WO2004078195A1 - 腸管細胞のインスリン産生細胞への変換誘導剤、及び糖尿病治療剤 - Google Patents

腸管細胞のインスリン産生細胞への変換誘導剤、及び糖尿病治療剤 Download PDF

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Definitions

  • diabetes treatments that focus on these two points of action (enhancement of insulin secretion and insulin action) have been developed and some of them have been quite effective. It does not surpass, but may improve the condition or delay the progress of the condition, but does not lead to drastic treatment.
  • the action of an insulin secretagogue transiently increases insulin secretion, but if the drug is used for a long period of time, ⁇ cells will be exhausted and the insulin secretion ability will be irreversibly attenuated. It is pointed out as a problem. Therefore, restoring the insulin secretion function of the / 3 cell, which has decreased with the progression of diabetes mellitus, to a normal state is nothing but restoring the j3 cell itself to a normal state.
  • a partial peptide of the pre-blog glucagon peptide at least An agent for inducing the conversion of intestinal cells into insulin-producing cells, comprising as an active ingredient a partial peptide comprising the amino acid sequence at positions 92 to 97 of the loglucagon peptide.
  • Typical amino protecting groups include, for example, an acyl group, a formyl group, an acetyl group, an isopropyl group, a butoxycarbonyl group, a fluorenylmethoxycarbonyl group, a carbobenzyloxy group, and the like. And amino groups in the side chains of basic amino acid residues are suitably protected.
  • Representative carboxyl protecting groups include, for example, benzyl ester, methyl ester, t-butyl ester, p-nitrophenyl ester and the like. C-terminal amino acid residues and acidic amino acid residues Amino groups are suitably protected.
  • salts with alkali metals such as ammonium salts, sodium and potassium, salts with alkaline earth metals such as calcium and magnesium, aluminum salts, zinc salts, triethylamine, ethanol
  • alkali metals such as ammonium salts, sodium and potassium
  • alkaline earth metals such as calcium and magnesium
  • aluminum salts such as calcium and magnesium
  • aluminum salts such as calcium and magnesium
  • zinc salts triethylamine
  • ethanol examples thereof include salts with organic amines such as amine, morpholine, pyrrolidine, piperidine, piperazine and dicyclohexylamine, and salts with basic amino acids such as arginine and lysine.
  • the peptide of the present invention can be produced, for example, by a chemical peptide synthesis method, such as a solid phase synthesis method.
  • the peptide of the present invention is produced as a recombinant peptide by expressing it in Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells, etc., using a gene recombination technique using DNA encoding the peptide. You can also.
  • the DNA can be obtained by designing a sequence in accordance with the codon usage of the host and according to a usual chemical synthesis method of DNA.
  • a DNA sequence encoding the peptide of the present invention may be replaced with a promoter sequence, such as tryptophan synthase operon (t rp) promoter, lactose operon (lac) promoter. Overnight, linked to a lambda phage promoter, a tac promoter, a T7 phage promoter, etc., and preferably further added with a ribosome binding sequence such as a Shine-Dalgarno sequence (SD sequence) or a transcription termination factor. Is used to transform E. coli.
  • the peptide of the present invention can be obtained by culturing the obtained transformant under conditions where the promoter functions.
  • Each tissue of small intestine (including jejunum and ileum) and large intestine was immersed in 4% paraformaldehyde-phosphate buffer overnight at 4 and then embedded in O.C.T. compound to prepare a section sample.
  • the section specimen was dried, fixed with acetone, dried at -20 ° C overnight, washed with PBS-Tween 20, and immersed in 0.2% Triton X100 for 1 hour.
  • insulin and glucagon were purified using anti-insulin goat antibody (Santa Cruz) or anti-glucagon mouse antibody (Sigma), and anti-goat IgG donkey antibody conjugated with Alexa488, or anti-mouse IgG donkey antibody conjugated with Cy3. Immunostaining was performed.

