CN117616037A

CN117616037A - 融合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN117616037A
Application number: CN202280048550.3A
Authority: CN
Inventors: 徐霆; 金宇灏; 汪皛皛; 王媲琳; 郭康平
Original assignee: Suzhou Alphamab Co Ltd
Current assignee: Suzhou Alphamab Co Ltd
Priority date: 2021-07-06
Filing date: 2022-07-05
Publication date: 2024-02-27
Also published as: CA3224575A1; WO2023280133A1; WO2023280133A9; EP4368636A1; TW202317607A; AU2022308120A1; KR20240029769A

Abstract

一种融合蛋白及其应用，所述融合蛋白包含人GLP‑1多肽变体和免疫球蛋白Fc区；其中与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP‑1多肽变体的氨基酸序列包含至少2个氨基酸突变，所述至少2个氨基酸突变位于选自下组的氨基酸位置处：W31、K26和Y19。还提供了所述融合蛋白在治疗疾病或病症中的应用。

Description

融合蛋白及其应用

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种GLP-1多肽变体与免疫球蛋白Fc区的融合蛋白及其应用。

背景技术

胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一种由小肠上皮L-细胞分泌的肠促胰素，在健康的个体中，GLP-1能响应机体营养物质的摄取，促进胰岛素释放并抑制胰高血糖素分泌。在患有II型糖尿病的患者中，输入超生理剂量的GLP-1可恢复内源性胰岛素分泌，降低血糖。

由于二肽基肽酶IV(DPPIV)的酶解和肾脏的清除作用，天然GLP-1的血浆半衰期短。尽管已经开发了几种修饰以延长半衰期的GLP-1R激动剂(例如，度拉糖肽(dulaglutide))用于治疗II型糖尿病，但仍需开发有效的长期治疗并维持最低限度的副作用的方案。

发明内容

本申请提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含人GLP-1多肽变体和免疫球蛋白Fc区。所述融合蛋白具有优异的药代动力学性质，例如，较长的半衰期(t1/2)较长，或较高的暴露量。本申请的融合蛋白不易被清除，显著提高了天然GLP-1的半衰期，有利于GLP-1多肽变体在体内发挥功能，提高药效，降低使用量。

本申请提供了融合蛋白，所述融合蛋白包含人GLP-1多肽变体和免疫球蛋白Fc区；其中与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列包含至少2个氨基酸突变，所述至少2个氨基酸突变位于选自下组的氨基酸位置处：W31、K26和Y19。

在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区位于所述人GLP-1多肽变体的C端。

在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区为源自IgG的Fc区。

在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区为源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区。

在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区为源自IgG4的Fc区。

在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区包含如SEQ ID NO:32-35中任一项所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区包含氨基酸突变，与未经所述氨基酸突变的免疫球蛋白Fc区相比，所述氨基酸突变使得所述免疫球蛋白Fc区与Fc受体的结合亲和力选择性增强。

在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区在根据EU编码的M252、S254和T256位置处包含氨基酸突变。

在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区包含下组的氨基酸突变：M252Y、S254T和/或T256E。

在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区的氨基酸突变为M252Y、S254T和T256E。

在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述融合蛋白包含铰链区，且所述铰链区位于所述人GLP-1多肽变体和所述免疫球蛋白Fc区之间。

在某些实施方式中，所述铰链区源自IgG。

在某些实施方式中，所述铰链区源自IgG1或IgG4。

在某些实施方式中，所述铰链区包含如SEQ ID NO:30-31中任一项所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述铰链区源自IgG1。

在某些实施方式中，所述铰链区包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述融合蛋白还包含连接子，且所述连接子位于所述人GLP-1多肽变体和所述铰链区之间。

在某些实施方式中，所述连接子为肽连接子。

在某些实施方式中，所述连接子具有5-20个氨基酸长度。

在某些实施方式中，所述连接子具有15个氨基酸长度。

在某些实施方式中，所述连接子包含如SEQ ID NO:27-29中任一项所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述连接子包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，人GLP-1多肽变体具有人GLP-1的至少部分活性。

在某些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列包含选自下组的氨基酸位置处的至少2个突变：W31、K26和Y19。

在某些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列包含W31和K26氨基酸位置处的突变。

在某些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列包含W31和Y19氨基酸位置处的突变。

在某些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列包含K26和Y19氨基酸位置处的突变。

在某些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列包含W31、K26和Y19氨基酸位置处的突变。

在某些实施方式中，所述人GLP-1多肽变体在所述W31处包含氨基酸取代，所述氨基酸取代为W31Y、W31R、W31K或W31A。

在某些实施方式中，所述人GLP-1多肽变体在所述W31处包含氨基酸取代，所述氨基酸取代为W31Y。

在某些实施方式中，所述人GLP-1多肽变体在所述Y19处包含氨基酸取代，所述氨基酸取代为选自下组的任意一种氨基酸取代：Y19A、Y19L、Y19T、Y19F、Y19I、Y19V和Y19S。

在某些实施方式中，所述人GLP-1多肽变体在所述Y19处包含氨基酸取代，所述氨基酸取代为选自下组的任意一种氨基酸取代：Y19A。

在某些实施方式中，所述人GLP-1多肽变体在所述K26处包含氨基酸取代，所述氨基酸取代为K26R。

在某些实施方式中，所述人GLP-1多肽变体包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述人GLP-1多肽变体包含SEQ ID NO:4-25中任一项所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列包含的氨基酸突变为W31Y、K26R和Y19A。

在某些实施方式中，所述人GLP-1多肽变体包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列包含的氨基酸突变为W31Y和K26R。

在某些实施方式中，所述人GLP-1多肽变体包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述融合蛋白包含所述人GLP-1多肽变体和所述免疫球蛋白Fc区。在某些实施方式中，所述人GLP-1多肽变体包含SEQ ID NO:4或25所示的氨基酸序列，在某些实施方式中，所述免疫球蛋白的Fc区为源自IgG4的Fc区。在某些实施方式中，所述Fc区包含EU编码的M252Y、S254T和T256E的氨基酸突变。在某些实施方式中，所述Fc区包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述融合蛋白包含所述人GLP-1多肽变体和所述铰链区。在某些实施方式中，所述人GLP-1多肽变体包含SEQ ID NO:4或25所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述铰链区源自IgG1。在某些实施方式中，所述铰链区包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述融合蛋白包含所述人GLP-1多肽变体、所述免疫球蛋白Fc区和所述铰链区。在某些实施方式中，所述人GLP-1多肽变体包含SEQ ID NO:4或25所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区为源自IgG4的Fc区。在某些实施方式中，所述铰链区源自IgG1。在某些实施方式中，所述Fc区包含EU编码的M252Y、S254T和T256E的氨基酸突变。在某些实施方式中，所述Fc区包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述铰链区包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述融合蛋白自N端至C端，依次包含所述人GLP-1多肽变体，所述连接子，所述铰链区以及所述免疫球蛋白Fc区。

在某些实施方式中，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO:37-45中任一项所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO:43-44中任一项所示的氨基酸序列。

