KR102568272B1 - Ｇｌｐ-1ｒ 항체 융합 단백질의 안정한 약제학적 용액 제형 - Google Patents

Ｇｌｐ-1ｒ 항체 융합 단백질의 안정한 약제학적 용액 제형 Download PDF

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Abstract

본 발명은 치료적 유효량의 GLP-1R 항체 융합 단백질, 아미노산, 계면활성제 및 완충제 시스템을 포함하는, GLP-1R 항체 융합 단백질의 안정한 약제학적 용액 제형을 개시한다. 아미노산의 최종 농도는 1 mM 내지 500 mM이며, 계면활성제의 최종 농도는 0.01% 내지 0.5%이고, 안정한 용액 제형의 pH 값은 5.0 내지 8.0이다. 본 발명의 안정한 용액 제형은 당뇨병, 비만 및 이와 관련된 질환의 치료에 사용될 수 있다.

Description

ＧＬＰ-1Ｒ 항체 융합 단백질의 안정한 약제학적 용액 제형
본 발명은 생체의학 기술 분야에 관한 것이며, 특히 GLP-1R 항체 융합 단백질의 안정한 약제학적 용액 제형에 관한 것이다.
GLP-1 유도체는 II형 당뇨병 및 비만 치료를 위한 임상 시험에 사용되고 있다(문헌[Gallwitz B, Eur . Endocrinol ., 2015; 11:21-5]). GLP-1은 다수의 생물학적 효과들, 예를 들어 인슐린 분비 자극, 글루카곤 분비 저해, 위 배출 저해, 위 및 장 운동 저해뿐만 아니라 체중 감량의 유도를 유도한다(문헌[Lund A et al., Eur. J. Intern. Med ., 2014; 25:407-14]). GLP-1의 하나의 주요 특징은, 인슐린 치료 및 내인성 인슐린 분비를 촉진하는 일부 다른 경구 치료법에서의 하나의 염려인 저혈당증을 유도할 위험 없이 인슐린의 분비를 자극하는 GLP-1의 능력이다. 내인성 GLP-1은 너무 급속하게 분해되고, 이의 극도로 짧은 반감기는 치료용 펩타이드로서의 GLP-1의 효능을 제한한다.
현재, GLP-1 및 이의 유도체와 IgG Fc 단편 또는 인간 혈청 알부민(HSA)의 융합을 포함하여, GLP-1 및 이의 유도체의 반감기를 연장하고 동시에 이들의 생물학적 활성을 유지시키기 위한 다양한 방식들이 존재한다(문헌[Verspohl EJ, Pharmacol. Rev., 2012; 64:A-AX]). 본 발명자들이 선택한 새로운 방법은 GLP-1을 전장 항-GLP-1R 항체(IgG)와 융합시키는 것이다. IgG는 이의 융합 파트너의 생체내 반감기를 연장할 수 있고, 인간에서 이 자체의 반감기는 21일이다. GLP-1의 생물학적 활성을 유지하는 것 외에도, GLP-1R 항체 융합 단백질은 IgG 모이어티에 의해 제공되는 유리한 안정성을 가진다. 동시에, IgG 모이어티는 GLP-1R 항체 융합 단백질 분자 표적화 특성을 제공하며, 따라서, GLP-1과 GLP-1R 사이의 상호작용의 가능성을 증가시킨다. 더욱이, 항체 분자는 다른 보편적으로 사용되는 대부분의 융합 파트너들보다 더 낮은 면역원성을 가진다. 장기 사용 또는 심지어 평생(life-long) 사용을 위한 약물에 있어서, 낮은 면역원성은 필수적이다.
융합 단백질은 종종 포유류 세포주, 예를 들어 CHO, SP2/0 또는 NSO에 의해 생성된다. 본 발명에서, CHO 세포가 GLP-1R 항체 융합 단백질의 생성에 사용된 경우, 상기 융합 단백질은 내인성 프로테아제에 의한 분해를 받거나 소정의 세포 배양 물리화학적 조건 하에 놓였음을 주지한다. 분해 공정은 낮은 pH 조건 하에 더 신속하고 더 분명하였으며, 그 외에도, GLP-1R 항체 융합 단백질은 pH가 7보다 높았을 때 응집에 더 취약하였다. 더욱이, 본 발명에서, 냉장 조건(2℃ 내지 8℃) 하에서와 단일 완충제 용액(예, 시트레이트 완충제 시스템) 내에서 GLP-1R 항체 융합 단백질의 용해성은 치료용 투약의 필요조건을 충족하기에 너무 낮은 것으로 발견되었다. 본 발명에서, 상기 언급된 문제점들은 소정의 부형제들의 특정한 조합 및 GLP-1R 항체 융합 단백질의 특정한 농도를 사용하여 pH 조절을 통해 해결된다.
본 발명의 목적은 GLP-1R 항체 융합 단백질의 안정한 약제학적 용액 제형을 제공하는 것이고, 본 제형은 생체내에서 긴 반감기를 가질 정도로 안정하고 효과적이며, 당뇨병, 비만 및 관련 질병의 치료에 사용될 수 있다.
상기 언급된 기술적 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 하기 기술적 해결방안을 제공한다.
GLP-1R 항체 융합 단백질의 안정한 약제학적 용액 제형은 치료적 유효량의 GLP-1R 항체 융합 단백질, 아미노산, 계면활성제 및 완충제 시스템을 포함하며, 여기서, 아미노산의 최종 농도는 1 mM 내지 500 mM이며, 계면활성제의 최종 농도는 0.01% 내지 0.5%이고, 안정한 용액 제형의 pH는 5.0 내지 8.0이다.
GLP-1R 항체 융합 단백질의 용액 제형이 낮은 pH에서 불안정하며 높은 pH에서 쉽게 응집되고 GLP-1R 항체 융합 단백질이 단일 완충제 용액에서 충분한 용해성을 갖지 않는 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 GLP-1R 항체 융합 단백질을 포함하고 완충제 시스템, 안정화제 및 삼투조절제로서 아미노산, 및 계면활성제를 추가로 포함하는 생리화학적으로 안정한 제형을 제공한다. 안정한 용액 제형은 25℃에서 적어도 6개월 동안 안정하다. 바람직하게는, 본 발명의 안정한 용액 제형은 약 0.1 mg/mL 내지 100 mg/mL 최종 농도의 GLP-1R 항체 융합 단백질, 5 mM 내지 30 mM 농도의 시트레이트 완충제, 0.01% 내지 0.2% 최종 농도의 TWEEN-80 및 80 mM 내지 200 mM 최종 농도의 L-아르기닌을 포함하고, 여기서 pH는 5 내지 8이다. 안정한 용액 제형은 특수한 환경 하에서의, 특히 고온에서의 GLP-1R 항체 융합 단백질의 용해성 및 이의 안정성을 증강시킨다. 본 발명은 또한, 당뇨병, 비만 및 관련 질병의 치료 방법을 포함하며, 본 치료 방법은 본 발명의 GLP-1R 항체 융합 단백질 제형을 투여하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 아미노산의 최종 농도는 80 mM 내지 200 mM이며, 계면활성제의 최종 농도는 0.01% 내지 0.2%이며, 완충제 시스템은 시트레이트 완충제이고, 안정한 용액 제형의 pH는 5.5 내지 7.0이다.
