TW201514205A - 能與ｇｌｐ－１ｒ特異性結合的抗體及其與ｇｌｐ－１的融合蛋白質 - Google Patents

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Abstract

本發明公開了一種能與GLP-1R特異性結合的抗體及其與GLP-1的融合蛋白。這些融合蛋白質可以高效地與人GLP-1R受體結合並活化受體信號通道，可以被用於糖尿病、超重、肥胖及其相關病症的治療。

Description

能與GLP-1R特異性結合的抗體及其與GLP-1的融合蛋 白質
本發明係有關於抗體技術領域，特別係有關於一種能與GLP-1R特異性結合的抗體及其與GLP-1的融合蛋白質。
第II型糖尿病的典型症狀包括以下三個方面：1)周邊胰島素抗性，主要是骨骼和肌肉對胰島素的感受度下降，導致對這些組織的葡萄糖輸出受到影響(Kahn and Goldfine,J Diabetes Complication(1993)7：92-105；Weyer等，J Clin Invest.(1999)104：787-794)；2)過度的肝臟葡萄糖生成，肝臟細胞對胰島素的調節感受降低(Kahn and Goldfine,J Diabetes Complication.(1993)7：92-105；Lam等，Am J Physiol Endocrinol Metab.(2009)11：375-378)和昇糖素的過度分泌(Unger and Orci,Arch Intern Med.(1977)137：482-491)；3)胰島beta細胞失調，在疾病早期，beta細胞的增殖和胰島素分泌量增加代償性彌補胰島素抗性對血糖的影響(Bonner-Weir,Trends Endocrinol Metab.(2000)11：375-378)，但隨著時間和胰島素抗性程度的增加，導致beta細胞耗竭，胰島素分泌隨之下降，導致了第II型糖尿病的真正始發(DeFronzo,Diabetes.(1988)37：667-687；Kahn等，J Nutr.(2001) 131：354S-360S)。
昇糖素類似胜肽-1(GLP-1)是一個包含有30個胺基酸的胜肽片段。它由腸道內L細胞分泌來感受葡萄糖的攝入(Orskov等，Diabetes(1994)43：535-539；Drucker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)84：3431-3438)。其感受分泌後，GLP-1和胰腺上的GLP-1R(昇糖素類似胜肽-1受體)結合活化下游腺苷酸環化酶信號通路來促進胰島素的合成與分泌。GLP-1分泌還會減少胃排空，以此來減少食物消化後進入循環系統的葡萄糖的量(Wettergren等，Dig.Dis.Sci.(1993)38：665-673)。在小鼠以及第I型和第II型糖尿病患者中，GLP-1增加了胰島素的分泌及降低血糖濃度(Nauck等，Diabetes.(1997)105：187-195；Todd等，Eur J Clin Invest.(1997)27：533-536)。有研究顯示，GLP-1還能夠抑制胰腺beta細胞的凋亡，促進其增殖(Perfetti等，Endocrinology(2000)141：4600-4605；Hui等，Endocrinology(2003)144：1444-1455)。臨床已經證實了GLP-1在治療糖尿病病人上的可行性和效果(Samson and Garber，Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes.(2013)20：87-97)，也已經有專利(U.S Pat.No 5,899,883，U.S.Pat.No.6,989,148)敘述了使用GLP-1及其衍生物來治療糖尿病的方法。但是GLP-1在體內半衰期較短，治療效果不佳。
本發明的目的之一在於提供一種能與GLP-1R特異性結合的抗體。
本發明的目的之二在於提供一種能與GLP-1R特異性結合的抗體與GLP-1形成的融合蛋白質，它能延長GLP-1的體內半衰期來保留GLP-1分子生物學活性。同時，GLP-1和能與GLP-1R 特異性結合之抗體形成的融合蛋白質，具有由抗體提供的分子靶向性，而且抗體的免疫源性也低於其他的融合蛋白質夥伴。
本發明解決其技術問題所採用的技術手段是：一種能與GLP-1R特異性結合的抗體，所述抗體包含以下方案之一的胺基酸序列：
(a)選自以下序列之一的輕鏈CDR3序列：與選自L1-L13的輕鏈CDR3序列：SEQ ID NO：46~SEQ ID NO：53其中之一相差總共不超過三個胺基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDR3序列；較佳的與選自L1-L13的輕鏈CDR3序列：SEQ ID NO：46~SEQ ID NO：53其中之一相差總共不超過兩個胺基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDR3序列；更佳的與選自L1-L13的輕鏈CDR3序列：SEQ ID NO：46~SEQ ID NO：53其中之一相差一個胺基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDR3序列。
(b)選自以下序列之一的重鏈CDR3序列：與選自H1-H13的重鏈CDR3序列：SEQ ID NO：20~SEQ ID NO：27其中之一相差總共不超過四個胺基酸添加、替換和/或缺失的重鏈CDR3序列；較佳的與選自H1-H13的重鏈CDR3序列：SEQ ID NO：20~SEQ ID NO：27其中之一相差總共不超過三個胺基酸添加、替換和/或缺失的重鏈CDR3序列；進一步的與選自H1-H13的重鏈CDR3序列：SEQ ID NO：20~SEQ ID NO：27其中之一相差總共不超過二個胺基酸添加、替換和/或缺失的重鏈CDR3序列；更進一步的與選自H1-H13的重鏈CDR3序 列：SEQ ID NO：20~SEQ ID NO：27其中之一相差一個胺基酸添加、替換和/或缺失的重鏈CDR3序列。及(c)(a)的輕鏈CDR3序列和(b)的重鏈CDR3序列。
較佳地，所述抗體還包含以下方案的一種或幾種組合的胺基酸序列：
(a)選自以下之一的輕鏈CDR1序列：與選自L1-L13的輕鏈CDR1序列：SEQ ID NO：28~SEQ ID NO：37其中之一相差不超過三個胺基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDR1；較佳的與選自L1-L13的輕鏈CDR1序列：SEQ ID NO：28~SEQ ID NO：37其中之一相差總共不超過兩個胺基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDR1序列；更佳的與選自L1-L13的輕鏈CDR1序列：SEQ ID NO：28~SEQ ID NO：37其中之一相差一個胺基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDR1序列。
(b)選自以下之一的輕鏈CDR2序列：與選自L1-L13的輕鏈CDR2序列：SEQ ID NO：38~SEQ ID NO：45其中之一相差不超過兩個胺基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDR2；較佳的與選自L1-L13的輕鏈CDR2序列：SEQ ID NO：38~SEQ ID NO：45其中之一相差一個胺基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDR2序列。
(c)選自以下之一的重鏈CDR1序列：與選自H1-H13的重鏈CDR1序列：SEQ ID NO： 6~SEQ ID NO：12其中之一相差不超過兩個胺基酸添加、替換和/或缺失的重鏈CDR1；較佳的與選自H1-H13的重鏈CDR1序列：SEQ ID NO：6~SEQ ID NO：12其中之一相差一個胺基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDR2序列。及
