RU2681857C2 - Антитело, специфически связывающееся с glp-1r, и его слитый с glp-1 белок - Google Patents
Антитело, специфически связывающееся с glp-1r, и его слитый с glp-1 белок Download PDFInfo
- Publication number
- RU2681857C2 RU2681857C2 RU2016108703A RU2016108703A RU2681857C2 RU 2681857 C2 RU2681857 C2 RU 2681857C2 RU 2016108703 A RU2016108703 A RU 2016108703A RU 2016108703 A RU2016108703 A RU 2016108703A RU 2681857 C2 RU2681857 C2 RU 2681857C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- amino acid
- acid sequence
- heavy chain
- Prior art date
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 83
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 82
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims description 27
- 102000007446 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Human genes 0.000 title claims description 15
- 108010086246 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Proteins 0.000 title claims description 15
- 101100337060 Caenorhabditis elegans glp-1 gene Proteins 0.000 title 1
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 claims abstract description 116
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 40
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 3
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 101710198884 GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 claims abstract 21
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 claims description 112
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 15
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 2
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 84
- 206010033307 Overweight Diseases 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 102000006419 Glucagon-Like Peptide Receptors Human genes 0.000 abstract description 3
- 108010083749 Glucagon-Like Peptide Receptors Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 102100025101 GATA-type zinc finger protein 1 Human genes 0.000 abstract 5
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 description 96
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 57
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 48
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 46
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 30
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 30
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 26
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 20
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 17
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 17
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 16
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 description 14
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 description 13
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 13
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 11
- 101001015516 Homo sapiens Glucagon-like peptide 1 receptor Proteins 0.000 description 10
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 10
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 102000056448 human GLP1R Human genes 0.000 description 9
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 5
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 5
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 4
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 4
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 3
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol group Chemical group OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical class [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 208000002249 Diabetes Complications Diseases 0.000 description 2
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 2
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 2
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 235000021316 daily nutritional intake Nutrition 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 2
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- ZOBPZXTWZATXDG-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazolidine-2,4-dione Chemical compound O=C1CSC(=O)N1 ZOBPZXTWZATXDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical class OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 102000003779 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000194 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- -1 GLP-1 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 208000002705 Glucose Intolerance Diseases 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 208000013016 Hypoglycemia Diseases 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010056997 Impaired fasting glucose Diseases 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100345589 Mus musculus Mical1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100370002 Mus musculus Tnfsf14 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010033647 Pancreatitis acute Diseases 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241000283080 Proboscidea <mammal> Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 101150052859 Slc9a1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 229940123464 Thiazolidinedione Drugs 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 201000003229 acute pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- LFVVNPBBFUSSHL-UHFFFAOYSA-N alexidine Chemical compound CCCCC(CC)CNC(=N)NC(=N)NCCCCCCNC(=N)NC(=N)NCC(CC)CCCC LFVVNPBBFUSSHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950010221 alexidine Drugs 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000002058 anti-hyperglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010953 base metal Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 201000006549 dyspepsia Diseases 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003158 enteroendocrine cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007446 glucose tolerance test Methods 0.000 description 1
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940071870 hydroiodic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 208000002551 irritable bowel syndrome Diseases 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000003880 negative regulation of appetite Effects 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000009104 prediabetes syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical class OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/26—Glucagons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/75—Agonist effect on antigen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Obesity (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Описанное изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая антитело, специфически связывающееся с рецептором глюкагоноподобного пептида 1 (GLP-1R)(варианты), слитый белок GLP-1, полинуклеотид, кодирующий вышеуказанный слитый белок GLP-1, вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, клетку-хозяина для получения слитого белка GLP-1, содержащую вектор, фармацевтическую композицию для предотвращения или лечения инсулиннезависимого сахарного диабета у субъекта, содержащая эффективное количество вышеуказанного антитела или слитого белка GLP-1, способ предотвращения или лечения инсулиннезависимого сахарного диабета, способ предотвращения или лечения ожирения у субъекта, способ предотвращения или лечения избыточного веса у субъекта, способ предотвращения или лечения заболевания, чувствительного к стимуляции GLP-1R у субъекта, где вышеуказанные способы включают введение субъекту вышеуказанного антитела или слитого белка GLP-1 или фармацевтической композиции. Изобретение расширяет арсенал средств, связывающихся с рецептором глюкагоноподобного пептида 1 (GLP-1R). 20 н. и 33 з.п. ф-лы, 6 ил., 16 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области техники, связанной с антителами, и особенно относится к антителу, специфически связывающемуся с GLP-1R, и его слитым с GLP-1 белкам.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Типичные симптомы диабета II типа включают следующие три аспекта: 1) периферическую инсулинорезистентность, проявляющуюся в основном снижением чувствительности костно-мышечными тканей к инсулину, приводящим к нарушению усвоения этими тканями глюкозы (Kahn and Goldfine, J Diabetes Complication (1993) 7:92-105; Weyer et al., J Clin Invest, (1999) 104:787-794); 2) гиперпродукцию глюкозы печенью, снижение чувствительности печеночных клеток к инсулину (Kahn and Goldfine, J Diabetes Complication (1993) 7:92-105, Lam et al., Am J Physiol Endocrinol Metab (2009) 11:375-378) и гиперсекрецию глюкагона (Unger and Orci, Arch Intern Med (1977) 137:482-491); и 3) расстройства островковых бета-клеток поджелудочной железы, когда на ранней стадии заболевания увеличивается пролиферация бета-клеток и повышается секретируемое количество инсулина, что компенсирует влияние инсулинорезистентности на уровень глюкозы в крови (Bonner-Weir, Trends Endocrinol Metab (2000) 11:375-378), но с течением времени и повышением уровня инсулинорезистентности происходит уменьшение числа бета-клеток, вследствие чего снижается секреция инсулина, тем самым приводя к развитию диабета II типа (DeFronzo, Diabetes (1988) 37:667-687; Kahn et al., J Nutr (2001) 131:354S-360S).
Глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1) представляет собой пептидный фрагмент, состоящий из 30 аминокислот. Он выделяется L-клетками кишечника в ответ на всасывание глюкозы (Orskov et al., Diabetes (1994) 43:535-539; Drucker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84:3431-3438). После секреции в ответ на стимуляцию, GLP-1 связывается с GLP-1R (рецептором глюкагоноподобного пептида 1) поджелудочной железы, что активирует сигнальный путь аденилатциклазы, имеющий целью стимулировать синтез и секрецию инсулина. Выделение GLP-1 замедляет опорожнение кишечника, тем самым снижая количество глюкозы, поступающее в систему кровообращения после переваривания пищи (Wettergren et al., Dig. Dis. Sci. (1993) 38: 665-673). У мышей и у пациентов с диабетом I и II типов действие GLP-1 повышает выделение инсулина и снижает концентрацию сахара в крови (Nauck et al., Diabetes. (1997) 105:187-195, Todd et al., Eur J Clin Invest. (1997) 27:533-536). Исследования показали, что GLP-1 также может препятствовать апоптозу бета-клеток поджелудочной железы и способствовать их пролиферации (Perfetti et al., Endocrinology (2000) 141:4600-4605, Hui et al., Endocrinology (2003) 144:1444-1455). Целесообразность и эффективность применения GLP-1 для лечения пациентов с диабетом была доказана клинически (Samson and Garber, Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. USA (2013) 20:87-97). Также есть патенты (патент США № 5899883 и патент США № 6989148), в которых раскрыты способы лечения диабета с применением GLP-1 и его производных. Однако из-за короткого периода полувыведения GLP-1 из организма невозможно получить хороший терапевтический эффект.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Одной из целей настоящего изобретения является предложить антитела, специфически связывающиеся с GLP-1R.
Второй целью настоящего изобретения является предложить антитела, специфически связывающиеся с GLP-1R, и слитые с GLP-1 белки, которые могут продлить период полувыведения GLP-1 из организма с целью сохранения биологической активности молекул GLP-1. В то же самое время слитые белки, образованные на основе GLP-1 и антитела, специфически связывающегося с GLP-1R, обладают свойством нацеливания на молекулы, обусловленным антителами. Кроме того, иммуногенность антитела также ниже, чем иммуногенность других партнеров по слиянию.
Для решения технических проблем, обозначенных выше, в настоящем изобретении применены следующие решения:
Антитело, специфически связывающееся с GLP-1R, содержит аминокислотную последовательность согласно одному из нижеследующего:
(a) CDR3 последовательность легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из:
CDR3 последовательностей легкой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем трех аминокислот в одной из CDR3 последовательностей легкой цепи SEQ ID NO:46-53, выбранной из L1-L13; предпочтительно, CDR3 последовательностей легкой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем двух аминокислот в одной из CDR3 последовательностей легкой цепи SEQ ID NO:46-53, выбранной из L1-L13; и более предпочтительно, CDR3 последовательностей легкой цепи, которые отличаются вставкой, заменой и/или делецией одной аминокислоты в одной из CDR3 последовательностей легкой цепи SEQ ID NO:46-53, выбранной из L1-L13;
(b) CDR3 последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из:
CDR3 последовательностей тяжелой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем четырех аминокислот в одной из CDR3 последовательностей тяжелой цепи SEQ ID NO:20-27, выбранной из Н1-Н13; предпочтительно, CDR3 последовательностей тяжелой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем трех аминокислот в одной из CDR3 последовательностей тяжелой цепи SEQ ID NO:20-27, выбранной из Н1-Н13; более предпочтительно, CDR3 последовательностей тяжелой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем двух аминокислот в одной из CDR3 последовательностей тяжелой цепи SEQ ID NO:20-27, выбранной из Н1-Н13; и более предпочтительно, CDR3 последовательностей тяжелой цепи, которые отличаются вставкой, заменой и/или делецией всего одной аминокислоты в одной из CDR3 последовательностей тяжелой цепи SEQ ID NO:20-27, выбранной из Н1-Н13; и
(c) CDR3 последовательность легкой цепи подпункта (a) и CDR3 последовательность тяжелой цепи подпункта (b).