Abstract

プレプログルカゴンペプチドの部分ペプチドであって、少なくともプレプログルカゴンペプチドの９２位～９７位のアミノ酸配列を含む部分ペプチドを、糖尿病治療剤の有効成分とする。

Description

明細書 腸管細胞のィンスリン産生細胞への変換誘導剤、 及び糖尿病治療剤 技術分野
本発明は腸管細胞のィンスリン産生細胞への変換誘導剤、 及び同誘導剤を含む 糖尿病治療剤に関する。 本発明は、 医薬及び医療分野で有用である。 背景技術
生活習慣病の中でも、 特に糖尿病は患者数が多く、 最も重大な社会的問題の 1 つと考えられている。 この糖尿病状態をもたらす原因は複数あるが、 血糖が上昇 する直接の原因は、 ィンスリン分泌低下かィンスリン作用低下のいずれかに依存 するところが大きい。
インスリン分泌を担っているのは、 塍臓ランゲル八ンス氏島に分布して存在す る 3細胞である。 細胞はグルコース刺激が加わるとィンスリンを分泌し、 血中 に放出する。 インスリンは、 筋肉細胞、 脂肪細胞、 肝臓細胞などに作用して血液 中のダルコ一スを細胞内に取り込ませることにより、 血糖値は一定に保たれる。 糖尿病状態によって高い血糖値が持続すると、 網膜、 腎臓、 神経、 動脈などに特 有の合併症を発症させる。
今日まで、 主としてこの 2つの作用点 (インスリン分泌促進、 及びインスリン 作用促進) に着目した糖尿病治療薬が開発され、 かなりの効果をあげているもの もあるが、 これらの治療法は、 対症療法を越えるものではなく、 病態を改善させ ることや、 病態の進行を遅延させることはあるものの、 抜本的な治療には至らな い。 例えば、 インスリン分泌促進剤を作用させるとインスリン分泌は一過性に上 昇するが、 長期に薬剤使用を継続すると^細胞が疲弊し、 インスリン分泌能が不 可逆的に減衰することが、 現実の問題として指摘されている。 したがって、 糖尿 病の病態進行にともなって低下した /3細胞のィンスリン分泌機能を正常状態にも どすことは、 j3細胞そのものを正常状態に復元させることに他ならない。
また、 生体内においてはィンスリンと同じくグルコースの代謝に閧与する種々 のペプチドホルモンが存在する。 なかでも塍臓および消化管において産生される グルカゴン関連ペプチドは、 インスリン同様血糖調節の観点から重要である。 グ ルカゴン関連ペプチドは、 前駆体であるプレブログルカゴンとして合成された後、 臓器ごとに異なるプロセッシングを受け、 塍臓では主としてグルカゴン、 消化管 では GL P (glucagon- like peptide) — 1と G L P— 2が生成される。 これら ぺプチドホルモンの主な生理作用としては、 グルカゴンは肝臓におけるグリコ一 ゲン分解による糖新生の促進、 GL P— 1は塍臓におけるィンスリン分泌促進
(インクレチン作用） 、 GL P— 2は消化管機能調節が考えられている （例えば、 Ann N Y Acad Sci 1988; 527: 168- 85参照） 。
この中で、 GL P - 1は、 プレブログルカゴンぺプチドの 92位〜 128位の アミノ酸配列を有する 37アミノ酸からなるペプチド （GL P— 1 (1 - 37) と称することがある) として最初に同定されたが (例えば、 Peptides 1981; 2 S uppl 2: 41-4参照) 、 その後、 7番目のアミノ酸であるヒスチジンから始まる 3
1アミノ酸のぺプチド (GL P - 1 (7 - 37) ) およびそのアミ ド体が生体内 での活性本体であり、 ィンクレチンとして作用していることが明らかになった
(例えば、 J Clin Invest 1987 Feb; 79 (2)： 616-9; N Engl J Med 1992 May 1 4; 326 (20)： 1316-22) 。 GLP— 1 (7 - 37) もしくはその受容体ァゴニス トは、 塍臓 )3細胞からのィンスリン分泌促進を作用点とした糖尿病治療薬として 期待されている。