(d)選自以下之一的重鏈CDR2：與選自H1-H13的重鏈CDR2序列：SEQ ID NO：13~SEQ ID NO：19其中之一相差不超過三個胺基酸添加、替換和/或缺失的重鏈序列。較佳的與選自H1-H13的重鏈CDR2序列：SEQ ID NO：13~SEQ ID NO：19其中之一相差總共不超過兩個胺基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDR1序列；更佳的與選自H1-H13的重鏈CDR2序列：SEQ ID NO：13~SEQ ID NO：19其中之一相差一個胺基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDR1序列。
一種能與GLP-1R特異性結合的抗體，所述抗體包含以下方案之一：(a)包含以下方案的一種或幾種的輕鏈可變結構域：(i)選自SEQ ID NO：28~SEQ ID NO：37其中之一的輕鏈CDR1序列；(ii)選自SEQ ID NO：38~SEQ ID NO：45其中之一的輕鏈CDR2序列；及(iii)選自SEQ ID NO：46~SEQ ID NO：53其中之一的輕鏈CDR3序列； (b)包含以下方案的一種或幾種的重鏈可變結構域：(i)選自SEQ ID NO：6~SEQ ID NO：12其中之一的重鏈CDR1序列；(ii)選自SEQ ID NO：13~SEQ ID NO：19其中之一的重鏈CDR2序列；及(iii)選自SEQ ID NO：20~SEQ ID NO：27其中之一的重鏈CDR3序列；及(c)(a)的輕鏈可變結構域序列和(b)的重鏈可變結構域序列。
一種能與GLP-1R特異性結合的抗體，所述抗體包含以下方案之一的胺基酸序列：(a)選自以下方案之一的輕鏈可變結構域序列：(i)具有與選自L1-L13的輕鏈可變結構域序列：SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103及SEQ ID NO：105其中之一至少80%相同的序列的胺基酸；及(ii)與編碼L1-L13的輕鏈可變結構域序列的多聚核苷酸序列：SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102及SEQ ID NO： 104其中之一至少80%相同的多聚核苷酸序列編碼的胺基酸序列；(b)選自以下的重鏈可變結構域序列：(i)與H1-H13的重鏈可變結構域序列：SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77及SEQ ID NO：79其中之一至少80%相同的胺基酸序列；及(ii)與編碼H1-H13的重鏈可變結構域序列的多聚核苷酸序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76及SEQ ID NO：78其中之一至少80%相同的多聚核苷酸序列編碼的胺基酸序列；及(c)(a)的輕鏈可變結構域序列和(b)的重鏈可變結構域序列。
較佳地，所述抗體還包含以下方案之一的胺基酸序列：(a)選自L1-L13的輕鏈可變結構域序列：SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103及SEQ ID NO：105其中之一的輕鏈可變結構 域序列；(b)選自H1-H13重鏈可變結構域序列：SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77及SEQ ID NO：79其中之一的重鏈可變結構域序列；及(c)(a)的輕鏈可變結構域序列和(b)的重鏈可變結構域序列。
較佳地，方案(c)中(a)的輕鏈可變結構域序列與(b)的重鏈可變結構域序列的組合選自以下之一：L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13。
較佳地，所述抗體還包含以下方案之一的胺基酸序列：(a)SEQ ID NO：106的輕鏈恒定區胺基酸序列；(b)SEQ ID NO：107的輕鏈恒定區胺基酸序列；(c)SEQ ID NO：108的重鏈恒定區胺基酸序列；(d)SEQ ID NO：109的重鏈恒定區胺基酸序列；(e)SEQ ID NO：106的輕鏈恒定區胺基酸序列和SEQ ID NO：108的重鏈恒定區胺基酸序列；(f)SEQ ID NO：107的輕鏈恒定區胺基酸序列和SEQ ID NO：108的重鏈恒定區胺基酸序列； (g)SEQ ID NO：106的輕鏈恒定區胺基酸序列和SEQ ID NO：109的重鏈恒定區胺基酸序列；及(h)SEQ ID NO：107的輕鏈恒定區胺基酸序列和SEQ ID NO：109的重鏈恒定區胺基酸序列。
較佳地，所述抗體選自鼠源抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多株抗體、重組抗體、抗原結合抗體片段、單鏈抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、Fab片段、F(fa’)x片段、結構域抗體、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體、IgG4抗體。
一種GLP-1融合蛋白質，所述GLP-1融合蛋白質由GLP-1和本發明的抗體融合形成，其中GLP-1包含選自以下之一的胺基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：127。
較佳地，GLP-1通過N’-R1-L-R2-C’、N’-R2-L-R1-C’或者N’-R2-L-R1r-C’的連接方式與請求項1或3或4所述抗體的輕鏈和/或重鏈相融合；其中L為聯結序列(linker sequence)，其包含全長的、部分的或者重複的選自LK1~LK3的胺基酸序列：SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112其中之一的胺基酸序列；R1為GLP-1的胺基酸序列；R1r為GLP-1的反向胺基酸序列；R2為請求項1或3或4所述抗體輕鏈或者重鏈的胺基酸序列； C’代表GLP-1融合蛋白質多肽鏈的羥基殘基端；N’代表GLP-1融合蛋白質多肽鏈的胺基殘基端。
一種多核苷酸，其編碼本發明所述的GLP-1融合蛋白質。
一種載體，其包含本發明所述的多核苷酸。
一種宿主細胞，其包含本發明所述的載體。
一種藥用組合物，其包含與藥用可接受載體混合的本發明所述的GLP-1融合蛋白質。
一種包含或基於本發明所述的抗體或者GLP-1融合蛋白質的藥用組合物在製備用於預防或治療非胰島素依賴性糖尿病的藥物中的用途。
考慮到GLP-1R在使用昇糖素類似胜肽-1調控第II型糖尿病人的血糖濃度方法中所承擔的關鍵作用，並且其顯著的治療特徵是其刺激胰島素分泌而不伴有低血糖相關危險的能力。本發明將GLP-1與能與GLP-1R特異性結合的抗體相融合，延長GLP-1的體內半衰期來保留GLP-1分子之生物學活性。同時，GLP-1和能與GLP-1R特異性結合的抗體形成的融合蛋白質具有由抗體提供的分子靶向性，而且抗體的免疫源性也低於其他的融合蛋白質夥伴。
本發明的功效是：將GLP-1與能與GLP-1R特異性結合的抗體相融合，延長GLP-1的體內半衰期來保留GLP-1分子生物學活性。同時，GLP-1和能與GLP-1R特異性結合的抗體形成的融合蛋白質具有由抗體提供的分子靶向性，而且抗體的免疫源性 也低於其他的融合蛋白質夥伴。