Предпочтительно указанное антитело дополнительно содержит одну или несколько комбинаций аминокислотных последовательностей из нижеследующего:
(a) CDR1 последовательности легкой цепи, выбранной из одного из нижеследующего:
CDR1 последовательностей легкой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем трех аминокислот в одной из CDR1 последовательностей легкой цепи SEQ ID NO:28-37, выбранной из L1-L13; предпочтительно, CDR1 последовательностей легкой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем двух аминокислот в одной из CDR1 последовательностей легкой цепи SEQ ID NO:28- 37, выбранной из L1-L13; и более предпочтительно, CDR1 последовательностей легкой цепи, которые отличаются вставкой, заменой и/или делецией одной аминокислоты в одной из CDR1 последовательностей легкой цепи SEQ ID NO:28-37, выбранной из L1-L13;
(b) CDR2 последовательности легкой цепи, выбранной из одного из нижеследующего:
CDR2 последовательностей легкой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем двух аминокислот в одной из CDR2 последовательностей легкой цепи SEQ ID NO:38-45, выбранной из L1-L13; и предпочтительно, CDR2 последовательностей легкой цепи, которые отличаются вставкой, заменой и/или делецией одной аминокислоты в одной из CDR2 последовательностей легкой цепи SEQ ID NO:38-45, выбранной из L1-L13;
(с) CDR1 последовательности тяжелой цепи, выбранной из одного из нижеследующего:
CDR1 последовательностей тяжелой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем двух аминокислот в одной из CDR1 последовательностей тяжелой цепи SEQ ID NO:6-12, выбранной из Н1-Н13; и предпочтительно, CDR1 последовательностей тяжелой цепи, которые отличаются вставкой, заменой и/или делецией одной аминокислоты в одной из CDR1 последовательностей тяжелой цепи SEQ ID NO:6-12, выбранной из Н1-Н13; и
(d) CDR2 тяжелой цепи, выбранной из одного из нижеследующего:
CDR2 последовательностей тяжелой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем трех аминокислот в одной из последовательностей тяжелой цепи SEQ ID NO:13-19, выбранной из Н1-Н13; предпочтительно, CDR2 последовательностей тяжелой цепи, которые отличаются вставками, заменами и/или делециями не более чем двух аминокислот в одной из CDR2 последовательностей тяжелой цепи SEQ ID NO:13-19, выбранной из Н1-Н13; и более предпочтительно, CDR2 последовательностей тяжелой цепи, которые отличаются вставкой, заменой и/или делецией одной аминокислоты в одной из CDR2 последовательностей тяжелой цепи SEQ ID NO:13-19, выбранной из Н1-Н13.
Антитело, специфически связывающееся с GLP-1R, содержит одно из нижеследующего:
(a) содержит вариабельный домен легкой цепи, выбранный из одного или нескольких из нижеследующих:
i. CDR1 последовательности легкой цепи, выбранной из одной из SEQ ID NO:28-37;
ii. CDR2 последовательности легкой цепи, выбранной из одной из SEQ ID NO:38-45; и
iii. CDR3 последовательности легкой цепи, выбранной из одной из SEQ ID NO:46-53;
(b) содержит вариабельный домен тяжелой цепи, выбранный из одного или нескольких из нижеследующих:
i. CDR1 последовательности тяжелой цепи, выбранной из одной из SEQ ID NO:6-12;
ii. CDR2 последовательности тяжелой цепи, выбранной из одной из SEQ ID NO:13-19; и
iii. CDR3 последовательности тяжелой цепи, выбранной из одной из SEQ ID NO:20-27; и
(c) последовательность вариабельного домена легкой цепи подпункта (a) и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи подпункта (b).
Антитело, специфически связывающееся с GLP-1R, содержит аминокислотную последовательность согласно одному из нижеследующего:
(a) последовательность вариабельного домена легкой цепи, выбранную из одного из нижеследующего:
i. аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична одной из последовательностей вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105, выбранной из L1-L13; и
ii. аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична одной из полинуклеотидных последовательностей SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, которая кодирует последовательность вариабельного домена легкой цепи, выбранную из L1-L13;
(b) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, выбранную из следующих последовательностей:
i. аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична одной из последовательностей вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, выбранной из Н1-Н13; и
ii. аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична одной из полинуклеотидных последовательностей SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, которая кодирует последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, выбранную из Н1-Н13;
(c) последовательность вариабельного домена легкой цепи подпункта (a) и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи подпункта (b).
Предпочтительно, чтобы указанное антитело дополнительно содержало аминокислотную последовательность из одного из следующего:
(a) последовательность вариабельного домена легкой цепи из одной из последовательностей вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105, выбранной из L1-L13;
(b) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи из одной из последовательностей вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, выбранной из Н1-Н13; и
(c) последовательность вариабельного домена легкой цепи подпункта (a) и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи подпункта (b).
Предпочтительно комбинацию последовательностей вариабельного домена легкой цепи подпункта (a) и последовательностей вариабельного домена тяжелой цепи подпункта (b) в схеме (c) выбирать из одного из следующего: L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12 и L13H13.
Предпочтительно, чтобы указанное антитело дополнительно содержало аминокислотную последовательность из одного из следующего:
(a) аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO:106;
(b) аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO:107;
(с) аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO:108;
(d) аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO:109;
(e) аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO:106, и аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO:108;
(f) аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO:107, и аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO:108;
(g) аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO:106, и аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO:109; и
(h) аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, приведенную в SEQ ID NO:107, и аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, приведенную в SEQ ID NO:109.
Предпочтительно указанное антитело выбирать из мышиного антитела, человеческого антитела, гуманизированного антитела, химерного антитела, моноклонального антитела, поликлонального антитела, рекомбинантного антитела, антигенсвязывающего фрагмента антитела, одноцепочечного антитела, двухцепочечного антитела, трехцепочечного антитела, четырехцепочечного антитела, Fab фрагмента, F(fa')x фрагмента, доменного антитела, IgD антитела, IgE антитела, IgM антитела, IgG1 антитела, IgG2 антитела, IgG3 антитела и IgG4 антитела.
Слитый с GLP-1 белок образуется путем слияния GLP-1 с антителом настоящего изобретения, где GLP-1 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из одной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:127.
Предпочтительно GLP-1 слит с легкой цепью и/или тяжелой цепью антитела по п. 1, или по п. 3, или по п. 4 посредством связей типа N'-R1-L-R2-C', N'-R2-L-R1-C' или N'-R2-R1r-C',
где L представляет собой последовательность пептидного линкера, содержащего полноразмерную, частичную или повторяющуюся аминокислотную последовательность, выбранную из одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112;
R1 представляет собой аминокислотную последовательность GLP-1;
R1r представляет собой обратную аминокислотную последовательность GLP-1;
R2 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи или тяжелой цепи антитела по п. 1, или по п. 3, или по п. 4;
C' представляет собой C-концевой аминокислотный остаток полипептидной цепи слитого с GLP-1 белка;
N' представляет собой N-концевой аминокислотный остаток полипептидной цепи слитого с GLP-1 белка;
Полинуклеотид кодирует слитый с GLP-1 белое настоящего изобретения.
Вектор содержит полинуклеотид настоящего изобретения.
Клетка-хозяин содержит вектор настоящего изобретения.
Фармацевтическая композиция содержит слитый с GLP-1 белок настоящего изобретения в смеси с фармацевтически приемлемым носителем.
Раскрыто применение фармацевтической композиции, содержащей или основанной на антителе или слитом с GLP-1 белке настоящего изобретения, в получении лекарственных средств, используемых для предотвращения или лечения инсулиннезависимого сахарного диабета.
С учетом того, что GLP-1R играет ключевую роль в применении глюкагоноподобного пептида 1 в регулировании и контролировании уровней глюкозы в крови у пациентов с диабетом II типа, и того, что его значимой терапевтической характеристикой является способность стимулировать секрецию инсулина без сопутствующего этому риска вызвать гипогликемию, в настоящем изобретении GLP-1 сливают с антителом, специфически связывающимся с GLP-1R, таким образом продлевая период полувыведения GLP-1 из организма и поддерживая биологическую активность молекул GLP-1. В то же самое время слитые белки, образованные на основе GLP-1 и антитела, специфически связывающегося с GLP-1R, обладают свойством нацеливания на молекулы, обусловленным антителом. Кроме того, иммуногенность антитела также ниже, чем иммуногенность других партнеров по слиянию.
Полезный эффект от данного изобретения является следующим: GLP-1 способен к слиянию в антителом, специфически связывающимся с GLP-1R, тем самым продлевается период полувыведения GLP-1 из организма и поддерживается биологическая активность молекул GLP-1. В то же самое время слитые белки, образованные на основе GLP-1 и антитела, специфически связывающегося с GLP-1R, обладают свойством нацеливания на молекулы, обусловленное антителом. Кроме того, иммуногенность антитела также ниже, чем иммуногенность других партнеров по слиянию.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В связи с тем, что GLP-1 в организме быстро инактивируется дипептидилпептидазой (DPP-IV), что является причиной его недостаточной эффективности, настоящее изобретение направлено на увеличение периода полувыведения и биоактивности GLP-1 путем его слияния с антителом к GLP-1R. Антитела, используемые для слияния, не препятствуют связыванию GLP-1 с рецептором, могут специфически способствовать биологической активности GLP-1, также способны в течение длительного времени увеличивать локальную концентрацию GLP-1 вокруг рецептора благодаря повышенному сродству к рецептору и стабильности, и, таким образом, значительно увеличить эффективное время и силу связывания с рецептором. В то же время, слияние с антителом увеличивает пространственные затруднения при распознавании или захвате GLP-1 дипептидилпептидазами-4 (DPP-IV), что уменьшает скорость инактивации GLP-1 в организме и увеличивает время действия GLP-1. Согласно опубликованным данным (Lin and Wang, J. Of Molecular Modeling (2009) 15:53-65), высвобождение сшивки между N-концевым внеклеточным участком GLP-1R и его трансмембранным доменом является важной стадией для допуска GLP-1 к сайту связывания с GLP-1R и проявления его биологической активности. Связывание указанного в настоящем изобретении антитела с GLP-1R в значительной степени распространяется на N-концевой внеклеточный участок рецептора, связывание его с рецептором помогает вышеуказанному высвобождению сшивки и способствует доступу GLP-1. Таким образом, слияние GLP-1 с антителом, направленным против GLP-1R, увеличивает период полувыведения и силу сродства GLP-1, что приводит к повышению его биоактивности, и тем самым является важным новаторством, которое значительно лучше терапии на основе GLP-1. Более того, некоторые антитела, используемые в данном изобретении, сами по себе имеют биологические особенности повышения GLP-1/GLP-1R активации при присутствии GLP-1. Исходя из вышеизложенных причин, GLP-1 слитые белки по настоящему изобретению являются более активным активатором GLP-1R по сравнению с GLP-1.