另一方面，本申请提供了分离的核酸分子，所述核酸分子编码所述融合蛋白。

另一方面，本申请提供了载体，所述载体包含所述分离的核酸分子。

另一方面，本申请提供了细胞，其包含或表达所述融合蛋白、所述分离的核酸分子或所述载体。

另一方面，本申请提供了药物组合物，所述组合物包含所述融合蛋白、所述分离的核酸分子、所述载体和/或所述细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。

另一方面，本申请提供了免疫缀合物，所述免疫缀合物包含所述的融合蛋白。

另一方面，本申请提供了所述融合蛋白、所述分离的核酸分子、所述载体、所述细胞、所述药物组合物和/或所述免疫缀合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗代谢性疾病或病症。

在某些实施方式中，所述代谢性疾病或病症包括GLP-1相关代谢性病症。

在某些实施方式中，所述代谢性疾病或病症包括糖尿病。

另一方面，本申请提供了预防和/或治疗代谢性疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用所述融合蛋白、所述分离的核酸分子、所述载体、所述细胞、所述药物组合物和/或所述免疫缀合物。

在某些实施方式中，所述代谢性疾病或病症包括糖尿病。

另一方面，本申请提供了所述融合蛋白、所述分离的核酸分子、所述载体、所述细胞、所述药物组合物和/或所述免疫缀合物，其用于预防和/或治疗代谢性疾病或病症。

在某些实施方式中，所述代谢性疾病或病症包括糖尿病。

另一方面，本申请提供了增加或促进有需要的受试者中胰岛素表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述融合蛋白、所述分离的核酸分子、所述载体、所述细胞和/或所述药物组合物。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

附图说明

本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：

图1显示的是不同连接子的本申请所述融合蛋白GM-RY-L1H2-Fc4、GM-RY-L2H2-Fc4和GM-RY-L3H2-Fc4的药代动力学检测结果。

图2显示的是不同铰链区的本申请所述融合蛋白GM-ARY-L2H2-Fc4和GM-ARY-L2H1-Fc4的药代动力学检测结果。

图3显示的是Fc区包含YTE突变的本申请所述融合蛋白GM-RY-L2H1-Fc4m的药代动力学检测结果。

图4显示的是Fc区包含YTE突变的本申请所述融合蛋白GM-ARY-L2H1-Fc4m和GM-RY-L2H1-Fc4m的药代动力学检测结果。

图5显示的是不同铰链区且包含YTE突变的本申请所述融合蛋白GM-ARY-L2H2-Fc4m、GM-RY-L2H2-Fc4m、GM-ARY-L2H1-Fc4m和GM-RY-L2H1-Fc4m的药代动力学检测结果。

图6显示的是本申请融合蛋白中任GLP-1多肽变体的氨基酸序列的编号示例。

图7显示的是本申请的融合蛋白具备与度拉糖肽同等水平的GLP-1受体激活能力的检测结果。

图8A显示的是K26R-W31Y、K26R-Q23T、K26R-Q23S、K26R-Q23N、K26R-Y19L、 K26R-Y19T和K26R-Y19F双突变的融合蛋白与GLP-1受体的结合活性。

图8B显示的是K26R-W31Y、K26R-Q23E、K26R-Y19I、K26R-Y19V、K26R-Y19A和K26R-Y19S双突变的融合蛋白与GLP-1受体的结合活性。

图8C显示的是K26R-W31Y、K26R-Q23N、K26R-Q23S和K26R-Q23T双突变的融合蛋白与GLP-1受体的结合活性。

图8D显示的是W31Y和Y19处氨基酸突变的双突变的融合蛋白与GLP-1受体的结合活性。

图8E显示的是W31Y-Y19A和W31Y-Q23E的氨基酸双突变的融合蛋白与GLP-1受体的结合活性。

图8F显示的是GM-WY和GM-WYFL与GLP-1受体的结合活性。

图9A显示的是K26R-W31Y双突变和K26R-W31Y-Q23处氨基酸突变的三突变的融合蛋白均能够激活GLP-1受体。

图9B和图9C显示的是K26R-W31Y-Y19处氨基酸突变的三突变的融合蛋白均能够激活GLP-1受体。

图9D和图9F显示的是K26R-W31Y-Q23处氨基酸突变的三突变的融合蛋白和K26R-W31Y-Y19处氨基酸突变的三突变的融合蛋白均能够激活GLP-1受体。图9E显示的是K26R-W31Y-Q23处氨基酸突变的三突变的融合蛋白能够激活GLP-1受体。

图10A显示的是本申请的融合蛋白GM-KRWY的药代动力学效果。

图10B显示的是本申请的融合蛋白GM-KRWYYL、GM-KRWYYA和GM-KRWYYI的药代动力学效果。

图10C显示的是本申请的融合蛋白GM-KRWYQN、GM-KRWYQE和GM-KRWYYA的药代动力学效果。

图11A-11B显示的是本申请的融合蛋白GM-KRWY在口服糖耐量试验中的降血糖活性。

图11C-11D显示的是本申请的融合蛋白GM-KRWYYA和GM-KRWYQE在口服糖耐量试验中的降血糖活性。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

术语定义

在本申请中，术语“GLP-1”通常是指胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide 1)。天然GLP-1分子在体内经过加工，切割了前6个氨基酸，因此本领域习惯将GLP-1的氨基酸序列的N端第一个氨基酸定为第7位，C端最后一个氨基酸定为第37位。经过加工的肽可以在体内得到进一步修饰，去除C端的甘氨酸残基并以酰胺基替代。GLP-1通常有两种生物活性形式，分别为GLP-1(7-37)OH和GLP-1(7-36)NH ₂。本申请所述的“GLP-1”包含天然的、人工合成的或经修饰的GLP-1蛋白，还包含完整的GLP-1蛋白或其功能性片段，以及不同生物活性形式的GLP-1蛋白。例如，野生型的人GLP-1可包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其N末端的氨基酸残基H记为第7位。因此，本申请的术语“K26”通常是指从GLP-1蛋白N端第7位的H起算，第26位氨基酸的位置，在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中，第26位的氨基酸为K；术语“W31”通常是指从GLP-1蛋白N端第7位的H起算，第31位氨基酸的位置，在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中，第31位的氨基酸为W。在本申请中，在描述氨基酸突变和/或取代时，对于GLP-1多肽变体的氨基酸残基的编号描述区别于Fc区的氨基酸残基的编号描述，Fc区的氨基酸残基编号根据EU编码。

所述人GLP-1可以被改造，改造后的GLP-1的变体可以具有改造前的人GLP-1的至少部分活性。例如，示例性的野生型人GLP-1改造后的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:2所示。

在本申请中，术语“人GLP-1的至少部分活性”通常是指具有人GLP-1蛋白的一种或多种活性，或具有人GLP-1蛋白的至少20％(例如，至少25％、30％、35％、40％、45％、或50％或更高)的活性。所述“人GLP-1的至少部分活性”的人GLP-1可以是野生型的，如，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。所述“人GLP-1的至少部分活性”中的人GLP-1可以是野生型人GLP-1改造后的GLP-1变体，如，SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。例如，本申请的人GLP-1多肽变体可以具有氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的人GLP-1的至少部分活性。在另一些情形中，本申请的人GLP-1多肽变体可以具有氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的人GLP-1的至少部分活性。

