JP2010521186A - ポリマーと複合体化されたｇｌｐ−１融合ペプチド、その製造及び利用 - Google Patents

ポリマーと複合体化されたｇｌｐ−１融合ペプチド、その製造及び利用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＧＬＰ−１の活性及び生体内での強化された安定性、特に、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する耐性を有する、ポリマーと複合体化され、それによって複合分子を形成している融合ペプチドを提供する。上記複合分子の融合ペプチドは、Ｎ末端側に、ＧＬＰ−１（７−３５、７−３６又は７−３７）配列を構成部分（Ｉ）として、Ｃ末端側に、少なくとも９アミノ酸のペプチド配列、その機能的なフラグメント、変異体又は誘導体を構成部分（ＩＩ）として備えている。合成のポリマー及び／又はタンパク質、例えば、トランスフェリン若しくはアルブミンは、上記融合ペプチドに共有結合又は非共有結合して、複合分子を形成する。構成部分（ＩＩ）は、好ましくは、ＩＰ２（介在ペプチド２）の全長又は部分である。好適な実施形態は、ＧＬＰ−１（７−３５、３６若しくは３７）／ＩＰ２／ＧＬＰ−１（７−３５、３６若しくは７３）又はＧＬＰ−２と、ポリマー成分、例えば、天然の又は非天然のポリマーとを備えている。上記融合ペプチドは、改変された細胞において又は合成的に製造され得、例えば、化学的に合成されたポリマー成分と複合体化される。上記複合分子は、例えば、糖尿病タイプＩ若しくはＩＩ、アポトーシス関連疾病、又は神経変性障害のような様々な疾病又は疾患を治療するための薬剤の調製のために用いられ得る。

Description

発明の詳細な説明
本発明は、伸長されたＣ末端を有し、エンドペプチダーゼＩＶによる不活性化に対して耐性を有し、形質転換された動物細胞において高い水準で発現され得、例えば糖尿病タイプＩＩの治療において有用な、新規の、ポリマーと複合体化されたＧＬＰ−１融合ペプチドに関するものである。
グルカゴン遺伝子はよく研究されている遺伝子である（例えばWhite, J.W. et al., 1986 Nucleic Acid Res. 14(12) 4719-4730を参照のこと）。高分子量の前駆体分子であるプレプログルカゴン分子は、膵臓α細胞並びに空腸及び大腸Ｌ細胞において合成される。プレプログルカゴンは、１８０アミノ酸長のプロホルモンであり、その配列は、グルカゴンに加えて、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）及びグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）という、関連した構造の二つの配列を含んでいる。プレプログルカゴン分子では、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２の間に、１７アミノ酸のペプチド配列（より正確に言えば、１５アミノ酸の配列にＣ末端のＲＲ切断部位が付加したもの）の介在ペプチド２（ＩＰ２）がある。ＩＰ２の配列（上記前駆体分子において、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２の間に位置している）は、通常、ＧＬＰ−１の第３７番目のアミノ酸の後ろでタンパク質分解的に切断される。従って、プレプログルカゴン分子は、細胞及び環境に依存して、処理を受けていない形態の３７アミノ酸のペプチドであるＧＬＰ−１（１−３７）を含む、様々なペプチドに切断される。一般に、上記処理は、膵臓及び腸において行われる。ＧＬＰ−１（１−３７）の配列は、さらにタンパク質分解的に切断されて、処理された形態の３１アミノ酸である活性型ＧＬＰ−１（７−３７）、又はＧＬＰ−１（７−３６）アミドになり得る。即ち、ＧＬＰ−１（７−３７）という表示は、上記親ペプチドＧＬＰ−１のＮ末端から数えて第１番目から（第１番目を含む）第３７番目まで（第３７番目を含む）のアミノ酸残基からなる問題のフラグメントを意味する。ＧＬＰ−１（７−３６）アミド及びＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸配列は、下記式Ｉにより与えられる（配列番号４３）。
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘ （Ｉ）
この式は、ＸがＮＨ２のとき、ＧＬＰ−１（７−３６）アミドを示し、ＸがＧｌｙ−ＯＨのとき、ＧＬＰ−１（７−３７）を示す。
ＧＬＰ−１は、消化管ホルモンであり、β細胞においてアデニル酸シクラーゼ及びプロテインキナーゼの活性を促進する働きを有する、最も強力な内在性のインスリン分泌性因子である。生理的には、上部の腸からの胃抑制ポリペプチドとともに、血糖値を下げる内分泌ホルモンとして働く。即ち、ＧＬＰ−１は、食物の摂取に応じて分泌され、例えば胃、肝臓、膵臓及び脳への複合的な効果を有しており、それらは一斉に血糖を調整する。その結果、グルカゴン様ペプチドＧＬＰ−１（７−３７）アミド及びそのアミド化されていない類似体であるＧＬＰ−１（７−３７）は、その炭水化物代謝への強力な作用及び糖尿病タイプＩＩを含む糖尿病の処置への適用可能性により、相当な注目を集めている。糖尿病タイプＩＩは、インスリンが存在していても細胞が適切な反応を示さないことから、インスリン抵抗性として特徴付けられている。このことは、糖尿病タイプＩよりも、より複雑な問題となる。糖尿病タイプＩＩは、その症状が典型的には軽症であり（ケトアシドーシス無し）、散発性であるために、診断されるまで、何年もの間、患者に認識されないことがある。しかし、認識されなかった糖尿病タイプＩＩは、腎不全及び冠状動脈性心臓病を含む深刻な合併症が発生し得る。これは、罹患率及び死亡率の増加を招く。
ＧＬＰ−１（７−３６）アミド又はＧＬＰ−１（７−３７）は血中における寿命が短い。これらのペプチドは、ジペプチジル・ペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）によって第８番目の残基と第９番目の残基との間が切断される。切断されたペプチドは不活性となる。そのため、外から投与されたＧＬＰ−１は非常に短命であり、治療のための適用において限られた有用性しか有さない。
自然に存在するＧＬＰ−１（ＧＬＰ−１（７−３７））の類似体であって、（ＤＰＰ−ＩＶに対して）安定しているものを合成するための様々な試みが行われている。特に、生体ではＡｌａである第８番目の残基が、他の残基、例えばＧｌｙ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ、に置き換えられた（Burcelin, R., et al. (1999) Metabolism 48, 252-258）。Ｇｌｙ８又はＧ８類似体は、合成された分子として、又、変異ポリペプチドを分泌するように遺伝学的に改変された細胞株により製造されたものとして、頻繁に試験された（Burcelin, R., et a1 (1999) Annals of the New York Academy of Sciences 875: 277-285）。生物学的な活性を損なわずに生体における安定性を向上させることを目的として、様々な改変がＧＬＰ−１（７−３７）に導入されている。しかし、付随する問題のために、これらの手法はいかなる治療上の有効性も獲得していない。
国際公開公報第９９５３０６４号パンフレットにおいて、ソレンスは、公衆が利用可能な不死化された細胞株から、初代培養株を分化させたものまで様々なタイプの細胞に対して組み込むことができる、多量体の、ＧＬＰ−１発現カセットを作り出すための手法を開示している。実施例は、哺乳類の中枢神経系から得られた、ＥＧＦ応答性のニューロスフィア、ｂＦＧＦ応答性の神経前駆幹細胞を含んでいるが、稼働した実施例は、ハムスターの乳児の肝臓（ＢＨＫ）細胞を用いている。形質移入され、移植された細胞は、首尾よく糖尿病のマウスを処理し、糖尿病でないマウスと実質的に同等の血糖値調節が行われたと記載されている。しかし、この種の移植技術は、糖尿病患者に対する日常的な治療に適合するものではない。
外因的に血糖値を安定化させるための他のアプローチとして、インクレチンミメティックスとして知られる新たな種類の薬剤が、糖尿病タイプＩＩの治療のために研究されている。エクセナチド（バイエッタ（登録商標））は、アメリカドクトカゲの唾液において見出された天然の化合物を合成したものである。臨床試験において、インクレチンミメティックス（エクセナチド）は、血糖値の低減及びβ細胞機能マーカーの改善を示している。しかし、エクセナチドは、ヒトインクレチンホルモンであるグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の一部の効果しか示さない。
以上をまとめると、現時点において、ＧＬＰ−１に基づいて血糖値を下げ得る、言い換えれば、ＧＬＰ−１について知られている有利な効果の全範囲、例えば肥満体患者の胃内容物排出速度の低減又はインスリン刺激作用により、生理学的な濃度において、栄養素の循環器系への流入率を強力に低減させるその作用、を反映した治療を提供する有効な糖尿病タイプＩＩの治療法は知られていない。従って、本発明の目的は、生理学的に活性であり、タンパク質分解に対して耐性のＧＬＰ−１に基づくペプチド分子を提供することである。生体内において可能な限り安定なＧＬＰ−１に基づくペプチド分子を提供することは非常に好ましい。
本発明は、Ｎ末端側に、ＧＬＰ−１（７−３５、７−３６又は７−３７）配列を構成部分（Ｉ）として、Ｃ末端側に、少なくとも９アミノ酸のペプチド配列又はその機能的なフラグメント、変異体又は誘導体を構成部分（ＩＩ）として含んでいる融合ペプチド（本明細書において、以降、「融合ペプチド」と称する）と、それに加えて、例えばポリアミノ酸等の、少なくとも一つの合成ポリマー又は天然ポリマーと、を含んでいる複合分子に関する。この少なくとも一つのポリマー成分は、典型的には、融合ペプチドのサブユニットと共有結合をしている。本発明の意味において、「複合体化された」とは、「化学的に結合された」ことを意味することが意図される。「化学的に結合された」とは、共有結合又は非共有結合を介して結合されたことを意味することが意図される。共有結合が好適ではあるが、上記ポリマー成分は、又、共有結合なく複合体化すること、例えば水素結合又は静電気的な相互作用、疎水的な相互作用等、を介して、上記融合ペプチドと連結されてもよい。上記融合ペプチド及び上記ポリマーを含んだ複合体全体を、以降、「複合体」、又は「複合分子」と称する。
本発明は、もたらされる本発明の複合分子は、主にエンドペプチダーゼＩＶのタンパク質分解活性による生体内でのタンパク質分解からさらに保護されるという知見に基づくものである。少なくとも二つの構成部分（Ｉ）及び（ＩＩ）並びに上記合成ポリマーを有する、本発明の複合体は、ＧＬＰ−１の生物学的活性を示すとともに、Ｃ末端の伸長（elongation）により、その構成部分（Ｉ）として存在するＧＬＰ−１に安定性を与える。このように、上記融合ペプチドをポリマーと複合体化することで、その生体における安定性が相当に増大する。
ここで用いられる上記ポリマーは、生理学的に許容されるポリマーであり得る。このようなポリマーには、水溶液に溶解又は懸濁され得、薬学的に有効な量の上記融合ペプチドを投与したときに哺乳動物に与える悪影響、例えば副作用、を有さないポリマーが包含される。本発明において使用される、生理学的に許容されるポリマーは、特に限定されない。上記ポリマーは、合成されたもの、又は天然に生じたポリマー（天然ポリマー、例えばタンパク質）であってもよい。ポリマーの詳細な実施形態については後述する。
１、２、又は３つのポリマー成分、好ましくは１つのポリマー成分が、上記融合ペプチドのサブユニットに共有結合により結合して、本発明の複合分子を形成し得る。但し、特定の実施形態では、融合ペプチドのサブユニット当たり、３つ以上のポリマー成分が供給されていてもよい。上記ポリマー成分は、上記融合ペプチドの構成部分（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の何れか、又は双方と、共有結合してもよい。少なくとも一つの上記ポリマー成分が、構成部分（ＩＩ）に結合することが好ましい。１つ以上のポリマー成分が構成部分（Ｉ）に結合する場合には、当該ポリマー成分は、Ｎ末端、又は、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン若しくはアルギニン残基の側鎖に結合することが好適である。好適には、構成部分（Ｉ）が有する、Ｔｈｒ１１、Ｔｈｒ１３、Ａｓｐ１５、Ｓｅｒ１７、Ｓｅｒ１８、Ｔｙｒ１９、Ｇｌｕ２１、Ｌｙｓ２６、Ｇｌｕ２７、Ｌｙｓ３４、Ａｒｇ３６残基の一つ以上の側鎖が、結合のために使用される。天然に存在するＩＰ２の配列が構成部分（ＩＩ）として用いられる場合、そのＡｒｇ、Ｇｌｕ、及びＡｓｐ残基の一つ以上の残基が、その側鎖において、ポリマー成分により修飾される。
ポリマー、特にＰＥＧ、をＮ末端に結合することは、上記複合分子の精製に有益である。また、ポリマーがＮ末端に結合することにより、他の任意の残基、例えば他の任意のリジン残基、へポリマーがランダムに結合することと比較して、生物学的活性がよりよく保存されると考えられる。よって、好適な実施形態では、少なくとも一つのポリマー成分が、融合タンパク質のＮ末端に位置する。ＰＥＧ化（PEGylation）を用いる場合、本発明のペプチドに含まれる、末端、側鎖のカルボキシル基、又は、リジンのイプシロンアミノ基のＰＥＧ化は、酸化に対する耐性を与えるが、これもまた本発明の範疇に含まれる。
本発明に係る融合ペプチドにおいて用いられるポリマーは、慣用されている方法を用いて、下記式に示すモノマーを重合することにより調製され得る。
Figure 2010521186
上記式において、Ｒ18は、水素、ハロゲン、炭素数１〜４のアルキル基、及びＣＯＯＲ22基（Ｒ22は、水素原子及び炭素数１〜４のアルキル基である）から選択され；
Ｒ19は、水素、ハロゲン、及び炭素数１〜４のアルキル基から選択され；
Ｒ20は、水素、ハロゲン、炭素数１〜４のアルキル基、及びＣＯＯＲ22基（Ｒ18及びＲ20は両方ともＣＯＯＲ22基ではない）から選択され；並びに
Ｒ21は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜２０のアルコキシカルボニル基、モノ−若しくはジ−アルキル（炭素数１〜２０）アミノカルボニル基、炭素数６〜２０のアリール基（アルカリル基を含む）、炭素数７〜２０のアラルキル基、炭素数６〜２０のアリ−ルオキシカルボニル基、炭素数１〜２０のアラルキルオキシカルボニル基、炭素数６〜２０のアリ−ルアミノカルボニル基、炭素数７〜２０のアラルキルアミノ基、ヒドロキシル基、又は炭素数２〜１０のアシルオキシ基であり、これらの基は何れも、ハロゲン原子、アルコキシ基、オリゴアルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、アシルアミノ基、アミン基（モノ−およびジ−アルキルアミノ基並びにトリアルキルアンモニウム基を含む）、カルボキシル基、スルホニル基、ホスホリル基、ホスフィノ基（モノ−およびジ−アルキルホスフィン基並びにトリアルキルホスホニウム基を含む）、双性イオン基、並びにヒドロキシ基から選択される置換を、一つ以上有し得る。あるいは、Ｒ21及びＲ20、若しくはＲ21及びＲ19は、ともに−ＣＯＮＲ23ＣＯを形成し得る（Ｒ23は、炭素数１〜２０のアルキル基である）。
Ｒ21は、好ましくは、一般式（Ｆ）に示す基である：
Figure 2010521186
上記式において、部分Ａ1及びＡ2は、同一か又は異なり、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、又は共有結合であり、好ましくは−Ｏ−である。Ｗ+は、アンモニウム、ホスホニウム又はスルホニウムの陽イオン性基と、陰イオン性の部分及び陽イオン性の部分を連結する基、好ましくは炭素数１〜１２のアルカンジイル基、とを備える基であり、好ましくは、Ｗ+は、式−Ｗ1−Ｎ+Ｒ26 3、−Ｗ1−Ｐ+Ｒ27 3、−Ｗ1−Ｓ+Ｒ27 2、又は、−Ｗ1−Ｈｅｔ+で示される基であり：
Ｗ1は、一個以上のエチレン性不飽和二重若しくは三重結合を任意に含む、炭素数１個以上、好ましくは２〜６個の、アルカンジイル基、二置換型のアリール基（アリーレン基）、アルキレンアリーレン基、アリーレンアルキレン基、アルキレンアリールアルキレン基、シクロアルカンジイル基、アルキレンシクロアルキル基、シクロアルキルアルキレン基、又は、アルキレンシクロアルキルアルキレン基であり、基Ｗ1は、一個以上のフッ素置換基及び／又は一個以上の官能基を任意に含み；
Ｂは、結合か、直鎖若しくは分岐した鎖状のアルカンジイル基、アルキレンオキサアルキレン基、又はアルキレン（オリゴオキサアルキレン）基かであり、一個以上のフッ素置換基を任意に含み；そして、
各基Ｒ26は、同一か又は異なり、各々が水素若しくは炭素数１〜４個のアルキル基であり、好ましくはメチル基、又は、フェニル基のようなアリール基であるか、又は、二つの基Ｒ26が、それらが結合する窒素原子とともに、５〜７個の原子を含む脂肪族複素環を形成するか、又は、３つの基Ｒ26が、それらが結合する窒素原子とともに、各環に５〜７個の原子を含む縮合環構造を形成するかし、一個以上の基Ｒ26は、親水性官能基により任意に置換され、
基Ｒ4は、同一か又は異なり、各々はＲ26又は基ＯＲ26であり（Ｒ26は上記のように定義される）；又は
Ｈｅｔは、芳香族窒素−、リン−もしくは硫黄−、好ましくは窒素−、であり、ピリジンなどの環を含む。
Ｒ21は、より好ましくは、一般式（Ｇ）に示す基である：
Figure 2010521186
基Ｒ25は、同じか又は異なり、各々は、水素原子又は炭素数１〜４のアルキルであり、ｍは１から４であり、基Ｒ27は、好ましくは同じであり、好ましくはメチル基である。
式（Ｆ）及び（Ｇ）において、Ｂは、好ましくは、直鎖状の炭素数２〜６のアルカンジイル基である。
エチレン性不飽和モノマーは、陰イオン性、陽イオン性、又は、非イオン性モノマーであり得る。二つからそれ以上の異なるエチレン性不飽和モノマーは、重合され得る。
エチレン性不飽和モノマーは、ポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、又は、ＨＰＭＡコポリマーから選択されるポリマーを形成するために重合され得る。又は、上記ポリマーは、例えば、ポリエステル、ポリアセタール、ポリ（オルトエステル）、ポリカーボネート及びポリアミドのような、酵素的又は加水分解的な分解に感受性のものであり得る。
上記ポリマーは、ホモポリマー又は上述した成分の少なくとも二つのコポリマーであり得る。上記コポリマーは、ブロック共重合体又はランダム共重合体であり得る。
特に好適なポリマーの具体例としては、これらに限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、エチレングリコール及びプロピレングリコールのコポリマー等のポリアルキレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、ポリオレフィンアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリヒドロキシアルキルメタクリルアミド、ポリヒドロキシエチレンメタクリレートのようなポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリレート、ポリサッカライド、ポリ（［α］−ヒドロキシ酸）、ポリビニルアルコール、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモーフォリン）、ポリビニルエチルエーテル、ポリビニルアセテート、ポリ乳酸グリコール酸、ポリ乳酸、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、ポリウレタン、ポリシアル酸、三酢酸セルロース、硝酸セルロース、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
更なる具体的なポリマーとしては、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、ポリ（乳酸−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）コポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン−アクリル酸−ｇＰＥＧ）（ＶＡＰ）、Ｎ−ビニルピロリドンとアクリル酸とのコポリマー、及びＮ−ビニルピロリドンと無水マレイン酸のコポリマーが挙げられる。
本発明の他の好適な実施形態では、上記ポリマーは下記一般式（Ｂ）又は（Ｃ）に示される。
Figure 2010521186
Figure 2010521186
（ここで、Ｒ1は、公知の電子吸引基であり；
Ｒ2は、Ｃ＝Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ9、又は、単結合から選択され；Ｒ9は、Ｈ又は炭素数１〜４のアルキル基であり；
Ｒ3は、炭素数１〜２０のアルキレン基；炭素数３〜８のシクロアルキレン基；Ｃ（＝Ｏ）Ｒ10、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ11、炭素数１〜２０のアルコキシ基、炭素数２〜２０のアルケニレン基、炭素数２〜２０のアルケニルオキシラニレン基；アリーレン基、ヘテロシクレン基、アラルキレン基；それらにおいて、一つ乃至全ての水素原子がハロゲンによって置換されているもの；炭素数１〜４のアルコキシ基、アリール基、ヘテロシクリル基、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ10、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ11Ｒ12、オキシラニル基、及びグリシジル基からなる群より選択される一つ乃至二つの置換基によって置換されている炭素数１〜６のアルキル基、からなる群より選択され；
Ｒ10は、炭素数１〜２０のアルキレン基、炭素数１〜２０のアルコキシ基、各アルコキシ基がそれぞれ炭素数１〜３のオリゴ（アルコキシ）基、アリールオキシ基、又はヘテロシクリルオキシ基であり；それらの基は、任意に置換されたアルコキシ基、オリゴアルコキシ基、アミノ基（モノ−及びジ−アルキルアミノ並びにトリアルキルアンモニウムを含んでおり、それらのアルキル基は、アシル基、アルコキシカルボニル基、アルケンオキシカルボニル基、アリール基、及びヒドロキシ基から選択される置換基を有していてもよい）、並びにヒドロキシル基から選択される置換基を有していてもよく；
Ｒ11及びＲ12は、独立して、Ｈ若しくは炭素数１〜２０のアルキル基であるか、又は、Ｒ11及びＲ12は、共同して炭素数２〜５のアルカンジイル基を形成し、３〜６員環を形成し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｚ、ハロゲン、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、ＯＨ、ＣＮ、炭素数２〜２０のアルケニル基、炭素数２〜２０のアルケニルオキシラニル基、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ13、グリシジル基、アリール基、ヘテロシクリル基、アリールキル基、アラキケニル基、それらにおいて、一つ乃至全ての水素原子がハロゲンによって置換されているもの、炭素数１〜４のアルコキシ基、アリール基、ヘテロシクリル基、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ10、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ11Ｒ12、オキシラニル基、及びグリシジル基からなる群より選択される一つ乃至二つの置換基によって置換されている炭素数１〜６のアルキル基、から選択され；
Ｒ13は、炭素数１〜２０のアルキレン基、炭素数１〜２０のアルコキシ基、各アルコキシ基がそれぞれ炭素数１〜３のオリゴ（アルコキシ）基、アリールオキシ基、又はヘテロシクリルオキシ基であり、それらの任意の基は、任意に置換されたアルコキシ基、オリゴアルコキシ基、アミノ基（モノ−及びジ−アルキルアミノ並びにトリアルキルアンモニウムを含んでおり、それらのアルキル基は、アシル基、アルコキシカルボニル基、アルケンオキシカルボニル基、アリール基、及びヒドロキシ基から選択される置換基を有していてもよい）、並びにヒドロキシル基から選択される置換基を有していてもよく；そして、
Ｌは、連結基（linking group）であり；
Ｚは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ14、ＳＲ15、ＳｅＲ15、ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ15、ＯＰ（＝Ｏ）（＝ＯＲ15）2、Ｏ−Ｎ（Ｒ15）2、及びＳ−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒ15）2からなる群より選択され、Ｒ14は、任意の水素原子が独立にハロゲン化物に置換され得る、炭素数１〜２０のアルキル基であり、Ｒ15は、アリール基又は直鎖状の、若しくは分岐した炭素数１〜２０のアルキル基であり、そしてＮ（Ｒ15）2基が存在する場合には、二つのＲ15基は共同して５又は６員の複素環を形成してもよく；
Ｒ6は、ＣＨ2Ｅ2、Ｈ、又は炭素数１〜４のアルキル基であり、
Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して、Ｈ及び炭素数１〜４のアルキル基から選択され；
ｍは、０〜４であり、
ｆは、１〜５００、好ましくは５〜５０であり、
Ｅ1及びＥ2は、それぞれ独立して、脱離基、又は脱離基の前駆体であり、そして
基Ｍは、同一か又は異なり、エチレン性不飽和モノマー由来の残基であり、特に、式（Ａ）に規定されるモノマーである。
好ましくは、Ｒ６は−ＣＨ２Ｅ２である。もし、脱離基が求核試薬による直接的な置換よりも脱離しやすく、電子求引性の基Ｒ１が（融合ペプチドなどの生体分子に付着するための）マイケル反応における活性化分子に適している場合には、一連のマイケル及びレトロ−マイケル反応によって、その後の分子内のビス−アルキル化が起こり得る。脱離基は、最初のアルキル化が起こった後にまだ露出していない潜在性の結合された二重結合を遮蔽するのに役立ち、その後のマイケルおよびレトロ−マイケル反応によりビス−アルキル化が生じる。
好ましくは、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して−Ｈまたは−ＣＨ３から選択される。
また、好ましくは、Ｒ４およびＲ５のうちの１つのみがＨである。どちらも水素でないことが好ましい。Ｒ４およびＲ５の少なくとも１つ、好ましくはいずれもがメチル基であることが好適である。
好ましい実施形態において、Ｒ３は−ＣＯ−Ｒ１０であり、その中におけるＲ１０はオリゴアルコキシ基、好ましくは２〜１０個のエトキシル基を有するオリゴエトキシル基である。あるいは、アルコキシ基は１〜３個の炭素原子を有していてもよい。この好ましい実施形態において、Ｒ４およびＲ５は好ましくはメチル基である。
Ｚ基はラジカル伝達性の基（a radically transferable group）であり、好ましくはハロゲン、より好ましくはＣｌ、ＢｒまたはＩであり、さらに好ましくはＢｒである。Ｒ４およびＲ５基もまたＺであり得るため、重合開始剤はジ−、オリゴ−、またはポリ−官能基であり得る。
好適な連結基であるＬは、化学結合、炭素数１〜１０のアルキレン基、または任意に置換されたアリールもしくはヘテロアリールを含み、どの基であっても、任意に置換されたアルコキシ基、オリゴアルコキシ基、アミノ基（モノおよびジアルキルアミノならびにトリアルキルアンモニウムを含んでおり、このアルキル基は、言い換えれば、アシル基、アルコキシカルボニル基、アルケンオキシカルボニル基、アリール基およびヒドロキシル基から選択される置換基を有していてもよい）およびヒドロキシル基から選択された置換基を有し得る。
電子求引性の基Ｒ１についての好適な基は、ケト基、エステル基およびスルホン基を含む。
Ｅ１基およびＥ２基は、一般的に、−ＳＲ１７、−ＳＯ２Ｒ１７、−ＯＳＯ２Ｒ１７、−Ｎ＋Ｒ１７ ３、−Ｎ＋ＨＲ１７ ２、−Ｎ＋Ｈ２Ｒ１７、ハロゲン、または−ＯＡｒから選択される離脱基であり、Ｒ１７はアルキル基またはアリール基を表し、Ａｒは、少なくとも１つの電子吸引性の置換基を含んでいる、置換されたアリール基を表す。
あるいは、Ｅ１基およびＥ２基は、離脱基の前駆体であってもよく、この場合には脱離基は、酸化または還元などの単純な化学反応により獲得し得る。脱離基の前駆体としてのＥ１およびＥ２を有することは、その後の重合反応（または重合開始剤の合成）を容易にする場合には好ましい。
本発明の好ましい実施形態では、Ｅ１およびＥ２はそれぞれ、独立して（任意に置換された）アリールスルフィド基またはアリールスルホン基である。
アリールスルフィド（脱離基の前駆体）は、周知のように、単純な酸化反応によりアリールスルホン基（脱離基）に変換され得る。本発明の第１の形態による工程は、その後の、脱離基の前駆体であるＥ１基およびＥ２基（存在する場合）が脱離基に変換される反応段階を含み得る。
しかしながら、生物分子に結合し得る新規な化合物では、Ｅ１基およびＥ２基（存在する場合）は脱離基でなければならない。したがって、特に好ましい脱離基は以下である：
Figure 2010521186
式（Ｂ）および（Ｃ）のポリマーは、公知のように下記一般式（Ｄ）および（Ｅ）の重合開始剤の存在下におけるリビングラジカル重合工程によって、エチレン性不飽和モノマー、特に式（Ａ）のエチレン性不飽和モノマーが重合する重合工程により調製することができる：
Figure 2010521186
Figure 2010521186
上記式においてＲ１からＲ８、Ｌ、Ｅ１、Ｚおよびｍは、上述したように規定される。
一般式（Ｄ）および（Ｅ）の化合物は、本発明の第１の形態によるリビングラジカル重合工程における重合開始剤として働く。重合開始剤は、リビングラジカル重合工程によりＺが付着する炭素原子まで伸ばされる。重合開始剤の反対側の端は、生物分子との誘導体化に適したものであり得る。この点において、重合開始剤は、α−メチレン脱離基、または脱離基の前駆体、または電子吸引性の基に結合される二重結合を有することが極めて重要である。これにより、生物分子がマイケル反応において重合開始剤と反応することとなる。
重合開始剤は、１から５の二重結合を有していてもよい。二重結合のいずれかの適した位置における結合系に求核原子が付加されてもよい。好ましくは、しかしながら、一般式（Ｅ）の重合開始剤においてｍが０である。
特に好ましい一般式（Ｄ）の重合開始剤は、式（Ｉ）を有する：
Figure 2010521186
本発明のリビングラジカル重合工程は、例えばＮ→Ｏ、または他の炭素−、硫黄−、および酸素−が中心にあるラジカル群が重合開始剤化合物からモノマーに移動する、グループ移動ラジカル重合であってもよい。好ましくは、しかしながら、当該工程は、原子移動ラジカル重合工程であることが好ましい。
ポリマーは、好ましくは上述したようなリビングラジカル重合工程により作製される。例えば、国際公開第００／１８８０７号パンフレットに記載されたようなＮＯ群移動系、国際公開第９９／５８５８８号パンフレットに記載された触媒系、可視光による照射、または国際公開第９９／１０３８７号パンフレットに記載されたような他のＥＭ照射を含む系、Ｒｉｚｚａｒｄｏ，Ｅ．ｅｔａｌ．ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ２０００，７６８，２７８−２９６に記載されたようなラジカル付加断片化連鎖移動重合反応（ＲＡＦＴ）、一般的な型Ｚ−Ｃ＝ＳＳＲ、またはＢｏｎｔｅｖｉｎ，Ｂ．，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．ＰｔＡ，Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．，２０００，３８（１８），３２３５−３２４３に記載されたようなキサンテス（xanthes）（ＭＡＤＩＸ）の交換を通した高分子デザインの化合物（重合開始剤）を用いる方法、などの他の制御された重合技術を使用し得る。
原子またはグループ移動ラジカル重合工程は、国際公開第０２／２８９２９号パンフレットにさらに記載されている。
リガンドは、例えば、溶解性の特徴および／または生産物であるポリマーの混合物からの、触媒における分離可能性に基づいて好適に選択される。例えば多孔質の基質において、ある環境下では触媒を固定化することがあり得るにもかかわらず、一般的に触媒は反応混合液に可溶性である。液相において行われる場合の好ましい工程においては、リガンドは液相に可溶性である。リガンドは一般的に窒素を含むリガンドである。好ましいリガンドは、ビピリジンなどの、ピリジル基およびイミノ分子を含む化合物、または、
