KR20210103265A - 신규 비알코올성 지방간염 치료용 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염의 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 ⅰ) GLP-1 또는 그의 유사체 및 IL-10 단백질 ⅱ) GLP-1 또는 그의 유사체가 IL-10 단백질에 연결된 융합단백질 또는 iii) 항체 Fc 영역의 N-말단에 GLP-1 또는 그의 유사체가 연결되고, 상기 항체 Fc 영역의 C-말단에 IL-10 단백질이 연결된 이중 특이성 이량체 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

신규 비알코올성 지방간염 치료용 약학 조성물{A novel pharmaceutical composition for treating non-alcoholic steatohepatitis}
본 발명은 신규 약학적 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 비알코올성 지방간염 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, 이하, 'NASH'로 지칭함)는 진행 단계에 따라 특징적인 병인이 존재한다. 즉 인슐린 저항성, 당/지질의 조절기능 저하(dysregulation)에서 시작해 지방축적(steatosis), 염증(inflammation) 및 섬유화(fibrosis), 세포사멸 등의 병인들이 점차 관련되어 비알코올성 지방간(non-alcoholic fatty liver disease, 이하, 'NAFLD'로 약칭함)에서 NASH(F0, F1, F2, F3, F4 단계로 구분)로 진행하고 더 나아가 간경변(compensated→ decompensated)으로 진행되는 것이다.
비알코올성 지방간(non-alcoholic fatty liver disease, 이하, 'NAFLD'로 약칭함)는 비만, 당뇨병, 고혈압 등을 동반한 대사증후군과 더불어 급격하게 증가되고 있는 간질환으로, 간경변이나 간암으로 진행될 수 있고, 최근 NAFLD의 중증(severe) 염증 형태인 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, 이하, 'NASH'로 지칭함)의 발생률, NASH-관련 간경변이 빠르게 증가하고 있어 이에 대한 치료제 개발을 위한 많은 연구들이 이루어지고 있다.
NASH는 진행 단계에 따라 특징적인 병인이 존재하는 것으로 알려지고 있다. 즉 인슐린 저항성, 당/지질의 조절기능 저하(dysregulation)에서 시작해 지방축적(steatosis), 염증(inflammation) 및 섬유화(fibrosis), 세포사멸 등의 병인들이 점차 관련되어 비알코올성 지방간(non-alcoholic fatty liver disease, 이하, 'NAFLD'로 약칭함)에서 NASH(F0, F1, F2, F3, F4 단계로 구분)로 진행하고 더 나아가 간경변(compensated → decompensated)으로 진행되는 것이다.
그러나, 불행하게도 현재까지 NASH 치료제로 승인된 약물이 없고, 질병의 부담을 고려하면 치료제 선택권에 대한 환자의 요구가 충족되지 못하고 있는 미충족 수요(unmet needs)가 높은 약물이다. NAFLD와 NASH의 발생과 진행에 기여하는 기본적인 병태생리학적 기전은 매우 복잡하고, 이러한 작용기전은 현재 연구가 진행되는 여러 표적들에 대한 다양한 치료제 개발에서 확인되고 있다. 광범위한 범위에서 약물 개발은 대사경로, 염증 연쇄반응, 섬유화에 영향을 주는 작용기전의 조절에 초점을 맞추고 있다. 비록 NAFLD 발병에 대한 작용기전이 상당부분 규명되고 있지만, 임상시험 설계의 복잡성으로 인한 치료제 개발에 많은 어려움이 발생하고 있다. 현재 임상3상으로 진행되는 후보물질들이 치료제로서의 가능성을 제시하는 가운데, 간지방증, 괴사염증, 섬유화 감소 측면에서 좋은 결과를 보이고 있다. 다양한 코호트 연구를 통해 장기적인 안전성과 유효성이 확립된다면, 잠재적인 이환율과 사망률을 경감시키는데 도움이 될 것이다.
아울러, GLP-1 수용체를 NAFLD 또는 NASH 치료제로 사용하고자 하는 시도가 이루어지고 있다. 이와 관련하여, WO2016043533A1는 반감기가 증가된 GLP-1/글루카곤 수용체 이중 작용제인 옥신토모듈린 유도체를 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 치료제를 개시하고 있고, US9938335 역시 글루카곤 수용체/GLP-1 수용체 이중 작용제로 사용되는 글루카곤 유사 펩타이드 및 이를 이용한 NAFLD 및 NASH 치료방법을 개시하고 있다.
이러한 선행기술에 기재된 물질들은 동물모델에서 일부 효과가 확인되었으나, 아직까지 최종적으로 임상시험을 통과한 물질은 존재하지 않는 실정이다.
본 발명은 상술한 문제점을 포함하여 여러 가지 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 보다 효율적으로 NASH를 치료할 수 있는 신규 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나, 본 발명의 보호범위가 상기 목적으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, ⅰ) GLP-1 또는 그의 유사체 및 IL-10 단백질 ⅱ) GLP-1 또는 그의 유사체가 IL-10 단백질에 연결된 융합단백질 또는 iii) 항체 Fc 영역의 N-말단에 GLP-1 또는 그의 유사체가 연결되고, 상기 항체 Fc 영역의 C-말단에 IL-10 단백질이 연결된 이중 특이성 이량체 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 ⅰ) GLP-1 또는 그의 유사체 및 IL-10 단백질 ⅱ) GLP-1 또는 그의 유사체가 IL-10 단백질에 연결된 융합단백질 또는 iii) 항체 Fc 영역의 N-말단에 GLP-1 또는 그의 유사체가 연결되고, 상기 항체 Fc 영역의 C-말단에 IL-10 단백질이 연결된 이중 특이성 이량체 융합단백질을 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염 치료방법이 제공된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 생산된 항체 Fc 영역의 N-말단에 GLP-1 또는 그의 유사체가 연결되고, 상기 항체 Fc 영역의 C-말단에 IL-10 단백질이 연결된 이중 특이성 이량체 융합단백질(GLP-1/IL-10 융합단백; MD100)의 생성 결과를 나타내는 일련의 SDS-PAGE 겔 사진이다. GLP-1-hyFc(좌측) 및 hyFc-IL-10V(중앙)는 병용 효과를 확인하기 위해 별도 생산하였다:
좌측 및 중앙
1: 비환원 조건
2: 환원 조건
우측(GLP-1-hyFc-IL-10V)
1: input - 비환원 조건
2: flow through - 비환원 조건
3: elution - 비환원 조건
4: input - 환원 조건
5: flow through - 환원 조건
6: elution - 환원 조건
도 2는 다양한 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 GLP-1/IL-10 융합단백질(MD100), GLP-1-hyFc(GX-G6) 및 liraglutide의 시험관내 활성을 조사하기 위한 두 차례의 cAMP 유도능 측정 결과를 나타내는 일련의 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-1/IL-10 융합단백질(MD100)와 재조합 인간 IL-10 단백질 및 hyFc-IL-10V의 농도별 처리에 따른 TNFα의 분비량을 ELISA로 분석한 결과를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-1/IL-10 융합단백질(MD100, 우측)와 재조합 IL-10(좌측)의 IL-10R과의 결합력을 Octet Bio-layer 간섭법(interferometry)을 통해 분석한 결과를 비교하여 나타낸 일련의 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-1/IL-10 융합단백질(MD100)의 생체 내 약물동력학(pharmacokinetics, PK) 양상을 Fc 영역 특이적 항체를 이용한 ELISA로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-1 + IL-10 조합(Combo) 및 GLP-1/IL-10 융합단백질(MD100) 투여에 따른 대사 관련 효과를 나타낸 것으로서, 각 실험군의 체중(A), 체중변화(B), 혈중 트리글리세라이드 함량(TG, C), 총 콜레스테롤 함량(D), 총 빌리루빈 함량(E), 인슐린 저항성(G), 내당능(G) 및 혈당수준(H)을 측정한 결과를 나타내는 일련의 그래프들을 보여준다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-1 + IL-10 조합(Combo) 및 GLP-1/IL-10 융합단백질(MD100) 투여에 따른 간 지방증 및 염증에 대한 효과를 조사한 결과로서, 각 실험군으로부터 적출된 간을 촬영하거나 간 조직 박편에 대한 시리우스 레드 염색 결과를 나타내는 일련의 사진(A), 각 실험군에서의 간의 중량(B), 체중대간 중량비(C), 간 트리글리세라이드 함량(D), ALT 함량(E), AST 함량(F), TNFα 발현 정도(G), IL-6 발현정도(H) 및 IL-1β 발현정도(I)를 각각 나타내는 일련의 그래프들을 보여준다.