Существует серьезное опасение, что при регулярно повторяющемся введении в течение длительного периода времени слитый белок может вызывать антигенность. Это особенно вызывает опасение в случае терапии, использующей слитый с GLP-1 белок, поскольку с того момента как у пациента выявлено данное заболевание, его лечение становится пожизненным. Кроме того, если Fc участки иммуноглобулина сохраняют нежелательные эффекторные функции, терапия с использованием слитых с Fc белков может быть проблематичной. С помощью компьютерного 3D-моделирования структуры иммуноглобулина и оптимизации и гуманизации последовательности антитела были идентифицированы определенные слитые с GLP-1 белки, которые более не обладают эффекторной функцией и, таким образом, понижается риск вызвать иммунный ответ после регулярно повторяющегося и длительного терапевтического применения. Как обсуждается в настоящем изобретении, аминокислоты частицы GLP-1 предпочтительно слиты с легкой и тяжелой цепями антител через пептидный линкер с повышенным содержанием глицина и серина. Благодаря меньшему размеру боковых цепей глицин и серин позволяют последовательности пептидного линкера быть достаточно гибкой, снижая жесткость соединения между GLP-1 и соответствующими положениями антитела, так, GLP-1 может свободно взаимодействовать с GLP-1R. В то же время наличие пептидного линкера отделяет GLP-1 от антитела, тем самым позволяя избежать взаимодействия их доменов. Попеременное расположение глицина и серина позволяет избежать чрезмерно повторения, чтобы не вызвать нежелательной иммуногенности к слитому белку, однако, пептидный линкер неизбежно повышает иммуногенность слитого белка в организме, и поэтому очень большое значение имеет выбор длины пептидного линкера, которая позволила бы уравновесить гибкость структуры и иммуногенность. Соответственно, настоящее изобретение также предлагает три различные длины пептидных линкеров для слияния. В то же время, настоящее изобретение предлагает различные способы связывания GLP-1 с антителом путем использования пептидных линкеров для слияния, а структуры полученных слитых с GLP-1 белков содержат:
1) слитый белок, содержащий GLP-1 и легкую цепь, связанные линкерной структурой типа N'-R1-L-R2-C';
2) слитый белок, содержащий GLP-1 и легкую цепь, связанные линкерной структурой типа N'-R2-L-R1-C';
3) слитый белок, содержащий GLP-1 и легкую цепь, связанные линкерной структурой типа N'-R2-L-R1r-C';
4) слитый белок, содержащий GLP-1 и тяжелую цепь, связанные линкерной структурой типа N'-R1-L-R2-C';
5) слитый белок, одновременно содержащий 1) и 4);
6) слитый белок, одновременно содержащий 2) и 4); и
7) слитый белок, одновременно содержащий 3) и 4).
В объем настоящего изобретения входят: ДНК, кодирующая GLP-1, которая связана с полноразмерной/вариабельным участком/фрагментом легкой цепи или полноразмерной/вариабельным участком/полноразмерной тяжелой цепью ДНК указанного антитела, с помощью ДНК, кодирующей последовательность пептидного линкера, образующего слитую легкую цепь или слитую тяжелую цепь ДНК, кроме того, со стороны 5' конца легкой цепи ДНК также вводится ДНК, кодирующая сигнальный пептид, с образованием гена, на основе которого мутант/дикого типа GLP-1 может быть соединен с последовательностью антитела. В настоящем изобретении последовательность GLP-1, полученная способом генного синтеза, связана как с пептидным линкером, так и с легкой или тяжелой цепью ДНК антитела с помощью методики ПЦР. Последовательности вариабельного участка легкой или тяжелой цепей антител к GLP-1R получают из определенных клеток гибридомы с помощью методики ПЦР с последующим присоединением к константному участку ДНК или определенному подтипу антитела. Константный участок ДНК антитела дикого типа можно получать из определенной библиотеки клонов и использовать в качестве основы для оптимизации последовательности. После клонирования в вектор для экспрессии, гены, используемые для экспрессии описанных здесь слитых белков, используют для получения и экспрессии слитых белков. После образования пар векторов для экспрессии легкой цепи и тяжелой цепи в ходе экспрессии, несущие ДНК гены одновременно трансфицируют или переносят в клетку-хозяина. Промотор индуцируют путем оптимальной адаптации. Трансформанты или гены для амплификации желаемых последовательностей культивируют в подходящей среде при соответствующих рН и температуре. ДНК обычно вводят, используя широко известные способы, такие как CaPO4, электропорация и PEI (полиэтиленимин) и т.п.
Подходящие клетки-хозяева, пригодные для экспрессии нуклеиновых кислот в пределах описанного здесь вектора, включают высшие эукариотические клетки, а примеры клеточных линий млекопитающих для экспрессии включают клеточные линии яичника китайского хомячка (CHO) и эмбриональную клетку почки человека (клеточная линия HEK293 или HEK293, культивируемые в суспензии), а сигнальный пептид на N-конце легкой цепи направляет секрецию рекомбинантных слитых белков из линий клеток-хозяев млекопитающих. Вектор для экспрессии или клонирования несет в себе селективный маркер, который позволяет осуществлять его постоянную репликацию в клетках-хозяевах и используется для скрининга клеток, способных включать в себя кодирующую слитый белок нуклеиновую кислоту, и промотор, который эффективно связывается с кодирующей слитый белок последовательностью и направляет синтез мРНК. Одним примером служит использование вектора, несущего в себе устойчивость к антибиотикам и вирус гепатита В и обезьяний вирусный промотор (SV40), для отбора клеток-хозяев CHO, стабильно экспрессирующих слитые белки.
После экспрессии клетками-хозяевами слитых белков в настоящем изобретении применяется метод афинной хроматографии для очистки части, экспрессированной таким образом в надосадочную жидкость клеточной культуры. В примере данного изобретения слитый белок, слитый с полноразмерным антителом улавливается афинной хроматографической колонкой для белка G, а затем его элюируют из хроматографической колонки, используя низкий рН с последующим сбором. Мягкие условия при элюировании помогают избежать денатурации белка.
Слитый белок данного изобретения можно составлять с одним или несколькими наполнителями. Слитый белок настоящего изобретения можно объединять с фармацевтически приемлемым буферным раствором, в котором рН подобран таким образом, чтобы обеспечивать пригодную стабильность, и который пригоден для терапевтического введения (такого, как парентеральное введение). По выбору можно добавлять один или несколько фармацевтически приемлемых противомикробных средств. Предпочтительными фармацевтически приемлемыми противомикробными средствами являются м-крезол и фенол. Можно добавлять один или несколько фармацевтически приемлемых растворов, чтобы подобрать ионную силу или напряжение. Можно добавлять один или несколько разбавителей, чтобы дополнительно подобрать изотоничность состава. Примером разбавителя для подгонки изотоничности является глицерин. "Фармацевтически приемлемый" означает, что вещество является приемлемым для введения человеку или другим животным, и, следовательно, не содержит токсичных ингридиентов или нежелательных примесей и не влияет на активность активных ингредиентов состава.
Слитый белок данного изобретения можно получать в виде растворенного состава или лиофилизованного порошка, который можно восстанавливать, используя подходящий разбавитель. Лиофилизованная лекарственная форма представляет собой один из видов составов, в которых слитый белок стабилен, при наличии или без наличия буферирующей способности для поддержания рН в течение предполагаемого срока хранения восстановленного продукта. Раствор, содержащий обсуждаемые здесь слитые белки, предпочтительно является изотоническим перед лиофилизацией для того, чтобы осуществлять получение изотонического раствора после восстановления.
Фармацевтически приемлемая форма соли слитых белков настоящего изобретения также входит в объем настоящего изобретения. Широко используемыми кислотами для образования солей присоединения кислот являются неорганические кислоты, такие как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, йодистоводородная кислота, серная кислота и фосфорная кислота; и органические кислоты, такие как п-толуолсульфокислота, углекислота, янтарная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота и уксусная кислота. Предпочтительными солями присоединения кислот являются те, которые образованы с неорганическими кислотами, такими как хлористоводородная кислота и бромистоводородная кислота.
Соли присоединения основания включают те, которые получены из неорганических оснований, таких как гидроксиды аммония, основных металлов или щелочно-земельных металлов, карбонаты и бикарбонаты. Такие основания, полезные в приготовлении раствора соли по данному изобретению, таким образом, включают гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония, карбонат калия и подобные им.
Слитые белки настоящего изобретения обладают биологической активностью. Термин "биологически активный" обозначает способность слитых белков связываться с GLP-1R и активировать его в организме и стимулировать стрессовый ответ. Ответные реакции включают, но не ограничиваются ими, повышенную секрецию инсулина, подавление выделения глюкагона, угнетение аппетита, потерю веса, вызов чувства насыщения, подавление апоптоза и индуцирование пролиферации бета клеток поджелудочной железы и дифференциации бета клеток поджелудочной железы. Несколько показательных белков, слитых с GLP-1, исследовали с точки зрения из активности in vitro и in vivo. Сначала на стадии 4 (Фигура 1) с помощью анализа флуоресцентного обнаружения получали данные о взаимодействии слитого белка с GLP-1R. Затем на стадии 5 с помощью исследование активности in vitro получали данные о взаимодействии слитого белка и активации им человеческого GLP-1R. В этих экспериментах использовали клетки CHO, сверхэкспрессирующие человеческий GLP-1R. Активация GLP-1R в этих клетках вызывает активацию аденилилциклазы, которая в свою очередь индуцирует экспрессию гена-репортера, приводимого в действие цАМФ-восприимчивым элементом (CRE). На стадии 12 (Фигура 2) получают данные о том, где ген-репортер представляет собой люциферазу. Экспериментальные данные in vitro указывают на то, что слитые белки способны связываться с GLP-1R и активировать его и демонстрируют более высокую эффективность in vitro по сравнению с нативным GLP-1. На стадии 13 (Фигура 3) получают данные об изменении концентрации глюкозы в крови мышей через 16 часов (ч) после внутрибрюшинного введения одного из слитых белков настоящего изобретения. Данные исследования in vivo на мышах из стадии 13 продемонстрировали наличие активности у слитого белка и его более продолжительный период полувыведения по сравнению с нативным GLP-1.
Введение слитого белка можно проводить любым путем, об эффективности которого известно лечащему врачу - специалисту в данной области. Периферическое парентеральное введение является одним из таких способов. Термин "парентеральное введение" обычно в медицинской литературе используют, когда имеют в виду инъекцию лекарственной формы в организм с помощью стерильного шприца или другого механического приспособления, такого как инфузионный насос. Периферические парентеральные пути введения включают внутривенное, внутримышечное, подкожное и внутрибрюшинное введение.
Слитые белки настоящего изобретения можно также вводить перорально, ректально, назально или через нижние дыхательные пути, которые не являются парентеральными. Среди этих не парентеральных путей предпочтительными являются введение через нижние дыхательные пути и пероральный путь.