Figure 2010521186
であってもよく、上記式においてＲは好適なアルキル基であり、置換基が、可変性であり、かつ望ましい溶解度特性を与えるために適応できるものであるか、またはトリフェニルホスフィンもしくは１，１，４，７，１０，１０−ヘキサメチル−トリエチレン テトラアミンであってもよい。
このようなリガンドは、通常、触媒の一部として、塩化銅および塩化ルテニウムの遷移金属化合物と組み合わせて用いられる。
リビングラジカル重合工程は、好ましくは５から５００の範囲の重合度を達成するために行われる。好ましくは、重合度は１０から１００の範囲であり、より好ましくは１０から５０の範囲である。より好ましいグループまたは原子移動ラジカル重合技術において、重合度はモノマーに対する重合開始剤の初期の割合に直接関連する。好ましくはこの割合は１：（５から５００）の範囲であり、より好ましくは１：（１０から１００）の範囲であり、最も好ましくは１：（１０から５０）の範囲である。
触媒中の金属化合物およびリガンドの割合は、金属イオンが完全に複合体化されたときの構成成分の割合に基づいて、ほぼ化学量論的となり得る。その割合は、好ましくは１：（０．５から２）、より好ましくは１：（０．８：１．２５）の範囲であり得る。好ましくは、その範囲は約１：１である。
この工程中、触媒は、存在している重合開始剤の量と比較してモル等価量となるような量において使用され得る。しかしながら、触媒は反応において消費されないので、一般に触媒を重合開始剤と同じ量含む必要はない。重合開始剤に対する触媒の割合（遷移金属化合物に基づく）は、好ましくは１：（１：５０）の割合であり、より好ましくは１：（１から１０）の割合である。
重合反応は、気相において行われてもよいが、より好ましくは液相において行われる。この反応は固体および液体の相を備えた不均質なものであってもよいが、均質なものであることがより好ましい。好ましくは、重合は単一の液相において行われる。モノマーが液体である場合は、非重合の溶媒（non-polymerisable solvent）を含む必要がない場合がある。しかしながら、より多くの場合、重合は、非重合の溶媒の存在下で起こる。この溶媒は、例えば両方のモノマーを含んでいる共通の溶液を提供するために適していることから、双性イオンのモノマーおよびいくらかのコモノマーの性質を考慮して選択され得る。
好ましいポリマーは、式（Ｋ）である：
Figure 2010521186
また、本発明において用いられ得る好ましいポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＥＧの修飾形、例えばメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）である。水溶性のＰＥＧポリマーとペプチドとの結合により、腎臓の濾過作用が低速になり、それゆえそれらの循環における滞留時間が増加する。この技術によって、活性分子の周囲の水和されたＰＥＧポリマー鎖からなるクモの巣状の遮蔽物が付着することにより、活性分子のサイズが大きくなる。この修飾の重要な利点の１つは、クリアランスの半減期を増加させ、体循環においてより長く薬を滞在させることができることである。また、この技術は、分子の安定性を増加させ、体内の配分量を変化させ、かつ免疫反応を減少させ、薬をより効果的にさせている。融合ペプチドに付着したポリマー分子は、「保護された」ポリペプチドとプロテアーゼの活性部位との相互作用に対して立体障害となる。
生理的に認容されるポリマーは、特別な構造には限定されず、線状（例えばアルコキシＰＥＧまたは二機能性のＰＥＧ）、すなわち、分岐していないもの、分岐しているもの、もしくは多数のアームがあるもの（例えばフォーク型のＰＥＧまたはポリオール核に付着したＰＥＧ）、樹木状のもの、または分解性の連鎖を有するものであってもよい。さらに、ポリマーの内部構造は、いくつもの異なるパターンにより組織されたものであってもよく、ホモポリマー、交互のコポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、交互のトリポリマー、ランダムコポリマー、およびブロックトリポリマーにより構成される群から選択されてもよい。
本明細書において、用語ポリエチレングリコール（“ＰＥＧ”）は、包括的であり、以下の一般式を有する一連のポリマーを意味する：
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
上記式中、ｎは約５から４０００の範囲である。ＰＥＧはまた、以下の構造ユニットを引用する：
-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-
上記式中、ｎは約５から約４０００の範囲である。このように、ＰＥＧにより、メトキシ−ＰＥＧｓ；ヒドロキシル基以外の少なくとも１つの末端部分であって、他の部分との反応性のあるものを有するＰＥＧｓ；分岐したＰＥＧｓ；吊り下げ型のＰＥＧｓ；フォーク型のＰＥＧｓ；などの修飾されたＰＥＧｓが意味される。
本発明の方法に有用なポリエチレングリコールは、通常、約１００から２０００００ダルトンの平均分子量を有する。約１０００から４００００ダルトンの分子量が、いくらかより一般的に使用される。一般的に、および最終的には、約３００から８０００、特に、約５００から５０００ダルトンの分子量が好ましい。
ＰＥＧは、生物学的な、または生物工学的な適用に関して非常に価値があり、かつ一般的に認められているという性質を有することから、生物学的な適用に有用である。ＰＥＧは主として透明であり、無色であり、無臭であり、水溶性であり、熱に安定であり、多くの化学物質に対して不活性であり、加水分解または変質せず、かつ一般的に無毒性である。ポリエチレングリコールは、ＰＥＧは、危害を与えることなく生きている組織または有機体と共存できるといわれ、生体適合性であるとみなされている。さらにいえば、ＰＥＧは、それ自身において、通常は非免疫原性であるとみなされており、つまりＰＥＧは体内において免疫応答を起こしにくいといわれる。ＰＥＧが様々なペプチドに付着し得るための、末端の活性化基は、免疫原性効果を避けるために、ＰＥＧの非免疫原性の性質を感知できるほどに変化させ得ないものであることが好ましい。ＰＥＧ結合体は、実質的な免疫応答を起こしにくく、または凝固もしくは他の望ましくない効果を引き起こしにくいことが好ましい。
ＰＥＧは、タンパク質またはペプチドを、酵素の消化、免疫系分子および細胞から遮蔽し得る、高水和されたランダムコイルポリマーであり、細網内皮性のシステム（ＲＥＳ）の清掃率を減速させるために水力学的な量を増加させ得る。ＰＥＧは、多くの有機溶媒への溶解性とともに、水への溶解性の性質を有する有用なポリマーである。ＰＥＧは、この独特の溶解性の性質により、ある低水溶性の化合物に結合（ＰＥＧ化）し、その結果の結合体を水溶性にすることができる。
本発明に用いるポリマーは、通常線状のものまたは分岐したものであり得る。分岐したポリマーの基幹は公知である。典型的に、分岐したポリマーは中心核部分およびこの中心核に連結された多数の線状のポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、通常エチレンオキシドを、グリセロール、ペンタエリスリトールおよびソルビトールなどの種々のポリオールに付加して調製され得る、分岐した形のものが用いられる。例えば、ペンタエリスリトールから調製された４つのアームの分岐したＰＥＧは、以下に示される：
C(CH2-OH)4+nC2H4O -> C[CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH]4
中心部分は、また、いくつかのアミノ酸から誘導され得る。例としては、リジンである。
分岐したポリエチレングリコールは、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｎとして一般的な形で表され得る。この中においてＲは、中心部分を表し、例えばグリセロールまたはペンタエリスリトールなどである。また、ｎはアームの数を表す。好適な分岐したＰＥＧｓは、米国特許出願公開第５，９３２，４６２号明細書に基づいて調製することができ、その内容は引用によって完全に本明細書に組み入れられる。その後これらの分岐したＰＥＧｓは、本明細書における教示に基づいて使用され得る。
フォーク型のＰＥＧｓおよび関連するポリマーもまた、本発明の方法に有用であり得る。用語「フォーク型」は、少なくとも１つの末端の近くで分岐したようなＰＥＧｓを表すのに用いられる。ポリマーは、ポリマー鎖の１つの末端において分岐した部分と、分岐した部分のそれぞれの末端に１つずつあって、他の分子と共有結合するための２つの遊離型の反応基とを有している。それぞれの反応部分は、例えば反応基を分岐した部分に連結するアルキル鎖などを含む、束縛基を有していてもよい。このように、分岐した末端によって、ポリマーは、２つの分子と結合体を形成するために反応することができる。フォーク型のＰＥＧｓにおける分岐した末端につながる基幹は、線状であってもよいし、分岐していてもよい。
ＰＥＧ化技術以外では、腎クリアランスを妨げるのに十分長くないが、それら自身を、融合ペプチドの結合体とともに、生来の長く循環する血漿成分に対して付着させるポリマーが、循環する期間を延ばすための誘導体を調製するのに用いられている。例えば、分子量（ＭＷ）が１．５ｋＤａのポリ（スチレン−コ−マレイン酸無水物（ＳＭＡ））は、血漿アルブミンとの結合を介して融合ペプチドの循環期間を増加し得る。
さらに、サッカライドのユニットに基づく種々のポリマーは、結合による融合ペプチドの安定化に利用され得る。例えば、デキストランまたはある酸性の多糖類、例えばペクチン、発痛酸（algesic acid）、ヒアルロン酸およびカラゲナンなど、は可溶性および不溶性の産物の両方、好ましくは可溶性の産物を生産するために融合ペプチドサブユニットと結合され得る。このような多糖類はポリアニオン性であり、一般的に食用植物に由来する。
本発明における他の実施形態において、生理的に認容されるポリマーは、ポリシアル酸（ＰＳＡ）およびその誘導体である。ＰＳＡは周知の方法により融合ペプチドに結合し得る。本発明の一実施形態では、多糖類化合物は、天然に生じる多糖類、天然に生じる多糖類からなる誘導体、または天然に生じる多糖類の誘導体であってもよい。化合物における多糖類部分は、ポリマー鎖中に、５以上、一般的には少なくとも１０、および他の実施形態においては少なくとも２０から５０のシアル酸残基を有する。容易に入手できる多糖類化合物は、ポリマー鎖中に合計で５００以上の糖の残基を有し得るが、通常は３００より少ない残基を有する。一般的に、化合物における糖の残基の全ては、シアル酸残基である。
多糖類化合物における少なくともポリシアル酸部分、および一実施形態では化合物全体は、高い親水性である。親水性は、ヒドロキシル基とともに、主としてシアル酸ユニットにおいて吊り下がったカルボキシル基により与えられる。糖ユニットは、例えばアミン、ヒドロキシルもしくは硫酸基、またはそれらの組み合わせなどの他の官能基を含んでいてもよい。これらの基は、天然に生じる糖類化合物に存在し得るか、または多糖類化合物の誘導体に導入され得る。
本発明に用いる多糖類化合物はまた、細菌により生産される。これらの天然に生じる多糖類のいくつかは、糖脂質として公知である。多糖類化合物が、肝細胞およびクッパー細胞におけるガラクトース受容体により認識されやすい末端のガラクトースユニットから実質的にフリーであれば、特に有利である。
さらにまた、銅（Ｉ）に触媒されたリビングラジカル重合を介して得られたＮ−（ヒドロキシ）スクシニミド化されたエステル末端のグリコポリマーは、結合の目的で用い得る。使用するモノマーは、保護されたグルコースおよびガラクトース、グルコフラノシドモノマー（１）およびガラクトピラノシドモノマー（２）に基づくものであってよい。対応するポリマーは、比較的狭い分子量分布（ＰＤＩ＝１．１０〜１．３１）であり、４．５から１０．２ｋＤａの間のＭｎであることを特徴とする。保護基は、ギ酸処理により除去され得る。融合ペプチドサブユニットの第１アミノ基は、末端機能的な糖ポリマーと反応し得る。
あるいは、本発明の結合分子における融合ペプチドは、コンドロイチン硫酸と結合することにより安定化し得る。この組み合わせにおける産物は、通常ポリアニオン性であり、かつ非常に親水性である。
用いるポリマーは、融合ペプチドの構成成分（Ｉ）および／または（ＩＩ）に結合されていてもよく、また、アミノ酸（ポリアミノ酸）からなるコポリマーであってもよい。使用されるアミノ酸は、天然に生じるアミノ酸または周知の人工修飾アミノ酸（以下もまた参照）であってもよい。使用され得るタンパク質の例は、アルブミン、グロブリン、グルテリン、ヒストン、プロラミン、プロタミン、ケラチン、フィブロイン、エラスチン、コラーゲン、クロマチン、レクチン、免疫グロブリン、リポタンパク質、カゼイン、ビテリン、ヘモグロビン、シトクロム、カタルス（catalse）、ロドプシン、カエルロプラスミン（caeruloplasmin）、トランスフェリン、およびフェレドキシンであり、なかでもアルブミンおよびトランスフェリンが安定させる効果のために特に好ましい。
最後に、融合ペプチドは、（ｉ）線状のポリアルキレングリコール部分、および（ｉｉ）脂肪親和性の部分を含むポリマーと結合し得る。これらのうち、融合ペプチド、線状のポリアルキレングリコール部分、および脂肪親和性の部分の立体配置的な互いの関係は、結果として生じる結合分子の生体内における酵素の消化に対する耐性が、融合ペプチドのみと比較して高まるように、調整されている。あるいは、生理的に活性な融合ペプチドは、生理的に適合性のポリエチレングリコールの修飾されたグリコリピッド部分と共有結合的に連結され得る。このような結合複合体において、生理的に活性なペプチドは、生理的に適合性のポリエチレングリコールの修飾されたグリコリピッド分子と、ポリペプチドの遊離アミノ酸基において弱い共有結合により、共有結合的に連結され得る。このうち弱い共有結合は、生体内で生化学的な加水分解および／またはタンパク質分解により切断可能である。生理的に適合性のポリエチレングリコールの修飾されたグリコリピッド部分は、ポリソルベートのポリマーにより有利に構成され得る。例えば、ポリソルベートのポリマーは、モノパルミテート、ジパルミテート、モノラウレート、ジラウレート、トリラウレート、モノオレイン酸エステル、ジオレイン酸エステル、トリオレイン酸エステル、モノステアリン酸エステル、ジステアリン酸エステル、およびトリステアリン酸エステルからなる群より選択される脂肪酸エステル基により構成される。このような複合体において、生理的に適合性のポリエチレングリコールの修飾されたグリコリピッド部分は、脂肪酸のポリエチレングリコールエステル、および例えばラウリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、およびステアリン酸からなる群により選択される脂肪酸により構成される脂肪酸のポリエチレングリコールエステルからなる群により選択されるポリマーにより好適に構成され得る。
（ポリマー活性化）
本発明の複合分子の融合ペプチドサブユニットをポリマー（既に重合された又は複合されるときにおいては単量体型のどちらかである）に複合するために、ポリマーはまず活性化される必要がある。「活性化」は、ポリマーへの反応基の予備的な結合を意味する。既に少なくとも１つの反応基を含むポリマーと同様に、活性化されたポリマーは「活性」状態と呼ばれる。多くの合成ポリマーは、通常、タンパク質のｓペンダント基と反応する反応基を含まない。例えば、非置換型ＰＥＧは、直鎖状のポリマー鎖の各末端において水酸基を有しており、タンパク質に対する複合の前に、これらの１つ又は両方がまず活性化されなければならない。架橋の可能性を回避するために、ＰＥＧの２つの水酸基末端の１つのみを活性化し、「単官能基」置換型ＰＥＧを形成することが望ましい。
タンパク質複合の前にポリマーを活性化するための技術は、当業者に周知である。例えば、Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, p. 605619 (1996) Academic Pressを参照のこと。例えば、ＰＥＧ又はｍＰＥＧにおける水酸基の活性化は、他の天然ポリマー又は合成ポリマーと同様に、トリクロロ−ストリアジン（ＴｓＴ；シアヌル酸）を用いて達成し得る（とりわけ、Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252:3582-3586 (1977)及びAbuchowski et al., J. Biol. Chem. 252:3578-3581 (1977)を参照のこと）。水酸基を活性化する他の方法は、アミン反応性Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミジル−（ＮＨＳ）又はｐ−ニトロフェニル（Ｎｐ）炭酸塩活性エステルの形成を介する(Zalipsky et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 15:100-114 (1992)を参照のこと)。
同様の活性化は、ヒドロキシル基を含むポリマーがまず環状無水物（コハク酸無水物又はグルタル酸無水物）と反応され、その後、形成されたカルボキシル基改変型産物が、カルボジイミドの存在下においてＮ−ヒドロキシスクシンイミドと結合され、スクシンイミジルコハク酸塩又はグルタレート型活性エステルをもたらすときに達成され得る（Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys. 7:175-186 (1984)を参照のこと）。
ポリマー、好ましくはＰＥＧと、融合ペプチドとを複合するための別の方法は、（遷移金属触媒性リビングラジカル重合からの）Ｎ−スクシンイミジルエステル官能基化ポリマーを用いるリビングラジカル重合に基づいている。
ポリマーの水酸基を活性化するための他の方法は、Ｎ、Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を用いた反応によるイミダゾリルカルバメート中間体の形成を介する。ＣＤＩ活性化型ポリマーはタンパク質のアミン基と反応し、上述したスクシンイミジルカルボネート化学反応を用いて形成されたＮアルキルカルバメート連鎖と同等の、安定なＮアルキルカルバメート連鎖を形成する（Beauchamp petal., Anal. Biochem. 131:25-33 (1983)を参照のこと）。
ＰＥＧのような合成ポリマーの活性化におけるさらなる方法に関して、とりわけ、米国特許第５，３４９，００１号明細書；米国特許第５，３５９，０３０号明細書；及び米国特許第５，４４６，０９０号明細書を参照のこと。
本発明の複合分子の融合ペプチドサブユニットに対して複合されるポリマーが、血清タンパク質のような天然のポリマーであるとき、以下の項においてより十分に記載されるように、一般的に、多機能架橋剤の結合によってタンパク質サブユニットを活性化することが好ましい。
（ポリマー−融合ペプチド複合体化）
ポリマーの活性化の後で（もし必要であれば）、当該ポリマーは個々の融合ペプチドサブユニットと複合体化される。一般に、ポリマーは、一次アミノ基、カルボキシル基、芳香環、又はチオール基のようなタンパク質鎖におけるペンダント基を介して共有結合的にタンパク質に結合され得る（融合ペプチドに対する場合において）。これらのすべてのペンダント基は既に存在していてもよいし、又は本発明の周知の実施形態を用いる、タンパク質の予備的な化学的改変又はタンパク質のアミノ酸配列の改変によって付加され得る。
複合体化を実行するために用いられるための融合ペプチドに対するポリマーの割合は、個々のサブユニットの特性（ペンダント基の数及び位置、生物学的活性の性質）と同様に、ポリマーの特性（構造、大きさ、電荷、反応性）によって決まる。それは、生物学的活性及び複合安定性を最適化するために割合を変化させることによって適切な割合を決定することは、日常の実験の問題である。
融合ペプチドサブユニットに対するＰＥＧの複合に関して３つの主たる選択肢、すなわち、アミン、チオール及び水酸基のＰＥＧ化があり、これらは本発明の本複合分子を提供するために用いられ得る。
アミンＰＥＧ化に関して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル（タンパク質のＰＥＧ化のために最もよく使われる方法であるＮＨＳ−法）を用いることによって以下の方法が採用され得る。この方法によって、全ての一次アミノ基及び二次アミノ基が扱われる。結果は安定なアミノ結合である。改変は、穏やかなアルカリ条件下、例えば、５０ｍＭ重炭酸塩緩衝液ｐＨ８．５から９．５において実行される。これらの条件を用いてＮＨＳ活性エステルは非常によく反応する。概して、上記改変は、４℃から２５℃の間の温度において１時間後に完了される。改変の程度は、融合ペプチドにおける改変され得る基の数に関するＰＥＧ−ＮＨＳ−試薬の量（当量）によって容易に制御され得る。
（反応スキーム）
Figure 2010521186
この方法は、迅速且つ効率的な結合を可能にし、アミノ基に関して選択的であり、且つ改変された基が拡散するために非常に良好な表面保護をもたらす。しかしながら、ＮＨＳ−法は融合ペプチド表面における改変の統計的な拡散をもたらすため、もし、融合ペプチドがアルカリ反応条件に対して反応し易い及び／又は均質な最終産物が必要とされるなら好ましくない。ｐＨ値は反応に影響を与える。ｐＨ値が高ければ、融合ペプチドサブユニットのリジン残基の改変はより効率がよくなる。７より下のｐＨ値において、ヒスチジン残基の選択的改変は可能である。この改変は、しかしながら、アルカリ条件に対して安定ではない。好ましくは、アミノ基に関するＰＥＧ−試薬の当量は１：１から１００：１の範囲である。通常、融合ペプチド濃度が高いほど、ＰＥＧ化はより効率がよくなる。理想的には、融合ペプチド濃度は０．１ｍｇ／ｍＬから１５ｍｇ／ｍＬの範囲において選択される。
もう一つの方法として、還元的アミノ化を採用し得る。還元的アミノ化は、融合ペプチドのアミノ末端を扱い、且つＰＥＧ−アルデヒドを用いて行われる。Ｎ−末端アミノ酸を用いたアルデヒドの濃縮は不安定な中間体（シッフ塩基）をもたらす。これは、ＮａＣＮＢＨ３によって、安定な二次アミンへと還元される。上記改変は、僅かに酸性条件、例えば、ｐＨ５から６における５０−１００ｍＭＮａ−酢酸塩緩衝液において実行される。上記反応は、４℃から２５℃の間の温度において、１４時間から２４時間を要する。反応緩衝液は、還元のために２５ｍＭＮａＣＮＢＨ３を含む。上記反応を停止するために、エタノールアミンが用いられ得る。改変の程度は、主として反応時間によって決定され、より低い程度で温度及びＰＥＧ−アルデヒドの当量によって決定される。
（反応スキーム）
Figure 2010521186
還元的アミノ化は、Ｎ−末端の選択的な改変をもたらし得る。好ましくは、モノ−ＰＥＧ化がこの方法によって可能となる。しかしながら、もし短い反応時間が要求される及び／又はモノ−ＰＥＧ化、ジ−ＰＥＧ化及びトリ−ＰＥＧ化種の分離のためのクロマトグラフィー段階が望まれないのであれば好ましくない。この方法の好ましい実施形態において、ＮａＣＮＢＨ３の濃度は調整される。ＮａＣＮＢＨ３の濃度が高ければ、安定な最終産物の構築がより早くなる。好ましくは、アミノ末端に関するＰＥＧ−試薬は、１：１の割合から１０：１の割合の範囲である。ｐＨ値に関して、４．５から６のｐＨ値の間の僅かに酸性条件が好ましい。Ｎ−末端アミノ基のｐＫｓ値は、リジンのエプシロンアミノ基のｐＫｓ値と僅かに異なる。それゆえ、Ｎ−末端の選択的ＰＥＧ化はｐＨ値にひどく依存する。さらに、融合ペプチド濃度が高いほど、ＰＥＧ化の効率はよくなる。理想的には、融合ペプチド濃度は２ｍｇ／ｍＬから１５ｍｇ／ｍＬの範囲において選択される。
チオールＰＥＧ化に関して、以下のマレイミド法が採用され得る。もし、タンパク質がシステインの形態における数個又は理想的にはただ１つのスルフヒドリル基を含んでいるなら、チオール基のＰＥＧ化は好ましい方法である。この方法は、安定なチオエーテル結合を生じる。マレイミド法は、ｐＨ値に強く依存し、且つｐＨ値８、例えば、５０ｍＭ重炭酸緩衝液において実行される。より高いｐＨ値において、副反応はアミン基を用いて起こる。上記反応は、２５℃において２時間実行される。上記反応は、エタンチオール、ＤＴＥ及びＤＴＴのようなチオール含有試薬の添加によって終結させることができる。
（反応スキーム）
Figure 2010521186
もし、例えば、遺伝学的方法によって導入された（改変された）融合ペプチドにおいて、ただ１つの遊離のチオール基が存在するなら、この方法は、チオール基の選択的ＰＥＧ化、穏やかな反応条件及び／又は部位特異的モノＰＥＧ化のために特に好まれる。上記方法は、反応パラメータ、すなわち例えば濃度条件の有利な選択によって最適化され得る。融合ペプチド濃度が高いほど、ＰＥＧ化はより効率よくなる。好ましくは、融合ペプチド濃度が２ｍｇ／ｍＬから１５ｍｇ／ｍＬの範囲において選択される。
最終的に、ＰＥＧ化は水酸基ＰＥＧ化によって、好ましくはエポキシド法に基づいて達成され得る。ＰＥＧ−エポキシドはｐＨ値８．５から９．５の間、例えば５０ｍＭ重炭酸緩衝液における僅かにアルカリ条件下において、水酸基と反応しエーテル結合を形成するる。頻繁に副反応はアミン基及びチオール基と起こる。ＰＥＧエポキシドはアルカリｐＨ値における水溶液において非常に安定である。カップリングは１４時間から２５時間、４℃から２５℃において実行される。上記反応はエタノールの添加によって容易に終結させることができる。
（反応スキーム）
Figure 2010521186
もし、水酸基との反応に関して穏やかな反応条件が望まれるなら、上記エポキシド法は好ましい。もし、ＰＥＧ化の高い特異性及び／又は短い反応時間が求められるなら、この方法はふさわしくない。融合ペプチド濃度が高いほど、ＰＥＧ化の効率はよくなる。好ましくは、融合ペプチド濃度が１ｍｇ／ｍＬから１０ｍｇ／ｍＬの範囲において選択される。
本発明の好ましい実施形態において、約４００００の平均分子量を有し、マレイミドプロピオンイミド基を用いて活性化される非分岐型ｍＰＥＧは、融合ペプチドのアミノ酸システインのチオール基に複合される。ｍＰＥＧが複合されるべき配列において、融合ペプチドはシステイン残基を含み得ないので、この技術における標準法によって、例えばペプチド構成成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）のＮ−末端及び／又はＣ−末端、好ましくは構成成分（Ｉ）のＮ−末端又は構成成分（ＩＩ）のＣ−末端において、容易に組み入れられ得る。もう一つの方法として、システイン残基はアミノ酸置換、好ましくは例えばシステインによるセリン残基、グリシン残基又はアラニン残基の置換のようなに同類置換によっても導入され得る。融合ペプチドは通常チオール基（システイン残基）を含まないので、例えばチオール基を介する融合ペプチドの複合は有利である。従って、チオール基は特に融合ペプチドに導入されなければならない。これは、同様に、複合が複合分子の特異的部位に位置することを可能にする。
しかしながら、これらは、構成成分（Ｉ）及び構成成分（ＩＩ）の間のリンカー配列も備えられ得る。必要であれば、構成成分（Ｉ）及び（ＩＩ）の間のリンカー、例えば、少なくとも１つのシステイン残基を含む１から１０の短いアミノ酸配列、好ましくは約４アミノ酸によって、上記システイン残基は備えられ得る。
本明細書において用いる場合、用語「発明の（融合）ペプチド」は、本明細書において定義された融合ペプチド、その変異体、類似体、フラグメント、又は誘導体であり、それらの組み合わせ（例えば、融合ペプチドの誘導体のフラグメント、類似体又は変異体であって、当該融合ペプチドの誘導体は、少なくとも構成部分（Ｉ）及び構成部分（ＩＩ）を含み、それらが互いに直接又は間接的に共有結合されているもの）を含む。上記融合ペプチドは、追加の構成部分、例えば構成部分（ＩＩＩ）、を含み得る。本発明に係る融合ペプチドは、少なくとも一つのポリマー成分と連結されており、本発明の複合分子を形成する。本明細書において、用語「ＧＬＰ−１ペプチド」は、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）を意味し、「改変されたＧＬＰ−１ペプチド」は、任意のＧＬＰ−１の類似体、ＧＬＰ−１の誘導体、ＧＬＰ−１の変異体、又はＧＬＰ−１のフラグメントを意味することが意図され、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）の誘導体のフラグメント、類似体又は変異体を範疇に含んでおり、本発明のペプチドの構成部分（Ｉ）及び（ＩＩＩ）の何れかに存在し得る。本明細書において用いる場合、用語「ＧＬＰ−２ペプチド」は、ＧＬＰ−２（１−３３、３４又は３５）を意味し、「改変されたＧＬＰ−２ペプチド」は、任意のＧＬＰ−２の類似体、ＧＬＰ−２の誘導体、ＧＬＰ−２の変異体、又はＧＬＰ−２のフラグメントを意味することが意図され、ＧＬＰ−２（１−３３、３４又は３５）の誘導体のフラグメント、類似体又は変異体を範疇に含んでいる。変異体、類似体、フラグメント及び誘導体は、改変されていない配列、例えばＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）又はＧＬＰ−２（１−３３、３４又は３５）、への改変として特徴付けられる。本発明の意義の範囲内において、任意の変異体、類似体、フラグメント又は誘導体は、機能的であるべきである。例えば、改変されていないＧＬＰ−１ペプチドと生物学的に同等の効果を奏すべきである。
好ましくは、本発明のペプチドは、融合ペプチド又はその変異体、類似体、フラグメント若しくは誘導体であり、構成部分（Ｉ）は、配列番号１に示される配列に対し、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、さらに好ましくは、少なくとも９０％の相同性を有する配列を含んでいる。配列番号１は、哺乳動物において厳密に保存されている、ＧＬＰ−１（７−３７）（長さ３１アミノ酸）の天然のアミノ酸配列を示す。
本発明に係る融合ペプチド（又は、より広く、融合ペプチドの類似体、フラグメント、変異体もしくは誘導体を含む、任意の本発明のペプチド）の二番目の構成部分（構成部分（ＩＩ））は、典型的には、βターン様構造を形成するか又はしない、少なくとも９個のアミノ酸を有するペプチド配列を含んでいる。βターン構造は、タンパク質又はペプチドの典型的な二次構造要素である。βターン構造は、典型的には４つのアミノ酸から形成され、ペプチド又はタンパク質の背骨となる鎖の方向を反転させる。構成部分（ＩＩ）のアミノ酸配列は、少なくとも９個のアミノ酸を含み、好ましくは、少なくとも一つのプロリン又はアラニン残基をその配列中に含み得る。プロリン残基は、βターンを形成する四量体アミノ酸配列内の共通するアミノ酸である。プロリン残基は、上記融合ペプチドの構成部分（ＩＩ）に存在する四量体βターン配列の第２番目又は第３番目、好ましくは第２番目の位置に共通して配置されている。
本発明の融合体は、典型的には、その構成部分（ＩＩ）中に、９〜３０アミノ酸、好ましくは９〜２０アミノ酸、最も好ましくは９〜１５アミノ酸の長さの配列を含む。一般的に、構成部分（ＩＩ）におけるより短い配列は、長い配列に比べてＧＬＰレセプターに対する結合活性が高いため好適であり得る。構成部分（ＩＩ）の配列は、必須の条件ではないが、好ましくは中性であり得、又は、ｐＨ７において負電荷を帯び得る。
本発明に係る融合ペプチドは、構成部分（ＩＩ）がＶＡＩＡ、ＩＡＥＥ、ＰＥＥＶ、ＡＥＥＶ、ＥＥＬＧ、ＡＡＡＡ、ＡＡＶＡ、ＡＡＬＧ、ＤＦＰＥ、ＡＡＤＸ、ＡＸＤＸ、及びＸＡＤＸ（Ｘは、任意の、天然に生じた又は非天然の改変されたアミノ酸を指す）からなる群より選択されるモチーフ配列を有することが好ましい。これらの４量体モチーフは、構成部分（ＩＩ）の配列の任意の位置に存在し得る。特に好ましい実施形態において、本発明の融合ペプチドの構成部分（ＩＩ）は、その、ＡＡ、ＡＸ、ＲＲ、ＲＸ、及びＸＲ（Ｘは、任意の、天然に生じた又は非天然の改変されたアミノ酸を示す）からなる群より選択されるＮ末端のモチーフを介して、構成部分（Ｉ）のＣ末端と結合しているペプチド配列である。
本発明の融合ペプチドの構成部分（ＩＩ）の好適なモチーフとしては、ヒト又はマウスＩＰ−２の部分配列に対応する、配列番号２５の配列モチーフ（ＤＦＰＥＥＶＡ）又は配列モチーフＤＦＰＥＥＶＡに対して少なくとも８０％配列相同性を有する配列が挙げられる。
