JP6731953B2 - Ｇｌｐ−１ｒ抗体融合タンパク質の安定な医薬溶液製剤 - Google Patents

Ｇｌｐ−１ｒ抗体融合タンパク質の安定な医薬溶液製剤 Download PDF

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Description

本発明は、バイオ医薬品の技術分野に関し、特にＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の安定な医薬溶液製剤に関する。
ＧＬＰ−１誘導体は、ＩＩ型糖尿病および肥満の治療のために臨床試験において使用されている（Ｇａｌｌｗｉｔｚ Ｂ，Ｅｕｒ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２０１５；１１：２１−５）。ＧＬＰ−１は、複数の生物学的効果、例えばインスリン分泌の刺激、グルカゴン分泌の抑制、胃内容排出の抑制、胃および腸管運動の抑制、体重減少の誘導を引き起こす（Ｌｕｎｄ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，２０１４；２５：４０７−１４）。ＧＬＰ−１の１つの顕著な特徴は、インスリン治療および内因性インスリン分泌を促進させる他の何らかの経口療法の懸念の１つである低血糖誘発のリスクのない、そのインスリン分泌刺激能力である。内因性ＧＬＰ−１はきわめて急速に分解され、その極度に短い半減期は治療用ペプチドとしてのＧＬＰ−１の有効性を制限する。
現在、ＧＬＰ−１およびその誘導体のＩｇＧ Ｆｃフラグメントまたはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）との融合を含め、ＧＬＰ−１およびその誘導体の半減期を延ばし、同時にそれらの生物活性を維持する様々な方法が存在する（Ｖｅｒｓｐｏｈｌ ＥＪ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，２０１２；６４：Ａ−ＡＸ）。本発明者らが選択した新しい方法は、ＧＬＰ−１を完全長の抗ＧＬＰ−１Ｒ抗体（ＩｇＧ）と融合させることである。このＩｇＧは、その融合パートナーのｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を延ばすことができ、ヒトにおけるそれ自体の半減期は２１日である。ＧＬＰ−１の生物活性を維持することに加えて、ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質は、そのＩｇＧ部分によってもたされる有利な安定性を有する。同時に、そのＩｇＧ部分は、ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質に分子標的特性を与え、こうしてＧＬＰ−１とＧＬＰ−１Ｒとの間の相互作用の可能性を増加させる。さらに、その抗体分子は、他の一般に使用される大部分の融合パートナーよりも低い抗原性を有する。長期にわたるまたは生涯にわたる使用のための薬物については、低い抗原性が不可欠である。
融合タンパク質は、多くの場合、哺乳動物の細胞系、例えばＣＨＯ、ＳＰ２／０、またはＮＳＯによって産生される。本発明では、ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の産生にＣＨＯ細胞を使用した場合、その融合タンパク質が、内因性プロテアーゼにより、またはある種の細胞培養の物理化学的条件下で分解にさらされることに注目する。この分解過程は低ｐＨ条件下でより迅速かつより明白であり、それに加えて、このＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質は、ｐＨが７を超えた場合により凝集する傾向がある。さらに、冷蔵条件（２〜８℃）下および単一緩衝液（例えばクエン酸緩衝系）中では、ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の溶解度が低過ぎるため、治療用量の必要条件を満たさないことを本発明において発見した。本発明では、上記の問題を、ある種の医薬品添加剤の特定の組合せおよびＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の特定の濃度を使用してｐＨを制御することにより解決する。
本発明の目的は、ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の安定な医薬溶液製剤を提供することである。この製剤は、ｉｎ ｖｉｖｏでの長い半減期のために安定かつ有効であり、糖尿病、肥満、および関連する疾患の治療のために使用することができる。
上記の技術的問題を解決するために、本発明は、下記の技術的解決法を提供する。
ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の安定な医薬溶液製剤は、治療に有効な量のＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質と、アミノ酸と、界面活性剤と、緩衝系とを含み、アミノ酸の最終濃度が１〜５００ｍＭであり、界面活性剤の最終濃度が０．０１％〜０．５％であり、かつ安定な溶液製剤のｐＨが５．０〜８．０である。
このＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の溶液製剤が、低ｐＨで不安定でありかつ高ｐＨで容易に凝集し、またこのＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質が、単一緩衝液中で十分な溶解度を有さないという問題を克服するために、本発明は、ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質を含み、さらに緩衝系と、安定剤および浸透圧調節剤としてのアミノ酸と、界面活性剤とを含む物理化学的に安定な製剤を提供する。この安定な溶液製剤は、２５℃において少なくとも６ヶ月間にわたり安定である。好ましくは、本発明の安定な溶液製剤は、最終濃度で約０．１〜１００ｍｇ／ｍＬのＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質と、５〜３０ｍＭの濃度のクエン酸緩衝液と、最終濃度で０．０１％〜０．２％のＴＷＥＥＮ−８０と、最終濃度で８０〜２００ｍＭのＬ−アルギニンとを含み、そのｐＨは５〜８である。この安定な溶液製剤は、ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の溶解度を高め、かつ特殊な環境下、とりわけ高温でのその安定性を高める。本発明はまた、本発明のＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質製剤の投与を含む、糖尿病、肥満、および関連する疾患の治療方法を含む。