所述活性不要求与人GLP-1蛋白具有相同水平的活性，可以是高于、相近或低于人GLP-1蛋白的活性。在某些情形中，“人GLP-1的至少部分活性”可以指选自下组中的一种或多种：与GLP-1受体结合的活性、激活GLP-1受体的活性、激活腺苷酸环化酶、促进细胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平升高的活性、正性调节细胞内Ca ²⁺水平的活性、刺激胰岛素分泌的活性、增加肝糖原储存量的活性、延缓胃排空的活性、抑制胃动力的活性、降低食欲的活性、抑制β细胞凋亡的活性、抑制餐后胰高血糖素的分泌的活性、缓解低血糖的活性和减轻体重的活性。例如，其可以通过检测与GLP-1受体结合的能力、cAMP的表达水平来检测。例如，其可以通过荧光素酶法检测对cAMP/PKA信号通路的激活水平来检测。所述“人GLP-1的至少部分活性”可以是包含人GLP-1的融合蛋白(例如，与Fc区的融合蛋白)的至少部分活性。

在本申请中，术语“多肽”通常是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”可以是具有两个或更多个氨基酸的任意链，并且不指特定长度的产物。本申请所述多肽包括肽、二肽、三肽、寡肽、蛋白质、氨基酸链或任何其它用于指具有两个或更多个氨基酸的链，而且术语“多肽”可以代替这些术语中任一个或与其交换使用。术语“多肽”还可以指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰化、通过已知的保护性/封闭性基团衍生化、蛋白水解分裂、或通过非天然存在的氨基酸修饰。多肽可以自天然的生物学来源衍生或通过重组技术生成。

在本申请中，术语“变体”通常是指与天然生物活性蛋白质具有序列同源性的蛋白质分子。本申请所述的多肽变体包括通过添加(包含插入)、缺失、修饰和/或取代一个或多个氨基酸残基而具有改变的氨基酸序列的多肽，其同时保留亲本序列(例如，SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列)的至少一种治疗和/或生物活性而与亲本序列不同。例如，变体可与亲本蛋白具有至少0％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。变体可以天然存在或者是非天然存在的。可以使用本领域已知的技术来生成非天然存在的变体。本申请的多肽变体可以包含保守的或非保守的氨基酸替代、删除或添加。

在本申请中，术语“突变”通常包括对序列(核酸或氨基酸序列)的任何类型的改变或修饰，包括氨基酸或核苷酸的缺失、截短、失活、破坏、取代或易位。在本申请中，氨基酸突变可以是氨基酸取代，术语“取代”通常是指用不同的“替换”氨基酸残基来替换预先确定的亲本氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基。该一个或多个被替换的氨基酸残基可以是“天然存在的氨基酸残基”(即由遗传密码编码)。

术语“氨基酸取代”是指用另一个氨基酸残基替代存在于亲本序列中的一个氨基酸残基。亲本序列中的氨基酸可以是例如经由化学肽合成或通过本领域已知的重组方法来取代。

在本申请中，术语“Fc区”通常是指源自免疫球蛋白重链C端区域的结构域，所述C端区域可以通过木瓜蛋白酶消化完整的抗体而产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区，其中，“未经所述氨基酸突变的免疫球蛋白Fc区”是指SEQ ID NO:32-35中任一项所示的氨基酸序列，其分别对应人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc序列。本申请所述免疫球蛋白的Fc区通常包含2个恒定域(CH ₂结构域和CH ₃结构域)，如无特别说明，不包含铰链区，且任选地可以包含CH ₄结构域。

在本申请中，术语“YTE突变”是指IgG的Fc区中的一组突变。YTE突变可以导致Fc区与人类FcRn的结合增加，且可能改变包含该YTE突变的Fc区的融合蛋白的血清半衰期。包含YTE突变的Fc区包括下述三种氨基酸突变的组合：M252Y、S254T和T256E，其中根据在Kabat中的EU索引进行编号。

在本申请中，术语“铰链区”通常是指一种长度在15-30个氨基酸之间的柔性氨基酸序列，其允许其N端或C端的多肽部分独立地移动。铰链区通常来自免疫球蛋白重链CH _l和CH ₂功能区之间的区域。铰链区通常来源于IgG，例如，可来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。相对于天然的源自IgG的铰链区，本申请的铰链区的N端或C端可以增加一个或多个氨基酸残基，也可以删减一个或多个氨基酸残基，还可以替换一个或多个氨基酸残基，只要仍保持铰链区的功能即可。

在本申请中，术语“免疫球蛋白”通常是指基本上由免疫球蛋白基因编码的一个或多个多肽组成的蛋白质。公认的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。一般来说，免疫球蛋白可以是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。全长免疫球蛋白“轻链”(约25KD和214个氨基酸)的NH2-末端(约110个氨基酸)由可变区基因编码，COOH-末端由κ或λ恒定区基因编码。天然的免疫球蛋白基本上由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和Fc区组成。

在本申请中，术语“连接子”通常是指连接两个异源性多肽或其片段的氨基酸序列。在本申请中，连接子可以是共价连接多肽以形成融合多肽的氨基酸序列。连接子的长度可以具有10-20个氨基酸长度。连接子可以是柔性的或刚性的。

在本申请中，所述“选择性增强”通常是指在特定条件下增强，所述特定条件可以是特定的pH范围、特定的温度范围、特定的连接方式、特定的样品来源或特定的反应时间等。例如，Fc区的氨基酸突变使得Fc区在特定pH范围内与Fc受体的结合能力增强，但不显著改变Fc区在该特定范围内以外与Fc受体的结合能力，可以称为“选择性增强”。

在本申请中，术语“融合蛋白”通常是指包含或者由下述这样的多肽组成的更长的多肽，所述多肽的氨基酸序列可以直接或间接地(通过连接子，例如，连接肽)融合至一异源多肽(例如，前一多肽或其结构域无关的多肽)的氨基酸序列。

在本申请中，术语“免疫缀合物”通常是指多肽或蛋白质和感兴趣的活性物质(例如，蛋白质、核酸、药物或标记分子等)直接或间接连接(例如，通过连接子共价连接)而形成的缀合物。

在本申请中，术语“核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。

在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主细胞中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还可以包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。

在本申请中，术语“细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞，细胞系或细胞培养物。所述宿主细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的，意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段即可。所述宿主细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。所述重组宿主细胞不仅包括某种特定的细胞，还包括这些细胞的后代。

在本申请中，术语“代谢性疾病或病症”通常是指破坏体内正常代谢过程，使得机体无法正常利用和/或贮存能量的疾病或病症。所述代谢性疾病或病症可以是指糖类代谢障碍的疾病、脂肪类代谢障碍的疾病和/或细胞线粒体障碍的疾病。所述代谢性疾病或病症可以是与饮食、毒素或感染相关的，也可以是遗传性疾病。所述代谢性疾病或病症可以包括由缺少代谢相关的酶、或代谢相关的酶功能异常引起的疾病或病症。本申请所述代谢性疾病或病症可以选自糖尿病和其他GLP-1相关代谢性病症。

在申请中，“度拉糖肽(dulaglutide)”通常是指一种包含GLP-1类似物的异源融合蛋白质，由GLP-1类似物(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)与源自人IgG4的Fc区通过小分子肽共价连接形成。度拉糖肽也可称为杜拉鲁肽或度拉鲁肽，商品名为或度拉糖肽包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列(参见PCT专利WO2009009562和美国专利US7452966)。

