KR20220080221A - 신규 변형 면역글로불린 fc 융합단백질 및 그의 용도 - Google Patents

신규 변형 면역글로불린 fc 융합단백질 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질 및 그의 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질은 다른 생물학적 활성 단백질과 융합 단백질의 형태로 발현시켰을 때, 당해 생물학적 활성 단백질의 생체 내 반감기를 증가시킬 뿐만 아니라 ADCC나 CDC와 같은 효과기 기능을 유효하게 억제함으로써 예기치 못한 부작용을 최소화할 수 있다.

Description

신규 변형 면역글로불린 FC 융합단백질 및 그의 용도{A novel modified immunoglobulin Fc fusion protein and use thereof}
본 발명은 신규 변형 면역글로불린 Fc 융합단백질 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 반감기가 증가되고 ADCC나 CDC와 같은 항체 Fc 단편에서 기인할 수 있는 부작용을 최소화할 수 있는 신규 변형 면역글로불린 Fc 융합단백질 및 그의 용도에 관한 것이다.
면역글로불린(항체) Fc 도메인은 다양한 치료 및 진단 단백질을 위한 담체 단백질로서 널리 사용되고 있다. 항체는 2 개의 기능적으로 독립적인 부분, 즉, 항원에 결합하는 "Fab"로 알려진 가변 도메인 및 "탐식세포에 의한 보체 활성화 및 공격과 같은 이펙터 기능에 연결되는 "Fc"로 알려진 불변 도메인을 포함한다. Fc는 혈청 반감기가 길고 Fab는 수명이 짧다(Capon et al., Nature 337: 525-531, 1989). 치료 단백질 또는 펩티드와 함께 구성될 때, Fc 도메인은 더 긴 반감기를 제공 할 수 있거나, Fc 수용체 결합, 단백질 A 결합, 보체 고정 그리고 더 나아가 태반 전달과 같은 기능을 통합 할 수 있다. 특히, 이러한 Fc 도메인의 더 긴 반감기는 신생아 Fc 수용체(Neonatal Fc Receptor; 이하, "FcRn"으로 지칭됨) 결합 친화성에 기인한다.
지금까지, Fc 도메인 및 생물학적 활성 단백질을 융합시키기 위한 많은 기술이 개발되어 생물학적 활성 단백질의 반감기를 증가시킬 수 있었다. 이의 대표적인 예로는 TNFα 수용체 2가 IgG1 항체의 Fc 도메인에 연결된 융합단백질인 에타너셉트 (상표명: Enbrel®)을 들 수 있다(미국 특허 제5,447,851호). 그 외에도 IgG 항체의 Fc 도메인에 융합된 일부 사이토카인 및 성장 호르몬도 존재한다.
그러나, 세포표면 수용체의 세포외 도메인으로의 융합과 달리, 수용성 단백질의 IgG로의 융합은 비-융합 사이토카인 또는 성장 인자와 비교하여 생물학적 활성의 감소를 초래한다. 키메라 단백질은 이량체로서 존재하며, 서로 근접한 2 개의 활성 단백질의 존재로 인해 수용체와 같은 표적분자에 결합하는 데 입체 장애(steric hinderance)를 유발한다. 따라서, 효율적인 Fc 융합 단백질을 생성하기 위해 이러한 문제를 극복해야 한다.
Fc 융합 기술의 또 다른 한계는 의도하지 않은 면역 반응이다. 면역 글로불린의 Fc 도메인은 또한 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC) 또는 보체-의존적 세포 독성(CDC)과 같은 효과기(effector) 기능을 갖는다. 특히, 4개의 인간 IgG 동소형은 활성화 Fcγ 수용체(FcγRI, FcγRIIa 및 FcγRIIIa를 포함하는 FcγR), 억제성 FcγRIIb 수용체 및 보체(C1q)의 제1인자와 상이한 친화도를 가지고 결합하여 매우 상이한 효과기 기능을 유발한다(Bruhns, P. et al., Blood 113(16): 3716-3725, 2009). FcγR 또는 C1q에 대한 IgG의 결합은 힌지 영역 및 CH2 도메인에 위치한 잔기에 의존한다. 그러나, Fc 도메인의 이펙터 기능은 Fc 도메인에 융합된 치료용 단백질이 생체 내에서 대상체에게 투여될 때 대상체에서 세포사멸, 사이토카인 분비 또는 염증을 초래하며, 따라서, 이들이 꼭 필요한 것이 아니라면, 원하지 않는 반응을 감소시키기 위해 억제해야 한다.
상기 확인된 문제점을 극복하기 위해, US2006/0074225A1, Armour, K. L. 등(Eur. J. Immunol., 29(8): 2613-2624, 1999), Shields, R. L. et al.(J. Biol. Chem. 276(9): 6591-6604, 2001), 그리고 Idusogie, EE. et al.(J. Immunol. 164(8): 4178-4184, 2000)에 기술된 것을 포함하여 일부 변형된 Fc 도메인 단백질이 개발된 바 있다.
아울러, 반감기의 개선에도 불구하고, Fc 도메인과 융합된 치료 단백질의 반감기를 추가로 개선할 필요성 역시 여전히 존재한다.
그러나, 상기 종래 기술들은 만족스러운 반감기 연장 수준을 달성하지 못하거나 다른 부작용을 갖는 단점을 가지고 있다.
따라서, 본 발명은 상술한 여러 가지 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 ADCC 및 CDC와 같은 효과기 기능 없이 융합된 치료 단백질이 더 긴 반감기를 나타내면서도 생리활성 단백질의 생성과 활성에는 영향을 주지 않는 신규한 변형 Fc 도메인 단백질을 제공하는 것이다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1 내지 4로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 변형 IgG4 Fc 도메인 단백질의 18번째 및 196번째 아미노산이 다른 아미노산으로 변이된 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하나 이상의 생물학적 활성 단백질(API, active pharmaceutical ingredient)이 상기 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 연결된 융합단백질이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질 또는 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질을 포함하는 동형 또는 이형-이량체가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질 또는 그를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 동형 또는 이형-이량체를 유효성분으로 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질에 생물학적 활성 단백질이 융합된 융합단백질 또는 그를 포함하는 동형 또는 이형-이량체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 생물학적 활성 단백질의 생체 내 반감기를 연장하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질은 다른 생물학적 활성 단백질과 융합함으로써 상기 생물학적 활성 단백질의 반감기를 증가시키면서도 항체 기반 단백질 치료제 사용 시 부작용인 ADCC나 CDC와 같은 항체의 Fc 도메인 의존성 효과기 기능을 불활성화할 수 있다. 그러나 본 발명의 효과가 상술한 내용으로 한정되는 것은 아니다.
도 1 내지 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일 특이성 융합단백질의 구조를 보여주는 개요도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질 구조를 보여주는 개요도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질로 구성된 동형 이량체 구조를 보여주는 개요도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일 특이성 융합단백질의 동형 이량체 구조를 보여주는 개요도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 두 개의 서로 다른 단일 특이성 융합단백질의 이형 이량체 구조를 보여주는 개요도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 두 개의 다른 이중 특이성 융합단백질로 구성되는 이형 이량체 구조를 보여주는 개요도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 IgG1의 힌지 영역과 링커 펩타이드(linker 펩타이드)를 갖는 단일 특이성 융합단백질의 동형 이량체 구조를 보여주는 개요도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 두 개의 서로 다른 단일 특이성 융합단백질로 구성되는 이형 이량체의 구조를 보여주는 개요도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 C-말단에 생물학적 활성 단백질을 가진 단일 특이성 융합단백질의 동형 이량체 구조를 보여주는 개요도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 C-말단에 생물학적 활성단백질을 갖는 두 개의 다른 이중 특이성 융합단백질로 구성되는 이형 이량체의 구조를 보여주는 개요도이다.
도 13은 FcRn에 의해 항체가 재사용되는 과정을 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 14a는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG-11)의 시료 생산 결과를 나타내는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 사진이고, 도 14b는 생산된 PG-11을 크기배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)로 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 15a는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG-22)의 시료 생산 결과를 나타내는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 사진이고, 도 15b는 생산된 PG-22을 크기배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)로 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 16a는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG-088)의 시료 생산 결과를 나타내는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 사진이고, 도 16b는 생산된 PG-088을 크기배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)로 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 17a는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG-088m)의 시료 생산 결과를 나타내는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 사진이고, 도 17b는 생산된 PG-088m을 크기배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)로 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 18a는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG-075)의 시료 생산 결과를 나타내는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 사진이고, 도 18b는 생산된 PG-075을 항-IgG 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석으로 결과를 나타내는 사진이다.
도 19a는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG-110)의 시료 생산 결과를 나타내는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 사진이고, 도 19b는 생산된 PG-110을 크기배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)로 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 20a는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG-129)의 시료 생산 결과를 나타내는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 사진이고, 도 20b는 생산된 PG-129-2를 크기배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)로 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 21a는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG-400)의 시료 생산 결과를 나타내는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 사진이고, 도 21b는 생산된 PG-400를 크기배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)로 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 22a는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG-410)의 시료 생산 결과를 나타내는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 사진이고, 도 22b는 생산된 PG-410를 크기배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)로 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 이형 이량체 단백질 MG12-4(좌측) 및 MG12-5(우측)의 시료 생산 결과를 나타내는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 24a는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG-50-1)의 시료 생산 결과를 나타내는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 사진이고, 도 24b는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG-50-2)의 시료 생산 결과를 나타내는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 사진이며, 도 24c는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG-073)의 시료 생산 결과를 나타내는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 사진(좌측), 및 상기 SDS-PAGE 분석 결과를 바탕으로 추정되는 상기 융합단백질의 다양한 절단형태의 구조를 나타내는 개요도(우측)이고, 도 24d는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG-210-5)의 시료 생산 결과를 나타내는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 사진(상단) 및 생산된 PG-210-5를 크기배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)로 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램(하단)이며, 도 24e는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG-210-6)의 시료 생산 결과를 나타내는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 사진(상단), 및 생산된 PG-210-6을 크기배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)로 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램(하단)이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 융합단백질(PG-11)와 재조합 인간 태아 Fc 수용체(rhFcRn) 사이의 결합 친화도를 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 이용하여 분석한 결과를 나타내는 일련의 그래프이다. 세 개의 그래프는 각각 독립시행된 시험 결과를 나타낸다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 융합단백질(PG-11, 상단)와 재조합 인간 태아 Fc 수용체(rhFcRn) 사이의 결합 친화도를 IgG4 Fc 도메인을 사용하고 있는 Trulicity(하단)와 비교하여 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 이용하여 분석한 결과를 나타내는 일련의 그래프이다. 좌측 중간 및 우측의 그래프들은 각각 독립 시행된 세 번의 시험 결과를 나타낸다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 융합단백질(PG-11, 상단)와 재조합 인간 태아 Fc 수용체(rhFcRn) 사이의 결합 친화도를 IgG1 Fc 도메인이 포함된 재조합 인간화 항체인 Rituximab(하단)와 비교하여 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 이용하여 분석한 결과를 나타내는 일련의 그래프이다. 하단의 좌측 중간 및 우측의 그래프들은 각각 독립 시행된 세 번의 시험 결과를 나타낸다.
도 28은 항-PD-L1 scFv 및 IL-2 단백질이 본 발명의 일 실시예에 따른 NTIG 단백질의 N-말단 및 C-말단에 각각 연결된 이중 특이성 융합단백질(좌측)과 대조군으로서 항-PD-L1 scFv 및 IL-2 단백질이 서열번호 2의 변형 IgG4 Fc 단백질의 N-말단 및 C-말단에 각각 연결된 이중 특이성 융합단백질(우측)의 rhFcRn과의 결합친화도를 rhFcRn을 리간드로 하고 상기 두 물질을 검체로 하여 SPR 분석을 통해 비교분석한 결과를 나타내는 일련의 그래프이다.
도 29는 항-PD-L1 scFv 및 IL-2 단백질이 본 발명의 일 실시예에 따른 NTIG 단백질의 N-말단 및 C-말단에 각각 연결된 이중 특이성 융합단백질(좌측)과 대조군으로서 항-PD-L1 scFv 및 IL-2 단백질이 서열번호 2의 변형 IgG4 Fc 단백질의 N-말단 및 C-말단에 각각 연결된 이중 특이성 융합단백질(우측)의 rhFcRn과의 결합친화도를 상기 도 28과 반대로 상기 두 물질을 리간드로 하고 rhFcRn을 검체로 하여 SPR 분석을 통해 비교분석한 결과를 나타내는 일련의 그래프이다.
도 30은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG-11)의 Fc 감마 수용체I(FcgR1, 좌측) 및 Fc 감마 수용체 IIIa(FcgR3a, 우측)와의 결합 친화도를 IgG1 계열 인간화 항체인 Rituximab과 비교하여 BLI 분석을 통해 분석한 결과를 나타내는 일련의 그래프들이다. 상단, 중단, 및 하단은 독립시행된 세 번의 실험 결과를 나타낸다.
도 31은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG-11)의 다른 다양한 Fc 감마 수용체(FcgR2a, Fcg2b 및 FcgR3b)와의 결합친화도를 IgG1 계열 인간화 항체인 Rituximab과 비교하여 BLI 분석을 통해 분석한 결과를 나타내는 일련의 그래프들이다. 대조군으로는 PBS를 사용하였다.
도 32는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG-11)의 보체 C1q와의 결합 친화도를 Rituximab과 비교하여 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 33은 본 발명의 다양한 실시예에 따른 GLP-2 유사체를 포함하는 융합단백질들(PG-22, PG-210-5, PG-210-6, MG12-4 및 MG12-5)의 GLP-2 활성을 비교분석한 결과를 나타내는 일련의 그래프이다. 상하단의 두 그래프는 독립시행된 두 번의 시험 결과를 각각 나타낸다.
도 34는 본 발명의 실시예 2-3의 이량체성 IL-10 변이체 융합단백질(좌측) 및 실시예 2-4의 단량체성 IL-10 변이체 융합단백질(우측)의 처리 농도에 따른 IL-10R1과의 친화도를 BLI 분석으로 확인한 결과를 나타내는 일련의 그래프이다.