GL P - 1 (1 - 37) は、 ィンクレチンとしての活性が弱いことから、 糖尿 病治療薬としてもさることながら、 ィンクレチンとしての研究対象としては、 G L P - 1 (7 - 37) が主流となった。 すなわち、 本来の GL P― 1は GLP— 1 (7 - 37) であり、 GLP— 1 ( 1— 37) は前駆体べプチドからのプロセ ッシング過程で生じた単なる中間体と考えられているのが現状である （例えば、 J Clin Invest 1987 Feb; 79 (2)： 616- 9参照） 。
最近、 GL P— 1 (7— 37) が、 ）3細胞の前駆細胞に作用してインスリン陽 性細胞へ分化誘導する作用が見出され、 細胞の復元すなわち塍臓機能の回復を 目的とした再生医学的手法が注目されている （例えば、 Endocrinology 2002 Aug ； 143 (8)： 3152- 61参照) 。 大きく 2つのアプローチ、 すなわち、 体外で 細胞を増殖分化させて細胞移植 する方法と、 体内の ]3細胞前駆細胞から ιδ細胞そのもの、 もしくはインスリン産 生細胞を分化誘導する方法、 が検討されているが、 治療方法としての確立をはか るためには、 ；3細胞を分化誘導する方法を幅広く利用することが必須と言える。 発明の開示
本発明は、 新規な糖尿病治療剤を提供すること、 好ましくは、 従来の糖尿病治 療剤と異なる作用を有し、 滕島機能が低下した場合においても有効な治療を可能 とする糖尿病治療剤を提供することを課題とする。
本発明者は、 上記課題を解決するために検討を行った結果、 GLP— 1 (1一 37) が、 腸管細胞をィンスリン産生細胞に変換誘導させることを見出し、 さら にこの分化したインスリン産生細胞が血糖調節に有効であることを実証した。 具体的には、 本発明者は、 塍臓以外にも 細胞の前駆細胞が存在する可能性を 想定し、 GL Ρ— 1の作用によってィンスリン陽性に転換する細胞を様々な臓器 で探索した。 より具体的には、 マウス胎児より臓器ごとに細胞を採取してインビ トロ初代培養系に用い、 GLP— 1 (7 - 37) 又は GLP— 1 (1— 37) 共 存下で 8日間培養した後 抗インスリン抗体で染色し、 陽性細胞の有無を調べた。 その結果、 腸管由来細胞を GLP— 1 (1 - 37) の共存下で培養したときに 限って、 インスリン陽性細胞の出現が確認され、 ]3細胞前駆細胞が塍臓以外にも 存在することがはじめて示された。 さらに、 腸管細胞のインスリン産生細胞への 変換誘導に対し、 GL Ρ- 1 (1 - 37) が作用するのに対し、 本来の GL Ρ— 1である GL P— 1 (7 - 37) が無作用であることは、 予想出来ない発見であ つた。 このことは、 塍外 細胞前駆細胞は塍 /3細胞前駆細胞と異なり、 GL P— 1 (7 - 37) 以外のシグナル分子によって惹起されることを示している。 すな わち GL P— 1 (1 - 37) の Ν末端 1— 6アミノ酸配列 （His Asp Glu P e Gl u Arg :配列番号 2) の重要性を示唆している。
本発明は、 上記知見に基づいてなされたものであり、 その要旨は以下のとおり である。
(1) プレブログルカゴンペプチドの部分ペプチドであって、 少なくともプレブ ログルカゴンペプチドの 92位〜 97位のアミノ酸配列を含む部分ペプチドを有 効成分として含有することを特徴とする、 腸管細胞のインスリン産生細胞への変 換誘導剤。
(2) 前記部分ペプチドが、 下記 （a) 〜 （j ) のいずれかのアミノ酸配列を有 し、 かつ、 腸管細胞のインスリン産生細胞への変換誘導活性を有するぺプ： ある、 （1) に記載の腸管細胞のインスリン産生細胞への変換誘導剤。