Слитые белки настоящего изобретения можно применять для лечения разнообразных заболеваний и состояний. Слитые белки настоящего изобретения прежде всего проявляют свое биологическое действие путем воздействия на GLP-1R. Субъекты с заболеваниями и/или состояниями, которые благоприятным образом реагируют на стимуляцию GLP-1R или на введение соединений GLP-1, можно лечить с использованием слитых с GLP-1 белков настоящего изобретения. На таких субъектов ссылаются как на субъектов, "нуждающихся в лечении соединениями GLP-1" или "нуждающихся в стимуляции с использованием GLP-1R". Включены субъекты с выявленным инсулиннезависимым сахарным диабетом, инсулинзависимым сахарным диабетом, инсультом (см. WO 00/16797), инфарктом миокарда (см. WO 98/08531), ожирением (см. WO 98/19698), катаболическими изменениями после операции (см. патент США № 6,006,753), функциональной диспепсией и синдромом раздраженного кишечника (см. WO 99/64060). Также включены субъекты, которым показано профилактическое лечение соединениями GLP-1, например, субъекты с высоким риском развития у них инсулиннезависимого сахарного диабета (см. WO 00/07617). Высокий риск развития инсулиннезависимого сахарного диабета характерен для субъектов с нарушенной переносимостью глюкозы или с нарушением уровней глюкозы натощак, субъектов, вес тела которых на примерно 25% превышает нормальный вес для роста субъекта и жидкости в организме, субъектов, перенесших частичную резекцию поджелудочной железы, субъектов, один или оба родителя которых страдают от инсулиннезависимого сахарного диабета, субъектов с выявленным диабетом при беременности и субъектов, перенесших острый панкреатит или страдающих хроническим панкреатитом Эффективное количество слитых белков, описанных здесь, представляет собой дозу, которая приводит к желаемому терапевтическому и/или профилактическому эффекту и не вызывает неприемлемых побочных явлений при введении субъекту, нуждающемуся в стимуляции рецептора GLP-1. Термин "желаемый терапевтический эффект" включает в себя следующее: облегчение симптома(ов), связанных с заболеванием или состоянием; задержку появления симптомов, связанных с заболеванием или состоянием; увеличение продолжительности жизни по сравнению с таковой в отсутствие лечения; и улучшенное качество жизни по сравнению с таковым в отсутствие лечения. Термин "эффективное количество" слитого с GLP-1 белка для лечения сахарного диабета представляет собой количество, которое приводит к улучшенному контролированию концентрации глюкозы в крови по сравнению с таковой в отсутствие лечения, тем самым задерживая появление таких осложнений, связанных с диабетом, как ретинопатия, нейропатия или заболевания почек. "Эффективное количество" слитого с GLP-1 белка для профилактики сахарного диабета представляет собой количество, которое, по сравнению с ситуацией в отсутствие лечения, приводит к отложенному появлению повышенных уровней глюкозы в крови, которое требует лечения такими антигипергликемическими препаратами, как сульфонилмочевина, тиазолидиндион, инсулин и/или бисгуанидин. Дозирование слитых белков, эффективное для нормализации уровней глюкозы в крови пациента, будет зависеть от нескольких факторов, среди которых, без ограничения, пол субъекта, вес и возраст, насколько трудно регулировать уровень глюкозы в крови, путь введения и биодоступность, фармакокинетический профиль слитого белка, действенность и состав препарата. Дозы могут быть в интервале от 0,01 до 1 мг/кг массы тела, предпочтительно в интервале от 0,05 до 0,5 мг/кг массы тела. Предпочтительно, чтобы слитые белки настоящего изобретения вводили либо раз в неделю, либо дважды в неделю. В зависимости от заболевания, требующего лечения, может быть необходимо вводить слитый белок чаще, например, три или более раз в неделю.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На Фигуре 1 показано определение с помощью проточной цитометрии (FACS) специфического связывания рекомбинантного экспрессированного слитого с GLP-1 белка (GLP-1(A8G)-LK-L13H13) с человеческим GLP-1R (hGLP-1R), стабильно экспрессированным в клеточной линии яичника китайского хомячка (пик на сплошной линии, обозначенный звездочкой *), по сравнению с собственно клеточной линией яичника китайского хомячка (пик на прерывистой линии).
Фигура 2 получена на основе исследования с использованием гена-репортера и представляет собой кривую активации GLP-1 дикого типа (кружки) и GLP-1(A8G)-LK-L13H13 (треугольники) к GLP-1R, стабильно экспрессированному в клеточной линии яичника китайского хомячка.
Фигура 3 получена в результате пробы на толерантность к глюкозе у мышей (ICR), на которой показана толерантность к глюкозе у мышей натощак через 16 ч после одноразовой в.б. инъекции GLP-1(A8G)-LK-L13H13 в количестве 5 микрограмм на мышь (квадратики) и 15 микрограмм на мышь (треугольники).
Фигура 4 получена в результате пробы на толерантность к глюкозе у мышей (C57BL), на которой видно, что толерантность к глюкозе у мышей натощак через 40 ч после одноразовой в.б. инъекции GLP-1(A8G)-LK-L13H13 в количестве 15 микрограмм на мышь (треугольники).
На Фигуре 5 приведена кривая зависимости концентрации глюкозы в крови от времени у мышей с сахарным диабетом II типа (мыши db/db), которая показывает изменение концентрации глюкозы в крови в продолжительность эксперимента у мышей с сахарным диабетом II типа после одноразовой в.б. инъекции GLP-1(A8G)-LK-L13H13 при концентрации, равной 10 нмоль/кг (перевернутые треугольники).
На Фигуре 6 приведена кривая зависимости дневного потребления пищи от времени у мышей с сахарным диабетом II типа (мыши db/db), которая показывает изменение в дневного потреблении пищи мышами с сахарным диабетом II типа после в.б. инъекции GLP-1(A8G)-LK-L13H13 в количестве 10 нмоль/кг (перевернутые треугольники), в течение периода от 3 дней до инъекции слитого белка до 5 дней после инъекции. На Фигуре 6 и Фигуре 5 приведены результаты двух параллельных экспериментов.
КОНКРЕТНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Последующие конкретные варианты осуществления в комбинации с фигурами дополнительно иллюстрируют технические решения настоящего изобретения.
В данном изобретении, если не указано иное, применяются исходные материалы, оборудование и подобное, которые можно приобрести у поставщиков или которые широко используются в данном уровне техники. Методы в последующих вариантах изобретения, если не указано иное, все являются традиционными методами в данном уровне техники.
Стадия 1: Конструирование стабильной клеточной линии антигена для иммунизации.
CHO-DHFR минус клетки переносят в 6-и луночный планшет и трансфицируют pYS плазмидой, несущей ген hGLP-1R (нуклеотидную последовательность см. в SEQ ID NO:113, а аминокислотную последовательность см. в SEQ ID NO:114) после 24 ч культивирования. Среду меняют перед проведением трансфекции, которую проводят с использованием рекомендованных производителем Lipofectamine 2000 (Invitrogen) условий. Через 48 часов после трансфекции среду в культуре заменяют на полную среду, содержащую 10 гМ MTX. Среду меняют каждые 3 дня в течение примерно двух недель до появления стабильных слонов. Рассеянные колонии клеток отделяют от планшета и собирают. После того, как растущие клетки достигли примерно 50%-ного слияния, постепенно повышающиеся концентрации MTX (вплоть до концентрации, равной 10 мкM MTX) вводят для селекции под давлением. Сконструированные стабильные клеточные линии анализируют с помощью FACS, используя антитела (Abcam) к hGLP-1R для идентификации клонов клеток после селекции под давлением. Наблюдали значительный уровень экспрессии hGLP-1R в мембране отобранных CHO-DHFR-hGLP-1R клеток после селекции с использованием 10 мкM MTX. Наконец, шесть стабильных клеточных линий hGLP-1R с высоким уровнем экспрессии идентифицировали с помощью субклонирования.
Стадия 2: Приготовление антител.
Эмульгированные в адъюванте Фрейнда полные клетки CHO DHFR-hGLP-1R используют в дозировке 2×106 клеток/мышь для подкожного введения в мышей BALB/c (6-8 недель). Через 2 недели привитые мыши получают бустер, используя неполный эмульгированный в адъюванте Фрейнда иммуноген, и после этого - каждую неделю. Образцы крови собирают из среза на конце хвоста и центрифугируют, собирая сыворотку для определения титров сыворотки, используя анализ FACS. После получения приемлемого титра антител мышей умерщвляют и клетки их селезенки собирают в асептических условиях. Клетки SP2/0 собирают в логарифмической фазе роста при 3 мин центрифугирования при 2000 об/мин. Осадок снова суспендируют в культуральной среде, не содержащей сыворотки, затем центрифугируют и еще раз суспендируют, и считают. Клетки сплина и клетки SP2/0 смешивают в соотношении клетки SP2/0: клетки сплина ≥1:1, а затем трижды проводят цикл промывка-центрифугирование. После отделения осадка из последнего центрифугирования по каплям добавляют 1 мл PEG-1350 (предварительно нагретого до 37°C) (за 30 сек), после перемешивания пипеткой в течение 1 мин, медленно добавляют 30 мл (предварительно нагретого до 37°C) среды, не содержащей сыворотку (Invitrogen), чтобы прекратить слияние с PEG. После 5 мин центрифугирования при 1500 об/мин осадок в пробирке, состоящий из клеток, повторно суспендируют и добавляют RPMI1640 (Invitrogen), содержащий HAT (сахарин, аметоптерин и тимидин; Invitrogen) и 20% FBS (Bioind) в качестве среды для слияния. 20000 клеток сплина и 5000 клеток фидерного слоя в 100 мкл объеме помещают в каждую лунку 96-и луночного планшета. Слитые клетки гибридомы и клетки фидерного слоя совместно культивируют в 96-и луночном планшете с выбором HAT для удаления неслитых клеток. Через 10 дней надосадочную жидкость клеток гибридомы в планшетах для культивирования собирают для проведения исследования методом ELISA (ИФА).
Стадия 3: Скрининг полных клеток методом ELISA
Клетки CHO-DHFR-hGLP-1R, сверхэкспрессирующие hGLP-1R и CHO-DHFR минус клетки, не экспрессирующие hGLP-1R, отдельно переносили в 96-и луночный планшет и продолжали рост до 90% слияния. Надосадочную жидкость культуральной среды удаляют и прикрепившиеся клетки дважды промывают, используя PBS, затем добавляют 100 мкл 100%-го метанола для фиксирования клеток в течение 10 мин при 4°C. Затем добавляют 100 мкл свежеприготовленного 0,6%-ного H2O2-PBS и после инкубирования при комнатной температуре в течение 20 мин клетки дважды промывают, используя PBS. После блокирования с использованием раствора PBS-1% BSA добавляют надосадочную жидкость гибридомы и инкубируют в течение 90 мин при 4°C. После нескольких промывок добавляют 100 мл вторичного антитела GxM-HRP-Fc (Sigma-Aldrich) (разбавленного в 5000 раз) и вносят в каждую лунку, затем инкубируют при 37°C в течение 0,5 ч. После промывки (5 раз) в каждую лунку вводят 100 мкл субстрата хромогенного TMB и инкубируют при 37°C в течение 15 мин, а затем добавляют 2M H2SO4 для прекращения реакции и считывания значений OD450. Положительный контроль представляет собой мышиную сыворотку после иммунизации; отрицательный контроль представляет собой надосадочную жидкость клеточной культуры. Клоны гибридомы, секретирующие антитело к антигену hGLP-1R, подвергают скринингу и стабильные секретирующие клеточные линии против hGLP-1R получают после клонирования. Наконец, надосадочную жидкость антител, секретированную гибридомой, подтверждают, используя анализ FACS.