도 8은 고지방 식이 유도 비알코올성 지방간염 마우스 모델에서 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-1 + IL-10 조합 투여(Combo)에 따른 간 지방증 및 염증에 미치는 효과를 조사한 결과로서, 각 실험군으로부터 적출된 간을 촬영하거나 간 조직 박편에 대한 시리우스 레드 염색 결과를 나타내는 일련의 사진(A), 각 실험군에서의 간의 중량(B), 체중대간 중량비(C), 간 트리글리세라이드 함량(D), ALT 함량(E), AST 함량(F), TNFα 발현 정도(G), IL-6 발현정도(H) 및 IL-1β 발현정도(I)를 각각 나타내는 일련의 그래프들을 보여준다.
도 9는 고지방 식이 유도 비알코올성 지방간염 마우스 모델에서 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-1/IL-10 융합단백질(MD100)의 농도별 투여에 의한 대사 프로파일을 조사한 결과로서, 각 실험군에서의 체중(A), 체중의 변화(B), 혈당의 변화(C) 및 혈당수준(D)를 각각 측정한 결과를 나타내는 일련의 그래프들을 보여준다.
도 10은 고지방 식이 유도 비알코올성 지방간염 마우스 모델에서 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-1/IL-10 융합단백질(MD100)의 농도별 투여에 따른 간 지방증 및 염증에 미치는 효과를 조사한 결과로서, 각 실험군으로부터 적출된 간을 촬영하거나 간 조직 박편에 대한 시리우스 레드 염색 결과를 나타내는 일련의 사진(A), 각 실험군에서의 간의 중량(B), 체중대간 중량비(C), 간 트리글리세라이드 함량(D), ALT 함량(E), AST 함량(F), TNFα 발현 정도(G), IL-6 발현정도(H) 및 IL-1β 발현정도(I)를 각각 나타내는 일련의 그래프이다.
도 11은 고지방 식이 유도 비알코올성 지방간염 마우스 모델에서 일 실시예에 따른 GLP-1/IL-10 융합단백질(MD100)의 농도별 투여에 따른 간 섬유증에 미치는 영향을 조사한 결과로서, 각 실험군에서 적출한 간조직에 대한 시리우스 레드 염색 결과를 나타내는 일련의 사진(A) 및 하이드록시프롤린 분석 결과를 나타낸 그래프(B)을 보여준다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-1 + IL-10 조합(Combo) 및 GLP-1/IL-10 융합단백질(MD100) 처리에 따른 팔미트산 이용 시험관내 지질독성을 조사한 결과로서, 약물 처리시 세포 생존도(A) 및 다양한 세포사멸 표지자들의 발현 정도(B)를 측정한 결과를 나타내는 일련의 그래프를 보여준다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-1 + IL-10 조합(Combo) 및 GLP-1/IL-10 융합단백질(MD100) 처리에 따른 염증 개선 정도를 시험관내 분석을 통해 분석한 결과로서, 실험물질들을 LPS로 염증을 유도한 골수유래 대식세포(BMDM)에 처리한 후 다양한 염증 관련 지표인 인산화 NK-κB(A), TNF-α(B), IL-6(C) 및 IL-1β(D)의 발현 정도를 측정한 결과를 나타내는 일련의 그래프들을 보여준다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-1 + IL-10 조합(Combo) 및 GLP-1/IL-10 융합단백질(MD100) 처리에 의한 올레산에 의해 유도된 시험관 내 간지방증(hepatic steatosis)에 미치는 영향을 BODIPY 염색을 통해 확인한 결과를 나타내는 일련의 형광현미경 촬영 사진(A) 및 상기 A의 결과를 정량화한 그래프(B)를 나타낸다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-1 + IL-10 조합(Combo) 및 GLP-1/IL-10 융합단백질(MD100) 처리에 따른 지방전구세포의 지방세포로의 분화에 미치는 영향을 분석한 결과로서, 각 실험군에서의 시리우스 레드 염색 결과를 나타내는 일련의 사진(A), 각 실험군에서의 트리글리세라이드 축적 정도(B), PPARγ 발현정도를 웨스턴 블랏 분석으로 확인한 결과(C), PPARγ(D), C/EBPα(E) 및 aP2(F)의 발현정도를 나타내는 일련의 그래프를 보여준다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "GLP-1"은 "글루카곤-유사 펩타이드-1(glucagon-like peptide-1)"의 약어로서 프로글루카곤 펩타이드의 조직 특이적인 번역 후 가공에 의해 유도되는 30 또는 31 아미노산 길이의 펩타이드 호르몬이다. GLP-1은 음식 섭취 시 소장의 장내분비(enteroendocrine) L-세포 및 뇌간(brain stem)의 고립속(solitary tract) 핵 내의 특정 신경세포에서 생산되어 분비된다. 최초 산물인 GLP-1(1-37)은 쉽게 아마이드화되며 절단에 의해 두 가지의 동등한 생물학적 활성을 가진 절단된 형태(GLP-1(7-36) 아마이드 및 GLP-1(7-37))로 전환된다. 활성 GLP-1은 아미노산 위치 13-20 및 24-35의 두 개의 알파-나선 부위와 상기 두 알파-나선 부위를 연결하는 링커 지역을 포함한다. GLP-1은 포도당-의존적으로 혈당 수준을 낮추는 역할을 수행하기 때문에, 제2형 당뇨병 치료제로 개발되어 사용되고 있다. 그러나, 생체 내에서 GLP-1은 디펩티딜 펩티데이즈-4(DPP-4)에 의해 신속하게 분해되기 때문에 생체 내 반감기가 2분에 불과하여, 자연상태의 펩타이드로는 그 효과가 극히 제한적이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "GLP-1 유사체"는 생물학적으로 GLP-1의 기능을 수행하는 단백질로서 GLP-1/exendin-4 수용체에 결합하여 하류 신호전달을 매개할 수 있는 단백질을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "융합단백질"은 둘 이상의 단백질 또는 단백질 내 특정 기능을 담당하는 도메인이 각각의 단백질 또는 도메인이 본연의 기능을 담당하도록 연결된 재조합 단백질(recombinant protein)을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "항체 Fc 영역"은 항체를 파파인으로 절단하였을 때 생성되는 단편 중 결정화되는 단편(crystalized fragment)을 의미하며, Fc 수용체라고 지칭되는 세포 표면 수용체 및 보체계(complement system)의 몇몇 단백질과 상호작용을 한다. 항체 Fc 영역은 중쇄의 두 번째 및 세 번째 불변 영역(CH2 및 CH3)을 포함하는 단편이 힌지 부분에서 분자 간 이황화 결합에 의해 연결된 동형 이량체 구조를 나타낸다. IgG의 Fc 영역은 다수의 N-글리칸 부착 부위를 가지고 있으며, 이는 Fc 수용체-매개 작용에 있어서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있으며, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 및 IgD 등이 사용될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "하이브리드 항체 Fc 영역"은 대한민국 특허 제897938호에 기재된 다양한 서브타입의 Ig Fc 영역의 부분들의 조합에 의해 생성된 Fc 영역 펩타이드를 의미하며, 이러한 항체 Fc 영역의 부분들의 조합에 의해 Fc 수용체 및 보체와의 결합능에 있어서 야생형 항체 Fc 영역과 차이를 나타낼 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Exendin"은 도마뱀 Heloderma suspectum의 독에서 분리된 39 아미노산으로 구성된 펩타이드이다. Exendin 4는 GLP-1과 아미노산 서열상 50% 동일하며, 글루카곤 펩타이드 패밀리의 일원으로, GLP-1 수용체의 작용제로서 GLP-1과 동등한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. Exendin 4는 "extenatide"로도 불린다. Exendin 3는 상기 Exendin 4에서 두 번째 및 세 번째 아미노산이 각각 세린 및 아스파르트산으로 치환된 변이체이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Lixisenatide"는 GLP-1 수용체 작용제 중 하나로서, Sanofi사에 의해 제조되어, 유럽에서는 Lyxumia라는 상표명으로, 미국에서는 Adlyxin이라는 상표명으로 제2형 당뇨병 치료를 위한 일일 투여 주사제로 판매되고 있는 약물이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Albiglutide"는 GSK사에 의해 유럽에서는 Eperzan이라는 상표명으로, 미국에서는 Tanzeum이라는 상표명으로 제2형 당뇨병 치료제로 판매되고 있는 GLP-1 수용체 작용제 중의 하나이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Liraglutide"는 Novo Nordisk사에 의해 "Victoza"라는 상표명으로 제2형 당뇨병 및 비만 치료제로 판매되고 있는 피하주사형 GLP-1 수용체 작용제이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Taspoglutide"는 Ipsen사와 Roche사에 의해 공동개발된 GLP-1 수용체 작용제로 제2형 당뇨병 치료제로, GLP-1(7-36) 펩타이드의 8번째 및 35번째 아미노산인 알라닌이 메틸화되어 있고 마지막 아미노산이 아마이드화되어 있는 GLP-1 유도체이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "XTEN"은 Amunix사에 의해 개발된 단백질 의약품의 생체 내 반감기를 향상시키기 위해 부가되는 6개의 아미노산을 포함하는 비구조화된(unstructed) 저면역원성 펩타이드로서 통상 144 a.a.를 단위로 하여 그의 배수의 아미노산으로 구성되어 있다(US20100239554A1).