바람직하게는, 시트레이트 완충제의 농도는 5 mM 내지 30 mM이다.
바람직하게는, 아미노산은 L-아르기닌이며, L-아르기닌의 최종 농도는 100 mM 내지 180 mM이며, 계면활성제는 TWEEN-80이고, TWEEN-80의 최종 농도는 0.05% 내지 0.15%이다.
바람직하게는, 치료적 유효량의 GLP-1R 항체 융합 단백질의 최종 농도는 0.1 mg/mL 내지 100 mg/mL이다.
바람직하게는, 치료적 유효량의 GLP-1R 항체 융합 단백질의 최종 농도는 5 mg/mL 내지 40 mg/mL이다.
바람직하게는, GLP-1R 항체 융합 단백질의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6으로부터 선택되는 서열이고, 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9로부터 선택되는 서열이다.
바람직하게는, GLP-1R 항체 융합 단백질의 경쇄 불변 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO: 11이고, 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 12이다.
본 발명의 GLP-1R 항체 융합 단백질은 GLP-1 또는 이의 유사체를 포함하며, 이러한 GLP-1 또는 이의 유사체는 이의 C-말단에서 펩타이드 링커에 의해 GLP-1R 항체의 경쇄의 N-말단에 융합된다. 항체 융합 단백질은 GLP-1 및 이의 유사체와 비교하여, 유사하거나 개선된 생물학적 활성 및 연장된 반감기를 가진다. 바람직한 GLP-1R 항체 융합 단백질의 경쇄 가변 도메인의 서열은 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 모두 또는 일부를 포함하며, 경쇄 불변 도메인의 서열은 SEQ ID NO: 10 또는 11의 모두 또는 일부를 포함하며, 중쇄 가변 도메인의 서열은 SEQ ID NO: 7, 8 또는 9의 모두 또는 일부를 포함하고, 중쇄 불변 도메인의 서열은 SEQ ID NO: 12의 모두 또는 일부를 포함한다. 보다 바람직한 GLP-1R 항체 융합 단백질의 경쇄 가변 도메인의 서열은 실질적으로 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며, 경쇄 불변 도메인의 서열은 실질적으로 SEQ ID NO: 10 또는 11이며, 중쇄 가변 도메인의 서열은 실질적으로 SEQ ID NO: 7, 8 또는 9이고, 중쇄 불변 도메인의 서열은 실질적으로 SEQ ID NO: 12이다. 가장 바람직한 GLP-1R 항체 융합 단백질의 경쇄 가변 도메인의 서열은 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며, 경쇄 불변 도메인의 서열은 SEQ ID NO: 10 또는 11이며, 중쇄 가변 도메인의 서열은 SEQ ID NO: 7, 8 또는 9이고, 중쇄 불변 도메인의 서열은 SEQ ID NO: 12이다.
본 발명의 안정한 용액 제형은 당뇨병 또는 비만의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 안정한 용액 제형은 과민성 대장 증후군, 및 혈장 글루코스의 감소, 위 및/또는 장 운동의 저해, 위 및/또는 장 배출의 저해 또는 음식물 섭취의 저해로부터 이득을 얻는 다른 질병들의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 유익한 효과들은 당뇨병, 비만, 과민성 대장 증후군 및 관련 질병들의 치료에 대한 안정성, 생체내 긴 반감기, 양호한 효능 및 적합성이다.
하기 구체적인 실시형태를 통해, 본 발명의 기술적 해결방안이 더 예시된다.
본 발명에서, 구체적으로 지칭되지 않는 한, 이용되는 원료 및 장비 등은 모두 상업적으로 입수 가능하거나 당업계에서 보편적으로 사용된다. 구체적으로 지시되지 않는 한, 하기 실시형태의 방법들은 모두 당업계에서 종래의 방법들이다.
본 발명의 GLP-1R 항체 융합 단백질의 제조는 선행 특허 출원: CN104371019A, WO 2015/021871에 기재되어 있다.
생물학적 활성은, 반응을 유도하기 위해 생체내에서 GLP-1R에 결합하고 이를 활성화시키는 GLP-1R 항체 융합 단백질의 능력을 지칭한다. 이러한 반응으로는, 인슐린 분비 촉진, 글루카곤 분비 저해, 식욕 저해, 체중 감량 유도, 포만 유도, 췌장 β-세포의 세포자멸사 저해 및 췌장 β-세포의 증식 유도 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
GLP-1R 항체 융합 단백질의 안정한 약제학적 용액 제형은 완충제에 GLP-1R 항체 융합 단백질을 포함하며, 안정화제 및 삼투조절제로서 아미노산, 및 계면활성제를 추가로 포함한다. 25℃에서, 안정한 용액 제형은 적어도 6개월 동안 안정하고, 25℃에서, 보다 정확하게는 안정한 용액 제형은 6개월 내지 8개월, 6개월 내지 12개월, 6개월 내지 18개월, 6개월 내지 24개월, 8개월 내지 12개월, 8개월 내지 18개월, 8개월 내지 24개월, 12개월 내지 18개월, 12개월 내지 24개월, 18개월 내지 24개월 동안 안정하다.
본 발명에 사용되는 완충제 시스템으로는, 하기 유기 화합물 또는 무기 화합물들 중 하나 또는 몇몇 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다: 시트르산, 시트르산의 염, 아스코르브산, 아스코르브산의 염, 글루콘산, 글루콘산의 염, 탄산, 탄산의 염, 타르타르산, 타르타르산의 염, 숙신산, 숙신산의 염, 아세트산, 아세트산의 염, 프탈산, 프탈산의 염, 인산, 포스페이트, 염산, Tris, 트로메타민(tromethamine), 및 비제한적으로 히스티딘, 아르기닌, 글리신 등을 포함한 아미노산.