在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。

在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、 6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。

发明详述

GLP-1多肽变体

一方面，本申请提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含人GLP-1多肽变体，其具有人GLP-1的至少部分活性。在某些情形中，人GLP-1多肽变体可以具有选自下组中的一种或多种活性：与GLP-1受体结合的活性、激活GLP-1受体的活性、激活腺苷酸环化酶、促进细胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平升高的活性、正性调节细胞内Ca ²⁺水平的活性、刺激胰岛素分泌的活性、增加肝糖原储存量的活性、延缓胃排空的活性、抑制胃动力的活性、降低食欲的活性、抑制β细胞凋亡的活性、抑制餐后胰高血糖素的分泌的活性、缓解低血糖的活性和减轻体重的活性。例如，其可以通过检测与GLP-1受体结合的能力、cAMP的表达水平来检测。所述人GLP-1多肽变体的活性可以为人GLP-1活性的至少20％(例如，至少25％、30％、35％、40％、45％、或50％或更高)。

与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比：HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGG(SEQ ID NO:2)，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列可包含至少2个氨基酸突变，例如，可包含2个、3个或更多个氨基酸突变。例如，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列可包含2-4个(例如，2-3个、3个或2个)氨基酸取代。所述至少2个氨基酸突变可以位于选自下组的氨基酸位置处：K26、W31和Y19。

在本申请中，所述氨基酸位置“Xn”是指在相应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中第n位的残基X处发生氨基酸取代，其中n为正整数(对于GLP-1，n从7开始起算)，X为任意氨基酸残基的缩写。例如，氨基酸位置“W31”表示相应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第31位氨基酸的位置。对于SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，氨基酸残基X和位置n的对应关系如图6所示。

在本申请中，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列可包含选自下组的氨基酸位置处的至少2个突变：W31、K26和Y19。

例如，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列可包含W31和K26氨基酸位置处的2个氨基酸突变。例如，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列有2个氨基酸突变，可以位于W31和K26氨基酸位置处。例如，所述人GLP-1多肽变体可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

例如，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列可包含W31和Y19氨基酸位置处的2个氨基酸突变。例如，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列有2个氨基酸突变，可以位于W31和Y19氨基酸位置处。例如，所述人GLP-1多肽变体可包含SEQ ID NO:12-18中任一项所示的氨基酸序列。

例如，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列可包含K26和Y19氨基酸位置处的2个氨基酸突变。例如，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列有2个氨基酸突变，可以位于K26和Y19氨基酸位置处。例如，所述人GLP-1多肽变体可包含SEQ ID NO:5-11中任一项所示的氨基酸序列。

例如，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列可包含W31、K26和Y19氨基酸位置处的3个氨基酸突变。例如，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列有3个氨基酸突变，可以位于W31、K26和Y19氨基酸位置处。例如，所述人GLP-1多肽变体可包含SEQ ID NO:19-25中任一项所示的氨基酸序列。

在本申请中，所述氨基酸突变可以包含氨基酸取代。所述氨基酸突变使所述GLP-1多肽变体仍具有人GLP-1(例如，氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2中任一项所示的人GLP-1蛋白)的至少部分活性。所述氨基酸突变可以使所述GLP-1多肽变体的融合蛋白仍具有人GLP-1(例如，氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2中任一项所示的人GLP-1蛋白)的融合蛋白的至少部分活性。所述氨基酸突变可以使所述GLP-1多肽变体与Fc区的融合蛋白仍具有人GLP-1(例如，氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2中任一项所示的人GLP-1蛋白)与Fc区的融合蛋白的至少部分活性。

在本申请中，所述K26处可以包含氨基酸取代，所述氨基酸取代可以为K26R。

在本申请中，所述W31处可以包含氨基酸取代，所述氨基酸取代可以为W31Y、W31A、W31R或W31K。在本申请中，所述W31处可以包含氨基酸取代，所述氨基酸取代可以为W31Y、W31K或W31R。例如，所述W31处可以包含氨基酸取代，所述氨基酸取代可以为W31Y。

在本申请中，所述Y19处可以包含氨基酸取代，所述氨基酸取代可以为Y19A、Y19L、Y19T、Y19F、Y19I、Y19V或Y19S。例如，所述Y19处可以包含氨基酸取代，所述氨基酸取代可以为Y19A。

在本申请中，氨基酸取代“XnY”是指相应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中第n位的残基X被取代为氨基酸残基Y，其中n为正整数(对于GLP-1，n从7开始起算)，X和Y分别独立地为任意氨基酸残基的缩写，且X不同于Y。例如，氨基酸取代“W31Y”是指相应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中第31位的氨基酸残基W被取代为氨基酸残基Y。

在本申请中，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列可包含至少2个氨基酸取代，所述氨基酸取代可以选自下组：1)K26R，2)选自W31Y、W31R、W31K和W31A中的任意一个，和3)选自Y19A、Y19L、Y19T、Y19F、Y19I、Y19V和Y19S中的任意一个。

例如，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列可包含选自下组的至少2个氨基酸突变：1)K26R，2)选自W31Y、W31R和W31K和W31A中的任意一个，和3)选自Y19A、Y19L、Y19T、Y19F、Y19I、Y19V和Y19S中的任意一个。

在本申请中，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列可包含W31和K26氨基酸位置处的2个氨基酸取代，所述K26处的氨基酸取代可以为K26R，且所述W31处的氨基酸取代可以为W31Y、W31R和W31K和W31A。例如，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列可包含W31Y和K26R的氨基酸取代。

在本申请中，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列可包含氨基酸取代W31Y。

在本申请中，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列可包含氨基酸取代K26R。

在本申请中，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列可包含氨基酸取代Y19A。

在本申请中，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列可包含氨基酸取代W31Y和Y19A。

在本申请中，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列可包含氨基酸取代W31Y和K26R。例如，所述人GLP-1多肽变体可包含SEQ ID NO：4和19-25中任一项所示的氨基酸序列。

例如，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列的氨基酸取代可以为W31Y和K26R，例如，所述人GLP-1多肽变体可包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

在本申请中，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列可包含氨基酸取代K26R，氨基酸取代W31Y和Y19处的氨基酸取代。例如，所述GLP-1多肽变体可包含SEQ ID NO：19-25中任一项所示的氨基酸序列。

在本申请中，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列可包含氨基酸取代K26R，氨基酸取代W31Y和氨基酸取代Y19A。例如，所述人GLP-1多肽变体可包括SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。

本申请中，所述人GLP-1多肽变体可以包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列:HGEGTFTSDVSSX ₁₉LEEQAAREFIAX ₃₁LVKGGG；其中，X ₁₉＝Y、A、L、T、F、I、V或S；X ₃₁＝W、A、R、K或Y。

申请号PCT/CN2021/141606和PCT/CN2021/141608的PCT国际专利申请分别涉及人GLP-1多肽变体及其融合蛋白，在此将其作为整体并入本文作为参考。