本發明針對GLP-1在體內被二胜肽胜肽酶(DPP-IV)迅速清除而有效性不足的缺點，用GLP-1R的抗體與其融合來增強其半衰期和生物學活性。所用於融合的抗體，具有不阻礙GLP-1與受體結合的前提下，特異性識別GLP-1R的生物學活性，本身與受體的高親和力和穩定性能夠長效地增加GLP-1在受體周圍的局部濃度，從而大大增加其與受體結合的有效時間和效價。同時，與抗體的融合增加了GLP-1被DPP-IV識別或者捕獲的空間位阻，減少了其在體內被清除的機率，而增加了GLP-1的有效時間。據文獻報導，GLP-1R的N端胞外區和其跨膜區部分的咬合狀態的釋放，是GLP-1得以進入與GLP-1R的結合位點，行使其生物活性的關鍵步驟。而本發明中所述的抗體與GLP-1R結合很大程度上涉及到受體的N端胞外區，其和受體的結合有助於上述咬合狀態的釋放，利於GLP-1的進入。所以，GLP-1與針對GLP-1R的抗體融合後，增加了自身的半衰期和親和效價，有更強的生物學活性，是更進一步優越於GLP-1療法的一個重要創新。更重要的是，本發明所用的部分抗體本身具有在GLP-1存在的情況下，增強GLP-1R的GLP-1活化的生物學特性。因為以上的一些原因，本發明所述的GLP-1融合蛋白質是比GLP-1更有效的GLP-1R活化劑。
融合蛋白質長時間反覆使用時的抗原性存在普遍的顧慮。對於GLP-1融合物療法，這尤其是一個顧慮，因為糖尿病患者一旦經診斷為該疾病，必須一生接受治療。此外，如果免疫球蛋白的Fc部分保留不需要的效應物功能(effector function)，Fc融合蛋白質療法可能是一個顧慮。通過用電腦協助對免疫球蛋白的三 維結構的預測，以及抗體的序列的優化以及人源化，加上鑑定反覆和長期使用後誘導免疫反應風險降低並且不再具有效應物功能的特定GLP-1融合蛋白質，本發明中討論的GLP-1部分的胺基酸較佳地通過富含甘胺酸和絲胺酸的聯結序列與抗體的輕鏈和重鏈相融合。因為甘胺酸和絲胺酸帶有較小的側鏈，使聯結序列具有相當的靈活性，減少了GLP-1和抗體之間相對位置的剛性，使GLP-1可以自由地與GLP-1R相互作用。同時，聯結序列的存在隔離了GLP-1和抗體，避免了兩者結構域的相互作用。甘胺酸和絲胺酸交替出現，避免過度重複向融合蛋白質中引入不必要的免疫源性，但是聯結序列無可避免的增加融合蛋白質在體內的免疫源性，較佳的聯結序列長度對於平衡結構柔度和免疫源性很重要。所以，本發明提供了3個不同長度的聯結序列用於融合。同時，本發明中提供了GLP-1與抗體用聯結序列通過不同的連接方式來形成融合，由此而形成的GLP-1融合蛋白質的形式包括：1)帶有GLP-1與輕鏈通過N’-R1-L-R2-C’方式連接的融合蛋白質；2)帶有GLP-1與輕鏈通過N’-R2-L-R1-C’方式連接的融合蛋白質；3)帶有GLP-1與輕鏈通過N’-R2-L-R1r-C’方式連接的融合蛋白質；4)帶有GLP-1與重鏈通過N’-R1-L-R2-C’方式連接的融合蛋白質；5)同時帶有1)和4)的融合蛋白質；6)同時帶有2)和4)的融合蛋白質；及 7)同時帶有3)和4)的融合蛋白質。
本發明中，編碼GLP-1的DNA與所述抗體的全長/可變區/片段輕鏈或全長/可變區/全長重鏈DNA通過編碼聯結序列的DNA連接成融合輕鏈或融合重鏈DNA，同時在輕鏈DNA的5’末端還將引入編碼信號引導胜肽的DNA來形成基因，並可以此基因基礎連接突變/野生型的GLP-1和抗體序列。本發明通過基因合成的方法得到GLP-1的序列，並通過PCR的方法將其與聯結序列以及抗體輕鏈或重鏈DNA相連接。針對GLP-1R的抗體輕鏈或重鏈可變區序列由特定融合瘤細胞中藉由PCR方法調取，並與特定抗體亞型的恒定區DNA相連接組成得到。野生型抗體亞型的恒定區DNA可以通過從特定的資料庫選殖得到並作為序列優化的基礎。在此所述的用於表達融合蛋白質的基因，通過轉殖方式放入表達載體中用於融合蛋白質的產生和表達。在表達過程中，輕鏈和重鏈表達載體搭配後，用共轉染或者轉化的方式將帶有其基因的DNA引入宿主細胞中，並用優化適應誘導啟動子，選擇轉化子或者擴增編碼所希望序列之基因的培養基在適宜的pH、溫度中培養。DNA引入方式選用普遍使用的CaPO4、電穿孔和PEI等方式。
適於表現此處所述載體中核酸的合適宿主細胞包括高等真核細胞，哺乳動物宿主細胞之實施例包括了中國倉鼠卵巢細胞系(CHO)和人胚胎腎臟細胞(HEK293或者懸浮培養的HEK293細胞系)，位於輕鏈N末端的信號引導胜肽調控重組融合蛋白質於哺乳動物宿主細胞系中的分泌。用於表現和轉殖的載體上帶有能夠使載體在宿主細胞中不斷複製的選擇標記，用於篩選帶有編碼融合蛋白質之核酸的細胞並且其帶有與融合蛋白質編碼序列 有效連接並調控mRNA合成的啟動子。其中一個實施例是用帶有抗生素抗性以及乙型肝炎病毒和猿病毒啟動子(SV40)的載體穩定表達融合蛋白質的CHO宿主細胞。
本發明在宿主細胞表達融合蛋白質後，用親和層析的方法將其分泌在細胞培養液中的部分純化。本發明中的實施例包括用蛋白G的親和層析管柱捕獲融合有全長抗體的融合蛋白質，然後用低pH將其從層析管柱上洗脫後再收集。溫和的洗脫條件有助於防止蛋白的變性。
可以用一種或多種賦形劑配製本發明的融合蛋白質。本發明的融合蛋白質可以與可藥用的緩衝液，經調節提供可接受的穩定性的pH以及可施用(例如胃腸外施用)的pH組合。任選地，可以添加一種或多種可藥用的抗微生物劑。間甲酚和苯酚是較佳的可藥用抗微生物劑。可以添加一種或多種可藥用鹽溶液以調節離子強度或張力。可以添加一種或多種賦形劑以進一步調節製劑的等滲性。甘油是等滲性調節賦形劑的實施例。可藥用意味著適於施用於人類或其他動物，因此不含有毒性成分或不希望的污染物，並且不干擾其中活性化合物的活性。
可以利用溶液製劑或合適稀釋劑重組之凍乾粉配製本發明的融合蛋白質。凍乾劑型是其中融合蛋白質穩定的一種劑型，具有或不具有重組產品在預期之使用貨架期內能保持pH的緩衝能力。包含在此討論的融合蛋白質的溶液在凍乾前較佳是等滲的，使之重組後能夠形成等滲溶液。
本發明的融合蛋白質的可藥用鹽溶液形式在本發明範圍內。常用於形成酸加成鹽的酸為無機酸，例如鹽酸、氫溴酸、氫 碘酸、硫酸、磷酸等，以及有機酸，例如對甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、對溴苯基一磺酸、碳酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸、乙酸等。較佳的酸加成鹽是與無機酸，例如鹽酸和氫溴酸形成的鹽。
鹼加成鹽包括從無機鹼，例如銨、鹼或鹼土金屬氫氧化物衍生的那些鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽等。因此，在製備本發明的鹽溶液中有用的這類鹼包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、碳酸鉀等。
本發明的融合蛋白質具有生物學活性。生物學活性指該融合蛋白質在體內結合並活化GLP-1R並引起細胞感受反應。反應包括但是不限於提高胰島素的分泌、昇糖素分泌的抑制、抑制食欲、體重減輕、誘導過飽、抑制凋亡、誘導胰腺beta細胞增殖及胰腺beta細胞分化。對有代表性的一些GLP-1融合蛋白質測試體外和體內活性。首先，步驟4(第1圖)提供了該融合蛋白質和GLP-1R相互作用的螢光檢測數據。然後，步驟5提供了基於該融合蛋白質與人GLP-1R相互作用後將其活化的體外活性測定。在實驗中使用過表達人類GLP-1R的CHO細胞。在這些細胞中，GLP-1R的活化引起腺苷酸環化酶的活化，該酶的活化又誘導由cAMP反應序列(cAMP response element，CRE)驅動的報導基因的表達。步驟12(第2圖)提供了報導基因為螢光素酶的數據。體外的實驗數據共同表明融合蛋白質能夠結合並活化GLP-1R，並且在體外表現比GLP-1-Gly8(7-37)OH更有效。步驟13(第3圖)提供對禁食並腹腔注射本發明的融合蛋白質之一後16h的小鼠灌服葡萄糖後血糖的變化數據。步驟13小鼠中產生的數據則顯示該融合蛋白質在體內具有活性，並且比天然GLP-1具有更長的半衰期。
可以通過具有普通技能的內科醫生已知有效的任意途徑施用這些融合蛋白質。周邊腸胃外屬其中一種此類方法。醫學文獻中通常將腸胃外施用理解為通過消毒注射器或一些其他機械裝置例如注射泵向機體注射劑型。周邊腸胃外可以包括靜脈內、肌內、皮下和腹膜內施用途徑。
本發明的融合蛋白質也可以進行經口、直腸、經鼻或下呼吸道途徑施用，它們是非腸胃外途徑。這些非腸胃外途徑中，較佳為下呼吸道途徑和經口途徑。