特に好ましいのは、構成部分（ＩＩ）が、配列番号２２に示される配列（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩ）、若しくは、配列番号２６に示される配列（ＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩ）（全てのアミノ酸配列は、一文字表記されている）、又は、配列番号２２若しくは配列番号２６に示される配列に対して少なくとも８０％の相同性を有している配列を含んでいる融合ペプチドである。配列番号２２は、ＩＰ−２（介在ペプチド２）の全長配列（ヒト又はマウス）の部分配列であって、１５アミノ酸長の全長ＩＰ−２配列のＮ末端の１０アミノ酸を含む配列を示す。配列番号２６は、配列番号２２に示す配列に対し、Ｎ末端（ＲＲ）残基を（ＡＡ）で置換することにより得られる配列を示す。ＩＰ−２は、βターンを含むペプチド配列の好適な例である。そして、構成部分（ＩＩ）に含まれる、他のより好適な配列は、ＩＰ−２の配列のより長い部分配列、例えば、ヒトに存在するＮ末の１４アミノ酸の配列（配列番号２３（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬ））若しくはそのマウスのカウンターパート（配列番号２４（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬ））又は配列番号２３若しくは２４に示される配列に対して少なくとも８０％の相同性を示す配列である。上記融合ペプチドの構成部分（ＩＩ）に含まれる最も好ましい因子は、自然に存在するＩＰ−２配列の１５アミノ酸の全てを有する全長ＩＰ−２配列（ヒト：配列番号２（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ）、マウス：配列番号３（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ））又は配列番号２若しくは３に示される配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する配列である。本発明の範囲は、ＩＰ−２の哺乳動物におけるイソ型（哺乳動物におけるＩＰ２の自然のバリエーション）の全てを含む。本段落において言及された全ての配列は、例えば、配列番号２７（ＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬ）、配列番号２８（ＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬ）、配列番号２９（ＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ）、配列番号３０（ＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ）のように、天然に存在する（ＲＲ）に代わるＮ末端のモチーフ（ＡＡ）、（ＡＸ）又は（ＸＡ）とともに用いられ得る。例えば、ＩＰ２又はＩＰ２のフラグメント若しくは変異体の２コピー、３コピー、又はさらに多コピーの配列のような、１コピー以上の配列が構成部分（ＩＩ）に含まれているものも用いられ得る。
従って、本発明のペプチドは、配列番号８に示される配列（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ）、即ち、ＧＬＰ−１（７−３７）が、そのＣ末端を介してマウスＩＰ−２に、リンカー配列をともなわずに連結した配列、又は、配列番号１２に示される配列（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ）、即ち、ＧＬＰ−１（７−３７）が、そのＣ末端を介してヒトＩＰ−２に、リンカー配列をともなわずに連結した配列を好適に含む。配列番号８及び配列番号１２に示される本発明のペプチドのさらに好適な本発明に係る変異体は、配列番号３１（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ）、配列番号３２（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＡＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ）、配列番号３３（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＡＡＡＡＶＡＩＡＥＥＬＧ）、配列番号３４（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＡＡＤＡＡＡＡＶＡＩＡＡＡＬＧ）、配列番号３５（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰ）、配列番号３６（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡ）、配列番号３７（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧＲＲＨＡＣ）、配列番号３８（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ）、配列番号３９（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＡＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ）、配列番号４０（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＡＡＡＡＶＡＩＶＥＥＬＧ）、配列番号４１（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＡＡＤＡＡＡＡＶＡＩＶＡＡＬＧ）、配列番号４２（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧＲＲＨＡＣ）、即ち、ＧＬＰ−１（７−３７）が、そのＣ末端を介してＩＰ−２配列の特定の類似体又は変異体に、リンカー配列をともなわずに連結した配列である。配列番号８及び１２又はその誘導体に対して少なくとも８０％の相同性を有するそれらの変異体、類似体、又はフラグメントも同様に範疇であり、好ましい。
ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）が、それを必要とする任意の患者に投与された場合、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）の不安定性は、その保護されていない３次元構造に起因することを、本発明者らは独自に見出した。生体内において、プロテアーゼはＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）分子を切断し、その生理学的な活性を急速に消失させる。ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）のＣ末端にペプチドの配列を連結させることにより、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）の構造は、酵素的な分解に対して安定性を獲得する。このような安定性の獲得は、Ｃ末端の付加的なペプチド配列（本発明に係る融合ペプチドの構成部分（ＩＩ）に含まれている）が折り曲がっている場合、例えば、βターン構造が存在するような一次構造を有しており、構成部分（ＩＩ）に堅牢性を付与している場合に、特に顕著となる。しかしながら、本発明のペプチドの構成部分（ＩＩ）におけるβターン構造は、構成部分（Ｉ）のＧＬＰ−１配列の、酵素的な分解に対する安定化のために必ずしも必要というわけではない。本発明のペプチドは、そのＣ末端の伸長されたペプチド（例えば、βターン構造要素を含んいる）の効能により、ＤＰＰ−ＩＶによる不活性化に対して向上した抵抗性を有することが見出されている。Ｃ末端のペプチドは、そのターゲットとする細胞のその受容体に作用する前には、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）配列から切断されないか、又は、生体内において、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）を形成するように酵素的に切断され得る。ＧＬＰ−１受容体の部位に結合する本発明のペプチドの厳密な形状によらず、本発明のペプチドは、活性のあるインスリン分泌性の化合物としての働きを奏する。
構成部分（ＩＩ）に含まれるに好適と考えられるペプチド配列は、そのβターン要素を導く一次構造に応じて、例えば、分光学的な手法、円偏光二色性分析、その他の当業者に公知な方法を用いて、容易に適宜特定することができる。
構成部分（ＩＩ）及び構成部分（Ｉ）は、直接連結されていてもよいし、リンカー配列を介して連結されていてもよい。好ましくは、両構成部分は、互いに直接連結されている。それらがリンカー（又はスペーサー）を介して連結されている場合、当該リンカーはペプチドリンカーであることが好ましい。ペプチドリンカーは、典型的には、１から１０のアミノ酸長を有しており、好ましくは、１から５の、なお好ましくは１から３のアミノ酸長を有しており、又いくつかの場合において、リンカー配列は、なお長い１１から５０のアミノ酸を含む配列であり得る。ペプチドリンカーは、様々なアミノ酸配列から構成され得る。好ましくは、ペプチドリンカーは、連結される構成部分間に構造的な柔軟性を導入する。構造的な柔軟性は、例えば、様々なグリシン又はプロリン残基を含むペプチドを用いることにより達成され、好ましくは、少なくとも３０％、より好ましくは、少なくとも４０％、なおさらに好ましくは、少なくとも６０％のプロリン及びグリシンをリンカー配列内に含む。ペプチドリンカーは、具体的な配列によらず、好ましくは、免疫学的に不活性であり得る。
本発明の好ましい実施形態において、本発明のペプチド、即ち、融合ペプチド又はその類似体、フラグメント、変異体若しくは誘導体は、構成部分（ＩＩ）のＣ末端及び／又は構成部分（Ｉ）のＮ末端の何れかに連結する第４の構成部分（構成部分（ＩＩＩ））を含む。好ましくは、構成部分（ＩＩＩ）は、構成部分（ＩＩ）のＣ末端に位置する。構成部分（ＩＩＩ）が（そのＣ末端を介して）構成部分（Ｉ）のＮ末端に連結するか、又は、（そのＮ末端を介して）構成部分（ＩＩ）のＣ末端に連結するかによらず、結合は、直接的、又はリンカー配列を介した間接的なものであり得る。上記リンカー配列については、上述した構成部分（Ｉ）及び構成部分（ＩＩ）を結合するリンカーについての開示において説明されている。一般的に、構成部分（ＩＩＩ）は、少なくとも４個のアミノ酸残基を含んでおり、好ましくは、少なくとも１０個の付加的なアミノ酸残基を含んでおり、より好ましくは、少なくとも２０個、又は少なくとも３０個のアミノ酸残基を含んでいる。機能の観点から言えば、構成部分（ＩＩＩ）は、本発明のペプチドの安定性をさらに増強することを目的としている。構成部分（ＩＩＩ）は、ＧＬＰ−１（７−３７）の生物学活性とほぼ同程度である本発明のペプチドの生物学的活性を阻害しないことが期待されている。
好ましくは、本発明の構成部分（ＩＩＩ）は、少なくとも４個の、好ましくは、少なくとも１０個の、より好ましくは、少なくとも２０個の付加的なアミノ酸残基を、例えば、配列番号４及び５に示されるマウス又はヒトのイソ型のような、任意の哺乳動物の個体のＧＬＰ−２のイソ型（他の、哺乳動物において、自然に存在するＧＬＰ−２の変異体）の配列のＮ末端に含んでいる。ＧＬＰ−２は、プログルカゴン内に存在し、炭水化物代謝に関与する。構成部分（Ｉ）に含まれる生物学的に活性な配列（ＧＬＰ−１ペプチド）と同様、構成部分（ＩＩＩ）は、ＧＬＰ−２の自然に存在する形態の類似体、変異体又は誘導体を含んでいてもよい。他の局面において、構成部分（ＩＩＩ）は、少なくとも４個の、好ましくは、少なくとも１０個の、より好ましくは、少なくとも２０個の付加的なアミノ酸残基を、同様に、全ての哺乳動物のイソ型、又は（本明細書において記載したような）、その全ての機能的な変異体、類似体若しくは誘導体を含む、ＧＬＰ−１（７−３７）のＮ末端配列に含んでいてもよい。一般に、構成部分（ＩＩＩ）は、ＧＬＰ−１ペプチド、又は、本明細書において示すような、本発明のペプチドの構成部分（Ｉ）に適合するような、改変されたＧＬＰ−１ペプチドの任意の形態を含んでいてもよい。さらに他の局面において、構成部分（ＩＩＩ）は、ＧＬＰ−１（７−３７）及びＧＬＰ−２のキメラ形態を含んでいてもよい。キメラ形態は、ＧＬＰ−１（７−３７）とＧＬＰ−２（又は両方のフラグメント、類似体、変異体若しくは誘導体）とを互いに結合させることにより作り出すすることができ、続いて、このキメラ形態は構成部分（ＩＩＩ）として本発明のペプチドに導入される。好ましくは、上記キメラ形態は、一つに連結された、ＧＬＰ−１（７−３７）の部分配列及びＧＬＰ−２の部分配列から構成される。例えば、上記キメラ形態は、ＧＬＰ−１のＮ末端の５から３０個のアミノ酸及びＧＬＰ−２のＣ末端の５から３０個のアミノ酸、又はその逆の構成であり得、又例えば、ＧＬＰ−１（７−３７）の第７又は第８番目から第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７又は第２８番目までのアミノ酸、及び、ＧＬＰ−２のアミノ酸配列の第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３又は第２４から、例えばＣ末端までであり得る。
もし、自然に存在する形態のＧＬＰ−２又はＧＬＰ−１（７−３７）のそれぞれの改変体が、構成部分（ＩＩＩ）として用いられた場合、構成部分（ＩＩＩ）は、好ましくは、配列番号４若しくは５に示される配列か、配列番号１に示される配列か、又は、配列番号４若しくは５に示されるか、配列番号１に示される配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する配列を含んでいる。これらの好適な配列に対する変異、例えば、側鎖の修飾又はペプチド主鎖の改変に起因するもの等も、（本明細書において「変異体」に関連する部分のように）本発明の構成部分（ＩＩＩ）として包含される。
他の実施形態において、構成部分（ＩＩＩ）は、上述したような配列を複数個含んでいる。例えば、構成部分（ＩＩＩ）は、少なくとも２つの、好ましくは、２、３、又は４コピーのＧＬＰ−１（７−３７）及び／若しくはＧＬＰ−２、又は、少なくとも２コピーの、配列番号１、４若しくは５に示される配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する配列を含んでいてもよい。又、構成部分（ＩＩＩ）は、少なくとも１コピー以上の、上述したような、例えば、最終的には、ＧＬＰ−１（７−３７）及び／若しくはＧＬＰ−２又はその、少なくとも８０％の配列上の相同性を有する改変のキメラ形態のバリエーションを形成する、ＧＬＰ−１（７−３７）又はＧＬＰ−２のキメラ形態を含んでいてもよい。本発明の範囲内では、又、二つ以上の、好ましくは二つの構成部分（ＩＩＩ）を含んでいてもよく、それらは、例えば、（１）そのＮ末端により、構成部分（ＩＩ）のＣ末端に連結されており、（２）そのＣ末端により、構成部分（Ｉ）のＮ末端にリンカーを介して又は直接連結されている。もし二つの構成部分（ＩＩＩ）が供給されている場合、それらは同一であってもよいし、それぞれ異なっていてもよい。
以上のように、構成部分（Ｉ）、（ＩＩ）、合成若しくは天然のポリマー、及び／又はタンパク質、並びに構成部分（ＩＩＩ）を含む本発明の複合分子は特に好適である。これらの全ての成分を含んでいる四つの具体的な実施形態は、配列番号６（Ｎ−ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２（マウス）−ＲＲ−ＧＬＰ−１（７−３７）−Ｃ、本明細書においてマウスＣＭ１とも称される）、配列番号７（Ｎ−ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２（マウス）−ＲＲ−ＧＬＰ−２−Ｃ、本明細書においてマウスＣＭ２とも称される）、配列番号１０（Ｎ−ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２（ヒト）−ＲＲ−ＧＬＰ−１（７−３７）−Ｃ、本明細書においてヒトＣＭ１とも称される）、又は配列番号１１（Ｎ−ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２（ヒト）−ＲＲ−ＧＬＰ−２−Ｃ、本明細書においてヒトＣＭ２とも称される）に示される配列、配列番号６、７、１０又は１１に示される配列に対して、少なくとも８０％の相同性を有する配列、又は、それらの誘導体から選択される。配列番号６、７、１０又は１１に示される全ての配列は、ＩＰ２（構成部分（ＩＩ））のＣ末端にＲＲ−リンカー（二つのアルギニン残基）を有している。これは、排除されていてもよい。配列番号６、７、１０又は１１に係る各実施形態のそれぞれの構成部分（Ｉ）は、ＧＬＰ−１（７−３７）であり、構成部分（ＩＩＩ）（これらの各実施形態において、構成部分（ＩＩ）のＣ末端に結合されている）は、ＧＬＰ−１（７−３７）又はＧＬＰ−２である。
本発明のペプチドは、様々な変形態様を生じうる。このような変形態様は以下に開示され、詳細に説明される。
本明細書において、用語「塩」は、カルボキシル基の塩と、上述した融合ペプチド、その類似体、フラグメント、誘導体又は変異体のアミノ基の酸付加塩との両方について言及される。カルボキシル基の塩としては、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第２鉄、又は亜鉛の塩等のような、公知の手法により形成された無機塩、及び、例えばエタノールアミン等のアミン、アルギニン、リジン、ピペリジン、プロカイン等との塩のような、同様に形成された有機塩基との塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、塩酸又は硫酸のような鉱酸との塩、及び、例えば、酢酸又はシュウ酸のような有機酸との塩が挙げられる。当然に、これらの任意の塩は、本発明に係るペプチドの生物学的な活性、即ち循環器系への栄養の流入率を低減させる能力、を保持する。上述したように、塩の形態のペプチドは、薬学的な製剤内に含有され得る。
本発明に係る融合ペプチドの「フラグメント」は、上記分子の任意の部分集合、即ち、より短いが、所望の生物学的活性を保持するペプチドについて言及される。フラグメントは、上記分子（即ち、融合ペプチド又は任意の構成部分）の何れかの末端からアミノ酸を除去し、インクレチンとしてのその特性からもたらされる結果を試験することにより、調製され得る。ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端の何れかから、一度に、一つのアミノ酸を除去するプロテアーゼは公知であり、所望の生物学的活性を保持するフラグメントの決定に必要なのは、単なる通常の実験操作である。このように、フラグメントは、ペプチド末端におけるアミノ酸、及び／又はペプチド配列中に位置するアミノ酸の除去によるものであり得る。
さらに、抗糖尿病タイプＩＩ活性を有する本発明のペプチドは、融合ペプチドそのもの、その類似体、変異体、塩、機能的な誘導体、及び／又はフラグメントであり、本発明のペプチドに隣接する付加的なアミノ酸残基をさらに含有し得る。結果得られる分子が、プロテアーゼに対する抵抗性又は安定性、及びインクレチンとしての活性を保持する限り、任意の上記のような隣接する残基が、主たるペプチドの基本的又は新規な特徴、例えば膵臓細胞への影響に影響を及ぼすか否かを、通常の実験により決定することができる。特定の配列について言及するとき、用語「実質的に」「からなる」は、特定された本発明のペプチドの基本的及び新規な特徴に影響を及ぼさない付加的な隣接する残基が存在し得ることを指す。この用語は、上記特定された配列中における置換、削除又は付加を意味しない。
本発明における「変異体」は、上記において規定された本発明のペプチドの全体又はそのフラグメントと実質的に同一の分子を指す。変異ペプチドは、公知の手法を用いた変異ペプチドの直接的な化学合成により首尾よく調製され得る。当然に、そのような本発明のペプチドの変異体は、同様の抗糖尿病性、例えば、天然に生じた相当するＧＬＰ−１ペプチドのようなインスリン刺激活性、を有する。
他の局面において、上記において定義されたペプチドのアミノ酸配列変異体は、合成された誘導体をコードするＤＮＡｓにおける突然変異によって調製され得る。例えば、この変異体は、上記アミノ酸配列中の残基からの削除、又は残基の挿入もしくは置換を含む。また、最終コンストラクトが所望の活性を有するのであれば、最終コンストラクトに辿りつくよう、削除、挿入及び置換は任意に組み合わせてもよい。言うまでもなく、変異体ペプチドをコードするＤＮＡで作られ得る突然変異はリーディングフレームを変更してはならず、好ましくはｍＲＮＡの二次構造を生成し得る相補的な領域を作り出さない。
本発明において、上記で定義されたペプチドの「類似体」は、分子全体、又は分子の活性フラグメントのいずれかと非常に類似している非天然の分子を意味する。上記類似体は、相当する天然に生じたＧＬＰ−１ペプチドと同様の活性を示し得る。
他の局面において、上記において定義されたペプチドのアミノ酸配列変異体は、合成された誘導体をコードするＤＮＡｓにおける突然変異によって調製され得る。例えば、この変異体は、上記アミノ酸配列中の残基からの削除、又は残基の挿入もしくは置換を含む。また、最終コンストラクトが所望の活性を有するのであれば、最終コンストラクトに辿りつくよう、削除、挿入及び置換は任意に組み合わせてもよい。言うまでもなく、変異体ペプチドをコードするＤＮＡで作られ得る突然変異はリーディングフレームを変更してはならず、好ましくはｍＲＮＡの二次構造を生成し得る相補的な領域を作り出さない。
本発明において、上記で定義されたペプチドの「類似体」は、分子全体、又は分子の活性フラグメントのいずれかと非常に類似している非天然の分子を意味する。上記類似体は、相当する天然に生じたＧＬＰ−１ペプチドと同様の活性を示し得る。
本発明において、本発明のペプチドで形成され得る置換のタイプは、異なる種類のホモログタンパク質／ペプチドの間でのアミノ酸交換の頻度の解析を基にしてもよい。上記解析に基づき、保存置換は下記に示す５つのグループのうち１つの範囲内における交換として、本明細書に定義され得る。
Ｉ．小型の脂肪族化合物であり、非極性もしくはわずかな極性の残基として、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；ＩＩ．極性であり、負電荷を帯びた残基及びそれらのアミドとして、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；ＩＩＩ．極性であり、正電荷を帯びた残基として、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；ＩＶ．大型であり、脂肪酸化合物の非極性残基として、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ；Ｖ．大型の芳香族残基として、Ｐｈｅ、Ｔｒｙ、Ｔｒｐである。
上述のグループのうち、以下の置換、すなわちＡｓｐ／Ｇｌｕ；Ｈｉｓ／Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ｐｈｅ／Ｔｙｒ／Ｔｒｐ；Ｍｅｔ／Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌは、「より高度に保存」されると考えられる。半保存的置換は、上述したグループ（Ｉ）〜（ＩＶ）のうち２つの間での交換であると定義されており、上記（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）を含むスーパーグループ（Ａ）、又は上記（ＩＶ）及び（Ｖ）を含むスーパーグループ（Ｂ）に限定される。置換は、遺伝的にコードされるアミノ酸に限定されるものではなく、まして自然に存在するアミノ酸に限定されるものではない。
概して、本発明のペプチドの類似体もしくは変異体もまた、例えば溶解度の改善を意図してなされたアミノ酸置換（疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸との置き換え）を含む。本発明のペプチドからなるＧＬＰ−１ペプチドの変異体／類似体（本発明のペプチドの構成部分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）において生じる）の一実施形態において、（改変された）ＧＬＰ−１ペプチドは、上記ＧＬＰ−１ペプチドの第７番目、第８番目、第１１番目、第１２番目、第１６番目、第２２番目、第２３番目、第２４番目、第２５番目、第２７番目、第３０番目、第３３番目、第３４番目、第３５番目、第３６番目又は第３７番目の位置での１つ以上の置換によって特徴づけられる。一例として、以下の用語[Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）]は、第３４番目の位置で、天然に生じたリジンがアルギニンと置換されているＧＬＰ−１類似体を表す。
具体的には、本発明のポリペプチドの構成成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）は、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）の変異体及び類似体を含んでいてもよく、ＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）としては、例えば、Ｇｌｎ９−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｄ−Ｇｌｎ９−ＧＬＰ−１（７−３７）、アセチル−Ｌｙｓ９−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｔｈｒ１６−Ｌｙｓ１８−ＧＬＰ−１（７−３７）、及びＬｙｓ１８−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｌｙｓ３８−Ａｒｇ２６−ＧＬＰ−１（７−３８）−ＯＨ、Ｌｙｓ３６−Ａｒｇ２６−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ａｒｇ２６，３４−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｒｇ２６，３４−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｒｇ２６，３４−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｒｇ２６，３４−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｒｇ２６，３４−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｒｇ２６−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｒｇ２６−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｒｇ２６−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｒｇ３４−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｌａ３７−Ｌｙｓ３８−ＧＬＰ−１（７−３８）及びＬｙｓ３７−ＧＬＰ−１（７−３７）が挙げられる。
本発明の別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、下記式（ＩＩ）に示されるアミノ酸配列を含んでいる改変されたＧＬＰ−１ペプチドを構成成分（Ｉ）又は（ＩＩＩ）として含む（配列番号４４）。
Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７ （ＩＩ）
上記式（ＩＩ）において、Ｘａａ７は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デサミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、３−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−アセチル−ヒスチジン、ａ−フルオロメチル−ヒスチジン、ａ−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン又は４−ピリジルアラニンを指し；Ｘａａ８は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボン酸又は（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸を指し（この中でもＧｌｙが特に好ましい）；Ｘａａ１６は、Ｖａｌ又はＬｅｕを指し；Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇを指し；Ｘａａ１９は、Ｔｙｒ又はＧｌｎを指し；Ｘａａ２０は、Ｌｅｕ又はＭｅｔを指し；Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ又はＡｉｂを指し；Ｘａａ２３は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇを指し；Ｘａａ２５は、Ａｌａ又はＶａｌを指し；Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇを指し；Ｘａａ２７は、Ｇｌｕ又はＬｅｕを指し；Ｘａａ３０は、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇを指し；Ｘａａ３３は、Ｖａｌ又はＬｙｓを指し；Ｘａａ３４は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＡｒｇを指し；Ｘａａ３５は、Ｇｌｙ又はＡｉｂを指し；Ｘａａ３６は、Ａｒｇ、ＧｌｙもしくはＬｙｓ、又はアミドもしくは存在しないことを指し；Ｘａａ３７は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、アミド又は存在しないことを指す。
本発明の別の実施形態において、本発明のペプチドの構成成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）は、下記式（ＩＩＩ）のアミノ酸配列を含んでいる改変されたＧＬＰ−１ペプチドを含む（配列番号４５）。
Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ２６−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ｌｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７ （ＩＩＩ）
上記式（ＩＩＩ）において、Ｘａａ７は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デサミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、３−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−アセチル−ヒスチジン、ａ−フルオロメチル−ヒスチジン、ａ−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン又は４−ピリジルアラニンを指し；Ｘａａ８は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボン酸、又は（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸を指し；Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇを指し；Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ又はＡｉｂを指し；Ｘａａ２３は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇを指し；Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇを指し；Ｘａａ３０は、Ａｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇを指し；Ｘａａ３４は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、又はＡｒｇを指し；Ｘａａ３５は、Ｇｌｙ又はＡｉｂを指し；Ｘａａ３６は、ＡｒｇもしくはＬｙｓ、アミド又は存在しないことを指し；Ｘａａ３７は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＧｌｕもしくはＬｙｓ、アミド又は存在しないことを指す。