본 문서에서 사용되는 용어 "링커 펩타이드"는 둘 이상의 다른 생물학적 활성을 가진 단백질 또는 펩타이드를 연결하여 융합단백질을 제조할 사용되는 비구조화된 펩타이드이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "융합단백질"은 둘 이상의 다른 생물학적 기능을 갖는 폴리펩타이드 또는 도메인이 직접 또는 링커 펩타이드에 의해 연결되어 두 가지 생물학적 기능을 동시헤 발휘하는 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "이중 특이성 이량체 융합단백질"은 상기 융합단백질 중 분자간 상호작용에 의해 동형 이량체의 구조를 갖는 단백질을 의미한다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, ⅰ) GLP-1 또는 그의 유사체 및 IL-10 단백질 ⅱ) GLP-1 또는 그의 유사체가 IL-10 단백질에 연결된 융합단백질 또는 iii) 항체 Fc 영역의 N-말단에 GLP-1 또는 그의 유사체가 연결되고, 상기 항체 Fc 영역의 C-말단에 IL-10 단백질이 연결된 이중 특이성 이량체 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 조성물에 있어서, 상기 GLP-1 유사체는 GLP-1, 엑센딘 3(Exendin 3), 엑센딘 4(Exendin 4), GLP-1/Exendin 4 하이브리드 펩타이드, GLP-1-XTEN, Exendin 4-XTEN, Lixisenatide, Albiglutide, Liraglutide, 또는 Taspoglutide일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 GLP-1은 서열번호 6 또는 7으로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 Exendin 3는 서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 Exendin 4는 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 GLP-1/Exendin 4 하이브리드는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 Lixisenatide는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 Exendin 4-XTEN은 서열번호 11로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 Albiglutide는 서열번호 12로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 Liraglutide는 서열번호 13로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 Taspoglutide는 서열번호 14로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 융합단백질은 상기 GLP-1 또는 GLP-1 유사체와 IL-10 단백질 사이에 항체 Fc 영역을 포함할 수 있으며, 상기 항체 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 IgD의 Fc 영역 또는 2종 이상의 아이소타입의 Fc 영역이 혼합된 하이브리드 항체 Fc 영역일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 항체 Fc 영역은 서열번호 2, 15 내지 19로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 악학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있고, 상기 담체 외에 약학적으로 허용가능한 보조제, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 포유동물에 투여 시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들면, 경구, 비경구, 예를 들면 좌제, 경피, 정맥, 복강, 근육 내, 병변 내, 비강, 척추관 내 투여로 투여될 수 있으며, 또한 서방형 또는 연속적 또는 반복적 방출을 위한 이식장치를 사용하여 투여될 수 있다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코즈 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
상기 조성물의 환자에 대한 투여량은 환자의 신장, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물들을 포함하는 많은 요소들에 따라 다르다. 약학적으로 활성인 단백질은 100 ng/체중(kg) - 10 ㎎/체중(㎏)의 양으로 투여될 수 있고, 더 바람직하게는 1 내지 500 ㎍/kg(체중)으로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 5 내지 50 ㎍/kg(체중)으로 투여될 수 있는데, 상기 요소들을 고려하여 투여량이 조절될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 ⅰ) GLP-1 또는 그의 유사체 및 IL-10 단백질 ⅱ) GLP-1 또는 그의 유사체가 IL-10 단백질에 연결된 융합단백질 또는 iii) Fc 영역의 N-말단에 GLP-1 또는 그의 유사체가 연결되고, 상기 Fc 영역의 C-말단에 IL-10 단백질이 연결된 이중 특이성 이량체 융합단백질을 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염 치료방법이 제공된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "치료적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg일 수 있으나, 유효 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예
연구재료 및 방법
1) 실험동물
중앙실험동물을 통하여 C57BL6/J 마우스[20-25g, 5주령 (CD-HFD) 또는 9주령 (CDA-HFD), 수컷)을 구입하고, 동물들은 사료와 식수를 자유로이 공급받고, 온도와 빛이 조절되는 사육장(23±1℃, 08:00에 조명을 켜는 12:12h 명/암 주기)에서 실험 시작 7일 전부터 순응시켰다.
2) 식이 유도 비알코올성 지방간염 동물 모델 및 약물 투약
① CD-HFD 유도 NASH 모델: 6주령 마우스에 17주 동안 CD-HFD (choline-deficient high fat diet, 45% kcal fat) 식이를 급이하였다. 5.5주부터 10주까지 약 4.5주동안 Fructose(23.1g/L)+Glucose(18.9g/L) 식수를 공급하였다. CD-HFD 식이 공급 13주 후 마우스는 무작위로 4군[CD-HFD, GLP-1, GLP-1+IL-10(Combo), GLP-1-hyFc-IL-10V(MD100)]으로 나누고, Chow 군과 CD-HFD 군에는 식염수, GLP-1(5 nmol/kg), Combo(5+5 nmol/kg), MD100(5 nmol/kg)을 3일마다 피하로 4주간 투약하고 매주 체중을 측정하였다.
② CDA-HFD 유도 NASH 모델: 10주령 마우스에 8주 동안 CDA-HFD(콜린-결핍, L-아미노산-제한 고지방 식이, 60 kcal% fat)식이를 공급하였다. CDA-HFD 식이 공급 5주 후 마우스는 무작위로 7군(CDA-HFD, GLP-1, IL-10, Combo, 10 nmol MD100, 20 nmol MD100, 40 nmol MD100)으로 나눈 후 Chow 군에는 식염수, CDA-HFD(hyFc M1, backbone), GLP-1(10 nmol/kg), IL-10(10 nmol/kg), Combo(10+10 nmol/kg), MD100(10, 20, 40 nmol/kg)을 2일마다 피하로 3주간 투약하고 매주 체중을 측정하였다.
3) 복강 당부하 검사(IPGTT) 및 인슐린 저항성 검사(ITT)
① IPGTT: 마우스를 6시간 동안 금식 시키고, 복강에 2 g/kg D-글루코오스를 투여하였다. 혈당 측정기를 이용하여 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120분 간격으로 혈당수준을 측정하였다.