Fc区

在本申请中，所述融合蛋白包含免疫球蛋白Fc区。在本申请中，免疫球蛋白Fc区可以源自IgG，例如，源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。所述IgG1的Fc区可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。所述IgG2的Fc区可包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。所述IgG3的Fc区可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。所述IgG4的Fc区可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。

在本申请中，所述Fc区可以包含氨基酸突变，与未经所述氨基酸突变的免疫球蛋白Fc区(例如，SEQ ID NO:32-35中任一项所示的氨基酸序列)相比，所述氨基酸突变可以使得所述免疫球蛋白Fc区与Fc受体的结合亲和力选择性增强。

在本申请中，所述Fc区可以是源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区，且在M252、S254和/或T256位置处包含一种或多种氨基酸突变(例如，所述氨基酸位置根据Kabat的EU编码)。例如，所述Fc区可以是源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区，且在M252、S254和T256位置处包含氨基酸突变(例如，所述氨基酸位置根据Kabat的EU编码)。

例如，所述M252处的氨基酸突变可以为M252Y。例如，所述S254T处的氨基酸突变可以为S254T。例如，所述T256处的氨基酸突变可以为T256E。

在本申请中，所述Fc区可以是源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区，且可包含M252Y、S254T和T256E的氨基酸突变。

例如，所述Fc区可以是源自IgG1的Fc区，且可包含M252Y、S254T和T256E的氨基酸突变。例如，所述Fc区可以是源自IgG2的Fc区，且可包含M252Y、S254T和T256E的氨基酸突变。例如，所述Fc区可以是源自IgG3的Fc区，且可包含M252Y、S254T和T256E的氨基酸突变。例如，所述Fc区可以是源自IgG4的Fc区，且可包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。

铰链区

在本申请中，所述融合蛋白可包含铰链区。在本申请中，所述铰链区可以源自IgG。

在本申请中，所述铰链区可以源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在本申请中，所述铰链区可以源自IgG1。在本申请中，所述铰链区可以源自IgG4。

在本申请中，与天然存在的IgG1铰链区相比，所述融合蛋白中的铰链区可以包含一个或多个氨基酸突变，以去除链间二硫键。这样的氨基酸突变是本领域已知的技术。

在本申请中，与天然存在的IgG铰链区相比，所述融合蛋白中的铰链区可以在N端增加一个或多个氨基酸。在本申请中，与天然存在的IgG铰链区相比，所述融合蛋白中的铰链区可以在C端增加一个或多个氨基酸。在本申请中，与天然存在的IgG铰链区相比，所述融合蛋白中的铰链区可以在N端减少一个或多个氨基酸。在本申请中，与天然存在的IgG铰链区相比，所述融合蛋白中的铰链区可以在C端减少一个或多个氨基酸。

在本申请中，与天然存在的IgG4铰链区相比，所述融合蛋白中的铰链区可以在N端增加一个或多个氨基酸，例如，增加Ala。在本申请中，与天然存在的IgG4铰链区相比，所述融合蛋白中的铰链区可以包含一个或多个氨基酸突变，以避免不期望的蛋白形成。这样的氨基酸突变是本领域已知的技术。

在本申请中，所述铰链区可以包含如SEQ ID NO:30或31所示的氨基酸序列。

连接子

在本申请中，所述融合蛋白可包含连接子。所述连接子连接所述人GLP-1多肽变体和所述免疫球蛋白Fc区。在本申请中，所述连接子可以是肽连接子。在本申请中，所述肽连接子可以是刚性的或柔性的。示例性的连接子可包括但不限于SEQ ID NO:27-29或47-70中任一项所示的氨基酸序列。

在本申请中，所述连接子可以具有12-15个氨基酸长度。在本申请中，所述连接子可以具有15个氨基酸长度，对于上述列举的不足15个氨基酸长度的连接子，可以通过添加氨基酸使得其长度达到15个氨基酸，例如，添加Gly。

例如，本申请所述的连接子可包含SEQ ID NO:27-29中任一项所示的氨基酸序列。

融合蛋白

在本申请中，所述融合蛋白可包含所述人GLP多肽变体、所述连接子、所述铰链区和所述免疫球蛋白Fc区。

在本申请中，所述融合蛋白中的所述人GLP多肽变体可以包含SEQ ID NO:4或25所示的氨基酸序列，所述免疫球蛋白Fc区可以是源自IgG的Fc区。例如，所述免疫球蛋白Fc区可以是包含M252Y、S254T和T256E的氨基酸突变的IgG的Fc区。

在本申请中，所述融合蛋白中的所述人GLP多肽变体可以包含SEQ ID NO:4或25所示的氨基酸序列，所述铰链区可以源自IgG1或IgG4的铰链区，所述免疫球蛋白Fc区可以是源自IgG的Fc区。例如，所述免疫球蛋白Fc区可以是包含M252Y、S254T和T256E的氨基酸突变的IgG的Fc区。

在本申请中，所述融合蛋白中的所述人GLP多肽变体可以包含SEQ ID NO:4或25所示的氨基酸序列，所述连接子可以包含SEQ ID NO:27-29中任一项所示的氨基酸序列，所述铰链区可以源自IgG1或IgG4的铰链区，所述免疫球蛋白Fc区可以是源自IgG的Fc区。例如，所述免疫球蛋白Fc区可以是包含M252Y、S254T和T256E的氨基酸突变的IgG的Fc区。

在本申请中，自N端至C端，所述融合蛋白可依次包含所述人GLP多肽变体、所述连接子、所述铰链区和所述免疫球蛋白Fc区。

在本申请中，所述融合蛋白中的所述人GLP多肽变体可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述连接子可以包含SEQ ID NO:27-29中任一项所示的氨基酸序列，所述铰链区可以源自IgG1或IgG4的铰链区，所述免疫球蛋白Fc区可以是源自IgG4的Fc区。例如，所述融合蛋白可包含SEQ ID NO:37-39中任一项所示的氨基酸序列。

在本申请中，所述融合蛋白中的所述人GLP多肽变体可以包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述连接子可以包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，所述铰链区可以源自IgG1或IgG4的铰链区，所述免疫球蛋白Fc区可以是源自IgG4的Fc区，且可选地包含M252Y、S254T和T256E的氨基酸突变。例如，所述融合蛋白可包含SEQ ID NO:40-42和44中任一项所示的氨基酸序列。

在本申请中，所述融合蛋白中的所述人GLP多肽变体可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述连接子可以包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，所述铰链区可以源自IgG1或IgG4的铰链区，所述免疫球蛋白Fc区可以是源自IgG4的Fc区，且包含M252Y、S254T和T256E的氨基酸突变。例如，所述融合蛋白可包含SEQ ID NO:43和45中任一项所示的氨基酸序列。

在本申请中，所述融合蛋白中的所述人GLP多肽变体可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述连接子可以包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，所述铰链区可以源自IgG1的铰链区，所述免疫球蛋白Fc区可以是源自IgG4的Fc区，且包含M252Y、S254T和T256E的氨基酸突变。例如，所述融合蛋白可包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。

在本申请中，所述融合蛋白中的所述人GLP多肽变体可以包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述连接子可以包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，所述铰链区可以源自IgG1的铰链区，所述免疫球蛋白Fc区可以是源自IgG4的Fc区，且包含M252Y、S254T和T256E的氨基酸突变。例如，所述融合蛋白可包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。