本發明的融合蛋白質可以用於治療多種疾病和病症。本發明的融合蛋白質首先通過作用於GLP-1R而發揮其生物學作用。因此可以用本發明的GLP-1融合蛋白質治療會對GLP-1R刺激或對GLP-1化合物施用於有效反應的疾病和/或病症的受試者。將這些受試者稱為「需要GLP-1化合物治療」或「需要GLP-1R刺激」的受試者。包括非胰島素依賴性糖尿病、胰島素依賴性糖尿病、中風(見WO 00/16797)、心肌梗塞(見WO 98/08531)、肥胖(見WO 98/19698)、手術後分解代謝改變(見美國專利號6,006,753)功能性消化不良和腸易激綜合症(見WO99/64060)。也包括要求以GLP-1化合物預防性治療的受試者，例如具有發展為非胰島素依賴性糖尿病危險的受試者(見WO 00/07617)。糖耐量損傷或空腹葡萄糖損傷的受試者、體重對於受試者身高和體液高出正常體重約25%的受試者、部分胰切除的受試者、父母一方或雙方具有非胰島素療的GLP-1融合蛋白質的「有效量」是與沒有治療相比引起對血糖濃度的更佳控制，從而導致糖尿病併發症(例如視網膜病、神經病或腎臟疾病)發作延遲的量。預防糖尿病的GLP-1融合蛋白質的「有效量」是與沒有治療相比延緩血 糖水平升高的發作的量，所述發作需要以抗低血糖藥物例如磺醯脲類、噻唑烷二酮、胰島素和/或雙胍類治療。有效將患者血糖正常化的融合蛋白質的劑量取決於許多因素，其中包括但不限於受試者性別、體重和年齡、調節血糖無能的嚴重性、施用途徑和生物利用率。融合蛋白質藥物代謝動力學圖譜、潛能和劑型。劑量可以為0.01至1mg/kg體重，較佳為0.05至0.5mg/kg體重。較佳為每週一次或二次施用本發明的融合蛋白質。取決於所治療的疾病，可能有必要更頻繁地施用該融合蛋白質，例如每週三次或更多次。
第1圖是流式細胞術(FACS)檢測重組表達的GLP-1融合蛋白質(GLP-1(A8G)-LK-L13H13)與穩定表達人源GLP-1R(hGLP-1R)的中國倉鼠卵巢細胞株(標有*的實線峰)以及中國倉鼠卵巢細胞株本身(虛線峰)的特異性結合的對比。
第2圖是通過報導基因方法得到的GLP-1野生型(圓形)和GLP-1(A8G)-LK-L13H13(三角形)對穩定表達hGLP-1R的中國倉鼠卵巢細胞株的活化曲線。
第3圖是小鼠(ICR)糖耐量實驗，檢測GLP-1(A8G)-LK-L13H13在5微克/隻(方形)和15微克/隻(三角形)單次i.p.注射16h後對禁食狀態下的小鼠的糖耐量的影響。
第4圖是小鼠(C57BL)糖耐量實驗，檢測GLP-1(A8G)-LK-L13H13在15微克/隻(三角形)單次i.p注射40h後對禁食狀態下的小鼠的糖耐量的影響。
第5圖是第二型糖尿病小鼠(db/db Mice)血糖濃度時間 糖曲線，檢測GLP-1(A8G)-LK-L13H13在30微克/千克的濃度下(倒三角形)對第二型糖尿病小鼠進行單次i.p.注射後的小鼠血糖濃度變化的時間曲線。
第6圖是第二型糖尿病小鼠(db/db Mice)日進食量時間曲線，記錄GLP-1(A8G)-LK-L13H13在30微克/千克的濃度下(倒三角形)單次對第二型糖尿病小鼠進行i.p.注射前3天到注射後5天這一時間段內小鼠日進食量的變化的時間曲線。第6圖和第5圖為平行進行的實驗結果。
下面通過具體實施方式，並結合附圖，對本發明的技術手段作進一步的具體說明。
本發明實施例中，若非特指，所採用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。
步驟1：免疫用抗原細胞穩定株的建構
接種CHO-DHFR細胞至6孔盤中，培養24h後轉染含hGLP-1R基因(核苷酸序列見SEQ ID NO：113，胺基酸序列見SEQ ID NO：114)的pYS質體於6孔盤中的細胞，轉染前更換培養液，按照Invitrogen公司推薦Lipofectamine 2000的轉染條件進行轉染。48h後，再換為含有10nM MTX的完全培養基，每隔3天更換培養液，待兩周左右，出現穩定生長的轉殖株，消化分散細胞集落，待長至50%滿度時，逐漸提高MTX的濃度進行加壓篩選，直至MTX的濃度為10μM。構建的穩定細胞株分別進行FACS檢測，利用抗hGLP-1R的抗體(Abcam)鑑定篩選後的細 胞群體，10μM MTX篩選後的CHO-DHFR-hGLP-1R細胞膜上hGLP-1R有大量表達，最後經過再次選殖、鑑定獲得6株hGLP-1R高表達細胞穩定株。
步驟2：抗體的製備
將在弗氏佐劑中乳化的CHO-DHFR-hGLP-1R全細胞，以2x106細胞/隻的劑量皮下注射BALB/c小鼠(6-8周齡)。2周後，使用不完全弗氏佐劑乳化免疫原加強免疫小鼠，此後每週加強一次。通過剪尾的方式採血，離心分離血清，進行FACS檢測血清效價。直至達到適合抗體效價時，斷頸處死小鼠，無菌狀態下獲取脾臟細胞。收集生長狀態處於對數生長期的SP2/0細胞，2000rpm、3min離心，沉澱用無血清培養液重懸，再次離心-重懸，計數。混合脾臟細胞和SP2/0細胞，保證SP2/0：脾臟細胞1：1，共「洗滌-離心」3次。彈散最後一次離心後的沉澱，逐滴加入1mL預溫至37℃的PEG-1350(30s內滴完)，上下吹吸1min，緩慢加入30mL預熱至37℃的無血清培養基(Invitrogen)以終止PEG的融合作用，1500rpm，5min離心，彈散細胞沉澱，加入添加有HAT(次黃嘌呤、氨甲喋呤和胸苷；Invitrogen)、20% FBS(Bioind)的RPMI 1640(Invitrogen)作為融合培養基，按每孔20000個脾細胞及5000個飼養層細胞鋪於96孔盤中，每孔100μl。融合後的融合瘤細胞和飼養層細胞一起在96孔盤中進行培養，並進行HAT篩選，以除去非融合的細胞。10天後收取培養盤中的融合瘤細胞上清液進行ELISA檢測。
步驟3：全細胞ELISA篩選
將CHO-DHFR-hGLP-1R過度表達hGLP-1R的細胞和不 表達hGLP-1R的CHO-DHFR-空白細胞分別接種至96孔盤，長至90%滿度。除去細胞培養上清，PBS洗兩遍，加入100μl之100%甲醇以4℃固定10min。再加入100μl新鮮配製的0.6% H2O2-PBS，室溫處理20min，PBS洗滌2遍。經過PBS-1%BSA封閉後，加入融合瘤細胞上清4℃孵育90min。多次洗滌後，每孔加入5000倍稀釋的GxM-HRP-Fc二抗(Sigma-Aldrich)100μl，37℃孵育0.5h。洗滌5次後，每孔加入100μl TMB呈色基質，37℃反應15min後，以2M H2SO4終止反應，讀取OD450值。陽性對照為免疫小鼠的血清；陰性對照為細胞培養基上清液。選取分泌抗hGLP-1R抗體的融合瘤細胞株，進行單株化以獲得能穩定分泌針對hGLP-1R的細胞株。最後選取融合瘤細胞分泌的抗體上清進行FACS驗證。
步驟4：陽性融合瘤細胞上清液流式細胞儀分析鑑定(FACS)
用含10mM EDTA的PBS消化、收集105個CHO-DHFR-hGLP-1R細胞，分別加入1.5ml EP管，離心後棄上清，陰性對照樣本用流式細胞儀樣本緩衝液(PBS，2% FBS)重懸。陽性處理組細胞每管加200μl抗體上清，室溫孵育；1500rpm離心，棄上清，用流式細胞儀樣本緩衝液洗一次，再離心，重懸，每孔加入1：50稀釋的FITC標記的羊抗鼠螢光抗體(BD Pharmingen)200μl，室溫避光孵育30min；離心，棄上清，再用流式細胞儀樣本緩衝液洗一次，離心，最後用流式細胞儀樣本緩衝液重懸，上機檢測。融合瘤細胞上清液和表達有hGLP-1R的CHO-DHFR細胞有特異性結合，灰色峰和虛線峰為陰性對照，融合瘤細胞上清液對應的實線峰(帶有*標記)有明顯右移(圖1)。
步驟5：抗體基因的選殖及再選殖