본 발명에서 정의된 바와 같은 삼투조절제는 첨가 시 제형의 삼투압을 증가시킬 수 있는 성분이다. 본 발명의 삼투조절제는 비제한적으로 아르기닌, 히스티딘, 메티오닌, 라이신, 오르니틴, 루신, 이소루신, 알라닌, 글리신, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한 유리(free) 아미노산이다. 염기성 아미노산은 바람직하게는 아르기닌, 히스티딘, 라이신 또는 이들의 조합이다. 아미노산은 아미노산의 염 형태로 첨가될 수 있으며, 여기서, 첨가되는 아미노산은 D-아미노산, 예컨대 D-아르기닌 또는 L-아미노산, 예컨대 L-아르기닌일 수 있다.
본 발명의 범위 내에서, 비제한적으로 아르기닌, 히스티딘, 메티오닌, 라이신, 오르니틴, 루신, 이소루신, 알라닌, 글리신, 글루타민, 글루탐산, 아스파라긴, 아스파르트산, 페닐알라닌, 티로신, 세린, 프롤린 및 트립토판을 포함한 첨가되는 아미노산은 삼투조절제로서의 작용에만 한정되는 것이 아니라, 이와 동시에 안정화제로서도 작용한다. 바람직하게는, 본 발명에서 안정화제 및 삼투조절제로서의 아미노산의 농도는 1 mM 내지 500 mM이다.
본 발명에 정의된 바와 같은 계면활성제는 양친매성 유기 화합물이며, 즉, 이러한 화합물은 상이한 용해성 특성들을 가진 기를 함유한다. 전형적으로, 이들 화합물은 친유성 탄화수소 기 및 친수성 이온성 기를 둘 다 함유한다. 본 발명의 계면활성제로는, 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들어 소르비탄 모노카프릴레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 트리올레에이트; 글리세린 지방산 에스테르, 예를 들어 글리세린 모노카프릴레이트, 글리세린 모노미리스테이트, 글리세린 모노스테아레이트; 폴리글리세린 지방산 에스테르, 예를 들어 데카글리세릴 모노스테아레이트, 데카글리세릴 다이스테아레이트, 데카글리세릴 모노리놀레에이트; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(여기서, 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트는 TWEEN-20이며, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트는 TWEEN-40임), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(여기서, 폴리옥시에틸렌(80) 소르비탄 모노올레에이트는 TWEEN-80임), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(여기서, 폴리옥시에틸렌(60) 소르비탄 모노스테아레이트는 TWEEN-60이고, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올레에이트는 TWEEN-85이고, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리스테아레이트는 TWEEN-65임); 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비톨 테트라스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 테트라올레에이트; 폴리옥시에틸렌 글리세린 지방산 에스테르, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 글리세릴 모노스테아레이트; 폴리에틸렌 글리콜 지방산 에스테르, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 다이스테아레이트; 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르; 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬 에테르, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 프로필 에테르, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 세틸 에테르; 폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 노닐페닐 에테르; 폴리옥시에틸렌 수소화된 피마자유, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 수소화된 피마자유; 폴리옥시에틸렌 밀랍 유도체, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비톨 밀랍; 폴리옥시에틸렌 라놀린 유도체, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 라놀린; 및 폴리옥시에틸렌 지방산 아미드, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 스테아르산 아미드; C10-C18 알킬 설페이트, 예를 들어 소듐 세틸 설페이트, 소듐 라우릴 설페이트, 소듐 올레일 설페이트; 첨가된 에틸렌 옥사이드 단위가 평균 2 몰 내지 4 몰인 폴리옥시에틸렌 C10-C16 알킬 에테르 설페이트, 예를 들어 소듐 폴리옥시에틸렌 라우릴 설페이트; 및 C1-C18 알킬 설포숙시네이트 에스테르 염, 예를 들어 소듐 라우릴 설포숙시네이트 에스테르; 및 천연 계면활성제, 예컨대 레시틴, 글리세로포스포리피드, 스핑고포스포리피드, 예를 들어 스핑고미엘린, 및 C12-C18 지방산의 수크로스 에스테르 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 사용되는 계면활성제로는 상기 기재된 계면활성제들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 보다 적합한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 예를 들어 TWEEN-20, TWEEN-40, TWEEN-60 및 TWEEN-80이다.
GLP-1R 융합 단백질의 안정한 약제학적 용액 제형은 GLP-1R 항체 융합 단백질을 약 0.1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 최종 농도로 포함한다. GLP-1R 항체 융합 단백질의 바람직한 농도(mg/mL)는 0.1 내지 1, 1 내지 5, 5 내지 10, 5 내지 20, 10 내지 20, 20 내지 30, 20 내지 40, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100 mg/mL의 범위이다. 보다 바람직하게는, GLP-1R 항체 융합 단백질의 농도(mg/mL)는 약 0.1, 약 0.25, 약 0.5, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6.5, 약 8, 약 10, 약 12.5, 약 15, 약 17.5, 약 20, 약 22.5, 약 25, 약 27.5, 약 30, 약 32.5, 약 35, 약 37.5, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100 mg/mL이다.
안정한 용액 제형의 바람직한 완충제 시스템은 5 mM 내지 30 mM 농도 범위의 시트레이트 염이다. 보다 바람직하게는, 시트레이트 농도(mM)는 약 5 내지 25, 5 내지 20, 5 내지 15, 5 내지 12.5, 5 내지 10, 7.5 내지 30, 7.5 내지 25, 7.5 내지 20, 7.5 내지 15, 7.5 내지 12.5, 7.5 내지 10, 8 내지 30, 8 내지 25, 8 내지 20, 8 내지 15, 8 내지 12.5, 8 내지 11, 8 내지 10, 9 내지 30, 9 내지 25, 9 내지 20, 9 내지 15, 9 내지 12.5, 10 내지 30, 10 내지 25, 10 내지 20, 10 내지 17.5, 10 내지 15, 10 내지 12.5, 12.5 내지 30, 12.5 내지 25, 12.5 내지 20, 12.5 내지 15, 15 내지 30, 15 내지 25, 15 내지 20, 17.5 내지 30, 17.5 내지 25, 17.5 내지 22.5, 17.5 내지 20, 20 내지 30, 20 내지 27.5, 20 내지 25, 20 내지 22.5, 22.5 내지 30, 22.5 내지 27.5, 22.5 내지 25, 25 내지 30, 25 내지 27.5, 27.5 내지 30의 범위이다. 더 바람직한 시트레이트 농도는 약 5 mM 내지 20 mM이다. 특히 바람직한 시트레이트 농도는 약 10 mM, 10.0 mM, 20 mM 또는 20.0 mM이다.