核酸分子、载体、细胞和制备方法

在另一个方面，本申请还提供了分离的一种或多种核酸分子，所述一种或多种核酸分子可编码本申请所述的融合蛋白。例如，所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的融合蛋白，也可以编码其中的一部分。

本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。在某些实施方式中，所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。重组DNA和分子克隆技术包括由Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,(1989)(Maniatis)和由T.J.Silhavy,M.L.Bennan和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1984)以及由Ausubel,F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology,pub.by Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)描述的那些技术。简而言之，可从基因组DNA片段、cDNA和RNA制备所述核酸，所有这些核酸可直接从细胞中提取或通过各种扩增方法(包括但不限于PCR和RT-PCR)重组产生。

在另一个方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含所述的核酸分子。例如，所述载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。

所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。

在另一方面，本申请提供了一种细胞，所述细胞可包含本申请所述的一种或多种核酸分子和/或本申请所述的一种或多种载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述细胞中，例如原核细胞(例如，细菌细胞)、CHO细胞、NS0细胞、HEK293T细胞或HEK293A细胞，或者其他真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述细胞中，例如电穿孔、脂质体转染等。

在另一个方面，本申请提供了制备本申请所述融合蛋白的方法。所述方法可包括，在使得所述融合蛋白表达的条件下，培养本申请所述的细胞。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等。

在某些情形中，所述方法还可包括收获(例如分离和/或纯化)，本申请所述融合蛋白的步骤。例如，可以采用蛋白G-琼脂糖或蛋白A-琼脂糖进行亲和层析，还可通过凝胶电泳和/或高效液相色谱等来纯化和分离本申请所述融合蛋白。

药物组合物和用途

另一方面，本申请提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含所述融合蛋白，所述的核酸分子，所述的载体，或所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。

例如，所述药学上可接受的佐剂可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。

在本申请中，所述药物组合物可被配制用于口服给药，静脉内给药，肌肉内给药，在肿瘤部位的原位给药，吸入，直肠给药，阴道给药，经皮给药或通过皮下储存库给药。

本申请所述的药物组合物可以用于治疗代谢性疾病或病症。例如，所述代谢性疾病或病症可以选自糖尿病和其他GLP-1相关代谢性病症。

所述药物组合物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型，给药途径，病人年龄，性别，体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。由于所述药物组合物具有优良的体内功效和浓度的持续时间，它可以显著地减少所述药物的给药频率和剂量。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请发明的各个技术方案，而不用于限制本申请发明的范围。

实施例

实施例1 融合蛋白的制备

制备人GLP-1多肽变体和Fc的融合蛋白，从N端至C端依次包含GLP-1多肽变体(氨基酸序列如SEQ ID NO:4-25中任一项所示)、连接肽(氨基酸序列如SEQ ID NO:27-29中任一项所示)、铰链区(氨基酸序列如SEQ ID NO:30-31中任一项所示)和源自IgG的Fc区(氨基酸序列如SEQ ID NO:32-36中任一项所示)。将包含编码融合蛋白的核酸序列的载体转入细胞，表达纯化得融合蛋白。示例性的融合蛋白全长序列和各部分序列如下表1所示。

表1 示例性融合蛋白的结构和氨基酸序列

实施例2 使用不同连接子的融合蛋白的药代动力学检测

考察本申请融合蛋白GM-RY-L1H2-Fc4、GM-RY-L2H2-Fc4和GM-RY-L3H2-Fc4的体内药代动力学。实验在SPF动物房进行，动物房环境温度23±2℃，相对湿度40-70％，12小时明暗交替。实验动物自由饮食，实验前适应至少3天。体重为180-220g的SPF级SD大鼠随机分组。皮下注射(SC)各组大鼠相对应供试品，剂量为1mg/kg，度拉糖肽(DULA)作为对照。于给药前、给药后6h、24h、48h、72h、96h和120h经颈静脉采血约100ul。将采集的血液加入离心管中，室温静置30-60min。之后4℃，两小时内4000rpm离心10分钟，迅速分离血清。-80℃保存。样本进行ELISA检测。使用DAS(3.2.8)软件计算药代动力学参数。

结果如图1和表2显示，GM-RY-L1H2-Fc4、GM-RY-L2H2-Fc4和GM-RY-L3H2-Fc4的体内代谢性质与对照的度拉糖肽没有显著差异，其中使用L2连接子(SEQ ID NO:28)的GM-RY-L2H2-Fc4具有最好的半衰期，暴露量与对照相当。

表2 药代动力学检测结果

实施例3 使用不同铰链区的融合蛋白的药代动力学检测

根据实施例2的方法，检测本申请融合蛋白GM-ARY-L2H2-Fc4和GM-ARY-L2H1-Fc4的体内药代动力学。样本进行ELISA检测。使用DAS(3.2.8)软件计算药代动力学参数。

结果如图2和表3显示，GM-ARY-L2H2-Fc4和GM-ARY-L2H1-Fc4的体内半衰期相当，其中使用IgG1的铰链区(SEQ ID NO:30)的GM-ARY-L2H1-Fc4的暴露量较好。

表3 药代动力学检测结果

实施例4 使用Fc区包含YTE突变的融合蛋白的药代动力学检测

使用食蟹猴检测本申请融合蛋白GM-RY-L2H1-Fc4m和GM-ARY-L2H1-Fc4m的体内药代动力学。实验每组2只食蟹猴，雌雄各半，每组分别单次皮下注射给予对应供试品(1mg/kg)，DULA(IgG4的Fc区未进行YTE突变的度拉糖肽)和DULA-Fc4m(IgG4的Fc区进行YTE突变的度拉糖肽)作为对照。分别于给药前和给药后4h、8h、24h、48h、72h、120h、168h、264h、336h、504h、672h、840h和1008h采集血样。分离血清，ELISA法测定给予受试物后食蟹猴血清中受试物的浓度。使用DAS(3.2.8)软件计算药代动力学参数。

结果如图3、图4、表4和表5显示，其中表4的数据来自图3的曲线，表5的数据来自图4的曲线。与同样包含YTE突变的度拉糖肽相比，本申请的GM-RY-L2H1-Fc4m(图3和图4)和GM-ARY-L2H1-Fc4m(图4)具有更好的体内半衰期和暴露量；而度拉糖肽的Fc区进行YTE突变的效果较弱，与未突变的度拉糖肽相比，Fc区的YTE突变并没有提升度拉糖肽的体内半衰期和暴露量(图4)。

结合图1的数据，未进行Fc区YTE突变的本申请融合蛋白的半衰期或暴露量与度拉糖肽相当，而Fc区进行YTE突变后的本申请融合蛋白的半衰期和暴露量均显著高于度拉糖肽。这说明Fc区的YTE突变显著提升了本申请融合蛋白的药代动力学性质，且融合蛋白的人GLP-1多肽变体的氨基酸突变和Fc区的YTE突变对药代动力学性质的提升具有协同效果。