收集分泌抗體的融合瘤細胞，按照QIAGEN的mRNA抽提試劑盒操作規程，提取融合瘤細胞的mRNA。然後將提取後的mRNA反轉錄成cDNA，逆轉錄引子為小鼠輕、重鏈恒定區的特異性引子，重鏈逆轉錄引子為(5’-TTTGGRGGGAAGATGAAGAC-3’)(SEQ ID NO：115)，輕鏈逆轉錄引子為(5’-TTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3’)(SEQ ID NO：116)和(5’-TTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’)(SEQ ID NO：117)。RT-PCR的反應條件為：25℃ 5min；50℃ 60min；70℃ 15min。將反轉錄的cDNA用0.1mM的TE稀釋至500μl，加入到超濾離心管(Amicon Ultra-0.5)中，2000g離心10min；棄濾液，再加500μl的0.1mM的TE，2000g離心10min；棄濾液，將製備管倒置到新的離心管中，2000g離心10min，得到純化後的cDNA；取10μl的純化後的cDNA作為模板，加入4μl的5x的tailing buffer，4μl的dATP(1mM)和10U的末端轉移酶(Promega)後混勻，37℃孵育5min後65℃ 5min；然後以加上PolyA的cDNA為模板，PCR擴增抗體的輕、重鏈可變區基因。上游引子均為Oligo dT，重鏈下游引子為(5’-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3’)(SEQ ID NO：118)和(5’-TGGACAGGGCTCCATAGTTCC-3’)(SEQ ID NO：119)，輕鏈下游引子為(5’-ACTCGTCCTTGGTCAACGTG-3’)(SEQ ID NO：120)。PCR反應條件：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，40cycles；72℃ 7min；PCR產物連接到PMD 18-T載體後進行定序。定序得到的抗體輕鏈和重鏈可變區序列見附錄序列表。
基於已定序得到的抗體的DNA序列設計PCR引子，從 而將完整輕鏈、重鏈信號胜肽和可變域以及小鼠IgG1恒定區與表現載體pTM5相連。
步驟6：在懸浮HEK293宿主細胞中瞬時表達抗GLP-1R的抗體
接種懸浮HEK293或者CHO表達細胞至細胞培養瓶中，經過24h 37℃旋轉培養後被用於轉染。轉染過程中使用Polyethylenimine(PEI)作為轉染介質，將其與DNA混合後加入到細胞培養中。PEI和DNA的混合較佳配比為1：1至5：1。細胞在接受PEI與DNA混合物後繼續37℃旋轉培養96h以上以表現抗原結合蛋白，期間向細胞培養液中加入0.5%的胰酪蛋白(Casein Tryptone)作為表達需要的胺基酸源，最後收集細胞上清液，用於抗原結合蛋白質的純化分離。
步驟7：抗體人源化及優化
首先，將篩選所得的鼠源抗體輕、重鏈可變區序列，並使用NCBI的線上抗體可變區序列比對工具Ig Blast，搜索與輸入的抗體可變區序列同源的人源抗體生殖細胞基因序列(Ig Germline Gene sequence)，並將除CDR序列外，同源性最高的人源基因序列做為模板序列進行CDR轉殖，得到人源化抗體可變區序列，並外包合成人源化抗體輕、重鏈的基因。根據序列設計PCR引子，在合成序列的5’端和3’端引入合適的限制性內切酶位點，並通過PCR擴增後將其與人IgG2或者IgG4恒定區序列連接後得到完整的重組人源化抗體序列。重組的抗體根據步驟6進行表達，並按照步驟4中的FACS技術驗證其針對GLP-1R的親和力。在保留了針對GLP-1R親和力的人源化抗體群中，選出親和力表現 最優秀的抗體，並通過定點突變，對其可變區序列進行進一步的改造，更進一步提高其針對GLP-1R的親和力。
步驟8：GLP-1人源化融合蛋白質的基因選殖與再選殖
優化後的人源化抗體在輕鏈的N端或者C端與GLP-1及其衍生物序列進行融合組成GLP-1融合蛋白質，兩者的序列由聯結序列(LK)做為橋樑進行連接。信號胜肽-GLP-1-聯結序列的核苷酸序列由金斯瑞生物科技有限公司合成，以合成基因為模板，PCR擴增「信號胜肽-GLP1-聯結序列」部分的序列，PCR上游引子為(5’-CCACCATGGACTTTGGGCTGAGC-3’)(SEQ ID NO：121)，PCR下游引子為(5’-AGAGCCGGTGGCAGAGCCAG-3’)(SEQ ID NO：122)，PCR反應條件為：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，35cycles；72℃ 7min。另以人源化抗體的核苷酸序列為模板，擴增融合蛋白質的抗體部分的序列。
PCR上游引子為(5’-CTGGCTCTGCCACCGGCTCTGCCATCCAGATGACCCAGTCTCC-3’)(SEQ ID NO：123)，PCR下游引子為(5’-ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3’)(SEQ ID NO：124)，PCR反應條件為：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，35cycles；72℃ 7min。然後通過overlapping PCR將融合蛋白質核酸序列的「信號胜肽-GLP-1-聯結序列」部分與抗體部分連接，引子兩端添加Nhe1和Not1的酶切位點，從而將完整的融合蛋白質序列與表達載體pTM5相連。overlapping PCR上游引子為(5’-CCGGCTAGCCACCATGGACTTTGGGCTGAGC-3’)(SEQ ID NO：125)，下游引子為(5’-AGTGCGGCCGCTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3’) (SEQ ID NO：126)。PCR反應條件：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，35cycles；72℃ 7min；PCR產物連接到PTM5載體後進行定序。
步驟9：在懸浮HEK293宿主細胞中瞬時表達GLP-1融合蛋白質
接種HEK293懸浮細胞至細胞培養瓶中，在轉染前換培養基。將包含融合蛋白質輕/重鏈基因的載體以DNA總量0.5-1.5μg/ml的濃度與1.5-7.5μg/ml的Polyethylenimine(PEI)混合靜置15-25分鐘後，加入細胞培養中。24小時後，再向細胞培養加入0.5-1%的Trypton N1。培養5-10天後收取的上清液中含有分泌表現的GLP-1融合蛋白質。
步驟10：在懸浮CHO宿主細胞中穩定表達GLP-1融合蛋白質
接種懸浮CHO細胞至6孔盤中，通過步驟1中的轉染條件轉染融合蛋白質的表達載體。48小時後，加入300mg/ml的hygromycin(重鏈)和6mg/ml的puromycin(輕鏈)進行聯合篩選。在細胞出現大量凋亡後(死亡率>90%)，逐步降低抗生素濃度恢復剩餘細胞的生長，後轉為細胞培養瓶擴大培養，並隨後確認上清中抗體的表達。在隨後的培養基中保持減半的抗生素濃度以維持細胞對GLP-1融合蛋白質的穩定表達。
步驟11：GLP-1融合蛋白質從細胞培養上清液中的純化和製備
將細胞培養離心去除其中細胞，其上清經過偶聯蛋白G配基的親和層析管柱後，用pH2.5-3.5的洗脫液將表達的GLP-1 融合蛋白質從層析柱上洗脫。洗脫管中預置中和緩衝液及時中和洗脫液的低pH值。洗脫後收集的蛋白質溶液對PBS透析。
步驟12：報導基因實驗檢測GLP-1融合蛋白質在體外活化GLP-1受體的功能(見第2圖)
以每孔20000個接種共同表現hGLP1R-CRE-Luciferase的CHO-DHFR-細胞至96孔細胞培養盤，37℃培養過夜。第二天除去培養基上清液，用無血清培養基清洗細胞表面兩次，吸去殘液，再加入100μl用無血清培養基稀釋純化抗體或GLP-1，37℃孵育4小時。刺激結束後，加入100μl Promega的Bright Glo化學發光基質，最後將細胞裂解物轉移至白色96孔盤，在Molecular Devices的SpectraMax L冷光儀上讀取相對發光強度。
步驟13：小鼠(ICR)禁食狀態下葡萄糖耐量實驗
測定小鼠靜脈中葡萄糖耐量，測定及評價本發明之一實施例中的GLP-1融合蛋白質(抗體GLP-1(A8G)-LK-L13H13)的效果。四組中每組包含至少三至五隻小鼠。第I組接受同體積PBS對照腹腔注射。第II組接受15μg/隻的單次腹腔注射。第III組接受5μg/隻的單次腹腔注射。在注射後，小鼠進行6-16h的禁食處理，禁食完成後去小鼠血液樣本測定其基礎血糖濃度值。然後接受1.5g/kg濃度的葡萄糖灌食。在葡萄糖灌食後15、30、60和90分鐘採集其血液樣本以測定血糖濃度，見第3圖。