본 발명의 GLP-1R 융합 단백질의 안정한 약제학적 용액 제형의 pH는 약 5 내지 8의 범위이다. 이러한 pH 범위는 GLP-1R 항체 융합 단백질의 용해성을 유지시키고 인슐린 분비를 자극하는 활성을 촉진하기에 허용 가능한 안정성을 본 제형에 대해 제공하고, 비경구 투여에 적합하다. pH는, 요망되는 완충제 농도 및 pH 값을 달성하기 위해 HCl과 같은 산의 첨가, NaOH와 같은 염기의 첨가, 또는 시트레이트 완충제와 시트르산의 조합에 의해 요망되는 pH로 조정될 수 있다. 바람직한 pH 범위는 5 내지 7.75, 5 내지 7.5, 5 내지 7.25, 5 내지 7.0, 5 내지 6.75, 5 내지 6.5, 5 내지 6.25, 5 내지 6.0, 5 내지 5.75, 5 내지 5.5, 5 내지 5.25, 5.25 내지 8.0, 5.25 내지 7.75, 5.25 내지 7.5, 5.25 내지 7.25, 5.25 내지 7.0, 5.25 내지 6.75, 5.25 내지 6.5, 5.25 내지 6.25, 5.25 내지 6.0, 5.25 내지 5.75, 5.25 내지 5.5, 5.5 내지 8.0, 5.5 내지 7.75, 5.5 내지 7.5, 5.5 내지 7.25, 5.5 내지 7.0, 5.5 내지 6.75, 5.5 내지 6.5, 5.5 내지 6.25, 5.5 내지 6.0, 5.5 내지 5.75, 5.75 내지 8.0, 5.75 내지 7.75, 5.75 내지 7.5, 5.75 내지 7.25, 5.75 내지 7.0, 5.75 내지 6.75, 5.75 내지 6.5, 5.75 내지 6.25, 5.75 내지 6.0, 6.0 내지 8.0, 6.0 내지 7.75, 6.0 내지 7.5, 6.0 내지 7.25, 6.0 내지 7.0, 6.0 내지 6.75, 6.0 내지 6.5, 6.0 내지 6.25, 6.25 내지 8.0, 6.25 내지 7.75, 6.25 내지 7.5, 6.25 내지 7.25, 6.25 내지 7.0, 6.25 내지 6.75, 6.25 내지 6.5, 6.5 내지 8.0, 6.5 내지 7.75, 6.5 내지 7.5, 6.5 내지 7.25, 6.5 내지 7.0, 6.5 내지 6.75, 6.75 내지 8.0, 6.75 내지 7.75, 6.75 내지 7.5, 6.75 내지 7.25, 6.75 내지 7.0, 7.0 내지 8.0, 7.0 내지 7.75, 7.0 내지 7.5, 7.0 내지 7.25, 7.25 내지 8.0, 7.25 내지 7.5, 7.5 내지 8.0, 7.5 내지 7.75, 7.75 내지 8.0이다. 더 바람직한 pH 범위는 6 내지 7이고, 특히 바람직한 pH 범위는 약 6.5 또는 6.50이다.
본 발명은 바람직하게는, GLP-1R 융합 단백질의 안정한 약제학적 용액 제형용 삼투조절제 및 안정화제로서 L-아르기닌을 1 mM 내지 500 mM 범위의 농도로 사용하여, GLP-1R 항체 융합 단백질을 안정화시키고 용해성을 증가시키며 제형의 삼투압을 조정하여, 상기 제형을 비경구 투여에 적합하게 한다. 바람직한 L-아르기닌 농도는 80 mM 내지 200 mM의 범위이다. 더 바람직한 농도는 80 내지 190 mM, 80 내지 180 mM, 80 내지 170 mM, 80 내지 160 mM, 80 내지 150 mM, 80 내지 140 mM, 80 내지 130 mM, 80 내지 120 mM, 80 내지 110 mM, 80 내지 100 mM, 80 내지 90 mM, 90 내지 200 mM, 90 내지 190 mM, 90 내지 180 mM, 90 내지 170 mM, 90 내지 160 mM, 90 내지 150 mM, 90 내지 140 mM, 90 내지 130 mM, 90 내지 120 mM, 90 내지 110 mM, 90 내지 100 mM, 100 내지 200 mM, 100 내지 190 mM, 100 내지 180 mM, 100 내지 170 mM, 100 내지 160 mM, 100 내지 150 mM, 100 내지 140 mM, 100 내지 130 mM, 100 내지 120 mM, 100 내지 110 mM, 110 내지 200 mM, 110 내지 190 mM, 110 내지 180 mM, 110 내지 170 mM, 110 내지 160 mM, 110 내지 150 mM, 110 내지 140 mM, 110 내지 130 mM, 110 내지 120 mM, 120 내지 200 mM, 120 내지 190 mM, 120 내지 180 mM, 120 내지 170 mM, 120 내지 160 mM, 120 내지 150 mM, 120 내지 140 mM, 120 내지 130 mM, 130 내지 200 mM, 130 내지 190 mM, 130 내지 180 mM, 130 내지 170 mM, 130 내지 160 mM, 130 내지 150 mM, 130 내지 140 mM, 140 내지 200 mM, 140 내지 190 mM, 140 내지 180 mM, 140 내지 170 mM, 140 내지 160 mM, 140 내지 150 mM, 150 내지 200 mM, 150 내지 190 mM, 150 내지 180 mM, 150 내지 170 mM, 150 내지 160 mM, 160 내지 200 mM, 160 내지 190 mM, 160 내지 180 mM, 160 내지 170 mM, 170 내지 200 mM, 170 내지 190 mM, 170 내지 180 mM, 180 내지 190 mM, 190 내지 200 mM의 범위이다. 더 바람직한 L-아르기닌 농도는 100 mM 내지 180 mM이다. 특히 바람직한 농도는 약 138 mM 또는 약 138.0 mM이다.