本発明の特に好ましい実施形態において、本発明のペプチドの構成成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）は、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３６）−アミド、ＧＬＰ−１（７−３７）又はその変異体、類似体もしくは誘導体から選択される、（改変された）ＧＬＰ−１ペプチドを含む。また、本発明のペプチドは、その構成成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）において、上記ＧＬＰ−１ペプチドにおける第８番目のＡｉｂ残基又は第７番目のアミノ酸残基を有し、Ｄ−ヒスチジン、デサミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−アセチル−ヒスチジン、ａ−フルオロメチル−ヒスチジン、ａ−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン及び４−ピリジルアラニンから選択される、改変されたＧＬＰ−１ペプチドを含んでいることが好ましい。
タンパク質中のアミノ酸置換の生成例として、本発明において使用される類似体を取得するために用いることのできるものは、例えば、米国再発行特許発明第３３，６５３号、第４，９５９，３１４号、第４，５８８，５８５号及び第４，７３７，４６２号（マークら）；第５，１１６，９４３号（ケートら）；第４，９６５，１９５号（ネイメンら）；及び第５，０１７，６９１号（リーら）に示される公知の方法のいずれかのステップ、ならびに米国特許出願第４，９０４，５８４号（ショーら）に示されるリジンが置換されたタンパク質を含む。
好ましくは、上記において定義され、構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）及び／又は（ＩＩＩ）に含まれる変異体もしくは類似体は、「天然の」配列（例えば、ＧＬＰ−１（７−３７）もしくはＧＬＰ−２、又は生物学的に活性なそのフラグメントもしくは任意のＩＰ２イソ型）と同様の核配列を有し得、上記天然のアミノ酸と少なくとも７０％の同一性があるアミノ酸配列を有するとともに、その生物学的活性を保持する。より好ましくは、上記天然の配列と少なくとも８０％の同一性があり、少なくとも９０％の同一性があり、又は最も好ましくは少なくとも９５％の同一性があるものである。特定のペプチドが、定義された長さの関連ポリペプチドと、規定の比率の同一性を有していると考えられる場合、規定の比率の同一性は、関連ペプチドと相対的である。よって、１００アミノ酸長である関連ペプチドと５０％同一であるペプチドは、５０アミノ酸ポリペプチド、すなわち上記関連ポリペプチドの５０アミノ酸長部分と完全に同一であるポリペプチドとなり得る。また、関連ポリペプチドの全長を超える１００アミノ酸長のポリペプチドは、関連ポリペプチドと５０％同一である可能性がある。当然ながら、その他のポリペプチドも同じ基準を兼ね備え得る。本明細書において使用される場合において、用語「配列の同一性」は、上記配列が以下のように比較されていることを意味する。上記配列はＧｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ＧｒｏｕｐのＧＡＰ（世界的な配列プログラム）の第９版を用いて、ギャップ開放ペナルティ−１２（初めにギャップをなくすために）及びギャップ拡張ペナルティ−４（上記ギャップにおいて連続してゼロを付加する毎に）でのデフォルト（ＢＬＯＳＵＭ６２）マトリックス（−４〜＋１１の値）によって配列される。配列後、比率の同一性は、一致した数を必要とされる配列中のアミノ酸の数の比率として表すことによって算出される。
融合ペプチドの誘導体、又はその類似体、フラグメントもしくは変異体もまた、本発明に包含される。用語、本発明のペプチドの「誘導体」は、天然に生じている別の共通２０アミノ酸と１つのアミノ酸も置き換わっていない、改変された本発明のペプチドのみを含むものが意図される。これに対し、遺伝的にコードされたアミノ酸は、当該アミノ酸を、有機誘導体化剤、すなわち選択された側鎖の残基、又はアミノ基もしくはカルボキシル基の末端残基と反応させること（好ましくは共有結合修飾によって）が可能な有機誘導体化剤と反応させることによって、又は非天然のアミノ酸（化学合成によって作製された、例えば、遺伝コードによってコードされたアミノ酸のＤ−異性体、Ａｉｂ（ａ−アミノ酪酸）、Ａｂｕ（ａ−アミノ酪酸）、Ｔｉｅ（ｔｅｒｔ−ブチルグリシン）、ｐ−アラニン、３−アミノメチル安息香酸、アントラニル酸）、もしくは天然のアミノ酸（遺伝コードによってコードされていない、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩、オルニチン、ホスホセリン、Ｄ−アラニン及びＤ−グルタミン）を導入することによって、又は別のペプチド骨格配列によるペプチド骨格の修飾によって改変され得る。
以下に、本発明のペプチドのアミノ酸における好ましい修飾（上記において規定されたように、融合ペプチドの変異体、類似体、又はフラグメントも含む）について開示する。なお、この修飾は、例えば、構成成分（Ｉ）、（ＩＩ）及び／又は（ＩＩＩ）に位置づけられた、本発明のペプチドの任意の位置（任意のアミノ酸）において起こり得る。
本発明のペプチドが任意の形態（例えば、本発明のペプチドの類似体）で存在している場合、システイニル残基を、通常、カルボキシルメチルもしくはカルボキシアミドメチル誘導体を生じさせるために、クロロ酢酸もしくはクロロアセトアミドなどのアルファ−ハロアセテート（及び相当するアミン）と反応させる。また、システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−ベータ−（５−イミダゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル−２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリ安息香酸塩、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
本発明のペプチド中のヒスチジル残基は、ジエチルプロカルボン酸塩の作用因子がヒスチジル側鎖に対して比較的特有であるので、ｐＨ５．５−７．０でジエチルプロカルボン酸塩と反応することによって誘導体化され得る。また、パラブロモフェナシル臭化物も有用である。この反応は好ましくはｐＨ６．０の０．１Ｍカルボン酸ナトリウムにおいて行なわれる。特に、本発明のペプチドの構成成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）に含まれているような、ＧＬＰ−１（７−３７）のＮ−末端ヒスチジン残基（Ｈｉｓ７）は、スズキら（Diabetes Res.; Clinical Practice 5 (Supp. 1): S30 (1988)）によって示されているように、ＧＬＰ−１ペプチドのインスリン分泌性の活性にとって非常に重要である。同様に、本発明のペプチドは、構成成分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）の一部として、アルキル基もしくはアシル基（炭素数１〜６）によって、ＧＬＰ−１のＨｉｓ−７で改変され得、又はＨｉｓと機能的に同等の炭素数５〜６の環構造との置き換えによって改変され得る。好ましい修飾は、Ｈｉｓ７のアミノ末端又はそのヒスチジル側鎖での疎水性成分の導入である。
本発明のペプチドのリジニル及びアミノ末端残基は、例えばコハク酸又は他のカルボン酸のアンヒドリドと反応され得る。これら物質による誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆転させる作用がある。本発明のペプチド中のリジン残基に含まれるイプシロンアミノ基の（炭素数１２〜１８）修飾によって、循環器系における半減期は増加する。アルギニル残基は、例えば、１個又は数個の従来の試薬（中でもフェニルグリオキサル、及びニンヒドリン）との反応によって、改変され得る。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基のグアニジン官能基のｐＫａ値が高いため、この反応はアルカリ性の環境において行なう必要がある。さらに、これら試薬はアルギニンイプシロン−アミノ基と同様に、リジン基と反応し得る。
チロシル残基の特異的な修飾自体は、広く研究されている。通常、Ｎ−アセチルイミダゾル及びテトラニトロメタンは、それぞれＯ−アセチルチロシル種及びｅ−ニトロ誘導体を生成するために使用され得る。
カルボキシル側の基（アスパルチル又はグルタミル）は、例えば、１−シクロヘキシル−３−［２−モルフォリニル−（４−エチル）］カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ’Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾される。
さらに、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換され得る。
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、対応するグルタミル及びアスパルチル残基へデアミド化され得る。別の局面において、これらの残基は、弱酸性の環境下でデアミド化され得る。これら残基のいずれかの形態も本発明の範囲の範疇に包含される。デアミド化が本発明のペプチドの直接的なタンパク質分解的切断において、生理学的な重要性を有し得るのであれば、デアミド化された本発明のペプチドは、プロテアーゼもしくはペプチターゼ酵素によってタンパク質分解感受性が改変されてもよい。生合成の本発明のペプチドは、ある保存環境下で分解することが指摘されており、その結果、本発明のペプチド中の１つ以上の位置でデアミド化する。本発明のペプチド中のメチオニン残基は、酸化（主としてスルホキシド）の影響を受け易い。上述したその他の誘導体のように、本発明のペプチドのデサミド及び／又は本発明のペプチドのスルホキシドは、十分に生物学的活性を示すために用いられ得る。
アルファ−アミノ酸含有残基の誘導体化に適したその他の試薬は、メチルピコリニミデート；ピリドキサルリン酸；ピリドキサル；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイオスレア；２，４−ペンタンジオン；及びグリオキシル酸との反応で触媒されたトランスアミナーゼなどのイミドエステルを含む。
本発明のペプチド（それらのカルボキシ基（Ｃ−末端）及びそれらのアミン基（Ｎ−末端）を有する）の末端アミノ酸残基（上述に示したカルボキシもしくはアミドアミノ酸側鎖と同様に）は、適切なアミノもしくはカルボキシル保護基によって、保護された形態（例えば、アミド基によるＣ末端）及び／又は保護されていない形態において存在し得る。また、本発明のペプチドの酸付加塩が供給されてもよい。一般的な酸付加塩は、例えば、ＨＢｒ、ＨＩ、又より好ましくはＨＣｌなどのハロゲン化水素酸（塩）である。
本発明のペプチドの誘導体を生じるその他の修飾は、本発明のペプチドと共有結合し得る炭水化物及び／又は脂質に基づく。その修飾では、脂質及び／又は炭水化物と、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミンもしくはチロシン、又はそれらの反応側鎖部分を介してグルタミン酸塩もしくはアスパラギン酸塩とが結合することが好ましい。また、別の局面において、炭水化物及び／又は脂質は、本発明のペプチドの末端部分と連結し得る。さらに、本発明のペプチドは、本発明のペプチドを安定化し得、及び／又は体液中で（特に血液中で）本発明のペプチドの輸送特性を改善する役目を果たし得る、機能的に異なるペプチド又はタンパク質部分と結合し得る。適切なペプチド又はタンパク質は、例えばアルブミン、トランスフェリンなどが挙げられ、本発明のペプチドと直接結合される（構成成分ＩＶのように）か、又はペプチド又は有機リンカー配列（上記を参照のこと）を介して結合される。好ましくは、これらペプチド又はタンパク質は、本発明のペプチドの末端の一つと結合される。
本発明のペプチドの分解という問題を避けるために、本発明の別の実施形態では、Ｄアミノ酸から構成されるか、又は少なくとも部分的にＤアミノ酸から構成される本発明のペプチドのレトロインベルソ異性体（retro-inverso isomer）を提供する。用語「レトロインベルソ異性体」は、配列の方向が逆になるとともに、各アミノ酸残基のキラリティーが反転した、直鎖状のペプチドの異性体を意味する（例えば、Jameson et al., Nature, 368, 744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368, 692-693 (1994)を参照のこと）。母ペプチドについて言えば、上記レトロインベルソ異性体は、通常、Ｆ−ｍｏｃアミノ酸誘導体と逆のアミノ酸順序に組み立てられる。一般的に、天然のペプチドは逆相ＨＰＬＣによって精製され得る。
本発明のペプチドへ組み込まれ得るその他の修飾は、ペプチド骨格の修飾に関する。好ましくは、改変された本発明のペプチドは、母核模倣である。その骨格は天然に生じた骨格とは異なる一方、その側鎖構造は本発明のペプチド又はそのフラグメント、変異体、誘導体もしくは類似体と同一である。一般的に、母核模倣は、（好ましくは）置換又は挿入のいずれかとして、１つ以上の骨格鎖部分（ＮＨ、ＣＨ、ＣＯ）の修飾を示す。置換は、例えば、（Ｉ）−ＮＨ−の代わりに−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＣＨ２−；（ＩＩ）−ＣＨＲ−の代わりに−Ｎ−、Ｃ−アルキル−又は−ＢＨ−；（ＩＩＩ）−ＣＯ−の代わりに−ＣＳ−、−ＣＨ２−、−ＳＯｎ−、−Ｐ＝Ｏ（ＯＨ）−又は−Ｂ（ＯＨ）−である。本発明のペプチドにおけるペプチド模倣は、これら修飾のそれぞれの組み合わせであってもよい。特に、各グループＩ、ＩＩ及びＩＩＩの修飾は組み合わせ得る。ペプチド模倣において、各骨格鎖部分は修飾され得、又別の局面においては一定の数の鎖部分のみが非天然に生じた部分のために交換され得る。好ましくは、−ＮＨ−、−ＣＨＲ−又は−ＣＯ−いずれかからなる本発明のペプチドのすべての骨格鎖部分は、別の天然に生じたグループと交換される。本発明のペプチド骨格に含まれるアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）が置換される場合（分子全体又は少なくとも一箇所で）、好ましい置換部分は、例えば、レトロインベルソ（retro-inverso）アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）、ヒドロキシルエチレン（ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、アルケン（ＣＨ２＝ＣＨ−）、カルバ（ＣＨ２−ＣＨ２−）及び／又は−Ｐ＝Ｏ（ＯＨ）−ＣＨ２−などの生物等比体積の部分である。また、挿入による骨格鎖の伸張は、本発明のペプチドの母核模倣おいて生じ得る（例えば、Ｃ−アルファ原子の側面部分で）。Ｃ−アルファ原子のどちら側にも、例えば−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ−、−ＮＨ−が挿入され得る。
特に好ましくは、本発明のペプチドのオリゴカルバメートペプチド骨格構造である。上記アミド結合は、カルバメート部分によって置き換えられる。保護されたＮ−アミノアルキルカルボン酸の単量体は、相当するアミノ酸又はアミノアルコールを経て利用可能となる。それらは、固相合成によってＦ−ｍｏｃ部分又は感光性ニトロアトリルオキシカルボニル基を用いることによって、例えば、ｐ−ニトロフェニルエステルなどの活性エステルに変換される。
本発明のペプチドは、概略的に上述したタンパク質分解的切断に対して保護されている。本発明のペプチドは、特に、ジペプチジルアミノペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）に対して保護されている。本明細書において用いられる場合、用語「ＤＰＰ−ＩＶに対して保護された」は、請求項１に係るペプチドが参照される。本発明のペプチド並びにその誘導体、類似体、フラグメント及び変異体は、本発明のペプチドの構成部分（Ｉ）及び／又は（ＩＩＩ）の部分としてのＧＬＰ−１（７−３５、３６又は３７）を、血漿ペプチダーゼ（ＤＰＰ−ＩＶ）に対して耐性にする。
ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶによる分解に対するペプチドの抵抗性は、例えば、以下の分解評価によって決定することができる：分注したペプチドを、分注した精製ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶとともに、３７℃で４〜２２時間、ｐＨ７〜８の適当な緩衝液（アルブミンが存在しない緩衝液）中でインキュベートする。トリフルオロ酢酸の添加により酵素反応が停止され、ＨＰＬＣ又はＬＣ−ＭＳ分析によってペプチド分解産物が分離され定量される。上記分析を実施する一つの方法は以下のとおりである：上述の混合物が、Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ−Ｃ１８（３０ｎｍ穴、５μｍ粒子）の１５０×２．１ｍｍカラム上に加えられ、流速０．５ｍｌ／分、０．１％トリフルオロ酢酸中におけるアセトニトリルの線形勾配下で溶出する（０％〜１００％アセトニトリル、３０分間）。ペプチド及びその分解産物は、２１４ｎｍ（ペプチド結合）又は２８０ｎｍ（芳香族アミノ酸）における吸光度が計測され得、それらのピーク領域の積分により定量される。分解パターンは、分離されたピークのＭＳスペクトルを測定可能なＬＣーＭＳを用いて測定され得る。所定の時間における、損傷の無い化合物／分解された化合物の割合は、ペプチドのＤＰＰ−ＩＶに対する安定性の評価に用いられる。
本発明のペプチドは、当該ペプチドが、ＧＬＰ−１（７−３７）に比べて、所定の時間における損傷の無い化合物の割合に基づいて、１０倍以上安定であるときに、ＤＰＰ−ＩＶ安定であると定義される。従って、ＤＰＰ−ＩＶ安定な本発明のペプチドは、好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２０倍、ＧＬＰ−１（７−３７）ペプチド等よりも安定である。安定性は、当業者において知られている任意の方法、例えば、ＤＰＰ−ＩＶを、供試されるペプチドの溶液に加え、例えば一定の時間、例えば分光法、ウェスタンブロット解析、抗体スクリーニング等により、ペプチドの分解を測定する方法によって評価されてもよい。他の観点において、本発明のペプチドは、ＧＬＰ−１（７−３３７）の効果を、例えばその天然のレセプター（ＧＬＰ−１レセプター）に結合することによって奏する化合物として定義される。好ましくは、本発明のペプチドは、ＧＬＰ−１に対して、天然に存在するＧＬＰ−１ペプチドの結合親和性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも５０％に相当する結合親和性を有する。結合親和性は、例えば表面プラズモン共鳴等の任意の適切な方法によって測定され得る。さらに、もし、本発明のペプチドが、その細胞外受容体への結合によって細胞内にシグナルを伝達して細胞内ｃＡＭＰの形成を誘導するのであれば、それは好ましい。
本発明のペプチドは、固相ペプチド合成技術を用いて、公知技術におけるＧＬＰ−１（７−３６）アミド及びＧＬＰ−１（７−３７）の生産様式と同様に、合成的に生産され得、その後、例えば、逆相ＨＰＬＣカラム又は適切なクロマトグラフィー技術による単一の精製工程によって、実験室規模において精製され得る。しかしながら、本発明のペプチドの生産は、操作された細胞において（微生物細胞又は動物細胞株の何れかにおいて）なされることが好ましい。本発明のペプチドは、例えば慣用の分離技術を用いて、当該ペプチドを発現する細胞から単離され得る。 即ち、細胞は、例えば支持体及び栄養素を備えている適当な条件の下、インビトロにて育成され得、分泌タンパク質、即ち本発明のペプチドは、細胞外の培地から回収される。従って、細胞内において操作を受けた配列は、好適には、本発明のペプチドの分泌を導くリーダー配列及びシグナルペプチド配列を含む。上記細胞は、好適には、上記リーダー配列及びシグナル配列を切断可能なプロテアーゼを、内在的に、又は操作を受けた遺伝子配列により、発現する。他の形態において、本発明のペプチドをコードする、操作を受けた遺伝子配列は、上述したようなリーダー配列及びシグナルペプチド配列を含まず、それゆえに、細胞内において発現された本発明のペプチドは分泌されずに、細胞溶解を伴う処理によって細胞から回収される。このような方法では、コード配列は、培地からペプチド産物を効率的に抽出するための精製用のタグを含み得、当該タグは、単離された本発明のペプチドを遊離させるために切断され得る。
本発明のさらに他の側面によれば、構成部分（Ｉ）及び（ＩＩ）並びに合成ポリマー及び／又はタンパク質及び、最終的には、構成部分（ＩＩＩ）を包含する本発明の複合体を投与することによる、動物の治療方法、好適にはヒトの治療方法が提供される。グルコース代謝に関連する疾病又は疾患の治療又は予防に用いられる製品の製造における本発明の複合分子の使用も又提供される。グルコース性障害の非限定的な例としては、例えば、真性糖尿病タイプＩ又はタイプＩＩ（ＮＩＤＤＭ）、インシュリン耐性、体重障害、又はそれらに関連する疾病又は疾患等が包含される。ここで、上記体重障害又は関連する疾患には、肥満、体重超過関連疾患、満腹感による調節の欠如、血漿中のインシュリンレベルの低下、血糖値の増加、又は膵臓β細胞量の減少が包含される。好適には、タイプＩＩ糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の治療のための薬剤の製造のための、本発明の複合分子の使用が本明細書において開示される。このように、本発明は、本発明に係る複合分子の使用、例えば、患者の体重の減少、患者の満腹感の低減、食後における患者の血漿中のインシュリンレベルの増加、患者の空腹時血糖値の減少、患者における膵臓β細胞量の増加、又は、患者における糖尿病タイプＩ又はＩＩの治療に関するものである。
他の疾病又は疾患にかかる患者も、同様に、本発明の複合分子、即ち、少なくとも一つのポリマー成分に結合された融合ペプチド、又はその類似体、フラグメント、変異体若しくは誘導体によって治療され得る。本発明の複合分子は、神経変性障害及びそれに関連する疾病又は疾患の治療、並びに、アポトーシスに関連する障害及び疾病又は疾患の治療のための薬剤の調製のために使用され得る。これらの障害を治療するための本発明の複合分子の使用は、以下によって結果を得る：サイクリックＡＭＰ第２メッセンジャー経路に共役するＧＬＰ−１受容体は、げっし類及びヒトの脳全体に発現している。脳における受容体の分布の化学構成は、食物の摂取及び有害なストレスへの応答の制御におけるＧＬＰ−１の中心的な役割と単に相関をしているだけではない。ＧＬＰ−１受容体とのＧＬＰ−１の結合は、神経分化誘導特性を示し、培養神経細胞において、グルタミン酸により誘導されたアポトーシス及び酸化による損傷からの保護を提供する。その上、ＧＬＰ−１は、培養細胞において、アミロイドβタンパク質前駆体のプロセシングを調節する作用が示され、更に、投与量依存的に、生体内において、脳におけるアミロイドβタンパク質を減少させる。それゆえ、ＧＬＰ−１は、又、中枢神経系の制御因子としても知られる。例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）及び他の他の中枢神経又は末梢神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）及び他の中枢神経又は末梢神経変性状態、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アレキサンダー病、アルパース病、毛細血管拡張性運動失調、カナバン病、コケイン症候群、クロイツフェルト・ヤコブ病、多発性硬化症、サンドホッフ病、ピック病、脊髄小脳失調症、シルダー病、及びパーキンソン病）に対して治療上の妥当性を有する。
さらに、生理学的に活性なＧＬＰ−１は、様々な細胞に対して抗アポトーシス効果を示すこと、例えば、ＧＬＰ−１は、単離されたばかりのヒト・ランゲルハンス島又は他の細胞型の量及び機能を保存するために効果的であることが示されている。即ち、生物学的に活性の、複合分子の融合ペプチドは、細胞又は組織のアポトーシスにより引き起こされる障害の治療に用いられ得る。
本発明の複合分子は、外的に投与される、単離された本発明の複合分子を含む組成物の製造のために使用され得る。得られる組成物は、上述した障害を治療するために好適に使用され得る。
上記融合ペプチド配列を活性成分として有する本発明の複合分子を含む製剤の調製は、一般的に周知であり、本明細書において援用される米国特許第４，６０８，２５１号、第４，６０１，９０３号、第４，５９９，２３１号、第４，５９９，２３０号、第４，５９６，７９２号、及び第４，５７８，７７０号が例示される。典型的には、このような製剤は、水溶液又は懸濁液として注射可能に調製され、好適には水を含む（水性系）か又は乳化され得る。用語「水性系」は、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）の水を含む製剤として定義付けられる。同様に、用語「水溶液」は、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）の水を含む溶液として定義付けられる。用語「水性懸濁液」は、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）の水を含む懸濁液として定義付けられる。
静脈、皮膚若しくは皮下注射又は患部への注射のために、活性成分は、発熱物質が除かれ、好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する、非経口投与において許容される水溶液の形態であり得る。液体の薬学的組成物は、概して、水等の液体媒体を含む。好適には、上記液体媒体には、生理的食塩水、デキストロース−エタノール若しくはその他のサッカライド溶液、又は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール又はこれらの組み合わせのようなグリコール類が含まれ得る。さらなる例としては、リンガー液又は乳酸化リンガー液のようなその他の等張性媒体がある。
例えば、本発明は、上記本発明に係る化合物の水溶液及び緩衝液を含む薬学的な製剤に関するものである。なお、上記化合物は０．１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で含まれ、上記製剤は約２．０〜１０．０、好ましくは約７．０〜８．５のｐＨを有する。好ましくは、上記製剤のｐＨは、本発明に係る化合物の等電点から少なくとも１単位離れており、より好ましくは、本発明に係る化合物の等電点から少なくとも２単位離れている。
また、注射前の液体において、溶液又は懸濁液に適した固形物の形態が調製され得る。上記薬学的な製剤はフリーズドライ製剤であり得、そこへ医者もしくは患者によって使用前に溶媒及び／又は希釈液が加えられる。言い換えれば、一旦調製された上記製剤は、直ちに患者へ投与されるのではない。より正確に言えば、以下の調製、すなわち凍結状態で保存するか、又は液体の形態もしくは患者への投与に適した他の形態に後で作り変えることを目的とした乾燥形態で保存するためにパッケージ化される。別の実施形態において、上記薬学的な製剤は、事前にいかなる溶解をすることなく、直ちに使用できる乾燥製剤（例えば、フリーズドライ又はスプレードライ）である。よって、「乾燥形態」とは、液体の薬学的組成物又は薬学的な製剤が、凍結乾燥法（例えば凍結乾燥；例えばWilliams and Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38: 48-59を参照のこと）、噴霧乾燥法（Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U. K. ), pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18: 1169-1206; and Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11: 12-20を参照のこと）、又は空気乾燥法（Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25: 459-470; and Roser (1991) Biopharm. 4: 47-53）のいずれかによって乾燥されることが意図される。液体の薬学的組成物の保存期間中、ポリペプチドによる凝集体構造はこのポリペプチドの生物活性に悪影響を及ぼし得、その結果、薬学的組成物の治療効果の損失をもたらす。さらに、上記ポリペプチドを含有する薬学的組成物が投与製剤によって投与されるとき、凝集体構造は、管組織、膜組織又は心臓の閉塞などの別の問題をもたらし得る。
本発明のペプチドの薬学的な製剤には、その他の成分を含み得る。この付加成分は、潤滑剤、乳化剤、酸化防止剤、充てん剤、ｐＨ緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液又はマレイン酸緩衝液）、保存料、界面活性剤、安定化剤、張度調製剤、偽の製剤（cheating agents）、金属イオン、疎水性媒体、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質）及び／又は両性イオン（例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン及びヒスチジンなどのアミノ酸）を含んでいてもよい。
本発明の製剤に用いられる安定化剤については、好ましくは高分子量ポリマー又は低分子化合物の群から選択されればよい。本発明のさらなる実施形態において、上記安定化剤としては、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ３３５０）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、カルボキシ−ヒドロキシセルロースもしくはその誘導体（例えば、ＨＰＣ、ＨＰＣ−ＳＬ、ＨＰＣ−Ｌ及びＨＰＭＣ）、シクロデキストリン、モノチオグリセロール、チオグリコリック酸及び２−メチルチオエタノールなどの含硫物質、並びに種々の塩（例えば、塩化ナトリウム）が挙げられる。これら特定の安定化剤は、それぞれ本発明の別の実施形態の構成要素となる。また、上記薬学的組成物は、組成物中で薬学的に活性なポリペプチドの安定性をさらに強める、付加安定化剤を含み得る。本発明に特に関係する安定化剤は、特に限定されないが、メチオニン酸化に対して上記ポリペプチドを保護するメチオニン及びＥＤＴＡ、並びに凍結融解又は人工的なせん断に伴う凝集に対して上記ポリペプチドを保護する非イオン性界面活性剤を含む。