好ましくは、アミノ酸の最終濃度は８０〜２００ｍＭであり、界面活性剤の最終濃度は０．０１％〜０．２％であり、緩衝系はクエン酸緩衝液であり、かつ安定な溶液製剤のｐＨは５．５〜７．０である。
好ましくは、クエン酸緩衝液の濃度は５〜３０ｍＭである。
好ましくは、アミノ酸はＬ−アルギニンであり、かつＬ−アルギニンの最終濃度は１００〜１８０ｍＭであり、界面活性剤はＴＷＥＥＮ−８０であり、かつＴＷＥＥＮ−８０の最終濃度は０．０５％〜０．１５％である。
好ましくは、治療に有効な量のＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の最終濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬである。
好ましくは、治療に有効な量のＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の最終濃度は５ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬである。
好ましくは、このＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６から選択されるものであり、かつ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号７、配列番号８、配列番号９から選択されるものである。
好ましくは、このＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列は配列番号１０または配列番号１１であり、かつ重鎖定常ドメインのアミノ酸配列は配列番号１２である。
本発明のＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質は、ＧＬＰ−１またはその類似体を含み、それがそのＣ末端において、ペプチドリンカーにより、ＧＬＰ−１Ｒ抗体の軽鎖のＮ末端に融合されている。この抗体融合タンパク質は、ＧＬＰ−１およびその類似体と比べて、同様または改良された生物活性と、長い半減期とを有する。好ましいＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の軽鎖可変ドメインの配列は、配列番号１、２、３、４、５、または６の全部または一部を含み、軽鎖定常ドメインの配列は、配列番号１０または１１の全部または一部を含み、重鎖可変ドメインの配列は、配列番号７、８、または９の全部または一部を含み、かつ重鎖定常ドメインの配列は、配列番号１２の全部または一部を含む。より好ましいＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の軽鎖可変ドメインの配列は、実質的に配列番号１、２、３、４、５、または６であり、軽鎖定常ドメインの配列は、実質的に配列番号１０または１１であり、重鎖可変ドメインの配列は、実質的に配列番号７、８、または９であり、かつ重鎖定常ドメインの配列は、実質的に配列番号１２である。最も好ましいＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の軽鎖可変ドメインの配列は、配列番号１、２、３、４、５、または６であり、軽鎖定常ドメインの配列は、配列番号１０または１１であり、重鎖可変ドメインの配列は、配列番号７、８、または９であり、かつ重鎖定常ドメインの配列は、配列番号１２である。
本発明の安定な溶液製剤は、糖尿病または肥満の治療に使用することができる。
本発明の安定な溶液製剤は、過敏性腸症候群、ならびに血糖値の低減、胃および／もしくは腸の運動の抑制、胃および／もしくは腸の内容排出の抑制、または摂食の抑制から恩恵を受ける他の疾患の治療に使用することができる。
本発明の有益な効果は、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏでの長い半減期、良好な効能、ならびに糖尿病、肥満、過敏性腸症候群、および関連する疾患の治療に適していることである。
下記の特定の実施形態により本発明の技術的解決法をさらに例示する。
本発明では、別段の言及がない限り、使用される原料および機器などはすべて市販のものであるか、当技術分野で普通に使用されるものである。下記の実施形態の方法は、別段の指示がない限り、すべて当技術分野の通常の方法である。
本発明のＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の調製については、先行特許出願中国特許出願公開第１０４３７１０１９Ａ号明細書、国際公開第２０１５／０２１８７１号パンフレットに記載されている。
生物活性とは、ｉｎ ｖｉｖｏでＧＬＰ−１Ｒと結合し、活性化して応答を引き出すＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の能力を指す。応答には、これらに限定されないが、インスリン分泌の促進、グルカゴン分泌の抑制、食欲の抑制、減量の誘導、満腹の誘導、パンクレアチンβ細胞アポトーシスの抑制、およびパンクレアチンβ細胞増殖の誘発が挙げられる。
ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の安定な医薬溶液製剤は、緩衝液中にそのＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質を含み、それはさらに安定剤および浸透圧調節剤としてのアミノ酸と、界面活性剤とを含む。この安定な溶液製剤は、２５℃において少なくとも６ヶ月間にわたり安定であり、より正確には、この安定な溶液製剤は、２５℃において６ヶ月〜８ヶ月間、６ヶ月〜１２ヶ月間、６ヶ月〜１８ヶ月間、６ヶ月〜２４ヶ月間、８ヶ月〜１２ヶ月間、８ヶ月〜１８ヶ月間、８ヶ月〜２４ヶ月間、１２ヶ月〜１８ヶ月間、１２ヶ月〜２４ヶ月間、１８ヶ月〜２４ヶ月間にわたり安定である。
本発明で使用される緩衝系には、これらに限定されないが、下記の有機または無機化合物、すなわちクエン酸、クエン酸の塩、アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩、グルコン酸、グルコン酸の塩、炭酸、炭酸の塩、酒石酸、酒石酸の塩、コハク酸、コハク酸の塩、酢酸、酢酸の塩、フタル酸、フタル酸の塩、リン酸、リン酸塩、塩酸、トリス、トロメタミン、およびこれらに限定されないが、ヒスチジン、アルギニン、グリシンを含めたアミノ酸のうちの１種類または数種類が挙げられる。