본 발명은 바람직하게는, GLP-1R 융합 단백질의 안정한 약제학적 용액 제형용 계면활성제로서 TWEEN-80을 0.01% 내지 0.5% 범위의 농도로 사용한다. TWEEN-80의 바람직한 농도는 약 0.01% 내지 약 0.2%이고, 바람직한 농도는 용해성 응집물 및 불용성 입자의 형성이 최소화되는 GLP-1R 항체 융합 단백질과 아르기닌의 조합에 의해 결정된다. TWEEN-80의 더 바람직한 농도는 약 0.01% 내지 0.2%, 0.01% 내지 0.15%, 0.01% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.05%, 0.01% 내지 0.025%, 0.025% 내지 0.2%, 0.025% 내지 0.15%, 0.025% 내지 0.1%, 0.025% 내지 0.05%, 0.05% 내지 0.2%, 0.05% 내지 0.15%, 0.05% 내지 0.1%, 0.05% 내지 0.075%, 0.075% 내지 0.2%, 0.075% 내지 0.15%, 0.075% 내지 0.1%, 0.1% 내지 0.2%, 0.1% 내지 0.15%, 0.15% 내지 0.2%의 범위이다. 더 바람직한 TWEEN-80 농도는 약 0.05% 내지 약 0.15%의 범위이다. 특히 바람직한 TWEEN-80 농도는 약 0.1%이다.
특히 바람직한 GLP-1R 융합 단백질의 안정한 약제학적 용액 제형은 약 5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL 농도 범위의 GLP-1R 항체 융합 단백질, 약 20 mM 농도의 시트레이트 완충제, 약 0.1% 농도의 TWEEN-80 및 약 138 mM 농도의 L-아르기닌을 포함하며, 이의 pH는 약 6.5이다. 또 다른 특히 바람직한 GLP-1R 융합 단백질의 안정한 약제학적 용액 제형은 약 20 mg/mL 내지 약 40 mg/mL 농도 범위의 GLP-1R 항체 융합 단백질, 약 20 mM 농도의 시트레이트 완충제, 약 0.1% 농도의 TWEEN-80 및 약 138 mM 농도의 L-아르기닌을 포함하며, 이의 pH는 약 6.5이다. 또 다른 특히 바람직한 안정한 용액 제형은 약 5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL 농도 범위의 GLP-1R 항체 융합 단백질, 약 5 mM 내지 20 mM 농도의 시트레이트 완충제, 약 0.05% 내지 약 0.15% 농도의 TWEEN-80 및 약 100 mM 내지 180 mM 농도의 L-아르기닌을 포함하며, 이의 pH는 약 6.0 내지 7이다. 또 다른 특히 바람직한 안정한 용액 제형은 약 20 mg/mL 내지 약 40 mg/mL 농도 범위의 GLP-1R 항체 융합 단백질, 약 5 mM 내지 20 mM 농도의 시트레이트 완충제, 약 0.05% 내지 약 0.15% 농도의 TWEEN-80 및 약 100 mM 내지 180 mM 농도의 L-아르기닌을 포함하며, 이의 pH는 약 6.0 내지 7이다.
안정한 용액 제형의 투여는 당업계의 의사에게 알려진 임의의 효과적인 경로에 의해 수행될 수 있다. 비경구 투여는 이들 방법 중 하나이다. 비경구 투여는 일반적으로 의학적 문헌에서, 멸균 주사기 또는 일부 다른 의학적 장치, 예컨대 주입 펌프를 통해 피험자에게 투약 형태를 주사하는 것으로 이해된다. 비경구 경로로는, 정맥내 경로, 근육내 경로, 피하 경로 및 복강내 경로 등이 있을 수 있다. 피하 투여가 바람직한 경로이다.
본 발명의 안정한 용액 제형은 비-인슐린 의존성 당뇨병을 앓고 있는 피험자, 또는 비-인슐린 의존성 당뇨병, 인슐린-의존성 당뇨병 또는 비만으로 진행되는 피험자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 안정한 용액 제형 내 GLP-1R 항체 융합 단백질의 유효량은, 바람직하지 못한 부작용을 유발하지 않으면서 GLP-1R 자극이 필요한 피험자에게 투여 시 요망되는 치료적 효과 및/또는 예방적 효과를 유도하는 양이다.
본 융합 단백질은 2주에 1회 또는 1주에 1회 투여되는 것이 바람직하다. 치료되는 질병에 따라, 본 융합 단백질을 보다 빈번하게, 예컨대 1주에 2회 또는 3회 투여하는 것이 필요할 수 있다.
이제 본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 기재될 것이다.
본 발명의 구체적인 실시형태
리포터 유전자 검정법을 사용하여, GLP-1 융합 단백질에 의한 GLP-1R의 시험관내 활성화를 확인하였다.
hGLP1R-CRE-루시퍼라제를 공동-발현하는 CHO-DHFR-세포를 1개 웰 당 20000개 세포로 96-웰 세포 배양 플레이트에 접종하고, 상기 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하였다. 이튿날, 배양 상층액을 제거하였다. 세포를 혈청 무함유 배지로 2회 세척하고, 잔여 액체를 흡인에 의해 제거하였다. 혈청 무함유 배지를 사용하여 예비-희석한 GLP-1R 항체 융합 단백질 시료 또는 대조군 100 ㎕를 첨가한 후, 세포를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, BRIGHT-GLO™ 화학발광 기질(Promega) 100 ㎕를 첨가하였다. 마지막으로, 세포 용해물을 백색 96-웰 플레이트로 옮기고, 상대 발광 세기를 SPECTRAMAX® L(Molecular Devices) 마이크로플레이트 판독기에서 기록하였다. 용량-반응 곡선(반응 세기 대 로그 농도)을 GraphPad를 사용하여 분석하여, EC50을 확인하였다.
SEC-HPLC를 사용하여, GLP-1R 항체 융합 단백질의 순도를 분석하였다.
크기-배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)를 사용하여, GLP-1R 항체 융합 단백질의 응집물(용해성 응집물)의 형성 및 이의 단량체 형태의 손실을 확인하였다. 25℃에서 AGILENT 1100 HPLC에서, UV 흡광도의 기준선(baseline)이 일정하고 안정해질 때까지 200 mM 포스페이트 완충제(pH 6.8)를 이동상으로서 사용하여 TSK-G3000SWxl 고성능 SEC 컬럼을 플러쉬(flush)하였다. (이동상과 예비-희석된) 1 mg/mL 내지 3 mg/mL 농도의 GLP-1R 항체 융합 단백질의 안정한 약제학적 용액 제형을 50 ㎕의 양으로 주사하였다. 0.5 mL/min의 유속에서 시료를 이동상을 사용하여 용리시키고, UV 280 nm에서의 흡광도를 기록하였다. 각각의 진행 후, 단량체(주요 피크), 이량체 및 다량체의 흡광도 피크의 AUC를 계산하고, 주요 피크에 대한 AUC 대 총 AUC의 백분율을 계산하고, 시료의 순도로서 기록하였다.
