KR102349718B1 - 신규 이중 특이성 단백질 및 그의 용도 - Google Patents

신규 이중 특이성 단백질 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 이중 특이성 융합단백질 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체가 융합된 이중 특이성 융합단백질 또는 GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질 및 그를 유효성분으로 포함하는 장의 증식을 필요로 하는 질환 또는 증상 또는 비만, 제2형 당뇨병 및 비알코올성 지방간염과 같은 대사성 질환의 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

신규 이중 특이성 단백질 및 그의 용도{A novel bispecific protein and use thereof}
본 발명은 신규 이중 특이성 단백질 및 그의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로는 GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체를 포함하는 이중 특이성 단백질 및 그의 용도에 관한 것이다.
GLP-1 및 GLP-2는 모두 프로글루카콘이라는 전구체로 발현되어 일련의 조직특이적 단백질 절단 과정을 거쳐서 생성이 되는 펩타이드 호르몬이다. 이 중, GLP-1은 음식 섭취 시 소장의 장내분비(enteroendocrine) L-세포 및 뇌간(brain stem)의 고립 속(solitary tract) 핵 내의 특정 신경세포에서 생산되어 분비되는데, 최초 산물인 GLP-1(1-37)은 쉽게 아마이드화되며 절단에 의해 두 가지의 동등한 생물학적 활성을 가진 절단된 형태(GLP-1(7-36) 아마이드 및 GLP-1(7-37))로 전환되며 활성 GLP-1은 포도당-의존적으로 혈당 수준을 낮추는 역할을 수행하기 때문에, 제2형 당뇨병 치료제로 개발되어 사용되고 있다. 아울러, GLP-2는 GLP-1과 마찬가지로 프로글루카곤의 특별한 번역 후 절단 공정에 의해 생성되는 33 아미노산 길이의 펩타이드로서 소장의 장내분비 L 세포와 중추신경계의 다양한 신경세포에서 생산이 되며, 음식 섭취 시 소장에서 GLP-1과 함께 분비가 된다. GLP-2의 경우 투여 시 소장 성장 및 기능을 향상시키고, 뼈의 파괴를 감소시키며 신경보호작용을 하는 것으로 알려지고 있어, 현재 단장증후군이나 크론병, 골다공증과 같은 질환의 치료제로 개발되고 있다.
GLP-1은 상술한 바와 같이 원래 제2형 당뇨병 환자의 치료에서 포도당 항상성에 대한 유익한 효과로 주목을 받았으나(Gutniak et al., N. Engl. J. Med. 326: 1316-1322, 1992), 이 역시 GLP-2와 유사하게 위장 분비와 운동성을 감소시킨다는 연구결과를 통해 단장증후군의 치료에서의 역할이 암시된 바 있다(Kunkel et al., Neurogastroenterol. Motil. 23: 739-e328, 2011). 아울러, GLP-1에 의한 GLP1R 신호전달 체계의 활성화에 의해 장의 성장 및 소장샘 세포(crypt cell)의 융합이 촉진되는 것이 보고된 바 있다(Koehler et al., Cell Metabol. 21(3): 379-391, 2015). 이러한 기전을 바탕으로, Naia 사에서는 GLP-1에 반감기 연장 펩타이드인 XTEN이 연결된 GLP-1-XTEN을 이용하여 단장증후군에 대한 임상 1상 시험을 진행 중에 있다. 더 나아가, GLP-1과 GLP-2의 병용 투여 시 각각의 펩타이드 단독 투여 시에 비해 소장 흡수에 있어서 상가적인 효과가 나타났다고 보고된 바 있다(Madsen et al., Regul. Pept. 184: 30-39, 2013).
한편, 비알코올성 지방간질환(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 한 가지 병이라기보다 염증을 동반하지 않는 단순 지방간에서부터 만성 간염, 간경변증에 이르는 다양한 형태의 간질환을 포함하며, 비만 및 그에 따른 인슐린 저항성과 밀접하게 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. 비알코올성 지방간질환은 단순히 지방만 끼어 있고 간세포 손상은 없는 가벼운 지방간으로부터, 간세포 손상이 심하고 지속되는 지방간염, 심지어는 복수나 황달 등을 동반하는 간섬유화 또는 간경변증(간경화)이 생기는 경우까지 병의 정도가 매우 다양할 수 있으며, 더 진행되면 간암으로까지 진행되는 것으로 알려져 있을 뿐 아니라, 서구적인 식습관의 만연에 따른 서구형 질환으로 발생 빈도가 급격하게 증가하고 있는 질환이다. 대부분의 비알코올성 지방간질환은 가벼운 병이지만, 심한 지방간 환자 4명 중에 한 명은 치료를 하지 않고 방치되었을 경우 서서히 시간이 지남에 따라 심각한 간질환인 간경변증(또는 간섬유증)으로 진행하는 바, 결코 무시할 수 있는 증상이 아니라고 할 수 있다. 비알코올성 지방간질환의 유병률은 인구집단의 특성에 따라 다양하게 보고되는데 일반인의 10~24%, 비만인의 58~74%까지 보고되고 있다. 그러나, 현재까지 비알코올성 지방간질환 또는 비알코올성 지방간염의 치료제로 승인된 약물은 아직까지 없는 상황으로, 비알코올성 지방간질환의 치료제의 개발은 매우 시급한 과제로 간주되고 있다.
아울러, GLP-1R 단독 작용제와 비교하여 더 우수한 효과를 나타내는 GLP-1R 및 GLP-2R 이중 작용제를 이용한 비알코올성 지방간염 등의 대사증후군 치료제는 아직까지 개발된 바 없다.
본 발명은 상술한 문제점을 포함하여 여러 가지 문제점을 해결하기 위한 것으로서, GLP-1 및 GLP-2의 기능을 유지하면서도 기존 GLP-2 유사체 및 GLP-1 유사체의 단점을 개선할 수 있으며, 비알코올성 지방간과 같은 대사증후군의 치료에 있어서 효과적인 새로운 이중 특이성 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나, 본 발명의 보호범위가 상기 목적으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체가 융합된 이중 특이성 융합단백질이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 상기 이중 특이성 융합단백질을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면 상기 중 어느 하나 이상의 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 비알코올성 지방간염의 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면 상기 중 어느 하나 이상의 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 대사증후군 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면 상기 중 어느 하나 이상의 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 비만 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면 상기 중 어느 하나 이상의 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 제2형 당뇨병 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면 상기 중 어느 하나 이상의 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 간 섬유증 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 이중 특이성 융합단백질을 장의 증식을 필요로 하는 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 장의 증식을 필요로 하는 질환 또는 증상의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 이중 특이성 융합단백질을 대사증후군에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 대사증후군의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 이중 특이성 융합단백질을 비만 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 비만 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 이중 특이성 융합단백질을 제2형 당뇨병에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 제2형 당뇨병의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 이중 특이성 융합단백질을 비알코올성 지방간질환 또는 비알코올성 지방간염에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 비알코올성 지방간질환 또는 비알코올성 지방간염의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 이중 특이성 융합단백질을 간 섬유증에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 간 섬유증의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 이중 특이성 융합단백질은 생체 내 투여 시 장 증식을 유의하게 증가시켜 장 증식을 필요로 하는 질환 예컨대 단장증과 같은 질환 또는 대사증후군, 비만, 제2형 당뇨병, 비알코올성 지방간질환, 간 섬유증과 같은 대사성 질환의 치료에 매우 효율적으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질의 개략적인 구조를 나타내는 개요도이다.
도 2는 다양한 GLP-1 및/또는 GLP-2 유사체와 GLP-1 수용체, GLP-2 수용체 및 다른 글루카곤 수용체 사이의 상호작용 관계를 나타내는 개요도이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 이중 특이성 융합 단백질을 정제한 후 비환원(NR) 및 환원(R) 조건에서 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 일련의 겔 사진이다:
M: size marker;
1: MG12-1(5 ㎍);
2: MG12-2(5 ㎍);
3: MG12-3(5 ㎍);
4: MG12-4(5 ㎍); 및
5: MG12-5(5 ㎍).
도 3b는 GLP-2 동형 이량체(GLP-2-Fc homodimer, 좌측)와 Knobs-into-Holes 구조를 포함한 MG12-5(우측)을 정제한 후 비환원(NR) 및 환원(R) 조건에서 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 일련의 겔 사진이다:
M: size marker;
1 & 2: GLP-2-Fc homo(10 ㎍); 및
3 & 4: MG12-5(10 ㎍).
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-6을 환원 및 비환원 조건에서 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 일련의 겔 사진(좌측) 및 정제된 단백질에 대한 HPLC 결과를 나타내는 크로마토그램(우측)이다:
M: size marker;
1: MG12-6; 및
C: Ctrl (3 μg)-Herceptin.
도 3d는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-7 및 MG12-8을 환원 및 비환원 조건에서 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 일련의 겔 사진(좌측) 및 정제된 단백질에 대한 HPLC 결과를 나타내는 크로마토그램(우측)이다:
M: size marker;
1: MG12-7;
2: MG12-8; 및
3: Ctrl (3 μg)-Herceptin.
도 3e는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-9를 환원 및 비환원 조건에서 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타내는 겔 사진(상단) 및 정제된 단백질에 대한 HPLC 결과를 나타내는 크로마토그램(하단)이다. 상기 크로마토그램 위쪽은 사이즈 마커를 나타낸다:
1: Reducing MG12-9;
2: Non-reducing MG12-9; 및
3: Ctrl (3 μg)-BSA.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-1-Fc 동형 이량체 단백질과 GLP-1 펩타이드의 생물학적 활성을 루시퍼레이즈 리포터 어세이로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-1의 생물학적 활성을 GLP-1 펩타이드와 비교하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-3의 생물학적 활성을 GLP-1 펩타이드와 비교하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4d는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-4의 생물학적 활성을 GLP-1 펩타이드와 비교하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4e는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-5의 생물학적 활성을 GLP-1 펩타이드와 비교하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-2-Fc 동형 이량체 단백질의 GLP-2 활성을 GLP-2 펩타이드와 비교하여 형광분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-1 단백질의 GLP-2 활성을 GLP-2 펩타이드와 비교하여 형광분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-3 단백질의 GLP-2 활성을 GLP-2 펩타이드와 비교하여 형광분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5d는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-4 단백질의 GLP-2 활성을 GLP-2 펩타이드와 비교하여 형광분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5e는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-5 단백질의 GLP-2 활성을 GLP-2 펩타이드와 비교하여 형광분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-1-Fc 동형 이량체의 GLP-1 활성을 루시퍼레이즈 리포터 분석으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-2-Fc 동형 이량체의 GLP-2 활성을 형광분석으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-2 단백질의 GLP-1 활성을 루시퍼레이즈 리포터 분석으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6d는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-2 단백질의 GLP-2 활성을 형광분석으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 이중 특이성 융합단백질을 동물(랫트) 투여 시 약물동태학(pharmacokinetics, PK) 프로파일을 GLP-1-Fc를 이용한 ELISA 분석으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 이중 특이성 융합단백질을 동물(랫트) 투여 시 약물동태학(pharmacokinetics, PK) 프로파일을 GLP-2-Fc를 이용한 ELISA 분석으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 이량체 단백질(GLP-2-2G, GLP-2-Fc 동형 이량체 및 MG12-5)을 모델 동물에 투여 시 장의 무게를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 이량체 단백질(GLP-2-2G, GLP-2-Fc 동형 이량체 및 MG12-5)을 모델 동물에 투여 시 12일간의 체중의 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8c는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 이량체 단백질(GLP-2-2G, GLP-2-Fc 동형 이량체 및 MG12-5)을 모델 동물에 투여 전 에너지 흡수 비율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8d는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 이량체 단백질(GLP-2-2G, GLP-2-Fc 동형 이량체 및 MG12-5)을 모델 동물에 투여 후 1주 경과 시 에너지 흡수 비율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8d는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 이량체 단백질(GLP-2-2G, GLP-2-Fc 동형 이량체 및 MG12-5)을 모델 동물에 투여 후 2주 경과 시 에너지 흡수 비율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 이중 특이성 융합단백질(MG12-1 및 MG12-4) 및 대조군(GLP-1-Fc 동형 이량체 및 GLP-2-Fc 동형 이량체)을 모델 동물에 투여 후 13일 경과 시 소장의 무게의 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 이중 특이성 융합단백질(MG12-1 및 MG12-4) 및 대조군(GLP-1-Fc 동형 이량체 및 GLP-2-Fc 동형 이량체)을 모델 동물에 투여 후 13일 경과 시 체중의 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 이중 특이성 융합단백질(MG12-1 및 MG12-4) 및 대조군(GLP-1-Fc 동형 이량체)을 모델 동물에 투여 후 뇌, 소장 및 대장에서의 형광강도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 이종 특이성 융합단백질(MG12-1, MG12-4 및 MG12-5) 및 대조군들(Fc only, GLP-1-Fc 동형 이량체 및 GLP-2-Fc 동형 이량체)을 모델 동물에 투여 후 간, 소장 및 대장에서의 분포를 확인하기 위해 PET-MRI 분석을 수행한 결과를 나타내는 일련의 그래프이다.