Стадия 4: Проточный анализ (FACS) надосадочной жидкости положительных клеток гибридомы
PBS, содержащий 10 мM EDTA, используют для отделения и сбора 105 клеток CHO DHFR-hGLP-1R в ЕР пробирку объемом 1,5 мл. Надосадочную жидкость удаляют после центрифугирования и отрицательный контрольный образец повторно суспендируют в загрузочном буфере (PBS, 2% FBS). Для положительного контроля добавляют 200 мкл надосадочной жидкости антитела, чтобы повторно суспендировать клетки, инкубируя при комнатной температуре; затем клетки центрифугируют при 1500 об/мин для удаления надосадочной жидкости, промывают загрузочным буфером и снова центрифугируют. Клетки повторно суспендируют с добавлением меченого FITC флуоресцентного козлиного антитела к мышиному антигену при разведении 1:50 (BD Pharmingen, 200 мкл/лунку) и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте. Надосадочную жидкость удаляют после центрифугирования, клетки промывают загрузочным буфером, снова центрифугируют и повторно суспендируют в загрузочном буфере для анализа. Надосадочная жидкость гибридомы и клетки CHO-DHFR-hGLP-1R демонстрируют специфичное связывание: серый пик и пик на прерывистой линии представляют собой отрицательные контрольные эксперименты; пик на сплошной линии (отмеченной звездочкой *), соответствующий надосадочной жидкости гибридомы, сдвигается очевидно вправо (Фигура 1).
Стадия 5: Клонирование и субклонирование генов антител.
Собирают клетки гибридомы, секретирующей антитела. Гибридому мРНК экстрагируют согласно протоколу производителя набора QIAGEN для экстракции мРНК. Затем экстрагированную мРНК обратно транскрибируют в цДНК. Праймеры обратной транскрипции представляют собой специфические праймеры для константных участков легкой и тяжелой цепей мыши, причем праймер обратной транскрипции тяжелой цепи представляет собой (5'-TTTGGRGGGAAGATGAAGAC-3') (SEQ ID NO:115), праймер обратной транскрипции легкой цепи представляет собой (5'-TTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3') (SEQ ID NO:116) и (5'-TTAACACTCATTCCTGTTGAA-3') (SEQ ID NO:117). ОТ-ПЦР проводят в следующих условиях: 25°C в течение 5 мин, 50°C в течение 60 мин и 70°C в течение 15 мин. Обратно транскрибированную цДНК разбавляют, используя 0,1 мM TE до 500 мкл, вносят в ультрафильтрационную центрифужную пробирку (Amicon Ultra-0.5) и центрифугируют при 2000 g в течение 10 мин. Фильтрат удаляют, добавляют 500 мкл 0,1 мМ TE и центрифугируют при 2000 g в течение 10 мин. Фильтрат удаляют и трубку состава помещают в обратном порядке в новую центрифужную пробирку и центрифугируют при 2000 g в течение 10 мин с получением очищенной цДНК. 10 мкл очищенной цДНК используют в качестве матрицы. Добавляют 4 мкл 5x хвостового буфера, 4 мкл dATP (1 мМ) и 10 Ед концевой трансферазы (Promega), тщательно перемешивают и инкубируют при 37°C в течение 5 мин и при 65°C в течение 5 мин. PolyA хвост цДНК использую в качестве матрицы и проводят ПЦР PCR для амплификации генов вариабельных участков легкой и тяжелой цепей антител. Идущие ранее праймеры - все представляют собой OligodT, при этом находящейся далее праймеры тяжелой цепи представляют собой (5'-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3') (SEQ ID NO:118) и (5'-TGGACAGGGCTCCATAGTTCC-3') (SEQ ID NO:119), и находящийся далее праймер легкой цепи представляет собой (5'-ACTCGTCCTTGGTCAACGTG-3') (SEQ ID NO:120). ПЦР проводят в следующих условиях: 95°C в течение 5 мин; 95°C в течение 30 сек, 56°C в течение 30 сек, 72°C в течение 1 мин, 40 циклов; 72°C в течение 7 мин. Продукты ПЦР соединены с вектором PMD 18-T для сквенирования. Полученные последовательности вариабельных участков легкой и тяжелой цепей антитела после сквернирования приводят в приложенном перечне последовательностей.
Праймеры ПЦР конструируют на основе сквернированных последовательностей ДНК антитела, таким образом полная легкая цепь, сигнальные пептиды тяжелой цепи и вариабельные домены и константные участки IgG1 соединены с вектором pTM5 для экспрессии.
Стадия 6: Промежуточная экспрессия антител к антигену GLP-1R в суспензии клеточной линии HEK293.
Суспензию экспрессирующей клеточной линии HEK293 или CHO вносят в колбу шейкера, и после 24 ч вращения при 37°C клетки готовы для трансфекции. Полиэтиленимин (PEI) используют в качестве агента трансфекции в ходе трансфекции и его смесь с ДНК вносят в клеточную культуру. Оптимизированное соотношение PEI к DNA при смешивании составляет от 1:1 до 5:1. Обработанные смесью PEI/ДНК клетки вращают в течение более 96 ч при 37°C с целью осуществления экспрессии антигенсвязывающего белка, тем временем в клеточную культуру добавляют 0,5% трипсина в качестве источника аминокислот, необходимых для экспрессии, и наконец, клеточную надосадочную жидкость собирают для очистки и отделения антигенсвязывающего белка.
Стадия 7: Гуманизация и оптимизация антитела
Сначала последовательности вариабельных участков легкой и тяжелой цепей прошедшего скриннинг мышиного антитела подвергают выравниванию с гомологичными антителами, используя он-лайн NCBI инструмент (Ig Blast) для выравнивания последовательностей вариабельных участков антитела с целью поиска генных последовательностей зародышевой линии гуманизированного антитела (последовательность Ig Germline Gene), гомологичных последовательности вариабельных участков отобранных антител для гуманизации, и последовательности гуманизированных генов с наивысшей гомологичностью, за исключением последовательностей CDR, используют в качестве матрицы для прививания CDR с целью получения последовательноствей вариабельных участков гуманизированного антитела и синтеза генов легкой и тяжелой цепей гуманизированного антитела. В соответствии с последовательностью праймеры ПЦР конструируют со стороны 5'-конца и 3'-конца синтетической последовательности, вводя подходящие сайты ферментов рестрикции. С помощью ПЦР амплифицируют вариабельные участки гуманизированного антитела, а затем объединяют с последовательностью константного участка человеческого IgG2 или IgG4, получая полную последовательность рекомбинантного человеческого антитела. Экспрессии рекомбинантных антител добиваются в соответствии со стадией 6, и их сродство к GLP-1R подтверждают с помощью анализа FACS, как описано в стадии 4. Лучшего кандидата гуманизированного антитела, сохранившего сродство к GLP-1R, выбирают из их группы и с помощью сайт-специфичного мутагенеза дополнительно улучшают последовательность его вариабельного участка с целью усиления сродства к GLP-1R.
Стадия 8: Клонирование и субклонирование генов гуманизированного слитого белка GLP-1
Оптимизированное гуманизированное антитело сливают с GLP-1 или его производной последовательностью с N-концом и С-концом легких цепей с образованием слитого с GLP-1 белка, и их последовательности соединяют с помощью последовательности пептидного линкера (LK). Нуклеотидная последовательность сигнальный пептид-GLP-1-пептидный линкер была синтезирована компанией Genscript Biotechnology CO., LTD. Используя синтетический ген в качестве матрицы, ПЦР амплифицирует последовательность части "сигнальный пептид-GLP1-линкер", при этом идущий ранее при ПЦР праймер представляет собой (5'-CCACCATGGACTTTGGGCTGAGC-3') (SEQ ID NO:121), находящийся далее при ПЦР праймер представляет собой (5'- AGAGCCGGTGGCAGAGCCAG-3') (SEQ ID NO: 122). ПЦР проводят в следующих условиях: 95°C в течение 5 мин; 95°C в течение 30 сек, 56°C в течение 30 сек, 72°C в течение 30 сек, 35 циклов; 72°C в течение 7 мин. Помимо этого, используя нуклеотидные последовательности гуманизированного антитела в качестве матрицы, амплифицировали последовательность части антитела последовательности слитого белка.
Идущий ранее при ПЦР праймер представляет собой (5'-CTGGCTCTGCCACCGGCTCTGCCATCCAGATGACCCAGTCTCC-3') (SEQ ID NO:123), а находящийся далее при ПЦР праймер представляет собой (5'- ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3') (SEQ ID NO:124). ПЦР проводят в следующих условиях: 95°C в течение 5 мин; 95°C в течение 30 сек, 56°C в течение 30 сек, 72°C в течение 1 мин, 35 циклов; 72°C в течение 7 мин. Затем с помощью перекрывающейся ПЦР часть "сигнальный пептид-GLP-1-пептидный линкер" последовательность нуклеиновой кислоты слитого белка соединяют с частью антитела, вводя два сайта ферментов рестрикции - Nhe1 и Not1 - в оба конца праймеров, и таким образом полная последовательность слитого белка и вектор для экспрессии pTM5 связываются вместе. Перекрывающийся идущий ранее при ПЦР праймер представляет собой (5'-CCGGCTAGCCACCATGGACTTTGGGCTGAGC-3') (SEQ ID NO:125), а находящийся далее праймер представляет собой (5'- AGTGCGGCCGCTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3') (SEQ ID NO:126). ПЦР проводят в следующих условиях: 95°C в течение 5 мин; 95°C в течение 30 сек, 56°C в течение 30 сек, 72°C в течение 1 мин, 35 циклов; 72°C в течение 7 мин. Продукты ПЦР соединены с вектором PTM5 для сквенирования.
Стадия 9: Промежуточная экспрессия слитого с GLP-1 белка в суспензии клеточной линии HEK293.
Суспендированные клетки HEK293 засевают в колбу шейкера и культуральную среду меняют перед трансфекцией. Векторы, содержащие ген легкой/тяжелой цепи белка в концентрации от 0,5 до 1,5 мкг/мл в пересчете на суммарное количество ДНК, смешивают с 1,5-7,5 мкг/мл полиэтиленимина (PEI), и после выдерживания в течение 15-25 минут смесь вносят в клеточную культуральную среду. Через 24 ч, в клеточную культуральную среду добавляют 0,5-1% Trypton N1. Надосадочную жидкость, содержащую выделенный слитый с GLP-1 белок, собирают после культивирования в течение 5-10 дней.
Стадия 10: Стабильная экспрессия слитого с GLP-1 белка в суспензии клеточной линии CHO.
Суспендированные клетки CHO засевают в 6-и луночный планшет и проводят трансфекцию вектора для экспрессии слитого белка, применяя условия для трансфекции из стадии 1. Через 48 ч, вносят 300 мг/мл гигромицина (тяжелая цепь) и 6 мг/мл пуромицина (легкая цепь) для параллельной селекции. После достижения количественного уровня апоптоза (уровень гибели >90%), концентрацию антибиотика постепенно снижают, чтобы позволить восстановиться оставшимся клеткам, и переносят в колбу шейкера для осуществления роста культуры, затем убеждаются, что экспрессия антитела в надосадочной жидкости произошла. Вслед за этим в среде поддерживают половинную концентрацию антибиотика, чтобы позволить осуществиться стабильной экспрессии слитого с GLP-1 белка в клетках.
Стадия 11: Очистка и приготовление слитого с GLP-1 белка из надосадочной жидкости клеточной культуры.