本発明において規定される浸透圧調節剤は、添加時に製剤の浸透圧を増大することができる物質である。本発明の浸透圧調節剤は、これらに限定されないがアルギニン、ヒスチジン、メチオニン、リシン、オルニチン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、グルタミン酸、およびアスパラギン酸を含めた遊離アミノ酸である。塩基性アミノ酸は、好ましくはアルギニン、ヒスチジン、リシン、またはこれらの組合せである。アミノ酸は、アミノ酸の塩の形態で加えることができ、その場合、その加えられるアミノ酸は、Ｄ−アルギニンなどのＤ−アミノ酸またはＬ−アルギニンなどのＬ−アミノ酸であることができる。
本発明の範囲内では、この加えられるアミノ酸は、浸透圧調節剤としての役割を果たすと同時にまた、安定剤としての役割も果たし、このアミノ酸には、これらに限定されないが、アルギニン、ヒスチジン、メチオニン、リシン、オルニチン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、チロシン、セリン、プロリン、およびトリプトファンが挙げられる。好ましくは、本発明における安定剤および浸透圧調節剤としてのアミノ酸の濃度は、１〜５００ｍＭである。
本発明において規定される界面活性剤は、両親媒性有機化合物であり、すなわち、これらの化合物は、異なる溶解特性を有する基を含有する。一般に、これらの化合物は、親油性炭化水素基および疎水性イオン基の両方を含有する。本発明の界面活性剤には、これらに限定されないが、ソルビタン脂肪酸エステル、例えばソルビタンモノカプリラート、ソルビタンモノラウラート、ソルビタンモノパルミタート、ソルビタントリオレアートと、グリセリン脂肪酸エステル、例えばグリセリンモノカプリラート、グリセリンモノミリスタート、グリセリンモノステアラートと、ポリグリセリン脂肪酸エステル、例えばデカグリセリルモノステアラート、デカグリセリルジステアラート、デカグリセリルモノリノレアートと、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（ここで、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラートはＴＷＥＥＮ−２０である）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート（ＴＷＥＥＮ−４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ここで、ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレアートはＴＷＥＥＮ−８０である）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート（ここで、ポリオキシエチレン（６０）ソルビタンモノステアラートはＴＷＥＥＮ−６０である）、ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート（ＴＷＥＥＮ−８５）、ポリオキシエチレンソルビタントリステアラート（ＴＷＥＥＮ−６５）と、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、例えばポリオキシエチレンソルビトールテトラステアラート、ポリオキシエチレンソルビトールテトラオレアートと、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、例えばポリオキシエチレングリセリルモノステアラートと、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、例えばポリエチレングリコールジステアラートと、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えばポリオキシエチレンラウリルエーテルと、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、例えばポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテルと、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、例えばポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルと、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、例えばポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油と、ポリオキシエチレン蜜蝋誘導体、例えばポリオキシエチレンソルビトール蜜蝋と、ポリオキシエチレンラノリン誘導体、例えばポリオキシエチレンラノリンと、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、例えばポリオキシエチレンステアリン酸アミドと、Ｃ１０〜Ｃ１８アルキル硫酸塩、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウムと、平均で２〜４モルのエチレンオキシド単位が加えられたポリオキシエチレンＣ１０〜Ｃ１６アルキルエーテル硫酸塩、例えばポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウムと、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルスルホコハク酸エステル塩、例えばラウリルスルホコハク酸ナトリウムエステルと、レシチン、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、例えばスフィンゴミエリンなどの天然界面活性剤と、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸のスクロースエステルとが挙げられる。本発明で使用される界面活性剤は、本明細書中で述べた界面活性剤のうちの１種類または複数種類を含むことができる。より好適な界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えばＴＷＥＥＮ−２０、ＴＷＥＥＮ−４０、ＴＷＥＥＮ−６０、およびＴＷＥＥＮ−８０である。