② ITT: 마우스를 4시간 동안 금식 시키고, 복강에 0.5 U/kg 인슐린을 투여하였다. 혈당 측정기를 이용하여 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120분 간격으로 혈당수준을 측정하였다.
4) 혈액 화학 분석
마우스에서 채취된 혈액을 원심분리기를 이용하여 혈청을 분리하였다. 혈청 10 ㎕ 내의 중성지방(Triglyceride; TG), 총 콜레스테롤(TCHO), 총 빌리루빈(TBIL), 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈(ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼레이즈(AST)의 함량을 자동 임상 화학 분석기(FUJI DRI-CHEM 4000i, Japan)를 이용하여 측정하였다.
5) 조직학적 분석
① 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색: 마우스의 간 조직을 10% 포르말린에 24시간 동안 고정시킨 후 파라핀에 포매시켜 파라핀 블럭을 만들었다. 5 μm 두께로 조직을 잘라 H&E 염색하였다.
② 시리우스 레드 염색: 시리우스 레드(Sirius Red) 염색은 Picrosirius Red Stain Kit (#24901A-250, #24901B-250, Polysciences Inc., Warrington)를 이용하여 수행되었으며, 방법은 제조업체의 지침에 따라 진행되었다.
6) 간 트리글리세라이드
30 mg의 간 조직을 균질화한 후 EnzyChrom Triglyceride Assay Kit (#ETGA-200, Bioassay)을 이용하여 간 트리글리세라이드 함량을 측정하였으며, 구체적인 방법은 제조업체의 지침에 따라 수행되었다.
7) 하이드록시프롤린 분석
10 mg의 간 조직을 균질화한 후, Hydroxyproline Colorimetric Assay Kit (#K555, Biovision)을 이용하여 하이드록시프롤라인 함량을 측정하였으며, 구체적인 방법은 제조업체의 지침에 따라 진행되었다.
8) 세포배양
① AML12 세포는 10% 우태아 혈청(FBS, Hyclone, HS3243.01)과 1% Insulin-Transferrin-Selenium-A(ITS, Gibco, 51300-044), 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 DMEM에 온도 37℃, 5% CO2가 공급된 배양기에서 배양하였다.
② 3T3-L1 세포는 10% 송아지 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 DMEM에 온도 37℃, 5% CO2가 공급된 배양기에서 배양하였다.
9) 3T3-L1 세포분화
6x104개의 3T3-L1 지방전구세포를 60 mm 배양접시에 접종하였다. 2일마다 배양액을 교체해주면서, 포화후 2일이 경과한 날에 10% FBS, 520 ㅅM IBMX, 1 ㅅg/ml 인슐린, 및 1 ㅅM 덱사메타손을 포함한 DMEM 배지로 교체하였다. 그리고 2일에 한번씩 다음과 같은 순서로 배양액을 교체하였다. 1) 10% FBS와 1 ㅅg/ml 인슐린을 포함한 DMEM 배지, 2) 10% FBS만 포함된 DMEM 배지, 및 3) 10% FBS만 포함된 DMEM 배지로 교체 해주고, 2일 더 배양하였다.
10) 팔미트산(PA) 및 올레산(OA) 처리
① PA 처리: 1% BSA를 포함한 DMEM 배양액에 160 mM의 팔미트산(Sigma Aldrich, P0500)를 500 μM이 되도록 섞어서 처리하였다.
② OA 처리 방법: 1% BSA를 포함한 DMEM 배양액에 1 M의 올레산(Sigma Aldrich, O1008)를 200 μM이 되도록 섞어서 처리하였다.
11) 분자세포생물학적 분석
① 면역블랏 분석: 준비된 세포를 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루로라이드(PMSF; Sigma Aldrich, 10837091001), 10% 글리세롤, 0.1% Triton X-100(Sigma Aldrich, T8787), 1 mM 에틸렌디아민테트라아세이트(EDTA), 0.5% IGEPALㄾ CA-630(Sigma Aldrich, 56741), 10 mM β-포스포글리세라이드, 1 mM Na3V04, 5 mM NaF, 1 mg/ml of 아프로티닌(Sigma Aldrich, 10236624001) 및 류펩틴(Sigma Aldrich, L8511)을 포함하는 용해 완충액을 사용하여 용해시켰다. 준비된 용해물을 SDS-PAGE 겔을 이용하여 전기영동시켜, 단백질을 크기 별로 분리한 후, 폴리비닐리덴 디플루오로라이드 막(PVDF; Merk Millipore, L-IPVH 00010)으로 단백질을 전사시켰다. 그 다음, 단백질의 발현을 알아보기 위해서, 1차 항체를 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이어서, HRP-결합 2차 항체를 상온에서에서 1시간 동안 반응시켰였다. 이후, 단백질의 발현을 화학발광 키트(Thermo Fisher Scientific, 34580)를 이용하여 확인하였다. 사용된 항체는 다음과 같다. 항-β-액틴 항체(Santa Cruz Biotechnology, sc-47778); 항-절단형 카스페이즈-3 항체(Cell Signaling Technology, 9661S), 항-절단형 PARP 항체(Cell Signaling Technology, 9544S), 항-p-NF-kB 항체(Cell Signaling Technology, 3033S), 항-NF-kB 항체(Cell Signaling Technology, 8242S), 항-PPARγ 항체(Cell Signaling Technology, 2430S).
② Quantitative RT-PCR분석 방법
준비된 세포에 TRIzolㄾ 시약(MRC, TR 118)에 Ribonuclease Inhibitor(Sigma Aldrich, R1158)를 처리하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA(1 μg)에 역전사를 위해 무작위 헥사머 프라이머와 TAKARA cDNA 합성 키트(TaKaRa, RR036A)를 이용하여 cDNA를 합성했다. 합성된 cDNA는 SYBRㄾ Green(ABI, 4367659) 과 하기 표 1에 기재된 마우스 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 정량적 PCR분석을 수행하였다.
RT-PCR에 사용된 프라이머 정보
유전자 프라이머 방향 핵산 서열(서열번호)
TNF-α 포워드 5'-GCCACCACGCTCTTCTG-3' (20)
리버스 5'-GGTGTGGGTGAGGAGCA-3' (21)
IL-6 포워드 5'-ACAACCACGGCCTTCCCTAC-3' (22)
리버스 5'-CACGATTTCCCAGAGAACATGTG-3' (23)
IL-1β 포워드 5'-AACCTGCTGGTGTGTGACGTTC-3' (24)
리버스 5'-CAGCACGAGGCTTTTTTGTTGT-3' (25)
PPARγ 포워드 5'-CTCTCAGCTGTTCGCCAA-3' (26)
리버스 5'-CACGTGCTCTGTGACGATCT-3' (27)
CEBPα 포워드 5'-CTGGCTCTGGGTCTGGAA-3' (28)
리버스 5'-AGCCACAGGGGTGTGTGT-3' (29)
aP2 포워드 5'-CCGCAGACGACAGGAAGG-3' (30)
리버스 5'-AGGGCCCCGCCATCT-3' (31)
18S 포워드 5'-CGCTCCCAAGATCCAACTAC-3' (32)
리버스 5'-CTGAGAAACGGCTACCACATC-3' (33)
5) BODIPY 염색
준비된 세포를 4% 파라포름알데하이드에 상온에서 15분 동안 고정 시킨 후, BODIPY 염색시약(1 μg/ml, Thermo Fisher Scientific, USA)로 상온에서 20분 염색한 후 공초점 현미경으로 지방을 관찰하였다.