步驟14：糖耐量實驗檢測GLP-1融合蛋白質在小鼠(C57BL)體內長效性(40h)
測定小鼠靜脈中葡萄糖耐量，測定及評價本發明之一實施例中的GLP-1融合蛋白質(抗體GLP-1(A8G)-LK-L13H13)在 小鼠體內的長效性。兩組中包含至少三至五隻小鼠。第I組接受同體積PBS對照腹腔注射。第II組接受15μg/隻濃度的單次腹腔注射。在注射後24h，小鼠進行16h的禁食處理，禁食完成後取小鼠血液樣本測定其基礎血糖濃度值。然後接受1.5g/kg濃度的葡萄糖灌食。在葡萄糖灌食後15、30、60和90分鐘採集其血液樣本以測定血糖濃度，見第4圖。
步驟15：GLP-1融合蛋白質降低第二型糖尿病小鼠(db/db Mice)血糖濃度的長效性研究(72h)
在不同時間點測定二型糖尿病小鼠血糖濃度，以評價本專利的GLP-1融合蛋白質(抗體GLP-1(A8G)-LK-L13H13)在第二型糖尿病小鼠體內降低其血糖濃度的長效性。兩組中每組包含至少六隻小鼠。在注射開始前取小鼠血液樣本測定其基礎血糖濃度值。之後，第I組接受同體積PBS對照腹腔注射，第II組接受30μg/千克濃度的單次腹腔注射。在注射後1、4、6、24、48、72小時分別採集其血液樣本以測定兩組小鼠血糖濃度，見第5圖。
步驟16：GLP-1融合蛋白質減少第二型糖尿病小鼠(db/db Mice)日進食量的長效性研究(120h)
在對第二型糖尿病小鼠日進食量改變的測定中，評價本發明之一實施例中的GLP-1融合蛋白質(抗體GLP-1(A8G)-LK-L13H13)在降低第二型糖尿病小鼠進食水平方面的長效性。該步驟和步驟15在同一批小鼠上同步進行。兩組中每組包含至少六隻小鼠。在步驟15的注射前3天起至注射後5天(120小時)，每日早晨同一時間點秤量每組小鼠日進食量，見第6圖。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
<110> 杭州鴻運華寧生物醫藥工程有限公司
<120> 能與GLP-1R特異性結合的抗體及其與GLP-1的融合蛋白質
<130> 2014
<150> CN 201310350640.0
<151> 2013-08-13
<160> 127
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (15)

  1. 一種能與GLP-1R特異性結合的抗體，其中所述抗體包含以下方案之一的胺基酸序列：(a)選自以下序列之一的輕鏈CDR3序列：與選自L1-L13的輕鏈CDR3序列：SEQ ID NO：46~SEQ ID NO：53其中之一相差總共不超過三個胺基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDR3序列；(b)選自以下序列之一的重鏈CDR3序列：與選自H1-H13的重鏈CDR3序列：SEQ ID NO：20~SEQ ID NO：27其中之一相差總共不超過四個胺基酸添加、替換和/或缺失的重鏈CDR3序列；以及(c)(a)的輕鏈CDR3序列和(b)的重鏈CDR3序列。
  2. 根據請求項1所述的能與GLP-1R特異性結合的抗體，其中所述抗體還包含以下方案的一種或幾種組合的胺基酸序列：(a)選自以下之一的輕鏈CDR1序列：與選自L1-L13的輕鏈CDR1序列：SEQ ID NO：28~SEQ ID NO：37其中之一相差不超過三個胺基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDR1；(b)選自以下之一的輕鏈CDR2序列：與選自L1-L13的輕鏈CDR2序列：SEQ ID NO：38 ~SEQ ID NO：45其中之一相差不超過兩個胺基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDR2；(c)選自以下之一的重鏈CDR1序列：與選自H1-H13的重鏈CDR1序列：SEQ ID NO：6~SEQ ID NO：12其中之一相差不超過兩個胺基酸添加、替換和/或缺失的重鏈CDR1；以及(d)選自以下之一的重鏈CDR2：與選自H1-H13的重鏈CDR2序列：SEQ ID NO：13~SEQ ID NO：19其中之一相差不超過三個胺基酸添加、替換和/或缺失的重鏈序列。
  3. 一種能與GLP-1R特異性結合的抗體，其中所述抗體包含以下方案之一：(a)包含以下方案的一種或幾種的輕鏈可變結構域：(i)選自SEQ ID NO：28~SEQ ID NO：37其中之一的輕鏈CDR1序列；(ii)選自SEQ ID NO：38~SEQ ID NO：45其中之一的輕鏈CDR2序列；以及(iii)選自SEQ ID NO：46~SEQ ID NO：53其中之一的輕鏈CDR3序列；(b)包含以下方案的一種或幾種的重鏈可變結構域：(i)選自SEQ ID NO：6~SEQ ID NO：12其中之一的重鏈CDR1序列； (ii)選自SEQ ID NO：13~SEQ ID NO：19其中之一的重鏈CDR2序列；以及(iii)選自SEQ ID NO：20~SEQ ID NO：27其中之一的重鏈CDR3序列；以及(c)(a)的輕鏈可變結構域序列和(b)的重鏈可變結構域序列。
  4. 一種能與GLP-1R特異性結合的抗體，其中所述抗體包含以下方案之一的胺基酸序列：(a)選自以下方案之一的輕鏈可變結構域序列：(i)具有與選自L1-L13的輕鏈可變結構域序列：SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103及SEQ ID NO：105其中之一至少80%相同的序列的胺基酸；以及(ii)與編碼L1-L13的輕鏈可變結構域序列的多聚核苷酸序列：SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102及SEQ ID NO：104其中之一至少80%相同的多聚核苷酸序列編碼的胺基酸序列； (b)選自以下的重鏈可變結構域序列：(i)與H1-H13的重鏈可變結構域序列：SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77及SEQ ID NO：79其中之一至少80%相同的胺基酸序列；以及(ii)與編碼H1-H13的重鏈可變結構域序列的多聚核苷酸序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76及SEQ ID NO：78其中之一至少80%相同的多聚核苷酸序列編碼的胺基酸序列；以及(c)(a)的輕鏈可變結構域序列和(b)的重鏈可變結構域序列。
  5. 根據請求項4所述的能與GLP-1R特異性結合的抗體，其中所述抗體還包含以下方案之一的胺基酸序列：(a)選自L1-L13的輕鏈可變結構域序列：SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103及SEQ ID NO：105其中之一的輕鏈可變結構域序列； (b)選自H1-H13重鏈可變結構域序列：SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77及SEQ ID NO：79其中之一的重鏈可變結構域序列；以及(c)(a)的輕鏈可變結構域序列和(b)的重鏈可變結構域序列。
  6. 根據請求項5所述的能與GLP-1R特異性結合的抗體，其中方案(c)中(a)的輕鏈可變結構域序列與(b)的重鏈可變結構域序列的組合選自以下之一：L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12以及L13H13。