도 35a는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질 PG-210-6의 농도에 따른 대식세포에서의 TNF-α 방출정도를 ELISA 분석으로 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 35b는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질 PG-410의 처리 농도에 따른 대식세포에서의 TNF-α 방출정도를 ELISA 분석으로 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 35c는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질 PG-110 및 PG-088m의 처리 농도에 따른 대식세포에서의 TNF-α 방출정도를 ELISA 분석으로 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 36a는 비교예로 FcεRIα-modified IgG4 Fc(상단)와 본 발명의 실시예 3-3의 융합단백질 FcεRIα-NTIG-IL-10Vm(하단)의 마우스 IgE와의 친화도를 BLI 분석으로 분석한 결과를 나타내는 일련의 그래프이고, 도 36b는 본 발명의 실시예 3-3의 융합단백질 FcεRIα-NTIG-IL-10Vm의 인간 IgE와의 친화도를 BLI 분석으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 37은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질 PG-110 및 FcεRIα-modified IgG4 Fc의 IgE 억제 활성을 β-헥소사미니데이즈 방출 분석을 통해 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 38 은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질 PG-400(좌측) 및 PG-410(우측)의 CD40L과의 결합친화도를 BLI 분석으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 39는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질 PG-110의 다양한 투여경로(SC, IV, IP 및 IM)에 따른 약물 동역학적 프로파일을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1 내지 4로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 변형 IgG4 Fc 도메인 단백질의 18번째 및 196번째 아미노산이 다른 아미노산으로 변이된 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질이 제공된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "변형 IgG4 면역글로불린 Fc 도메인 단백질" 또는 "변형 IgG4 Fc 도메인 단백질"은 면역글로불린의 Fc 도메인의 구성요소인 힌지, CH2 및 CH3의 전부 또는 일부가 서로 다른 유형의 항체 분자 즉 IgG, IgD, IgE, IgM 등으로부터 유래한 것을 조합하여 제조된 재조합 항체 Fc 도메인 단백질을 의미한다. 대표적인 변형 IgG4 면역글로불린 Fc 도메인 단백질로는 대한민국 특허 제897938호에 개시된 것들이 존재한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질" 또는 "Fc 도메인 변이체 단백질"은 상기 변형 IgG4 Fc 도메인 단백질 내의 적어도 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 변이체 단백질을 의미한다.
상기 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질에 있어서, 상기 18번째 아미노산의 변이는 T18N, T18K, 및 T18Q로 구성되는 군으로부터 선택되는 변이일 수 있고, 상기 196번째 아미노산의 변이는 M196A, M196F, M196I, M196L, M196V, M196P, 및 M196W으로 구성되는 군으로부터 선택되는 변이일 수 있으며, 상기 18번째 아미노산의 변이는 T18Q인 것이 더욱 바람직하고, 상기 196번째 아미노산의 변이는 M196L인 것이 바람직하다.
상기 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질은 C-말단에 라이신(K)이 제거되거나 제거되지 않은 것일 수 있다. 라이신의 제거 여부는 C-말단에 다른 API가 연결되는지 여부에 따라 결정할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질의 C-말단에 API가 연결되는 경우에는 라이신이 제거되는 것이 단백질 생산 측면에서 유리할 수 있고, C-말단에 API가 연결되지 않는 경우라면 굳이 라이신을 제거할 필요가 없다.
상기 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질은 서열번호 5 내지 9로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하나 이상의 생물학적 활성 단백질(API, active pharmaceutical ingredient)이 상기 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 연결된 융합단백질이 제공된다(도 1 내지 4).
본 문서에서 사용되는 용어 "생물학적 활성 단백질"은 인체의 조직 및 기관을 구성하는 단백질인 구조단백질과 구분되는 개념으로 인체 내에서 일어나는 대사작용이나 세포간 또는 세포내 신호전달 등의 특정한 기능을 수행하는 단백질로서, 해당 단백질의 결핍 또는 과잉에 의해 야기되는 질환의 진단 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
도 1 내지 4에 도시된 바와 같이, 본 발명의 융합단백질(10 내지 40)에서, 생물학적 활성 단백질 또는 활성 약제학적 성분(API, 11)은 IgG1의 힌지 영역(13) 및/또는 G4S 링커와 같은 링커 펩타이드(14)를 통해 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질(12)의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다. 그러나, 힌지 영역(13)은 이량체화에 필수적이다. 생물학적 활성 단백질(11)이 IgG1의 힌지 영역(13)에 직접 연결된 경우, 힌지 영역(즉, 서열번호 20 및 21)은 도 3에 도시된 바와 같이 링커로 간주 될 수 있다. 힌지 영역은 유연성 및 시스테인 잔기를 통해 분자간 이황화 결합을 형성할 수 있는 이량체화 모이어티를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질은 하나 또는 두 개의 생물학적 활성 단백질을 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질이 두 개의 생물학적 활성 단백질을 갖는 경우, 융합 단백질은 그 자체적으로 이중 특이성을 나타낸다(도 4). 도 4a에 도시 된 바와 같이, 제1 생물학적 활성 단백질(11a)는 IgG1의 힌지 영역(13)을 통해 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질(12)의 N-말단에 연결되고, 제2 생물학적 활성 단백질(11b)은 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질(12)의 C-말단에 링커 펩타이드(14)를 통해 연결된다. 아울러 도 4b에 도시된 바와 같이, IgG1 힌지(13) N-말단에 추가로 G4S 링커와 같은 링커 펩타이드(14)가 연결되고 링커 펩타이드(14)의 N-말단에 제1 생물학적 활성 단백질(11a)가 연결되고 제2 생물학적 활성 단백질(11b)은 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질(12)의 C-말단에 링커 펩타이드(14)를 통해 연결된다. 이 경우, N-말단에 연결된 링커 펩타이드(14)와 C 말단에 연결된 링커 펩타이드(14)는 동일한 서열일 수 있고, G4S 링커와 같은 성질을 갖고 있으나, 구체적인 서열은 일부 상이할 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 생물학적 활성 단백질은 사이토카인, 효소, 혈액응고인자, 막 수용체의 세포외 도메인, 성장인자, 펩타이드 호르몬 또는 항체 유사체일 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 링커 펩타이드의 길이는 2 내지 60 a.a., 4 내지 55 a.a., 5 내지 50 a.a., 5 내지 46 a.a. 5 내지 45 a.a. 또는 5 내지 30 a.a.일 수 있다. 상기 링커 펩타이드 중 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질의 N-말단에 API를 연결하는 링커 펩타이드는 IgG1 항체 중쇄의 힌지 영역의 일부 또는 전부를 포함할 수 있고, 힌지 영역의 일부를 포함하는 경우 힌지 영역의 일부의 N-말단 또는 C-말단에 인공적인 링커 펩타이드가 추가된 것일 수 있다. 아울러 상기 힌지 영역은 두 가지 이상의 항체 중쇄의 힌지 영역의 부분이 혼합된 하이브리드 형태의 힌지 영역일 수도 있다. 상기 링커 펩타이드는 구체적으로 GGGGSGGGGSGGGGSEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 14), RNTGRGGEEKKGSKEKEEQEERETKTPECP(서열번호 15), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 16), GSGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPPCP(서열번호 17), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 18), EPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 19), EPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 20), GGGGSGGGGSGGGGSAKNTTAPATTRNTTRGGEEKKKEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 21), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 22), (G4S)n(n은 1 ~ 10의 정수임, 단위체 서열번호 23), (GSSGGS) n (단위체: 서열번호 24, n은 1 내지 10의 정수), SGGGSGGGGSGGGGSGGEEQEEGGS(서열번호 25), AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 26) KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 27), EGKSSGSGSESKST(서열번호 28), GSAGSAAGSGEF(서열번호 29), (EAAAK)n(단위체: 서열번호 30, n은 1 내지 10의 정수), CRRRRRREAEAC(서열번호 31), GGGGGGGG(서열번호 32), GGGGGG(서열번호 33), PAPAP(서열번호 34), (Ala-Pro)n(n은 1 ~ 10의 정수), VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 35, PLGLWA(서열번호 36), TRHRQPRGWE(서열번호 37), AGNRVRRSVG(서열번호 38), RRRRRRRR(서열번호 39), GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 40), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 41), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 42), GFLG(서열번호 43), AKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECP(서열번호 44), GGSGG(서열번호 45), GGSGGSGGS(서열번호 46), GGGSGG(서열번호 47), 및 GSTSGSGKPGSGEGS(서열번호 48)로 구성되는 군으로부 선택되는 하나 또는 그 이상의 조합일 수 있다.
이때, 상기 사이토카인은 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 콜로니 자극인자, 또는 종양 괴사 인자일 수 있으며, 상기 케모카인은 CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL12, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL16, XCL1, XCL2, 또는 CX3CL1일 수 있고, 상기 인터페론은 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-입실론, 인터페론-카파, 인터페론-델타, 인터페론-감마, 인터페론-타우, 인터페론-오메가, 인터페론-뉴 또는 인터페론-제타일 수 있으며, 상기 인터류킨은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12α, IL-12β, IL-13, IL-15 또는 IL-21일 수 있으며, 상기 콜로니 자극인자는 대식세포 콜로니-자극 인자(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF), 과립구 대식세포 콜로니-자극인자(granulocyte macrophage-stimulating factor, GM-CSF), 과립구 콜로니-자극인자(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF) 또는 Promegapoietin일 수 있고, 상기 종양 괴사 인자는 TNF 알파(TNFα), TNF 베타(TNFβ), CD40 리간드 (CD40L), Fas 리간드(FasL), TNF-관련 세포사멸 유도 리간드(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL), 또는 LIGHT일 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 효소는 tPA(tissue-type plasminogen activator), urokinase, alteplase, reteplase, tenecteplase, streptokinase, anlsteplase, taaphylokinase, nattokinase, limbrokinase, collagenase, glutenase, alglucerase, velaglucerase, imiglucerase, taliglucerase-α, β-glucocerebrosidase, α-galactosiase A, α-glucosiase, α-L-iduroniase, arylsulphatase B, agalsidase, adenosine deaminase, phenylalanine ammonia lyase, dornase, rasburicase, pegloticase, glucarpidase, 또는 ocriplasmin일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 혈액응고인자는 factor VIII 또는 factor IX일 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 막 수용체는 수용체 타이로신 카이네이즈(receptor tyrosine kinase, RTK) 슈퍼패밀리, T 세포 수용체, Fc 수용체, 케모카인 수용체, Toll-like 수용체 패밀리, 구아닐릴 사이클레이즈-연결 수용체(guanylyl cyclase-linked receptor, GCCR), 또는 수용체 세린/트레오닌 카이네이즈일 수 있고, 상기 수용체 타이로신 카이네이즈는 EGFR 패밀리, 인슐린 수용체 패밀리, 혈소판-유래 성장인자 수용체(PDGFR) 패밀리, 혈관 내피 성장인자 수용체(VEGFR) 패밀리, 섬유아세포 성장인자 수용체(FGFR) 패밀리, 대장암 카이네이즈(colon cancer kinase, CCK) 패밀리, 신경 성장인자 수용체(NGFR) 패밀리, 간세포 성장인자 수용체(HGFR) 패밀리, 에리트로포이에틴-생산 인간 간세포 수용체(EphR) 패밀리, 타이로신-단백질 카이네이즈 수용체(AXL) 패밀리, 안지오포이에틴 수용체(TIER) 패밀리, 수용체 타이로신 카이네이즈 연관 수용체(RYKR) 패밀리, 디스코이딘 도메인 수용체(DDR) 패밀리, RET(rearranged during transfection) 패밀리, 류코사이트 수용체 타이로신 카이네이즈(LTK) 패밀리, ROR(receptor tyrosine kinase-like orphan receptors) 패밀리, 또는 근육-특이적 카이네이즈(MuSK) 패밀리, CD80(B7.1), CD83일 수 있으며, 상기 Fc 수용체는 Fc 감마 수용체, Fc 알파 수용체 또는 Fc 엡실론 수용체일 수 있고, 상기 사이토카인 수용체는 제1형 사이토카인 수용체, 제2형 사이토카인 수용체, 종양 괴사인자 수용체 패밀리, 케모카인 수용체, TGF-베타 수용체 패밀리일 수 있으며, 상기 Toll-유사 수용체 패밀리는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 또는 TLR13일 수 있고, 상기 구아닐릴 사이클레이즈-연결 수용체는 나트륨이뇨 인자 수용체 1(NPR1), NPR2, 또는 NPR3일 수 있으며, 상기 수용체 세린/트레오닌 카이네이즈는 TGF-β 슈퍼패밀리 수용체, 골형성 단백질(BMP) 수용체, 또는 액티빈 수용체-유사 카이네이즈(ALK)일 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 성장인자는 이드레노메둘린(adrenomedullin), 안지오포이에틴(angiopoietin), 골형성 단백질(bone morphogenetic protein), 섬모 향신경성 인자(ciliary neurotrophic factor), 백혈병 억제인자(leukemia inhibitory factor), 상피 성장인자(epidermal growth factor, EGF), 에프린(ephrin), 에리트로포이에틴(EPO), 섬유아 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 신경교 세포계 유도 신경 영양 인자(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF) 패밀리, 성장 분화 인자-9(GDF9), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 간암-유래 성장인자(hepatoma-derived growth factor, HDGF), 인슐린, 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 각질세포 성장인자(keratinocyte growth factor, KGF), 이동-자극 인자(migration-stimulating factor, MSF), 대식세포-자극 인자(macrophage-stimulating factor), 뉴레굴린(neuregulin), 뉴로트로핀(neurotrophin), 태반 성장인자(placental growth factor, PGF), 혈소판-유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), T-세포 성장인자(TCGF), 트롬보포이에틴(thrombopoietin, TPO), 형질전환 성장인자(transforming growth factor, TGF) 패밀리, 또는 혈관 내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)일 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 펩타이드 호르몬은 인간 성장 호르몬(hGH), GLP-1 유사체, GLP-2 유사체, 인슐린, 부신피질자극호르몬(adrenocorticotropic hormone), 아밀린(amylin), 안지오텐신(angiotensin), 뉴로펩타이드 Y(neuropeptide Y), 엔케팔린(enkephalin), 뉴로텐신(neurotensin), 심방나트륨이뇨펩티드(atrial natriuretic peptide), 칼시토닌(calcitonin), 콜레시스토키닌(choloecystokinin), 가스트린(gastrin), 겔린(ghelin), 글루카곤(glucagon), 여포자극 호르몬(follicle-stimulating hormone), 렙틴(leptin), 멜라노사이트-자극 호르몬(melanocyte-stimulating hormone, MSH), 옥시토신(oxytocin), 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone), 프로락틴(prolactin), 레닌(renin), 소마토스타틴(somatostatin), 갑상선-자극 호르몬(thyroid-stimulating hormone, TSH), 타이로트로핀-방출 호르몬(thyrotropin-releasing hormone, TRH), 바소프레신(vasopressin), 또는 혈관작용장펩타이드(vasoactive intestinal peptide)일 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 항체 유사체는 scFv, VNAR, VHH, affibody, affilin, affimer, affitin, alphabody, anticalin, avimer, DARPin, Fynomer, Kunitz domain peptide, monobody, repebody, VLR, 또는 nanoCLAMP일 수 있다.