실시예 1: GLP-1R 항체 융합 단백질의 안정성에 미치는 pH의 효과:
pH는 GLP-1R 항체 융합 단백질의 용해성 및 안정성에 영향을 미칠 수 있고, 제형에서 가장 중요한 파라미터들 중 하나이다. 본 발명자들은 실시예 1에서, 형성된 용해성 응집물(이량체 및 다량체)의 양을 측정함으로써 GLP-1R 항체 융합 단백질의 안정성에 미치는 pH의 효과를 확인하고, 45℃에서 1주 또는 3주 후 각각의 시료에서 형성된 용해성 응집물의 비율(응집물%)을 측정함으로써 GLP-1R 항체 융합 단백질의 안정성에 미치는 각각의 구체적인 pH의 효과를 확인하였다.
GLP-1R 융합 단백질의 안정한 약제학적 용액 제형을 표 1에 따라 제조하였다:
상이한 pH 조건에서의 GLP-1R 항체 융합 단백질 제형
GLP-1R 항체 융합 단백질
4.5 mg/mL		 pH 완충제
1 6.5 0.1 M PBS
2 7 0.1 M PBS
3 7.5 0.1 M PBS
4 8 0.1 M PBS
GLP-1R 융합 단백질의 안정한 약제학적 용액 제형을 0.22 ㎛ 폴리비닐리덴 다이플루오라이드(PVDF) 막을 통한 여과에 의해 멸균하였다. 상기 용액을 45℃에서 2 mL 보로실리케이트 유리 바이얼에 분석 시까지 또는 최대 3주까지 저장하였다. 각각의 시료 내의 용해성 응집물의 비율을 SEC-HPLC에 의해 확인하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 형성된 용해성 응집물의 비율은 특히 바람직한 pH 6.5에서 가장 낮았으며, 제형의 안정성은 최상이었고; 이러한 안정성은 pH가 감소함에 따라 증가하는 경향이 있다.
상이한 pH 조건에서 GLP-1R 항체 융합 단백질 제형에서 형성된 용해성 응집물의 비율
GLP-1R 항체 융합 단백질
4.5 mg/mL		 pH 단위 시점(주(week))
1 3
1 6.5 % 0.52 4.51
2 7.0 % 0.65 4.80
3 7.5 % 1.12 8.16
4 8.0 % 1.39 14.79
실시예 2: 바람직한 제형의 강건성 (robustness)
본 발명자들은, 3개의 가장 중요한 부형제 또는 인자들(L-아르기닌, pH 및 TWEEN-80)에서의 오차(± 15%)가 실제 제조 공정에서 약물의 품질 및 안정성에 유의한 효과를 미치게 될지 조사하기 위해 10 mg/mL 농도의 GLP-1R 항체 융합 단백질 제형에서 강건성 연구를 수행하였다. GLP-1R 항체 융합 단백질의 일반적인 제형 규칙 및 특성을 기반으로, 단량체 순도(즉, 주요 피크의 백분율)에서의 변화를 기준으로서 선택하였다.
GLP-1R 항체 융합 단백질의 제형을 DOE 실험을 위해 표 3에 따라 제조하였다:
DOE 실험에 대한 GLP-1R 항체 융합 단백질 제형
제형 L-아르기닌(mM) TWEEN-80(%) pH
DOE-1 110 0.05 7
DOE-2 110 0.15 6
DOE-3 166 0.05 6
DOE-4 166 0.15 7
바람직한 제형(반복 1) 138 0.1 6.5
바람직한 제형(반복 2) 138 0.1 6.5
DOE-5 110 0.15 7
DOE-6 110 0.05 6
DOE-7 166 0.15 6
DOE-8 166 0.05 7
제형을 제조하고, 0.22 ㎛ 폴리비닐리덴 다이플루오라이드(PVDF) 막을 통한 여과에 의해 멸균하였다. 상기 제형을 40℃에서 2 mL 유리 바이얼에 분석 시까지 또는 최대 1개월까지 저장하였다. 각각의 제형의 순도를 SEC-HPLC에 의해 확인하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, pH 6 내지 pH 7, L-아르기닌 110 mM 내지 166 mM 및 TWEEN-80 농도 0.05% 내지 0.15%에서, 각각의 제형에 대한 순도는 유사한 것으로 보였으며, 유의한 차이가 없었고, 이는 바람직한 제형이 양호한 강건성을 가짐을 가리키며, 제조 시의 편차가 실제 제형의 안정성에 유의한 영향을 미쳐서는 안 된다.
DOE 실험에서 GLP-1R 항체 융합 단백질 제형의 순도
제형 순도(%) 순도(%) 순도(%)
0일 15일 1개월
DOE-1 99.76 96.18 95.94
DOE-2 99.77 95.59 95.34
DOE-3 99.75 96.42 96.20
DOE-4 99.75 94.43 94.10
바람직한 제형(반복 1) 99.75 95.35 94.58
바람직한 제형(반복 2) 99.75 95.84 94.88
DOE-5 99.74 96.38 95.91
DOE-6 99.74 95.60 95.23
DOE-7 99.75 96.44 96.33
DOE-8 99.75 94.43 93.77
실시예 3: 제형 안정성에 미치는 GLP-1R 항체 융합 단백질의 농도의 효과
본 발명자들은, GLP-1R 항체 융합 단백질의 고용량의 사용을 실제 상황에서 용이하게 하기 위해 바람직한 제형이 더 높은 농도의 GLP-1R 항체 융합 단백질에서 허용 가능한 안정성을 제공할 수 있는지 확인하기 위해, 2개의 상이한 농도의 GLP-1R 항체 융합 단백질에서 바람직한 제형의 성능을 비교하였다. 본 발명자들은 비교를 위해 10 mg/mL 및 20 mg/mL의 GLP-1R 항체 융합 단백질을 선택하였다.