ＧＬＰ−１Ｒ融合タンパク質の安定な医薬溶液製剤は、最終濃度で約０．１〜約１００ｍｇ／ｍＬのＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質を含む。ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の好ましい濃度（ｍｇ／ｍＬ）は、約０．１〜１、１〜５、５〜１０、５〜２０、１０〜２０、２０〜３０、２０〜４０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲である。より好ましくは、ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の濃度（ｍｇ／ｍＬ）は、約０．１、約０．２５、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６．５、約８、約１０、約１２．５、約１５、約１７．５、約２０、約２２．５、約２５、約２７．５、約３０、約３２．５、約３５、約３７．５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００ｍｇ／ｍＬである。
安定な溶液製剤の好ましい緩衝系は、その濃度が約５〜３０ｍＭの範囲であるクエン酸塩である。より好ましくは、クエン酸濃度（ｍＭ）は、約５〜２５、５〜２０、５〜１５、５〜１２．５、５〜１０、７．５〜３０、７．５〜２５、７．５〜２０、７．５〜１５、７．５〜１２．５、７．５〜１０、８〜３０、８〜２５、８〜２０、８〜１５、８〜１２．５、８〜１１、８〜１０、９〜３０、９〜２５、９〜２０、９〜１５、９〜１２．５、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、１０〜１７．５、１０〜１５、１０〜１２．５、１２．５〜３０、１２．５〜２５、１２．５〜２０、１２．５〜１５、１５〜３０、１５〜２５、１５〜２０、１７．５〜３０、１７．５〜２５、１７．５〜２２．５、１７．５〜２０、２０〜３０、２０〜２７．５、２０〜２５、２０〜２２．５、２２．５〜３０、２２．５〜２７．５、２２．５〜２５、２５〜３０、２５〜２７．５、２７．５〜３０の範囲である。さらに好ましいクエン酸濃度は、約５〜２０ｍＭである。特に好ましいクエン酸濃度は、約１０、１０．０、２０、または２０．０ｍＭである。
本発明のＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の安定な医薬溶液製剤のｐＨは、約５〜８の範囲である。このｐＨ範囲は、その製剤がＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の溶解度を維持し、かつインスリン分泌を刺激する活性を促進するための、かつ非経口投与にとって適切な許容できる安定性をもたらす。このｐＨは、酸、例えばＨＣｌを加えることにより、または塩基、例えばＮａＯＨを加えることにより、またはクエン酸塩緩衝剤とクエン酸とを組み合わせて所望の緩衝液濃度およびｐＨ値を達成することにより、所望のｐＨに調整することができる。好ましいｐＨは、５〜７．７５、５〜７．５、５〜７．２５、５〜７．０、５〜６．７５、５〜６．５、５〜６．２５、５〜６．０、５〜５．７５、５〜５．５、５〜５．２５、５．２５〜８．０、５．２５〜７．７５、５．２５〜７．５、５．２５〜７．２５、５．２５〜７．０、５．２５〜６．７５、５．２５〜６．５、５．２５〜６．２５、５．２５〜６．０、５．２５〜５．７５、５．２５〜５．５、５．５〜８．０、５．５〜７．７５、５．５〜７．５、５．５〜７．２５、５．５〜７．０、５．５〜６．７５、５．５〜６．５、５．５〜６．２５、５．５〜６．０、５．５〜５．７５、５．７５〜８．０、５．７５〜７．７５、５．７５〜７．５、５．７５〜７．２５、５．７５〜７．０、５．７５〜６．７５、５．７５〜６．５、５．７５〜６．２５、５．７５〜６．０、６．０〜８．０、６．０〜７．７５、６．０〜７．５、６．０〜７．２５、６．０〜７．０、６．０〜６．７５、６．０〜６．５、６．０〜６．２５、６．２５〜８．０、６．２５〜７．７５、６．２５〜７．５、６．２５〜７．２５、６．２５〜７．０、６．２５〜６．７５、６．２５〜６．５、６．５〜８．０、６．５〜７．７５、６．５〜７．５、６．５〜７．２５、６．５〜７．０、６．５〜６．７５、６．７５〜８．０、６．７５〜７．７５、６．７５〜７．５、６．７５〜７．２５、６．７５〜７．０、７．０〜８．０、７．０〜７．７５、７．０〜７．５、７．０〜７．２５、７．２５〜８．０、７．２５〜７．５、７．５〜８．０、７．５〜７．７５、７．７５〜８．０の範囲である。さらに好ましいｐＨは、６〜７の範囲であり、また特に好ましいｐＨは、約６．５または６．５０である。
本発明は、ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質を安定化し、かつ溶解度を増すために、また非経口投与などに適するように製剤の浸透圧を調整するために、ＧＬＰ−１Ｒ融合タンパク質の安定な医薬溶液製剤のための浸透圧調節剤および安定剤として、好ましくは、Ｌ−アルギニンを１〜５００ｍＭの範囲の濃度で利用する。好ましいＬ−アルギニン濃度は、８０〜２００ｍＭの範囲である。さらに好ましい濃度は、８０〜１９０、８０〜１８０、８０〜１７０、８０〜１６０、８０〜１５０、８０〜１４０、８０〜１３０、８０〜１２０、８０〜１１０、８０〜１００、８０〜９０、９０〜２００、９０〜１９０、９０〜１８０、９０〜１７０、９０〜１６０、９０〜１５０、９０〜１４０、９０〜１３０、９０〜１２０、９０〜１１０、９０〜１００、１００〜２００、１００〜１９０、１００〜１８０、１００〜１７０、１００〜１６０、１００〜１５０、１００〜１４０、１００〜１３０、１００〜１２０、１００〜１１０、１１０〜２００、１１０〜１９０、１１０〜１８０、１１０〜１７０、１１０〜１６０、１１０〜１５０、１１０〜１４０、１１０〜１３０、１１０〜１２０、１２０〜２００、１２０〜１９０、１２０〜１８０、１２０〜１７０、１２０〜１６０、１２０〜１５０、１２０〜１４０、１２０〜１３０、１３０〜２００、１３０〜１９０、１３０〜１８０、１３０〜１７０、１３０〜１６０、１３０〜１５０、１３０〜１４０、１４０〜２００、１４０〜１９０、１４０〜１８０、１４０〜１７０、１４０〜１６０、１４０〜１５０、１５０〜２００、１５０〜１９０、１５０〜１８０、１５０〜１７０、１５０〜１６０、１６０〜２００、１６０〜１９０、１６０〜１８０、１６０〜１７０、１７０〜２００、１７０〜１９０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、１９０〜２００の範囲である。さらに好ましいＬ−アルギニン濃度は、１００〜１８０ｍＭである。特に好ましい濃度は、約１３８ｍＭまたは約１３８．０ｍＭである。