6) Oil red O 염색
Oil red O(ORO) 작용 용액은 이소프로파놀에 용해된 0.5% ORO와 탈이온수를 3:2의 비율로 혼합함으로써 준비하였다. 준비된 ORO 작용 용액을 4% 포름알데하이드로 15분 동안 고정시켜 준비한 세포에 배양접시(60 mm 기준)당 1 ml 첨가한 후 상온에서 2시간 반응시켰다. 2시간 후, 탈이온수로 세척한 후 현미경으로 관찰하였다. 그리고, 1 ml의 이소프로판올을 첨가하고 5분간 반응시킨 후 500 nm로 흡광도를 측정하여 트리글리세라이드(TG)의 축적정도를 정량적으로 측정하였다.
실시예 1: 이중 특이성 융합단백질의 고안
본 발명자들은 GLP-1 또는 GLP-1 유사체가 hyFc 영역에 의해 IL-10 변이체(IL-10V)에 의해 연결된 GLP-1-hyFc-IL-10V 단백질을 암호화하는 유전자 컨스트럭트를 고안하였다.
구체적으로 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 GLP-1/Exendin 4 하이브리드, 서열번호 2로 기재되는 hyFc 영역 및 서열번호 3으로 기재되는 IL-10V를 각각 서열번호 4 및 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 링커 펩타이드에 의해 연결되도록 한 이중 특이성 융합단백질을 고안한 후, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 합성하거나 PCR로 증폭하여 제조한 후, GLP-1/Eendin-4 sub-vector, hyFc sub-vector, 및 IL-10V sub-vector 및 골격벡터(pBispecific vector, Genexine, Inc.)에 서브클로닝한 후, 한 tube에서 반응시켜 최종 벡터 컨스트럭트를 제조하였다. 병용 효과를 확인하기 위해 GLP-1-hyFc와 hyFc-IL-10V를 별도로 고안하여 사용하였다. 상기와 같이 제조된 벡터 컨스트럭트들을 Thermo Fisher사의 ExpiCHO kit를 이용하여 일시적 발현을 수행하였다. 구체적으로 ExpiCHO-S cell에 상기와 같이 제조된 벡터 컨스트럭트와 키트 내에 포함되어 있는 ExpiFectamine 시약을 혼합한 후 8% CO2 및 37℃의 조건을 갖춘 배양기에서 1일간 배양 후 온도를 32℃로 낮춰서 7일 차까지 배양을 진행하였다.
상기 배양을 통해 얻어진 상층액을 Protein A 칼럼 및 이차 칼럼을 통해 정제된 융합단백질(각각, 'GLP-1-hyFc', 'hyFc-IL-10V', 'MD100'으로 명명함)을 4X LDS 시료 완충액과 주사용수로 적절히 희석하여 최종 3-10 μg/20 μL이 되도록 조제하였다. 환원조건 시료의 경우 각 분석하고자 하는 물질과 4X LDS 시료 완충액, 10X 환원제와 주사용수를 적절히 희석하여 최종 3-10 μg/20 μL이 되도록 조제하고 70℃ 가열블록에서 10분간 가열하였다. 준비된 시료를 미리 설치된 전기영동 장비에 고정된 겔의 각 웰에 20 μL씩 적재하였다. 사이즈 마커의 경우 3~5 μL/well을 적재하였다. 전원공급장치를 120 V, 90분으로 설정한 후 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 완료된 겔을 분리한 후 염색용액 및 탈-염색 용액을 이용하여 염색하고, 결과를 분석하였다. 그 결과, 도 1에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질은 정상적으로 발현이 됨을 확인할 수 있었다. 이후, 상기 확보된 이중 특이성 융합단백질을 암호화하는 유전자 컨스트럽트를 pAD15 발현벡터(WO2015/009052A)에 삽입한 후, CHO DG44(from Dr. Chasin, Columbia University, USA) 세포에 형질감염시킨 후, 이중 특이성 융합단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 구축하였다.
실험예 1: 시험관 내 GLP-1 활성 분석
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 정제된 융합단백질이 GLP-1 활성을 정상적으로 나타내는지 여부를 확인하기 위해, 상기 실시예에서 제조된 이중 특이성 융합단백질의 GLP-1 시험관내(in vitro) 활성을 cAMP 분석으로 조사하였다. 구체적으로, GLP-1 특이적인 반응에 의해 cAMP가 유도되는 정도를 평가하기 위해, cAMP HunterTM eXpress GLP1R CHO-K1 GPCR Assay kit(DiscoverX, Cat# 95-0062E2CP2M)를 사용하였다. cAMP HunterTM eXpress Assay cell을 96 웰 플레이트에 접종하여 16 시간 배양 후, MD100 및 GLP-1-hyFc와 liraglutide를 0.1~10 nM 농도로 처리하여 30분간 배양하였다. 항-cAMP 항체와 cAMP 검출시약을 넣고 1 시간 이후에 발광신호(luminescent signal)를 측정하여 약물의 생물학적 활성(EC50)을 평가하였다.
그 결과, 도 2 및 표 1에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 MD100은 시판되는 GLP-1 유사체인 Liraglutide와 거의 동등한 GLP-1 활성을 나타냈다. GLP-1-hyFc에서도 동일한 결과가 나타났고, 이는, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질에 포함된 GLP-1이 정상적으로 작용함을 입증한 결과이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질의 GLP-1 활성 분석
GLP-1-hyFc
(GX-G6)		 Liraglutide MD100
(GLP-1-hyFc-IL-10V)
1차 EC50 (nM)
(GLP-1-hyFc 대비 상대적 활성)		 0.257
(100%)		 0.230
(112%)		 0.268
(95.9%)
R2 0.998 0.997 0.998
2차 EC50 (nM)
(GLP-1-hyFc 대비 상대적 활성)		 0.303
(100%)		 0.250
(121%)		 0.314
(96.5%)
R2 0.993 0.939 0.995
평균 EC50 (nM) 0.280±0.03 0.240±0.01 0.291±0.03
상대활성 100% 116% 96.2%
실험예 2: 시험관 내 IL-10 활성 분석
본 발명자들은 이어 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 융합단백질이 IL-10 단백질로서의 기능을 제대로 발휘할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 시험관 내 조건에서 IL-10 활성을 분석하였다.
구체적으로, 마우스 골수유래 비만 세포(BMMC)을 이용하여 디니트로페닐(dinitrophenyl, DNp)-BSA에 특이적인 항체 IgE(anti-DNP IgE) 1 μg/ml을 다양한 농도(0, 10, 100 및 1000 pM)의 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(MD100)과 함께 처리하여 TNF-α 분비를 유도하고, 1일이 경과한 후에 상기 항원(DNp-BSA) (Sigma #A6681,USA) 1 μg/ml을 처리하고 1일 경과 후에 TNF-α 분비 억제능을 세포배양액을 대상으로 한 항-TNF-α 항체(abchem, USA)를 이용한 ELISA를 통해 분석하였다. 대조군으로 시판중인 rhIL-10(Peprotech, USA)과 상기 실시예 1에서 제조된 hyFc-IL-10V를 사용하였다. 그 결과, 도 3에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질은 시판 rhIL-10이나 hyFc-IL-10V와 동등한 정도의 TNF-α 분비 억제능을 나타냈으며, 저 농도에서는 상대적으로 더 우수한 TNF-α 분비 억제능을 나타냈다. 이는, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질이 정상적인 IL-10의 기능을 발휘함을 입증하는 것이다.
실험예 3: IL-10R 수용체 결합력 평가
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질(MD100)에 대해 IL-10 수용체와의 결합력을 확인하기 위해 Octet Assay System(Octet K2, ForteBio, USA)을 이용한 생체-층 간섭법(Bio-layer Interferometry, BLI)을 이용하여 결합동역학(binding kinetics)을 측정하였다. 이를 위해 구체적으로, 아민 반응성 2세대(AR2G) 바이오센서(Fortebio, USA)에 IL-10 수용체를 고정화한 뒤 상기 Octet Assay System 장치에 적재하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(MD100)의 결합속도상수(Ka)와 해리속도상수(Kd) 산출을 통해 결합상수(KD)를 산출하였으며, 대조군으로는 시판중인 재조합 인간 IL-10(rhIL-10; Peprotech, USA)을 사용하였다.