GLP-1R 항체 융합 단백질의 제형을 표 5에 따라 제조하였다:
상이한 단백질 농도에서 GLP-1R 항체 융합 단백질의 제형
번호 GLP-1R 항체 융합 단백질 농도
(mg/mL)		 시트레이트 농도
(mM)		 L-아르기닌 (mM) TWEEN-80
(%)		 pH
5 10 20 138 0.1 6.5
6 20 20 138 0.1 6.5
제형을 제조하고, 0.22 ㎛ 폴리비닐리덴 다이플루오라이드(PVDF) 막을 통한 여과에 의해 멸균하였다. 상기 제형을 37℃에서 2 mL 유리 바이얼에 분석 시까지 또는 최대 1개월까지 저장하였다. 각각의 제형의 순도를 SEC-HPLC에 의해 확인하고, 이의 생물학적 활성을 리포터 유전자 검정법에 의해 확인하였다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 바람직한 제형은 20 mg/mL의 농도에서 GLP-1R 항체 융합 단백질에 대해 높은 안정성을 제공하였으며, 37℃에서 이의 순도 변화는 10 mg/mL에서와 유사하였고, 비-유의한 변화가 있을 뿐이었으며, 이와 동시에 이들의 생물학적 활성에서도 유의한 차이가 없었다.
상이한 단백질 농도에서 GLP-1R 항체 융합 단백질 제형의 순도 및 생물학적 활성
번호 순도(%) 순도(%) 순도(%) 순도(%)
0일 7일 15일 1개월
5 98.3 98.2 97.6 96.7
6 96.6 96.85 96.5 96.05
번호 활성(EC50) 활성(EC50) 활성(EC50) 활성(EC50)
0일 7일 15일 1개월
5 0.1 nM 0.08 nM 0.09 nM 0.11 nM
6 0.06 nM 0.07 nM 0.08 nM 0.08 nM
실시예 4: 진동 하에서의 바람직한 제형의 안정성
본 발명자들은, 본 제형이 진동 환경에서 GLP-1R 항체 융합 단백질에 대해 안정성을 제공할 수 있는지 조사하고, 시료 운송 및 일일 운반의 효과를 평가하기 위해 진동 조건 하에서의 바람직한 제형의 안정성에 대한 연구를 수행하였다.
GLP-1R 항체 융합 단백질의 제형을 표 7에 따라 제조하였다:
진동 하에서의 안정성에 대한 GLP-1R 항체 융합 단백질 제형
번호 GLP-1R 항체 융합 단백질 농도
(mg/mL)		 시트레이트 농도
(mM)		 L-아르기닌 (mM) TWEEN-80 (%) pH
7 10 20 138 0.1 6.5
제형을 제조하고, 0.22 ㎛ 폴리비닐리덴 다이플루오라이드(PVDF) 막을 통한 여과에 의해 멸균하였다. 상기 제형을 70 rpm 속도의 쉐이커 상에 놓고 37℃에서 2 mL 유리 바이얼에서 분석 시까지 또는 최대 15일까지 저장하였다. 각각의 제형의 순도를 SEC-HPLC에 의해 확인하고, 생물학적 활성을 리포터 유전자 검정법에 의해 확인하였다. 표 8에 나타낸 바와 같이, GLP-1R 항체 융합 단백질의 안정성 및 생물학적 활성은 진동 조건 하에 유지되었다.
진동 하에서 GLP-1R 항체 융합 단백질 제형의 순도 및 생물학적 활성
번호 순도(%) 순도(%) 순도(%) 순도(%) 순도(%)
0일 1일 5일 10일 15일
7 98.8 99.5 99.5 99.5 99.6
번호 활성(EC50) 활성(EC50) 활성(EC50) 활성(EC50) 활성(EC50)
0일 1일 5일 10일 15일
7 0.13 nM 0.13 nM 0.13 nM 0.14 nM 0.16 nM
실시예 5: 바람직한 제형의 안정성에 대한 가속화된 연구
본 발명자들은, 시간 경과에 따른 바람직한 제형에서의 GLP-1R 항체 융합 단백질의 안정성의 변화 경향을 신속하게 조사하기 위해, 바람직한 제형에 대해 가속화된 안정성 연구를 수행하였다.
GLP-1R 항체 융합 단백질의 제형을 표 9에 따라 제조하였다:
가속화된 안정성 연구를 위한 GLP-1R 항체 융합 단백질 제형
번호 GLP-1R 항체 융합 단백질 농도
(mg/mL)		 시트레이트 농도
(mM)		 L-아르기닌 (mM) TWEEN-80 (%) pH
8 10 20 138 0.1 6.5
제형을 제조하고, 0.22 ㎛ 폴리비닐리덴 다이플루오라이드(PVDF) 막을 통한 여과에 의해 멸균하였다. 상기 제형을 25℃에서 2 mL 유리 바이얼에서 분석 시까지 또는 최대 6개월까지 저장하였다. 각각의 제형의 순도를 SEC-HPLC에 의해 확인하고, 이의 생물학적 활성을 리포터 유전자 검정법에 의해 확인하였다. 표 10에 나타낸 바와 같이, GLP-1R 항체 융합 단백질 제형은 25℃의 저장 온도를 적어도 6개월 동안 견뎠으며, 순도 및 생물학적 활성에서 유의한 변화가 없었고, 이는 우수한 안정성을 보여준다.
가속화된 조건 하에서의 GLP-1R 항체 융합 단백질 제형의 순도 및 생물학적 활성
번호 순도(%) 순도(%) 순도(%) 순도(%) 순도(%) 순도(%)
0개월 0.5개월 1개월 2개월 4개월 6개월
8 98.4% 98.6% 98.8% 99.4% 97.6% 96.9%
번호 활성(EC50) 활성(EC50) 활성(EC50) 활성(EC50) 활성(EC50) 활성(EC50)
0개월 0.5개월 1개월 2개월 4개월 6개월
8 0.17 nM N/A 0.09 nM 0.08 nM 0.1 nM 0.05 nM
N/A = 시험되지 않음.
상기 기재된 실시예는 청구된 실시형태를 어떻게 제조하고 사용하는지에 대한 완전한 개시내용 및 설명을 당업자에게 제시하고자 제공되며, 본원에 개시된 것들의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 당업자에게 명확한 변형은 본 발명의 청구 범위 내에 포함되고자 한다.