도 12a는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 이종 특이성 융합단백질(MG12-1, MG12-3, MG12-4 및 MG12-5), 그리고 Exendin 4(Ex-4), GLP-2-2G, 및 Exendin 4와 GLP-2-2G의 조합(Ex-4 + GLP-2-2G)을 실험동물에 12일간 투여 시, 소장의 무게를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12b는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 이종 특이성 융합단백질(MG12-1, MG12-3, MG12-4 및 MG12-5), 그리고 Exendin 4(Ex-4), GLP-2-2G, 및 Exendin 4와 GLP-2-2G의 조합(Ex-4 + GLP-2-2G)을 실험동물에 12일간 투여 시, 사료 섭취 대비 체중증가율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12c는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 이종 특이성 융합단백질(MG12-1, MG12-3, MG12-4 및 MG12-5), 그리고 Exendin 4(Ex-4), GLP-2-2G, 및 Exendin 4와 GLP-2-2G의 조합(Ex-4 + GLP-2-2G)을 실험동물에 12일간 투여 후, 실험동물로부터 십이지장(Duodenum)을 적출하여 점막 깊이(mucosal depth) 및 융모의 높이(villi height)를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12d는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 이종 특이성 융합단백질(MG12-1, MG12-3, MG12-4 및 MG12-5), 그리고 Exendin 4(Ex-4), GLP-2-2G, 및 Exendin 4와 GLP-2-2G의 조합(Ex-4 + GLP-2-2G)을 실험동물에 12일간 투여 후, 실험동물로부터 공장(jejunum)을 적출하여 점막 깊이(mucosal depth) 및 융모의 높이(villi height)를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13a는 본 발명의 콜린 결핍 고지방 식이에 따른 대사 증후군 모델 동물에 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12의 투여 스케쥴을 개략적으로 나타낸 개요도이다.
도 13b는 상기 도 13a에 도시된 실험 스케쥴에 따라 수행된 동물실험에서 시간의 경과에 따른 체중의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 13c는 상기 도 13a에 도시된 실험 스케쥴에 따라 수행된 동물실험에서 약물 투여 후 시간의 경과에 따른 체중의 상대 변화를 보다 상세하게 나타낸 그래프이다.
도 13d는 상기 도 13a에 도시된 실험 스케쥴에 따라 수행된 동물실험에서 섭취한 사료의 양을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14a는 상기 도 13a에 도시된 실험 스케쥴에 따라 수행된 동물시험에 사용된 각 실험군에 대하여 수행된 복강내당 분석 결과를 나타내는 그래프로 12시간 사료 제한을 한 후 2 g/kg의 투여량으로 포도당을 복강투여한 후 시간별로 총 3시간 동안 측정한 혈당량을 기록한 것이다.
도 14b는 상기 도 14a의 실험결과를 혈당 변화 곡선하 면적(AUC)으로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 15a는 상기 도 13a에 도시된 실험 스케쥴에 따라 수행된 동물실험 종료 후 희생된 각 실험군의 실험동물에서 적출된 간 조직을 촬영한 사진이다.
도 15b는 상기 도 15a의 실험동물의 각 실험군별로 간조직의 중량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 15c는 상기 도 15a의 실험동물의 각 실험군별로 혈중 AST 수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16a는 중증 비알코올성 지방간염(severe NASH) 유발 동물 모델의 제조과정 및 본 발명의 일 실시예에 따른 MG-12, 음성대조군(vehicle) 및 양성대조군으로서 obeticholic acid(OCA)를 투여하는 동물 실험의 투여 스케쥴을 나타낸 개요도이다.
도 16b는 상기 도 16a에 도시된 실험 스케쥴대로 수행된 동물실험의 8주차부터 각 실험군별로 시간의 경과에 따른 체중의 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16c는 도 16a에 도시된 실험 스케쥴대로 수행된 동물실험 종료 후 각 실험군별로 희생된 실험동물에서 적출된 간 조직의 중량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16d는 도 16a에 도시된 실험 스케쥴대로 수행된 동물실험에서 각 실험군별로 혈중 AST(좌측) 및 ALT(우측) 수준을 측정한 결과를 나타내는 일련의 그래프이다.
도 16e는 도 16a에 도시된 실험 스케쥴대로 수행된 동물실험에서 각 실험군별로 NAFLD 활성 지수를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "GLP-1"은 "글루카곤-유사 펩타이드-1(glucagon-like peptide-1)"의 약어로서 프로글루카곤 펩타이드의 조직특이적인 번역 후 가공에 의해 유도되는 30 또는 31 아미노산 길이의 펩타이드 호르몬이다. GLP-1은 음식 섭취 시 소장의 장내분비(enteroendocrine) L-세포 및 뇌간(brain stem)의 고립 속(solitary tract) 핵 내의 특정 신경세포에서 생산되어 분비된다. 최초 산물인 GLP-1(1-37)은 쉽게 아마이드화되며 절단에 의해 두 가지의 동등한 생물학적 활성을 가진 절단된 형태(GLP-1(7-36) 아마이드 및 GLP-1(7-37))로 전환된다. 활성 GLP-1은 아미노산 위치 13-20 및 24-35의 두 개의 알파-나선 부위와 상기 두 알파-나선 부위를 연결하는 링커 지역을 포함한다. GLP-1은 포도당-의존적으로 혈당 수준을 낮추는 역할을 수행하기 때문에, 제2형 당뇨병 치료제로 개발되어 사용되고 있다. 그러나, 생체 내에서 GLP-1은 디펩티딜 펩티데이즈-4(DPP-4)에 의해 신속하게 분해되기 때문에 생체 내 반감기가 2분에 불과하여, 자연 상태의 펩타이드로는 그 효과가 극히 제한적이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "GLP-2"는 GLP-1과 마찬가지로 프로글루카곤의 번역 후 절단 공정에 의해 생성되는 33 아미노산 길이의 펩타이드로서 소장의 장내분비 L 세포와 중추신경계의 다양한 신경세포에서 생산이 된다. GLP-2는 음식 섭취 시 GLP-1과 함께 분비가 된다. GLP-2의 경우 투여 시 소장 성장 및 기능을 향상시키고, 뼈의 파괴를 감소시키며 신경보호작용을 하는 것으로 알려지고 있어, 현재 단장증후군이나 크론병, 골다공증과 같은 질환의 치료제로 개발되고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "GLP-1 유사체"는 생물학적으로 GLP-1의 기능을 수행하는 단백질로서 GLP-1/Exendin-4 수용체에 결합하여 하류 신호전달을 매개할 수 있는 단백질을 의미하며, "GLP-1 수용체 작용제"로도 지칭된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "GLP-2 유사체"는 생물학적으로 GLP-2의 기능을 수행하는 단백질로서 GLP-2 수용체에 결합하여 하류 신호전달을 매개할 수 있는 단백질을 의미하며, "GLP-2 수용체 작용제"로도 지칭된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "융합단백질"은 둘 이상의 단백질 또는 단백질 내 특정 기능을 담당하는 도메인이 각각의 단백질 또는 도메인이 본연의 기능을 담당하도록 연결된 재조합 단백질(recombinant protein)을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "반감기 증가 모이어티"는 재조합 단백질에 연결되어, 당해 재조합 단백질의 체내 반감기를 향상시키기 위한 기능기를 의미한다. 이러한 "반가기 증가 모이어티"로는 항체 Fc 영역(Capon et al., Nature. 337: 525-531, 1989), PEG(Caliceti and Veronese, Adv. Drug Delivery Rev. 55: 1261-1277, 2003), XTEN(Schellenberger et al., Nat. Biotechnol. 27: 1186-1190, 2009), PAS(Pro-Ala-Ser, Schlapschy et al., Protein Eng. Des. Sel. 26: 489-501, 2013), ELP(elastine-like peptide, Floss et al., Trends Biotechnol. 28: 37-45, 2010), 글리신-풍부 HAP(homo-amino-acid polymer, Schlapschy et al., Protein Eng. Des. Sel. 20: 273-284, 2007), GLK(gelatine-like protein, Huang et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 74(3): 435-441, 2010), 및 혈청 알부민(Sheffield et al., Cell Physiol. Biochem., 45(2): 772-782, 2018) 등이 사용될 수 있으며, 이와 같은 단백질에 부가되는 "반감기 증가 모이어티"에 대하여는 리뷰논문 등을 통해 잘 알려져 있다(Strohl, W. R., BioDrugs, 29(4): 215-239, 2015). 이에, 상기 개별 인자들에 대한 선행논문 및 상기 리뷰논문들은 본 문서에 참조로 삽입이 된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "항체 Fc 영역"은 항체를 파파인으로 절단하였을 때 생성되는 단편 중 결정화되는 단편(crystalized fragment)을 의미하며, Fc 수용체라고 지칭되는 세포 표면 수용체 및 보체계(complement system)의 몇몇 단백질과 상호작용을 한다. Fc 영역은 중쇄의 두 번째 및 세 번째 불변 영역(CH2 및 CH3)을 포함하는 단편이 힌지 부분에서 분자 간 이황화 결합에 의해 연결된 동형 이량체 구조를 나타낸다. IgG의 Fc 영역은 다수의 N-글리칸 부착 부위를 가지고 있으며, 이는 Fc 수용체-매개 작용에 있어서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "하이브리드 Fc 영역"은 다양한 서브타입의 Ig Fc 영역의 부분들의 조합에 의해 생성된 Fc 영역 펩타이드를 의미하며, 이러한 Fc 영역의 부분들의 조합에 의해 Fc 수용체 및 보체와의 결합능에 있어서 야생형 Fc 영역과 차이를 나타낼 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Exendin"은 도마뱀 Heloderma suspectum의 독에서 분리된 39 아미노산으로 구성된 펩타이드이다. Exendin 4는 GLP-1과 아미노산 서열상 50% 동일하며, 글루카곤 펩타이드 패밀리의 일원으로, GLP-1 수용체의 작용제로서 GLP-1과 동등한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. Exendin-4는 최근 및 "extenatide"로도 불린다. Exendin 3는 상기 Exendin 4에서 두 번째 및 세 번째 아미노산이 각각 세린 및 아스파르트산으로 치환된 변이체이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Lixisenatide"는 GLP-1 수용체 작용제 중 하나로서, Sanofi사에 의해 제조되어, 유럽에서는 Lyxumia라는 상표명으로, 미국에서는 Adlyxin이라는 상표명으로 제2형 당뇨병 치료를 위한 일일 투여 주사제로 판매되고 있는 약물이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Albiglutide"는 GSK사에 의해 유럽에서는 Eperzan이라는 상표명으로, 미국에서는 Tanzeum이라는 상표명으로 제2형 당뇨병 치료제로 판매되고 있는 GLP-1 수용체 작용제 중의 하나이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Liraglutide"는 Novo Nordisk사에 의해 "Victoza"라는 상표명으로 제2형 당뇨병 및 비만 치료제로 판매되고 있는 피하주사형 GLP-1 수용체 작용제이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Taspoglutide"는 Ipsen사와 Roche사에 의해 공동개발된 GLP-1 수용체 작용제로 제2형 당뇨병 치료제로, GLP-1(7-36) 펩타이드의 8번째 및 35번째 아미노산인 알라닌이 메틸화되어 있고 마지막 아미노산이 아마이드화되어 있는 GLP-1 유도체이다. 단, 다른 펩타이드와 융합단백질의 형태로 제조될 경우에는 C-말단이 아마이드화되지 않고 일반적인 카르복실기인 경우도 무방하다.
본 문서에서 사용되는 용어 "XTEN"은 Amunix사에 의해 개발된 단백질 의약품의 생체 내 반감기를 향상시키기 위해 부가되는 6개의 아미노산을 포함하는 비구조화된(unstructed) 저면역원성 펩타이드로서 통상 144 a.a를 단위로 하여 그의 배수의 아미노산으로 구성되어 있다(US20100239554A1).
본 문서에서 사용되는 용어 "Teduglutide"는 GLP-2의 2번째 아미노산인 알라닌(A)이 글라이신(G)로 치환된 돌연변이체로서 미국에서는 Gattex라는 상표명으로, 유럽에서는 Revestive라는 상표명으로 단장증후군 치료제로 판매되고 있는 GLP-2 유사체이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Glepaglutide"는 반감기가 향상된 GLP-2 유사체로 단장증후군 치료제로 개발되어 현재 단장증후군에 대하여 임상 3상시험을 진행 중인 약물이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "GLP-2 analogue 10"는 GLP-2 유사체 중 하나로서 GLP-2의 11번째 및 18번째 아미노산을 시스테인으로 치환하여 두 치환된 시스테인의 티올기를 통해 지질화된 분자 내 가교제가 연결됨으로써 안정화된 구조를 갖게 되고, C-말단에 Exendin 4의 C-말단의 9개 아미노산을 부가한 것을 특징으로 한다(Yang et al., J. Med. Chem. 61: 3218-3223, 2018).
본 문서에서 사용되는 용어 "링커 펩타이드"는 둘 이상의 다른 생물학적 활성을 가진 단백질 또는 펩타이드를 연결하여 융합단백질을 제조할 사용되는 비구조화된 펩타이드이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "흡수불량(malabsorption)"은 장관 특히, 소장에서 영양소가 일부 또는 전부 흡수되지 않아 생기는 질환을 말한다. 원인은 첫째, 1차적 선천적 이상으로서 젖당·설탕 등 이당류 분해효소의 결핍, 췌장·소장 등의 소화효소 결핍, 포도당과 비타민 B12 등 소장 점막의 전송장애 등을 들 수 있고, 둘째, 2차적 원인으로서 장질환 등으로 계속 흡수불량이 일어나는 경우로서, 이 밖에 장관 내의 효소가 부족하거나 정상 상태의 장내 세균이 변하는 경우, 췌장·간·담낭 등의 질환으로 소화가 잘 되지 않는 경우, 기생충·복통 등 장관 벽의 질환이 있는 경우, 장관절제 수술로 흡수 면적이 줄었을 경우 등을 들 수 있다. 위험 인자로는 알코올 과다섭취, 장관 수술, 가족 중 흡수불량이나 낭포성 섬유증 환자가 있는 경우, 광유 또는 다른 완화제를 사용한 경우 등이 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "염증성 장질환(inflammatory bowel disease)"은 장관 내 비정상적인 만성 염증이 호전과 재발을 반복하는 질환으로 흔히 궤양성 대장염과 크론병이 대표적이며 아직까지 명확한 발병기전은 밝혀져 있지 않고 있다. 염증성 장질환의 진단은 임상 증상, 내시경 및 조직병리 소견, 혈액검사소견, 영상의학검사 소견을 종합하여 이루어지며, 염증성 장질환은 증상이 없어지는 관해기와 악화되는 활동기가 반복되는 만성 질환으로 질환의 완치보다는 증상의 조절과 합병증 예방 및 삶의 질을 향상시키는 것을 치료 목적으로 하고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "궤양성 장염(ulcerative colitis)"은 크론병, 베체트병과 함께 염증성 장질환의 하나로, 대장에 원인 불명의 염증 또는 궤양이 만성적으로 생기는 질환이다. 정확한 원인은 아직 밝혀지지 않았다. 대부분의 경우 증상의 악화와 호전이 반복되는데, 현대의학으로는 완치가 어려운 난치성 질환이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "베체트병(Bechete's disease)"은 자가면역질환의 하나로 자가면역에 의해 신체에 존재하는 점막 특히 위장관의 점막이 헐게 되는 질병으로, 증상이 다양하고, 병소가 나타나는 부위 역시 개인에 따라 다르며, 신경계나 위장관계, 안구계, 혈관계와 같은 부위에 나타날 경우 치명적으로 발전할 수 있는 난치성 질환으로 현재까지 근본적인 치료법이 존재하지 않고 있다.