本発明は、ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の安定な医薬溶液製剤のための界面活性剤として、好ましくは、ＴＷＥＥＮ−８０を０．０１％〜０．５％の範囲の濃度で利用する。ＴＷＥＥＮ−８０の好ましい濃度は、約０．０１％〜約０．２％の範囲であり、その好ましい濃度範囲は、可溶性凝集体および不溶性粒子の形成ができるだけ少なくなるようなＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質およびアルギニンの組合せによって決められる。さらに好ましいＴＷＥＥＮ−８０の濃度は、約０．０１％〜０．２％、０．０１％〜０．１５％、０．０１％〜０．１％、０．０１％〜０．０５％、０．０１％〜０．０２５％、０．０２５％〜０．２％、０．０２５％〜０．１５％、０．０２５％〜０．１％、０．０２５％〜０．０５％、０．０５〜０．２％、０．０５〜０．１５％、０．０５〜０．１％、０．０５〜０．０７５％、０．０７５％〜０．２％、０．０７５％〜０．１５％、０．０７５％〜０．１％、０．１％〜０．２％、０．１％〜０．１５％、０．１５％〜０．２％の範囲である。さらに好ましいＴＷＥＥＮ−８０濃度は、約０．０５％〜約０．１５％の範囲である。特に好ましいＴＷＥＥＮ−８０濃度は、約０．１％である。
ＧＬＰ−１Ｒ融合タンパク質の特に好ましい安定な医薬溶液製剤は、約５〜約２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度のＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質、約２０ｍＭの濃度のクエン酸緩衝液、約０．１％の濃度のＴＷＥＥＮ−８０、約１３８ｍＭの濃度のＬ−アルギニンを含み、約６．５のｐＨを有する。ＧＬＰ−１Ｒ融合タンパク質の別の特に好ましい安定な医薬溶液製剤は、約２０〜約４０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度のＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質、約２０ｍＭの濃度のクエン酸緩衝液、約０．１％の濃度のＴＷＥＥＮ−８０、約１３８ｍＭの濃度のＬ−アルギニンを含み、約６．５のｐＨを有する。別の特に好ましい安定な溶液製剤は、約５〜約２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度のＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質、約５〜２０ｍＭの範囲の濃度のクエン酸緩衝液、約０．０５〜約０．１５％の範囲の濃度のＴＷＥＥＮ−８０、約１００〜１８０ｍＭの範囲の濃度のＬ−アルギニンを含み、約６．０〜７の範囲のｐＨを有する。別の特に好ましい安定な溶液製剤は、約２０〜約４０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度のＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質、約５〜２０ｍＭの範囲の濃度のクエン酸緩衝液、約０．０５〜０．１５％の範囲の濃度のＴＷＥＥＮ−８０、約１００〜１８０ｍＭの範囲の濃度のＬ−アルギニンを含み、約６．０〜７の範囲のｐＨを有する。
この安定な溶液製剤の投与は、当業者である医師に知られている任意の効果的な経路によって行うことができる。非経口投与は、これらの方法の１つである。非経口投与は、医学文献中では一般に剤形を滅菌したシリンジまたは他の何らかの機械装置、例えば輸液ポンプにより個体中に注入するものと理解されている。非経口経路には、静脈内、筋内、皮下、および腹膜内経路を挙げることができる。皮下投与が好ましい経路である。
本発明の安定な溶液製剤は、非インスリン依存型糖尿病を有するか、または非インスリン依存型糖尿病、インスリン依存性糖尿病、もしくは肥満へ進行している個体の治療に使用することができる。本明細書中で述べた安定な溶液製剤中のＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の有効量は、ＧＬＰ−１Ｒの刺激を必要としている個体に投与した場合に、望ましくない副作用を生じることなく所望の治療および／または予防効果をもたらす量である。
この融合タンパク質は、２週間に１回または１週間に１回のいずれかで投与されることが好ましい。治療される疾患によっては、この融合タンパク質をより頻繁に、例えば週に２〜３回投与することが必要な場合もある。
次に本発明を下記の非限定的な実施例によって記述することにする。
ＧＬＰ−１融合タンパク質によるＧＬＰ−１Ｒのｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性化を調べるためにレポーター遺伝子アッセイが使用された。
ｈＧＬＰ１Ｒ−ＣＲＥルシフェラーゼを同時発現するＣＨＯ−ＤＨＦＲ細胞が、９６ウェル細胞培養プレート中に１ウェル当たり２０，０００個の細胞として播種され、そのプレートを３７℃で一晩培養した。翌日、培養液上清を取り出した。細胞を無血清培地で２回洗浄し、残余の液体を吸引によって除去した。無血清培地で予備希釈した１００μＬのＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質サンプルまたは対照を加えた後、細胞を３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、１００μＬのＢＲＩＧＨＴ−ＧＬＯ（商標）化学発光基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。最後にその細胞ライゼートを白色の９６ウェルプレートに移し、その相対的ルミネセンス強度をＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）Ｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）マイクロプレートリーダーに記録した。ＧｒａｐｈＰａｄを使用して用量−反応曲線（反応強度対対数濃度）を分析してＥＣ５０を求めた。ＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用してＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の純度を分析した。