<110> Gmax Biopharm LLC <120> ＧＬＰ-1Ｒ 항체 융합 단백질의 안정한 약제학적 용액 제형 <130> 2016.2.2 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 157 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 구조 <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val 35 40 45 Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala 50 55 60 Ser Ile Ser Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe 65 70 75 80 Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Gln Leu 85 90 95 Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 100 105 110 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val 115 120 125 Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser Asn Tyr Leu 130 135 140 Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 145 150 155 <210> 2 <211> 164 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 구조 <400> 2 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser 35 40 45 Ala Thr Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser 50 55 60 Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Thr Lys Ser 65 70 75 80 Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys 85 90 95 Pro Gly Gln Pro Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe 100 105 110 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 115 120 125 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 130 135 140 Cys Phe Gln Ser Asn Tyr Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 145 150 155 160 Val Glu Ile Lys <210> 3 <211> 153 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 구조 <400> 3 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gln 35 40 45 Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val 50 55 60 Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Leu Leu Ala Trp 65 70 75 80 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Ala 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Ser Glu Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 100 105 110 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe 115 120 125 Ala Ile Tyr Cys Cys Gln Gln Ala His Arg Phe Pro Pro Thr Phe Gly 130 135 140 Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg Arg 145 150 <210> 4 <211> 160 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 구조 <400> 4 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser 35 40 45 Ala Thr Gly Ser Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser 50 55 60 Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn 65 70 75 80 Ile Asn Asn Leu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 85 90 95 Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Glu Val Pro Ser 100 105 110 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 115 120 125 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Cys Cys Gln Gln Ala His 130 135 140 Arg Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg Arg 145 150 155 160 <210> 5 <211> 151 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 구조 <400> 5 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val 35 40 45 Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala 50 55 60 Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His Trp Tyr 65 70 75 80 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser 85 90 95 Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 100 105 110 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala 115 120 125 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln 130 135 140 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 145 150 <210> 6 <211> 158 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 구조 <400> 6 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser 35 40 45 Ala Thr Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 50 55 60 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser 65 70 75 80 Val Thr Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 85 90 95 Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg 100 105 110 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg 115 120 125 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser 130 135 140 Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 145 150 155 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 구조 <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Phe Ile Ser Asn Leu Ser Tyr Arg Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Met Ala Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 125 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 구조 <400> 8 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 9 <211> 114 <212> PRT <213> 인공 서열 <220> <223> 합성 구조 <400> 9 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Leu Pro Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 10 <211> 106 <212> PRT <213> 호모 사피엔스 <400> 10 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 11 <211> 101 <212> PRT <213> 호모 사피엔스 <400> 11 Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala 1 5 10 15 Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala 20 25 30 Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val 35 40 45 Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser 50 55 60 Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr 65 70 75 80 Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala 85 90 95 Pro Thr Glu Cys Ser 100 <210> 12 <211> 326 <212> PRT <213> 호모 사피엔스 <400> 12 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325

Claims (23)

  1. 치료적 유효량의 GLP-1R 항체 융합 단백질, 아미노산, 계면활성제 및 완충제 시스템을 포함하는, GLP-1R 항체 융합 단백질의 안정한 약제학적 용액 제형으로서,
    아미노산의 최종 농도는 1 mM 내지 500 mM이며, 계면활성제의 최종 농도는 0.05% 내지 0.15%이고, 안정한 용액 제형의 pH는 5.0 내지 8.0이고,
    이때 완충제 시스템이 시트레이트 완충제이고, 아미노산이 아르기닌이며, 계면활성제가 TWEEN-80인,
    안정한 약제학적 용액 제형.
  2. 제1항에 있어서,
    안정한 용액 제형이 25℃에서 적어도 6개월 동안 안정한, 안정한 용액 제형.
  3. 제1항에 있어서,
    아미노산의 최종 농도가 80 mM 내지 200 mM이며, 안정한 용액 제형의 pH가 5.5 내지 7.0인, 안정한 용액 제형.
  4. 제3항에 있어서,
    시트레이트 완충제의 농도가 5 mM 내지 30 mM인, 안정한 용액 제형.
  5. 제4항에 있어서,
    시트레이트 완충제의 농도가 20 mM인, 안정한 용액 제형.
  6. 제3항에 있어서,
    아미노산이 L-아르기닌이고, L-아르기닌의 최종 농도가 100 mM 내지 180 mM인, 안정한 용액 제형.
  7. 제6항에 있어서,
    L-아르기닌의 최종 농도가 138 mM인, 안정한 용액 제형.
  8. 제3항에 있어서,
    TWEEN-80의 최종 농도가 0.1%인, 안정한 용액 제형.
  9. 제1항에 있어서,
    치료적 유효량의 GLP-1R 항체 융합 단백질의 최종 농도가 0.1 mg/mL 내지 100 mg/mL인, 안정한 용액 제형.
  10. 제9항에 있어서,
    치료적 유효량의 GLP-1R 항체 융합 단백질의 최종 농도가 5 mg/mL 내지 40 mg/mL인, 안정한 용액 제형.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    GLP-1R 항체 융합 단백질의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6으로부터 선택되는 서열이고, GLP-1R 항체 융합 단백질의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9로부터 선택되는 서열인, 안정한 용액 제형.
  12. 제11항에 있어서,
    GLP-1R 항체 융합 단백질의 경쇄 불변 도메인의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO: 11이고, GLP-1R 항체 융합 단백질의 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 12인, 안정한 용액 제형.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    GLP-1R 항체 융합 단백질의 농도가 5 mg/mL 내지 40 mg/mL이며, L-아르기닌의 농도가 138 mM이며, TWEEN-80의 농도가 0.1%이고, pH가 6 내지 7인, 안정한 용액 제형.
  14. 제13항에 있어서,
    GLP-1R 항체 융합 단백질의 농도가 5 mg/mL인, 안정한 용액 제형.
  15. 제13항에 있어서,
    GLP-1R 항체 융합 단백질의 농도가 10 mg/mL인, 안정한 용액 제형.
  16. 제13항에 있어서,
    GLP-1R 항체 융합 단백질의 농도가 20 mg/mL인, 안정한 용액 제형.
  17. 제13항에 있어서,
    GLP-1R 항체 융합 단백질의 농도가 30 mg/mL인, 안정한 용액 제형.
  18. 제13항에 있어서,
    GLP-1R 항체 융합 단백질의 농도가 40 mg/mL인, 안정한 용액 제형.
  19. 제13항에 있어서,
    pH가 6.5인, 안정한 용액 제형.
  20. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    안정한 용액 제형이 멸균 주사기에 저장되는, 안정한 용액 제형.
  21. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    당뇨병 또는 비만의 치료를 위한, 안정한 용액 제형.
  22. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    과민성 대장 증후군, 및 혈장 글루코스 저하, 위 및/또는 장 운동 저해, 위 및/또는 장 배출 저해 또는 음식물 섭취 저해로부터 이득을 얻는 다른 질병들의 치료를 위한 안정한 용액 제형.
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