본 문서에서 사용되는 "단장증후군(short bowel syndrome, SBS)"은 흡수장애 질환으로, 소장의 일부를 수술에 의해 제거하거나 또는 상기 창자의 분절(segment)의 기능이상(dysfunction)에 의해서 유발될 수 있다. 예를 들면, 크론병(Crohn's disease), 소화관의 염증 장애, 창자꼬임(volvulus), 혈액공급이 차단되어 조직사 (tissue death)를 초래하는 소장의 자연 꼬임(spontaneous twisting), 소장의 종양, 소장의 상처 또는 외상, 괴사성 장염(necrotizing enterocolitis), 비만을 치료하기 위한 우회술(bypass surgery), 소장의 질병 및 손상된 부위를 제거하기 위한 수술과 관련된 수술에 의해서 대부분의 장애가 유발된다. 또한, 일부 유아는 선천적으로 짧은 창자를 가지고 태어나기도 한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "대사증후군(metabolic syndrome)"은 인슐린 저항성이 원인인 것으로 추정되는 질환으로 콜레스테롤, 혈압, 혈당치 중 2개 이상의 수치에 이상이 생기는 증상을 의미한다. 각종 심혈관 질환과 제2형 당뇨병의 위험 요인들이 서로 군집을 이루는 현상을 한 가지 질환군으로 개념화시킨 것이다. 인슐린 저항성(IR) 및 이와 관련된 복잡하고 다양한 여러 대사이상과 임상양상을 모두 포괄하여 설명할 수 있는 유용한 개념이다. 대사증후군을 방치하면, 동맥경화, 심근경색, 뇌졸중 등 심혈관 질환 혹은 제2형 당뇨병의 발병 위험도가 증가하는 것으로 알려져 있다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체가 융합된 이중 특이성 융합단백질이 제공된다.
상기 이중 특이성 융합단백질은 반감기 증가 모이어티가 부가된 것일 수 있고, 상기 반감기 증가 모이어티는 상기 GLP-1 유사체와 GLP-2 유사체 사이에 삽입이 되거나 전체 융합단백질의 N-말단 또는 C-말단에 부가된 것일 수 있으며, 바람직하게는 항체 Fc 영역, PEG, XTEN, PAS(Pro-Ala-Ser), ELP(elastin-like peptide), 글리신-풍부 HAP(homo-amino-acid polymer), GLP(gelatine-like protein), 또는 혈청 알부민일 수 있다.
상기 이중 특이성 융합단백질은 체내에서 자연적으로 발현이 되는 GLP-1 및 GLP-2가 중간 펩타이드(intervention peptide)에 의해 연결된 프로글루카곤 또는 그의 유사체가 아니라, GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체가 직접 연결되거나 두 펩타이드가 상기 중간 펩타이드가 아닌 다른 형태의 링커 펩타이드에 의해 연결된 융합단백질일 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따르면, GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질이 제공된다.
상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 GLP-1 유사체는 GLP-1, 엑센딘 3(Exendin 3), 엑센딘 4(Exendin 4), GLP-1/Exendin 4 하이브리드 펩타이드, GLP-1-XTEN, Exendin 4-XTEN, Lixisenatide, Albiglutide, Liraglutide, 또는 Taspoglutide일 수 있다. 선택적으로, 상기 GLP-1 유사체는 두 개의 GLP-1이 링커 펩타이드에 의해 연결된 GLP-1 연속 반복체일 수 있다.
아울러, 상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 GLP-1 유사체 및 상기 GLP-2 유사체 중 적어도 하나는 연속적 반복체(tandem repeat)이고, 상기 GLP-1 유사체 및 상기 GLP-2 유사체의 반복 횟수는 서로 상이한 것일 수 있다. 상기와 같은 구조는 이중 특이성 융합단백질의 비대칭성을 위해 도입이 되는 것으로서, 이와 같이 이형 이량체를 형성하는 단위 융합단백질의 크기가 달라지면, 동형 이량체 생성 정도를 모니터링하기 용이하기 때문에 품질 제어(quality control)가 가능할 뿐만 아니라 기존의 반감기 증가기술로 잘 알려진 PEGylation 대비 제조 공정을 간소화할 수 있기 때문에 생산원가를 절감할 수 있는 이점이 있다. 이러한 GLP-1 유사체와 GLP-2 유사체의 반복단위수는 요구되는 GLP-1R 및 GLP-2R에 대한 결합친화도에 따라 조절될 수 있다.
상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 GLP-1은 서열번호 1 또는 2로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 Exendin 3는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 Exendin 4는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 GLP-1/Exendin 4 하이브리드는 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 Lixisenatide는 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 Exendin 4-XTEN은 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 Albiglutide는 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 Liraglutide는 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 Taspoglutide는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 GLP-1 연속 반복체는 서열번호 11로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 항체 Fc 영역은 하이브리드 항체 Fc 영역일 수 있고, 상기 하이브리드 항체 Fc 영역은 서열번호 12 내지 16으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다. 아울러, 상기 하이브리드 항체 Fc 영역은 ADCC(antibody-dependent cell cytotoxicity)나 CDC(complement-dependent cytotoxicity)와 같은 체내 투여 시 원하지 않은 부작용을 유발하지 않도록 추가적으로 변이된 것일 수 있다. 이러한 하이브리드 항체 Fc 영역은 대한민국 특허 제897938호에 기재된 것일 수 있고, 서열번호 13로 기재되는 아미노산 서열로 구성이 되는 하이브리드 Fc 영역의 18번째 아미노산인 트레오닌(T)가 글루타민(Q)로 치환되고, 196번째 아미노산인 메티오닌(M)이 류신(L)으로 치환된 서열번호 14로 기재되는 하이브리드 Fc 영역 변이체 또는 서열번호 12로 기재되는 아미노산 서열로 구성이 되는 하이브리드 Fc 영역의 18번째 아미노산인 트레오닌(T)가 글루타민(Q)로 치환되고, 196번째 아미노산인 메티오닌(M)이 류신(L)으로 치환된 서열번호 15로 기재되는 아미노산 서열로 구성이 되는 하이브리드 Fc 영역 변이체일 수 있다.
상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 GLP-2 유사체는 GLP-2, Glepaglutide, 또는 GLP-2 analogue 10일 수 있다.
상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 GLP-2는 서열번호 17 내지 20 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 18로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드는 인간 GLP-2 야생형 펩타이드이고, 서열번호 17로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 GLP-2 변이체는 2번째 아미노산인 알라닌이 글라이신으로 치환된 것으로서 Teduglutide로도 불린다. 한편, 서열번호 19로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 GLP-2 변이체는 2번째 아미노산인 알라닌(A)이 글라이신(G)로 변이되었을 뿐만 아니라 16번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 글라이신(G)으로 변이되고 17번째 아미노산인 류신(L)이 글루타민(Q)로 변이가 된 GLP-2 변이체(GLP-2 A2G, N16G, L17Q)로서 GLP-2로서의 기능은 그대로 유지하면서도 재조합 생산 시 GLP-2의 이량체화나 그로 인한 응집체 형성을 억제하는 것으로 알려지고 있다(Baker et al., J. Mol. Recognit. 25: 155-164, 2012). 선택적으로 GLP-2 야생형 펩타이드에서 2번째 아미노산인 알라닌이 글라이신으로 치환되고 17번째 아미노산인 류신이 글루타민으로 치환된 것(A2G, L17Q, 서열번호 20)도 상기 서열번호 19로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 GLP-2 유사체와 동등한 기능을 발휘할 수 있으므로, 본 발명에서 GLP-2 유사체로 사용하는 것이 가능하다.
상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 Glepaglutide는 서열번호 21로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 GLP-2 analogue 10는 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 제1융합단백질은 서열번호 23 내지 30로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 제2융합단백질은 서열번호 31 내지 36으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 제1융합단백질은 하이브리드 Fc 영역 중 CH3 도메인의 10번째 아미노산인 세린이 시스테인(C)으로 치환되고, 22번째 아미노산인 트레오닌(T)이 트립토판(W)으로 치환된 것(Knob 구조)일 수 있고, 제2융합단백질은 Fc 영역 중 CH3 도메인의 5번째 아미노산인 타이로신(Y)이 시스테인(C)로, 22번째 아미노산인 트레오닌이 세린(S)로, 24번째 아미노산인 류신(L)이 알라닌(A)로, 63번째 아미노산인 타이로신(Y)이 발린(V)로 치환된 것(Hole 구조)일 수 있고, 반대로 상기 제1융합단백질은 Fc 영역 중 CH3 도메인의 5번째 아미노산인 타이로신(Y)이 시스테인(C)로, 22번째 아미노산인 트레오닌이 세린(S)로, 24번째 아미노산인 류신(L)이 알라닌(A)로, 63번째 아미노산인 타이로신(Y)이 발린(V)로 치환된 것(Hole 구조)일 수 있고, 상기 제2융합단백질은 하이브리드 Fc 영역 중 CH3 도메인의 10번째 아미노산인 세린이 시스테인(C)으로 치환되고, 22번째 아미노산인 트레오닌(T)이 트립토판(W)으로 치환된 것(Knob 구조)일 수 있다.
선택적으로, 상기 제1융합단백질은 하이브리드 Fc 영역 중 CH3 도메인의 22번째 아미노산인 트레오닌(T)가 타이로신(Y)로 치환되고, 상기 제2융합단백질은 하이브리드 Fc 영역 중 CH3 도메인의 63번째 아미노산인 타이로신(Y)이 트레오닌(T)로 치환된 것이고, 상기 제2융합단백질은 하이브리드 Fc 영역 중 CH3 도메인의 63번째 아미노산인 타이로신(Y)이 트레오닌(T)로 치환된 것이고, 상기 제1융합단백질은 하이브리드 Fc 영역 중 CH3 도메인의 63번째 아미노산인 타이로신(Y)이 트레오닌(T)로 치환된 것일 수 있다. 다만 상기 63번째 아미노산의 변이는 서열번호 69로 기재되는 인간 IgG1의 CH3 도메인의 아미노산 서열이 기준이 아니라 IMGT(international ImMunoGeneTics information system)의 numbering 규칙에 따르면(Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 27: 55-77, 2003), Y86T로 표시 될 수 있다.
상기 이중 특이성 융합단백질에 있어서, 상기 융합단백질의 융합파트너들 사이, 즉 펩타이드 또는 도메인 사이에는 하나 이상의 링커 펩타이드가 삽입이 될 수 있다. 즉, 상기 GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체가 융합된 이중 특이성 융합단백질의 경우 GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체 사이에 링커 펩타이드가 삽입이 될 수 있고, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질의 경우 제1융합단백질 내부의 GLP-1 유사체와 항체 Fc 영역 사이에 링커 펩타이드가 삽입이 될 수 있고, 마찬가지로 제2융합단백질 내의 GLP-2 유사체와 항체 Fc 영역 사이에 링커 펩타이드가 삽입이 될 수 있다. 이 때, 상기 링커 펩타이드는 N-글리칸 부착 부위를 포함하거나 포함하지 않는 것일 수 있고, 더 바람직하게는 상기 제1융합단백질은 상기 링커 펩타이드에 N-글리칸 부착 부위를 포함하지 않고 상기 제2융합단백질은 상기 링커 펩타이드에 N-글리칸 부착 부위를 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 제1융합단백질 및 상기 제2융합단백질 모두 N-글리칸 부착 부위를 포함하지 않는 것일 수도 있고 상기 제1융합단백질은 상기 링커 펩타이드에 N-글리칸 부착 부위를 포함하지 않고 상기 제2융합단백질은 상기 링커 펩타이드에 N-글리칸 부착 부위를 포함한 것일 수도 있다.
상기 링커 펩타이드는 EPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 37), EPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 38), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 39), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 40), AKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECP(서열번호 41), GGGGSGGGGSGGGGSEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 42), GGGGSGGGGSGGGGSAKNTTAPATTRNTTRGGEEKKKEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 43), AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 44), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 45), GGSGG(서열번호 46), GGSGGSGGS(서열번호 47), GGGSGG(서열번호 48), 서열번호 (G4S)n(단위체: 서열번호 49, n은 1 내지 10의 정수), (GGS)n(n은 1 내지 10의 정수), (GS)n(n은 1 내지 10의 정수), (GSSGGS)n(단위체: 서열번호 50, n은 1 내지 10의 정수), KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 51), EGKSSGSGSESKST(서열번호 52), GSAGSAAGSGEF(서열번호 53), (EAAAK)n(단위체: 서열번호 54, n은 1 내지 10의 정수), CRRRRRREAEAC(서열번호 55), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 56), GGGGGGGG(서열번호 57), GGGGGG(서열번호 58), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 59), PAPAP(서열번호 60), (Ala-Pro)n(n은 1 내지 10의 정수), VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 61, PLGLWA(서열번호 62), TRHRQPRGWE(서열번호 63), AGNRVRRSVG(서열번호 64), RRRRRRRR(서열번호 65), GFLG(서열번호 66), GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 67), 또는 GSTSGSGKPGSGEGS(서열번호 68)일 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 상기 이중 특이성 융합단백질을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물은 장의 증식을 필요로 하는 질환 또는 증상의 치료에 사용될 수 있다.