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を使用してＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の凝集体（可溶性凝集体）の形成およびその単量体形の減損を調べた。２５℃でのＡＧＩＬＥＮＴ １１００ＨＰＬＣにおいて、ＵＶ吸光度のベースラインが一定かつ安定になるまで、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷｘｌ高性能ＳＥＣカラムに移動相として２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を流した。１〜３ｍｇ／ｍＬの濃度（移動相で予備希釈した）のＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の安定な医薬溶液製剤を５０μＬの量で注入した。このサンプルを０．５ｍＬ／分の流量の移動相で溶出し、ＵＶ２８０ｎｍにおける吸光度を記録した。各ランの後、単量体（主ピーク）、二量体、および多量体の吸光度ピークのＡＵＣを計算し、主ピークのＡＵＣ対総ＡＵＣの比率を計算し、そのサンプルの純度として報告した。
実施例１：ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の安定性に及ぼすｐＨの影響
ｐＨは、ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の溶解度および安定性に影響を与えることができ、製剤において最も重要なパラメーターの１つである。本発明者らは、実施例１において、ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の安定性に及ぼすｐＨの影響を、その形成される可溶性凝集体（二量体および多量体）の量を測定することにより、すなわち４５℃で１週間または３週間後に各サンプル中で形成される可溶性凝集体の比（凝集％）を測定することによって調べて、ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の安定性に及ぼす特定のｐＨのそれぞれの影響を判定した。
ＧＬＰ−１Ｒ融合タンパク質の安定な医薬溶液製剤は表１に従って調製した。
Figure 0006731953
ＧＬＰ−１Ｒ融合タンパク質の安定な医薬溶液製剤を０．２２μｍの二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜を通す濾過によって滅菌した。その溶液を２ｍＬのホウケイ酸ガラスバイアル中で４５℃において、分析までまたは最長で３週間まで貯蔵した。各サンプル中の可溶性凝集体の比率はＳＥＣ−ＨＰＬＣによって求めた。表２に示すように、形成された可溶性凝集体の比率は、特に好ましい６．５のｐＨで最低であり、また製剤の安定性も最良であり、安定性はｐＨが低下するにつれて増す傾向がある。
Figure 0006731953
実施例２：好ましい製剤の頑健性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）
本発明者らは、実際の生産工程において薬物の品質および安定性に顕著な影響を与えることになる３種類の最も重要な医薬品添加剤または要因（Ｌ−アルギニン、ｐＨ、およびＴＷＥＥＮ−８０）の仮定誤差（±１５％）を調べるため、頑健性試験を１０ｍｇ／ｍＬの濃度のＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質製剤に対して行った。一般調剤規定およびＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の特性に基づいて、単量体の純度（すなわち主ピークの割合）の変化を評価基準として選択した。
ＤＯＥ実験のためのＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の製剤は表３に従って調製した。
Figure 0006731953
製剤を調製し、０．２２μｍの二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜を通す濾過によって滅菌した。その製剤を２ｍＬのガラスバイアル中で４０℃において、分析までまたは最長で１ヶ月まで貯蔵した。各製剤の純度はＳＥＣ−ＨＰＬＣによって求めた。表４に示すように、６〜７のｐＨ、１１０〜１６６ｍＭのＬ−アルギニン、および０．０５％〜０．１５％の濃度のＴＷＥＥＮ−８０の範囲では、各製剤の純度は類似しているように見え、有意差は存在しなかった。これは、好ましい製剤が良好な頑健性であり、生産における偏差は、実際の製剤の安定性に有意な影響を与えないはずであることを示す。
Figure 0006731953
実施例３：製剤の安定性に及ぼすＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の濃度の影響
本発明者らは、２種類の異なる濃度のＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質で好ましい製剤の性能を比較し、この好ましい製剤が、より高濃度のＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質において許容できる安定性を可能にして、実際にＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の高用量の使用を容易にし得るかどうかを調べた。本発明者らは、比較のために１０および２０ｍｇ／ｍＬのＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質を選択した。
ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の製剤は表５に従って調製した。
Figure 0006731953
製剤を調製し、０．２２μｍの二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜を通す濾過によって滅菌した。各製剤を２ｍＬのガラスバイアル中で３７℃において、分析までまたは最長で１ヶ月まで貯蔵した。各製剤の純度をＳＥＣ−ＨＰＬＣによって求め、またその生物活性をレポーター遺伝子アッセイによって求めた。表６に示すように、好ましい製剤は、２０ｍｇ／ｍＬの濃度でＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の高い安定性を示し、３７℃におけるその純度の変化は１０ｍｇ／ｍＬの場合と類似しており（有意でない変化があるに過ぎない）、同時に、それらの生物活性について有意差は存在しなかった。
Figure 0006731953