Клетки удаляют из культуры после центрифугирования и надосадочную жидкость пропускают сквозь аффинную хроматографическую колонку для связывания белка G. Экспрессированный слитый с GLP-1 белок элюируют из хроматографической колонки, используя элюент с pH примерно 2,5-3,5. Низкий рН элюента нейтрализуют немедленно, используя нейтрализующий буфер, предоставленный в тубе с элюентом. Раствор белка собирают после элюирования и затем проводят диализ против PBS (фосфатно-солевого буфера).
Стадия 12: Исследование in vitro с помощью гена-репортера слитого с GLP-1 белка с точки зрения его действия при активации GLP-1R (см. Фигуру 2).
CHO-DHFR минус клетки коэкспрессирующие hGLP1R-CRE-люциферазу помещали в 96-и луночный планшет для клеточной культуры, внося 20000 клеток на лунку, и культивировали при 37°C с течение ночи. На следующий день удаляют культуральную надосадочную жидкость. Поверхность клеток дважды промывают средой, не содержащей сыворотку, и остаточную жидкость также удаляют, затем добавляют 100 мкл средой, не содержащей сыворотку, в целях разбавления и очистки антител или GLP-1 и инкубируют при 37°C в течение 4 ч. После стимуляции добавляют 100 мкл Bright Glo хемолюминисцентного субстрата Promega. Наконец, лизаты клеток переносят в 96-и луночный планшет и записывают относительную интенсивность люминесценции, используя микропланшетное считывающее устройство SpectraMax L производства Molecular Devices.
Стадия 13: Проба на толерантность к глюкозе у мышей ICR натощак.
Определение толерантности к глюкозе в вене у мышей проводят для оценки действенности слитых с GLP-1 белков (предпочтительно антитела к GLP-1 (A8G)-LK-L13H13), раскрываемых в данном патенте. В эксперименте использовали четыре группы мышей, и в каждой группе было не менее трех-пяти мышей. Группа I представляет собой контрольную группу, которая получала внутрибрюшинную инъекцию такого же объема PBS. Группа II получала одну внутрибрюшинную инъекцию 15 мкг на каждую мышь. Группа III получала одну внутрибрюшинную инъекцию 5 мкг на каждую мышь. После инъекции мышей не кормили в течение 6-16 часов и по завершении голодания отбирали образцы крови мышей для определения базальной концентрации глюкозы в крови. Затем мышам через желудочный зонд вводили глюкозу с концентрацией 1,5 г/кг и через 15, 30, 60 и 90 минут после введения через зонд отбирали образцы крови для определения концентрации глюкозы в крови, как показано на Фигуре 3.
Стадия 14: Проба на толерантность к глюкозе у мышей (C57BL) с применением слитого с GLP-1 белка с целью определения долговременной действенности (40 ч).
Определение толерантности к глюкозе в вене у мышей проводят для оценки долговременной действенности слитых с GLP-1 белков (предпочтительно антитела к GLP-1 (A8G)-LK-L13H13), раскрываемых в данном патенте. В эксперименте использовали две группы мышей, и в каждой группе было не менее трех-пяти мышей. Группа I представляет собой контрольную группу, которая получала внутрибрюшинную инъекцию такого же объема PBS. Группа II получала одну внутрибрюшинную инъекцию 15 мкг на каждую мышь. Через 24 после инъекции мышей не кормили в течение 16 часов, и по завершении голодания отбирали образцы крови мышей для определения базальной концентрации глюкозы в крови. Затем мышам через желудочный зонд вводили глюкозу с концентрацией 1,5 г/кг и через 15, 30, 60 и 90 минут после введения через зонд отбирали образцы крови для определения концентрации глюкозы в крови, как показано на Фигуре 4.
Стадия 15: Исследование долговременной (72 ч) действенности в отношении снижения концентрации глюкозы в крови у мышей с сахарным диабетом 2 типа (мыши db/db) при применении слитого с GLP-1 белка.
Концентрацию глюкозы в крови у мышей с сахарным диабетом 2 типа определяли в различные моменты времени для оценки долговременной (72 ч) действенности слитого с GLP-1 белка (предпочтительно, антитела к GLP-1 (A8G)-LK-L13H13), раскрываемого в данном патенте, в отношении снижения концентрации глюкозы в крови у мышей с сахарным диабетом 2 типа. В эксперименте использовали две группы мышей, и в каждой группе было не менее шести мышей. Перед началом инъекции отбирали пробы крови мышей для определения базальной концентрации глюкозы в крови. Позже Группа I (контрольная группа) получала внутрибрюшинную инъекцию такого же объема PBS. Группа II получала одну внутрибрюшинную инъекцию с концентрацией 10 нмоль/кг. Через 1, 4, 6, 24, 48 и 72 ч после инъекции отбирали образцы их крови для соответственного определения концентрации глюкозы в крови в двух группах мышей, как показано на Фигуре 5.
Стадия 16: Исследование долговременной (120 ч) действенности в отношении снижения дневного потребления пищи мышами с сахарным диабетом 2 типа (мыши db/db) при применении слитого с GLP-1 белка.
Изменения в потреблении пищи мышами с сахарным диабетом 2 типа определяли для оценки долговременной действенности слитого с GLP-1 белка (предпочтительно, антитела к GLP-1 (A8G)-LK-L13H13), раскрываемого в данном патенте, в отношении снижения уровня потребления пищи мышами с сахарным диабетом 2 типа. Эту стадию проводили одновременно со стадией 15 на той же партии мышей синхронно. В эксперименте использовали две группы мышей, и в каждой группе было не менее шести мышей. Начиная от 3-х дней до инъекции в стадии 15 до 5 дней после инъекции (120 ч), каждое утро и в одно и то же время взвешивали потребляемую мышами за день пищу, как показано на Фигуре 6.
Claims (134)
1. Антитело, специфически связывающееся с рецептором глюкагоноподобного пептида 1 (GLP-1R), содержащее:
аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи: SEQ ID NO:6;
аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи: SEQ ID NO:13;
аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи: SEQ ID NO:20;
аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи: SEQ ID NO:28;
аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи: SEQ ID NO:38; и
аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи: SEQ ID NO: 46.
2. Антитело, специфически связывающееся с GLP-1R, содержащее:
аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи: SEQ ID NO:7;
аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи: SEQ ID NO:14;
аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи: SEQ ID NO:21;
аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи: SEQ ID NO:29;
аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи: SEQ ID NO:39; и
аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи: SEQ ID NO: 47.
3. Антитело, специфически связывающееся с GLP-1R, содержащее:
аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи: SEQ ID NO:8;
аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи: SEQ ID NO:15;
аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи: SEQ ID NO:22;
аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи: SEQ ID NO:30;
аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи: SEQ ID NO:40; и
аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи: SEQ ID NO: 48.
4. Антитело, специфически связывающееся с GLP-1R, содержащее:
аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи: SEQ ID NO:9;
аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи: SEQ ID NO:16;
аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи: SEQ ID NO:23;
аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи: SEQ ID NO:31;
аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи: SEQ ID NO:41; и
аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи: SEQ ID NO: 49.
5. Антитело, специфически связывающееся с GLP-1R, содержащее:
аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи: SEQ ID NO:9;
аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи: SEQ ID NO:16;
аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи: SEQ ID NO:24;
аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи: SEQ ID NO:32;
аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи: SEQ ID NO:42; и
аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи: SEQ ID NO: 50.
6. Антитело, специфически связывающееся с GLP-1R, содержащее:
аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи: SEQ ID NO:7;
аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи: SEQ ID NO:14;
аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи: SEQ ID NO:21;
аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи: SEQ ID NO:33;
аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи: SEQ ID NO:39; и
аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи: SEQ ID NO: 47.
7. Антитело, специфически связывающееся с GLP-1R, содержащее:
аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи: SEQ ID NO:10;
аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи: SEQ ID NO:17;
аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи: SEQ ID NO:25;
аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи: SEQ ID NO:34;
аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи: SEQ ID NO:43; и
аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи: SEQ ID NO: 51.
8. Антитело, специфически связывающееся с GLP-1R, содержащее:
аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи: SEQ ID NO:9;
аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи: SEQ ID NO:16;
аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи: SEQ ID NO:24;
аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи: SEQ ID NO:35;
аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи: SEQ ID NO:43; и
аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи: SEQ ID NO: 51.
9. Антитело, специфически связывающееся с GLP-1R, содержащее:
аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи: SEQ ID NO:11;
аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи: SEQ ID NO:18;
аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи: SEQ ID NO:26;
аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи: SEQ ID NO:36;
аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи: SEQ ID NO:44; и
аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи: SEQ ID NO: 52.
10. Антитело, специфически связывающееся с GLP-1R, содержащее:
аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи: SEQ ID NO:10;
аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи: SEQ ID NO:16;
аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи: SEQ ID NO:23;
аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи: SEQ ID NO:35;
аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи: SEQ ID NO:43; и
аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи: SEQ ID NO: 51.
11. Антитело, специфически связывающееся с GLP-1R, содержащее:
аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи: SEQ ID NO:12;
аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи: SEQ ID NO:19;
аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи: SEQ ID NO:27;
аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи: SEQ ID NO:37;
аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи: SEQ ID NO:45; и
аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи: SEQ ID NO: 53.
12. Антитело по п.1, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи: SEQ ID NO:81; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:55.
13. Антитело по п.1, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью: SEQ ID NO:80; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:54.
14. Антитело по п.2, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи: SEQ ID NO:83; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:57.
15. Антитело по п.2, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью: SEQ ID NO:82; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:56.
16. Антитело по п.3, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи: SEQ ID NO:85; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:59.
17. Антитело по п.3, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью: SEQ ID NO:84; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:58.
18. Антитело по п.4, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи: SEQ ID NO:87; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:61.
19. Антитело по п.4, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью: SEQ ID NO:86; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:60.
20. Антитело по п.5, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи: SEQ ID NO:89; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:63.
21. Антитело по п.5, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью: SEQ ID NO:88; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:62.
22. Антитело по п.6, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи: SEQ ID NO:91; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:65.
23. Антитело по п.6, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью: SEQ ID NO:90; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:64.
24. Антитело по п.7, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи: SEQ ID NO:93; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:67.
25. Антитело по п.7, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью: SEQ ID NO:92; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:66.
26. Антитело по п.8, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи: SEQ ID NO:95; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:69.
27. Антитело по п.8, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью: SEQ ID NO:94; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:68.
28. Антитело по п.9, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи: SEQ ID NO:97 или SEQ ID NO:103; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:71 или SEQ ID NO:77.
29. Антитело по п.9, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью: SEQ ID NO:96 или SEQ ID NO:102; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:70 или SEQ ID NO:76.
30. Антитело по п.9, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи: SEQ ID NO:97; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:71.
31. Антитело по п.9, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью: SEQ ID NO:96; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:70.
32. Антитело по п.9, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи: SEQ ID NO:103; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:77.