상기 장의 증식을 필요로 하는 질환 또는 증상은 흡수장애, 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 또는 단장증후군(short bowel syndrome)일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 염증성 장질환은 궤양성 장염, 베체트병 또는 크론병(Crohn's disease)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질은 생체 내 투여 시 창자 특히 소장의 길이를 신장시킬 뿐만 아니라 소장 내 융모의 길이와 크립트의 깊이를 현저하게 향상시키는 효과를 갖고 있기 때문에, 단장증후군과 같이 소장의 증식 및 기능의 향상을 필요로 하는 질환의 치료에 효율적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면 상기 중 어느 하나 이상의 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 비알코올성 지방간염의 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면 상기 중 어느 하나 이상의 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 대사증후군 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면 상기 중 어느 하나 이상의 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 비만 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면 상기 중 어느 하나 이상의 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 제2형 당뇨병 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면 상기 중 어느 하나 이상의 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 간 섬유증 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
GLP-1 수용체 작용제 중 하나인 Exendin-4는 이미 임상시험에서 제2형 당뇨병 환자의 혈당조절 및 체중 조절에 효과가 있음이 증명된 바(DeFronzo et al., Diabetes Care 28: 1092-1100, 2005), 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 이중 특이성 융합단백질은 비만, 제2형 당뇨병은 물론 대사증후군 등의 비만 관련 질환의 치료에 사용될 수 있다.
상기 조성물은 악학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있고, 상기 담체 외에 약학적으로 허용가능한 보조제, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 포유동물에 투여 시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들면, 경구, 비경구, 예를 들면 좌제, 경피, 정맥, 복강, 근육내, 병변내, 비강, 척추관내 투여로 투여될 수 있으며, 또한 서방형 또는 연속적 또는 반복적 방출을 위한 이식장치를 사용하여 투여될 수 있다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
상기 조성물의 환자에 대한 투여량은 환자의 신장, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물들을 포함하는 많은 요소들에 따라 다르다. 약학적으로 활성인 단백질은 100 ng/체중(kg) - 10 ㎎/체중(㎏)의 양으로 투여될 수 있고, 더 바람직하게는 1 내지 500 ㎍/kg(체중)으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 5 내지 50 ㎍/kg(체중)으로 투여될 수 있는데, 상기 요소들을 고려하여 투여량이 조절될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 이중 특이성 융합단백질을 장의 증식을 필요로 하는 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 장의 증식을 필요로 하는 질환 또는 증상의 치료방법이 제공된다.
상기 치료방법에 있어서, 상기 장의 증식을 필요로 하는 질환 또는 증상은 흡수장애, 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 또는 단장증후군(short bowel syndrome)일 수 있으며, 바람직하게는 단증 증후군일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 이중 특이성 융합단백질을 대사증후군에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 대사증후군의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 이중 특이성 융합단백질을 비만 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 비만 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 이중 특이성 융합단백질을 제2형 당뇨병에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 제2형 당뇨병의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 이중 특이성 융합단백질을 비알코올성 지방간질환 또는 비알코올성 지방간염에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 비알코올성 지방간질환 또는 비알코올성 지방간염의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 이중 특이성 융합단백질을 간 섬유증에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 간 섬유증의 치료방법이 제공된다.
상기 치료방법에 있어서 상기 간 섬유증은 만성 비알코올성 지방간염에 의해 발생하는 간 섬유증일 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "치료적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg일 수 있으나, 유효 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
상기 둘 이상의 단백질 또는 도메인 사이에는 통상적으로 유연한 구조를 갖는 링커 펩타이드(linker peptide)가 삽입될 수 있다. 상기 링커 펩타이드는 EPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 37), EPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 38), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 39), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 40), AKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECP(서열번호 41), GGGGSGGGGSGGGGSEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 42), GGGGSGGGGSGGGGSAKNTTAPATTRNTTRGGEEKKKEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 43), AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 44), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 45), GGSGG(서열번호 46), GGSGGSGGS(서열번호 47), GGGSGG(서열번호 48), 서열번호 (G4S)n(단위체: 서열번호 49, n은 1 내지 10의 정수), (GGS)n(n은 1 내지 10의 정수), (GS)n(n은 1 내지 10의 정수), (GSSGGS)n(단위체: 서열번호 50, n은 1 내지 10의 정수), KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 51), EGKSSGSGSESKST(서열번호 52), GSAGSAAGSGEF(서열번호 53), (EAAAK)n(단위체: 서열번호 54, n은 1 내지 10의 정수), CRRRRRREAEAC(서열번호 55), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 56), GGGGGGGG(서열번호 57), GGGGGG(서열번호 58), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 59), PAPAP(서열번호 60), (Ala-Pro)n(n은 1 내지 10의 정수), VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 61, PLGLWA(서열번호 62), TRHRQPRGWE(서열번호 63), AGNRVRRSVG(서열번호 64), RRRRRRRR(서열번호 65), GFLG(서열번호 66), GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 67), 및 GSTSGSGKPGSGEGS(서열번호 68) 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 이중 특이성 융합단백질은 상기 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1유전자 컨스트럭트 및 상기 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 발현벡터를 숙주세포에 형질도입한 후 재조합 방식으로 발현함으로써 생산이 가능하다.
이 경우, 상기 제1유전자 컨스트럭트 및 제2유전자 컨스트럭트는 하나의 발현벡터에 삽입되어 발현되거나, 두 개의 개별적인 발현벡터에 삽입되어 발현이 될 수 있다. 전자의 경우 두 개의 별개의 조절서열에 각각의 유전자 컨스트럭트가 작동가능하게 연결되도록 벡터를 고안하거나 두 유전자 컨스트럭트가 하나의 조절서열에 작동가능하게 연결이 되고, 양 유전자 컨스트럭트를 내부 리보좀 진입 부위(internal ribosome entry site, IRES)가 연결하는 방식을 사용할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked to)"이란 목적으로 하는 핵산서열(예컨대, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 숙주세포에서)이 그의 발현이 이루어질 수 있도록 하는 방식으로 상기 조절서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다.
상기 "조절서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 조절서열에는 많은 숙주세포에서 목적으로 하는 핵산이 항상적으로 발현될 수 있도록 지시하는 것, 특정한 조직세포에서만 목적으로 하는 핵산이 발현될 수 있도록 지시하는 것(예, 조직특이적 조절서열), 그리고 특정 신호에 의해 발현이 유도되도록 지시하는 것(예, 유도성 조절서열)이 포함된다. 발현벡터의 설계는 형질전환될 숙주세포의 선택 및 원하는 단백질 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것은 당업자라면 이해할 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 숙주 세포에 도입되어 상기 융합 단백질을 발현할 수 있다. 상기 진핵세포 및 원핵세포에서 발현을 가능하게 하는 조절서열들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상술한 바와 같이, 이들은 보통 전사개시를 담당하는 조절서열들 및, 선택적으로 전사물의 전사종결 및 안정화를 담당하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가적인 조절서열들은 전사조절인자 외에도 번역 증진인자 및/또는 천연-조합 또는 이종성 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 포유류 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 가능한 조절서열들은 CMV-HSV 티미딘 키나아제 프로모터, SV40, RSV-프로모터(로우스 육종 바이러스), 인간 신장 요소 1α-프로모터, 글루코코르티코이드-유도성 MMTV-프로모터(몰로니 마우스 종양 바이러스), 메탈로티오네인-유도성 또는 테트라사이클린-유도성 프로모터 또는, CMV 증폭제 또는 SV40-증폭제와 같은 증폭제를 포함한다. 신경 세포 내 발현을 위해, 신경미세섬유-프로모터(neurofilament-promoter), PGDF-프로모터, NSE-프로모터, PrP-프로모터 또는 thy-1-프로모터들이 사용될 수 있다는 것이 고려되고 있다. 상기 프로모터들은 당 분야에 알려져 있으며, 문헌(Charron, J. Biol. Chem. 270: 25739-25745, 1995)에 기술되어 있다. 원핵세포 내 발현을 위해, lac-프로모터, tac-프로모터 또는 trp 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터들이 개시되어 있다. 전사를 개시할 수 있는 인자들 외에, 상기 조절서열들은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 하류(downstream)에 SV40-폴리-A 부위 또는 TK-폴리-A 부위와 같은 전사 종결 신호를 포함할 수도 있다. 본 문서에서, 적당한 발현 벡터들은 당 분야에 알려져 있으며, 그 예로는 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1(Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(Invitrogene), pSPORT1(GIBCO BRL), pGX-27(특허 제1442254호), pX(Pagano et al., Science 255: 1144-1147, 1992), 효모 2-혼성(two-hybrid) 벡터, 가령 pEG202 및 dpJG4-5(Gyuris et al., Cell 75: 791-803, 1995) 또는 원핵 발현벡터, 가령 람다 gt11 또는 pGEX(Amersham Pharmacia)가 있다. 본 발명의 핵산 분자들 외에, 벡터는 분비 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분비신호들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그리고, 사용된 발현 시스템에 따라, 융합단백질을 세포 구획으로 이끌 수 있는 리더서열(leader sequence)이 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 코딩 서열에 조합되며, 바람직하게는 해독된 단백질 또는 이의 단백질을 세포질 주변 또는 세포외 매질로 직접 분비할 수 있는 리더 서열이다.
또한, 본 발명의 벡터는 예를 들면, 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 제조될 수 있으며, 표준 재조합 DNA 기술에는 예를 들면, 평활말단 및 접착말단 라이게이션, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 처리, 부적합한 결합을 방지하기 위하여 알칼리성 포스파테이즈 처리에 의한 인산기 제거 및 T4 DNA 라이게이즈에 의한 효소적 연결 등이 포함된다. 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 신호 펩타이드를 코딩하는 DNA, 본 발명의 이중 특이성 융합단백질을 암호화하는 DNA를 적절한 조절서열이 포함되어 있는 벡터에 재조합함으로써 본 발명의 벡터가 제조될 수 있다. 상기 조절 서열이 포함되어 있는 벡터는 상업적으로 구입 또는 제조할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 pBispecific backbone vector(Genexine, Inc., 대한민국)또는 pAD15 vector를 골격 벡터로 사용하였다.
상기 발현벡터는 분비 신호서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 분비 신호서열은 세포내에서 발현되는 재조합 단백질의 세포 밖으로의 분비를 유도하며, tPA(tissue plasminogen activator) 신호서열, HSV gDs(단순포진 바이러스 당단백질 Ds) 신호서열 또는 성장호르몬 신호서열일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 발현벡터는 숙주세포에서 상기 단백질을 발현하도록 할 수 있는 발현벡터일 수 있으며, 상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 벡터, 파지미드 벡터, 인공 인간 염색체 등 그 어떠한 형태를 나타내더라도 무방하다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예: 이중 특이성 융합단백질의 고안
본 발명자들은 GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체를 모두 포함하는 다양한 이중 특이성 융합단백질을 하기 도 1 및 표 1과 같이 고안하였다.
상기 이중 특이성 융합단백질을 고안함에 있어서, 중점적으로 고려한 사항은 도 2에 기재된 바와 같이, GLP-1 수용체인 GLP-1R에는 GLP-1 외에도 Exendin 4(Ex4), 옥신토모듈린(OXM), GLP-2가 모두 결합하는 반면, GLP-2R에는 GLP-2만 결합한다는 점이다. 이에, 본 발명자들은 GLP-1 유사체의 GLP-1R와의 결합력을 조절하기 위해, GLP-1 유사체의 링커 부분에 글리칸이 부착될 수 있도록 글리칸 부착 도메인이 부가된 것을 사용하였다. 반대로 GLP-2를 포함하는 제2융합단백질에 글리칸 링커가 포함되도록 하고 반대로 GLP-1 유사체를 포함하는 제1융합단백질에 글리칸 부착부위를 포함하지 않는 비변형 링커가 포함되도록 한 이중 특이성 융합단백질(MG12-6)도 고안하였다. 아울러, 본 발명자들은 GLP-2의 17번째 알라닌이 글루타민으로 추가로 치환된 GLP-2 유사체를 사용한 이중 특이성 융합단백질 MG12-7 및 MG12-8을 고안하였다. 이 때 MG12-7 및 MG12-8의 차이점은 MG12-7은 GLP-1로 서열번호 1로 기재되는 A2G 변이체를 사용하는 반면 MG12-8 및 MG12-9는 상기 A2G 변이체 두 개가 (G4S)6 링커로 연결된 연속 반복체(tandem repeat)를 사용한다는 점이다.