그 결과 도 4 및 표 2에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질의 결합속도 상수(Ka)는 재조합 인간 IL-10의 그것과 유사한 반면, 해리속도 상수(Kd)는 재조합 인간 IL-10의 그것이 더 높게 나타났다. 그러나 전체적으로 볼 때 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질의 IL-10 수용체에 대한 결합상수(KD)는 재조합 인간 IL-10의 그것과 거의 동등한 수준인 것으로 확인되었다.
본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질의 IL-10 수용체와의 결합력 분석결과
시료 rhIL-10 MD100
평균 KD (nM) 46.5 61.35
평균 Ka (1/Ms) 56500±1050 12850±495
평균 Kd (1/s) 0.0026±0.0002 0.0008±0.0001
평균 R2 0.95 0.98
실험예 4: 약물동력학(pharmacokinetics) 분석
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질이 생체 내에서 장기간 체류하는지 여부를 조사하기 위해, 약물동력학 분석을 수행하였다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(MD100)을 0.5, 및 1.5 mg/kg의 투여량으로 각각 야생형 랫트에 피하투여하였다(n=3). 그리고 투여 전, 투여 후 1, 5, 10, 24, 48, 72, 120, 및 168 시간에 채혈하여 혈청 내 MD100의 농도를 hyFc 특이적 항체를 이용한 ELISA 분석으로 측정한 후 Winnolin S/W를 이용하여 PK 파라미터를 산출하였다. 그 결과, 도 5 및 표 3에서 확인되는 바와 같이, Cmax는 2530.3 ~ 5533.3 ng/mL, 반감기(t1/2)는 21~98 hr로 충분한 생체 내 노출과 지속성을 가짐을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질의 약물 동력학적 프로파일
투여량 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(hr)		 Clast
(ng/mL)		 t1/2
(hr)		 AUClast
(ng×hr/mL)
0.5 mg/kg 2530.27
± 208.62		 48.00
± 0.00		 445.03
± 10.47		 21.3 ± 4.03 408186.33
± 14791.41
1.5 mg/kg 5533.29
± 901.50 		56.00
± 13.86		 1066.11
± 130.01		 98.4
± 18.6		 1001119.24
± 75675.59
실험예 5: 단회 독성 분석
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질의 단회 독성을 분석하기 위해, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(MD100)을 다양한 투여량으로 야생형 랫트에 1회 피하투여함으로써 최대 내성 투여량 및 혈청학적 변화 및 표적 기관의 형태적 변화 등을 조사하였다.
시험 결과, 표 4에서 나타난 바와 같이, 임상증상, 육안 관찰, 혈청학적 검사에서 약물 투여와 관련된 변화는 관찰되지 않았다. 체중의 경우 투여 후 2일째 약물 투여 전과 비교하여 대부분 감소하는 양상을 나타냈으며, 이는 사료 섭취량 감소를 동반하였다. 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질 내에 포함된 GLP-1의 약리학적 작용으로 식욕 감소로 인한 체중 감소로 판단되며 독성학적 의미는 크지 않다고 판단된다.
장기의 중량 분석결과 웅성 고용량군에서는 대조군과 비교하여 비장의 중량 증가 및 흉선 중량의 감소가 확인되었는데, 이는 이미 알려진 IL-10의 독성시험에서 2 mg/kg 이상 투여에서 관찰된 결과와 일치하는 것이다. 비장 증대의 경우, 인간 재조합 IL-10과 같은 이종 사이토카인으로 인해 면역학적 반응으로 인한 약리학적 작용이라고 판단된다. 흉선의 경우, 보고된 조직병리학적 변화로, 피질 세포사멸이 발생하였으며, 이러한 변화는 8 mg/kg으로 2주간 반복투여한 시험에서는 관찰되었으나 3개월 이상의 장기시험에서는 관찰되지 않았다. 또한 림프구의 수와 연관되지 않고 기능에 영향을 주지 않은 점과 대조군에서도 발견되는 점으로 미루어 볼 때, 일시적인 현상으로 판단되었다. 결론적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(MD100)은 0.5, 5, 50 mg/kg을 단회 투여한 시험에서 최고 투여량인 50 mg/kg까지 독성학적 영향은 관찰되지 않아 최대 내성 투여량은 50 mg/kg 이상으로 판단된다.
단회 독성 평가 실험군 설정
실험군 물질 농도(mg/kg) 투여경로 투여량 실험두수(암/수)
1 대조군
(제형 완충액)		 0 피하(s.c) 5 ml/kg 6/6
2 MD100 0.5 6/6
3 MD100 5 6/6
4 MD100 50 6/6
실험예 6: CD-HFD 유도 NASH 마우스 모델에서 체중, 지방 및 포도당 항상성에 대한 GLP-1+IL-10(Combo) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 특이성 융합단백질의 효과
CD-HFD 유도 NASH 마우스 모델에서 에너지 대사에 대한 GLP-1+IL-10(Combo)와 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(MD100)의 효과를 알아보기 위하여 본 발명자들은 총 17주 동안 CD-HFD를 급이하고 13주부터 17주까지 4주간 GLP-1, Combo 또는 MD100을 마우스에 피하로 투여하였다. GLP-1, Combo, MD100 군 모두 CD-HFD 군과 비교하여 4주 처리시 체중이 유의적으로 감소하였으며(도 6A), 2주 처리 후부터 Combo와 MD100군에서 몸무게 감소가 관찰되었다(도 6B). 혈중 중성지방 (TG)는 Combo군은 CD-HFD 군과 비교하여 통계학적으로 감소하였다(도 6C). 그러나 혈중 총 콜레스테롤(TCHO)은 CD-HFD 군과 비교하여 Combo 군에서 유의적으로 감소하는 효과는 보지 못하였으며(도 6D), 총 빌리루빈(TBIL)의 수치는 증가하는 경향을 보였다(도 6E). 아울러, 포도당 항상성에 대한 Combo와 MD100의 역할을 알아보기 위하여 본 발명자들은 인슐린 저항성과 당부하 실험을 수행하였다. 그 결과, CD-HFD 군과 비교하여 Combo 투여군과 MD100 투여군에서 인슐린 저항성과 포도당 부하를 향상시킬 수 있었다(도 6F 및 6G). 또한 금식 후의 마우스의 혈당은 GLP-1 투여군과 Combo 투여군에서 개선되는 것을 확인하였다(도 6H). 종합적으로, 이들 데이터는 Combo와 MD100이 체중 및 혈당 조절에 잠재적인 치료 효과를 가지고 있음을 시사한다.
실험예 7: CD-HFD 유도 NASH 마우스 모델에서 간 지방증 및 염증에 대한 Combo 및 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질의 효과 분석
본 발명자들은 CD-HFD 유도 NASH 마우스 모델에서 간에서의 지질 축적에 대한 GLP-1 및 IL-10의 병용투여(Combo)와 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(MD100)의 효과를 알아보기 위하여 간 조직에서 지방 함량을 조사하였다. 그 결과, 도 7에서 확인되는 바와 같이, Chow 그룹(일반 Chow 급이를 섭취시킨 음성 대조군 그룹)에 비하여 CD-HFD 군의 간은 더 크고 지방으로 인하여 색이 하얗게 관찰되었으나, CD-HFD 군에 비하여 GLP-1, Combo, MD100 투여군에서 간의 크기가 작아졌고, 색깔도 진한 적색으로 관찰되었다. H&E 염색을 수행한 결과, GLP-1 투여군, Combo 투여군, MD100 투여군에서 모두 CD-HFD 모델과 비교하여 지방 방울(fat droplet)의 감소를 확인할 수 있었다(도 7A). 또한 간 무게 (도 7B) 및 간 대 체중 비율(도 7C)도 CD-HFD 군에 비교하여 GLP-1 투여군, Combo 투여군 및 MD100 투여군에서 유의하게 감소되었다. 간의 TG 함량 역시 GLP-1 투여군, Combo 투여군 및 MD100 투여군에서 감소되었다(도 7D). 혈청의 간 염증 지표인 ALT 수준의 경우 GLP-1 투여군은 CD-HFD 군과 비교하여 변화가 없었지만, Combo 투여군과 MD100 투여군은 유의하게 감소하였다(도 7E). 반면 AST 수준은 그룹간의 차이가 나타나지 않았다(도 7F). 아울러, 본 발명자들은 CD-HFD 유도 NASH 마우스 모델에서 GLP-1 투여군과 Combo 투여군의 염증억제 효과를 알아보기 위해서, 마우스 간 조직을 이용한 qRT-PCR 실험을 수행하였다. 그 결과, Combo 투여군 및 MD100 투여군의 염증 표적 유전자의 유의한 발현억제 효과는 관찰할 수 없었다(도 7G-7I). 위의 결과를 바탕으로 Combo 투여군과 MD100 투여군은 CD-HFD으로 유도되는 NASH 마우스의 간 조직에서 지질 축적을 감소시키는데 효과적임을 알 수 있었다.