(a) 配列番号 1のアミノ酸番号 92〜97からなるアミノ酸配列。
(b) 配列番号 1のアミノ酸番号 92 1 1 7からなるアミノ酸配列。
(c) 配列番号 1のアミノ酸番号 92 124からなるアミノ酸配列。
(d) 配列番号 1のアミノ酸番号 92 128からなるアミノ酸配列。
(e) 配列番号 1のアミノ酸番号 92 1 79からなるアミノ酸配列。
( f ) 配列番号 1のアミノ酸番号 84 97からなるアミノ酸配列。
(g) 配列番号 1のアミノ酸番号 84 1 17からなるアミノ酸配列。
(h) 配列番号 1のアミノ酸番号 84 1 24からなるアミノ酸配列。
( i ) 配列番号 1のアミノ酸番号 84 179からなるアミノ酸配列。
( j ) 前記 （b；) 〜 （ i ) のアミノ酸配列において、 数個のアミノ酸残基の置 換.. 欠失、 挿入又は付加を含むアミノ酸配列。
( 3 ) プレプロダルカゴンペプチドの部分ペプチドであって、 下記 (k) 又は ( 1 ) のいずれかのァミノ酸配列を有し、 かつ、 腸管細胞のィンスリン産生細胞 への変換誘導活性を有するペプチドを有効成分として含有することを特徴とする、 腸管細胞のィンスリン産生細胞への変換誘導剤。
(k) 配列番号 1のアミノ酸番号 92〜1 28からなるアミノ酸配列。
( 1 ) 配列番号 1のアミノ酸番号 92〜128からなるアミノ酸配列において、
1又は数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 揷入又は付加を含むアミノ酸配列。
(4) (1) 〜 （3) のいずれかに記載の腸管細胞のインスリン産生細胞への変 換誘導剤を含む糖尿病治療剤。
(5) 腸管細胞に （1) 〜 （3) のいずれかに記載の腸管細胞のインスリン産生 細胞への変換誘導剤を作用させてィンスリン産生細胞に変換した細胞を含む移植 片。 ( 6 ) 下記工程を含む腸管細胞のィンスリン産生細胞への変換の誘導剤のスクリ 一二ング法；
(a) 腸管細胞を被検物質又は （1) 〜 （3) のいずれかに記載の変換誘導剤 の存在下で培養する工程、
(b) 培養後の細胞について、 インスリン産生細胞のマーカ一の発現を測定す る工程、 および
(c) 被検物質存在下での前記マーカーの発現と、 前記変換誘導剤存在下での 前記マーカーの発現とを比較する工程。
( 7 ) 下記工程を含む腸管細胞のィンスリン産生細胞への変換の阻害剤のスクリ 一二ング法。
(a' ) 腸管細胞を、 （1) 〜 （3) のいずれかに記載の腸管細胞のインスリ ン産生細胞への変換誘導剤、 及び被検物質の存在下で培養する工程、 及び
(b， ) 培養後の細胞について、 ィンスリン産生細胞のマーカーの発現を測定 する工程。
(8) 下記工程を含む、 腸管細胞のインスリン産生細胞への変換誘導活性を有す るプレブログルカゴンぺプチドの部分べプチドに対する受容体を探索する方法； (a") 動物由来の遺伝子を動物細胞に遺伝子導入する工程、
(b") (a") で得られた遺伝子導入細胞に、 (1) 〜 (3) のいずれかに 記載の腸管細胞のィンスリン産生細胞への変換誘導剤を作用させ、 同誘導剤中の ペプチドと遣伝子導入細胞との結合、 又は、 遺伝子導入細胞の変化を観察するェ 程。 図面の簡単な説明
図 1は、 培養腸細胞に対する GLP- 1 (1-37) の効果を示す RT- PCRの結果を示す 図 （写真） 。
insulin I： プレブロインスリン I
insulin II： プレブロインスリン II
glucagon： プレブログルカゴン pdx - 1：
pdx-1：塍十二指腸ホメォボックス 1 (pancreas duodenal homeobox 1) ngn3：ニューロゲニン 3