실시예 명칭 GLP-1/2 유사체(서열번호) 링커(서열번호) Fc 영역 전체구성(서열번호)
1 MG12-1 1. GLP-1(1)
2. GLP-2(17)		 글리칸 링커(43)
비변형(42)		 knob
hole		 제1융합단백질(24)
제2융합단백질(32)
2 MG12-2 1. GLP-2(17)
2. GLP-1(1)		 글리칸 링커(43)
비변형(42)		 knob
hole		 제2융합단백질(33)
제1융합단백질(25)
3 MG12-3 1. Exendin 4(4)
2. GLP-2(17)		 글리칸 링커(43)
비변형(42)		 knob
hole		 제1융합단백질(26)
제2융합단백질(32)
4 MG12-4 1. GLP-1/Exendin 4 hybrid(5)
2. GLP-2(17)		 글리칸 링커(43)
비변형(42)		 knob
hole		 제1융합단백질(27)
제2융합단백질(34)
5 MG12-5 1. GLP-1/Exendin 4 hybrid(5)
2. GLP-2(17)		 비변형(42)
비변형(42)		 knob
hole		 제1융합단백질(28)
제2융합단백질(34)
6 MG12-6 1. GLP-2(17)
2. GLP-1/Exendin 4 hybrid(5)		 글리칸 링커(43)
비변형(42)		 knob
hole		 제2융합단백질(35)
제1융합단백질(28)
7 MG12-7 1. GLP-1/Exendin 4 hybrid(5)
2. GLP-2(19)		 글리칸 링커(43)
비변형(39)		 knob
hole		 제1융합단백질(29)
제2융합단백질(36)
8 MG12-8 1. GLP-1(11)
2. GLP-2(19)		 비변형(39)
비변형(39)		 knob
hole		 제1융합단백질(30)
제2융합단백질(36)
9 MG12-9 1. GLP-1(11)
2. GLP-2(17)		 비변형(39)
비변형(42)		 knob
hole		 제1융합단백질(30)
제2융합단백질(34)
아울러, 상기 이중 특이성 융합단백질의 경우 이종 이량체(heterodimer)가 우선적으로 생성되도록 하기 위해서 Knobs-into-holes 기술을 적용시켰다. 즉, 제1융합단백질은 하이브리드 Fc 영역 중 CH3 도메인의 10번째 아미노산인 세린(S)이 시스테인(C)으로 치환되고, 22번째 아미노산인 트레오닌(T)이 트립토판(W)으로 치환된 것(Knob)일 수 있고, 제2융합단백질은 Fc 영역 중 CH3 도메인의 5번째 아미노산인 타이로신(Y)이 시스테인(C)로, 22번째 아미노산인 트레오닌(T)이 세린(S)로, 24번째 아미노산인 류신(L)이 알라닌(A)으로, 63번째 아미노산인 타이로신(Y)이 발린(V)으로 치환된 것(Hole)일 수 있다. 이때, 상기 변이가 일어난 아미노산의 위치는 기준서열(서열번호 69의 인간 IgG1 CH3 도메인의 아미노산 서열)을 기준으로 한다. 만일 상기 CH3 도메인 상에 Knobs-into-Holes 구조와 무관한 부위에서 아미노산의 부가, 결실 또는 치환 등의 추가적인 변이가 발생한 경우라도 상기 기준서열을 기준으로 하여 해당 위치에 상응하는 아미노산이 변이된 것을 사용하면 된다. 선택적으로, 상기 Knobs-into-Holes 구조는 당업계에 잘 알려진 다른 아미노산 변이를 통해 도입될 수 있다. 이러한 변이는 선행문헌(Wei et al., Oncotarget 2017, 8(31): 51037-51049; Ridgway et al., Protein Eng. 1996, 9(7): 617-621; Carter, P., J. Immunol. Methods 2001, 48(1-2): 7-15; Merchant et al., Nat. Biotechnol. 1998, 16(7): 677-681)에 잘 기술되어 있다. 이러한 선택적인 변이로는 예컨대 제1융합단백질의 CH3 도메인의 22번째 아미노산인 트레오닌이 타이로신으로 치환된 Knob 구조 및 제2융합단백질의 CH3 도메인의 63번째 아미노산인 타이로신이 트레오닌으로 치환된 Hole 구조의 조합을 통해 이중 특이성 이량체 융합단백질이 생성될 수 있다. 상기 Knobs-into-Holes 구조는 반대로 상기 제1융합단백질에 Hole 구조가 도입되고, 상기 제2융합단백질에 Knob 구조가 도입되어 형성될 수 있다.
상기와 같이 고안한 실시예 1 내지 5의 이중 특이성 융합단백질의 제1융합단백질 및 제2융합단백질을 암호화하는 유전자 컨스트럭트를 PCR 및 위치지정 돌연변이 유도 프라이머를 이용하여 증폭함으로써 각각 합성한 후, 이를 각각 pAD15 벡터(Genexine, Inc., 대한민국)에 삽입함으로써, 발현벡터를 제조하였다.
상기와 같이 제조된 벡터 컨스트럭트들을 Thermo Fisher사의 ExpiCHO kit를 이용하여 일시적 발현을 수행하였다. 구체적으로 ExpiCHO-S cell에 상기와 같이 제조된 벡터 컨스트럭트와 키트 내에 포함되어 있는 ExpiFectamine 시약을 혼합한 후 8% CO2 및 37℃의 조건을 갖춘 배양기에서 1일간 배양 후 온도를 32℃로 낮춰서 7일 차까지 배양을 진행하였다.
상기 배양을 통해 얻어진 상층액을 Protein A 칼럼 및 이차 칼럼을 통해 정제된 실시예 1 내지 5의 융합단백질(각각, 'MG12-1',' 'MG12-2', 'MG12-3', 'MG12-4', 및 'MG12-5'로 명명함)을 4X LDS 시료 완충액과 주사용수로 적절히 희석하여 최종 3-10 μg/20 μL이 되도록 조제하였다. 환원조건 시료의 경우 각 분석하고자 하는 물질과 4X LDS 시료 완충액, 10X 환원제와 주사용수를 적절히 희석하여 최종 3-10 μg/20 μL이 되도록 조제하고 70℃ 가열블록에서 10분간 가열하였다. 준비된 시료를 미리 설치된 전기영동 장비에 고정된 겔의 각 웰에 20 μL씩 적재하였다. 사이즈 마커의 경우 3~5 μL/well을 적재하였다. 전원공급장치를 120 V, 90분으로 설정한 후 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 완료된 겔을 분리한 후 염색용액 및 탈-염색 용액을 이용하여 염색하고, 결과를 분석하였다.
분석결과 도 3a에서 확인되는 바와 같이, 모든 이중 특이성 융합단백질들은 비-환원 조건에서 50~75 kDa 사이, 환원 조건에서는 37 kDa 부위에서 관찰되었다. 이형 이량체 형태를 이루고 있는 본 발명의 이중 특이성 융합단백질들 중에서 한쪽의 힌지에 당쇄를 포함하고 있는 실시예 1 내지 4의 융합단백질의 경우, 환원 조건에서 두 개의 서로 다른 크기를 갖는 단량체들이 관찰되었고, 힌지에서의 당쇄를 포함하지 않는 실시예 5의 융합단백질(MG12-5)의 경우는 하나의 크기를 갖는 단량체가 관찰되었다.
아울러, 본 발명자들은 Knobs-into-Holes(KiH) 구조를 포함하지 않는 Fc와 융합된 GLP-2 동형 이량체(GLP-2-Fc homodimer, 서열번호 25)와 Knobs-to-Holes 구조를 포함한 MG12-5를 각각 위와 동일한 환원/비-환원 조건에서 SDS-PAGE 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 3b에서 확인되는 바와 같이, KiH 구조를 포함한 MG12-5의 경우 그렇지 않은 GLP-2-Fc 동형이량체 대비 비환원 조건에서 단량체 형태의 불순물 형성이 현저히 억제됨을 확인하였다.
아울러, 본 발명자들은 MG12-6 내지 MG12-9를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 합성한 후, 동물세포에서 임시 발현하기 위해서 HEK293F 세포에 N293F 벡터 시스템(와이바이오로직스)을 이용하여 플라스미드 DNA 형질감염을 수행하였다. 핵산 준비를 위해 배지 3 ml에 플라스미드 DNA 25 μg을 넣어 혼합한 후, 2 mg/ml PEI(Polyethylenimine, PolyPlus, USA) 25 μg를 첨가하고 혼합하였다. 반응액은 상온에서 15분 동안 정치한 후, 1x106 cells/ml로 배양된 80~1000 ml의 배양액에 넣어 120 rpm, 37℃ 8% CO2의 조건으로 24시간 동안 배양하였다. DNA 형질감염 24시간 후에 영양 보충배지 성분(Soytone, BD, USA)을 최종 농도 10 g/L가 되도록 첨가하였다. 7일 동안 배양한 후 세포배양액을 5000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 회수하였다. 이어, Protein A 레진(Resin)을 컬럼(Column)에 충진하고 1x DPBS로 세척하여 준비하였고, 상기 회수된 상층액을 0.5 ml/min의 속도로 4℃에서 레진과 결합시켰고, 0.1 M Glycine으로 단백질을 용출하였다. 완충용액을 교체하기 위하여 용출한 용액을 투석튜브(GeBAflex tube, Geba, Israel)에 넣어 1x DPBS로 4℃에서 투석하였으며, 이를 통해 수득된 물질은 PBS(pH 7.4) 완충액으로 제형화하였다.
수득된 MG12-6 내지 MG12-9 역시 상술한 바와 같이, 환원 및 비환원 조건에서 SDS 겔 전기영동을 수행하였다. 그 결과, 도 3c 내지 3e에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 이형 이량체 융합단백질들은 정상적으로 발현이 됨을 확인할 수 있었다.
결론적으로, SDS-PAGE를 통하여 본 발명의 실시예에 따른 모든 이중 특이성 융합단백질이 정상적으로 생산 및 정제될 수 있었고, 특히 MG12-5와 GLP-2-Fc 동형 이량체의 비교를 통해 증명되었듯이, KiH 구조를 적용한 이중 특이성 이중단백질의 경우 그렇지 않은 경우에 비해 단량체 형태의 불순물 형성이 현저히 저하되는 것을 확인하였다.
실험예 1: GLP-1 시험관내 활성 확인
본 발명자들은 상기 실시예에서 제조된 이중 특이성 융합단백질의 GLP-1 시험관내(in vitro) 활성을 cAMP 분석으로 조사하였다. 구체적으로, GLP-1 특이적인 반응에 의해 cAMP가 유도되는 정도를 평가하기 위해, cAMP 특이적으로 루시페린을 발현하는 세포주에 GLP-1 수용체를 함께 발현할 수 있도록 형질전환 세포주(GLP1R_cAMP/luc)를 제작하였다. 상기 세포를 해동 및 적절히 유지시킨 후, 0.05% TE(Trypsin EDTA)를 첨가하여 세포를 플라스크로부터 분리하고, 살아 있는 세포 수를 계수하였다. 활성 평가에 필요한 세포 수만큼 회수하여 세척하고, 0.5% FBS, DMEM/고 포도당 배지로 세포를 희석하여 2x104 cell/80 μL/well로 파종하였다. 16시간 정도 37℃, 5% CO2 배양기에서 세포를 배양한 후, 평가하고자 하는 다양한 농도의 검액을 20 μL/well로 처리하고 5시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 반응 시켰다. 반응이 완료된 플레이트에 Bright-GloTM 분석 시약을 100 μL/well로 처리한 후 2분간 상온에서 반응시켰다. 반응이 종료된 플레이트를 Luminometer에 삽입하고 생물발광 정도를 측정하였다.
분석 결과, 표 2 및 도 4a 내지 4e에서 확인되는 바와 같이 GLP-1-Fc 동형 이량체의 경우 천연 GLP-1 펩타이드 대비 약 72%의 활성을 나타내었고, 본 발명의 실시예 1, 3, 4 및 5에 따른 이중 특이성 융합단백질(각각 MG12-1, 3, 4 및 5)은 각각 9%, 118%, 39%, 35%의 상대활성을 나타내었다. DPP-4 효소에 의한 절단을 방지하기 위해 N-말단 돌연변이가 도입되고, GLP-1과 접합된 힌지에 당쇄를 포함하는 MG12-1의 경우 당쇄화에 의하여 활성이 약 11배 감소되는 현상을 보였고, MG12-1에서 GLP-1 대신 Exendin 4를 도입한 MG12-3의 경우 MG12-1 보다 약 13배 증가한 활성을 보였다. MG12-1에서 GLP-1 대신 GLP-1과 Exendin 4가 혼합된 GLP-1/Exendin 4 하이브리드가 도입된 MG12-4 및 MG12-5는 힌지의 당쇄화 유무와 상관없이 약 35-39%로 유사한 상대활성을 나타내었다.
본 발명의 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질의 시험관내 GLP-1 활성
　 GLP-1
펩타이드		 GLP-1-Fc
동형 이량체		 실시예 1 실시예 3 실시예 4 실시예 5
EC50(pM) 26 36 304 22 66 75
GLP-1 대비
상대활성(%)		 100 72 9 118 39 35
실험예 2: GLP-2 시험관내 활성 확인
본 발명자들은 상기 실시예에서 제조된 이중 특이성 융합단백질의 GLP-2 시험관내(in vitro) 활성을 cAMP 분석으로 조사하였다.
구체적으로, GLP-2 특이적인 반응에 의해 cAMP가 유도되는 정도를 평가하기 위해, cAMP 특이적으로 열리는 CNG 채널을 발현하는 세포주에 GLP-2 수용체를 발현하게 한 형질전환 세포주(Human GLP2R ACTOneTM)를 확보하였다. 상기 세포를 해동 및 적절히 유지시킨 후, GLP-1 시험관내 활성 분석과 동일한 조건으로 세포를 플라스크로부터 분리하고 활성 평가에 필요한 세포 수만큼 회수하여 세척하였다. 세척한 세포를 세포배양 배지(DMEM/고포도당 배지, 10% FBS, 5% G418, 0.01% puromycin)로 희석하여 3~5x104 cell/100 μL/well로 파종한 후 20시간 정도 37℃, 5% CO2 배양기에서 세포를 배양하였다. CO2 배양기에서 플레이트를 꺼낸 후 현미경으로 세포를 관찰하고 세포의 포화도가 80% 이상이 되었을 때, 1X 염료 적재 용액 (EliteTM fluorescent membrane potential dye kit, eEnzyme)을 100 μL/well로 첨가하였다. 실온에서 차광하여 2~2.5시간 반응시키고, 검액을 첨가하기 전 ELISA를 이용하여 형광 기준치(Fluorescence baseline, F0)를 측정하였다. 그 후 평가하고자 하는 다양한 농도의 검액을 50 μL/well로 처리하고 0.5시간 동안 반응시킨 다음, ELISA를 이용하여 형광값(Ft)을 측정하였다. Ft/F0 비율을 이용하여 각 검액의 반응성을 평가하였다.