실험예 8: CDA-HFD 유도 NASH 마우스 모델에서 GLP-1 및 IL-10의 병용투여(Combo)가 간 지방증 및 염증에 미치는 영향
본 발명자들은 CDA-HFD 유도 NASH 마우스 모델에서 GLP-1 및 IL-10의 병용투여(Combo)가 간에서의 TG 및 섬유증에 미치는 효과를 알아보기 위하여 간 조직에서 지방 함량을 조사하였다. Chow 군에 비하여 CDA-HFD 군의 간은 더 크고 지방으로 인하여 색이 하얗게 관찰되었으며, CDA-HFD 군에 비하여 GLP-1 투여군과 Combo 투여군에서 간의 크기가 작아졌고, 간의 색이 짙어지는 것이 관찰되었다(도 8A, 상단). 상기 결과와 상응하게, H&E 염색을 수행한 결과, GLP-1 투여군과 Combo 투여군에서 모두 지방 방울이 감소되는 것이 관찰되었다(도 8A, 하단). 간 무게(도 8B) 및 간 대 체중 비율(도 8C)은 CDA-HFD 군에 비교하여 GLP-1 투여군과 Combo 투여군에서 유의하게 감소하였다. 간의 TG 함량은 Chow 군과 비교하여 CDA-HFD 군에서 유의하게 증가하였으나 GLP-1 투여군 및 Combo 투여군에서는 개선 효과가 나타나지 않았다(도 8D). 혈청의 간 염증 지표인 ALT 수준은 GLP-1 투여군과 Combo 투여군에서 CDA-HFD 군과 비교하여 유의하게 감소하였으며(도 8E). AST 수준은 Combo 투여군에서만 개선 효과를 나타내었다(도 8F). CDA-HFD 유도 NASH 마우스 모델에서 Combo 투여군의 염증억제 효과를 알아보기 위해서, 마우스 간 조직을 이용한 qRT-PCR 실험을 수행한 결과, GLP-1 투여군, IL-10 투여군, Combo 투여군에서 염증 표적 유전자의 발현 억제 효과가 있는 것을 관찰할 수 있었다(도 8G-8I). 이러한 데이터는 CDA-HFD에 의해 유도되는 NASH 모델에서 Combo 투여군이 간 지방증 및 염증 감소에 효과적이라는 것을 시사한다.
실험예 9: CDA-HFD 유도 NASH 마우스 모델에서 MD100이 대사 프로파일에 미치는 영향
CDA-HFD 유도 NASH 마우스 모델에서 MD100의 투여량에 따른 대사 프로파일의 변화를 알아보기 위하여 본 발명자들은 총 8주 동안 CDA-HFD를 급이하고 5주부터 8주까지 3주간 다양한 농도의 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(10, 20, 40 nmol/kg, MD100)를 마우스에 피하투여하였다. 그 결과 모든 MD100 투여군에서 CDA-HFD 군과 비교하여 1주와 2주는 유의하게 감소하였으나, 3주 투여 후 20 nmol MD100은 CDA-HFD 군과 비슷하게 무게가 회복되었다(도 9A 및 9B). 약물 투여 전과 후를 비교하였을 때, Chow, CDA-HFD 및 20 nmol MD100 투여군에서 혈당수준의 차이가 관찰되지 않았으나 10 nmol MD100 투여군은 투여 후 혈당수준이 증가하였고, 40 nmol MD100 투여군은 투여 후 혈당수준이 감소하였다(도 9C). 그러나 CDA-HFD 군과 비교시 약물 투여 후 모든 실험군에서 혈당수준이 감소하였다(도 9D).
실험예 10: CDA-HFD 유도 NASH 마우스 모델에서 MD100이 간 지방증 및 염증에 미치는 영향
CDA-HFD 유도 NASH 마우스 모델에서 간에서의 지질 축적 및 섬유증에 대한MD100의 용량 의존적 효과를 알아보기 위하여 본 발명자들은 간 조직에서 지방 함량을 조사하였다. Chow 그룹에 비하여 CDA-HFD 군의 간은 더 크고 지방으로 인하여 색이 하얗게 관찰되었으나, CDA-HFD 군에 비하여 40 nmol MD100 투여군에서 간의 크기가 작아지는 것과, 색이 약간 짙어지는 것이 관찰되었다(도 10A, 상단). 그러나 H&E 염색결과, 10, 20 및 40 nmol MD100 투여군에서 지방 방울은 감소되지 않았다(도 10A, 하단). 간 무게는 CDA-HFD 군과 비교하여 10 nmol 투여군과 40 nmol MD100 투여군 모두에서 유의하게 감소하였으나(도 10B), 간 대 체중 비율은 Chow 군과 비교하여 모든 그룹에서 증가하였다(도 10C). 간의 TG 함량은 Chow 군과 비교하여 CDA-HFD 군에서 유의하게 증가하였으나, 10 nmol 및 40 nmol MD100 투여군에서는 개선 효과가 나타나지 않았으며, 오히려 20 nmol MD100 투여군에서 증가하였다(도 10D). 혈청의 간 염증 지표인 ALT 수준은 40 nmol MD100 투여군에서 CD-HFD 군과 비교하여 유의하게 감소하였으며(도 10E), AST 수준 역시도 40 nmol MD100 투여군에서 개선 효과가 나타났다(도 10F). CDA-HFD 유도 NASH 마우스 모델에서 MD100의 투여량에 따른 염증 억제 효과를 알아보기 위해서, 마우스 간 조직을 이용한 qRT-PCR 실험을 수행한 결과, MD100의 투여량에 따라서 염증 표적 유전자의 발현이 감소됨을 관찰할 수 있었다(도 10G-10I). 이러한 데이터는 CDA-HFD에 의해 유도되는 NASH 모델에서 MD100이 간 지방증 및 염증 감소에 효과적이라는 것을 시사한다.
실험예 11: CDA-HFD 유도 NASH 마우스 모델에서 MD100이 간 섬유증에 미치는 영향
CDA-HFD 유도 NASH 마우스 모델에서 MD100이 간 섬유증을 개선시키는 효과를 나타내는지 알아보기 위하여, 본 발명자들은 시리우스 레드(Sirius Red) 염색 및 하이드록시프롤린 분석을 수행하였다. CDA-HFD, 10 nmol, 20 nmol MD100 군은 Chow 군에 비하여 콜라겐 양이 증가하는 것으로 관찰되었으며, 40 nmol MD100 군에서 간 섬유증의 개선을 확인할 수 있었다(도 11A). 반면 하이드록시프롤린 분석을통하여 정량적인 분석을 하였을 때, CDA-HFD 군은 Chow 군에 비하여 콜라겐 양이 유의하게 증가하였으나 10, 20, 및 40 nmol MD100 투여군에서 억제 효과는 관찰되지 않았다(도 11B).