  7. 根據請求項6所述的能與GLP-1R特異性結合的抗體，其中所述抗體還包含以下方案之一的胺基酸序列：(a)SEQ ID NO：106的輕鏈恒定區胺基酸序列；(b)SEQ ID NO：107的輕鏈恒定區胺基酸序列；(c)SEQ ID NO：108的重鏈恒定區胺基酸序列；(d)SEQ ID NO：109的重鏈恒定區胺基酸序列；(e)SEQ ID NO：106的輕鏈恒定區胺基酸序列和SEQ ID NO：108的重鏈區胺基酸恒定序列；(f)SEQ ID NO：107的輕鏈恒定區胺基酸序列和SEQ ID NO：108的重鏈恒定區胺基酸序列； (g)SEQ ID NO：106的輕鏈恒定區胺基酸序列和SEQ ID NO：109的重鏈恒定區胺基酸序列；以及(h)SEQ ID NO：107的輕鏈恒定區胺基酸序列和SEQ ID NO：109的重鏈恒定區胺基酸序列。
  8. 根據請求項1或3或4所述的能與GLP-1R特異性結合的抗體，其中所述抗體選自鼠源抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多株抗體、重組抗體、抗原結合抗體片段、單鏈抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、Fab片段、F(fa’)x片段、結構域抗體、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體以及IgG4抗體。
  9. 一種GLP-1融合蛋白質，其中所述GLP-1融合蛋白質由GLP-1和如請求項1或3或4所述的抗體融合形成，其中GLP-1包含選自以下之一的胺基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：127。
  10. 根據請求項9所述的GLP-1融合蛋白質，其中GLP-1通過N’-R1-L-R2-C’、N’-R2-L-R1-C’或者N’-R2-L-R1r-C’的連接方式與請求項1或3或4所述抗體的輕鏈和/或重鏈相融合；其中L為聯結序列，其包含全長的、部分的或者重複的選自LK1~LK3的胺基酸序列：SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111及SEQ ID NO：112其中之一的胺基酸序列； R1為GLP-1的胺基酸序列；R1r為GLP-1的反向胺基酸序列；R2為請求項1或3或4所述抗體輕鏈或者重鏈的胺基酸序列；C’代表GLP-1融合蛋白質多肽鏈的羥基殘基端；以及N’代表GLP-1融合蛋白質多肽鏈的胺基殘基端。
  11. 一種多核苷酸，其編碼如請求項9所述的GLP-1融合蛋白質。
  12. 一種載體，其中包含如請求項11所述的多核苷酸。
  13. 一種宿主細胞，其中包含如請求項12所述的載體。
  14. 一種藥用組合物，其中包含與藥用可接受載體混合之如請求項9所述的GLP-1融合蛋白質。
  15. 一種如請求項14所述的藥用組合物在製備用於預防或治療非胰島素依賴性糖尿病之藥物中的用途。
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Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105637097A (zh) 2013-08-05 2016-06-01 特韦斯特生物科学公司 从头合成的基因文库
CA2943334A1 (en) 2014-03-19 2015-09-24 Mackay Medical Foundation The Presbyterian Church In Taiwan Mackay Memorial Hospital Immunogenic glycopeptides, composition comprising the glycopeptides and use thereof
KR102568272B1 (ko) 2015-02-11 2023-08-21 지맥스 바이오팜 엘엘씨 Ｇｌｐ-1ｒ 항체 융합 단백질의 안정한 약제학적 용액 제형
WO2016172377A1 (en) 2015-04-21 2016-10-27 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
US10844373B2 (en) 2015-09-18 2020-11-24 Twist Bioscience Corporation Oligonucleic acid variant libraries and synthesis thereof
CN108698012A (zh) 2015-09-22 2018-10-23 特韦斯特生物科学公司 用于核酸合成的柔性基底
CN115920796A (zh) 2015-12-01 2023-04-07 特韦斯特生物科学公司 功能化表面及其制备
EP3436480A4 (en) * 2016-03-30 2019-11-27 Musc Foundation for Research Development METHOD FOR THE TREATMENT AND DIAGNOSIS OF CANCER BY TARGETING GLYCOPROTEIN A REPETITION PREDOMINANT (GARP) AND FOR EFFECTIVE IMMUNOTHERAPY ALONE OR IN COMBINATION
CN107663240B (zh) * 2016-07-29 2021-01-12 中国人民解放军第四军医大学 高度糖基化cea特异性结合的单链抗体及其在检测和治疗上的应用
EP3500672A4 (en) 2016-08-22 2020-05-20 Twist Bioscience Corporation NOVO SYNTHESIZED NUCLEIC ACID BANKS
KR102217487B1 (ko) 2016-09-21 2021-02-23 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 핵산 기반 데이터 저장
CN110191718A (zh) 2016-12-15 2019-08-30 泰伦基国际有限公司 一种预防和治疗组织器官纤维化的方法
KR102514213B1 (ko) 2016-12-16 2023-03-27 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 면역 시냅스의 변이체 라이브러리 및 그의 합성
SG11201907713WA (en) 2017-02-22 2019-09-27 Twist Bioscience Corp Nucleic acid based data storage
WO2018170169A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Twist Bioscience Corporation Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
SG11201912057RA (en) 2017-06-12 2020-01-30 Twist Bioscience Corp Methods for seamless nucleic acid assembly
WO2018231864A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
US11938172B2 (en) 2017-06-19 2024-03-26 Talengen International Limited Method for regulating and controlling GLP-1/GLP-1R and drug
WO2019051501A1 (en) 2017-09-11 2019-03-14 Twist Bioscience Corporation PROTEINS BINDING TO GPCR AND METHODS OF SYNTHESIS
MX2020002977A (es) * 2017-09-22 2020-11-06 Regeneron Pharma Agonistas de receptor de peptido similar al glucagon tipo 1 y usos de los mismos.