33. Антитело по п.9, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью: SEQ ID NO:102; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:76.
34. Антитело по п.10, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи: SEQ ID NO:99; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:73.
35. Антитело по п.10, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью: SEQ ID NO:98; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:72.
36. Антитело по п.11, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи: SEQ ID NO:101 или SEQ ID NO:105; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:75 или SEQ ID NO:79.
37. Антитело по п.11, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью: SEQ ID NO:100 или SEQ ID NO:104; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:74 или SEQ ID NO:78.
38. Антитело по п.11, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи: SEQ ID NO:101; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:75.
39. Антитело по п.11, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью: SEQ ID NO:100; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:74.
40. Антитело по п.11, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи: SEQ ID NO:105; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO:79.
41. Антитело по п.11, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью: SEQ ID NO:104; и последовательность вариабельной области тяжелой цепи, кодируемую полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:78.
42. Антитело по любому из пп.1-41, отличающееся тем, что антитело содержит аминокислотную последовательность, выбранную из:
(a) аминокислотной последовательности константной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO:106;
(b) аминокислотной последовательности константной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO:107;
(с) аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO:108;
(d) аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO:109;
(e) аминокислотной последовательности константной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO:106, и аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO:108;
(f) аминокислотной последовательности константной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO:107, и аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO:108;
(g) аминокислотной последовательности константной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 106, и аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO:109; и
(h) аминокислотной последовательности константной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO:107, и аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO:109.
43. Антитело по любому из пп.1-42, отличающееся тем, что антитело является мышиным или гуманизированным антителом.
44. Слитый белок GLP-1, включающий GLP-1 и антитело по любому из пп.1-43, где GLP-1 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:127.
45. Слитый белок GLP-1 по п.44, отличающийся тем, что GLP-1 слит с легкой цепью и/или тяжелой цепью антитела в форме N'-R1-L-R2-C', N'-R2-L-R1-C' или N'-R2-R1r-C',
где:
L представляет собой пептидный линкер, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111 и SEQ ID NO:112;
R1 представляет собой аминокислотную последовательность GLP-1;
R1r представляет собой обратную аминокислотную последовательность GLP-1;
R2 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи или тяжелой цепи антитела;
C' представляет собой карбоксильный концевой остаток слитого белка GLP-1; и
N' представляет собой амино концевой остаток слитого белка GLP-1.
46. Полинуклеотид, кодирующий слитый белок GLP-1 по п. 44.
47. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п.46.
48. Клетка-хозяин для получения слитого белка GLP-1 по п.44, содержащая вектор по п.47.
49. Фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения инсулиннезависимого сахарного диабета у субъекта, содержащая эффективное количество антитела по любому из пп.1-43 или слитого белка GLP-1 по п.44 или 45 и фармацевтически приемлемый носитель.
50. Способ предотвращения или лечения инсулиннезависимого сахарного диабета, включающий введение субъекту антитела по любому из пп.1-43 или слитого белка GLP-1 по п.44 или 45 или фармацевтической композиции по п.49.
51. Способ предотвращения или лечения ожирения у субъекта, включающий введение субъекту антитела по любому из пп. 1-43 или слитого белка GLP-1 по п.44 или 45 или фармацевтической композиции по п.49.
52. Способ предотвращения или лечения избыточного веса у субъекта, включающий введение субъекту антитела по любому из пп.1-43 или слитого белка GLP-1 по п.44 или 45 или фармацевтической композиции по п.49.
53. Способ предотвращения или лечения заболевания, чувствительного к стимуляции GLP-1R у субъекта, включающий введение субъекту антитела по любому из пп. 1-43 или слитого белка GLP-1 по п.44 или 45 или фармацевтической композиции по п.49.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310350640 | 2013-08-13 | ||
| CN201310350640.0 | 2013-08-13 | ||
| PCT/CN2014/083568 WO2015021871A1 (zh) | 2013-08-13 | 2014-08-01 | 一种能与glp-1r特异性结合的抗体及其与glp-1的融合蛋白质 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016108703A RU2016108703A (ru) | 2017-09-14 |
| RU2016108703A3 RU2016108703A3 (ru) | 2018-03-19 |
| RU2681857C2 true RU2681857C2 (ru) | 2019-03-13 |
Family
ID=52468032
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016108703A RU2681857C2 (ru) | 2013-08-13 | 2014-08-01 | Антитело, специфически связывающееся с glp-1r, и его слитый с glp-1 белок |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10059773B2 (ru) |
| EP (1) | EP3034514B1 (ru) |
| JP (1) | JP6749235B2 (ru) |
| KR (1) | KR102285342B1 (ru) |
| CN (1) | CN104371019B (ru) |
| AU (1) | AU2014308330C1 (ru) |
| CA (1) | CA2921256C (ru) |
| HK (1) | HK1226415A1 (ru) |
| IL (1) | IL243902B (ru) |
| PL (1) | PL3034514T3 (ru) |
| RU (1) | RU2681857C2 (ru) |
| TW (1) | TWI568745B (ru) |
| WO (1) | WO2015021871A1 (ru) |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102160389B1 (ko) | 2013-08-05 | 2020-09-28 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 드 노보 합성된 유전자 라이브러리 |
| EP3119432B1 (en) | 2014-03-19 | 2020-01-08 | MacKay Medical Foundation the Presbyterian Church in Taiwan MacKay Memorial Hospital | Antibodies against immunogenic glycopeptides, composition comprising the same and use thereof |
| JP6731953B2 (ja) * | 2015-02-11 | 2020-07-29 | ジーエムエーエックス バイオファーム エルエルシー． | Ｇｌｐ−１ｒ抗体融合タンパク質の安定な医薬溶液製剤 |
| US9981239B2 (en) | 2015-04-21 | 2018-05-29 | Twist Bioscience Corporation | Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis |
| EP3350314A4 (en) | 2015-09-18 | 2019-02-06 | Twist Bioscience Corporation | BANKS OF OLIGONUCLEIC ACID VARIANTS AND SYNTHESIS THEREOF |
| KR20180058772A (ko) | 2015-09-22 | 2018-06-01 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 핵산 합성을 위한 가요성 기판 |
| CN115920796A (zh) | 2015-12-01 | 2023-04-07 | 特韦斯特生物科学公司 | 功能化表面及其制备 |
| WO2017173091A1 (en) * | 2016-03-30 | 2017-10-05 | Musc Foundation For Research Development | Methods for treatment and diagnosis of cancer by targeting glycoprotein a repetitions predominant (garp) and for providing effective immunotherapy alone or in combination |
| CN107663240B (zh) * | 2016-07-29 | 2021-01-12 | 中国人民解放军第四军医大学 | 高度糖基化cea特异性结合的单链抗体及其在检测和治疗上的应用 |
| CA3034769A1 (en) | 2016-08-22 | 2018-03-01 | Twist Bioscience Corporation | De novo synthesized nucleic acid libraries |
| US10417457B2 (en) | 2016-09-21 | 2019-09-17 | Twist Bioscience Corporation | Nucleic acid based data storage |
| US11219669B2 (en) | 2016-12-15 | 2022-01-11 | Talengen International Limited | Method for preventing and treating liver fibrosis |
| GB2573069A (en) | 2016-12-16 | 2019-10-23 | Twist Bioscience Corp | Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof |
| CA3054303A1 (en) | 2017-02-22 | 2018-08-30 | Twist Bioscience Corporation | Nucleic acid based data storage |
| US10894959B2 (en) | 2017-03-15 | 2021-01-19 | Twist Bioscience Corporation | Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof |
| AU2018284227B2 (en) | 2017-06-12 | 2024-05-02 | Twist Bioscience Corporation | Methods for seamless nucleic acid assembly |
| WO2018231864A1 (en) | 2017-06-12 | 2018-12-20 | Twist Bioscience Corporation | Methods for seamless nucleic acid assembly |
| CA3067890A1 (en) * | 2017-06-19 | 2018-12-27 | Talengen International Limited | Method for regulating and controling glp-1/glp-1r and drug |
| CN111566125A (zh) | 2017-09-11 | 2020-08-21 | 特韦斯特生物科学公司 | Gpcr结合蛋白及其合成 |
| EA202090649A1 (ru) | 2017-09-22 | 2020-06-29 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Агонисты рецептора глюкагоноподобного пептида 1 и их применения |
| GB2583590A (en) | 2017-10-20 | 2020-11-04 | Twist Bioscience Corp | Heated nanowells for polynucleotide synthesis |
| AU2019205269A1 (en) | 2018-01-04 | 2020-07-30 | Twist Bioscience Corporation | DNA-based digital information storage |
| CN117126279A (zh) | 2018-03-20 | 2023-11-28 | 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 | Gipr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用 |
| CN110357959B (zh) | 2018-04-10 | 2023-02-28 | 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 | Gcgr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用 |
| CN112639130B (zh) | 2018-05-18 | 2024-08-09 | 特韦斯特生物科学公司 | 用于核酸杂交的多核苷酸、试剂和方法 |
| CN110655577A (zh) * | 2018-06-13 | 2020-01-07 | 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 | APJ抗体及其与Elabela的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用 |