상기 융합단백질에 있어서, 상기 IL-10 단백질은 87번째 아미노산인 이소류신이 알라닌으로 치환된 IL-10 변이체 단백질일 수 있고, 134번째 아미노산인 아스파라긴 및 135번째 아미노산인 라이신 사이에 6 내지 10 a.a.의 길이를 갖는 링커 펩타이드가 삽입된 단량체성 IL-10 변이체 단백질일 수 있으며, 서열번호 54 또는 56으로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "융합단백질"은 둘 이상의 단백질 또는 단백질 내 특정 기능을 담당하는 도메인이 각각의 단백질 또는 도메인이 본연의 기능을 담당하도록 연결된 재조합 단백질(recombinant protein)을 의미한다. 상기 둘 이상의 단백질 또는 도메인 사이에는 통상적으로 유연한 구조를 갖는 링커 펩타이드(linker peptide)가 삽입될 수 있다. 상기 링커 펩타이드는 GGGGSGGGGSGGGGSEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 14), RNTGRGGEEKKGSKEKEEQEERETKTPECP(서열번호 15), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 16), GSGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPPCP(서열번호 17), GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 18), EPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 19), EPKSCDKTHTCPPCP(서열번호 20), GGGGSGGGGSGGGGSAKNTTAPATTRNTTRGGEEKKKEKEKEEQEERTHTCPPCP(서열번호 21), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 22), (G4S)n(n은 1 ~ 10의 정수임, 단위체 서열번호 23), (GSSGGS) n (단위체: 서열번호 24, n은 1 내지 10의 정수), SGGGSGGGGSGGGGSGGEEQEEGGS(서열번호 25), AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 26) KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 27), EGKSSGSGSESKST(서열번호 28), GSAGSAAGSGEF(서열번호 29), (EAAAK)n(단위체: 서열번호 30, n은 1 내지 10의 정수), CRRRRRREAEAC(서열번호 31), GGGGGGGG(서열번호 32), GGGGGG(서열번호 33), PAPAP(서열번호 34), (Ala-Pro)n(n은 1 ~ 10의 정수), VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 35, PLGLWA(서열번호 36), TRHRQPRGWE(서열번호 37), AGNRVRRSVG(서열번호 38), RRRRRRRR(서열번호 39), GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 40), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 41), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 42), GFLG(서열번호 43), AKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECP(서열번호 44), GGSGG(서열번호 45), GGSGGSGGS(서열번호 46), GGGSGG(서열번호 47), 및 GSTSGSGKPGSGEGS(서열번호 48)이 포함될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "항체"는 이뮤노글로불린(immunoglobulin) 분자로서 2 개의 동일한 중쇄 및 2 개의 동일한 경쇄가 결합하여 생성되는 이종 사량체 단백질로 상기 경쇄의 가변지역(VL) 및 상기 중쇄의 가변영역(VH)에 의해 구성되는 항원 인식부위(antigen-binding site)를 통해 항원 특이적 결합을 하며, 이를 통해 항원-특이적 체액성 면역반응(humoral immune response)을 유발한다. 항체에는 그 기원에 따라서 IgA, IgG, IgD, IgE, IgM, IgY 등이 존재한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "항체의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment of antibody"은 항체에서 유래한 항원 결합능을 가지고 있는 단편으로서 항체를 단백질 절단효소로 절단하여 생성된 단편은 물론 재조합 방식에 생성된 단일쇄 단편을 모두 포함하는데 이에는 Fab, F(ab')2, scFv, diabody, triabody, sdAb, 및 VHH가 포함된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Fab"는 항원-결합 항체단편(fragment antigen-binding)으로서 항체 분자를 단백질 분해효소인 파파인으로 절단하여 생성되는 단편으로 VH-CH1 및 VL-CL의 두 펩타이드의 이량체로, 파파인에 의해 생성된 다른 단편은 Fc(fragment crystallizable)라 지칭한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "F(ab')2"는 항체를 단백질 분해효소인 펩신으로 절단하여 생성되는 단편 중 항원결합 부위를 포함하는 단편으로 상기 Fab 두 개가 이황화결합으로 연결된 4량체의 형태를 나타낸다. 펩신에 의해 생성된 다른 단편은 pFc'으로 지칭한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Fab'"는 상기 F(ab')2를 약한 환원조건에서 분리시킴으로써 생성되는 Fab와 구조가 유사한 분자이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "scFv"는 "single chain variable fragment"의 약어로서 실제 항체의 단편은 아니나, 항체의 중쇄 가변영역(VH)과 경쇄 가변영역(VL)을 약 25 a.a. 크기의 링커 펩타이드로 연결하여 제조한 일종의 융합단백질로서 고유의 항체 단편이 아님에도 불구하고 항원 결합능을 지닌 것으로 알려지고 있다(Glockshuber et al., Biochem. 29(6): 1362-1367, 1990).
본 문서에서 사용되는 용어 "diabody" 및 "triabody"는 각각 두 개 및 세 개의 scFv가 링커에 의해 연결된 형태의 항체 단편을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "sdAb(single domain antibody)"는 나노바디(nanobody)로도 지칭되는 항체의 단일 가변영역 단편으로 구성된 항체 단편이다. 주로 중쇄로부터 유래한 sdAb가 사용되나, 경쇄로부터 유래한 단일 가변영역 단편 역시 항원에 대하여 특이적 결합이 되는 것으로 보고되고 있다. 중쇄 및 경쇄로 이루어진 통상의 항체와 달리 단일쇄의 이량체로만 구성되는 상어 항체의 가변영역 단편으로 이루어진 VNAR 및 낙타류 항체의 가변영역 단편으로 이루어진 VHH도 sdAb에 포함된다.
본 문서에서 사용되는 "항체 유사체(antibody mimetic)"는 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄가 이종사합체의 4차구조를 형성하여 기능을 발휘하는 통상의 전장 항체와 달리, monobody, 가변 림프구 수용체(VLR) 등과 같이 비항체 유래의 단백질 스캐폴드로부터 제조되는 항체와 유사한 기능 즉, 항원 결합능을 갖는 단백질을 포함하는 개념이다. 이러한 항체 유사체로는 단백질 A의 Z domain 유래의 Affibody(Nygren, P. A., FEBS J. 275(11): 2668-2676, 2008), Gamma-B crystallin 또는 Ubiquitin 유래의 Affilin(Ebersbach et al., J. Mol. Biol. 372(1): 172-185, 2007), Cystatin 유래의 Affimer(Johnson et al., Anal. Chem. 84(15): 6553-6560, 2012), Sac7d 유래의 Affitin(Krehenbrink et al., J. Mol. Biol. 383 (5): 1058-1068, 2008), Triple helix coiled coil 단백질 유래의 Alphabody(Desmet et al., Nat. Commun. 5: 5237, 2014), lipocalin 유래의 Anticalin(Skerra et al., FEBS J. 275(11): 2677-2683, 2008), 다양한 막 수용체의 도메인 유래의 Avimer(Silverman et al., Nat. Biotechnol. 23(12): 1556-1561, 2005), Ankyrin repeat motif 유래의 DARPin(Stumpp et al., Drug Discov. Today. 13(15-16): 695-701, 2008), Fyn 단백질의 SH3 도메인 유래의 Fynomer(Grabulovski et al., J. Biol. Chem. 282(5): 3196-3204, 2007), 다양한 단백질 저해제의 Kunitz 도메인 유래의 Kunitz domain peptide(Nixon and Wood, Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 9(2): 261-268, 2006), 피브로넥틴의 10번째 제3형 도메인 유래의 monobody(Koide and Koide, Methods Mol. Biol. 352: 95-109, 2007), 탄수화물 결합 모듈 32-2 유래의 nanoCLAMP(Suderman et al., Protein Exp. Purif. 134: 114-124, 2017), 먹장어 유래의 가변 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor, VLR)(Boehm et al., Ann. Rev. Immunol. 30: 203-220, 2012), 및 상기 VLR을 기반으로 항원 친화성을 향상시키도록 조작된 repebody(Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109: 3299-3304, 2012) 등이 포함된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질 또는 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 5 내지 9로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 것이라면 그 어떠한 것이라도 사용될 수 있으며, 당해 단백질을 생산하는데 사용되는 숙주세포의 종류에 코돈 최적화된 것일 수 있다. 이러한 숙주세포에 따른 코돈 최적화 기술은 업계에 잘 알려져 있다(Fuglsang et al., Protein Expr. Purif. 31(2): 247-249, 2003). 더 바람직하게는 서열번호 10 내지 13으로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.
상기 재조합 벡터에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 조절서열에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트 형태로 포함될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked to)"이란 목적으로 하는 핵산서열(예컨대, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 숙주세포에서)이 그의 발현이 이루어질 수 있도록 하는 방식으로 상기 조절서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다.
상기 "조절서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 조절서열에는 많은 숙주세포에서 목적으로 하는 핵산이 항상적으로 발현될 수 있도록 지시하는 것, 특정한 조직세포에서만 목적으로 하는 핵산이 발현될 수 있도록 지시하는 것(예, 조직특이적 조절서열), 그리고 특정 신호에 의해 발현이 유도되도록 지시하는 것(예, 유도성 조절서열)이 포함된다. 발현벡터의 설계는 형질전환될 숙주세포의 선택 및 원하는 단백질 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것은 당업자라면 이해할 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 숙주 세포에 도입되어 상기 융합 단백질을 발현할 수 있다. 상기 진핵세포 및 원핵세포에서 발현을 가능하게 하는 조절서열들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상술한 바와 같이, 이들은 보통 전사개시를 담당하는 조절서열들 및, 선택적으로 전사물의 전사종결 및 안정화를 담당하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가적인 조절서열들은 전사조절인자 외에도 번역 증진인자 및/또는 천연-조합 또는 이종성 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 포유류 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하는 가능한 조절서열들은 CMV-HSV 티미딘 키나아제 프로모터, SV40, RSV-프로모터(로우스 육종 바이러스), 인간 신장 요소 1α-프로모터, 글루코코르티코이드-유도성 MMTV-프로모터(몰로니 마우스 종양 바이러스), 메탈로티오네인-유도성 또는 테트라사이클린-유도성 프로모터 또는, CMV 증폭제 또는 SV40-증폭제와 같은 증폭제를 포함한다. 신경 세포 내 발현을 위해, 신경미세섬유-프로모터(neurofilament-promoter), PGDF-프로모터, NSE-프로모터, PrP-프로모터 또는 thy-1-프로모터들이 사용될 수 있다는 것이 고려되고 있다. 상기 프로모터들은 당 분야에 알려져 있으며, 문헌(Charron, J. Biol. Chem. 270: 25739-25745, 1995)에 기술되어 있다. 원핵세포내 발현을 위해, lac-프로모터, tac-프로모터 또는 trp 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터들이 개시되어 있다. 전사를 개시할 수 있는 인자들 외에, 상기 조절서열들은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 하류(downstream)에 SV40-폴리-A 부위 또는 TK-폴리-A 부위와 같은 전사 종결 신호를 포함할 수도 있다. 본 문서에서, 적당한 발현 벡터들은 당 분야에 알려져 있으며, 그 예로는 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1(Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(Invitrogene), pSPORT1(GIBCO BRL), pGX-27(특허 제1442254호), pX(Pagano et al., Science 255: 1144-1147, 1992), 효모 2-혼성(two-hybrid) 벡터, 가령 pEG202 및 dpJG4-5(Gyuris et al., Cell 75: 791-803, 1995) 또는 원핵 발현 벡터, 가령 람다 gt11 또는 pGEX(Amersham Pharmacia)가 있다. 본 발명의 핵산 분자들 외에, 벡터는 분비 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분비신호들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그리고, 사용된 발현 시스템에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질을 세포 구획으로 이끌 수 있는 리더서열(leader sequence)이 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 코딩 서열에 조합되며, 바람직하게는 해독된 단백질 또는 이의 단백질을 세포질 주변 또는 세포외 매질로 직접 분비할 수 있는 리더 서열이다.
또한, 본 발명의 벡터는 예를 들면, 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 제조될 수 있으며, 표준 재조합 DNA 기술에는 예를 들면, 평활말단 및 접착말단 라이게이션, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 처리, 부적합한 결합을 방지하기 위하여 알칼리 포스테이즈 처리에 의한 인산기 제거 및 T4 DNA 라이게이즈에 의한 효소적 연결 등이 포함된다. 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 신호 펩타이드를 코딩하는 DNA, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질, 또는 이를 포함하는 융합단백질을 암호화하는 DNA를 적절한 조절서열이 포함되어 있는 벡터에 재조합함으로써 본 발명의 벡터가 제조될 수 있다. 상기 조절 서열이 포함되어 있는 벡터는 상업적으로 구입 또는 제조할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 pBispecific backbone vector(Genexine, Inc., 대한민국), pAD15 vector, pGP30(Genexine, Inc. 대한민국) 또는 pN293F vector(Y-Biologics, Inc., 대한민국)를 골격 벡터로 사용하였다.
상기 발현벡터는 분비 신호서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 분비 신호서열은 세포내에서 발현되는 재조합 단백질의 세포 밖으로의 분비를 유도하며, tPA(tissue plasminogen activator) 신호서열, HSV gDs(단순포진 바이러스 당단백질 Ds) 신호서열 또는 성장호르몬 신호서열일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 발현벡터는 숙주세포에서 상기 단백질을 발현하도록 할 수 있는 발현벡터일 수 있으며, 상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 벡터, 파지미드 벡터, 인공 인간 염색체 등 그 어떠한 형태를 나타내더라도 무방하다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질을 포함하는 동형 이량체 또는 이형 이량체가 제공된다.