実施例４：好ましい製剤の振動下での安定性
本発明者らは、サンプルの輸送および日常の運搬の影響を評価するために好ましい製剤の振動条件下での安定性に関して試験を行い、この製剤が振動環境でＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質に安定性を与え得るかどうかを調べた。
ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の製剤は表７に従って調製した。
Figure 0006731953
製剤を調製し、０．２２μｍの二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜を通す濾過によって滅菌した。製剤は２ｍＬのガラスバイアル中で３７℃において貯蔵した。これを分析までまたは最長で１５日間まで７０ｒｐｍの速度の振盪機上に置いた。各製剤の純度をＳＥＣ−ＨＰＬＣによって求め、またその生物活性をレポーター遺伝子アッセイによって求めた。表８に示すように、このＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の安定性および生物活性は振動条件下で維持された。
Figure 0006731953
実施例５：安定性に関する好ましい製剤の加速試験
本発明者らは、好ましい製剤中のＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の安定性の経時的な変化の傾向を迅速に調べるために、好ましい製剤に関して加速安定性試験を行った。
ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の製剤は表９に従って調製した。
Figure 0006731953
製剤を調製し、０．２２μｍの二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜を通す濾過によって滅菌した。製剤を２ｍＬのガラスバイアル中で２５℃において、分析までまたは最長で６ヶ月まで貯蔵した。各製剤の純度をＳＥＣ−ＨＰＬＣによって求め、またその生物活性をレポーター遺伝子アッセイによって求めた。表１０に示すように、ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質製剤は、２５℃の貯蔵温度に少なくとも６ヶ月間耐え、純度および生物活性の有意な変化はなく、優れた安定性を示した。
Figure 0006731953
上記の実施例は、特許請求される実施形態を実施および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に与えるために提供され、本明細書中で開示されるものの範囲を限定することを意図しない。当業者に明らかな修正形態は、本発明の特許請求の範囲内にあることを意図している。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の安定な医薬溶液製剤であって、治療に有効な量の前記ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質と、アミノ酸と、界面活性剤と、緩衝系とを含み、前記アミノ酸の最終濃度が１〜５００ｍＭであり、前記界面活性剤の最終濃度が０．０１％〜０．５％であり、かつ前記安定な溶液製剤のｐＨが５．０〜８．０である、安定な医薬溶液製剤。
（構成２）
２５℃において少なくとも６ヶ月間にわたり安定である、構成１に記載の安定な溶液製剤。
（構成３）
前記アミノ酸の前記最終濃度が８０〜２００ｍＭであり、前記界面活性剤の前記最終濃度が０．０１％〜０．２％であり、前記緩衝系がクエン酸緩衝液であり、かつ前記安定な溶液製剤の前記ｐＨが５．５〜７．０である、構成１に記載の安定な溶液製剤。
（構成４）
前記クエン酸緩衝液の濃度が５〜３０ｍＭである、構成３に記載の安定な溶液製剤。
（構成５）
前記クエン酸緩衝液の前記濃度が２０ｍＭである、構成４に記載の安定な溶液製剤。
（構成６）
前記アミノ酸がＬ−アルギニンであり、かつＬ−アルギニンの最終濃度が１００〜１８０ｍＭである、構成３に記載の安定な溶液製剤。
（構成７）
Ｌ−アルギニンの前記最終濃度が１３８ｍＭである、構成６に記載の安定な溶液製剤。
（構成８）
前記界面活性剤がＴＷＥＥＮ−８０であり、かつＴＷＥＥＮ−８０の最終濃度が０．０５％〜０．１５％である、構成３に記載の安定な溶液製剤。
（構成９）
ＴＷＥＥＮ−８０の前記最終濃度が０．１％である、構成８に記載の安定な溶液製剤。
（構成１０）
前記治療に有効な量の前記ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の最終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬである、構成１に記載の安定な溶液製剤。
（構成１１）
前記治療に有効な量の前記ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の前記最終濃度が５ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬである、構成１０に記載の安定な溶液製剤。
（構成１２）
前記ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６から選択されるものであり、かつ前記ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列が、配列番号７、配列番号８、配列番号９から選択されるものである、構成１〜１１のいずれか１に記載の安定な溶液製剤。
（構成１３）
前記ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列が配列番号１０または配列番号１１であり、かつ前記ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の重鎖定常ドメインのアミノ酸配列が配列番号１２である、構成１２に記載の安定な溶液製剤。
（構成１４）
前記ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の前記濃度が５ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬであり、Ｌ−アルギニンの前記濃度が１３８ｍＭであり、ＴＷＥＥＮ−８０の前記濃度が０．１％であり、かつ前記ｐＨが６〜７である、構成１〜１１のいずれか１に記載の安定な溶液製剤。
（構成１５）