그 결과, 도 5a 내지 5e에서 확인되는 바와 같이, GLP-2-Fc 동형 이량체의 경우 천연 GLP-2 펩타이드 대비 약 132%의 활성을 나타내었고, 본 발명의 실시예 1, 3, 4 및 5에 따른 이중 특이성 융합단백질(각각 MG12-1, 3, 4, 및 5)는 각각 43%, 54%, 48%, 59%의 상대활성을 나타내었다. 모든 MG12 변이체들은 DPP-4 효소에 의한 절단을 방지하기 위해 N-말단 돌연변이가 도입되고, GLP-1의 경우와는 다르게 GLP-2가 접합된 힌지에 당쇄를 포함하지 않기 때문에 모든 변이체들은 거의 유사한 GLP-2 활성을 나타내는 것으로 확인하였다.
본 발명의 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질의 시험관내 GLP-2 활성
　 GLP-2
펩타이드		 GLP-2-Fc
동형 이량체		 실시예 1 실시예 3 실시예 4 실시예 5
EC50(nM) 0.58 0.44 1.35 1.07 1.22 0.99
GLP-2 대비
상대활성(%)		 100 132 43 54 48 59
실험예 3: MG12-2의 시험관내 GLP-1, GLP-2 활성 분석
본 발명자들은 GLP-1와 하이브리드 Fc 영역 사이의 힌지 부분에 당쇄를 부가한 실시예 1, 3 및 4의 융합단백질과 반대로 GLP-2와 하이브리드 Fc 영역 사이의 힌지 부분에 당쇄가 부가되고 GLP-1을 포함하는 융합단백질에는 당쇄가 포함되지 않도록 고안된 실시예 2의 이중 특이성 융합단백질(MG12-2)의 경우 GLP-1 및 GLP-2 활성이 어떻게 나타나는지 GLP-1-Fc 동형 이량체 및 GLP-2-Fc 동형이량체와 비교하여 조사하였다.
그 결과, 표 4 및 도 6a 내지 6d에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 실시예 2의 이중 특이성 융합단백질(MG12-2)은 GLP-1 및 GLP-2 활성에 대하여 각각 GLP-1-Fc 동형 이량체 대비 약 11.2%, GLP-2-Fc 동형 이량체 대비 약 17.5%의 활성을 나타내는 것으로 확인하였다. 이는, GLP-1 활성은 MG12-1과 유사한 수준이었으나, GLP-2 활성은 다른 MG12-2 변이체 대비 약 4-5배 낮은 값을 나타낸 것이다.
본 발명의 실시예 2에 따른 이중 특이성 융합단백질의 시험관내 GLP-1 및 GLP-2 활성
GLP-1 활성 GLP-2 활성
GLP-1-Fc
동형 이량체		 MG12-2 GLP-2-Fc
동형 이량체		 MG12-2
EC50 44.9 pM 402.3 pM 7.7 nM 44 nM
상대활성(%) 100 11.2 100 17.5
실험예 4: 생체 내 약물동태학 프로파일 분석
상기에서 제조된 실시예 1, 3 내지 5에 따른 이중 특이성 융합단백질(MG12-1, 3, 4 및 5)의 반감기 및 곡선 하 면적(AUC, Area Under the Curve), 혈중 최고 농도(Cmax) 등을 비교함으로써 약물동태학(PK) 프로파일을 확인하였다.
먼저, 그룹 당 3마리의 수컷 SD(Sprague Dawley) 랫트에 각각의 단백질을 1 mg/kg의 함량으로 피하(SC) 경로로 투여하였다. 주입 전, 및 주입 후 0.5, 1, 5, 10, 24, 48, 72, 120, 및 168 시간 경과 후 혈액을 수득하여, 이를 30분 동안 실온 보관하여 응집시켰다. 응집된 혈액을 3,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리한 후, 각 샘플의 혈청을 수득하였고, 초저온 냉동고에 저장하였다. 투여 단백질 중 GLP-1 부위와 Fc를 특이적으로 검출하도록 고안된 시험법(GLP-1-Fc ELISA)과 투여 단백질 중 GLP-2 부위와 Fc를 특이적으로 검출하도록 고안된 시험법(GLP-2-Fc ELISA)으로 분석하였다. 구체적으로, 마우스 기원의 인간 면역글로불린 G4(IgG4)와 결합하는 항체를 코팅한 플레이트에 생체 시료를 적재고, 비오틴화 항-GLP-1 항체를 이용하여 목적 단백질을 검출하는 방법(GLP-1-Fc ELISA)과 GLP-2에 특이적으로 반응하는 단클론 항체가 코팅된 플레이트에 생체 시료를 적재하고 마우스 기원의 인간 면역글로불린 G4(IgG4)에 HRP가 결합된 2차 항체를 이용하여 목적 단백질을 검출하는 방법(GLP-2-Fc ELISA)을 사용하였다. 수득 및 준비된 혈청 샘플은 표준 곡선의 직선상의 위치에서 분석되도록 적절히 희석하여 적재하였다.
그 결과, 표 5 및 6 그리고 도 7a 및 7b에서 확인되는 바와 같이, MG12-1, 3, 4, 5는 대체적으로 GLP-1-Fc ELISA 및 GLP-2-Fc ELISA로 분석한 결과에서 서로 유사한 PK 프로파일을 보였다. Cmax에서는 두 방법 모두에서 MG12-5가 가장 높은 값을 나타내었고, 반면에 MG12-3에서 가장 낮았다. 이 경향은 AUClast에서도 거의 유사하게 나타났다. 최종 반감기의 경우, MG12-3에서 두 방법 모두 가장 길게 나타났고, GLP-1-Fc ELISA 시험법에서는 MG12-4가, GLP-2-Fc ELISA에서는 MG12-5가 가장 낮은 반감기를 나타내었다.
실시예 Cmax (ng/mL) Tmax (h) AUClast (ng*h/mL) 반감기 (h)
1 442.2±20.8 10 13919.8±824.9 16.5±6.3
3 301.0±57.4 10 9257.4±1543.3 29.5±2.7
4 328.7±34.5 10 7679.8±1228.9 9.0±0.3
5 1036.2±59.5 10 26059.6±3028.5 18.4±6.2
실시예 Cmax (ng/mL) Tmax (h) AUClast (ng*h/mL) 반감기 (h)
1 1136.7±261.0 24.0±0.0 78639.0±11205.3 43.7±1.8
3 697.4±148.0 24.0±8.1 63977.3±10131.5 56.2±7.1
4 1052.5±112.8 24.0±0.0 78983.2±6542.8 49.0±2.1
5 3201.3±95.6 24.0±0.0 188741.6±7870.5 30.6±2.1
결론적으로 MG12-1, 3, 4, 5 모두 정상 모델 랫트에 피하투여 시, 적절히 노출되는 것을 확인할 수 있었고, Cmax 및 AUClast는 MG12-5에서 가장 높은 특징을 보였다.
실험예 5: 생체 내 활성 확인
5-1: 실험동물의 소장의 변화 및 영양소 흡수능 변화 분석
물질 투여에 따른 소장의 변화 및 영양소 흡수능의 변화를 관찰하기 위하여 B6 정상 마우스에서 실험을 진행하였다. PBS와 GLP-2-2G는 1일 2회, GLP-2-Fc 동형 이량체와 MG12-5는 3일 1회를 2주간 투여하였다. GLP-2-Fc 동형 이량체와 MG12-5의 경우 약물을 투여하지 않는 기간에는 다른 투여군과 마찬가지로 PBS를 1일 2회 투여하였다. 3일 간격으로 체중 및 식이 섭취를 관찰하고, 투여 전, 투여 5일차-6일차, 투여 11일차-12일차에 분변을 수집하여 열량 측정계(bomb calorimetry)를 통해 열량분석을 수행하였고, 해당 기간에 섭취한 사료 또한 동일 분석을 통해 열량분석을 수행하였다. 섭취 사료의 열량에서 분변의 열량을 제외한 값을 에너지 흡수율로 정의하였다. 약물 투여 14일차에 실험동물을 희생시켜 소장(Pylorus ileum)의 무게를 측정하였다.
그 결과, 도 8a에서 확인되는 바와 같이, 투약 기간 동안 대조군 대비 다른 실험군에서 소장무게의 증가가 확인되었는데, 그 중 MG12-5 투여군에서의 소장무게의 증가가 가장 두드러지게 나타났으며, 이는 도 8b, 8d 및 8e에서 나타난 바와 같이, 실제 체중의 증가와 에너지 흡수율의 변화 양상과 일치하는 것으로 확인되었다. 특히 도 8d에서 나타난 바와 같이, 투여 1주일 후의 에너지 흡수율의 변화에 있어서 오직 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-5 투여군에서만 유의한 증가 양상이 나타났다. 한편, 도 8c에서 나타난 바와 같이, 각 실험 물질의 투여 전에 수행된 실험에서는 에너지 흡수율의 변화가 나타나지 않았다. 그러나 오히려 체중은 GLP-2를 포함하고 있는 약물 투여군에서 증가하는 경향을 보였고, MG12-5에서 음성대조군(담체 투여군) 대비 유의미하게 증가하는 것을 확인하였다. 에너지 흡수율은 투여 전에는 모든 그룹에서 유사하게 확인되었고, 2회 투여 후인 1주차에서는 GLP-2를 포함하고 있는 약물 투여군에서 증가하는 경향은 보이나 MG12-5에서만 담체 투여군(vehicle) 대비 통계적으로 유의한 증가를 보였고, 4회 투여 후인 2주차에서는 GLP-2-Fc homo보다도 유의미한 증가를 보였다. 모든 투약이 종료되고 각 그룹의 소장무게를 측정한 결과, 에너지 흡수(energy absoprtion)와 유사하게 GLP-2를 포함하고 있는 약물 투여군에서 대조군 대비 유의미한 증가를 관찰하였으며, 특히 MG12-5에서는 다른 두 투약군 대비 통계적으로 유의미한 증가를 보였다.
결론적으로 MG12-5에서 GLP-2-2G 및 GLP-2-Fc 동형 이량체 대비 우월한 소장 무게 증가 효능을 확인하였고, 이는 섭취 사료의 열량을 보다 효율적으로 흡수하게 하여 다른 투약군 대비 통계적으로 유의미한 몸무게 증가를 보이게 하는 것으로 판단되었다.
아울러, 본 발명자들은 MG12-5 외에 다른 형태로 고안된 이중 특이성 융합단백질(MG12-1 및 MG12-4) 역시 실험동물의 소장무게 및 에너지 흡수율을 증가시키는지 확인하기 위해, 투여 물질만 달리하여 상기와 동일한 실험을 수행하였다. 구체적으로 PBS, 10 nmol/kg GLP-1-Fc 동형 이량체, 10 nmol/kg GLP-2-Fc 동형 이량체, 20 nmol/kg MG12-1, 및 20 nmol/kg MG12-4를 각각 피하 투여 하였다. 약물은 주 2회로 2주간 총 4회 투여 하였다. 4회 투약 후 부검 전 몸무게 측정을 하였고, 부검 후 소장을 적출하여 무게를 측정하였다. 부검 후 마우스의 위장관을 통째로 분리하여 장간막과 췌장을 제거한 후, 회장과 맹장이 만나는 부위를 절단하여 소장과 대장으로 분리하였다. 분리된 소장은 10% 중성 포르말린으로 관류세척하여 내용물을 제거하고, 흡수성 타올로 중성 포르말린을 제거한 후 무게를 측정하였다.
실험 결과, 도 9a 및 9b에서 확인되는 바와 같이, 음성대조군 대비 GLP-1-Fc 동형 이량체, GLP-2-Fc 동형 이량체 투여군에서 소장무게 증가 경향을 보였으며, GLP-2-Fc 동형 이량체 투여군에서는 통계적으로 유의미한 증가를 보였다. MG12-1, MG12-4 투여군에서는 GLP-2-Fc 동형 이량체 투여군보다 더 큰 소장무게의 증가를 보였고 두 그룹 모두에서 음성 대조군 대비 통계적으로 유의미한 소장무게의 증가를 보였다. 부검 전 체중변화에서는 음성대조군 대비 GLP-1-Fc 동형 이량체에서 수치적으로 감소, GLP-2-Fc 동형 이량체에서는 변화가 없었으며, MG12-1, MG12-4 투여군에서는 모두 수치적으로 체중 증가 경향을 보였다. 모든 약물 투여군에서 통계적 유의미한 변화는 관찰할 수 없었다.
결론적으로 정상 마우스에 투여 시 MG12-1, MG12-4 투여군에서 GLP-1-Fc 동형 이량체, 및 GLP-2-Fc 동형 이량체보다 소장 무게 증가, 몸무게 증가 효과가 더 우월한 것을 확인하였다.
5-2: 형광분석
이어 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질의 투여에 따른 각 조직 및 장기에서의 분포를 관찰하기 위하여 B6 정상 마우스에서 실험을 수행하였다. 각 물질의 투여 후 분포를 추적 관찰하기 위한 형광물질(fluorophore)로 Cy5.5를 사용하였다. 투여하고자 하는 각 물질인 MG12-1, MG12-4 및 GLP-1Fc 동형 이량체를 붕산 완충액(pH 8.5)로 완충액 교환을 수행하고, Cy5.5 표지 키트(GE, #PA15605)의 프로토콜을 참고하여 적정량의 Cy5.5와 냉장조건에서 밤새 반응시켰다. 반응이 완료된 물질에 있는 반응하지 않은 Cy5.5를 PBS 치환 과정을 통해 제거하고 최종 SDS-PAGE를 통해 Cy5.5가 잘 반응되었는지 확인하였다. 각 투여 물질은 형광강도를 측정할 수 있는 ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 동일한 형광강도를 갖도록 10% DMSO/PBS로 희석한 후 투여하였다. 약물 투여 후, Tmax로 예상되는 24시간 경과 후에 부검 및 관류하여 뇌, 소장, 대장에서 각 투여 약물의 분포를 비교 평가하였다.