상기 동형 이량체에서, 도 5에 도시된 바와 같이, 상이한 생물학적 활성 단백질(11a 및 11b)가 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질(12)의 N-말단 및 C-말단에 각각 연결된 경우, 제조된 동형 이량체(100)은 이중 특이성을 나타낸다. 그러나, 도 6에 도시된 바와 같이, 생물학적 활성 단백질(11)을 포함하는 단 하나의 단일 특이성 융합단백질이 이량체화되면, 생성된 동형 이량체(200)는 여전히 단일 특이성을 나타낸다(도 6). 이형 이량체의 경우 도 7에 도시된 바와 같이, 생물학적 활성 단백질(11a 및 11b)를 각각 포함하는 2 개의 상이한 단일 특이성 융합단백질이 이량체화되면, 제조된 이형 이량체(300)은 이중 특이성을 나타낸다. 도 8에 도시된 바와 같이, 각각의 2개의 상이한 생물학적 활성 단백질(11a, 11b, 11c 및 11d)를 포함하는 2 개의 상이한 이중 특이성 융합단백질이 이량체화되면, 생성된 이형 이량체(400)는 4중 특이성을 나타낸다.
선택적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 동형 이량체 또는 이형 이량체(500, 600, 700 및 800)는 생물학적 활성 단백질(들)(11, 11a, 11b, 11c 및 11d) 및 힌지 영역(13) 사이 또는 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질(12) 영역 및 상기 생물학적 활성 단백질(들) 사이에 하나 또는 둘 이상의 링커 펩타이드(14)를 포함할 수 있다. 이러한 융합 파트너들은 상기 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 상기 링커 펩타이드(14)를 통해 연결될 수 있다(도 9 내지 12).
특히, 융합단백질의 N-말단에 연결된 생물학적 활성 단백질(11a)은 표적 부분으로서 작용하는 리간드일 수 있고, 동일한 융합 단백질의 C-말단에 연결된 다른 생물학적 활성 단백질(11b)는 요구되는 생물학적 활성을 갖는 기능성 단백질일 수 있다(도 5 및 8). 반대로, 상기 기능성 단백질은 N-말단에 연결될 수 있고 리간드는 C-말단에 연결될 수 있다. 이들 이중 특이성 융합단백질은 힌지 영역(13)에 존재하는 시스테인 잔기를 통한 분자간 이황화 결합을 통해 동형 이량체를 형성 할 수 있고, 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질 사이의 선택적인 소수성 상호 작용은 이량체화를 도울 수 있다. 2 개의 상이한 이중 특이성 융합단백질은 이형 이량체를 형성할 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 동형 이량체 또는 이형 이량체 단백질은 1 내지 4 개의 생물학적 활성 단백질을 포함할 수 있고, 각 말단에 존재하는 생리활성 단백질에 링커 펩타이드를 부가하여 더 많은 종류의 단백질을 부가할 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 이형 이량체를 제조하고자 할 경우, 동형 이량체 형성을 최소화하기 위해 당업계에 잘 알려진 Knobs-into-Holes(KIH) 기술을 사용할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Knobs-into-Holes(KIH)"는 이중 특이성 IgG 항체의 생산에 있어서, 중쇄의 이형 이량체화(heterodimierization)를 위해 사용되는 항체 공학에 있어서의 하나의 고안 전략을 의미한다. 상기 KIH 기술은 이형 이량체를 형성하는 두 융합단백질을 제1융합단백질 및 제2융합단백질로 구분할 경우, 상기 제1융합단백질의 변형 IgG4 Fc 영역 중 CH3 도메인의 10번째 아미노산인 세린이 시스테인(C)으로 치환되고, 22번째 아미노산인 트레오닌(T)이 트립토판(W)으로 치환된 것(Knobs 구조)일 수 있고, 상기 제2융합단백질은 Fc 영역 중 CH3 도메인의 5번째 아미노산인 타이로신(Y)이 시스테인(C)로, 22번째 아미노산인 트레오닌이 세린(S)로, 24번째 아미노산인 류신(L)이 알라닌(A)로, 63번째 아미노산인 타이로신(Y)이 발린(V)로 치환된 것(Holes 구조)일 수 있고, 반대로 상기 제1융합단백질은 Fc 영역 중 CH3 도메인의 5번째 아미노산인 타이로신(Y)이 시스테인(C)로, 22번째 아미노산인 트레오닌이 세린(S)로, 24번째 아미노산인 류신(L)이 알라닌(A)로, 63번째 아미노산인 타이로신(Y)이 발린(V)로 치환된 것(Hole 구조)일 수 있고, 상기 제2융합단백질은 변형 IgG4 Fc 영역 중 CH3 도메인의 10번째 아미노산인 세린이 시스테인(C)으로 치환되고, 22번째 아미노산인 트레오닌(T)이 트립토판(W)으로 치환된 것(Knob 구조)일 수 있다.
이때, 상기 변이가 일어난 아미노산의 위치는 기준서열(서열번호 77의 인간 IgG1 CH3 도메인의 아미노산 서열)을 기준으로 한다. 만일 상기 CH3 도메인 상에 Knob-into-Holes 구조와 무관한 부위에서 아미노산의 부가, 결실 또는 치환 등의 추가적인 변이가 발생한 경우라도 상기 기준서열을 기준으로 하여 해당 위치에 상응하는 아미노산이 변이된 것을 사용하면 된다. 선택적으로, 상기 Knob-into-Holes 구조는 당업계에 잘 알려진 다른 아미노산 변이를 통해 도입될 수 있다. 이러한 변이는 선행문헌(Wei et al., Oncotarget 8(31): 51037-51049, 2017; Ridgway et al., Protein Eng. 9(7): 617-621, 1996; Carter, P., J. Immunol. Methods 48(1-2): 7-15, 2001; Merchant et al., Nat. Biotechnol. 16(7): 677-681, 1998)에 잘 기술되어 있다. 이러한 선택적인 변이로는 예컨대 제1융합단백질의 CH3 도메인의 22번째 아미노산인 트레오닌이 타이로신으로 치환된 Knob 구조 및 제2융합단백질의 CH3 도메인의 63번째 아미노산인 타이로신이 트레오닌으로 치환된 Hole 구조의 조합을 통해 이중 특이성 이량체 융합단백질이 생성될 수 있다. 상기 Knobs-into-Holes 구조는 반대로 상기 제1융합단백질에 Hole 구조가 도입되고, 상기 제2융합단백질에 Knob 구조가 도입되어 형성될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 융합단백질 또는 그를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 동형 또는 이형-이량체를 유효성분으로 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질에 생물학적 활성 단백질이 융합된 융합단백질 또는 그를 포함하는 동형 이량체 또는 이형 이량체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 생물학적 활성 단백질의 생체 내 반감기를 연장하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질에 생물학적 활성 단백질이 융합된 융합단백질 또는 그를 포함하는 동형 또는 이형-이량체를 유효성분으로 포함하는, 조성물이 제공된다.
상기 조성물은 악학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있고, 상기 담체 외에 약학적으로 허용가능한 보조제, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 포유동물에 투여 시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들면, 경구, 비경구, 예를 들면 좌제, 경피, 정맥, 복강, 근육내, 병변내, 비강, 척추관내 투여로 투여될 수 있으며, 또한 서방형 또는 연속적 또는 반복적 방출을 위한 이식장치를 사용하여 투여될 수 있다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있고, 주 1회, 주 2회, 월 1회 등의 간격으로 투여될 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
상기 조성물의 환자에 대한 투여량은 환자의 신장, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물들을 포함하는 많은 요소들에 따라 다르다. 약학적으로 활성인 단백질은 100 ng/체중(kg) - 10 ㎎/체중(㎏)의 양으로 투여될 수 있고, 더 바람직하게는 1 내지 500 ㎍/kg(체중)으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 5 내지 50 ㎍/kg(체중)으로 투여될 수 있는데, 상기 요소들을 고려하여 투여량이 조절될 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질에 생물학적 활성 단백질이 융합된 융합단백질 또는 그를 포함하는 동형 또는 이형-이량체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 질병 치료방법이 제공된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "치료적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg일 수 있으나, 유효 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
상기 질병은 상기 생물학적 활성 단백질의 투여를 필요로 하는 질환으로서 예컨대, 상기 생물학적 활성 단백질이 GLP-1 유사체일 경우, 상기 치료대상 질병은 당뇨병 또는 대사증후군일 수 있고, 상기 생물학적 활성 단백질이 GLP-2 유사체일 경우 단장증후군, 염증성 장질환일 수 있으며, 상기 생물학적 활성 단백질이 IL-2일 경우 악성종양일 수 있고, 상기 생물학적 활성 단백질이 FceRIa일 경우 천식, 아토피성 피부염 등 IgE 매개 알러지 질환일 수 있으며, 항-CD40L 항체 유사체의 경우 자가면역질환 또는 장기이식거부반응일 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질의 고안
항체의 Fc 도메인을 생물학적 활성 단백질 또는 활성 약제학적 성분(active pharmaceutical ingredient, API)에 연결하여 해당 API의 반감기를 증가시키는 기술은 널리 사용되고 있는 기술이다. 그러나, 항체의 Fc 도메인 부분은 297번 아미노산인 아스파라긴에 N-연결 당쇄가 부가되는데 항체 생산을 위한 숙주세포의 특성에 따라 당쇄 패턴이 인간 항체와 상이하게 나타나거나 당쇄 패턴이 일정하지 않고 이질적인(heterogenous) 형태로 생산되기 때문에, API가 연결된 융합단백질의 활성이 일정하지 않거나 ADCC(antibody-dependent cellular cytotoxicity)나 CDC(complement-dependent cytotoxicity)와 같은 경우에 따라서는 불필요한 효과를 나타내게 되어 부작용을 유발할 수 있다. 더구나, 항체가 생체 내에 투여된 후, 반감기가 증가하는 이유는 항체가 생체 내에서 혈관 내피세포에 의해 내포작용에 의해 흡수된 후, 엔도좀 상태에서 낮은 pH에 의해 신생아 Fc 수용체(neonatal Fc receptor, 이하 "FcRn"으로 지칭함)와 결합함으로써 라이소좀에 의한 분해를 회피하고 엔도좀이 세포막으로 리사이클 되는 과정에서 세포외의 생리학적 pH 조건에서는 FcRn과 분리되기 때문인 것으로 알려지고 있다(도 13). 이러한, FcRn에 의한 항체의 재사용은 항체의 반감기를 대략 21일까지 연장시키는 효과를 보이는 것으로 알려지고 있다(Raghavan, M. et al., Biochem, 34(45): 14649-14657, 1995).
그러나, 기존 항체 Fc 도메인은 IgG 종류에 따라서 FcRn과의 친화성이 다르기 때문에, API의 반감기를 향상시키는데 한계가 존재한다.
이에 본 발명자들은 기존에 사용되던 Fc 도메인 단백질의 FcRn과의 친화성을 높이면서도 ADCC 및 CDC 활성이 없는 Fc 도메인 단백질 변이체를 고안하였다.
이를 위해 본 발명자들은 서열번호 1 내지 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 변형 IgG4 Fc 단백질의 18번째 아미노산인 트레오닌(T)을 글루타민(Q)으로 치환하고 196번째 아미노산인 메티오닌(M)을 류신(L)로 치환한 변이체(서열번호 6 내지 9)를 고안하였으며, 이를 "NTIG(서열번호 5)"로 명명하였다.
실시예 2: 단일 특이성 융합단백질 컨스트럭트의 제조
이어 본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조된 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질(NTIG)의 N-말단 및/또는 C-말단에 다양한 생물학적 활성 단백질이 연결된 다양한 융합단백질을 제조하였다.
2-1: GLP-1E-NTIG의 고안 및 생산
본 발명자들은 GLP-1 및 Exendin-4의 하이브리드 펩타이드인 GLP-1/Exendin-4 하이브리드 펩타이드(서열번호 49)의 C-말단에 상기 실시예 1에서 제조된 NTIG 단백질(서열번호 7)을 하이브리드 형태의 힌지 영역 포함 링커 펩타이드((G4S)3-IgD/IgG1 하이브리드 힌지, 서열번호 14)로 연결한 융합단백질(GLP-1E-NTIG, 서열번호 50)을 고안한 후 이를 "PG-11"으로 명명하였다. 상기 GLP-1E-NTIG는 숙주세포에서의 분비를 위한 tPA 신호서열(서열번호 51)이 추가되도록 고안하였다. 한편, 상기 PG-11을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드 합성, PCR 증폭 및 위치지정 돌연변이 기술을 이용하여 합성한 후 pGP30 발현벡터(Genexine, Inc., 대한민국)에 삽입하였다. 상기 제조된 벡터를 Thermo Fisher사의 ExpiCHO kit를 이용하여 일시적 발현을 수행하였다. 구체적으로 ExpiCHO-S cell에 상기와 같이 제조된 벡터와 키트 내에 포함되어 있는 ExpiFectamine 시약을 혼합한 후 8% CO2 및 37℃의 조건을 갖춘 배양기에서 1일간 배양 후 온도를 32℃로 낮춰서 7일차까지 배양을 진행하였다.
그런 다음 Protein A 포획 정제를 수행하였고, 비환원 및 환원 조건에서의 SDS-PAGE 분석을 통해서 후보물질이 정제되었는지 확인하였으며, 후보 물질의 pI 값에 맞게 제형화 완충액으로 제형화를 수행하였다. 제형화가 완료된 물질을 Nano drop을 이용하여 정량하고 SEC-HPLC를 이용해 최종 순도를 확인하였다(도 14a 및 14b).
2-2: GLP-2-2G-NTIG의 고안 및 생산
본 발명자들은 인간 GLP-2 펩타이드의 두 번째 아미노산인 알라닌(A)가 글리신(G)으로 치환된 변이체인 GLP-2 유사체(GLP-2-2G, 서열번호 52)의 C-말단에 상기 NTIG(서열번호 7)를 상기 링커 펩타이드(서열번호 14)로 연결한 융합단백질(GLP-2-2G-NTIG, 서열번호 53)을 고안하였으며, 이를 "PG-22"로 명명하였다. 마찬가지로 상기 PG-22 역시 분비를 위해 tPA 신호서열(서열번호 51)이 추가되도록 고안하였다. 상기 실시예 2-1과 마찬가지로 상기 PG-22를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제조하여, pGP30 발현벡터(Genexine, Inc., 대한민국)에 삽입하여 ExpiCHO 시스템을 이용하여 생산한 후 최종 순도를 확인하였다(도 15a 및 15b).
2-3: NTIG-IL-10V의 고안 및 생산
본 발명자들은 상기 NTIG의 C-말단에 IL-10 변이체(서열번호 54)를 링커 펩타이드(서열번호 26)로 연결한 융합단백질(NTIG-IL-10V, 서열번호 55)을 고안하였으며, 이를 "PG-088"로 명명하였다. 상기 실시예 2-1과 마찬가지로 상기 PG-088을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제조하여, pBispec 발현벡터(Genexine, Inc., 대한민국)에 삽입하여 ExpiCHO 시스템을 이용하여 생산한 후 최종 순도를 확인하였다(도 16a 및 16b).