前記ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の前記濃度が５ｍｇ／ｍＬである、構成１４に記載の安定な溶液製剤。
（構成１６）
前記ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の前記濃度が１０ｍｇ／ｍＬである、構成１４に記載の安定な溶液製剤。
（構成１７）
前記ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の前記濃度が２０ｍｇ／ｍＬである、構成１４に記載の安定な溶液製剤。
（構成１８）
前記ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の前記濃度が３０ｍｇ／ｍＬである、構成１４に記載の安定な溶液製剤。
（構成１９）
前記ＧＬＰ−１Ｒ抗体融合タンパク質の前記濃度が４０ｍｇ／ｍＬである、構成１４に記載の安定な溶液製剤。
（構成２０）
前記ｐＨが約６．５である、構成１４に記載の安定な溶液製剤。
（構成２１）
前記安定な溶液製剤が滅菌シリンジ中に貯蔵される、構成１〜１１のいずれか１に記載の安定な溶液製剤。
（構成２２）
糖尿病または肥満の治療のための構成１〜１１のいずれか１に記載の安定な溶液製剤。
（構成２３）
過敏性腸症候群、ならびに血糖値の低減、胃および／もしくは腸の運動の抑制、胃および／もしくは腸の内容排出の抑制、または摂食の抑制から恩恵を受ける他の疾患の治療のための構成１〜１１のいずれか１に記載の安定な溶液製剤。

Claims (22)

  1. ＧＬＰ−１Ｒ抗体とＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１の類似体との融合タンパク質の安定な医薬溶液製剤であって、０．１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲の最終濃度の前記融合タンパク質と、１〜５００ｍＭの範囲の最終濃度のアミノ酸と、０．０１％〜０．５％の範囲の最終濃度の界面活性剤と、５〜３０ｍＭの範囲の最終濃度のクエン酸緩衝液とを含み、前記安定な溶液製剤が５．０〜８．０の範囲のｐＨを有し、前記アミノ酸がアルギニンであり、かつ前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートであり、かつ、前記溶液製剤が、２５℃で少なくとも６ヶ月間、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって求めた純度またはレポーター遺伝子アッセイによって求めた生物活性において有意な変化を有さない、前記安定な医薬溶液製剤。
  2. 前記アミノ酸の前記最終濃度が８０〜２００ｍＭの範囲であり、前記界面活性剤の前記最終濃度が０．０１％〜０．２％の範囲であり、かつ前記安定な溶液製剤の前記ｐＨが５．５〜７．０の範囲である、請求項１に記載の安定な溶液製剤。
  3. 前記クエン酸緩衝液の前記濃度が２０ｍＭである、請求項１に記載の安定な溶液製剤。
  4. 前記アミノ酸がＬ−アルギニンであり、かつＬ−アルギニンの最終濃度が１００〜１８０ｍＭの範囲である、請求項２に記載の安定な溶液製剤。
  5. Ｌ−アルギニンの前記最終濃度が１３８ｍＭである、請求項４に記載の安定な溶液製剤。
  6. 前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン（８０）モノオレアートであり、かつ前記界面活性剤の前記最終濃度が０．０５％〜０．１５％の範囲である、請求項２に記載の安定な溶液製剤。
  7. 前記界面活性剤の前記最終濃度が０．１％である、請求項６に記載の安定な溶液製剤。
  8. 前記融合タンパク質の前記最終濃度が５ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬの範囲である、請求項１に記載の安定な溶液製剤。
  9. 前記ＧＬＰ−１Ｒ抗体が、配列番号３または配列番号４の軽鎖可変ドメイン、および、配列番号８の重鎖可変ドメインを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の安定な溶液製剤。
  10. 前記ＧＬＰ−１Ｒ抗体が、配列番号３の軽鎖可変ドメインおよび配列番号８の重鎖可変ドメインを含む、請求項９に記載の安定な溶液製剤。
  11. 前記ＧＬＰ−１Ｒ抗体が、配列番号４の軽鎖可変ドメインおよび配列番号８の重鎖可変ドメインを含む、請求項９に記載の安定な溶液製剤。
  12. 前記ＧＬＰ−１Ｒ抗体が、配列番号１０または配列番号１１の軽鎖定常ドメイン、および、配列番号１２の重鎖定常ドメインをさらに含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の安定な溶液製剤。
  13. 前記融合タンパク質の前記最終濃度が５ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、Ｌ−アルギニンの前記最終濃度が１３８ｍＭであり、前記界面活性剤の前記最終濃度が０．１％であり、かつ前記ｐＨが６〜７である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の安定な溶液製剤。
  14. 前記融合タンパク質の前記最終濃度が５ｍｇ／ｍＬである、請求項１３に記載の安定な溶液製剤。
  15. 前記融合タンパク質の前記最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬである、請求項１３に記載の安定な溶液製剤。
  16. 前記融合タンパク質の前記最終濃度が２０ｍｇ／ｍＬである、請求項１３に記載の安定な溶液製剤。
  17. 前記融合タンパク質の前記最終濃度が３０ｍｇ／ｍＬである、請求項１３に記載の安定な溶液製剤。
  18. 前記融合タンパク質の前記最終濃度が４０ｍｇ／ｍＬである、請求項１３に記載の安定な溶液製剤。
  19. 前記ｐＨが約６．５である、請求項１３に記載の安定な溶液製剤。
  20. 前記安定な溶液製剤が滅菌シリンジ中にある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の安定な溶液製剤。
  21. 糖尿病または肥満の治療のための請求項１〜８のいずれか一項に記載の安定な溶液製剤。
  22. 過敏性腸症候群、ならびに血糖値の低減、胃および／もしくは腸の運動の抑制、胃および／もしくは腸の内容排出の抑制、または摂食の抑制から恩恵を受ける他の疾患の治療のための請求項１〜８のいずれか一項に記載の安定な溶液製剤。
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