그 결과, 하기 표 7 및 도 10에서 나타난 바와 같이, 뇌에서 세 투여 약물의 분포도는 큰 차이를 보이지 않았고, 소장 및 대장에서의 분포량은 GLP-1-Fc 동형이량체 대비 MG12-1, MG12-4에서 더 많은 것으로 확인되었고, 이는 통계적으로 유의미한 차이였다.
결론적으로 정상 마우스에 Cy5.5를 부착시킨 GLP-1-Fc 동형이량체, MG12-1, MG12-4를 투여 시, MG12-1, MG12-4는 GLP-1-Fc homodimer 대비 소장 및 대장으로 더 많이 분포되는 것으로 확인되었다.
각 기관에서의 평균 형광강도
물질 뇌 소장 대장
Cy5.5 0 0 0
GLP-1-Fc
동형 이량체		 161 854 310
MG12-1 489 7320 3702
MG12-4 297 4302 2343
5-3: PET-MRI 분석
이어 본 발명자들은 물질 투여에 따른 각 조직 장기에서의 분포를 관찰하기 위하여 Balb/c-nude 마우스에서 실험을 수행하였다. 각 물질의 투여 후 분포를 추적 관찰하기 위한 방사성 표지자로 Zr89를 사용하였다. 투여하고자 하는 각 물질을 예비시험을 통해 선정된 킬레이터 및 반응 조건으로 Zr89를 표지하였다. 표지된 Zr89-단백질을 PD-10 칼럼을 이용하여 정제하고 Radio TLC와 SEC-HPLC를 이용하여 Zr89 표지효율 및 순도를 확인하였다. Zr89-단백질의 표지효율이 90% 이상, 순도는 80% 이상일 때 적합 판정하였고, 표지된 단백질은 0.2 mCi/0.2 cc로 맞추어 피하투여하였다. 투여물질 당 3마리씩 투여 진행하였으며, 주입 후 1시간, 6시간, 24시간, 48시간, 168시간에 PET-MRI를 이용하여 20분간 정적 영상을 얻었다. 영상 분석을 통해 간, 소장, 대장에서 시간에 따른 약물의 분포를 SUV(Standardized Uptake Value)로 나타내어 비교분석하였다.
분석결과, 도 11에서 확인되는 바와 같이, Fc만 투여한 경우 세 장기에서 특별히 구분되는 분포 특징을 보이지는 않았다. GLP-1-Fc 동형 이량체 및 GLP-2-Fc 동형 이량체의 경우 세 장기 모두에서 Fc대비 증가한 SUV 값을 나타내었고, 특히 소장 및 대장에서 조금 더 증가폭이 컸다. MG12-1, MG12-4, MG12-5의 경우 간으로의 분포는 Fc 대비 줄어들거나 거의 차이가 없었고, 소장 및 대장으로의 분포는 GLP-1-Fc 동형 이량체, GLP-2-Fc 동형 이량체 대비 우월하게 높은 분포를 나타내었다. 이는 MG12-1, MG12-4에서 더 두드러지는 경향을 보였다.
결론적으로 Balb/c-nude 마우스에 Zr89를 부착시킨 Fc, GLP-1-Fc homodimer, GLP-2-Fc homodimer, MG12-1, MG12-4, MG12-5를 투여하여 분포도를 관찰한 결과, MG12-1, MG12-4, MG12-5에서 Fc, GLP-1-Fc homo, 및 GLP-2-Fc homo대비 우월하게 소장 및 대장으로의 물질 분포가 증가하는 것으로 확인되었다.
실험예 6: GLP-1 및 GLP-2 병용투여 대비 MG12의 현저한 효과
본 발명자들은 단순한 GLP-1 및 GLP-2의 병용투여와 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질의 효과를 비교하고자 하였다.
구체적으로, 물질 투여에 따른 몸무게 및 소장의 변화를 관찰하기 위하여 B6 정상 마우스에서 실험을 진행하였다. PBS(Vehicle), 10 nmol/kg Exendin-4(Ex-4), 33.3 nmol/kg GLP-2-2G, Ex-4 + GLP-2-2G, 33.3 nmol/kg MG12-1, 33.3 nmol/kg MG12-3, 33.3 nmol/kg MG12-4, 33.3 nmol/kg MG12-5를 피하 투여하였다. 약물은 Ex-4, GLP-2-2G, Ex-4 + GLP-2-2G의 경우 일 2회로 12일간 총 24회 투여하였고, 나머지 군의 경우 주 2회로 12일간 총 4회 투여하였다. 시험 기간 동안 주 2회 약물 투여 개시 후, 사료 섭취량을 측정하여 누적 사료섭취량으로 나타내었고, 부검 전 몸무게를 측정하여 사료섭취량 대비체중을 계산하였다. 부검 후 소장의 무게와 십이지장 및 공장의 점막 깊이(Mucosal depth) 및 융모 높이(Villus heigh)를 측정하였다. 상세하게는 부검 후 마우스의 위장관을 통째로 분리하여 장간막과 췌장을 제거한 후 회장과 맹장이 만나는 부위를 절단하여 소장과 대장으로 분리하였다. 분리된 소장은 10% 중성 포르말린으로 관류세척하여 내용물을 제거하고, 흡수성 타올로 중성 포르말린을 제거한 후 무게를 측정하였다 무게를 측정한 소장은 십이지장(Duodenum)과 공장(Jejunum) 부분을 적절히 잘라 10% 중성 포르말린액으로 고정하여 조직병리검사에 사용하였다.
그 결과, 대조군(vehicle) 대비 Ex-4 및 GLP-2-2G 투여군에서 소장무게 증가경향을 보였으며 Ex-4를 제외한 모든 실험군에서 대조군 대비 통계적으로 유의성 있는 소장무게 증가를 나타냈다(도 12a). Ex-4 + GLP-2-2G 투여군의 경우 각각의 물질 투여시보다 수치적으로 더 큰 소장무게 증가 경향을 나타냈고, 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12의 경우 병용 투여군보다 수치적으로 더 큰 소장무게 증가 경향을 나타냈다. 특히 MG12-5의 경우 병용 투여군보다 통계적으로 유의한 소장 증가를 나타냈다. 이러한 경향은 십이지장 및 공장의 점막 깊이 및 융모 높이를 측정한 결과에서도 유사하게 나타났다(도 12c 및 12d). 소장의 형태학적 증가에 따른 체중 증가를 확인하기 위하여 누적 사료 섭취량으로 정규화(normalize)하여 체중증가 경향을 비교하였다. 그 결과 도 12b에서 확인되는 바와 같이, 대조군 대비 Ex-4와 병용 투여군에서 약간 증가하는 경향을 보였고, MG12의 경우 병용 투여군 대비 수치적으로 더 큰 체중증가를 나타냈고, 특히, MG12-3, MG12-4, MG12-5에서는 병용 투여군 대비 통계적으로 유의미한 체중 증가를 나타내었다.
결론적으로 정상 마우스에 투여 시 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(MG12) 투여군에서 Ex-4 + GLP-2-2G 보다 소장 무게 및 조직병리학적 변화, 사료섭취량으로 정규화한 몸무게 변화에 있어서 더 우월한 효과를 나타내는 것으로 확인하였다.
실험예 7: MG12 단백질의 대사 증후군 치료효과
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12가 단장 증후군 외에 다양한 대사 증후군에 대하여 치료효과가 있는 여부를 확인하고자 하였다.
이를 위해 구체적으로, 본 발명자들은 고지방 식이를 통해 지방간 및 지방간염을 유도한 실험동물을 대상으로 도 13a 및 표 8에 나타낸 바와 같이, 8주령의 C57BL/6J male 마우스를 사용하여 콜린 결핍 고지방 식이(CD-HFD)를 12주간 처리하였고, 4주간 CD-HFD 식이와 동시에 20 nmol/kg의 MG12-5, MG12-8, 그리고 각각 10 nmol/kg의 GLP-1 및 GLP-2 조합(combo)을 피하로 주 2회 투여하였고, 실험동물의 다양한 혈청학적 지표 및 조직검사를 수행하였다.
각 실험군 별 식이 조건, 투여 물질 및 투여량
실험군 식이 종류 투여 물질 투여량 실험동물 수 투여경로
정상식이군 정상식이 PBS - 6 피하
음성대조군 CD-HFD PBS - 6 피하
MG12-8 투여군 CD-HFD MG12-8 20 nmol/kg 6 피하
MG12-5 투여군 CD-HFD MG12-5 20 nmol/kg 6 피하
GLP-1 및 GLP-2
병용 투여군		 CD-HFD GLP-1 + GLP-2 10 + 10 nmol/kg 6 피하
7-1: 체중 변화 및 먹이 섭취량 변화분석
우선 본 발명자들은 실험기간 동안 실험동물의 체중 및 먹이 섭취량의 변화를 기록하였다. 그 결과, 도 13b 및 도 13c에서 나타난 바와 같이, 본원발명의 MG12 투여 시 실험동물의 체중이 유의하게 감소하였으며, 특히 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-5 및 MG12-8 투여군의 경우 정상식이군(NCD + PBS) 그리고 GLP-1 및 GLP-2 병용 투여군보다 상대적 체중감량 효과가 더 크게 나타났으며, 먹이 섭취량 역시 도 13d에서 확인되는 바와 같이, 정상식이군이나 병용투여군(combo)보다 더 낮게 나타남을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 이형이량체 융합단백질이 GLP-1 및 GLP-2의 단순 병용투여보다 더 뛰어난 효과를 나타냄을 시사하는 것이다.
7-2: 혈당 감소 효과 분석
이어 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 MG-12의 체중감량 효과 외에 혈당 강하 효과를 조사하였다.
상술한 바와 같이 CD-HFD를 16주간 실시한 후 약물(MG12-5, MG12-8, GLP-1 및 GLP-2 병용)을 4주간 1주에 2차례 투여한 마우스를 12시간 동안 사료 급이를 제한한 후 2 g/kg의 용량으로 포도당을 복강투여한 후 시간별로 총 3시간 동안 혈당의 변화를 측정하였다. 그 결과 도 14a에서 확인되는 바와 같이, 정상급이군 대비 CD-HFD 급이군에서는 더 높은 혈당 증가 현상이 확인되었다. 반면, 담체만 투여한 음성대조군(CD-HFD + PBS) 대비 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-5 및 MG12-8 투여군에서는 통계적으로 유의한 혈당 감소가 확인되었다. GLP-1 및 GLP-2 병용투여 대비 MG12에서 통계적으로 유의하게 더 높은 효력을 확인할 수 있었다. 도 14b는 혈당 변화와 관련된 곡선하 면적(area under curve)을 나타낸 그래프로서 CD-HFD에 의해 증가한 혈당 변화의 곡선하 면적이 GLP-1 및 GLP-2의 투여에 의해 정상 범위로 감소하며, 특히 MG12-5 및 MG12-8에 의해 2배 이상 감소하는 것을 확인할 수 있다.
7-3: 간 조직 검사
본 발명자들은 상기와 같은 약물 투여 실험을 마친 마우스를 희생시켜 간 조직을 적출하여, 이에 대한 사진 촬영을 함으로써 간조직의 크기와 색상의 변화를 관찰하였고, 적출된 간조직의 무게를 측정하는 한편, 간독성 수치를 나타내는 지표인 ALT의 혈중 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 15a에서 나타난 바와 같이, MG12-5 투여군, MG12-8 투여군, 및 GLP-1 및 GLP-2 병용투여군에서 정상식이군과 유사한 간 색상을 관찰할 수 있었고 간 조직 내 지방 축적이 약물에 의해 감소한 것을 확인하였다. 아울러, 도 15b에서 확인되는 바와 같이, 정상식이군과 CD-HFD 급이군 간의 간 무게는 유사하였으며, MG12-5와 GLP-1 및 GLP-2 병용 투여에 의해 간 무게가 감소하였고, MG12-8 투여군에서 가장 큰 간 무게 감소 경향을 발견할 수 있었다. 뿐만 아니라, 도 15c에서 확인되는 바와 같이 16주 CD-HFD 식이 이후 측정한 간 독성을 나타내는 혈중 ALT의 수치를 확인한 결과 CD-HFD 식이에 의해 ALT가 약 2배 증가하였으나, MG12-5투여군 및 MG12-8 투여군의 경우 정상식이군과 유사한 정도로 ALT가 감소하는 것을 확인하였다. 반면, GLP-1 및 GLP-2 병용투여군은 음성대조군과 유사하게 높은 혈중 ALT가 확인되었다. 이는 GLP-1 및 GLP-2의 단순 병용투여에서 간독성 보호효과가 없었던 반면 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12의 투여 시 간독성 보호효과가 나타남을 보여주는 결과이다.
실험예 8: MG12 단백질의 비알코올성 지방간염 치료효과
상기 결과를 바탕으로 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12가 지방간에서 더 발달하여 나타나는 중증 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)에 대한 치료효과를 나타내는지 여부를 확인하기 위해 중증 NASH 유발 동물모델을 사용한 동물실험을 수행하였다.