表4 药代动力学检测结果

表5 药代动力学检测结果

参数

AUC(0-t)

t1/2

Tmax

Cmax

	ug/L*h	h	h	ug/L
DULA 1mg/kg SC	167169.546	29.517	8	2688.837
DULA-Fc4m 1mg/kg SC	121353.801	28.9625	8	2956.3575
GM-RY-L2H1-Fc4m 1mg/kg SC	331986.252	82.9165	28	2867.4045
GM-ARY-L2H1-Fc4m 1mg/kg SC	379488.618	100.2185	8	3445.402

实施例5 使用不同铰链区的Fc区YTE突变的融合蛋白的药代动力学检测

根据实施例4的方法，检测本申请包含Fc区YTE突变的融合蛋白GM-ARY-L2H2-Fc4m、GM-RY-L2H2-Fc4m、GM-ARY-L2H1-Fc4m和GM-RY-L2H1-Fc4m的体内药代动力学。样本进行ELISA检测。使用DAS(3.2.8)软件计算药代动力学参数。

结果如图5和表6显示，四种融合蛋白的体内半衰期或暴露量均较好，其中使用IgG1的铰链区(SEQ ID NO:30)的融合蛋白的综合效果较好。

表6 药代动力学检测结果

实施例6 荧光素酶法检测本申请融合蛋白对cAMP/PKA信号通路的激活作用

利用GLP-1多肽变体的融合蛋白结合GLP-1受体，激活腺苷酸环化酶，促进细胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平升高的原理，基于CREB(cAMP反应元件结合蛋白)报告基因检测本申请融合蛋白对cAMP/PKA信号通路的激活作用。利用人GLP-1R质粒和CREB驱使的荧光素酶报告质粒转染HER293细胞。转染后，消化收集HER293-GLP1R-CREB-D4细胞，计数，用含有10％FBS的DMEM培养基调整细胞数至4×10 ⁵细胞/ml，接种至96孔板，每孔50μl。使用含有10％FBS的DMEM培养基将待测样品从1000ng/ml起被稀释为9个浓度；度拉糖肽作为阳性对照。上述96孔板每孔再加入50μl一系列浓度的待测样品，37℃孵育数小时。弃去上清，每孔加入荧光素酶底物。室温放置5min后，取出50μl，使用荧光素酶分析系统Bio-Glo ^TM Luciferase Assay System(Promega,G7940)检测荧光素酶的活性，并且用酶标仪(Molecular Devices,SpectraMax M3)进行读数。荧光强度体现cAMP的水平，从而反应GLP- 1受体激活的程度。

结果如图7所示，本申请的融合蛋白具备与度拉糖肽相当水平的GLP-1受体激活能力。

实施例7 不同突变形式的GLP-1多肽变体的检测

本申请的实施例中使用的阳性对照度拉糖肽(Dulaglutide)为本领域已知的糖尿病药物，代号LY-2189265，度拉糖肽在本申请中称为GLP-1-Fc或DULA或KN042。

制备人GLP-1多肽变体的Fc融合蛋白，可以将包含编码该人GLP-1多肽变体的Fc融合蛋白核酸序列的载体转入细胞，表达纯化得融合蛋白。融合蛋白从N端至C端依次包含GLP-1多肽变体(氨基酸序列如下表所示)、连接肽(G4S) ₃和源自IgG4的Fc区及铰链区。示例性的人GLP-1多肽变体序列如下表所示。

(1)融合蛋白与GLP-1受体的结合亲和力检测

使用ELISA检测实施例1中的融合蛋白与GLP-1受体的结合亲和力。表达GLP-1受体和小鼠Fc的融合蛋白，称为GLP1R-muFc(SEQ ID NO：3)，将GLP1R-muFc稀释至5μg/ml，包被96孔板，室温固定30min。PBS清洗1次后用1％BSA 37℃封闭30min，0.05％PBST20清洗3次。每孔加入50μl，10μg/ml，4倍浓度梯度稀释的待测样品，KN042为阳性对照。37℃孵育1小时，PBST清洗5次。每孔加入50μl用含有1％BSA的0.05％PBST20稀释2000倍的小鼠单克隆HP6023抗人IgG4Fc-HRP(abcam,ab99817)，37℃孵育1小时，PBST清洗5次。每孔加入50μl TMB显色3min，加入50μl/孔1M H ₂SO ₄终止反应，用酶标仪(Molecular Devices,SpectraMax M3)进行检测OD值。KN042作为阳性对照。

结果如图8所示。包含双突变的部分融合蛋白表现出与GLP-1受体良好的结合活性。

(2)融合蛋白对cAMP/PKA信号通路的激活作用的荧光素酶法检测

参考本申请实施例6对于融合蛋白对cAMP/PKA信号通路的激活作用的荧光素酶法检测的方法，结果如图9所示。

结果显示，本申请要求保护的融合蛋白均能激活GLP-1受体，从而激活cAMP/PKA信号通路。

(3)融合蛋白的药代动力学检测

参考本申请实施例2对于融合蛋白的药代动力学检测的方法，结果如图10所示。图10A显示的是本申请的融合蛋白GM-KRWY的半衰期比度拉糖肽长，为16.199h，且药物暴露量高于度拉糖肽，且血药浓度相近。图10B显示的是本申请的融合蛋白GM-KRWYYL、GM-KRWYYA和GM-KRWYYI的半衰期比度拉糖肽长，为约13h至16.5h，且药物暴露量和血药浓度高于度拉糖肽。图10C显示的是本申请的融合蛋白GM-KRWYQN、GM-KRWYQE和GM-KRWYYA的半衰期比度拉糖肽长，为约22h至25h，且药物暴露量和血药浓度高于度拉糖肽。

(4)融合蛋白的口服糖耐量检测

考察GLP-1-Fc融合蛋白的体内降血糖活性。小鼠禁食过夜，实验前测量血糖和体重后随机分组。腹腔注射各组小鼠相对应供试品，度拉糖肽作为对照。给药后0.5h应用1.5g/kg的葡萄糖口服负荷各小鼠。小鼠于葡萄糖负荷前，负荷后10、20、30、60和120min，使用手持式罗氏血糖仪(Roche，Accu-chek)测量小鼠尾尖血糖值。切除小鼠尾尖约1mm，从尾根部向尾尖挤压静脉采血测量血糖值。结果如图11所示。