2-4: NTIG-IL-10V monomer의 고안 및 생산
본 발명자들은 상기 NTIG의 C-말단에 IL-10 단량체성 변이체(서열번호 56)를 링커 펩타이드(서열번호 26)로 연결한 융합단백질(NTIG-IL-10Vm, 서열번호 57)을 고안하였고, 이를 "PG-088m"으로 명명하였다. 상기 실시예 2-1과 마찬가지로 상기 PG-088m을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제조하여, pBispec 발현벡터에 삽입하여 ExpiCHO 시스템을 이용하여 생산한 후, 최종 순도를 확인하였다(도 17a 및 17b). 상기 IL-10 단량체성 변이체(IL-10Vm)는 면역 촉진 활성과 면역 억제 활성 두 가지 양면적인 활성을 가지고 있는 IL-10 단백질의 면역 촉진 활성을 선택적으로 억제하기 위한 돌연변이가 도입된 것으로서, 단백질 생산 과정에서 자가 이량체화 형성으로 응집체가 발생하는 문제점을 해결하기 위해 중간에 GGSGGSGGS(서열번호 46)의 링커를 삽입함으로써 단량체형으로 생산이 되도록 한 단량체성 변이체 단백질이다.
실시예 3: 이중 특이성 융합단백질 유전자 컨스트럭트의 제조
3-1: anti-PD-L1-NTIG-IL-2의 제조
PD-L1을 표적으로 하는 scFv를 상기 NTIG(서열번호 7)의 N-말단에 연결하고 IL-2를 C-말단에 연결한 융합단백질(anti-PD-L1-NTIG-IL-2)과, NTIG 대신에 서열번호 2의 변형 IgG4 Fc 도메인 단백질을 사용한 융합단백질(anti-PD-L1-modified IgG4 Fc-IL-2)들을 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를, pBispec 발현벡터에 삽입하고 ExpiCHO system을 이용하여 단백질을 생산하였다.
3-2: FcεRIα-NTIG-IL-10V의 고안 및 생산
본 발명자들은 상기 실시예 2-3에서 고안된 NTIG-IL-10V의 N-말단에 IgE에 특이적으로 결합하는 수용체인 FcεRIα의 세포외 도메인(서열번호 58)을 링커 펩타이드(서열번호 18)로 연결한 이중 특이성 융합단백질(FcεRIα-NTIG-IL-10V, 서열번호 59)을 고안하여, 이를 "PG-075"로 명명하였으며, 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제조하여, pBispec 발현벡터에 삽입하였다. 상기 PG-075 컨스트럭스 역시 분비를 위해 tPA 신호서열(서열번호 51)이 N-말단에 위치하도록 고안하였으며, ExpiCHO system을 이용하여 생산하고, SDS-PAGE와 western blotting을 수행하였다(도 18a 및 18b).
3-3: FcεRIα-NTIG-IL-10Vm의 고안 및 생산
본 발명자들은 상기 실시예 2-4에서 고안된 NTIG-IL-10Vm의 N-말단에 IgE에 특이적으로 결합하는 수용체인 FcεRIα의 세포외 도메인(서열번호 58)을 링커 펩타이드(서열번호 18)로 연결한 이중 특이성 융합단백질(FcεRIα-NTIG-IL-10Vm, 서열번호 60)을 고안하여, 이를 "PG-110"으로 명명하였으며, 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제조하여, pAD15 발현벡터에 삽입하였다. 상기 PG-110 컨스트럭스 역시 분비를 위해 tPA 신호서열(서열번호 51)이 N-말단에 위치하도록 고안하였다. 상기 pAD 발현벡터에 삽인된 유전자는 CHO DG44 세포에 형질감염시킨 후 메토트렉세이트(MTX) 증폭을 수행하였으며, 단일 클론 선별 작업을 거쳐 고효율 발현 세포주를 제조한 다음, 고효율 발현 세포주로부터 PG-110 단백질을 생산 및 정제하였다(도 19a 및 19b).
실시예 4: 항-CD40L 하이브리드 항체 제조
4-1: 키메라 항-CD40L 항체의 제조
본 발명자들은 WO2016/182335A1에 기재된 마우스 유래의 항-CD40L(항-CD154) 항체의 Fc 부위를 인간 IgG1 Fc 부위로 치환한 항체(C10)의 중쇄 CH2 및 CH3 도메인에 FcγRIIα 결합 저해 변이체가 도입된 항-CD40L 항체를 제조하였고, 이를 'C10M'으로 명명하였다.
4-2: 키메라 항-CD40L-NTIG 하이브리드 항체의 제조
본 발명자들은 상기 C10M 항체의 Fab 부분 중 중쇄 부분을, FcγR와 결합을 하지 않는 상기 실시예 1에서 제조된 NTIG 단백질의 N-말단에 연결한 하이브리드 중쇄 단백질을 고안하였고, 이를 "PG-129"로 명명하였다.
상기 하이브리드 중쇄 단백질은 상기 C10M 항체의 Fab의 중쇄부분(VH-CH1, 서열번호 61)을 NTIG(서열번호 7)과 연결한 하이브리드 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제조하여 이를 pAD15 발현벡터(WO2015/009052A)에 삽입하였다. 아울러, 상기 C10M 항체의 Fab의 경쇄부분(VL-CL, 서열번호 62)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 dual promoter하에서 조절될 수 있도록 상기 pAD15 발현벡터에 삽입하였다. 그런 다음 상기 벡터를 CHO DG44(from Dr. Chasin, Columbia University, USA)세포에 Neon- transfection system을 이용하여 공형질감염시켰다.
상기와 같이 완료된 발현벡터들은 Thermo Fisher사의 ExpiCHO kit를 이용하여 일시적 발현도 수행하였다. 구체적으로 ExpiCHO-S cell에 상기와 같이 제조된 벡터 컨스트럭트와 키트 내에 포함되어 있는 ExpiFectamine 시약을 혼합한 후 8% CO2 및 37℃의 조건을 갖춘 배양기에서 1일간 배양 후 온도를 32℃로 낮춰서 7일차까지 배양을 진행하였다.
그런 다음 Protein A 포획 정제를 수행하였고, 비환원 및 환원 조건에서의 PAGE 분석 및 웨스턴 블랏 분석을 통해서 후보물질이 정제되었는 지 확인하였으며, 후보 물질의 pI 값에 맞게 제형화 완충액의 제형화를 수행하였다. 제형화가 완료된 물질을 Nano drop을 이용하여 정량하고 SEC-HPLC를 이용해 최종 순도를 확인하였다.
그 결과, 도 20a 및 20b에서 나타난 바와 같이, 경쇄 및 중쇄가 정상적으로 발현되었을 뿐만 아니라 비-환원 조건에서 단일 밴드로 나타나 정상적인 이종 사량체를 형성하였음을 알 수 있었다. 아울러 SEC-HPLC 분석 결과 순도는 97.9%로 매우 높게 나타났다.
4-3: 인간화 항-CD40L-NTIG 하이브리드 항체의 제조
본 발명자들은 상기 키메라 항체가 본 발명의 NTIG 기술(면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질)을 도입함으로써 종래 인간 항체가 가지고 있는 단점을 충분히 개선했음에도 불구하고, 항원 결합 부위가 여전히 마우스 유래 항체라는 점에서 인체 내에서 불필요한 면역반응을 유발할 수 있을 것이라는 판단하에 보다 안전한 하이브리드 항체를 제조하기 위해, 본 발명의 기반이 되는 항체의 항원 결합 단편인 Fab의 항원 결정기를 제외한 나머지 프레임워크 부분을 인간 항체의 서열로 치환한 인간화 항체(항-CD40L Fab-NTIG)를 고안하였고(표 1 및 2), 이를 "PG-400"으로 명명하였다.
아울러, 본 발명자들은 상기 하이브리드 항체의 중쇄 C-말단에 면역 억제 활성을 갖는 사이토카인인 IL-10 단량체성 변이체 단백질(서열번호 56)을 연결한 이중 특이성 하이브리드 항체(항-CD40L Fab-NTIG-IL-10Vm)를 제조하도록 고안하였으며(표 3), 이를 "PG-410"로 명명하였다. 상기 이중 특이성 하이브리드 항체의 경쇄의 구조는 표 2에 기재된 것과 동일하다.
인간화 항-CD40L-NTIG 하이브리드 항체의 중쇄 구성
구성요소 아미노산 서열 서열번호
항-CD40L 중쇄 VH-CH1 QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGYIFTSYYMYWVKQAPGQGLEWIGEINPSNGDTNFNEKFKSKATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSDGRNDMDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 64
hinge + NTIG EPKSCDKTHT CPPCPSHTQP LGVFLFPPKP KDQLMISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV LHEALHNHYT QKSLSLSLG 68
인간화 항-CD40L-NTIG 하이브리드 항체의 경쇄 구성
구성요소 아미노산 서열 서열번호
항-CD40L 항체 경쇄 DIVLTQSPATLSVSPGERATISCRASQRVSSSTYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFATYYCQHSWEIPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 67
이중 특이성 항-CD40L-NTIG 하이브리드 항체 중쇄의 구성
구성요소 아미노산 서열 서열번호
항-CD40L 중쇄 VH-CH1 QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGYIFTSYYMYWVKQAPGQGLEWIGEINPSNGDTNFNEKFKSKATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSDGRNDMDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 64
hinge + NTIG EPKSCDKTHT CPPCPSHTQP LGVFLFPPKP KDQLMISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV LHEALHNHYT QKSLSLSLG 68
링커 펩타이드 AAGSGGGGGS GGGGSGGGGS 26
IL-10Vm SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDAKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGSGGSGGSKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN 56
상기 인간화 항-CD40L 하이브리드 항체(PG-400 및 PG-410)를 생산하기 위해, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제조한 후, 동물세포에서 임시 발현하기 위해서 HEK293F 세포에 N293F Vector system(와이바이오로직스)을 이용하여 플라스미드 DNA 형질감염을 수행하였다. 핵산 준비를 위해 배지 3 ml에 플라스미드 DNA 25 μg을 넣어 혼합한 후, 2 mg/ml PEI(Polyethylenimine, PolyPlus, USA) 25 μl를 첨가하고 혼합하였다. 반응액은 상온에서 15분 동안 정치한 후, 1ㅧ106 cells/ml로 배양된 40 ml의 배양액에 넣어 120 rpm, 37℃, 8% CO2의 조건으로 24시간 동안 배양하였다. DNA 형질감염 24시간 후에 영양보충배지 성분(Soytone, BD, USA)을 최종 농도 10 g/L가 되도록 첨가하였다. 7일 동안 배양한 후 세포배양액을 5000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 이어, Protein A 레진(Resin)을 컬럼(Column)에 충진하고 1ㅧDPBS로 세척하여 준비하였고, 상기 회수된 상층액을 0.5 ml/min의 속도로 4℃에서 레진과 결합시켰고, 0.1 M Glycine으로 단백질을 용출하였다. 완충용액을 교체하기 위하여 용출한 용액을 투석튜브(GeBAflex tube, Geba, Israel)에 넣어 1ㅧDPBS로 4℃에서 투석하였다. 수득된 물질은 Superdex 200 resin을 이용해서 겔여과를 수행한 다음, PBS(pH 7.4) 완충액으로 제형화하였다.
상기에서 정제된 하이브리드 항체에 대하여 SDS-PAGE 분석, 크기배제 FPLC 및 크기배제 HPLC 분석을 통하여 하이브리드 항체의 수율 및 순도를 검정하였다.
그 결과, 도 21a, 21b, 22a 및 22b에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 인간화 항-CD40L 하이브리드 항체가 적용된 PG-400 및 PG-410은 높은 순도로 생산되었음을 확인할 수 있었다.
4-4: 항-CD40L scFv-NTIG-IL-10 융합단백질의 고안
본 발명자들은 상기 인간화 항-CD40L 항체의 Fab 중 가변영역 부분을 선별한 후 이를 이용하여 scFv를 고안하였으며, 이를 상기 실시예 4-3에서 사용한 항-CD40L 항체의 중쇄 컨스트럭트의 VH-CH1 부분 대신에 삽입함으로써 단일쇄 기반의 항체 결합-단편 융합단백질을 고안하였고, 상기 항-CD40L scFv-NTIG의 C-말단에 실시예 4-3에서 사용된 IL-10 단량체성 변이체(서열번호 56)를 링커 펩타이드(서열번호 26)으로 연결하여 이중 특이성 융합단백질을 고안하였다(표 4). 본 실시예에서 상기 항-CD40L scFv는 경쇄 가변영역(VL)-링커-중쇄 가변영역(VH)으로 구성되어 있으나, 반대로 VH-링커-VL의 순서로 구성된 것을 사용하더라도 CD40L 결합능이 유지되므로 이를 사용하더라도 무방하고, 링커의 종류 또한 다양한 종류가 사용가능하다.
항-CD40L scFv-NTIG-IL-10 융합단백질의 구성
구성요소 아미노산 서열 서열번호
신호서열 MGWSCIILFLVATATGVHS 62
항-CD40L scFv VL DIVLTQSPATLSVSPGERATISCRASQRVSSSTYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVEPEDFATYYCQHSWEIPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSV 69
링커 1 GSTSGSGKPGSGEGS 48
VH QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGYIFTSYYMYWVKQAPGQGLEWIGEINPSNGDTNFNEKFKSKATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRSDGRNDMDSWGQGTLVTVSS 70
hinge + NTIG EPKSCDKTHT CPPCPSHTQP LGVFLFPPKP KDQLMISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV LHEALHNHYT QKSLSLSLG 68
링커 2 AAGSGGGGGS GGGGSGGGGS 26
IL-10Vm SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDAKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGSGGSGGSKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN 56
실시예 5: 이형 이량체의 제조
본 발명자들은 GLP-1 유사체 및 GLP-2 유사체를 모두 포함하는 이중 특이성 융합단백질을 하기 표 5와 같이 고안하였다. 이들 이중 특이성 융합단백질들은 제1융합단백질과 제2융합단백질 사이의 분자간 이황화 결합 및 소수성 상호작용에 의해 이형 이량체를 형성하도록 Knobs-into-Holes(KIH) 구조가 도입된 것이다.