本発明の製剤に用いられる界面活性剤については、好ましくは洗浄剤、エトキシル化キャスターオイル、ポリグリコリル化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック重合体（例えば、プルロニー（Pluronie）Ｆ６８、ポロキサマー（poloxamer）１８８及び４０７、トリトンＸ−１００などのポロキサマー）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、星型ＰＥＯ、アルキル化誘導体及びアルコキシル化誘導体などのポリオキシエチレン誘導体及びポリエチレン誘導体（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、Ｔｗｅｅｎ−８０及びＢｒｉｊ−３５などのＴｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレンヒドロキシステアリン酸、モノグリセリドもしくはエトキシル化されたその誘導体、ジグリセリドもしくはそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レクチン及びリン脂質（例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノラミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール及びスフィンゴミエリン）、リン脂質の誘導体（例えば、ジパルミトイルホスファチジン酸）及びリソリン脂質（例えば、パルミトイルリソホスファチジル−Ｌ−セリン、及びエタノラミン、コリン、セリンもしくはスレオニンの１−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸エステル）及びアルキル、アルコキシル（アルキルエステル）、リソホスファチジルのアルコキシ（アルキルエーテル）誘導体、及びホスファチジルコリン（例えば、リソホスファチジルコリンのラウロイル誘導体及びミリストイル誘導体）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及び親水性の頭部、すなわち、コリン、エタノラミン、ホスファチジン酸、セリン、スレオニン、グリセロール、イノシトール、及び正電荷を帯びたＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣＰ、ＢＩＳＨＯＰ、リソホスファチジルセリン及びリソホスファチジルスレオニン、及びグリセロリン脂質（例えばケファリン）、グリセロ糖脂質（例えば、ガラクトピランソイド（galactopyransoide））、スフィンゴ糖脂質（例えば、セラミド、ガングリオシド）、ドデシルホスホコリン、鶏卵リゾレシチン、フシジン酸誘導体（例えば、タウロ−ジヒドロフシジン酸ナトリウムなど）、長鎖脂肪酸、及びその炭素数６〜１２の塩（例えば、オレイン酸及びカプリル酸）、アクリルカルニチン及び誘導体、リジン、アルギニンもしくはヒスチジンのＮ’Ｘ−アシル化誘導体、側鎖がアシル化されたリジンの誘導体、又はリジン、アルギニンもしくはヒスチジンの何れかの組み合わせを含んでいるジペプチドのＮ−アセチル化されたアルギニン誘導体、及び天然もしくは酸性アミノ酸、天然アミノ酸及び２つの荷電アミノ酸の何れかの組み合わせを含むトリペプチドのＮ−アシル化誘導体、ＤＳＳ（ドキュセートナトリウム、ＣＡＳ登録番号〔５７７−１１−７〕、ドキュセートカルシウム、ＣＡＳ登録番号〔１２８−４９−４〕、ドキュセートカリウム、ＣＡＳ登録番号〔７４９１−０９−０〕）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム又はラウリル硫酸ナトリウム）、カプリル酸ナトリウム、コール酸又はその誘導体、胆汁酸及びその塩及びグリシン又はタウリン複合体、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、Ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸、一価の陰イオン界面活性剤（アルキル−アリル−スルホン酸）、両性イオン界面活性剤（例えば、Ｎ−アルキル−Ｎ、Ｎ−ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸、３−コラミド（-cholamido）−１−プロピルジメチルアンモニオ−１−プロパン−スルホン酸）、陽イオン界面活性剤（第４級アンモニウム塩基）（例えば、セチル−トリメチルアンモニウム臭化物、セチルピリジニウム塩化物）、非イオン界面活性剤（例えば、ドデシル−Ｄ−グルコピラノシド）、エチレンジアミンへのプロピレンオキシド及びエチレンオキシドの連続した付加から生じる四官能性ブロック重合体であるポロキサミン（例えば、テトロン酸（Tetronic's）が挙げられ、又、上記界面活性剤は、イミダゾリン誘導体の群もしくはその混合物から選択され得る。これら特定の界面活性剤は、それぞれ本発明の別の実施形態の構成要素となる。薬学的組成物における界面活性剤の使用は、当業者に公知である。説明の便宜のため、レミントン：The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995を参照のこと。
薬学的に利用可能な保存料については、好ましくはフェノール、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、メチルｐ−ヒドロキシ安息香酸、プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸、２−フェノキシエタノール、ブチルｐ−ヒドロキシ安息香酸、２−フェニルエタノール、ベンジルアルコール、エタノール、クロロブタノール、及びチオメロサル（thiomerosal）、ブロノポル（bronopol）、安息香酸、イミドゥレア（imidurea）、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、エチルｐ−ヒドロキシ安息香酸、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネジン（chlorphenesine）（３ｐ−クロルフェノキシプロパン−１，２−ジオール）又はその混合物が挙げられる。また、アルキルパラベンが含まれ得る。アルキルパラベンとしては、炭素数１〜４のアルキルパラベン又はその混合物について言及する。アルキルパラベンの一例としては、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、又はブチルパラベンを含む。保存料としては、抗菌剤のように作用するために上記製剤へ付加される化合物について言及する。この濃度は、菌の成長を抑制することによって保存効果を維持するのに十分でなくてはならない。好ましくは、上記保存料はフェノール誘導体である。より好ましくは、上記保存料はクレゾールである。さらに好ましくは、上記保存料はメタ−クレゾールである。最終混合物中の保存料の好ましい濃度は、約１．０ｍｇ／ｍＬ〜２０．０ｍｇ／ｍＬである。最終混合物中の保存料のより好ましい濃度範囲は、約２．０ｍｇ／ｍＬ〜８．０ｍｇ／ｍＬ、約２．５ｍｇ／ｍＬ〜４．５ｍｇ／ｍＬ、及び約２．０ｍｇ／ｍＬ〜４．０ｍｇ／ｍＬである。最終混合物中の保存料の最も好ましい濃度は約３．０ｍｇ／ｍＬである。
等張剤については、好ましくは塩（例えば、塩化ナトリウム）、糖もしくは糖アルコール、アミノ酸（例えば、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン）、アルジトール（例えば、グリセロール（グリセリン）、１，２−プロパンジオール（プロピレングリコール）、１，３−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール）、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００）、またはその混合物からなる群から選択される。等張剤としては、生理的に許容されるとともに、細胞膜を縦断する水の網目状の流れを妨げる製剤に対して適切な等張性を与える化合物について言及する。例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、水溶性スターチ、ヒドロキシエチルスターチ、及びカルボキシメチルセルロース−Ｎａを含む、単糖類、二糖類、もしくは多糖類などのいずれかの糖、又は水溶性グルカゴンが用いられ得る。糖アルコールは、少なくとも１つの−ＯＨ基を有する炭素数４〜８の炭化水素と定義されており、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラシチトール（galacititol）、ズルシトール、キシリトール及びアラビトールを含む。ある実施形態において、上記糖アルコール添加物はマンニトールである。上述した糖又は糖アルコールは、単独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。糖又は糖アルコールが液体製剤に可溶であり、本発明の方法によって達成される安定効果に悪影響を及ぼさない限り、その使用量は限定されない。１つ以上の等張剤がイオン強度又は等張性を調節するために加えられ得る。上記等張剤は、好ましくはＮａＣｌである。このＮａＣｌの濃度は、約１０ｍＭ〜２００ｍＭであることが好ましく、約５０ｍＭ〜１５０ｍＭであることがより好ましく、約１００ｍＭであることが最も好ましい。
偽の製剤（cheating agents）については、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸及びアスパラギン酸の塩、並びにその混合物から選択されることが好ましい。
緩衝液については、好ましくは酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、二水素リン酸ナトリウム、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、ヘペス（hepes）、バイシン（bicine）、トリシン（tricine）、リンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、又はその混合物が挙げられる。これら特定の緩衝液は、それぞれ本発明の別の実施形態の構成要素となる。
また、本発明の投与組成物は、１つ以上の酵素阻害剤を含み得る。上記酵素阻害剤としては、特に限定されないが、アクチノニン（actinonin）又はエピアクチノニン（epiactinonin）、及びこれらの誘導体などの化合物を含む。その他の酵素阻害剤としては、特に限定されないが、アプロチニン（トラシロール）及びボーマン・バーク（Bowman-Birk）阻害剤を含む。
この投与組成物は、リン酸緩衝塩、クエン酸、グリコール又はその他の分散剤を任意に含み得る。安定化添加剤は、好ましくは約０．１〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度で溶液中に含まれてもよい。
本発明の薬学的な複合分子を含有する薬学的組成物における上述したすべての添加剤の使用、特に、同じ濃度範囲に関しては当業者に公知である。説明の便宜のため、レミントン：The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995を参照のこと。
本発明の複合分子を含有する上記製剤は、従来通り注射によって（例えば、皮下（subcutaneously）、皮内、皮下（subdermally）、もしくは筋内のいずれかに）非経口で投与される。本発明の複合分子の非経口投与に適した組成物は、例えば、国際公開公報第０３／００２１３６号パンフレットに開示されているように調製されてもよい。
その他の投与形態に適した付加製剤は坐薬を含み、場合によっては、経口製剤、肺製剤、鼻製剤、口腔製剤、舌下製剤、腹腔内製剤、膣内製剤、肛門製剤及び頭蓋内製剤を含む。坐薬に関しては、従来の結合剤及び担体を含んでいてもよく、例えば、ポリアルカレングリコール又はトリグリセリドが挙げられる。なお、上記坐薬は、この有効成分を０．５％〜１０％の範囲、好ましくは１２％で含む混合物から形成され得る。経口製剤は、通常使用される賦形剤として、例えば医薬品等級のマンニトール、ラクトース、スターチ、マグネシウムステアリン酸、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含む。これらの組成物は、懸濁液、タブレット、ピル、カプセル、持続放出製剤または粉剤の形態で摂取されるとともに、１０〜９５％、好ましくは２５〜７０％の有効成分を含む。さらに、活性の持続期間は、この形態に応じて放出調製が制御されることによってさらに向上され得る。本発明の複合分子は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）又はエチレンビニル酢酸重合体などの高分子材料の粒子に組み込まれる。
製剤の選択は、製剤が投与される経路によってしばしば影響を受け、これは製剤がうまく機能するか否かの差を作り得る。そのため、輸送経路の選択は、患者の受容性、製剤の重要な特性（例えば水溶性）、疾病部位を標的にする能力、又は特定の疾病を処理する有効性によって進められ得る。本発明の複合分子の好ましい実施形態において、輸送経路の選択は経口、鼻もしくは肺用途に作製された薬剤において包含されるか、又は注射によって包含される。
最も重要な製剤の輸送経路は、経口経路である。ペプチドを主成分とした製剤は、肝臓及びその他の体組織中で直ちに除去するために変性もしくは分解され易いので、粘膜面及び生体膜を横断するのは容易ではない。さらに、当該製剤は正確な投与が要求される。一般的に、融合ペプチドは注射で投与されるのに対し、本発明の複合分子は経口投与で使用可能である。そのため、正常な製剤輸送を妨げる障害が消化管に認められるにも関わらず（例えば、胃内での酸促進加水分解、消化管全体を通じての酵素的分解、大腸内での細菌発酵）、本発明の複合分子に関しては経口投与が利用可能である。
別の局面において、肺輸送もまた本発明の複合分子の投与にとって重要であり、様々な方法、すなわちリポソーム、ミセル、ナノ粒子及びデンドリマーなどのナノ構造を含有し得る噴霧器（aerosols）、定量吸入器（metered dose inhaler systems）、粉剤（ドライパウダー吸入器）及び溶液（噴霧器）に影響される。本発明の複合分子の肺製剤輸送は、融合ペプチドの全身的な輸送に対して実行可能な選択肢を与える。本発明の複合分子は、融合ペプチドが肺の中でプロテアーゼによって分解されるので、肺全体で生体利用効率が減少するのを緩和させる融合ペプチドの肺輸送の経路を構築する。その上、本発明の複合分子は、毛細管血と肺胞気との間の障壁（空気・血液関門）を横断する。
さらに、上記複合分子は、活性融合ペプチドと高分子成分との結合を経て、鼻経路によって全身に輸送することが可能である。鼻に投与される製剤を提供するために、本発明の融合ペプチドと、生体接着剤もしくは吸収促進薬とを組み合わせることが好ましい。その材料の選択は、様々なパラメータ（例えば、製剤の生理的特性及び化学的特性の相違、並びに体内における製剤の標的部位の相違）に依存し得る。また、その有効性は、上記鼻に投与される製剤が液体、粉体、ゲル又は微小球体（microsphere）として与えられるかどうかに依存し得る。本発明の融合ペプチド、又は陽イオン物質でできたポリサッカライドキトサンと一体化された本発明の複合分子の鼻溶液製剤は、鼻粘膜を行き来する本発明の融合ペプチドの吸収を大幅に向上させ得る。キトサンは、生体接着性の賦形剤である。キトサンは、甲殻類の殻由来である。キトサンは、キチンの脱アセチル化によって合成され、生体適合性及び生体分解性が共に認められている。キトサンは、アレルギーに影響がないことが実証されており、健康なヒトの皮膚及び感染したヒトの皮膚の両方に生体適合性がある。キトサンの正電荷を帯びた分子は、粘液中に存在する負電荷を帯びたシアル酸残基と相互に作用すると推測され、それゆえ、長期間粘膜面で製剤化合物を保持し続ける。鼻製剤は、キトサングルタミン酸及びトリポリリン酸ペンテト酸５ナトリウムのイオノトロピックゲル化（ionotropic gelation）、ならびに本発明のペプチド及びキトサンの単純錯形成によって調製し得る。また、キトサン分子は、本発明の複合分子を形成するために、融合ペプチドと共有結合されてもよい。
本発明の融合ペプチド又は本発明の複合分子のための鼻製剤を提供する別のアプローチとしては、アルキルグリコシド、好ましくは、中鎖アルキルグリコシド又は長鎖アルキルグリコシド（例えば、オクチルマルトシドもしくはテトラデシルマルトシド）との結合である。鼻に投与される本発明のペプチド又は複合物質の生体利用効率は、アルキルグリコシドとの結合によって大幅に向上され得る。
本発明の複合分子の一部である融合ペプチドは、中性又は塩の形態として形成され得る。本発明のペプチドは、多数の有機塩基及び無機塩基、並びに有機酸及び無機酸のいずれかと反応して（付加）塩（例えば、上記ペプチドの遊離アミノ基と形成される）を形成するために、十分に酸性もしくは十分に塩基性であればよい。酸付加塩を形成するために一般的に用いられる酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸及びリン酸などの無機酸、並びに酒石酸、ａｓｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、マンデル酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸などの有機酸である。上記塩の一例としては、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオエート、へキシン−１，６−ジオエート、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ガンマ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩を含む。また、遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは水酸化第二鉄などの無機塩基、又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン及びプロカインなどの有機塩基由来であってもよい。本発明の複合分子に含まれる融合ペプチドの酸付加塩、カルボン酸塩、低級アルキルエステル及びアミドは、国際公開公報第９１／１１４５７号パンフレット（１９９１）；欧州特許出願第０７３３６４４号（１９９６）；及び米国特許出願第５，５１２，５４９号（１９９６）に従って形成すればよい。
上記融合ペプチド配列を含む複合分子を含有する製剤は、投与製剤と同じ方法で、且つ治療効果がみられるような投与量で投与される。投与量は、例えば患者の病気の重症度など、治療される患者によって決まる。適切な投与範囲は、（たとえ１〜１０ｍｇの範囲内でより多くの量が意図されるにしても）例えば、約０．１μｇ〜２０００μｇ（例えば、約０．５μｇ〜１０００μｇの範囲、好ましくは１μｇ〜５００μｇの範囲、特に好ましくは１０μｇ〜１００μｇの範囲など）の好ましい範囲を有する治療投与量につき、ほぼ数１００マイクログラム程度である。
例えば付加賦形剤（例えば、グリシン及びマンニトール、又はその他の添加剤）を加えた本発明の複合分子を含有する製剤は、バイアル（vials）のように凍結乾燥された形態で市販され得る。バイアルを希釈する手順は提供されるので、患者は製剤の投与前に、製品を所望の濃度に作り変えることができる。また、本発明の製剤は、その他公知の方法（例えば、予めシリンジ充填されるような方法など）で市販され得る。
薬学的組成物（特に、経口用途の）は、本発明の複合分子に加えて少なくとも１つの輸送剤を含んでいてもよい。この薬学的組成物は、本発明の複合分子の経口輸送を容易にするので、輸送剤なしの投与と比較して、本発明の複合分子の生体利用効率をさらに改善（例えば増加）させる。輸送剤としては、図２１に示す化合物（その塩を含む）が挙げられる。
本発明の輸送剤は、国際公開公報第９６／２１４６４号パンフレット、国際公開公報第９６／３００３６号パンフレット、国際公開公報第００／０６５３４号パンフレット、国際公開公報第９８／３４６３２号パンフレット、国際公開公報第００／０７９７９号パンフレット、国際公開公報第０１／４４１９９号パンフレット、国際公開公報第１／３２５９６号パンフレット、国際公開公報第０２／１８９６９号パンフレット、国際公開公報第０３／０４５３０６号パンフレット及び国際公開公報第０３／０７２１９５号パンフレットに開示されている輸送剤を含む。上記各文献は本明細書において援用される。
本発明の組成物にとって有用な輸送剤の多くは、アミノ酸（特に限定されないが、アミノカプリル酸、ブチリルヒドロキサミニック酸、アミノフェニル酪酸、アミノフェニルヘキサン酸、アミノフェニルプロパン酸、アミノサリチル酸、アミノフェニルコハク酸、アミノノナニック酸（aminononanic acid）、アミノニコチン酸、アミノバレニック酸（aminovalenic acid）、アミノフェニル酢酸、アミノカプロン酸、アミノウンデカン酸、アミノヘプタン酸、アミノヒドロキシ安息香酸、及びアミノデカン酸を含む）から容易に調製され得る。
例えば、これらの輸送剤は、１つの酸と、アミノ酸中に存在し、アミドを形成する遊離アミノ基と反応する適切な物質と、を反応させることによって調製され得る。当業者に公知であろう望ましくない側鎖反応を避けるために、保護基が用いられてもよい。
輸送剤化合物は、遊離塩基又はその塩の形態であり得る。適切な塩は、特に限定されないが、有機塩及び無機塩（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、酢酸塩、クエン酸塩、ハロゲン化物（好ましくは塩酸塩）、水酸化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、塩酸、硫酸、リン酸、塩化物、臭化物、ヨウ化物、プロピオン酸塩、臭化水素酸、アルコキシ、過塩素酸塩、テトラフルオロホウ酸塩、カルボン酸塩、メシラート、フメラート（fumerate）、炭酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、酢酸塩、グルコン酸、及びマレイン酸）を含む。好ましい塩は、特に限定されないが、酢酸塩及びメシラート塩が挙げられる。また、上記塩は、溶媒和物（エタノール溶媒和物を含む）及び水和物を含み得る。
本発明に用いられる輸送剤化合物の塩は、公知の方法によって調製すればよい。例えば、酢酸塩及びメシラート塩は、エタノール、トルエン及び酢酸中で調製され得る。
輸送剤は、再結晶、又は固形カラム担体（solid column supports）上での分別によって精製され得る。適切な再結晶溶媒系は、アセトニトリル、メタノール及びテトラヒドロフランを含む。分別は、移動相としてメタノール／ｎ−プロパノールを用いた適切な固体カラム担体（solid column supports）（アルミナなど）；移動相としてトリフルオロ酢酸／アセトニトリルの混合物を用いた逆相カラム担体；並びに移動相として水を用いてイオン交換クロマトグラフィーで行なえばよい。
陰イオン交換クロマトグラフィーを行なう場合、連続的に０〜５００ｍＭの塩化ナトリウム勾配が付けられていることが好ましい。
輸送剤は、国際公開公報第０３／０４５３０６号パンフレットに記載されているように、輸送剤と複合されるポリマーを含み得る。例えば、輸送剤及びポリマーは、高分子輸送剤がポリペプチド又はポリアミノ酸ではないという条件において、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）、−ＯＯＣ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ２ＮＨ−ＮＨＣＨ２−、−ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨＣＨ２−、−ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ−、−Ｏ−及び、炭素−炭素結合からなる群から選択される連結基によって複合され得る。上記ポリマーは、特に限定されないが、哺乳類への使用が安全な、交互共重合体、ブロック共重合体、及びランダム共重合体を含むいずれかのポリマーであり得る。
上記輸送剤を修飾するために好ましいポリマーは、特に限定されないが、ポリエチレン；ポリアクリル酸塩；ポリメタクリル酸塩；ポリ（オキシエチレン）；ポリ（プロピレン）；ポリプロピレングリコール；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；及びその誘導体、並びにその組み合わせを含む。上記ポリマーの分子量は、一般的に約１００〜２００，０００ダルトンの範囲である。このポリマーの分子量は、好ましくは約２００〜１０，０００ダルトンの範囲である。ある実施形態では、このポリマーの分子量は約２００〜６００ダルトンの範囲であり、より好ましくは約３００〜５５０ダルトンの範囲である。
本発明における輸送剤は、米国特許第６，６６３，８９８号、第６，６６３，８８７号、第６，６４６，１６２号、第６，６４２，４１１号、第６，６２７，２２８号、第６，６２３，７３１号、第６，６１０，３２９号、第６，５５８，７０６号、第６，５２５，０２０号、第６，４６１，６４３号、第６，４６１，５４５号、第６，４４０，９２９号、第６，４２８，７８０号、第６，４１３，５５０号、第６，３９９，７９８号、第６，３９５，７７４号、第６，３９１，３０３号、第６，３８４，２７８号、第６，３７５，９８３号、第６，３５８，５０４号、第６，３４６，２４２号、第６，３４４，２１３号、第６，３３１，３１８号、第６，３１３，０８８号、第６，２４５，３５９号、第６，２４２，４９５号、第６，２２１，３６７号、第６，１８０，１４０号、第５，５４１，１５５号、第５，６９３，３３８号、第５，９７６，５６９号、第５，６４３，９５７号、第５，９５５，５０３号、第６，１００，２９８号、第５，６５０，３８６号、第５，８６６，５３６号、第５，９６５，１２１号、第５，９８９，５３９号、第６，００１，３４７号、第６，０７１，５１０号、及び第５，８２０，８８１号に開示されている。また、本発明における輸送剤は、米国特許出願公開第２００３０２３２０８５号、第２００３０２２５３００号、第２００３０１９８６５８号、第２００３０１３３９５３号、第２００３００７８３０２号、第２００３００７２７４０号、第２００３００４５５７９号、第２００３００１２８１７号、第２００３０００８９００号、第２００２０１５５９９３号、第２００２０１２７２０２号、第２００２０１２０００９号、第２００２０１１９９１０号、第２００２０１０２２８６号、第２００２００６５２５５号、第２００２００５２４２２号、第２００２００４００６１号、第２００２００２８２５０号、第２００２００１３４９７号、第２００２０００１５９１号、第２００１００３９２５８号、第２００１０００３００１号に開示されている。また、本発明における輸送剤は、国際公開公報第２００３／０５７６５０号パンフレット、第２００３／０５７１７０号パンフレット、第２００３／０４５３３１号パンフレット、第２００３／０４５３０６号パンフレット、第２００３／０２６５８２号パンフレット、第２００２／１００３３８号パンフレット、第２００２／０７０４３８号パンフレット、第２００２／０６９９３７号パンフレット、第０２／２０４６６号パンフレット、第０２／１９９６９号パンフレット、第０２／１６３０９号パンフレット、第０２／１５９５９号パンフレット、第０２／０２５０９号パンフレット、第０１／９２２０６号パンフレット、第０１／７０２１９号パンフレット、第０１／５１４５４号パンフレット、第０１／４４１９９号パンフレット、第０１／３４１１４号パンフレット、第０１／３２５９６号パンフレット、第０１／３２１３０号パンフレット、第００／０７９７９号パンフレット、第００／５９８６３号パンフレット、第００／５０３８６号パンフレット、第００／４７１８８号パンフレット、第００／４０２０３号パンフレット、第９６／３００３６号パンフレットに開示されている。上記列挙した各米国特許出願公報、米国特許出願公開公報、及び国際公開公報は、本明細書において参照として援用される。
「輸送剤の有効量」とは、本発明の複合分子の一部である、薬学的有効量の融合ペプチドの消化管からの吸収を促進する、上記輸送剤の量を意味する。雄のスプレーグ・ドーリーラットにおける試験で用いられる輸送剤及び本発明の複合分子の一般的な量は、本発明の複合分子が０〜３０００μｇ／ｋｇの範囲であり、輸送剤が０〜２００μｇ／ｋｇである。
投与組成物は、１つ以上の輸送剤化合物及び本発明の複合分子を含む。ある実施形態において、投与組成物を形成するため、投与前に１つ以上の輸送剤化合物もしくはこれら化合物の塩、又はこれら化合物もしくは塩が１つ以上の単位を形成するポリアミノ酸もしくはペプチドが本発明の複合分子と混合されることによって、輸送剤として用いられ得る。
経口投与組成物は、タブレット、カプセル、又は粒子（粉状もしくは小袋入りの粒子）などの固形状の形態であることが好ましい。固形状の投与形態は、固形状の上記化合物と、固形状の活性物質とを混合することによって調製され得る。別の局面において、固形物は、公知の方法（フリーズドライ（凍結乾燥）、沈降、結晶化及び固形分散）によって、化合物及び活性物質からなる溶液から取得され得る。
様々な経口製剤は、任意で懸濁化剤を含んでいてもよい。いくつかの輸送剤は、その溶解度特性が原因で懸濁化剤を要する。懸濁化剤の一例としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられる。好ましくは、ヒドロキシプロピルメチルセルロースの最終濃度は、約２％〜１０％（重量／容積）である。さらに好ましくは、上記濃度は約２％〜５％（ｗ／ｖ）である。最も好ましくは、上記濃度は約３．９％（ｗ／ｖ）である。
しかしながら、本発明の組成物は、本発明の融合ペプチドのみを含む組成物（共有結合されたポリマー成分を含まない）よりも効率よく融合ペプチドを輸送し得るので、同じ血中濃度及び治療効果を達成し続ける一方、事前の投与単位形態もしくは輸送系に用いられるものよりも少量の本発明の融合ペプチドが患者に投与され得る。
また、投与組成物は液状の形態であり得る。溶媒としては、水、２５％ポリエチレングリコール水溶液、及び／又はリン酸緩衝液であってもよい。その他の投与媒体には、ポリエチレングリコールを含む。投与溶液は、上記輸送剤の溶液と上記複合分子活性剤の溶液とを混合することによって調製され得る。別の場合、輸送剤化合物（又は本発明の複合分子）の溶液は、固形状の本発明の複合分子活性剤（又は輸送剤化合物）と混合されてもよい。また、輸送剤化合物及び本発明の複合分子は、乾燥粉体として混合されてもよい。また、輸送剤化合物及び本発明の複合分子は、製造過程の間に混合され得る。本発明の投与組成物は、共通の共溶媒を任意で含んでいてもよい。いくつかの輸送剤は、その溶解度特性のために共溶媒が必要となる。共溶媒の一例としては、エタノール、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、グリコフロール（glycofurol）、エトキシジオール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール３００及びポリビニルピロリドンを含む。好ましくは、共溶媒の最終濃度は、約５％〜３０％（容積／容積）である。より好ましくは、上記濃度は約１０％〜２５％（ｖ／ｖ）である。最も好ましくは、上記濃度は約２０％である。
水溶液状の形態において、上記投与組成物のｐＨは、安定性を付与するとともに、経口投与に好ましいように調製され得る。上記ｐＨは、約７．０〜９．０の間で調節すればよい。より具体的には、上記ｐＨは約７．４〜８．４の間、７．８〜８．４の間、又は７．８〜８．１の間で調製すればよい。
〔実施例〕
〔実施例１〕
遺伝子コンストラクトの作製
ＧＬＰ−１（７−３７）の配列をコードするｃＤＮＡは、図１ａに示すようにＨｉｎｃＩＩ及びＥｃｏＲＩ部位を含む配列において、合成的に合成した。別途、図１ｂに示されるように、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＩＰ２並びにＳｆｏＩ、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩの制限酵素認識部位をコードする配列を含むｃＤＮＡを合成した。ＧＬＰ−１を分泌経路に導くために、ストロメライシン３の異種シグナル配列（ＡＣＣ番号 ＮＭ＿００５９４０）を用いた。即ち、ストロメライシンのシグナル及びリーダー配列をコードするｃＤＮＡが、ヒトＲＮＡから逆転写酵素ＰＣＲによって増幅され、図１ａ又は図１ｂに示すコンストラクトと共に、図１ｃ及び図１ｄ示すコンストラクトをそれぞれ形成するために使用された。
図１ｅのコンストラクトを形成するために、図１ａのコンストラクトのＨｉｎｃＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを図１ｄの配列のＳｆｏ１部位の中にクローニングした。同様に、図１ｆに示されるコンストラクトを製造するために、真核性の発現プラスミドのＥｃｏＲ１部位の中に図１ｄのＥｃｏＲ１フラグメントをクローニングした。また、図１ｇに示されるコンストラクトを形成するために、図１ｂに示されるコンストラクトのＨｉｎｃＩＩ／ＸｂａＩフラグメントを図１ｄに示されるコンストラクトのＳｆｏＩ／ＸｂａＩ部位の中にクローニングした。図１ｈは、短縮した内因性イントロン配列によって割り込まれ、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）、ＩＰ２及びＧＬＰ−２（１−３５）をコードする配列と融合された、ストレプトマイシンのリーダー及びシグナル配列をコードする、合成され、コドンが最適化された配列を示す。図１ｈのコンストラクトのＤＮＡ配列は配列番号１６に示され、配列番号１５は翻訳されたペプチドの配列を示す。
また、図１ｉ及び１ｊの配列を合成した。そして、これらを、図１ｈの線形化したＮａｅｌ／ＢｓｓＨＩＩ配列の中に、図１ｊのＮａｅｌ／ＢｓｓＨＩＩフラグメントをクローニングすることによって、図１ｋに示される配列を形成するために用いた。図１ｋのコンストラクトのＤＮＡ配列は配列番号１４に示され、配列番号１３は翻訳されたペプチドの配列を示す。図１ｈの配列のＢｓｓＨＩＩによる消化及び再連結によって図１ｌのコンストラクトを形成した。図１ｌのコンストラクトのＤＮＡ配列は配列番号１８に示され、配列番号１７は翻訳されたペプチドの配列を示す。図１ｈの線形化したＡｆｅｌ／ＢｓｓＨＩＩ配列の中に、図１ｉの配列のＡｆｅｌ／ＢｓｓＨＩＩフラグメントをクローニングすることによって、図１ｍのコンストラクトを形成した。図１ｍのコンストラクトのＤＮＡ配列は配列番号２０に示され、配列番号１９は翻訳されたペプチドの配列を示す。
上述したコンストラクトは当業者が通常の技術を用いることにより製造してもよい。
〔実施例２〕
哺乳動物細胞の、トランスフェクション、クローン選択及びＧＬＰ−１の発現
