病。
- 一種預防和/或治療代謝性疾病或病症的方法，其包括向有需要的受試者施用如請求項1至45中任一項所述的融合蛋白、如請求項46所述的分離的核酸分子、如請求項47所述的載體、如請求項48所述的細胞、如請求項49所述的醫藥組成物和/或如請求項50所述的免疫偶聯物。
- 如請求項54所述的方法，其中該代謝性疾病或病症包括GLP-1相關代謝性病症。
- 如請求項54或55所述的方法，其中該代謝性疾病或病症包括糖尿病。
- 如請求項1至45中任一項所述的融合蛋白、如請求項46所述的分離的核酸分子、如請求項47所述的載體、如請求項48所述的細胞、如請求項49所述的醫藥組成物和/或如請求項50所述的免疫偶聯物，其用於預防和/或治療代謝性疾病或病症。
- 如請求項57所述的融合蛋白、分離的核酸分子、載體、細胞和/或醫藥組成物，其中該代謝性疾病或病症包括GLP-1相關代謝性病症。
- 如請求項57或58所述的融合蛋白、分離的核酸分子、載體、細胞和/或醫藥組成物，其中該代謝性疾病或病症包括糖尿病。
- 一種增加或促進有需要的受試者中胰島素表達的方法，該方法包括向該受試者施用有效量的如請求項1至45中任一項所述的融合蛋白、如請求項46所述的分離的核酸分子、如請求項47所述的載體、如請求項48所述的細胞、如請求項49所述的醫藥組成物和/或如請求項50所述的免疫偶聯物。
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