이를 위해 구체적으로 도 16a에 도시된 바와 같은 태어난 지 2일령의 C57BL/6 마우스에 200 mg/kg의 스트렙토조토신(streptozotocin, STZ)를 1회 복강투여한 뒤 4주차부터 60%의 고지방 식이를 4주간 급이한 후 3주 동안 60% 고지방 식이와 음성대조군으로 PBS(vehicle), 그리고 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-8 약물을 10, 30, 그리고 90 nmol/kg의 투여량으로 주 3회 피하투여(s.c.)하였다. 11주차에 마우스를 희생하여 간 및 혈액을 얻어 분석을 진행하였다. 양성대조군인 OCA(obeticholic acid)로 8주차부터 매일 구강으로 30 mg/kg의 농도로 3주간 투여하였다.
우선 체중의 변화를 측정한 결과, 도 16b에서 확인되는 바와 같이, 음성대조군과 비교하여 양성대조군 및 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-8를 처리한 실험군 모두 유사한 체중의 변화를 보임을 확인하였다.
아울러, 본 발명자들은 상기 실험동물들을 대상으로 간 손상의 척도인 혈중 AST 및 ALT 농도를 측정하였다. 그 결과 도 16d에서 확인되는 바와 같이, 음성대조군과 비교했을 때 양성대조군은 AST의 경우 유사한 정도의 발현이 확인되었으며, ALT의 경우 오히려 음성대조군과 비교하여 증가하는 것으로 나타났다. 반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-8은 농도와 무관하게 혈중 AST 및 ALT의 수준을 모두 통계적으로 유의하게 감소시키는 것으로 확인되었다. 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12가 중증 NASH에 대한 치료효과가 있는 물질임을 입증하는 결과이다.
이어 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12의 비알코올성 지방간 증(NAFLD)에 대한 치료효과를 NAFLD 활성 지수를 통해 분석하고자 하였다. NAFLD 활성 지수는 간의 지방축적, 염증반응, 그리고 간세포의 모양의 변화 등을 종합적으로 분석하여 나타낸 지수로서 지방축적은 연두색, 염증반응은 회색, 그리고 간세포의 변화(ballooning)은 핑크색으로 표기하였다. 그 결과, 도 16e에서 확인되는 바와 같이, 음성대조군과 비교하여 양성대조군은 비록 간 내 지방축적은 다소 감소시켰으나, 염증반응을 억제하는데 실패하여 전체적인 지수는 음성대조군과 동등하게 나타났다. 반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12-8은 투여량 의존적으로 NAFLD 활성 지수를 낮추는 것으로 확인되었는데, 특히 30 nmol/kg 및 90 nmol/kg 투여군에서는 0.5 점 이하로 음성대조군 대비 1/8 이하로 낮추는 현저한 효과를 나타냈다. 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12가 비알코올성 지방간증에 대하여 매우 효과적인 치료제 후보물질임을 입증하는 결과이다.
이상의 결과를 놓고 볼 때, 본 발명의 일 실시예에 따른 MG12는 GLP-1 및 GLP-2의 단순 병용투여 시와 비교하여 단장 증후군이나 비만, 제2형 당뇨병 및 비알코올성 지방간염 등 대사성 질환의 치료에 있어서 매우 효과적인 치료 후보물질임을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 이형 이량체 융합단백질은 단장 증후군 및 대사성 질환 등 종래에 GLP-1 및/또는 GLP-2에 의해 치료가 시도된 다양한 질환의 치료제로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> SL METAGEN <120> A novel bispecific protein and use thereof <130> PD21-6067 <150> KR 10-2020-0030727 <151> 2020-03-12 <160> 69 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human GLP-1 mutant (A2G) <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human GLP-1 wild type <400> 2 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin 3 <400> 3 His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 4 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin 4 <400> 4 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 5 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/Exendin 4 hybrid <400> 5 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 6 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lixisenatide <400> 6 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 40 <210> 7 <211> 905 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin 4-XTEN <400> 7 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Ser Pro Ala 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human GLP-2 mutant (A2G) <400> 17 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 18 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human GLP-2 wild type <400> 18 His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 19 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human GLP-2 mutant (A2G, N16G, L17Q) <400> 19 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 20 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human GLP-2 mutant (A2G, L17Q) <400> 20 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Gln Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 21 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glepaglutide <400> 21 His Gly Glu Gly Thr Phe Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Ala Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 <210> 22 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2 analogue 10 <220> <221> MOD_RES <222> (11) <223> linked with a lipidated cross-linker via thiol groups of 11th and 18th amino acids, cystein <220> <221> MOD_RES <222> (18) <223> linked with a lipidated cross-linker via thiol groups of 11th and 18th amino acids, cystein <400> 22 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Cys Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Cys Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 40 <210> 23 <211> 286 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> first fusion protein of bispecific fusion protein containing GLP-1 analogue <400> 23 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser 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Thr Val Leu His Gln Asp Trp 130 135 140 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 145 150 155 160 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 165 170 175 Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 180 185 190 Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 195 200 205 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 210 215 220 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg 225 230 235 240 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 245 250 255 Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 260 265 270 Ser Leu Ser Leu Gly Lys 275 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 37 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 38 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 39 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 39 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 10 15 Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 20 25 30 <210> 40 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 40 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 10 15 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 20 25 30 <210> 41 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 41 Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly 1 5 10 15 Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg 20 25 30 Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro 35 40 <210> 42 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 42 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 10 15 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 20 25 30 Pro <210> 43 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 43 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala 1 5 10 15 Lys Asn Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Thr Arg Gly Gly 20 25 30 Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Thr 35 40 45 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 50 55 <210> 44 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 44 Ala Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 46 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 47 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 48 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 48 Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 49 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide unit sequence <400> 49 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 50 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide unit sequence <400> 50 Gly Ser Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 51 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 51 Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 52 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 52 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr 1 5 10 <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 53 Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe 1 5 10 <210> 54 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide unit sequence <400> 54 Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 55 Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Ala Glu Ala Cys 1 5 10 <210> 56 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 56 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala 20 25 30 Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 35 40 45 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 57 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 58 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 58 Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 59 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 59 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 10 <210> 60 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 60 Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 <210> 61 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 61 Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp 1 5 10 15 Val <210> 62 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 62 Pro Leu Gly Leu Trp Ala 1 5 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 63 Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu 1 5 10 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 64 Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly 1 5 10 <210> 65 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 65 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 66 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 66 Gly Phe Leu Gly 1 <210> 67 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 67 Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp 1 5 10 15 Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gly Ser Gln Lys Ala Gly Val Asp Glu 20 25 30 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 68 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser 1 5 10 15 <210> 69 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 CH3 domain <400> 69 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 1 5 10 15 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 20 25 30 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 35 40 45 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 50 55 60 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 65 70 75 80 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 85 90 95 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100

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  5. GLP-1 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제1융합단백질 및 GLP-2 유사체가 항체 Fc 영역에 연결된 제2융합단백질을 포함하며, 상기 제1융합단백질 및 제2융합단백질의 이량체화에 의해 생성되는 이중 특이성 융합단백질.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 GLP-1 유사체는 GLP-1, 엑센딘 3(Exendin 3), 엑센딘 4(Exendin 4), GLP-1/Exendin 4 하이브리드, GLP-1-XTEN, Lixisenatide, Albiglutide, Liraglutide, Dulaglutide, Extenatide, Taspoglutide, Lixisenatide, 또는 GLP-1 연속 반복체인, 이중 특이성 융합단백질.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 GLP-1 유사체 및 상기 GLP-2 유사체 중 적어도 하나는 연속적 반복체(tandem repeat)이고, 상기 GLP-1 유사체 및 상기 GLP-2 유사체의 반복 횟수는 서로 상이한 것을 특징으로 하는, 이중 특이성 융합단백질.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 GLP-1은 서열번호 1 또는 2로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이성 융합단백질.
  9. 제6항에 있어서, 상기 Exendin 3는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이성 융합단백질.
  10. 제6항에 있어서, 상기 Exendin 4는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이성 융합단백질.
  11. 제6항에 있어서,
    상기 GLP-1/Exendin 4 하이브리드는 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이성 융합단백질.
  12. 제6항에 있어서,
    상기 Lixisenatide는 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이성 융합단백질.
  13. 제6항에 있어서,
    상기 Exendin 4-XTEN은 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이성 융합단백질.
  14. 제6항에 있어서,
    상기 Albiglutide는 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이성 융합단백질.
  15. 제6항에 있어서,
    상기 Liraglutide는 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이성 융합단백질.
  16. 제6항에 있어서,
    상기 Taspoglutide는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이성 융합단백질.
  17. 제6항에 있어서,
    상기 GLP-1 연속 반복체는 서열번호 11로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이성 융합단백질.
  18. 제5항에 있어서,
    상기 항체 Fc 영역은 하이브리드 항체 Fc 영역인, 이중 특이성 융합단백질.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 하이브리드 항체 Fc 영역은 둘 이상의 아이소타입의 적어도 두 개 이상부분이 혼합된 형태의 Fc 영역인, 이중 특이성 융합단백질.
  20. 제5항에 있어서,
    상기 제1융합단백질은 하이브리드 Fc 영역 중 CH3 도메인의 10번째 아미노산인 세린이 시스테인(C)으로 치환되고, 22번째 아미노산인 트레오닌(T)이 트립토판(W)으로 치환된 것(Knob 구조)이고, 제2융합단백질은 Fc 영역 중 CH3 도메인의 5번째 아미노산인 타이로신(Y)이 시스테인(C)로, 22번째 아미노산인 트레오닌이 세린(S)로, 24번째 아미노산인 류신(L)이 알라닌(A)로, 63번째 아미노산인 타이로신(Y)이 발린(V)로 치환된 것(Hole 구조)이거나, 또는
    상기 제1융합단백질은 Fc 영역 중 CH3 도메인의 5번째 아미노산인 타이로신(Y)이 시스테인(C)으로, 22번째 아미노산인 트레오닌이 세린(S)로, 24번째 아미노산인 류신(L)이 알라닌(A)로, 63번째 아미노산인 타이로신(Y)이 발린(V)로 치환된 것(Hole 구조)이고, 상기 제2융합단백질은 하이브리드 Fc 영역 중 CH3 도메인의 10번째 아미노산인 세린이 시스테인(C)으로 치환되고, 22번째 아미노산인 트레오닌(T)이 트립토판(W)으로 치환된 것(Knob 구조)인, 이중 특이성 융합단백질.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 하이브리드 항체 Fc 영역은 서열번호 12 내지 16으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이성 융합단백질.
  22. 제5항에 있어서,
    상기 GLP-2 유사체는 GLP-2, Glepaglutide, 또는 GLP-2 analogue 10인, 이중 특이성 융합단백질.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 GLP-2는 서열번호 17 내지 20으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이성 융합단백질.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 Glepaglutide는 서열번호 21로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이성 융합단백질.
  25. 제22항에 있어서,
    상기 GLP-2 analogue 10는 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이성 융합단백질.
  26. 제5항에 있어서,
    상기 제1융합단백질은 서열번호 23 내지 30으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이성 융합단백질.
  27. 제5항에 있어서,
    상기 제2융합단백질은 서열번호 31 내지 36으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이성 융합단백질.
  28. 제5항에 있어서,
    상기 GLP-1 유사체 및 상기 GLP-2 유사체 사이 또는 상기 GLP-1 유사체 및 상기 Fc 영역 사이 또는 상기 GLP-2 유사체 및 상기 Fc 영역 사이에 링커 펩타이드가 삽입된, 이중 특이성 융합단백질.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 링커 펩타이드는 N-글리칸 부착 부위를 포함하거나 포함하지 않는, 이중 특이성 융합단백질.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 제1융합단백질은 상기 링커 펩타이드에 N-글리칸 부착 부위를 포함하지 않고 상기 제2융합단백질은 상기 링커 펩타이드에 N-글리칸 부착 부위를 포함하는, 이중 특이성 융합단백질.
  31. 제29항에 있어서,
    상기 제1융합단백질은 상기 링커 펩타이드에 N-글리칸 부착 부위를 포함하고 상기 제2융합단백질은 상기 링커 펩타이드에 N-글리칸 부착 부위를 포함하지 않는, 이중 특이성 융합단백질.
  32. 제28항에 있어서,
    상기 링커 펩타이드는 EPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 37), EPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 38), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 39), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 40), AKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECP(서열번호 41), GGGGSGGGGSGGGGSEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 42), GGGGSGGGGSGGGGSAKNTTAPATTRNTTRGGEEKKKEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 43), AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 44), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 45), GGSGG(서열번호 46), GGSGGSGGS(서열번호 47), GGGSGG(서열번호 48), 서열번호 (G4S)n(단위체: 서열번호 49, n은 1 내지 10의 정수), (GGS)n(n은 1 내지 10의 정수), (GS)n(n은 1 내지 10의 정수), (GSSGGS)n(단위체: 서열번호 50, n은 1 내지 10의 정수), KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 51), EGKSSGSGSESKST(서열번호 52), GSAGSAAGSGEF(서열번호 53), (EAAAK)n(단위체: 서열번호 54, n은 1 내지 10의 정수), CRRRRRREAEAC(서열번호 55), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 56), GGGGGGGG(서열번호 57), GGGGGG(서열번호 58), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 59), PAPAP(서열번호 60), (Ala-Pro)n(n은 1 내지 10의 정수), VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 61, PLGLWA(서열번호 62), TRHRQPRGWE(서열번호 63), AGNRVRRSVG(서열번호 64), RRRRRRRR(서열번호 65), GFLG(서열번호 66), GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 67), 또는 GSTSGSGKPGSGEGS(서열번호 68)인, 이중 특이성 융합단백질.
  33. 삭제
  34. 제5항 내지 제32항 중 어느 한 항의 이중 특이성 융합단백질을 유효성분으로 포함하는, 궤양성 장염, 베체트병, 및 단장 증후군으로 구성되는 군으로부터 선택되는 장의 증식을 필요로 하는 질환 또는 증상의 치료에 사용되는, 약학적 조성물.
  35. 삭제
  36. 삭제
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