JP7066840B2 (ja) 2017-10-20 2022-05-13 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション ポリヌクレオチド合成のための加熱されたナノウェル
CN110305211A (zh) 2018-03-20 2019-10-08 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 Gipr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
CN110357959B (zh) 2018-04-10 2023-02-28 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 Gcgr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
KR20210013128A (ko) 2018-05-18 2021-02-03 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 핵산 하이브리드화를 위한 폴리뉴클레오타이드, 시약 및 방법
CN110655577A (zh) * 2018-06-13 2020-01-07 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 APJ抗体及其与Elabela的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
CA3131691A1 (en) 2019-02-26 2020-09-03 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for antibody optimization
CN113766930A (zh) 2019-02-26 2021-12-07 特韦斯特生物科学公司 Glp1受体的变异核酸文库
US11332738B2 (en) 2019-06-21 2022-05-17 Twist Bioscience Corporation Barcode-based nucleic acid sequence assembly
CN112239507A (zh) * 2019-07-17 2021-01-19 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 ETA抗体与TGF-β Trap的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
CN112521501A (zh) * 2019-09-18 2021-03-19 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 Gipr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
GB202011958D0 (en) * 2020-07-31 2020-09-16 Pole Jolene The facelet
WO2022271258A1 (en) * 2021-06-25 2022-12-29 La Jolla Institute For Immunology Chimeric anti-sars-cov2 nucleoprotein antibodies
WO2023064779A1 (en) * 2021-10-11 2023-04-20 Ohio State Innovation Foundation Glycoprotein a repetitions predominant (garp)-binding antibodies and uses thereof
US20230330254A1 (en) * 2022-03-11 2023-10-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-glp1r antibody-tethered drug conjugates comprising glp1 peptidomimetics and uses thereof
US20240199728A1 (en) 2022-09-21 2024-06-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating obesity, diabetes, and liver dysfunction

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9409496D0 (en) 1994-05-12 1994-06-29 London Health Ass Method for improving glycaemic control in diabetes
US6006753A (en) 1996-08-30 1999-12-28 Eli Lilly And Company Use of GLP-1 or analogs to abolish catabolic changes after surgery
US6277819B1 (en) 1996-08-30 2001-08-21 Eli Lilly And Company Use of GLP-1 or analogs in treatment of myocardial infarction
UA65549C2 (uk) 1996-11-05 2004-04-15 Елі Ліллі Енд Компані Спосіб регулювання ожиріння шляхом периферійного введення аналогів та похідних glp-1 (варіанти) та фармацевтична композиція
SE9802080D0 (sv) 1998-06-11 1998-06-11 Hellstroem Pharmaceutical composition for the treatment of functional dyspepsia and/or irritable bowel syndrome and new use of substances therein
US5899883A (en) 1998-07-08 1999-05-04 Jinq Shing Chern Safety syringe
JP2002523333A (ja) 1998-07-31 2002-07-30 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ Ｉｉ型糖尿病を予防するためのｇｌｐ−１及び類似体の利用
MY155270A (en) 1998-09-24 2015-09-30 Lilly Co Eli Use of glp-1 or analogs in treatment of stroke
ES2311560T3 (es) 2000-12-07 2009-02-16 Eli Lilly And Company Proteinas de fusion glp-1.
TW200530269A (en) * 2003-12-12 2005-09-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Mpl antibodies
EA011583B1 (ru) * 2004-03-31 2009-04-28 Сентокор, Инк. Миметические антитела glp-1 человека, композиции, способы и применения
NZ555464A (en) 2004-12-02 2010-03-26 Domantis Ltd Bispecific domain antibodies targeting serum albumin and glp-1 or pyy
DE602005015257D1 (zh) 2004-12-22 2009-08-13 Lilly Co Eli
US20060275288A1 (en) * 2005-01-20 2006-12-07 Grihalde Nelson D GLP-1 receptor agonist and allosteric modulator monoclonal antibodies and uses thereof
ES2336575T3 (es) * 2005-09-22 2010-04-14 Biocompatibles Uk Limited Polipeptidos de fusion glp-1 (peptido-1 similar al glucagon) con resistencia aumentada a la peptidasa.
RU2432361C2 (ru) * 2007-01-05 2011-10-27 КовЭкс Текнолоджиз Айэлэнд Лимитед Соединения агонисты рецептора глюкагоноподобного белка-1 (glp-1r)
CN101663317A (zh) * 2007-01-05 2010-03-03 CovX科技爱尔兰有限公司 胰高血糖素样蛋白-1受体glp-1r激动剂化合物
US20090098130A1 (en) 2007-01-05 2009-04-16 Bradshaw Curt W Glucagon-like protein-1 receptor (glp-1r) agonist compounds
US20090021453A1 (en) 2007-07-19 2009-01-22 Zachary Smith Fashion accessory including alternating light emitting and non-light emitting elements of consistent lengths
US7982016B2 (en) * 2007-09-10 2011-07-19 Amgen Inc. Antigen binding proteins capable of binding thymic stromal lymphopoietin
EP2214700A4 (en) * 2007-11-02 2012-08-22 Janssen Biotech Inc HALF-SYNTHETIC GLP-1 PEPTIDE FUSION CONSTRUCTS, METHOD AND USES
MX2010010776A (es) * 2008-03-31 2010-10-26 Glaxo Group Ltd Fusiones y conjugados de farmaco.
US20120058116A1 (en) * 2009-04-24 2012-03-08 Andrew Beaton Fgfr1c antibody combinations
EP2494062B1 (en) * 2009-10-28 2016-12-28 Janssen Biotech, Inc. Anti-glp-1r antibodies and their uses
KR101614983B1 (ko) 2009-11-17 2016-04-22 입센 파마 에스.에이.에스 Ｈｇｈ 및 ｒｈｉｇｆ―１의 조합물을 위한 제제
JP5899883B2 (ja) 2011-01-26 2016-04-06 セントラル硝子株式会社 高圧ガスの供給方法、衝撃波減衰機構を有する機器及び高圧ガスの供給装置
TW201249867A (en) * 2011-04-01 2012-12-16 Astellas Pharma Inc Novel anti-human il-23 receptor antibody
JOP20200043A1 (ar) * 2011-05-10 2017-06-16 Amgen Inc طرق معالجة أو منع الاضطرابات المختصة بالكوليسترول
JP6006753B2 (ja) 2014-07-08 2016-10-12 株式会社京三製作所 踏切保安システム、中央装置及び踏切制御装置

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