HPRT： ヒポキサンチンホスホ エフーゼ 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明の腸管細胞のインスリン産生細胞への変換誘導剤 （以下、 「変換誘導 剤」 ともいう。 ） は、 プレブログルカゴンペプチドの部分ペプチドであって、 腸 管細胞のインスリン産生細胞への変換誘導作用を有するペプチド （以下、 「本発 明のペプチド」 ということがある) を有効成分とする。 本発明のペプチドは、 少 なくともプレブログルカゴンペプチドの 92位〜 9 7位に相当するアミノ酸配列 (His Asp Glu Phe Glu Arg：配列番号 2 ) を含むことを特徴としている。 本発 明のぺプチドの配列の基となるプレブ口グルカゴンペプチドの配列として、 由来 は特に制限されないが、 ヒト、 サル、 マウス、 ラット、 モルモット、 ゥサギ、 ィ ヌ、 ネコ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥマ、 ゥシ等の哺乳動物、 ニヮ卜リ等の鳥類等が挙げ られる。 これらの中では、 哺乳動物由来の配列が好ましい。 ヒ卜のプレブログル カゴンペプチドのアミノ酸配列を、 配列表の配列番号 1に示す （GenBank/EMBL/D DBJ accession J04040) 。
本発明のペプチドは、 前記配列番号 2に示すアミノ酸配列を含み、 かつ、 腸管 細胞のィンスリン産生細胞への変換誘導活性を有するものであれば、 特に制限さ れず、 プレブログルカゴンぺプチドの部分配列を有するぺプチド、 又はその一部 の配列を改変した誘導体であってよい。 前述したように、 プレブログルカゴンは 複雑なプロセッシングを受けて種々のべプチドが生成され、 配列番号 2に示すァ ミノ酸配列を含むぺプチドとして薬理作用が報告されているものとして、 GL P — 1 ( 1 - 3 7) と MPGF (プレブログルカゴンペプチドの 84— 1 7 9のァ ミノ酸からなるペプチド） がある （Pancreas 1990 Jul; 5 (4)： 484-8) が、 そ の他に多くのプロセッシング中間体べプチドが存在するものと推測される。 本発 明は、 配列番号 2に示すアミノ酸配列の重要性を見出したものであり、 GLP— 1 (1 - 3 7) 以外のプレブログルカゴン由来のペプチドであっても、 前記配列 を含むペプチドは、 同様の効果を有すると期待される。 本発明のペプチドとして具体的には、 下記 （a) 〜 （ i ) のいずれかのアミノ 酸配列を有し、 かつ、 腸管細胞のインスリン産生細胞への変換誘導活性を有する ペプチドが挙げられる。
(a) 配列番号 1のアミノ酸番号 9 2〜9 7からなるアミノ酸配列。
(b) 配列番号 1のアミノ酸番号 9 2〜1 1 7からなるアミノ酸配列。
(c) 配列番号 1のアミノ酸番号 9 2〜 1 2 4からなるアミノ酸配列。
(d) 配列番号 1のアミノ酸番号 9 2〜 1 2 8からなるアミノ酸配列。
(e) 配列番号 1のアミノ酸番号 8 4〜9 7からなるアミノ酸配列。
( f ) 配列番号 1のアミノ酸番号 8 4〜 1 1 7からなるアミノ酸配列。
(g) 配列番号 1のアミノ酸番号 8 4〜 1 2 4からなるアミノ酸配列。
(h) 配列番号 1のアミノ酸番号 8 4〜 1 7 9からなるアミノ酸配列。 上記べプチドの中では、 プレプ口グルカゴンぺプチドの 9 2位〜 1 2 8位から なるアミノ酸配列を有するぺプチドが好ましい。 具体的には、 前記 （d) のアミ ノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。 このペプチドが、 「GL P— 1 ( 1一 3 7) 」 に相当する。
本発明において、 「腸管細胞のインスリン産生細胞への変換」 とは、 腸管を構 成する細胞のうち、 潜在的にインスリン産生細胞に変換する能力を有する細胞又 はその一部がィンスリン産生細胞へ変換することをいい、 すべての腸管細胞がィ ンスリン産生細胞に変換することを要しない。