하기 실시예 5-1과 5-2의 차이는 제1융합단백질의 GLP-1 유사체와 NTIG를 연결하는 링커에 N-글리칸 당쇄가 연결될 수 있도록 N-연결 당쇄 부착 부위를 포함하느냐 아니냐의 차이다. 이는, GLP-1 수용체인 GLP-1R에는 GLP-1 외에도 Exendin 4(Ex4), 옥신토모듈린(OXM), GLP-2가 모두 결합하는 반면, GLP-2R에는 GLP-2만 결합하고, GLP-1R의 경우 위장관(gastrointestinal tract, GI tract) 외에도 뇌, 심장, 간, 근육 및 췌장 등 다양한 장기에서 발현이 되기 때문에, 위장관 특이적으로 GLP-1이 작용될 수 있도록 하기 위해서는 GLP-1R과의 친화도를 다소 낮출 필요가 있기 때문이다. 이를 위해, 본 발명자들은 GLP-1 유사체의 GLP-1R와의 결합력을 다소 낮추기 위해, GLP-1 유사체의 링커 부분(IgD/IgG1 하이브리드 힌지 포함)에 글리칸이 부착될 수 있도록 글리칸 부착 도메인이 부가된 것을 사용하였다(실시예 5-1).
본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-1/GLP-2 이형 이량체 형성을 위한 융합 단백질 고안
실시예 명칭 GLP-1/2 유사체(서열번호) 링커(서열번호) Fc 영역 전체구성(서열번호)
5-1 MG12-4 1. GLP-1/Exendin 4 hybrid(49) 글리칸 링커(21) knob 제1융합단백질(71)
2. GLP-2-2G(52) 비변형(14) hole 제2융합단백질(72)
5-2 MG12-5 1. GLP-1/Exendin 4 hybrid(49) 비변형(14) knob 제1융합단백질(73)
2. GLP-2-2G(52) 비변형(14) hole 제2융합단백질(72)
상기와 같이 제조된 벡터 컨스트럭트들을 Thermo Fisher사의 ExpiCHO kit를 이용하여 일시적 발현을 수행하였다. 구체적으로 ExpiCHO-S cell에 상기와 같이 제조된 벡터 컨스트럭트와 키트 내에 포함되어 있는 ExpiFectamine 시약을 혼합한 후 8% CO2 및 37℃의 조건을 갖춘 배양기에서 1일간 배양 후 온도를 32℃로 낮춰서 7일 차까지 배양을 진행하였다.상기 배양을 통해 얻어진 상층액을 Protein A 칼럼 및 이차 칼럼을 통해 정제된 실시예 5-1 및 5-2의 이형 이량체 단백질(각각, 'MG12-4' 및 'MG12-5'로 명명함)을 4X LDS 시료 완충액과 주사용수로 적절히 희석하여 최종 3-10 μg/20 μL이 되도록 조제하였다. 환원조건 시료의 경우 각 분석하고자 하는 물질과 4X LDS 시료 완충액, 10X 환원제와 주사용수를 적절히 희석하여 최종 3-10 μg/20 μL이 되도록 조제하고 70℃ 가열블록에서 10분간 가열하였다. 준비된 시료를 미리 설치된 전기영동 장비에 고정된 겔의 각 웰에 20 μL씩 적재하였다. 사이즈 마커의 경우 3~5 μL/well을 적재하였다. 전원공급장치를 120 V, 90분으로 설정한 후 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 완료된 겔을 분리한 후 염색용액 및 탈-염색 용액을 이용하여 염색하고, 결과를 분석하였다. 그 결과 도 23에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 이형 이량체는 정상적으로 생성이 됨을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 융합 단백질 생산에 있어서 힌지의 영향 분석
본 발명자들은 본 발명의 NTIG 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 다양한 API를 연결하면서 NTIG 단백질의 N-말단에 API를 연결하는 경우 힌지의 종류에 따라서 단백질의 생산 효율이 어떻게 달라지는지 여부를 조사하였다.
6-1: FcεRIα-NTIG-IL-13α2의 제조
본 발명자들은 NTIG(서열번호 7)의 N-말단에 FcεRIα(서열번호 58)를 연결하고 C-말단에 IL-13Rα2(서열번호 74)를 연결한 이중 특이성 융합단백질(FcεRIα-NTIG-IL-13Rα2)을 고안하였고 이를 "PG-50"으로 명명하였다. 상기 PG-50을 제조하면서 상기 FcεRIα와 NTIG를 연결하는 힌지 영역을 IgD 힌지(서열번호 15)와 (G4S)3 링커와 IgG1 힌지의 조합(서열번호 16)을 사용하는 경우의 단백질 생산성에 대하여 조사하였다. 이와 같이 IgD 힌지를 사용한 융합단백질을 "PG-50-1"로 명명하였고, (G4S)3 링커/IgG1 힌지를 사용한 융합단백질을 "PG-50-2"로 명명하였다. IgD 힌지의 경우 분자간 이황화 결합이 하나 생성이 되고, (G4S)3 링커/IgG1 힌지의 경우 분자가 이황화 결합이 두 개 생성이 된다.
그 결과, 도 24a 및 24b에서 확인되는 바와 같이, IgD 힌지를 보유한 PG-50-1 대비 IgG1 힌지를 포함한 융합단백질(PG-50-2)의 타겟 물질에 대한 생산 수율이 약 15% 증가함을 확인하였다.
6-2: GLP-2-2G-NTIG-IL-10wt의 제조
본 발명자들은 다른 API를 이용하여 다양한 종류의 힌지가 단백질 생산 수율에 미치는 영향을 분석하였다. 이를 위해 구체적으로, GLP-2-2G(서열번호 52)를 NTIG(서열번호 7)의 N-말단에 연결하고 상기 NTIG의 C-말단에 IL-10wt(서열번호 75)가 연결된 컨스트럭트를 제조하였다. 이 때 상기 GLP-2-2G와 NTIG는 (G4S)3 링커+IgD/IgG1 하이브리드 힌지(서열번호 14)를 이용하여 연결하고, NTIG의 C-말단에는 서열번호 26으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 링커 펩타이드를 이용하여 IL-10wt를 연결함으로써 이중 특이성 융합단백질(GLP-2-2G-NTIG-IL-10wt)을 고안하였고, 이를 "PG-073"으로 명명하였다. 상기와 같이 고안된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제조한 후, pBispec 발현벡터에 삽입하고 상기 실시예 2-1에서 사용한 방법대로 ExpiCHO 시스템을 이용하여 융합단백질을 발현시킨 후, 배양 상층액에 대하여 SDS-PAGE로 단백질 발현 정도를 확인하였다. 상기 IgD/IgG1 하이브리드 힌지는 두 개의 분자간 이황화 결합을 형성한다.
그 결과, 도 24c에서 확인되는 바와 같이, PG-073의 경우 비환원 조건에서 주 밴드는 110 kDa 크기로 GLP-2-2G와 IL-10이 모두 연결된 이중 특이성 융합단백질인 것으로 확인되었다. 그러나, 주 밴드 아래쪽에 GLP-2가 하나 또는 두 개 모두 절단된 형태의 밴드가 확인되었다. 따라서, GLP-2와 NTIG 사이에 사용된 상기 (G4S)3 링커 + IgD/IgG1 하이브리드 힌지 링커는 다소 불안정한 것으로 확인되었다. 더구나, 100 ml 배양액을 기준으로 생산된 융합단백질의 양이 0.5 mg(PG-073)에 불과하여 단백질 생산성이 떨어졌고, 순도 역시 66% 정도로 낮은 것으로 확인되었다.
6-3 및 6-4: GLP-2-2G(3 point)-NTIG-IL-10Vm의 제조
이에 본 발명자들은 상기 GLP-2-2G-NTIG-IL-10wt 융합단백질에서 GLP-2-2G를 3 point 돌연변이가 포함된 변이체(서열번호 76)로 변경하고, 힌지 부분을 다른 종류의 링커 또는 힌지(각각 서열번호 17 또는 18)로 교체하고 IL-10wt을 상기 실시예 2-4에서 제조한 IL-10Vm으로 교체한 융합단백질(GLP-2V(3 point)-NTIG-IL-10Vm)을 고안하였으며, 상기 융합단백질들을 각각 "PG210-5(실시예 6-3)" 및 "PG210-6(실시예 6-4)"으로 명명하였다.
상기 융합단백질들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 pBispec 발현벡터에 삽입한 후, 상기 실시예 2-1에서 사용한 방법대로 ExpiCHO 시스템을 이용하여 융합단백질을 발현시킨 후, 배양 상층액에 대하여 SDS-PAGE로 단백질 발현 정도를 확인하였다.
그 결과 도 24d 및 24e에서 확인되는 바와 같이, PG-210-5의 경우 200 ml 배양액 기준으로 3.48 mg의 단백질이 확인되었으며, 순도는 약 88.3% 정도로 확인되었고, PG-210-6의 경우 5 mg의 단백질이 확인되었고, 순도는 90.7%로 확인되었다.
실험예 1: FcRn 결합 친화도 분석
본 발명자들은 본 발명의 NTIG 단백질의 FcRn과의 결합 친화도를 IgG4 Fc 및 IgG1 항체와 비교하였다.
이를 위해, 구체적으로 리간드인 재조합 FcRn(rhFcRn, R&D systems, USA)을 아세테이트 버퍼에 5 μg/ml의 농도로 용해시킨 후 바이오센서 칩(Series S CM5 sensor chip, GE Healthcare, USA)에 아민 커플링을 이용하여 고정하였다.
이어 본 발명자들은 본 발명의 NTIG와 IgG4 Fc의 FcRn 결합 친화도를 비교하기 위해, 실시예 2-1에서 제조한 PG-11 및 시판 GLP-1가 IgG4 Fc에 연결된 융합단백질인 dulaglutide(상표명 Trulicity)의 FcRn과의 결합 친화도를 SPR(surface plasmon resonance) 분석을 통해 분석하였다. 분석기기로는 Biocore 8K(GE Healthcare, USA)를 이용하였으며, 분석에 사용된 시약들은 모두 GE Healthcare에서 구입한 것을 사용하였다. PG-11 및 Trulicity를 러닝 완충액(PBST, pH 6.0)에 용해시킨 후, 1,000 nM부터 1/2씩 순차 희석하고 다중-사이클 반응속도(multi-cycle kinetic) 분석을 수행하였다. 25℃, 30 μl/min의 유속으로 실험을 수행하였으며, 60초 동안 분석물의 결합반응(association)을 수행하고, 이어 60초 동안 해리반응(dissociation)을 수행하였다. 상기 실험결과를 바탕으로 최적의 항체 농도를 선정하여(Trulicity: 8,000 nM 및 PG-11: 2,000 nM) 다중-사이클 반응속도 분석을 수행하였으며, Biacore Insight 프로그램(GE Healthcare, USA)을 이용하여 평형 해리상수(KD)를 측정하였다. 이 때, 재생시에는 pH 7.4의 PBS 완충액으로 교체하였다.
그 결과, 표 6, 도 25 및 26에서 확인되는 바와 같이, Steady state affinity KD 비교 분석 결과, Trulicity의 KD 값은 2,090 nM, PG-11의 KD 값은 199 nM로 측정되었는데, 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 PG-11의 FcRn에 대한 친화도가 Trulicity의 그것에 비해 약 5.3배 정도 높은 것이다. FcRn과의 결합 친화도는 해당 Fc 융합단백질의 약물동태학(pharmacokinetics)와 관련 있을 것으로 알려져 있으며, 이에 따라 Trulicity와 비교하였을 때 PG-11의 체내 반감기가 더 길 것으로 예측된다(Mackness et al., MAbs. 11(7): 1276-1288, 2019).
PG-11 및 Trulicity의 FcRn 친화도 분석 결과
분석체 PG-11 Trulicity
정적 상태 친화도 (KD) 397±19.3 nM 2,090±75.5 nM
CV% (정적 상태 친화도(KD) 4.86 3.61
아울러, 본 발명자들은 본 발명의 NTIG와 IgG1 Fc의 FcRn 결합 친화도를 비교하기 위해, 상기 PG-11 및 IgG1 계열의 시판 재조합 키메라 항-CD20 항체인 리툭시맙(Rituximab)의 FcRn에 대한 결합 친화도를 SPR(surface plasmon resonance) 분석을 통해 분석하였다. 다양한 농도(PG-11의 경우 2,000 nM 내지 1.96 nM, 리툭시맙의 경우 4,000 nM 내지 3.9 nM)로 러닝 PBST 완충액(pH 6.0)에 용해시킨 후, 상술한 PG-11 및 Trulicity 비교 분석과 마찬가지로 결합 60초, 해리 60초 및 재생 30초 조건으로 결합, 해리 및 재생시켰다. 재생시에는 pH 7.4의 PBS 완충액을 사용하였다. 그 결과, 표 7 및 도 27에서 확인되는 바와 같이, Steady state affinity KD 비교 분석 결과, Rituximab의 KD 값은 2,390 nM이었고, PG-11의 KD 값은 256 nM로 측정되었는데, 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 PG-11의 FcRn에 대한 친화도가 Rituximab의 그것에 비해 약 9.3배 정도 높은 것이다.
PG-11 및 리툭시맙의 FcRn 친화도 분석 결과
분석체 PG-11 Rituximab
정적 상태 친화도 (KD) 256 nM 2,390±242 nM
CV% 정적 상태 친화도 (KD) - 10.15
상술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 NTIG는 종래의 IgG1 또는 IgG4의 Fc 영역에 비해 FcRn에 대한 친화도가 높아서 생체 내 투여시 반감기가 현저하게 개선될 것으로 예상이 되는 바이다.이어, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 NTIG(서열번호 7)의 기반이 된 서열번호 2의 변형 IgG4 Fc 도메인 단백질과 FcRn과의 친화도를 비교하고자 하였다.
이를 위해, 본 발명자들은 단순 KD 값을 산출하는 대신, 상기 단백질들을 pH 6.0에서 결합시키고 해리는 pH 7.3에서 수행하였으며, 이를 통해 정적 상태 친화도(KD)를 산출하였다(Piche-Nicholas et al., MAbs. 10(1): 81-94, 2018). 구체적으로, 상기 실시예 3-1에서 제조된 anti-PD-L1-NTIG-IL-2과 anti-PD-L1-modified IgG4 Fc-IL-2의 rhFcRn과의 결합 친화도를 상술한 바와 같이, 결합 및 해리시 pH 조건을 변경하여 SPR 분석을 수행하였다.