細胞の入手先：ＨＥＫ２９３（ヒト胚腎臓細胞系、＃ＡＣＣ ３０５、ＤＳＭＺ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ドイツ）、ＡｔＴ２０（マウスＬＡＦ１下垂体腫瘍細胞系、＃８７０２１９０２， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， イギリス）、ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞はＫａｓｓｅｍ教授（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｏｄｅｎｓｅ、デンマーク）より供与された。
１０6個の細胞をトランスフェクションするために、異なるＧＬＰ−１コンストラクトを複数含む０．５〜２μｇのプラスミドＤＮＡを用いた。このコンストラクトは実施例１の記載に従って生成した物である。Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. 1994ff Harvard Medical School Vol2., Unit 9.1)に記載されている、標準的なリン酸カルシウム共沈殿法によってＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションした。ＡｔＴ２０細胞のトランスフェクションには、ＦｕＧｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用い、current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et. al. 1994ff, Harvard Medical School Vol 2., Unit 9.4)の記載に従った。ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞のトランスフェクションは、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｍａｘａ）を用い、電気的パラメータ及び細胞型特異的溶液の組み合わせに基づく非ウイルス性の方法により行なわれた。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置（プログラム Ｃ１７）及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液ＶＰＥ−１００１を用いて、トランスフェクション効率＞６０％を達成した。細胞クローンのトランスフェクションから４８時間後、ＤＮＡの染色体中への融合を安定化させた細胞クローンの選択は、選択試薬ブラストサイジン（２μｇ／ｍｌ）を含む培地に供することにより行なわれた。１２〜１５日後、安定した、トランスフェクションされた細胞クローンは単離され、特徴付けのために拡張された。
ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ及びＨＥＫ２９３細胞内における様々なＧＬＰ−１コンストラクトの一過性発現を測定した。単量のＧＬＰ−１コンストラクトの＃１０３及び＃３１７（ＧＬＰ−１（７−３７）のコピーを一つだけ有している）からは検出限界程の活性ＧＬＰ−１レベルが確認されたのに対し、二量体のＧＬＰ−１コンストラクトである＃２１７（ＧＬＰ−１（７−３７）を構成部分（Ｉ）及び構成部分（ＩＩＩ）として有している）からは、ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ及びＨＥＫ２９３細胞の両方において大量の発現が確認された。結果を図２にまとめた。ＧＬＰ−１コンストラクト＃１５９（４個のＩＰ２のコピーを構成部分（ＩＩ）として有している）にコンストラクトを伸張させたものについては、有意に増加しない結果となった（図示せず）。様々なコンストラクトを有するｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞のトランスフェクション後の、安定してＧＬＰ−１を発現するクローンが選択された。発現レベルを表１に示す。
Figure 2010521186
〔実施例３〕
哺乳動物細胞から分泌された、ＧＬＰ−１ペプチドのウェスタンブロット解析
ＧＬＰ−１分泌細胞からの細胞培養上清を、１０％〜２０％の勾配ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分離して（１２０Ｖ、９０分間）、半乾燥ブロッティング（２．０ｍＡ／ｃｍ2、６０分間）により、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ０、４５μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＩＰＶＨ ０００１０）に転写した。メタノール固定及びブロッキング（３％ （ｗ：ｖ） ＢＳＡ、０．１％ （ｖ：ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ）の後、膜を１μｇ／ｍｌ ａｎｔｉ−ＧＬＰ−１ ａｎｔｉｂｏｄｙ （ＨＹＢ １４７−１２， Ａｎｔｉｂｏｄｙｓｈｏｐ）を用いて、４℃ｏ／ｎにて免疫ブロットした。洗浄、及び０．０２μｇ／ｍｌの検出抗体（Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ， ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ， Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＰＣ ２８５５−１１９７）による、室温における４時間のインキュベーションの後、化学蛍光検出によりタンパク質の位置を明らかにした。
ウェスタンブロット分析を図３に示す（１：擬似トランスフェクションされたｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞の上清に１００ｎｇの合成ＧＬＰ−１（７−３７）を溶解させたもの、２：コンストラクト＃２１７からの２両体ＧＬＰ−１を分泌するｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞（クローン７９ ＴＭ２１７／１３)の上清、３：コンストラクト＃２１７からの２量体ＧＬＰ−１を分泌するＡｔＴ２０細胞（クローン ８１−Ａ−２１７／３）の上清；Ｍ：予め染色したタンパク質マーカー［ｋＤａ］）。この結果は、ＧＬＰ−１（７−３７）及びＣ末端に付加物（図３の２及び３）を含む、本発明のペプチドが、トランスフェクションされた細胞系から分泌され、ＧＬＰ−１の分子中央のエピトープに結合する抗ＧＬＰ−１抗体により検出され得ることを示している。
〔実施例４〕
ヒト細胞から分泌されたＧＬＰ−１ペプチドのインビトロ血漿中安定性
ＨＥＫ２９３及びｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞を、異種ストロメライシンシグナル配列をコードし、以下のペプチドをコードするＧＬＰ−１変異体に連結しているコンストラクトを用いて、一過的にトランスフェクションした。
１：ＧＬＰ−１（７−３７）
２：ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−１１ＡＡにて延長
３：ＧＬＰ１（７−３７）−ＩＰ２−ＧＬＰ１（７−３７）。
細胞から分泌されるＧＬＰ−１又は合成ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｂａｃｈｅｍ）を含む細胞培養液の上清を、ジペプチジルペプチダーゼ活性を含むヒトリンパ球強化型血漿と共に、３７℃で、５％のＣＯ2濃度で、３又は４時間インキュベートした。擬似トランスフェクションされた細胞からの合成ＧＬＰ−１（７−３７）は、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（＃ＤＰＰ４， Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）の添加によって阻害されることが示されている、ＤＰＰ−ＩＶ活性のポジティブコントロールとして用いた。ＤＰＰ−ＩＶに分解され、不活性なＧＬＰ−１（９−３７）ペプチドを識別する、ＧＬＰ−１（７−３７）のＮ末端のエピトープに結合する抗体を用いた、ｔｈｅ ＧＬＰ−１ （Ａｃｔｉｖｅ） ＥＬｌＳＡ （＃ＥＧＬＰ−３５Ｋ， Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）により、活性型ＧＬＰが測定された。
結果を図４（ＨＥＫ２９３細胞）及び図５（ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞）に示す。ＨＥＫ２９３及びｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞は共に遺伝子コンストラクトの有効なホストである。タイプ１〜３のトランスフェクションされた細胞の結果の計測は実施例３と同様に行なった（１：擬似トランスフェクションされたｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞の上清に１００ｎｇの合成ＧＬＰ−１（７−３７）を溶解させたもの、２：コンストラクト＃２１７からの２両体ＧＬＰ−１を分泌するｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ細胞（クローン７９ ＴＭ２１７／１３)の上清、３：コンストラクト＃２１７からの２量体ＧＬＰ−１を分泌するＡｔＴ２０細胞（クローン ８１−Ａ−２１７／３）の上清）。コンストラクト１は、ＤＰＰ−ＩＶにより合成ＧＬＰ−１と同様に不活性化される野生型ＧＬＰ−１を生産する一方で、本発明の伸張されたＧＬＰ−１が形成するＣ末端（図４の２及び３、図５の３）は、分解に対してさらに抵抗性を有しており、少なくとも４０％の活性を維持する。伸張されたＧＬＰ−１ペプチドのＣ末端は、ヒト血漿中においてインビトロにて極めて安定である。２量体ＧＬＰ−１配列（３）を有するペプチドはほぼ完全にインビトロのＤＰＰ−ＩＶ分解に対して安定である。
〔実施例５〕
ＧＬＰ−１ペプチドのウェスタンブロット解析
様々なＧＬＰ−１ペプチドを、固相（ｓｙｎ）、又は、Ｅ．ｃｏｌｉ（ｒｅｃ）を用いた組み換えにて合成的に生産した。ＧＬＰ−１ペプチド（配列番号１を３１ｎｇ、及び配列番号６、配列番号７、配列番号８をそれぞれ１０ｎｇ）を１０％〜２０％の勾配ＳＤＳ ＰＡＧＥにて分離し（１２０Ｖ、９０分間）、半乾燥ブロッティング（２．０ｍＡ／ｃｍ２、６０分間）によりＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ Ｍｅｍｂｒａｎ ０．４５μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＩＰＶＨ ０００１０）に転写した。メタノール固定及びブロッキング（３％（ｗ：ｖ）ＢＳＡ、０．１％（ｖ：ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ）の後、膜を１μｇ／ｍｌの抗ＧＬＰ−１抗体（ＨＹＢ １４７−１２、Ａｎｔｉｂｏｄｙｓｈｏｐ）を用いて、４℃ ｏ／ｎにて免疫ブロットした。洗浄、及び０．０２μｇ／ｍｌの検出抗体（Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ， ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ， Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＰＣ ２８５５−１１９７）を用いた、室温における４時間のインキュベーションの後、化学蛍光検出にてタンパク質の位置を明らかにした。図６は示されたペプチドのウェスタンブロットを示す。次の値が得られた：配列番号１、ＧＬＰ−１（７−３７）に相当する（ＩＤ１ｓｙｎ）は、３１ａａ、３．３ｋＤ；配列番号８、ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２に相当する（ＩＤ８ｓｙｎ、ＣＭ３）は、４６ａａ、５．１ｋＤ；配列番号７、ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−ＲＲ−ＧＬＰ−２に相当する（ＩＤ７ｒｅｃ、ＣＭ２）は、８３ａａ、９．４ｋＤ；配列番号６、ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２−ＲＲ−ＧＬＰ−１（７−３７）に相当する（ＩＤ６ｓｙｎ、ＣＭ１）は、７９ａａ、８．７ｋＤ。
〔実施例６〕
ＧＬＰ−１ＣＭペプチドのインビトロヒト血漿安定性
合成ＧＬＰ−１ペプチド（配列番号１syn、配列番号６syn、配列番号７rec、配列番号８syn）を濃度２０ｎｇ／ｍｌにて、ヒト血漿と共に、３７℃、５％ＣＯ2にて３時間培養した。血漿のジペプチジルペプチダーゼ活性はＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（＃ＤＰＰ４，Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）を用いて阻害した。活性ＧＬＰはＧＬＰ−１（Ａｃｔｉｖｅ）ＥＬＩＳＡ（＃ＥＧＬＰ−３５Ｋ， Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）を用いて測定した。
野生型のＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号１）に対して、配列番号６、配列番号７及び配列番号８の本発明の伸張されたＧＬＰ−１ペプチドのＣ末端は、有意に、ヒト血漿中において、インビトロで安定であった（図７）。コントロール（右手側）としてＤＤＰ−ＩＶを加えた実験から得られた結果を示す。ＧＬＰ−１活性はコントロールの実験において完全に維持されていた。
〔実施例７〕
インビトロバイオアッセイ
サイクリックＡＭＰ生産
ＲＩＮ−５Ｆ（ラット島細胞腫、ＥＣＡＣＣ Ｎｏ． ９５０９０４０２）細胞を、２４穴プレートにて、４日間、７０％集密になるまで育てた。細胞をＤＭＥＭ（Ｅ１５−００９、ＰＡＡ）で２度洗浄した後、１％ ＨＳＡ（Ａｖｅｎｔｉｓ）、０．２ｍＭ ＩＢＭＸ（８５８４５５、Ｓｉｇｍａ）及び供試ペプチドを加えた０．５ｍｌＤＭＥＭ（Ｅ１５−００９、ＰＡＡ）に加えた。２５℃で２０分間インキュベートした後、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。細胞のｃＡＭＰを０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む０．１Ｎ ＨＣｌを加えることによって抽出した。サイクリックＡＭＰをｃＡＭＰ（低ｐＨ）ＥＩＡ（Ｃａｔ．ＤＥ０３５５、Ｒ＆Ｄ）を用いて定量した。刺激のために３×１０-8Ｍの配列番号１、配列番号６syn、配列番号６rec、配列番号７rec、配列番号８synを用いた。
結果を図８に示す。ＧＬＰ−１が存在しない状態における基本的な生産量を１００％のｃＡＭＰ生産とした。ＧＬＰ−１はＧプロテイン共役型レセプターに結合し、ｃＡＭＰ生産を刺激する。全ての供試分子において細胞ｃＡＭＰ生産が増加している。
〔実施例８〕
インビトロ生物活性
１１週齢の糖尿病タイプＩＩマウス（Ｃ５７ＢＬ／Ｋｓ−Ｌｅｐｒdb／db、Ｈａｒｌａｎ）に対して、１日に２回、午前９時及び午後５時に、５μｇのペプチドを皮下注射する処置をした（１グループあたりｎ＝５）。血糖値は処置前（０日）及びＧＬＰCMペプチドを処置した後（２日、４日、７日、１０日）、午前１０時に、一晩の絶食期間経過後、測定した。データは０日目の血糖値の測定値と相対的に表した。
試験に供された全ての本発明のペプチド（配列番号６（合成又は組み換え）及び配列番号７（合成又は組み換え））は抗高血糖効果を有している。最も良い結果は組み替え配列番号６（ＣＭ１）及び合成配列番号８（ＣＭ３）より得られた。図９（ｙ軸）は処置の相対的な効果を示している。０日目の血糖値を１とした。未処置動物は血糖値が増加し続け、本発明のペプチドで処置された動物は、ここでは大雑把に表示しているが、長期にわたり血糖値が減少し続けた。
〔実施例９〕
ＧＬＰ１ＣＭペプチドのインビトロ血漿安定性の測定（動態学的試験法）
インキュベーションバッファー（５０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ７，８）、０．２％ＨＳＡ）における、ＣＭ３、アラニン置換型ＣＭ３類似体（ＣＭ３−ＡＮＡ０１、ＣＭ３−ＡＮＡ０２、ＣＭ３−ＡＮＡ０３、ＣＭ３−ＡＮＡ０４）、Ｃ−末端短縮型ＣＭ３類似体（ＣＭ３−ＡＮＡ０６、ＣＭ３−ＡＮＡ０７）又はＣ−末端伸長型ＣＭ３類似体（ＣＭ３−ＡＮＡ０９）からの１μＭペプチドの一定分量は、１０％ヒト血漿を用いて、３７°Ｃ且つ５％ＣＯ２において０時間、３時間、６時間及び９時間インキュベートされた。ジペプチジルペプチダーゼ活性は、ＤＰＰＩＶ阻害剤（＃ＤＰＰ、Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）の添加によって停止され、且つ活性型ＧＬＰ−１レベルは、ＧＬＰ−１（活性型）ＥＬＩＳＡ（＃ＥＧＬＰ−３５Ｋ、Ｌｉｎｃｏ）を用いて測定された。結果は、少なくとも２つの独立した実験における三つ組みからの結果である。
ＧＬＰ−１のＣ−末端に付加された少なくとも９つのアミノ酸を有する本発明のペプチドは、ＣＭ３（マウス、ＧＬＰ−１（７−３７）−ＩＰ２）及び構成成分（ＩＩ）（ＩＰ２）において改変された配列を有するこれらの誘導体、すなわち、ＣＭ３−ＡＮＡ０１、ＣＭ３−ＡＮＡ０１、ＣＭ３−ＡＮＡ０２、ＣＭ３−ＡＮＡ０３、ＣＭ３−ＡＮＡ０４、ＣＭ３−ＡＮＡ０５、ＣＭ３−ＡＮＡ０７、ＣＭ３−ＡＮＡ０７である。ペペプチドＧＬＰ−１及びＣＭ３−ＡＮＡ０６は、コントロール物質又は標準物質を示す。
図１０は、活性型ＧＬＰ−１の活性部分（active portion）を、０時間の値に対する％（０ｈ＝１００％）として示す。ＧＬＰ−１は、９時間血漿暴露後、たった９％を有する最も悪い血漿中安定性を有していることは明らかである。ＣＭ３−ＡＮＡ０１は、９時間経過後、８４％原料を有する最も良い安定性値を示す。本発明のペプチドは、９時間後に少なくとも３０％において残留物を有し、一方、より短い伸長を有するペプチドはこれらの値に届かない。上記動態から、試験された物質のための活性型ＧＬＰ−１を０時間の値に対して８０％まで分解するために必要とされる時間（ＤＴ８０：８０％分解時間）が決定され得る。
Figure 2010521186
本発明の物質は、標準物質と比較して、かなり長いインビトロ血漿中安定性を示す。いずれの理論に縛られることなく、ＧＬＰ−１のＣ−末端伸長は立体障害を導入し、これらの類似体がＤＰＰＩＶの活性部位に入ることを防ぎ、且つこのようにして分解を免れる。一方、より短い標準物質は、ＧＬＰ−１安定性のためのこの保護効果を示さない。この仮説は、ペプチドＣＭ３−ＡＮＡ０６（３６ａａ）、ＣＭ３−ＡＮＡ０７（４０ａａ）及びＣＭ３（４６ａａ）の累積的なＣ−末端伸長の安定性が連続して増加することによって支持される。それにもかかわらず、この現象は純粋のアミノ酸の数にのみに依存しないことが、ＣＭ３のＩＰ２領域におけるアラニン置換によって示されている。ＣＭ３に類似した同数のアミノ酸を有するＣＭ３−ＡＮＡ０３ペプチドは、ＣＭ３と比較して大いに低下された安定性を有している。一方、同様に４６アミノ酸からなるＣＭ３−ＡＮＡ０１は、ＣＭ３よりも高い血漿中安定性を有している。これは、アミノ酸の数以外に、さらなる立体効果が安定性に影響を及ぼし得ることを示唆している。特定の構造に起因する、ＧＬＰ−１のＣ−末端におけるＩＰ２を含む伸長又はＩＰ２とある程度の相同性を有する伸長を有するペプチドが特に好ましく、これによってＮ−末端領域がＤＰＰＩＶの活性部位に入ることを妨げることができる。
〔実施例１０〕
インビトロ研究−免疫原性
試験物質ＣＭ１の潜在的免疫原性を解明するために、パラビオサイエンス（フローニンゲン、ドイツ）において、マウスの研究が行われた。上記試験は、２２日に渡って５回の反復注射（７０μｇペプチド／投与、静脈注射）を受けるＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて行われた（ｎ＝５）。
後述する図において示されるように、ＣＭ１ｓｙｎは毒性を誘導せず、且つ最小のＴ−細胞抗体反応及び抗体力価を誘導した。副生成物（ペプチドの純度はちょうど９５％）の免疫学的作用は排除され得ない。図１１は、ＣＭ１ｓｙｎの潜在的免疫原性作用の評価のための研究調査を示す。左手側（図１１Ａ）において、Ｔ−細胞想起応答（recall response）試験の結果が示される。処理マウス及びコントロールマウスの脾臓が外植され、Ｔ−細胞は単離され且つ抗原の量を増加させることによって刺激された。増殖性のリコール反応が測定される。右手側（図１１Ｂ）において、動物の免疫血清における抗原特異的ＩｇＧ抗体力価が測定された。
〔実施例１１〕
糖尿病マウスにおける投与量−有効性研究
２時間の絶食期間の後、Ｒｊ−ｄｂ（ｄｂ／ｄｂ）系統における糖尿病Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪマウスは、ＧＬＰ−１、ＣＭ１、ＣＭ３、ＣＭ３−ＡＮＡ０１及びエキセンディン−４の５つの異なる濃度を用いて処理された。第６グループは生理食塩水のみを用いて処理された。１グループあたり７匹の動物が処理された。注射の直前、注射後１時間及び４時間に、血中グルコースは尾部出血から測定された。
結果は、図１２（図１０Ａ（ＧＬＰ−１）、図１２Ｂ（ＣＭ１）、図１２Ｃ（ＣＭ３）及び図１２Ｄ（ＣＭ３−ＡＮＡ０１））によって、投与量−反応曲線で示される。全試験物質について、グラフは、異なる濃度についての開始の値に対する血中グルコースの比率を用いて作成された。基礎値との比較における減少率として、１時間の測定値を用いて投与量反応曲線を作成する事によって、異なる試験物質のためのＥＤ５０値が測定された。ＧＬＰ−１、ＣＭ３−ＡＮＡ０１、ＣＭ３ｒｅｃ及びエキセンディン−４のＥＤ５０値を評価するために、モーガン−マーサ−フローディン（ＭＭＦ）モデルが用いられ、ＣＭ１のために、リチャードモデルが用いられた。２つのモデルは、投与量反応測定に適するシグモイド適合モデルである。全てのペプチドのために、血中グルコースの減少率から血漿グルコースＥＤ５０値（１回の皮下注射投与量μｇ／マウス）が測定された。これらは、表２においてまとめられている。
Figure 2010521186
ＥＤ５０値から推定されるように、ＧＬＰ−１類似体であるＣＭ１、ＣＭ３及びＣＭ３−ＡＮＡ０１は、２０倍以上のより良いインビトロ生物活性を示す。これは、恐らく、血漿中安定性が増強された結果である。
試験された全てのペプチドは、少なくとも最も高い濃度に関して、高血糖ｄｂ／ｄｂマウスにおける血中グルコースレベルの有意な減少をもたらす。１．１−３．０ｎｍｏｌペプチドの一回の皮下注射後の血漿グルコースにおける減少（対コントロール）は、表３においてまとめられる。表３は試験物質のグルコース低下作用（対コントロール）を示す。血漿グルコースにおける減少及び対応する有意な水準は、ペプチド注射後１時間（＠１ｈ）及び４時間（＠４ｈ）の時間与えられる。違いは、ペプチドの長期間有効性において観察された。エキセンディン−４及びＣＭ３のみが４時間後の血中グルコースレベルの有意な減少を示した。
Figure 2010521186
〔実施例１２〕
ｄｂ／ｄｂマウスの長期間処理
ｎ＝１２のＲｊ−ｄｂ（ｄｂ／ｄｂ）系統におけるＣ５７ＢＬ／ＫｓＪマウスを用いる４つのグループが調査された：
グループＡ １日１回、賦形剤（０．９％生理食塩水）を用いた処理
グループＢ １日１回、２４ｎｍｏｌ／ｋｇ試験物質１：ＣＭ１ｒｅｃを用いた処理
グループＣ １日１回、２４ｎｍｏｌ／ｋｇ試験物質２：ＣＭ３−ＡＮＡ０１を用いた処理
グループＤ １日１回、２４ｎｍｏｌ／ｋｇ標準物質エキセンディン−４（当業者に周知であり承認されている（しかし、エキセンディン−４はＧＬＰ−１類似体ではない））を用いた処理。
ペプチド又は賦形剤は、午後２時から午後３時の間に、背中の皮膚のひだにおいて１日１回皮下投与される（グループＡ−Ｄ）。投薬計画は１８週間続けられた。１２〜１８週まで、グループあたり１２匹の動物の内６匹において、処理は１日に２回行われた。
マウスの様々なパラメータ、すなわち、健康状態（１）、体重（２）、飼料消費（３）、血中グルコース（４）、グルコース負荷試験（５）、インスリン情報（６）、糖化ヘモグロビン（７）、病理学（８）、及びＴ細胞の再刺激（９）が調査された。
健康状態（１）は全てのグループにおいて良好であり、処理の副作用は見られなかった。
体重（２）は、処理１８週後に、すべての処理グループにおいてより減少した（図１３）。ＣＭ３−ＡＮＡ０１グループにおいて、相対的な体重増加は有意に減少している。図１３Ａは、ｄｂ／ｄｂマウスの体重における生理食塩水（Ａ）、ＣＭ１（Ｂ）、ＣＭ３−ＡＮＡ０１（Ｃ）又はエキセンディン（Ｄ）を用いた処理の作用を表す。グループあたり１２匹の動物の平均値が曲線で表される。図１３Ｂは、ｄｂ／ｄｂマウスの体重における生理食塩水（Ａ）、ＣＭ１（Ｂ）、ＣＭ３−ＡＮＡ０１（Ｃ）又はエキセンディン（Ｄ）を用いた処理の作用を表す。１２２日処理後、グループあたり１２匹の動物の相対的な体重増加が曲線で表される。試験物質ＣＭ３−ＡＮＡ０１を用いた処理（グループＢ）のみが有意により少ない体重増加を示した（ｐ＜０．００１）。
飼料消費（３）は、コントロールと比較したＣＭ１及びＣＭ３−ＡＮＡ０１グループにおいて有意により低下した。図１４は、１２２日の処理期間のｄｂ／ｄｂマウスの毎週の飼料消費における生理食塩水（Ａ）、ＣＭ１（Ｂ）、ＣＭ３−ＡＮＡ０１（Ｃ）又はエキセンディン（Ｄ）を用いた処理の作用を表す。マウスあたりの相対的な飼料消費は、グループＢ及びＣにおいて有意に減少する（ｐ＜０．００１）。
血中グルコース（４）レベルは、様々な状態において測定された。非絶食時血中グルコースレベル（ペプチド注射後１時間）、すなわち非絶食時血中グルコースレベルにおける生理食塩水（Ａ）、ＣＭ１（Ｂ）、ＣＭ３−ＡＮＡ０１（Ｃ）又はエキセンディン（Ｄ）を用いた処理の作用は図１５Ａにおいて示される。血中グルコースは、２４ｎｍｏｌ／ｋｇの濃度における生理食塩水（Ａ）又はペプチドＣＭ１（Ｂ）、ＣＭ３−ＡＮＡ０１（Ｃ）若しくはエキセンディン（Ｄ）の皮下注射後１時間の尾部出血から測定された。コントロールと比較して、皮下ペプチド注射後１時間の非絶食時血中グルコースレベルはグループＢにおいて５５％、グループＣにおいて５１％及びグループＤにおいて６０％まで減少する（図１５Ｂ）。処理グループにおける血中グルコース減少は、極めて有意である（ｐ＜０．０００１）。
絶食時血中グルコースレベル（ペプチド注射後１８時間）、すなわち絶食時血中グルコースレベルにおける生理食塩水（Ａ）、ＣＭ１（Ｂ）、ＣＭ３−ＡＮＡ０１（Ｃ）又はエキセンディン（Ｄ）を用いた処理の作用は図１５Ｃにおいて示される。血中グルコースは、試験物質の皮下注射後１８時間、１２時間一晩絶食後の尾部出血から測定された。ペプチド注射後１８時間の絶食時血中グルコースレベルは、ＣＭ１及びＣＭ３−ＡＮＡ０１グループにおいて減少する。
腹腔内グルコース負荷試験（５）（ＩＰＧＴＴ）は、グループＡ−Ｄのマウスにおける処理の８週間後に実施された。１２時間絶食動物の基礎血中グルコース値（０分）は尾部出血によって測定され、その後、試験物質の皮下注射及び２０％グルコース溶液（ｋｇあたり１ｇグルコース）の腹腔内注射を行った。血中グルコースは、グルコース注射後１５分、３０分、４５分、６０分、９０分及び１２０分においてさらに測定された。全ての処理グループにおいてグルコース負荷の有意な正常化が示された（図１６Ａ）。図１６Ａにおいて、生理食塩水（Ａ）、ＣＭ１（Ｂ）、ＣＭ３−ＡＮＡ０１（Ｃ）又はエキセンディン（Ｄ）を用いた処理の８週後の腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）の間の絶対的な血中グルコースレベルが示される（それぞれのグループ（ｎ＝１２）の平均）。
血中グルコース負荷試験の図１６Ａによって提示されたデータの他の提示は、図１６Ｂにおいて与えられる。生理食塩水（Ａ）、ＣＭ１（Ｂ）、ＣＭ３−ＡＮＡ０１（Ｃ）又はエキセンディン（Ｄ）を用いた処理の８週後の腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）の間の相対的な血中グルコースレベルは、開始時血中グルコースレベル（１００％）において規格化した。
インスリンレベル（６）は１２時間一晩絶食期間後のマウスから測定された。処理の１８週後に、処理グループの全てのマウスは、非処理コントロールよりも有意により多くのインスリンを産生する。図１７は、０．９％生理食塩水（グループＡ）、ＣＭ１ペプチド（グループＢ）、ＣＭ３−ＡＮＡ０１ペプチド（グループＣ）又はエキセンディン−４（グループＤ）を用いた１８週処理後のマウスにおける血清インスリンレベルに関するデータを提示する。採取後直ちに、血液試料は、インスリン分解を回避するためのプロテアーゼ阻害剤の混合物を用いて処理された。血清は、インスリンマウス超高感度ＥＬＩＳＡ（Ｃａｔ．＃ＥＩＡ−３４４０、ＤＲＧ）を用いてインスリンに関して分析された。有意性は、スチューデントｔ−検定を用いて測定された。
糖化ヘモグロビン（７）は、赤血球（ＲＢＣ）において、過剰の血漿中グルコースがヘモグロビンに結合することによって形成される。赤血球は、１２０日の寿命を有するので、糖化ヘモグロビンの測定は、グルコース制御の長期間の指標を与え、且つ血漿中グルコースレベルよりもよい指標として考えられる。全血は後眼窩洞から採取され、且つ糖化ヘモグロビンレベルを測定するために酵素的ＨｂＡ１ｃ試験キット（＃ＤＺ１２１Ａ、Ｄｉａｚｙｍｅ）を用いて解析された。パラメータとして糖化ヘモグロビンを用いると、全ての処理グループにおいて増加における有意な減少が見られた。
図１８Ａは、生理食塩水（Ａ）、ＣＭ１（Ｂ）、ＣＭ３−ＡＮＡ０１（Ｃ）又はエキセンディン（Ｄ）を用いた処理の６週、１２週及び１８週後の全血試料における糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）の相対的な増加を示す。図１８Ｂは、生理食塩水（Ａ）、ＣＭ１（Ｂ）、ＣＭ３−ＡＮＡ０１（Ｃ）又はエキセンディン（Ｄ）を用いた処理の１８週後の全血試料における糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）の相対的な増加を示す。グループあたりの全ての動物（ｎ＝１２）の平均値が与えられる。全ての処理グループの糖化ヘモグロビンレベルの増加は、コントロールよりも有意により低下している。
処理されたマウスの病理学（８）が実施された。剖検は、膵臓の体積を除いて、非処理グループＡと比較した処理グループの臓器における違いを示さなかった。膵臓重量が測定され、且つ全ての処理グループにおいて極めて有意により重くなっていることが明らかにされた。図１９は、０．９％生理食塩水（グループＡ、ｎ＝１１）、ＣＭ１ペプチド（グループＢ、ｎ＝１２）、ＣＭ３−ＡＮＡ０１ペプチド（グループＣ、ｎ＝１２）又はエキセンディン−４（グループＤ、ｎ＝１２）を用いた処理の１８週後の動物の乱切（scarification）の日において測定された膵臓重量を示す。
試験された物質の潜在的免疫学的作用を評価するために、ＩＶ型免疫原性（９）がＴ細胞再刺激によって調べられた。このために、グループあたり８匹の動物の脾臓が外植、Ｔ細胞は単離され且つ異なる濃度の対応する試験物質を用いて再刺激された。非処理コントロールと比較して、ペプチド再刺激されたＴ細胞の増殖における有意な増加は見出されなかった。図２０は、異なる濃度の試験物質ＣＭ１（図２０Ａ）及びＣＭ３−ＡＮＡ０１（図２０Ｂ）並びに標準物質エキセンディン−４（図２０Ｃ）に対する脾臓細胞のインビトロリコール反応を表す。非放射性細胞増殖分析（細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ、化学発光法）を用いて、５０μｇ／ｍｌにおいて開始する３倍希釈の試験物質ＣＭ１及びＣＭ３−ＡＮＡ０１並びに標準物質エキセンディン−４に対するグループＡからＤのマウスの脾臓細胞のインビトロリコール反応が、個々のマウスの三つ揃いにおいて測定された。刺激指数（ＳＩ）は、それぞれのペプチドの存在における反応とペプチドの非存在における反応との商として算出された。それぞれの処理グループ及びコントロールグループの平均値±標準偏差は示される（グループＡ：ｎ＝３、グループＢ：ｎ＝６、グループＣ：ｎ＝７、グループＤ：ｎ＝６）。平均値の算出のために、５μｇ／ｍｌＣｏｎＡを用いたポジティブコントロール培養において６．５以上のＳＩを有するマウスのみが分析された。
糖尿病マウスにおける長期間の研究は、本発明のＣ−末端伸長型ペプチドの有効性をさらに支持する。試験された全てのパラメータ（体重、飼料消費、血中グルコースレベル、糖化ヘモグロビン、グルコース負荷、インスリン分泌、膵臓重量）において、Ｃ−末端伸長型ペプチドは有意な治療作用を示した。内因的に生じる配列とＣ−末端伸長型ＣｅｌｌＭｅｄペプチドとの相同性を考慮に入れると、これらの本発明のペプチドは、非哺乳類のエキセンディン−４と比較した免疫原性の点から見て、有利であることが示された。マウスにおける免疫原性研究からのデータは、ＣＭ１ペプチドの臨床的に関連する免疫原性がないことを支持する。