| WO2020176678A1 (en) | 2019-02-26 | 2020-09-03 | Twist Bioscience Corporation | Variant nucleic acid libraries for glp1 receptor |
| JP2022522668A (ja) | 2019-02-26 | 2022-04-20 | ツイスト バイオサイエンス コーポレーション | 抗体を最適化するための変異体核酸ライブラリ |
| CA3144644A1 (en) | 2019-06-21 | 2020-12-24 | Twist Bioscience Corporation | Barcode-based nucleic acid sequence assembly |
| CN112239507A (zh) * | 2019-07-17 | 2021-01-19 | 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 | ETA抗体与TGF-β Trap的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用 |
| CN112521501A (zh) * | 2019-09-18 | 2021-03-19 | 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 | Gipr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用 |
| AU2020356471A1 (en) | 2019-09-23 | 2022-04-21 | Twist Bioscience Corporation | Variant nucleic acid libraries for CRTH2 |
| GB202011958D0 (en) * | 2020-07-31 | 2020-09-16 | Pole Jolene | The facelet |
| WO2022271258A1 (en) * | 2021-06-25 | 2022-12-29 | La Jolla Institute For Immunology | Chimeric anti-sars-cov2 nucleoprotein antibodies |
| EP4416184A1 (en) * | 2021-10-11 | 2024-08-21 | Ohio State Innovation Foundation | Glycoprotein a repetitions predominant (garp)-binding antibodies and uses thereof |
| US20230330254A1 (en) * | 2022-03-11 | 2023-10-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-glp1r antibody-tethered drug conjugates comprising glp1 peptidomimetics and uses thereof |
| WO2024064842A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating obesity, diabetes, and liver dysfunction |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA011166B1 (ru) * | 2004-12-22 | 2009-02-27 | Эли Лилли Энд Компани | Композиции слитых белков-аналогов glp-1 |
| EA013796B1 (ru) * | 2005-09-22 | 2010-06-30 | Байокомпатиблз Юк Лтд. | Слитые полипептиды, содержащие glp-1 (глюкагон-подобный пептид-1), с повышенной устойчивостью к пептидазам |
| RU2432361C2 (ru) * | 2007-01-05 | 2011-10-27 | КовЭкс Текнолоджиз Айэлэнд Лимитед | Соединения агонисты рецептора глюкагоноподобного белка-1 (glp-1r) |
| WO2011056644A3 (en) * | 2009-10-28 | 2011-12-29 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Anti-glp-1r antibodies and their uses |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9409496D0 (en) | 1994-05-12 | 1994-06-29 | London Health Ass | Method for improving glycaemic control in diabetes |
| US6006753A (en) | 1996-08-30 | 1999-12-28 | Eli Lilly And Company | Use of GLP-1 or analogs to abolish catabolic changes after surgery |
| US6277819B1 (en) | 1996-08-30 | 2001-08-21 | Eli Lilly And Company | Use of GLP-1 or analogs in treatment of myocardial infarction |
| UA65549C2 (ru) | 1996-11-05 | 2004-04-15 | Елі Ліллі Енд Компані | Применение аналогов и производных glp-1 для периферического введения для борьбы с ожирением |
| SE9802080D0 (sv) | 1998-06-11 | 1998-06-11 | Hellstroem | Pharmaceutical composition for the treatment of functional dyspepsia and/or irritable bowel syndrome and new use of substances therein |
| US5899883A (en) | 1998-07-08 | 1999-05-04 | Jinq Shing Chern | Safety syringe |
| EP1306091A3 (en) | 1998-07-31 | 2003-05-21 | Novo Nordisk A/S | Stimulation of beta cell proliferation |
| MY155270A (en) | 1998-09-24 | 2015-09-30 | Lilly Co Eli | Use of glp-1 or analogs in treatment of stroke |
| KR20080085082A (ko) | 2000-12-07 | 2008-09-22 | 일라이 릴리 앤드 캄파니 | Ｇｌｐ-1 융합 단백질 |
| TW200530269A (en) * | 2003-12-12 | 2005-09-16 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-Mpl antibodies |
| JP2008537873A (ja) * | 2004-03-31 | 2008-10-02 | セントカー・インコーポレーテツド | ヒトｇｌｐ−１ミメティボディ、組成物、方法および用途 |
| BRPI0518761A2 (pt) * | 2004-12-02 | 2008-12-09 | Domantis Ltd | fusço de droga, conjugado de droga, Ácido nucleico recombinante, construÇço de Ácido nucleico, cÉlula hospedeira, mÉtodo para produzir uma fusço de droga, composiÇço farmacÊutica, droga, mÉtodo de tratamento e/ou prevenÇço de uma condiÇço em um paciente, mÉtodo de retardo ou prevenÇço de progressço de doenÇa, e, mÉtodo para diminuir a absorÇço de alimentos por um paciente |
| US20060275288A1 (en) | 2005-01-20 | 2006-12-07 | Grihalde Nelson D | GLP-1 receptor agonist and allosteric modulator monoclonal antibodies and uses thereof |
| CN101663317A (zh) * | 2007-01-05 | 2010-03-03 | CovX科技爱尔兰有限公司 | 胰高血糖素样蛋白-1受体glp-1r激动剂化合物 |
| US20090098130A1 (en) | 2007-01-05 | 2009-04-16 | Bradshaw Curt W | Glucagon-like protein-1 receptor (glp-1r) agonist compounds |
| US20090021453A1 (en) | 2007-07-19 | 2009-01-22 | Zachary Smith | Fashion accessory including alternating light emitting and non-light emitting elements of consistent lengths |
| US7982016B2 (en) * | 2007-09-10 | 2011-07-19 | Amgen Inc. | Antigen binding proteins capable of binding thymic stromal lymphopoietin |
| EP2214700A4 (en) * | 2007-11-02 | 2012-08-22 | Janssen Biotech Inc | HALF-SYNTHETIC GLP-1 PEPTIDE FUSION CONSTRUCTS, METHOD AND USES |
| AU2009231439A1 (en) | 2008-03-31 | 2009-10-08 | Glaxo Group Limited | Drug fusions and conjugates |
| EP2421611A1 (en) * | 2009-04-24 | 2012-02-29 | Glaxo Group Limited | Fgfr1c antibody combinations |
| CA2780554C (en) | 2009-11-17 | 2017-08-15 | Ipsen Pharma S.A.S. | Formulation for hgh and rhigf-1 combination |
| JP5899883B2 (ja) | 2011-01-26 | 2016-04-06 | セントラル硝子株式会社 | 高圧ガスの供給方法、衝撃波減衰機構を有する機器及び高圧ガスの供給装置 |
| TW201249867A (en) * | 2011-04-01 | 2012-12-16 | Astellas Pharma Inc | Novel anti-human il-23 receptor antibody |
| JOP20200043A1 (ar) * | 2011-05-10 | 2017-06-16 | Amgen Inc | طرق معالجة أو منع الاضطرابات المختصة بالكوليسترول |
| JP6006753B2 (ja) | 2014-07-08 | 2016-10-12 | 株式会社京三製作所 | 踏切保安システム、中央装置及び踏切制御装置 |
-
2014
- 2014-07-22 CN CN201410349725.1A patent/CN104371019B/zh active Active
- 2014-08-01 PL PL14836776.6T patent/PL3034514T3/pl unknown
- 2014-08-01 CA CA2921256A patent/CA2921256C/en active Active
- 2014-08-01 KR KR1020167003696A patent/KR102285342B1/ko active IP Right Grant
- 2014-08-01 EP EP14836776.6A patent/EP3034514B1/en active Active
- 2014-08-01 WO PCT/CN2014/083568 patent/WO2015021871A1/zh active Application Filing
- 2014-08-01 US US14/911,715 patent/US10059773B2/en active Active
- 2014-08-01 AU AU2014308330A patent/AU2014308330C1/en active Active
- 2014-08-01 JP JP2016533798A patent/JP6749235B2/ja active Active
- 2014-08-01 RU RU2016108703A patent/RU2681857C2/ru active
- 2014-08-13 TW TW103127846A patent/TWI568745B/zh active
-
2016
- 2016-02-01 IL IL243902A patent/IL243902B/en active IP Right Grant
- 2016-12-20 HK HK16114466A patent/HK1226415A1/zh unknown
-
2018
- 2018-08-13 US US16/102,552 patent/US10253103B2/en active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA011166B1 (ru) * | 2004-12-22 | 2009-02-27 | Эли Лилли Энд Компани | Композиции слитых белков-аналогов glp-1 |
| EA013796B1 (ru) * | 2005-09-22 | 2010-06-30 | Байокомпатиблз Юк Лтд. | Слитые полипептиды, содержащие glp-1 (глюкагон-подобный пептид-1), с повышенной устойчивостью к пептидазам |
| RU2432361C2 (ru) * | 2007-01-05 | 2011-10-27 | КовЭкс Текнолоджиз Айэлэнд Лимитед | Соединения агонисты рецептора глюкагоноподобного белка-1 (glp-1r) |
| WO2011056644A3 (en) * | 2009-10-28 | 2011-12-29 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Anti-glp-1r antibodies and their uses |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2015021871A1 (zh) | 2015-02-19 |
| JP6749235B2 (ja) | 2020-09-16 |
| AU2014308330B2 (en) | 2020-02-13 |
| IL243902B (en) | 2020-06-30 |
| US20160362498A1 (en) | 2016-12-15 |
| RU2016108703A3 (ru) | 2018-03-19 |
| EP3034514B1 (en) | 2024-07-17 |
| EP3034514A4 (en) | 2017-11-01 |
| RU2016108703A (ru) | 2017-09-14 |
| US20180346585A1 (en) | 2018-12-06 |
| US10059773B2 (en) | 2018-08-28 |
| CA2921256A1 (en) | 2015-02-19 |
| AU2014308330A1 (en) | 2016-02-25 |
| KR20160055789A (ko) | 2016-05-18 |
| TWI568745B (zh) | 2017-02-01 |
| AU2014308330C1 (en) | 2020-05-07 |
| HK1226415A1 (zh) | 2017-09-29 |
| CN104371019B (zh) | 2019-09-10 |
| CA2921256C (en) | 2023-02-21 |
| PL3034514T3 (pl) | 2024-10-07 |
| CN104371019A (zh) | 2015-02-25 |
| KR102285342B1 (ko) | 2021-08-03 |
| US10253103B2 (en) | 2019-04-09 |
| AU2014308330A2 (en) | 2016-04-28 |
| NZ716357A (en) | 2022-03-25 |
| IL243902A0 (en) | 2016-04-21 |
| EP3034514A1 (en) | 2016-06-22 |
| TW201514205A (zh) | 2015-04-16 |
| JP2016532448A (ja) | 2016-10-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2681857C2 (ru) | Антитело, специфически связывающееся с glp-1r, и его слитый с glp-1 белок | |
| JP2016532448A5 (ru) | ||
| TWI708613B (zh) | 使用glp-1受體促效劑與抑胃肽受體(gipr)結合蛋白之偶聯物治療或改善代謝病症之方法 | |
| JP2012521971A (ja) | 薬物融合体および複合体 | |
| WO2019119673A1 (zh) | 一种双基因修饰的干细胞及其用途 | |
| JP2013506628A (ja) | 延長された半減期を有する薬物融合物及びコンジュゲート | |
| CN109836503B (zh) | 一种治疗代谢疾病的多重活性蛋白 | |
| JP7268202B2 (ja) | 代謝性疾患を治療するための融合タンパク質 | |
| JP2022110056A (ja) | Ｂｄｎｆを含む融合蛋白質 | |
| KR102692516B1 (ko) | 융합 단백질을 포함하는 간염증, 간섬유화 및 간경화 예방 또는 치료용 약학적 조성물 | |
| WO2020119728A1 (zh) | 抗人白细胞介素5(il-5)单克隆抗体及其应用 | |
| JP2021517584A (ja) | 増殖分化因子１５アゴニスト化合物およびその使用方法 | |
| JPWO2016208696A1 (ja) | Ｂｄｎｆを含む融合蛋白質 | |
| AU2019256245A1 (en) | Acylated GLP-1 derivative | |
| JP2021518132A (ja) | Ｇｉｐｒ抗体及びｇｌｐ−１とのその融合タンパク質、並びにその医薬組成物及び用途 | |
| WO2020108636A1 (zh) | 全人抗gitr抗体及其制备方法 | |
| WO2022143515A1 (zh) | 一种人glp-1多肽变体及其应用 | |
| US10017555B2 (en) | Long-acting blood sugar decreasing fusion protein | |
| WO2022143516A1 (zh) | 一种人glp-1多肽变体及其应用 | |
| NZ716357B2 (en) | Antibody specifically binding to glp-1r and fusion protein thereof with glp-1 | |
| JP2023548399A (ja) | Ｔｇｆ－ベータファミリーの複数のリガンドを阻害する能力を有する新規の二機能性多特異性アンタゴニストおよびその使用 |