그 결과, 표 8 및 도 28에서 확인되는 바와 같이, NTIG가 적용된 anti-PD-L1-NTIG-IL-2의 FcRn에 대한 친화성이 변형 IgG4 Fc를 사용하고 있는 anti-PD-L1-modified IgG4 Fc-IL-2에 비해 높은 경향이 나타남을 확인할 수 있었다. 그러나, 결합 완충액의 교환 과정에서 anti-PD-L1-modified IgG4 Fc-IL-2 단백질 시료에서 단백질 응집체가 다량 생성됨으로써 결과의 신뢰도가 떨어지는 문제점이 발생하였으며, 이에 따라, 시험물질을 리간드로 하고 FcRn을 검체로 바꾸어서 동일한 실험을 다시 수행하였다.
이러한 결과는, NTIG의 적용이 기존 알려진 서열번호 2의 변형 IgG4 Fc 적용 대비 생산 단백질의 FcRn 결합력 증진을 통한 체내 반감기 증진 효과뿐 아니라, 단백질의 물성 및 안정성에 있어서도 더 우수한 효과를 나타낼 수 있음을 암시한다.
NTIG 및 변형 IgG4 Fc의 FcRn 친화도 분석 결과
리간드 분석체 결합비율 ka (1/ms) kd(1/s) KD (M) 정적 상태 친화도 KD (M) Chi2 Rmax %bound
FcRn anti-PD-L1-NTIG-IL-2 1:1 1.99E+06 5.43E-01 2.73E-07 2.95E-07 6.57E-02 7.1 2.04
FcRn anti-PD-L1-modified IgG4 Fc-IL-2 1:1 4.37E+06 1.98E+00 4.53-07 8.41-07 1.16E-01 5 12.12
분석에 사용된 완충액으로는 러닝 완충액(1X PBST, pH 7.3), 검체 희석 완충액(1X PBST, pH 6.0), 해리 완충액(1X PBST, pH 7.3) 및 재생 완충액(1X PBS, pH 8.0)을 사용하였다. 분석 결과, 표 9 및 도 29에서 확인되는 바와 같이, 두 단백질 모두 신속 결합 및 신속 해리 양상을 나타냈으며, 두 단백질 모두 중성 조건(pH 7.3)에서는 FcRn과의 결합이 잘 해리되는 편이었으나, pH 6.0 조건에서 anti-PD-L1-NTIG-IL-2 단백질의 친화도가 anti-PD-L1-modified IgG4 Fc-IL-2단백질의 친화도보다 5.06배 높은 것으로 확인되었다. 결론적으로, anti-PD-L1-modified IgG4 Fc-IL-2 단백질에 비해 anti-PD-L1-NTIG-IL-2단백질이 pH 6.0 조건에서 더 낮은 농도의 FcRn에서도 빠르게 결합하는 경향성을 나타났다. 이는 세포내로 내포작용에 의해 흡수된 Fc 포함 단백질이 엔도좀의 낮은 pH 조건에서 FcRn과 결합한다는 점을 고려하면, NTIG를 포함하는 융합단백질이 보다 효율적으로 FcRn에 의해 재활용될 것이라는 점을 강력하게 시사하는 것이다.
NTIG 및 변형 IgG4 Fc의 FcRn 친화도 분석 결과(리간드 및 분석체 전환)
리간드 분석체 결합비율 정적 상태 친화도 KD (M) 고정 수준 (RU) 상대적 친화도
anti-PD-L1-NTIG-IL-2 FcRn 1:1 3.91E-07 (397 nM) 242.1 5.06
anti-PD-L1-modified IgG4 Fc-IL-2 FcRn 1:1 1.98E-06 (1,980 nM) 236.5 -
실험예 2: 다양한 Fcγ 수용체와의 결합 친화도 분석
IgG1의 Fc 영역은 FcγRI 및 FcγRIIIa과 결합 친화성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 이들 Fc 수용체는 ADCC나 CDC와 같은 효과기 기능과 관련되어 있는 것으로서, 항암 치료를 위한 항체 또는 Fc 융합단백질의 사용 시에는 항암 치료에 있어서 도움이 되나, 항암 치료가 아닌 다른 질병의 치료를 목적으로 한 API를 사용할 경우, 부작용을 유발할 수 있는 단점을 가진다.
이에, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 NTIG 융합 단백질이 FcγRI 및 FcγRIIIa과의 친화도가 어느 정도 되는지 생물층 간섭계 분석（BLI)을 통해 IgG1 항체와 비교분석하였다.
그 결과, 도 30에서 확인되는 바와 같이, IgG1 계열 항체인 리툭시맙은 FcγRI 및 FcγRIIIa와 특이적 결합을 하는 반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 NTIG 포함 융합단백질인 PG-11은 이들 항체 수용체와 특이적 결합을 하지 않는 것으로 확인되었다.
더 나아가, 본 발명자들은 리툭시맙과 본 발명의 일 실시예에 따른 PG-11의 FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIIb와의 결합 친화도를 비교분석하였다.
그 결과, 도 31에서 확인되는 바와 같이, 리툭시맙은 상기 세 가지 Fc 수용체와 특이적 결합을 하는 것으로 확인되었다. 반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 PG-11의 경우 약한 결합을 나타냈으나, sensogram의 형태를 볼 때, 비-특이적 결합인 것으로 판단된다.
실험예 3: 보체 C1q 결합 분석
항체 Fc 영역은 보체 C1q와 결합함으로써 CDC(complement-dependent cytotoxicity)를 유발할 수 있으며, 따라서, 암치료가 아닌 일반 질환 치료용 Fc 융합단백질의 임상 적용 시 심각한 문제가 될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 NTIG 포함 융합단백질이 보체 C1q와의 결합 친화도가 어느 정도인지 IgG1 계열 항체인 리툭시맙과 비교분석하였다.
이를 위해 구체적으로, 코팅 완충액(0.1 M Na2HPO4, pH 9.6)를 사용하여 PG-11 및 Rituximab을 각각 2 μg/ml이 되도록 희석하였다. 이어, 희석된 시료를 웰에 100 μl씩 적재하고 4℃에서 밤새 반응시켰다. 그런 다음 플레이트에 세척 완충액을 300 μl씩 첨가하여 3회 세척하였고, 각 웰에 차단 완충액(2% BSA/PBS)를 200 μl 첨가하고 상온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 이어, 플레이트에 세척 완충액을 300 μl 첨가한 후 3회 반복 세척하고, 분석 완충액을 이용하여 항-C1q 항체를 10, 3, 1, 0.3, 0.1 μg/ml로 1/3씩 희석해준 뒤 각 웰에 50 μl씩 혼합한 후(duplication) 상온에서 에서 2 시간 동안 반응시켰다. 이어, 플레이트에 세척 완충액을 300 μl씩 혼합하고 8회 반복 세척하였다. C1q-HRP 컨주게이트를 400배 희석하여 각 웰에 50 μl씩 첨가한 후, 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 플레이트에 세척 완충액을 300 μl씩 첨가하고 8회 반복 세척한 후, 기질인 50 μl TMB를 혼합하고 상온에서 반응시켰다. 파란색으로 발색반응이 나타나면 각 웰에 50 μl 중지 용액을 첨가하여 반응을 정지시켜준 후, 450 nm로 설정된 마이크로플레이트 판독기로 흡광도(optical density)를 측정하였다.
분석 결과, 도 32에서 확인되는 바와 같이, 리툭시맙은 C1q와 농도의존적으로 결합하는 반면, 본 발명의 일 실시예에 다른 PG-11은 C1q와 결합하지 않는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 NTIG는 API의 반감기를 향상시키면서도 ADCC나 CDC와 같은 Fc 영역으로 인한 부작용을 최소화할 수 있는 안전한 단백질 담체임이 확인되었다.
실험예 4: GLP-2 활성 분석
상기 실시예들 중 GLP-2를 포함하는 다수의 융합단백질에 대하여 GLP-2 활성이 제대로 발휘되는지 여부를 cAMP HunterTM eXpress GPCR 분석으로 조사하였다(표 10).
GLP-2 활성 분석에 사용된 컨스트럭트들
실시예 코드 컨스트럭트 구조
2-2 PG-22 GLP-2G-NTIG
5-1 MG12-4 GLP-1E/GLP-2G-NTIG (GLP-1 w/ glycan linker)
5-2 MG12-5 GLP-1E/GLP-2G-NTIG (GLP-1 w/ non-glycan linker)
6-3 PG-210-5 GLP-2V(3 point)-NTIG-IL-10Vm (Patent linker)
6-4 PG-210-6 GLP-2V(3 point)-NTIG-IL-10Vm (GS+IgG1 hinge linker)
상기 분석 결과, 도 33 및 표 11에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 융합단백질 중 PG-210-6은 비교예인 PG-22와 GLP-2 활성이 거의 유사하였고, 본 발명의 다른 일 실시예의 PG-210-5는 PG-210-6에 비해 절반 정도의 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 이형 이량체인 MG12-4 및 MG12-5 역시 PG-22에 비해 GLP-2 활성이 절반 정도에 불과한 것으로 확인되었으나, MG12-4 및 MG12-5의 경우, GLP-2가 2 분자로 결합되어 있는 PG-22 대비 GLP-2가 1 분자 포함되어 있기 때문에 50%의 활성 감소는 예측되는 수준이었다. PG-210-5는 종래 특허문헌(US7812121B2)에서 사용된 링커 펩타이드가 적용된 것으로서 본 발명에서 사용한 (G4S)3 + IgG1 힌지의 혼합 링커 펩타이드를 사용한 PG-210-6의 활성이 우수한 것을 확인하였다.
GLP-2 활성 분석 결과
실시예 2-2 5-1 5-2 6-3 6-4
1차 EC50 (nM) 2.84 5.81 5.49 7.44 2.46
1차 상대활성 (%) 100% 48.8% 51.7% 38.1% 115%
2차 EC50 (nM) 2.65 6.08 4.85 5.95 2.93
2차 상대 활성 (%) 100% 43.5% 54.6% 44.5% 90%
평균활성 (%) 100% 46.15% 53.15% 41% 102.5%
실험예 5: IL-10Vm 융합단백질의 면역억제 활성 분석5-1: IL-10 수용체와의 친화도 분석
본 발명자들은 실시예 2-3 및 실시예 2-4의 융합단백질의 IL-10 수용체 1(IL-10R1)과의 친화도를 생물 층 간섭계 분석(BLI)을 통해서 분석하였다.
이를 위해 우선 본 발명자들은 Dip and ReadTM Amine Reactive 2nd Generation(AR2G) Reagent Kit(forteBio, Cat No. 18-5092)를 이용하여 96웰 플레이트에 IL-10R His-tag 단백질을 부착시켰다. 구체적으로, 96웰 플레이트에 D.W. 200 μl를 분주한 후, 상기 키트에 포함된 amine biosensor를 꽂아 10분 동안 수화시켰다. 이어, 새로운 96웰 플레이트에 D.W. 200 μl를 추가로 분주한 후, 필요한 시료 양의 1/20로 EDC:NHS를 1:1로 혼합한 후, D.W.에 희석하여 96웰 플레이트에 200 μl 씩 분주하였다. 이어, IL-10R His-tag 단백질을 10 mM acetate pH 5.0 용액에 10 μg/ml이 되도록 희석한 후 상기 96웰 플레이트에 200 μl씩 첨가하였다. 이후, 1 M 에탄올아민을 200 μl 씩 96웰 플레이트에 첨가한 후, Biosensor 플레이트와 샘플 플레이트를 Octet®-K2 기기에 넣고 측정하였다. 측정이 끝난 후 샘플 플레이트에 1x Kinetics 완충액을 200 μl를 첨가한 후, 기저값(baseline)을 정하였다. 이후, 상기 실시예에서 제조된 NTIG-IL-10 융합단백질을 다양한 농도(0, 62.5, 125, 250, 500 및 1,000 nM)로 1x Kinetic 완충액에 희석한 후 샘플 플레이트에 200 μl로 분주한 후, Octet®-K2 기기로 BLI(Bio-layer interferometry)을 측정하였다.
파라미터 실시예 2-3 실시예 2-4
KD (nM) 11.1±0.9 29.2±8.85
Kon (1/Ms) 71100±6670 20550±2312
Kdis (1/s) 0.0008 0.0006
R2 0.97 0.97
그 결과, 도 34 및 표 12에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예 2-4에 따른 융합단백질(NTIG-IL-10Vm)은 KD 값은 29.2 nM로 실시예 2-3의 이량체성 IL-10 융합단백질의 KD 값(11.1 nM)의 약 세 배 정도로 나타났다. 이는 단량체성 IL-10 변이체 단백질이 이량체성 IL-10 단백질에 비해 수용체와의 친화성이 다소 떨어지는 것으로 해석될 수 있으나, 단량체 형성을 통해 친화도가 떨어질 수 있음은 예측되는 정도였다.
5-2: IL-10Vm 융합단백질의 면역억제 활성 분석
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 단량체성 IL-10 변이체 단백질(IL-10Vm)를 포함하는 다양한 융합단백질들(PG-088m, PG-110, PG-410, 및 PG-210-6)의 시험관 내 면역억제 활성을 분석하였다.
이를 위해 구체적으로, 배양 중인 대식세포 Raw264.7가 들어 있는 T75 플라스크에서 상등액을 제거해준 후 PBS로 1회 세척한 후, TrypLETM Select Enzyme 3 ml을 첨가하고 37℃에서 3 내지 5분간 반응시켰다. 그런 다음 새로운 배지 10 ml을 T75 플라스크에 첨가하고 플라스크 바닥에서 떨어진 세포부유액을 50 ml 코니칼 튜브에 옮긴 후 1,500 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 이어, 상층액을 제거하고 튜브를 가볍게 두드려줘서 세포를 풀어주었다. 그런 다음 새로운 배지 5 ml을 혼합하고 세포를 계수하였다. 세포의 농도가 1X105 cells/ml이 되도록 조정한 후 96-웰 평편바닥 플레이트에 100 μl 씩 분주하였다.
그런 다음, 실시예 2-4에서 제조된 PG-088m, 실시예 3-3에서 제조된 PG-110, 실시예 4-3에서 제조된 PG-410 및 실시예 6-4에서 제조된 PG-210-6을 다양한 농도(PG-210-6 및 PG-410의 경우 0 내지 1,000 nM, PG-110 및 PG-088m의 경우 0 내지 1507 nM)로 순차 희석한 후 상기 Raw264.7 대식세포가 분주된 96-웰 플레이트에 50 μl 씩 처리하였다. 20분 경과 후 LPS(lipopolysaccharide)를 최종 농도가 400 ng/ml이 되도록 하여 50 μl 씩 처리해주고 36℃에서 16시간 동안 배양하였다. 다음날, 상등액을 모아준 후 제조사의 프로토콜에 따라서 TNF-α ELISA(Biolegend, USA) 분석을 수행하였다.