结果显示，与对照相比，本申请的融合蛋白GM-KRWY、GM-KRWYYA和GM-KRWYQE能够具有同等水平的体内降血糖活性。

前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方式的范围内。

Claims

融合蛋白，其包含人GLP-1多肽变体和免疫球蛋白Fc区；

其中与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列包含至少2个氨基酸突变，所述至少2个氨基酸突变位于选自下组的氨基酸位置处：W31、K26和Y19。
根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区位于所述人GLP-1多肽变体的C端。
根据权利要求1-2中任一项所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区为源自IgG的Fc区。
根据权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区为源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区。
根据权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区为源自IgG4的Fc区。
根据权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区包含如SEQ ID NO:32-35中任一项所示的氨基酸序列。
根据权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区包含氨基酸突变，与未经所述氨基酸突变的免疫球蛋白Fc区相比，所述氨基酸突变使得所述免疫球蛋白Fc区与Fc受体的结合亲和力选择性增强。
根据权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区在根据EU编码的M252、S254和T256位置处包含氨基酸突变。
根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区包含下组的氨基酸突变：M252Y、S254T和/或T256E。
根据权利要求9所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区的氨基酸突变为M252Y、S254T和T256E。
根据权利要求7-10中任一项所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
根据权利要求1-11中任一项所述的融合蛋白，其包含铰链区，且所述铰链区位于所述人GLP-1多肽变体和所述免疫球蛋白Fc区之间。
根据权利要求12所述的融合蛋白，其中所述铰链区源自IgG。
根据权利要求12-13中任一项所述的融合蛋白，其中所述铰链区源自IgG1或IgG4。
根据权利要求12-14中任一项所述的融合蛋白，其中所述铰链区包含如SEQ ID NO:30-31中任一项所示的氨基酸序列。
根据权利要求12-15中任一项所述的融合蛋白，其中所述铰链区源自IgG1。
根据权利要求16所述的融合蛋白，其中所述铰链区包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。
根据权利要求1-17中任一项所述的融合蛋白，其还包含连接子，且所述连接子位于所述人GLP-1多肽变体和所述铰链区之间。
根据权利要求18所述的融合蛋白，其中所述连接子为肽连接子。
根据权利要求18-19中任一项所述的融合蛋白，其中所述连接子具有5-20个氨基酸长度。
根据权利要求18-20中任一项所述的融合蛋白，其中所述连接子具有15个氨基酸长度。
根据权利要求18-21中任一项所述的融合蛋白，其中所述连接子包含如SEQ ID NO:27-29中任一项所示的氨基酸序列。
根据权利要求18-22中任一项所述的融合蛋白，其中所述连接子包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
根据权利要求1-23中任一项所述的融合蛋白，其中所述人GLP-1多肽变体具有人GLP-1的至少部分活性。
根据权利要求1-24中任一项所述的融合蛋白，其中与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列包含W31和K26氨基酸位置处的突变。
根据权利要求1-25中任一项所述的融合蛋白，其中与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列包含W31和Y19氨基酸位置处的突变。
根据权利要求1-26中任一项所述的融合蛋白，其中与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列包含K26和Y19氨基酸位置处的突变。
根据权利要求1-27中任一项所述的融合蛋白，其中与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列包含W31、K26和Y19氨基酸位置处的突变。
根据权利要求1-28中任一项所述的融合蛋白，其中所述人GLP-1多肽变体在所述W31处包含氨基酸取代，所述氨基酸取代为W31Y、W31R、W31K或W31A。
根据权利要求29所述的融合蛋白，其中所述人GLP-1多肽变体在所述W31处包含氨基酸取代，所述氨基酸取代为W31Y。
根据权利要求1-30中任一项所述的融合蛋白，其中所述人GLP-1多肽变体在所述Y19处包含氨基酸取代，所述氨基酸取代为选自下组的任意一种氨基酸取代：Y19A、Y19L、Y19T、Y19F、Y19I、Y19V和Y19S。
根据权利要求31所述的融合蛋白，其中所述人GLP-1多肽变体在所述Y19处包含氨基酸取代，所述氨基酸取代为选自下组的任意一种氨基酸取代：Y19A。
根据权利要求1-32中任一项所述的融合蛋白，其中所述人GLP-1多肽变体在所述K26处包含氨基酸取代，所述氨基酸取代为K26R。
根据权利要求1-33中任一项所述的融合蛋白，其中所述人GLP-1多肽变体包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
根据权利要求1-34中任一项所述的融合蛋白，其中所述人GLP-1多肽变体包含SEQ ID NO:4-25中任一项所示的氨基酸序列。
根据权利要求1-35中任一项所述的融合蛋白，其中与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列包含的氨基酸突变为W31Y、K26R和Y19A。
根据权利要求36所述的融合蛋白，其中所述人GLP-1多肽变体包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
根据权利要求1-35中任一项所述的融合蛋白，其中与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述人GLP-1多肽变体的氨基酸序列包含的氨基酸突变为W31Y和K26R。
根据权利要求38所述的融合蛋白，其中所述人GLP-1多肽变体包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
根据权利要求1-39中任一项所述的融合蛋白，其包含所述人GLP-1多肽变体和所述免疫球蛋白Fc区。
根据权利要求12-40中任一项所述的融合蛋白，其包含所述人GLP-1多肽变体和所述铰链区。
根据权利要求12-41中任一项所述的融合蛋白，其包含所述人GLP-1多肽变体、所述免疫球蛋白Fc区和所述铰链区。
根据权利要求18-42中任一项所述的融合蛋白，其自N端至C端，依次包含所述人GLP-1多肽变体，所述连接子，所述铰链区以及所述免疫球蛋白Fc区。
根据权利要求1-43中任一项所述的融合蛋白，其包含如SEQ ID NO:37-45中任一项所示的氨基酸序列。
根据权利要求1-44中任一项所述的融合蛋白，其包含如SEQ ID NO:43-44中任一项所示的氨基酸序列。
分离的核酸分子，其编码权利要求1-45中任一项所述的融合蛋白。
载体，其包含权利要求46所述的分离的核酸分子。
细胞，其包含或表达权利要求1-45中任一项所述的融合蛋白、权利要求46所述的分离的核酸分子或权利要求47所述的载体。
药物组合物，其包含权利要求1-45所述的融合蛋白、权利要求46所述的分离的核酸分子、权利要求47所述的载体和/或权利要求48所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
免疫缀合物，其包含权利要求1-45任一所述的融合蛋白。
权利要求1-45中任一项所述的融合蛋白、权利要求46所述的分离的核酸分子、权利要求47所述的载体、权利要求48所述的细胞、权利要求49所述的药物组合物和/或权利要求50所述的免疫缀合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗代谢性疾病或病症。
根据权利要求51所述的用途，其中所述代谢性疾病或病症包括GLP-1相关代谢性病症。
根据权利要求51-52中任一项所述的用途，其中所述代谢性疾病或病症包括糖尿病。
预防和/或治疗代谢性疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用权利要求1-45中任一项所述的融合蛋白、权利要求46所述的分离的核酸分子、权利要求47所述的载体、权利要求48所述的细胞、权利要求49所述的药物组合物和/或权利要求50所述的免疫缀合物。
根据权利要求54所述的方法，其中所述代谢性疾病或病症包括GLP-1相关代谢性病症。
根据权利要求54-55中任一项所述的方法，其中所述代谢性疾病或病症包括糖尿病。
权利要求1-45中任一项所述的融合蛋白、权利要求46所述的分离的核酸分子、权利要求47所述的载体、权利要求48所述的细胞、权利要求49所述的药物组合物和/或权利要求50所述的免疫缀合物，其用于预防和/或治疗代谢性疾病或病症。
根据权利要求57所述的融合蛋白、分离的核酸分子、载体、细胞和/或药物组合物，其中所述代谢性疾病或病症包括GLP-1相关代谢性病症。
根据权利要求57-58中任一项所述的融合蛋白、分离的核酸分子、载体、细胞和/或药物组合物，其中所述代谢性疾病或病症包括糖尿病。
增加或促进有需要的受试者中胰岛素表达的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-45中任一项所述的融合蛋白、权利要求46所述的分离的核酸分子、权利要求47所述的载体、权利要求48所述的细胞、权利要求49所述的药物组合物和/或权利要求50所述的免疫缀合物。