실험예 12: 팔미트산(PA)를 이용한 시험관 내 지방독성 모델에서의 GLP-1 및 IL-10의 Combo 및 MD100의 효과 규명
팔미트산(PA)은 인간 혈장에 가장 많이 존재하는 포화 지방산으로 알려져 있으며, 활성산소의 생성을 촉진시켜, 세포사멸을 유도한다. 팔미트산에 의한 세포사멸 유도현상을 "지질독성(lipotoxicity)"라고 지칭하며, 이는 비알코올성 지방간염의 발병(pathogenesis)을 증가시키는 주요 원인으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 시험관내 지질독성 모델을 이용하여 GLP-1 기반 후보 물질들이 지질독성을 억제할 수 있는지 알아보기 위하여 팔미트산을 세포에 처리한 후 세포 생존도를 측정하는 한편, 면역블랏 분석을 수행하였다. 그 결과, PA 단독 처리군에 비하여, GLP-1 및 IL-10 병용 처리군에서 세포 생존도가 가장 증가하는 것을 확인하였다(도 12A). 아울러, 상술한 결과와 상응하게, 세포사멸 표지자(marker)로 알려진 절단형 Caspase-3와 PARP의 발현 역시 GLP-1 및 IL-10의 병용 처리군에서 가장 감소함을 확인할 수 있었다(도 12B).
실험예 13: 골수-유래 대식세포(BMDM)을 이용한 시험관 내 염증 모델에서의 Combo 및 MD100의 효과 규명
비알코올성 지방간염은 염증을 동반하고, 지속된 염증에 의하여 병증이 가속화된다고 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 BMDM에 LPS를 처리하여 염증을 유도한 시험관 내 염증 모델을 이용하여 GLP-1 및 IL-10 병용 처리(Combo)와 본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질(MD100)의 항-염증 효과를 qPCR 실험과 면역블랏 분석을 통해 조사하였다. 그 결과, GLP-1 및 IL-10의 병용 처리군(Combo)과 MD100 처리군에서 전-염증성 경로인 NF-kB 신호전달이 억제되는 것을 확인하였고(도 13A), 이러한 결과와 상응하게, 전-염증성 표적 유전자인 TNF-α(도 13B), IL-6(도 13C) 및 IL-1β(도 13D)의 발현 역시 감소되어 있는 것을 확인하였다.
실험예 14: 올레산(OA)을 이용한 시험관내 간 지방증(steatosis) 모델에서 Combo 및 MD100의 효과 규명
비알코올성 지방간 질환의 가장 큰 특징은 정상 간에 지질이 축적되는 것이다. 따라서, 본 발명자들은 시험관 내 조건에서 GLP-1 기반 후보 물질들의 지질 축적 억제효과를 규명 위하여 지질 축적을 유도하였고, 그 결과, OA에 의해서 축적된 세포 내 지방 축적이 IL-10 단독 처리군, GLP-1 및 IL-10의 병용 처리군, MD100 처리군에서 유의하게 감소하는 것을 관찰하였다(도 14A 및 14B).
실험예 15: 시험관 내 지질생성 모델 구축을 통한 Combo 및 MD100의 효과 규명
정상 간에서 비알코올성 지방간으로 진행될 때 흔히 비만이나 인슐린 저항성과 같은 대사 증후군이 동반된다고 알려져 있다. 이 과정에서는 지방세포로부터 유리되는 지방산이 많아지고, 따라서 과량의 지방산이 간 내로 유입되어 간 내에서의 지방 합성을 유도한다. 이는 간 세포 내에 과량의 지방 축적을 유도하여 지방간을 형성한다고 알려져 있다. 따라서 3T3-L1 지방전구세포 분화 시스템을 이용하여 Combo 및 MD100이 지방세포가 형성되는 과정인 지질생성(adipogenesis) 과정을 억제함으로써 지방세포로부터 유리되어 간 내로 유입되는 지방산의 양을 감소시킬 수 있는지 조사하였다. 그 결과, 지질생성과 관련된 유전자 및 지질축적이 MD100 처리군에서 가장 유의하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 15A-15F).
상술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-1 및 IL-10의 병용투여 또는 GLP-1 및 IL-10을 포함하는 이중 특이성 융합단백질은 간에서의 지질축적을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라, 지방간에 수반되는 염증을 완화시키며 간에서의 과도한 지질에 의해 발생하는 지질독성 역시 효과적으로 억제할 수 있음이 실험적으로 입증이 되었다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 GLP-1 및 IL-10의 병용투여 조성물 및 이중 특이성 융합단백질은 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염 및 비알코올성 지방간의 경과에 따른 간섬유증과 같은 만성 대사성 간질환의 치료에 효율적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> Genexine, Inc. Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> A novel pharmaceutical composition for treating non-alcoholic steatohepatitis <130> PD19-5873 <160> 33 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/Exendin 4 hybrid <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hybrid Fc region <400> 2 Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 1 5 10 15 Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 20 25 30 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 35 40 45 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 50 55 60 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 65 70 75 80 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 85 90 95 Pro 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forward <400> 20 gccaccacgc tcttctg 17 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha reverse <400> 21 ggtgtgggtg aggagca 17 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 forward <400> 22 acaaccacgg ccttccctac 20 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 reverse <400> 23 cacgatttcc cagagaacat gtg 23 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta forward <400> 24 aacctgctgg tgtgtgacgt tc 22 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta reverse <400> 25 cagcacgagg cttttttgtt gt 22 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARgamma forward <400> 26 ctctcagctg ttcgccaa 18 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARgamma reverse <400> 27 cacgtgctct gtgacgatct 20 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEBPalpha forward <400> 28 ctggctctgg gtctggaa 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEBPalpha reverse <400> 29 agccacaggg gtgtgtgt 18 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aP2 forward <400> 30 ccgcagacga caggaagg 18 <210> 31 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aP2 reverse <400> 31 agggccccgc catct 15 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S forward <400> 32 cgctcccaag atccaactac 20 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S reverse <400> 33 ctgagaaacg gctaccacat c 21

Claims (15)

  1. ⅰ) GLP-1 또는 그의 유사체 및 IL-10 단백질 ⅱ) GLP-1 또는 그의 유사체가 IL-10 단백질에 연결된 융합단백질 또는 iii) 항체 Fc 영역의 N-말단에 GLP-1 또는 그의 유사체가 연결되고, 상기 항체 Fc 영역의 C-말단에 IL-10 단백질이 연결된 이중 특이성 이량체 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 GLP-1 유사체는 GLP-1, 엑센딘 3(Exendin 3), 엑센딘 4(Exendin 4), GLP-1/Exendin 4 하이브리드, GLP-1-EXTEN, Lixisenatide, Albiglutide, Liraglutide, Dulaglutide, Extenatide, Taspoglutide, 또는 Lixisenatide인, 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 GLP-1은 서열번호 6 또는 7로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 Exendin 3는 서열번호 8으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 Exendin 4는 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 GLP-1/Exendin 4 하이브리드는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 Lixisenatide는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 Exendin 4-XTEN은 서열번호 11로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 Albiglutide는 서열번호 12로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.

  10. 제2항에 있어서,
    상기 Liraglutide는 서열번호 13로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  11. 제2항에 있어서,
    상기 Taspoglutide는 서열번호 14으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 항체 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 IgD의 Fc 영역 또는 하이브리드 항체 Fc 영역인, 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 하이브리드 항체 Fc 영역은 둘 이상의 아이소타입의 적어도 두 개 이상부분이 혼합된 형태의 항체 Fc 영역인, 조성물.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 항체 Fc 영역은 서열번호 2 및 15 내지 19로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  15. 치료적으로 유효한 양의 ⅰ) GLP-1 또는 그의 유사체 및 IL-10 단백질 ⅱ) GLP-1 또는 그의 유사체가 IL-10 단백질에 연결된 융합단백질 또는 iii) 항체 Fc 영역의 N-말단에 GLP-1 또는 그의 유사체가 연결되고, 상기 항체 Fc 영역의 C-말단에 IL-10 단백질이 연결된 이중 특이성 이량체 융합단백질을 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 비알코올성 지방간 또는 비알코올성 지방간염 치료방법.

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