그 결과 도 35a 내지 35c에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 IL-10Vm을 포함하는 융합단백질들은 모두 농도 의존적으로 대식세포에서의 TNF-α의 분비를 억제하는 것으로 확인되었다. 융합단백질의 종류에 따른 유의한 차이는 발견되지 않았다. 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 단량체성 IL-10 변이체 단백질(IL-10Vm)이 NTIG 단백질의 C-말단에 연결되더라도 적절하게 작동함을 의미하는 것이다.
5-3: IgE 결합능 분석
본 발명자들은 실시예 3-3에서 제조된 융합단백질(FcεRIα-NTIG-IL-10Vm)의 마우스 IgE 및 인간 IgE와의 친화도를 생물 층 간섭계 분석(BLI)를 통해서 분석하였다.
이를 위해 우선 본 발명자들은 Dip and ReadTM Amine Reactive 2nd Generation(AR2G) Reagent Kit(forteBio, Cat No. 18-5092)를 이용하여 96 플레이트에 대조군으로 IL-10Vm이 없는 FcεRIα-NTIG 단백질 및 실시예 3-3에서 제조된 융합단백질을 부착시켰다. 구체적으로, 96웰 플레이트에 D.W. 200 μl를 분주한 후, 상기 키트에 포함된 amine biosensor를 꽂아 10분동안 수화시켰다. 이어, D.W. 200 μl를 추가로 분주한 후, 필요한 시료 양의 1/20로 EDC:NHS를 1:1로 혼합한 후, D.W.에 희석하여 96웰 플레이트에 200 μl 씩 분주하였다. 이어, FcεRIα-modified IgG4 Fc 단백질 및 FcεRIα-NTIG-IL-10Vm 융합단백질을 10 mM acetate pH 5.0 용액에 10 μg/ml이 되도록 희석한 후 상기 96웰 플레이트에 200 μl씩 첨가하였다. 이후, 1 M 에탄올아민을 200 μl 씩 96웰 플레이트에 첨가한 후, Biosensor 플레이트와 샘플 플레이트를 Octet®-K2 기기에 넣고 측정하였다. 측정이 끝난 후 샘플 플레이트에 1x Kinetics 완충액을 200 μl를 첨가한 후, 기저값(baseline)을 정하였다. 이후, 항-DNP 마우스 IgE(Sigma)를 다양한 농도(50 pM 내지 3.125 nM)로 1x Kinetic 완충액에 희석한 후 샘플 플레이트에 200 μl로 분주한 후, Octet®-K2 기기로 BLI(Bio-layer interferometry)을 측정하였다.
파라미터 FcεRIα-modified IgG4 Fc PG-110 (FcεRIα-NTIG-IL-10Vm)
1차 2차 3차 1차 2차 3차
평균 KD (nM) 0.364 0.478 0.940 0.224 0.282 0.346
평균: 0.594 평균: 0.284
평균 Kon (1/Ms) 1.23x105 1.49x 105 1.66x105 1.52x105 1.44x105 1.39x105
평균 Kdis (1/s) 4.48x10-5 7.10x10-5 1.56x10-4 3.40x10-5 4.06x10-5 4.82x10-5
평균 R2 0.996 0.999 0.997 0.999 0.999 0.999
그 결과, 도 36a 및 표 13에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 융합단백질(FcεRIα-NTIG-IL-10Vm)의 KD 값은 0.284 nM로 대조군인 FcεRIα-modified IgG4 Fc 보다 다소 낮은 것으로 나타났는데. 이 정도의 차이는 유의한 차이는 아니므로, 단량체성 IL-10 단백질의 부가에 의해 IgE와의 결합능이 떨어지지 않음을 확인할 수 있었다.상기 결과와 함께, 본 발명에서 사용한 인간 FcεRIα와 인간 IgE의 결합도를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 실시예 3-3의 융합단백질(PG-110)과 인간 IgE와의 친화도를 상술한 BLI 방법을 이용하여 분석하였다.
파라미터 PG-110 (FcεRIα-NTIG-IL-10Vm)
평균 KD (nM) 0.346
평균 Kon (1/Ms) 2.19x105
평균 Kdis (1/s) 7.59x10-5
평균 R2 0.9955
그 결과, 도 36b 및 표 14에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질은 인간 IgE와도 상기 마우스 IgE와 유사한 정도의 친화도롤 나타냈다.
5-4: IgE에 대한 억제 활성 분석
이어 본 발명자들은 상기 실시예 3-3에서 제조된 융합단백질(FcεRIα-NTIG-IL-10Vm)이 IgE에 대한 억제활성을 나타내는지 여부를 시험관 내 실험으로 조사하였다.
이를 위해 구체적으로, 대조군으로 FcεRIα-modified IgG4 Fc 그리고 실험물질로 실시예 3-3의 융합단백질(PG-110)을 다양한 농도로 순차희석하여 준비한 후 항-DNP 마우스 IgE 1μl/ml과 혼합한 후 상온에서 30분간 반응시켰다. 이어 마우스로부터 수득한 골수유래 비만세포를 HBSS 완충액으로 세척하고 5X105 cells/60μl의 농도로 맞춰준 후 96-웰 플레이트에 분주하였다. IgE 및 시험 약물을 반응시켰던 시료 20 μl를 사전에 준비된 비만세포에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 25분간 배양하였다. 이후, DNP BSA(500 ng/ml)을 20 μl 첨가한 후, 다시 37℃, 5% CO2 배양기에서 30분간 배양하였고, 1,500 rpm의 속도로 4℃에서 원심분리하고 상층액 30 μl를 분리하였다. 분리된 상층액 30 μl와 기질(4-nitrophenyl N-acetyle-β-glucosaminide, 5.84 mM) 30 μl을 혼합한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 25분동안 배양하였다. 이후, 0.1 M 소디움 카보네이트 완충액(pH 10) 400 μl를 혼합하고 반응을 종결시켰다. 이후, 405 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 상기 비만세포에서 분비된 베타-헥소미니데이즈(β-hexosaminidase)의 상대량을 비교하여 각 약물의 농도에 따른 비만세포 억제효과를 확인하였다. 상기 분석은 3회 독립시행하여 평균을 구하였다.
그 결과, 도 37 및 표 15에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질 PG-110은 농도의존적으로 IgE의 활성을 억제하였으며, 그 정도는 대조군인 FcεRIα-modified IgG4 Fc와 유사하였으나, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질 PG-110의 IC50이 FcεRIα-modified IgG4 Fc의 그것보다 근소하게 낮게 나타났다.
시험물질 IC50 (nM)
1차 시험 2차 시험 3차 시험 평균값
FcεRIα-modified IgG4 Fc 19.58 17.88 22.31 19.92
PG-110 21.64 14.78 14.42 16.947
실험예 6: CD40L에 대한 결합 분석
본 발명자들은 본 발명의 실시예 4-2 및 4-3에서 각각 제조된 PG-400 및 PG-410의 human CD40L과의 결합 친화도를 BLI 분석을 통해 조사하였다.
이를 위해 구체적으로, 평편바닥 96-웰 흑색 플레이트 위에 증류수를 200 μl 분주한 후, 바이오센터 트레이를 상기 수화된 흑색 플레이트 위에 올려놓은 후 아민 바이오센서를 꽂고 10분 동안 수화시켰다. 그런 다음 새로운 96-웰 흑색 시료 플레이트에 증류수 200 μl를 분주한 후 필요한 양의 1/20로 EDC:NHS를 1:1로 혼합한 후 증류수에 희석하여 96-웰 흑색 시료 플레이트에 200 μl 씩 분주하였다. 그런 다음, human CD40L(Peptrotech, 대한민국)을 10 mM 초산 용액(pH 6.0)에 5 μg/ml이 되도록 희석하여 96-웰 흑색 시료 플레이트에 200 μl 씩 분주하였다. 이어 1 M 에탄올아민을 상기 플레이트에 200 μl 씩 첨가하고 바이오센서 플레이트와 시료 플레이트를 Octet®-K2 기기에 적재하여 아민 센서 상에서 CD40L의 결합 정도를 측정하였다. 측정 끝나면 96-웰 흑색 시료 플레이트를 측정 기기에서 꺼낸 후 1X kinetics 완충액을 200 μl 혼합하여 기저선(baseline)을 설정하였다. 분석체인 PG-410과 PG-400을 농도가 200 내지 12.5 nM이 되도록 1X kinetics 완충액에 순차희석시킨 후 96-웰 흑색 시료 플레이트에 200 μl 씩 분주하였다. 다시 시료 플레이트를 Octet®-K2 기기에 적재한 후 BLI 분석을 통해 CD40L과의 결합 정도를 측정하였다.
분석체 PG-400 PG-410
KD (nM) 0.36 nM < 1E-12
Kon(1/Ms) 8.47E+05 1.96E+05
Kdis(1/s) 3.11E-04 < 1E-07
그 결과, 도 38 및 표 16에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(PG-410)은 PG-400 보다 CD40L에 대한 Kon 값은 4.3배 정도 낮았으나, KD 값은 fM 이하(< 1E-12)로 매우 높은 결합친화도를 나타냈고, 결론적으로, PG-400 및 PG-410 단백질은 human CD40L에 잘 결합할 수 있음을 확인하였다. 이때, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(anti-CD40L-NTIG-IL-10Vm)인 PG-410은 CD40L과 매우 높은 결합 친화도로 결합함을 알 수 있었다.
실험예 7: PG-110에 대한 약물 동역학적 분석
본 발명자들은 상기에서 제조된 실시예 3-3에 따른 이중 특이성 융합단백질(PG-110)의 반감기 및 곡선 하 면적(AUC, Area Under the Curve), 혈중 최고 농도(Cmax) 등을 비교함으로써 약물 동역학적(PK) 프로파일을 확인하였다.
구체적으로, 그룹 당 3 마리의 수컷 SD(Sprague Dawley) 랫트에 시험 대상 융합단백질(PG-110)을 1 mg/kg의 투여량으로 피하(SC), 정맥내(IV), 복강내(IP), 근육내(IM) 경로로 투여하였다. 주입 전, 및 주입 후 0.5, 1, 5, 10, 24, 48, 72, 120, 168, 240 및 336 시간 경과 후 혈액을 수득하여, 이를 30분 동안 실온 보관하여 응집시켰다. 응집된 혈액을 3,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 각 샘플의 혈청을 수득하였고, 초저온 냉동고에 저장하였다. 투여 단백질 중 Fc를 특이적으로 검출할 수 있는 IgG-Fc Quantitation set(Bethyl, Cat# E80-104, Lot# E80-104-30)를 이용하여 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질의 혈청 내 농도를 분석하였다.
그 결과, 도 39에서 확인되는 바와 같이, NTIG가 융합된 생리활성 단백질이 투여 경로에 관계없이 체내에서 오랫동안 유지될 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
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Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 130 135 140 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 145 150 155 160 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 165 170 175 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 180 185 190 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 195 200 205 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 <210> 3 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified IgG4 Fc Knob <400> 3 Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 1 5 10 15 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 20 25 30 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 35 40 45 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 50 55 60 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 65 70 75 80 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 85 90 95 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 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Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 68 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge + NTIG Lysine deleted <400> 68 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ser 1 5 10 15 His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 20 25 30 Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 35 40 45 Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 50 55 60 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 85 90 95 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 100 105 110 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 115 120 125 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 130 135 140 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 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Val Ala Ala Pro Ser Val 115 <210> 70 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized anti-CD40L VH <400> 70 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 71 <211> 310 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1E-NTIG Knob glycan linker <400> 71 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 260 265 270 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 275 280 285 Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 290 295 300 Ser Leu Ser Leu Gly Lys 305 310 <210> 72 <211> 281 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-2-2G-NTIG Hole non-glycan linker <400> 72 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Thr His Thr Cys Pro Pro 50 55 60 Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 65 70 75 80 Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 85 90 95 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 100 105 110 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 115 120 125 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 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Ser Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg 50 55 60 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val 65 70 75 80 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr 85 90 95 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 100 105 110 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 115 120 125 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 130 135 140 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 145 150 155 160 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 165 170 175 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 180 185 190 Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu 195 200 205 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 210 215 220 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 225 230 235 240 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 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Claims (15)

  1. 서열번호 1 내지 4로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 변형 IgG4 Fc 도메인 단백질의 18번째 및 196번째 아미노산이 다른 아미노산으로 변이된, 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 18번째 아미노산의 변이는 T18N, T18K, 및 T18Q로 구성되는 군으로부터 선택되는 변이인, 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 196번째 아미노산의 변이는 M196A, M196F, M196I, M196L, M196V, M196P, 및 M196W으로 구성되는 군으로부터 선택되는 변이인, 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    서열번호 5 내지 9로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질.
  5. 하나 이상의 생물학적 활성 단백질(API, active pharmaceutical ingredient)이 제1항의 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 연결된 융합단백질.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 생물학적 활성 단백질은 링커 펩타이드 또는 항체의 힌지 영역을 통해 상기 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 연결되는, 융합단백질.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 생물학적 활성 단백질은 사이토카인, 효소, 혈액응고인자, 막 수용체의 세포외 도메인, 성장인자, 펩타이드 호르몬 또는 항체 유사체인, 융합단백질.
  8. 제1항의 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질 또는 제5항의 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  9. 제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  10. 제5항의 융합단백질을 포함하는 동형 이량체.
  11. 제5항의 융합단백질을 포함하는 이형 이량체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질은 Knobs-into-Holes 구조를 갖는, 이형 이량체.
  13. 제5항의 융합단백질, 제10항의 동형 이량체 및 제11항의 이형 이량체로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물.
  14. 제1항의 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질에 생물학적 활성 단백질이 융합된 융합단백질 또는 그를 포함하는 동형 이량체 또는 이형 이량체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 생물학적 활성 단백질의 생체 내 반감기를 연장하는 방법.
  15. 치료적으로 유효한 양의 제1항의 면역글로불린 Fc 도메인 변이체 단백질에 생물학적 활성 단백질이 융합된 융합단백질 또는 상기 융합단백질을 포함하는 동형 이량체 또는 이형 이량체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 질병 치료방법.
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