〔実施例１３〕
安定性試験
ＧＬＰ−１の類似体であるＣＭ３（ＩＰ２によって伸長されたＧＬＰ−１、配列番号８）は、たった５ｋＤａの分子量を有する。このため、高い腎クリアランス率のために、血清レベルは急速に低下する。腎クリアランスを低下させるために、ＰＥＧポリマーは、ペプチドのステイン伸長に対してＣ−末端に連結される。
ＰＥＧ化ために、ペプチドＣＭ３−ＡＮＡ０８は以下のアミノ酸配列に基づき、その後ＣＭ３−ＡＮＡ０８（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧＣ）をもたらすタンパク質化学における標準法に従って、システイン残基によってＣ−末端が伸長された。：ＣＭ３（４６ａａ）：
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ（配列番号８）。
ＣＭ３−ＡＮＡ０８は、Ｃ−末端システインの遊離のチオール基を用いて、非分岐型４０ｋＤａ ｍＰＥＧマレイミドプロピオナミド（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、００８，０１６）に対して共有結合的に複合された。連結は標準法に従って行われた。本発明に係る、得られた融合ペプチドは、ＰＥＧ−ＣＭ３−ＡＮＡ０８と称される。
インビトロ血漿中安定性試験（４０ｋＤａ ＰＥＧ−ＣＭ３−ＡＮＡ−０８）
インビトロ血漿中安定性試験は標準法に従って行われた。結果は図２２Ａに表される。
ＰＥＧ化ＣＭ３−ＡＮＡ０８のインビトロ血漿中安定性は、非改変型ＣＭ３（９時間値：６３％）よりも僅かに高く、且つＣＭ３−ＡＮＡ０１（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ）（９時間値：８４％）よりも僅かに低い。僅かに上昇された３時間値によって、温度及び緩衝液依存的なＰＥＧ化ＣＭ３−ＡＮＡ０８ペプチドの再構成が、ＥＬＩＳＡ抗体のより良い認識をもたらすことが示される。
Ｔ０時間ではたった１９％のペプチドがＧＬＰ−１活性ＥＬＩＳＡにおいて検出され得る。これは、ＰＥＧはＥＬＩＳＡ抗体エピトープを覆うか又は立体的に妨げていることを示唆している。
ＧＬＰ−１の生物学的検定ｃＡＭＰ増加
インビトロ生物活性は、半数効果容量（ＥＤ５０）を測定することによってＧＬＰ−１受容体を形質転換されたＣＨＯ細胞株において試験された。
データは、図２２Ｂにおいて示される。
８４７ｐＭのＥＤ５０は、ＣＭ３（ＩＣ５０＝１８７ｐＭ）又はＣＭ３−ＡＮＡ０１（ＩＣ５０＝１５９ｐＭ）よりもおよそ５倍高い。
要約すれば、４０ｋＤａ ＰＥＧ ＣＭ３ ＡＮＡ０８ペプチドは、非改変型ペプチドのように同程度のインビトロ血漿中安定性を有するが、５倍低下したインビトロ生物活性を有することを示した。非処理グループに対する処理グループにおける有意な血中グルコースの減少をもたらすインビトロ生物活性が、糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスにおいて示された。毒性の兆候は認められなかった。
〔実施例１４〕
経口製剤
投与液剤の調製
実施例１３のＰＥＧ−ＣＭ３−ＡＮＡ０８（すなわち、ＰＥＧに連結された本発明の融合ペプチドによって形成された本発明の複合体が用いられた。原液を調製するために、この複合体は脱イオン水（ｐＨ６．５）において溶解され、８ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。原液は、使用されるまで０．５ｍｌの分注において−２０℃において凍結状態にされた。投与溶液のために、２００ｍｇ／ｍｌ（経口投与）又は１００ｍｇ／ｍｌ（結腸内投与）の最終濃度を得るために、図２１の輸送剤は脱イオン水に溶解された。遊離酸型の輸送剤は、１当量の水酸化ナトリウムを添加することによってナトリウム塩に変換された。溶液はボルテックスされ、超音波処理され、且つ加熱された。そして必要であれば、均一な溶解を達成するために、［ｍｕ］ｌの分量において追加の水酸化ナトリウムが加えられた。所定量のｒｈｅ複合体ストックは、その後、輸送剤溶液に加えられ、１ｍｇ／ｍｌ若しくは０．３ｍｇ／ｍｌ（経口）又は０．６ｍｇ／ｍｌ（結腸）の最終濃度を得た。可溶化及び「薬剤」添加後、溶液は脱イオン水の添加によって最終の体積にされた。
動物及び投与
上記複合体は、単独又は輸送剤との組み合わせにおいて、オスのスピローグ−ドーリーラットに投与された。通常、ラットは、投与までの１８−２４時間、絶食状態に置かれた。実験の日に、ラットは重さを測定され、且つその後ケタミン（４４ｍｇ／ｋｇ）及びソラジン（１．５ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせを用いて麻酔された。麻酔は、ｋｇ体重あたり０．５ｍｌｓの体積において、筋肉内（ＩＭ）注射（２６−標準規格注射針）によって後ろ足に投与された。尾部又はつま先を挟むことによって麻酔のレベルが測定された。一旦麻酔されると、ラットは本発明の（上述の）複合分子のみ又は輸送剤との組み合わせにおいて投与された。輸送経路は経口（ＰＯ）又は結腸（ＩＣ）のどちらかであった。ＰＯ及びＩＣ投与のために、ラッシュ８フランス産導尿管（Rusch 8 French catheter）は、１１ｃｍの長さに切断され、且つ１ｍｌシリンジに合うように適合された。上記シリンジは投与液剤で満たされ、且つ上記導尿管は余分な溶液を拭いて乾かされた。ＰＯ投与のために、上記導尿管はラットの口に挿入され、且つ食道（１０．０ｃｍ）に送り込まれた。投与液剤は、ラットを直立状態に維持したままシリンジのプランジャーを押すことによって供給された。輸送剤及びＧＬＰ−１類似体の投与量は、それぞれ２００ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇ又は０．３ｍｇ／ｋｇとした。投与体積は、１ｍｌ／ｋｇとした。ＩＣ投与のために、上記導尿管は直腸に挿入され、且つ大腸（７．５ｃｍ）に送り込まれた。投与液剤は、ラットを尻尾によって持ち上げた状態のままシリンジのプランジャーを押すことによって供給された。輸送剤及び複合分子の投与量は、それぞれ５０ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇとした。投与体積は、０．５ｍｌ／ｋｇとした。
試料採取及び取り扱い
血液試料を採取する間は、麻酔を維持するために、ラットは追加のケタミン／ソラジンの注射を受けてもよい。血液を採取するために、２２−標準規格注射針は尾動脈に挿入された。通常、血液サンプルは投与の前（０時間）、及び投与後５分、１５分、３０分、４５分、及び６０分において採取された。試料は、ＥＤＴＡ及びＤＤＰ−ＩＶ阻害剤を含むキャピジェクトチューブに採取され、且つ遠心分離まで湿った氷の上に置かれた。全ての試料が採取された後で、血漿を分離するために、チューブは、４℃、１０，０００ｒｐｍにおいて４分間遠心分離された。血漿はエッペンドルフチューブに採取され、且つ分析されるまで−２０℃において凍結された。
生物分析方法及びデータ解析
簡単に、複合体の濃度は、ラットの血漿においてラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いて定量化された。％Ｂ／Ｂ０（％結合した薬剤／結合しなかった薬剤）は分析基準のために導き出され、且つｌｏｇ／ｌｏｇスケールにおいて曲線で表された。４ＰＬロジスティック適合は、標準曲線にあわせるために用いられた。試料濃度は、標準曲線を外れた試料の％Ｂ／Ｂ０を読み取ることによって計算された。それぞれの時点からの％Ｂ／Ｂ０値は平均化され（ｎ＝５）、且つ濃度に対する曲線で表された。最終的に、データは、時間に対する複合体の平均血漿濃度として表された。分析の範囲は０．１−１２．８ｎｇ／ｍｌであった。
実験の結果は、輸送剤を用いることなくＰＥＧ−ＣＭ３−ＡＮＡ０８を投与した場合と比較して、図２１の輸送剤を用いてＰＥＧ−ＣＭ３−ＡＮＡ０８（複合体）を経口使用すると、生物学的有効性が改善される（すなわち、増加される）ことを実証した。
（配列表）
HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR G
配列番号１
RRDFPEEVAI VEELG
配列番号２
RRDFPEEVAI AEELG
配列番号３
HADGSFSDEM NTILDNLAAR DFINWLIQTK ITDRK
配列番号４
HADGSFSDEM STILDNLATR DFINWLIQTK ITDKK
配列番号５
HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GRRDFPEEVA IAEELGRRHA
EGTFTSDVSS YLEGQAAKEF IAWLVKGRG
配列番号６
HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GRRDFPEEVA IAEELGRRHA
DGSFSDEMST ILDNLATRDF INWLIQTKIT DKK
配列番号７
HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GRRDFPEEVA IAEELG
配列番号８
MAPAAWLRSA AARALLPPML LLLLQPPPLL ARALPPDVHH LHAERRGPQP
WHAALPSSPA PAPATQEAPR PASSLRPPRC GVPDPSDGLS ARNRQKR
配列番号９
HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GRRDFPEEVA IVEELGRRHA
EGTFTSDVSS YLEGQAAKEF IAWLVKGRG
配列番号１０
HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GRRDFPEEVA IVEELGRRHA
DGSFSDEMNT ILDNLAARDF INWLIQTKIT DRK
配列番号１１
HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR GRRDFPEEVA IVEELG
配列番号１２
1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg
M A P A A W L R S A A A R A
51 ccctgctgcc acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg
L L P P M L L L L L Q P P P L L
101 gcccgggccc tgcccccggt gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg
A R A L P P
151 ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc ccagcggcgt atccggacgc
201 caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc catgtgccgg
251 tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac
301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta
351 ggcctgacca gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct
D V H H L
401 gcacgccgag aggcgcggcc ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca
H A E R R G P Q P W H A A L P S S
451 gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg cccccaggcc tgccagcagc
P A P A P A T Q E A P R P A S S
501 ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg gcctgagcgc
L R P P R C G V P D P S D G L S A
551 tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga
R N R Q K R H A E G T F T S D V S
601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg
S Y L E G Q A A K E F I A W L V
651 aagggcaggg gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga
K G R G R R D F P E E V A I V E E
701 gctgggccgg cgacacgccg agggcacctt cacctccgac gtgagcagct
L G R R H A E G T F T S D V S S Y
751 acctggaggg ccaggccgcc aaggagttca tcgcctggct ggtgaagggc
L E G Q A A K E F I A W L V K G
801 aggggctgag cgcgc
R G *
配列番号１３
1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc
61 acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt
121 gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc
181 ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc
241 catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac
301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca
361 gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc
421 ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg
481 cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg
541 gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga
601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg
661 gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga gctgggccgg cgacacgccg
721 agggcacctt cacctccgac gtgagcagct acctggaggg ccaggccgcc aaggagttca
781 tcgcctggct ggtgaagggc aggggctgag cgcgc
配列番号１４
1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg
M A P A A W L R S A A A R A
51 ccctgctgcc acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg
L L P P M L L L L L Q P P P L L
101 gcccgggccc tgcccccggt gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg
A R A L P P
151 ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc ccagcggcgt atccggacgc
201 caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc catgtgccgg
251 tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac
301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta
351 ggcctgacca gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct
D V H H L
401 gcacgccgag aggcgcggcc ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca
H A E R R G P Q P W H A A L P S S
451 gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg cccccaggcc tgccagcagc
P A P A P A T Q E A P R P A S S
501 ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg gcctgagcgc
L R P P R C G V P D P S D G L S A
551 tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga
R N R Q K R H A E G T F T S D V S
601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg
S Y L E G Q A A K E F I A W L V
651 aagggcaggg gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga
K G R G R R D F P E E V A I V E E
701 gctgggccgg cgacacgccg acggcagctt cagcgacgag atgaacacca
L G R R H A D G S F S D E M N T I
751 tcctggacaa cctggccgcg cgcgacttca tcaactggct gatccagacc
L D N L A A R D F I N W L I Q T
801 aagatcaccg atcggaagtg agcgcgctga tatc
K I T D R K *
配列番号１５
1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc
61 acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt
121 gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc
181 ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc
241 catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac
301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca
361 gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc
421 ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg
481 cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg
541 gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga
601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg
661 gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga gctgggccgg cgacacgccg
721 acggcagctt cagcgacgag atgaacacca tcctggacaa cctggccgcg cgcgacttca
781 tcaactggct gatccagacc aagatcaccg atcggaagtg agcgcgctga tatc
配列番号１６
1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg
M A P A A W L R S A A A R A
51 ccctgctgcc acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg
L L P P M L L L L L Q P P P L L
101 gcccgggccc tgcccccggt gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg
A R A L P P
151 ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc ccagcggcgt atccggacgc
201 caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc catgtgccgg
251 tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac
301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta
351 ggcctgacca gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct
D V H H L
401 gcacgccgag aggcgcggcc ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca
H A E R R G P Q P W H A A L P S S
451 gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg cccccaggcc tgccagcagc
P A P A P A T Q E A P R P A S S
501 ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg gcctgagcgc
L R P P R C G V P D P S D G L S A
551 tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga
R N R Q K R H A E G T F T S D V S
601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg
S Y L E G Q A A K E F I A W L V
651 aagggcaggg gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga
K G R G R R D F P E E V A I V E E
701 gctgggccgg cgacacgccg acggcagctt cagcgacgag atgaacacca
L G R R H A D G S F S D E M N T I
751 tcctggacaa cctggccgcg cgctga tat c
L D N L A A R *
配列番号１７
1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc
61 acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt
121 gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc
181 ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc
241 catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac
301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca
361 gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc
421 ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg
481 cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg
541 gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga
601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg
721 acggcagctt cagcgacgag atgaacacca tcctggacaa cctggccgcg cgctgatatc
配列番号１８
1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg
M A P A A W L R S A A A R A
51 ccctgctgcc acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg
L L P P M L L L L L Q P P P L L
101 gcccgggccc tgcccccggt gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg
A R A L P P
151 ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc ccagcggcgt atccggacgc
201 caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc catgtgccgg
251 tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac
301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta
351 ggcctgacca gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct
D V H H L
401 gcacgccgag aggcgcggcc ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca
H A E R R G P Q P W H A A L P S S
451 gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg cccccaggcc tgccagcagc
P A P A P A T Q E A P R P A S S
501 ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg gcctgagcgc
L R P P R C G V P D P S D G L S A
551 tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga
R N R Q K R H A E G T F T S D V S
601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg
S Y L E G Q A A K E F I A W L V
651 aagggcaggg gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga
K G R G R R D F P E E V A I V E E
701 gctgggctga gcgcgc
L G *
配列番号１９
1 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc
61 acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt
121 gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc
181 ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc
241 catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac
301 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca
361 gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc
421 ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg
481 cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg
541 gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga
601 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg
661 gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga gctgggctga gcgcgc
配列番号２０
HGEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR G
配列番号２１
RRDFPEEVAI
配列番号２２
RRDFPEEVAI VEEL
配列番号２３
RRDFPEEVAI AEEL
配列番号２４
Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala
配列番号２５
Ala Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile
配列番号２６
Ala Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu
配列番号２７
Ala Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu
配列番号２８
Ala Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly
配列番号２９
Ala Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly
配列番号３０
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ala
Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly
配列番号３１
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
Arg Asp Phe Ala Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly
配列番号３２
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
Arg Asp Ala Ala Ala Ala Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly
配列番号３３
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ala
Ala Asp Ala Ala Ala Ala Val Ala Ile Ala Ala Ala Leu Gly
配列番号３４
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
Arg Asp Phe Pro
配列番号３５
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala
配列番号３６
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly Arg Arg
His Ala Cys
配列番号３７
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ala
Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly
配列番号３８
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
Arg Asp Phe Ala Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly
配列番号３９
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
Arg Asp Ala Ala Ala Ala Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly
配列番号４０
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ala
Ala Asp Ala Ala Ala Ala Val Ala Ile Val Ala Ala Leu Gly
配列番号４１
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly Arg Arg
His Ala Cys
配列番号４２
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa
配列番号４３（式（Ｉ））
Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa
Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
配列番号４４（式（ＩＩ））
Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Xaa Tyr Leu Glu Xaa
Xaa Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Xaa Trp Leu Val Xaa Xaa Xaa Xaa
配列番号４５（式（ＩＩＩ））
ａはＧＬＰ１7-37を表し、ｂはＨｉｎｃＩＩ−ＧＬＰ１7-37−ＩＰ２を表し、ｃはストロ−ＧＬＰ１7-37を表し、ｄはストロ−ＧＬＰ１7-37−ＩＰ２を表し、ｅはストロ−ＧＬＰ１7-37−ＩＰ２−ＧＬＰ１7-37を表し、ｆはストロ−ＧＬＰ１7-37−ＩＰ２−１１ａａを表し、ｇはストロ−ＧＬＰ１7-37−ＩＰ２（４ｘ）−１１ａａを表し、ｈは配列番号１６を表し、ｉはＢ１を表し、ｊはＢ２を表し、ｋは配列番号１４を表し、ｌは配列番号１８を表し、ｍは配列番号２０を表す図である。 ｈＴｅｒ−ＭＳＣ及びＨＥＫ２９３細胞への一過性トランスフェクション後の活性型ＧＬＰ１を表すグラフである。 ウェスタンブロット分析を表す図である。 血漿中安定性（インビトロ試験）を表すグラフである。 血漿中安定性（インビトロ試験）を示すグラフである。 ペプチドのウェスタンブロットを表す図である。 ＧＬＰ１ペプチドの血漿中安定性（インビトロ試験）を表すグラフである。 サイクリックＡＭＰ生産を表すグラフである。 ｄｂ／ｄｂマウスの相対的な空腹時血糖値を表すグラフである。 インビトロ血漿中安定性を表すグラフである。 ＡはＴ−細胞想起応答（recall response）試験の結果を表すグラフであり、Ｂは動物の免疫血清における抗原特異的ＩｇＧ抗体力価を表すすグラフである。 血漿グルコースの変化を表すグラフである。 Ａは、ｄｂ／ｄｂマウスの体重における生理食塩水（Ａ）、ＣＭ１（Ｂ）、ＣＭ３−ＡＮＡ０１（Ｃ）又はエキセンディン（Ｄ）を用いた処理の作用を表し、Ｂは、ｄｂ／ｄｂマウスの体重における生理食塩水（Ａ）、ＣＭ１（Ｂ）、ＣＭ３−ＡＮＡ０１（Ｃ）又はエキセンディン（Ｄ）を用いた処理の作用を表すグラフである。 １２２日の処理期間のｄｂ／ｄｂマウスの毎週の飼料消費における生理食塩水（Ａ）、ＣＭ１（Ｂ）、ＣＭ３−ＡＮＡ０１（Ｃ）又はエキセンディン（Ｄ）を用いた処理の作用を表すグラフである。 Ａは非空腹時血糖値を表し、Ｂはコントロールに対する血糖値の減少を表し、Ｃは空腹時血糖値を表すグラフである。 Ａは腹腔内グルコース負荷試験を表し、Ｂは腹腔内グルコース負荷試験（相対値）を表すグラフである。 ０．９％生理食塩水（グループＡ）、ＣＭ１ペプチド（グループＢ）、ＣＭ３−ＡＮＡ０１ペプチド（グループＣ）又はエキセンディン−４（グループＤ）を用いた１８週処理後のマウスにおける血清インスリンレベルに関するデータを提示するグラフである。 Ａは、生理食塩水（Ａ）、ＣＭ１（Ｂ）、ＣＭ３−ＡＮＡ０１（Ｃ）又はエキセンディン（Ｄ）を用いた処理の６週、１２週及び１８週後の全血試料における糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）の相対的な増加を表し、Ｂは、生理食塩水（Ａ）、ＣＭ１（Ｂ）、ＣＭ３−ＡＮＡ０１（Ｃ）又はエキセンディン（Ｄ）を用いた処理の１８週後の全血試料における糖化ヘモグロビン（ＧＨｂ）の相対的な増加を表すグラフである。 ０．９％生理食塩水（グループＡ、ｎ＝１１）、ＣＭ１ペプチド（グループＢ、ｎ＝１２）、ＣＭ３−ＡＮＡ０１ペプチド（グループＣ、ｎ＝１２）又はエキセンディン−４（グループＤ、ｎ＝１２）を用いた処理の１８週後の動物の乱切（scarification）の日において測定された膵臓重量を表すグラフである。 異なる濃度の試験物質ＣＭ１（図２０Ａ）及びＣＭ３−ＡＮＡ０１（図２０Ｂ）並びに標準物質エキセンディン−４（図２０Ｃ）に対する脾臓細胞のインビトロリコール反応を表すグラフである。 化合物を示す図である。 ４０ｋＤａ ＰＥＧ ＣＭ３−ＡＮＡ０８のインビトロ血漿安定性を表すグラフである。 ＣＭ３ａｎａ０８ ＰＥＧのデータを表すグラフである。

Claims (45)

  1. Ｎ末端側に、式ＩＩ
    Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７
    （ここで、Ｘａａ７は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、３−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−アセチル−ヒスチジン、ａ−フルオロメチル−ヒスチジン、ａ−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン又は４−ピリジルアラニンであり、Ｘａａ８は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボン酸、又は（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸であって、Ｇｌｙが特に好ましく；Ｘａａ１６はＶａｌ又はＬｅｕであり；Ｘａａ１８はＳｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ１９はＴｙｒ又はＧｌｎであり；Ｘａａ２０はＬｅｕ又はＭｅｔであり；Ｘａａ２２はＧｌｙ、Ｇｌｕ又はＡｉｂであり；Ｘａａ２３はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２５はＡｌａ又はＶａｌであり；Ｘａａ２６はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２７はＧｌｕ又はＬｅｕ；Ｘａａ３０はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３３はＶａｌ又はＬｙｓであり；Ｘａａ３４はＬｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３５はＧｌｙ又はＡｉｂであり；Ｘａａ３６はＡｒｇ、Ｇｌｙ若しくはＬｙｓ若しくはアミド又は欠損しており；Ｘａａ３７はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、アミド又は欠損している。）、
    又は、式ＩＩＩ
    Ｘａａ７‐Ｘａａ８‐Ｇｌｕ‐Ｇｌｙ‐Ｔｈｒ‐Ｐｈｅ‐Ｔｈｒ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｐ‐Ｖａｌ‐Ｓｅｒ‐Ｘａａ１８‐Ｔｙｒ‐Ｌｅｕ‐Ｇｌｕ‐Ｘａａ２２‐Ｘａａ２３‐Ａｌａ‐Ａｌａ‐Ｘａａ２６‐Ｇｌｕ‐Ｐｈｅ‐ｌｌｅ‐Ｘａａ３０‐Ｔｒｐ‐Ｌｅｕ‐Ｖａｌ‐Ｘａａ３４‐Ｘａａ３５‐Ｘａａ３６‐Ｘａａ３７
    （ここで、Ｘａａ７は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、３−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎ−アセチル−ヒスチジン、ａ−フルオロメチル−ヒスチジン、ａ−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン又は４−ピリジルアラニンであり；Ｘａａ８はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボン酸、又は（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸であり；Ｘａａ１８はＳｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２２はＧｌｙ、Ｇｌｕ又はＡｉｂ；Ｘａａ２３はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；Ｘａａ２６はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３０はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３４はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；Ｘａａ３５はＧｌｙ又はＡｉｂであり；Ｘａａ３６はＡｒｇ若しくはＬｙｓ、アミド又は欠損しており；Ｘａａ３７はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ若しくはＬｙｓ、アミド又は欠損している。）
    に示される配列を構成部分（Ｉ）として、Ｃ末端側に、少なくとも９アミノ酸のペプチド配列、その機能的なフラグメント、変異体又は誘導体を構成部分（ＩＩ）として備えている融合ペプチドと、合成又は天然のポリマーとを備えている、複合分子。
  2. 上記合成のポリマーが、下記式に示されるモノマーから調製されるものである、請求項１に記載の複合分子。
    Figure 2010521186
     （ここで、Ｒ18は、水素、ハロゲン、炭素数１〜４のアルキル基、及びＣＯＯＲ22基（Ｒ22は、水素原子及び炭素数１〜４のアルキル基である）から選択され；
    Ｒ19は、水素、ハロゲン、及び炭素数１〜４のアルキル基から選択され；
    Ｒ20は、水素、ハロゲン、炭素数１〜４のアルキル基、及びＣＯＯＲ22基（Ｒ18及びＲ20は両方ともＣＯＯＲ22基ではない）から選択され；並びに
    Ｒ21は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜２０のアルコキシカルボニル基、モノ−若しくはジ−アルキル（炭素数１〜２０）アミノカルボニル基、炭素数６〜２０のアリール基（アルカリル基を含む）、炭素数７〜２０のアラルキル基、炭素数６〜２０のアリ−ルオキシカルボニル基、炭素数１〜２０のアラルキルオキシカルボニル基、炭素数６〜２０のアリ−ルアミノカルボニル基、炭素数７〜２０のアラルキルアミノ基、ヒドロキシル基、又は炭素数２〜１０のアシルオキシ基であり、これらの基は何れも、ハロゲン原子、アルコキシ基、オリゴアルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、アシルアミノ基、アミン基（モノ−およびジ−アルキルアミノ基並びにトリアルキルアンモニウム基を含む）、カルボキシル基、スルホニル基、ホスホリル基、ホスフィノ基（モノ−およびジ−アルキルホスフィン基並びにトリアルキルホスホニウム基を含む）、双性イオン基、並びにヒドロキシ基から選択される置換を、一つ以上有し得る。あるいは、Ｒ21及びＲ20、若しくはＲ21及びＲ19は、ともに−ＣＯＮＲ23ＣＯを形成し得る（Ｒ23は、炭素数１〜２０のアルキル基である）。）
  3. 上記合成のポリマーが、下記一般式（Ｂ）又は（Ｃ）に示される構造を有するものである、請求項１に記載の複合分子。
    Figure 2010521186
    Figure 2010521186
     （ここで、Ｒ1は、公知の電子吸引基であり；
    Ｒ2は、Ｃ＝Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ9、又は、単結合から選択され；Ｒ9は、Ｈ又は炭素数１〜４のアルキル基であり；
    Ｒ3は、炭素数１〜２０のアルキレン基；炭素数３〜８のシクロアルキレン基；Ｃ（＝Ｏ）Ｒ10、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ11、炭素数１〜２０のアルコキシ基、炭素数２〜２０のアルケニレン基、炭素数２〜２０のアルケニルオキシラニレン基；アリーレン基、ヘテロシクレン基、アラルキレン基；それらにおいて、一つ乃至全ての水素原子がハロゲンによって置換されているもの；炭素数１〜４のアルコキシ基、アリール基、ヘテロシクリル基、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ10、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ11Ｒ12、オキシラニル基、及びグリシジル基からなる群より選択される一つ乃至二つの置換基によって置換されている炭素数１〜６のアルキル基、からなる群より選択され；
    Ｒ10は、炭素数１〜２０のアルキレン基、炭素数１〜２０のアルコキシ基、各アルコキシ基がそれぞれ炭素数１〜３のオリゴ（アルコキシ）基、アリールオキシ基、又はヘテロシクリルオキシ基であり；それらの基は、任意に置換されたアルコキシ基、オリゴアルコキシ基、アミノ基（モノ−及びジ−アルキルアミノ並びにトリアルキルアンモニウムを含んでおり、それらのアルキル基は、アシル基、アルコキシカルボニル基、アルケンオキシカルボニル基、アリール基、及びヒドロキシ基から選択される置換基を有していてもよい）、並びにヒドロキシル基から選択される置換基を有していてもよく；
    Ｒ11及びＲ12は、独立して、Ｈ若しくは炭素数１〜２０のアルキル基であるか、又は、Ｒ11及びＲ12は、共同して炭素数２〜５のアルカンジイル基を形成し、３〜６員環を形成し得るものであり；
    Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｚ、ハロゲン、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数３〜８のシクロアルキル基、ＯＨ、ＣＮ、炭素数２〜２０のアルケニル基、炭素数２〜２０のアルケニルオキシラニル基、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ13、グリシジル基、アリール基、ヘテロシクリル基、アリールキル基、アラキケニル基、それらにおいて、一つ乃至全ての水素原子がハロゲンによって置換されているもの、炭素数１〜４のアルコキシ基、アリール基、ヘテロシクリル基、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ10、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ11Ｒ12、オキシラニル基、及びグリシジル基からなる群より選択される一つ乃至二つの置換基によって置換されている炭素数１〜６のアルキル基、から選択され；
    Ｒ13は、炭素数１〜２０のアルキレン基、炭素数１〜２０のアルコキシ基、各アルコキシ基がそれぞれ炭素数１〜３のオリゴ（アルコキシ）基、アリールオキシ基、又はヘテロシクリルオキシ基であり、それらの任意の基は、任意に置換されたアルコキシ基、オリゴアルコキシ基、アミノ基（モノ−及びジ−アルキルアミノ並びにトリアルキルアンモニウムを含んでおり、それらのアルキル基は、アシル基、アルコキシカルボニル基、アルケンオキシカルボニル基、アリール基、及びヒドロキシ基から選択される置換基を有していてもよい）、並びにヒドロキシル基から選択される置換基を有していてもよく；そして、
    Ｌは、連結基（linking group）であり；
    Ｚは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ14、ＳＲ15、ＳｅＲ15、ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ15、ＯＰ（＝Ｏ）（＝ＯＲ15）2、Ｏ−Ｎ（Ｒ15）2、及びＳ−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒ15）2からなる群より選択され、Ｒ14は、任意の水素原子が独立にハロゲン化物に置換され得る、炭素数１〜２０のアルキル基であり、Ｒ15は、アリール基又は直鎖状の、若しくは分岐した炭素数１〜２０のアルキル基であり、そしてＮ（Ｒ15）2基が存在する場合には、二つのＲ15基は共同して５又は６員の複素環を形成してもよく；
    Ｒ6は、ＣＨ2Ｅ2、Ｈ、又は炭素数１〜４のアルキル基であり、
    Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して、Ｈ及び炭素数１〜４のアルキル基から選択され；
    ｍは、０〜４であり、
    ｆは、１〜５００、好ましくは５〜５０であり、
    Ｅ1及びＥ2は、それぞれ独立して、脱離基、又は脱離基の前駆体であり、そして
    基Ｍは、同一か又は異なり、エチレン性不飽和モノマー由来の残基であり、特に、請求項２において規定されるモノマーである）
  4. 上記合成のポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、エチレングリコール及びプロピレングリコールのコポリマー等のポリアルキレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、ポリオレフィンアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリヒドロキシアルキルメタクリルアミド、ポリヒドロキシエチレンメタクリレートのようなポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリレート、ポリサッカライド、ポリ（［α］−ヒドロキシ酸）、ポリビニルアルコール、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモーフォリン）、ポリビニルエチルエーテル、ポリビニルアセテート、ポリ乳酸グリコール酸、ポリ乳酸、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、ポリウレタン、ポリシアル酸、三酢酸セルロース、硝酸セルロース、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜３の何れかに記載の複合分子。
  5. 上記合成のポリマーが、１００〜２０００００ダルトンの平均分子量を有している、請求項１〜４の何れかに記載の複合分子。
  6. 上記平均分子量が、１０００〜４００００ダルトンである、請求項５に記載の複合分子。
  7. 上記天然のポリマーがタンパク質またはペプチドである、請求項１〜６の何れかに記載の複合分子。
  8. 上記タンパク質が、アルブミンまたはトランスフェリンである、請求項７に記載の複合分子。
  9. 上記ポリマーが、構成部分（Ｉ）または構成部分（ＩＩ）のいずれか一方に共有結合している、あるいは構成部分（Ｉ）および構成部分（ＩＩ）の両方に共有結合している、請求項１〜８の何れかに記載の複合分子。
  10. 上記ポリマーが、上記融合ペプチドのＮ末端、Ｃ末端および／またはアミノ酸側鎖に結合している、請求項１〜９の何れかに記載の複合分子。
  11. １つ〜３つ、好ましくは１つのポリマー成分を含む、請求項１〜１０の何れかに記載の複合分子。
  12. Ｎ末端側に、ＧＬＰ−１（７−３５、７−３６または７−３７）配列を構成部分（Ｉ）として、Ｃ末端側に、少なくとも９アミノ酸のペプチド配列、その機能的なフラグメント、変異体又は誘導体を構成部分（ＩＩ）として備えている、請求項１〜１１の何れかに記載の複合分子。
  13. Ｎ末端側に、式Ｉ
    Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘ （Ｉ）
    （ここで、ＸはＮＨ２又はＧｌｙ−ＯＨである。）
    に示される配列を構成部分（Ｉ）として、Ｃ末端側に、少なくとも９アミノ酸のペプチド配列、その機能的なフラグメント、変異体又は誘導体を構成部分（ＩＩ）として備えている、請求項１〜１２の何れかに記載の複合分子。
  14. 構成部分（Ｉ）が、配列番号１に示される配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含んでいる、請求項１２又は１３に記載の複合分子。
  15. 構成部分（ＩＩ）が、βターン様構造を形成するペプチド配列である、請求項１〜１４の何れかに記載の複合分子。
  16. 構成部分（ＩＩ）が、少なくとも一つのアラニン又はプロリン残基を含んでいるペプチド配列である、請求項１〜１５の何れかに記載の複合分子。
  17. 構成部分（ＩＩ）が、βターンを形成する性質を有する４量体（例えば、当該４量体の第２位にプロリン残基を有するもの）を含むペプチド配列である、請求項１〜１６の何れかに記載の複合分子。
  18. 構成部分（ＩＩ）が、ＶＡＩＡ、ＩＡＥＥ、ＰＥＥＶ、ＡＥＥＶ、ＥＥＬＧ、ＡＡＡＡ、ＡＡＶＡ、ＡＡＬＧ、ＤＦＰＥ、ＡＡＤＸ、ＡＸＤＸ、及びＸＡＤＸ（Ｘは、任意のアミノ酸を示す。）からなる群より選択されるモチーフ配列を有する、請求項１〜１７の何れかに記載の複合分子。
  19. 構成部分（ＩＩ）が、そのＮ末端側にある、ＡＡ、ＡＸ、ＲＲ、ＲＸ、及びＸＲからなる群より選択されるモチーフ配列を介して、構成部分（Ｉ）のＣ末端と連結しているペプチド配列である、請求項１〜１８の何れかに記載の複合分子。
  20. 配列番号２５に示されるモチーフ配列（ＤＦＰＥＥＶＡ）を含むか、又は配列番号２５に示される配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含んでいる、請求項１〜１９の何れかに記載の複合分子。
  21. 構成部分（ＩＩ）が、配列番号２２に示される配列（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩ）及び配列番号２６に示される配列（ＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩ）からなる群より選択される配列を含んでいるか、又は配列番号２２若しくは配列番号２６に示される配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含んでいるペプチド配列である、請求項１〜２０の何れかに記載の複合分子。
  22. 構成部分（ＩＩ）が、配列番号２３に示される配列（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬ）、配列番号２４に示される配列（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬ）、配列番号２７に示される配列（ＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬ）、及び配列番号２８に示される配列（ＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬ）からなる群より選択される配列か、又は配列番号２３、２４、２７若しくは２８の何れかに示される配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含んでいるペプチド配列である、請求項１〜２１の何れかに記載の複合分子。
  23. 構成部分（ＩＩ）が、配列番号２に示される配列（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ）、配列番号３に示される配列（ＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ）、配列番号２９に示される配列（ＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ）、及び配列番号３０に示される配列（ＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ）からなる群より選択される配列か、又は配列番号２、３、２９若しくは３０の何れかに示される配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含んでいるペプチド配列である、請求項１〜２２の何れかに記載の複合分子。
  24. 構成部分（ＩＩ）が、９〜３０、好ましくは９〜２０、最も好ましくは９〜１５のアミノ酸を有するペプチド配列である、請求項１〜２３の何れかに記載の複合分子。
  25. 構成部分（Ｉ）及び構成部分（ＩＩ）が、直接連結されているか、又は、リンカー配列を介して連結されている、請求項１〜２４の何れかに記載の複合分子。
  26. 上記リンカー配列が、１〜１０のアミノ酸長を有している、請求項１〜２５の何れかに記載の複合分子。
  27. 上記融合ペプチドが、配列番号８に示される配列（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ）、配列番号１２に示される配列（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ）、配列番号３１（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ）、配列番号３２（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＡＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧ）、配列番号３３（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＡＡＡＡＶＡＩＡＥＥＬＧ）、配列番号３４（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＡＡＤＡＡＡＡＶＡＩＡＡＡＬＧ）、配列番号３５（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰ）、配列番号３６（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡ）、配列番号３７（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＡＥＥＬＧＲＲＨＡＣ）、配列番号３８（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＡＡＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ）、配列番号３９（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＡＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧ）、配列番号４０（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＡＡＡＡＶＡＩＶＥＥＬＧ）、配列番号４１（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＡＡＤＡＡＡＡＶＡＩＶＡＡＬＧ）、及び配列番号４２（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＲＲＤＦＰＥＥＶＡＩＶＥＥＬＧＲＲＨＡＣ）からなる群より選択される配列か、又は、配列番号８若しくは１２に示される配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含んでいる、請求項１〜２６の何れかに記載の複合分子。
  28. 上記融合ペプチドが、構成部分（ＩＩ）のＣ末端及び／又は構成部分（Ｉ）のＮ末端に連結されている構成部分（ＩＩＩ）をさらに備えている、請求項１〜２７の何れかに記載の複合分子。
  29. 構成部分（ＩＩＩ）が、少なくとも４個のアミノ酸残基を含んでおり、好ましくは、少なくとも１０個の付加的なアミノ酸残基を含んでおり、より好ましくは、少なくとも２０個、又は少なくとも３０個のアミノ酸残基を含んでいる、請求項２８に記載の複合分子。
  30. 構成部分（ＩＩＩ）が、少なくとも４個の、好ましくは、少なくとも１０個の、より好ましくは、少なくとも２０個の付加的なアミノ酸残基を、プログルカゴンのようにＧＬＰ−２、又はＧＬＰ−１（７−３７）の配列のＮ末端に含んでいる、請求項２８又は２９に記載の複合分子。
  31. 構成部分（ＩＩＩ）が、配列番号４若しくは５に示される配列か、又は、配列番号４若しくは５に示される配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含んでいる、請求項２８〜３０の何れかに記載の複合分子。
  32. 上記融合ペプチドが、配列番号６に示される配列、配列番号７に示される配列、配列番号１０に示される配列、配列番号１１に示される配列からなる群より選択されるペプチド配列か、又は、配列番号６、７、１０若しくは１１に示さされる配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含んでいる、請求項２８〜３１の何れかに記載の複合分子。
  33. 上記融合ペプチドの少なくとも一つのアミノ酸が、天然のアミノ酸の側鎖の共有結合修飾、ペプチド主鎖の修飾、末端のアミノ基又はカルボキシ基の修飾により、誘導体化されている、請求項１〜３２の何れかに記載の複合分子。
  34. 上記融合ペプチドの少なくとも一つのアミノ酸が、炭水化物及び／又は脂質基により誘導体化されている、請求項３３に記載の複合分子。
  35. 上記融合ペプチドの構成部分（Ｉ）のＧＬＰ−１（ＧＬＰ−１（７））のＮ末端のＨｉｓ残基が、そのアミノ末端及び／又はそのヒスチジン側鎖において、化学的に、特に疎水性成分によって修飾されている、請求項３３又は３４に記載の複合分子。
  36. 構成部分（Ｉ）、（ＩＩ）及び／又は（ＩＩＩ）のアミノ酸配列の順序が逆転しており、該アミノ酸配列が、少なくとも部分的にＤアミノ酸異性体からなる、請求項１〜３５の何れかに記載の複合分子。
  37. （ａ）上記融合ペプチドの固相ペプチド合成工程、（ｂ）工程（ａ）の産物と、一つ以上のポリマー成分とを反応させる工程、及び（ｃ）任意に、付加的な反応によって、上記融合ペプチドを誘導体化する工程による、請求項１〜３６の何れかに記載の複合分子を製造する方法。
  38. 請求項１〜３２の何れかに記載の複合分子の部分としての融合ペプチドを製造する方法であって、上記融合ペプチドをコードする核酸を含むように形質転換された微生物が発酵し、上記融合ペプチドが回収される、方法。
  39. タンパク質が細胞外に搬送される条件の下、動物細胞が成育される、請求項３８に記載の融合ペプチドを製造する方法。
  40. ヒト又は動物の治療において用いるための薬剤としての、請求項１〜３６の何れかに記載の複合分子。
  41. 糖尿病タイプＩ又はタイプＩＩ、インスリン耐性、体重障害及びそれらに関連する疾病又は疾患を治療するための薬剤の製造のための、請求項１〜３６の何れかに記載の複合分子の使用。
  42. 神経変性障害及びそれに関連する疾病又は疾患の治療のための薬剤の製造のための、請求項１〜３６の何れかに記載の複合分子の使用。
  43. アポトーシスに関連する疾病又は疾患及び障害の治療のための薬剤の製造のための、請求項１〜３６の何れかに記載の複合分子の使用。
  44. 上記薬剤が、経口投与、経鼻投与又は経肺投与のために処方されている、請求項４１〜４３の何れかに記載の複合分子の使用。
  45. 経口投与のための薬剤が輸送剤を含んでいる、請求項４４に記載の複合分子の使用。
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