本発明のぺプチドは、 腸管細胞のィンスリン産生細胞への変換誘導活性を有す る限り、 前記 （a) 〜 （h) のアミノ酸配列において、 1〜8個、 好ましくは 1 〜5個、 より好ましくは 1〜3個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入又は付加を 含むアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。 また、 前記 1又は 2以上の アミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入又は付加は、 ペプチドの全長の 2 0 %以下、 好 ましくは 1 5 %以下、 より好ましくは 1 0 %以下であることが望ましい。
この際、 1又は 2以上のアミノ酸残基の置換、 欠失、 揷入又は付加の例として は、 GL P— 1 (7 - 3 7) の誘導体として知られているペプチドに配列番号 2 に示すアミノ酸配列が付加されてなるものが挙げられる。 例えば、 米国特許第 6， 583, 111号に記載の GL P— 1 (7— 3 7) 誘導体に配列番号 2に示すアミノ酸 配列が付加されてなるものが挙げられる。 GL P— 1 (7 - 3 7) 誘導体として は、 下記表に示す置換例が挙げられる。
GLP- 1(卜 37)配列中の部位 配列番号 1中の部位 置換後のアミノ酸
8 99 中性アミノ酸 9 100 中性又は酸性アミノ酸
10 101 中性アミノ酸 15 106 酸性アミノ酸 16 107 Thr, Tyr
18 109 Lys
21 112 Asp
22 113 Ser
23 114 Arg
24 115 Arg
26 117 Gin, Arg, Asp、 D体 31 122 Cys
34 125 D体、 Arg、 中性アミノ酸 36 127 D体、 Arg、 中性アミノ酸
また、 1又は 2以上のアミノ酸欠失の例としては、 C末端アミノ酸が 1〜 3個 欠失したものが挙げられる。 具体的には、 GL P— 1 ( 1 - 34) 、 GL P— 1 ( 1 - 3 5) 、 GL P- 1 (1 - 3 6) が挙げられる。 また、 これらの誘導体に は、 N末端アミノ酸がァシル化、 又はアルキル化されたものや、 N末端アミノ酸 及び/又は N末端から 2番目のァミノ酸が対応する D—アミノ酸に置換されたも の、 末端ヒスチジン残基がイミダゾール系置換基に変換されたものも含まれる。 ァシル化の例としては、 34位の Ly s残基側鎖に直鎖状又は分岐状の炭素原子 6〜 1 0個有するァシル基を付与したものが挙げられ、 イミダゾ一ル系置換基の 例としては、 下記の置換基が挙げられ、 好ましくは 4一イミダゾプロピオニル基 である （米国特許第 5， 512， 549号参照） 。 4一イミダゾプロピオニル
Figure imgf000011_0001
4一イミダゾァセチル
Figure imgf000011_0002
4一イミダゾ一 ， ジメチルーァセチル
Figure imgf000011_0003
また、 これらの誘導体には、 C末端アミノ酸残基のカルボニル基が、 アルコ一 ル基に置換されたものや、 C末端アミノ酸残基がァミノ基に置換されたものも含 まれる。
また、 本発明のぺプチドの末端アミノ酸残基及び/又はその他のアミノ酸残基 の側鎖は、 アミノ基および Zまたはカルボキシル基の両方又はいずれかが適当な 保護基を有している形態であってもよい。 保護基の形成及び除去については公知 の方法を適用することができる。
代表的なァミノ保護基としては、 例えば、 ァシル基、 ホルミル基、 ァセチル基、 イソプロピル基、 ブトキシカルボニル基、 フルォレニルメトキシカルボニル基、 カルボベンジルォキシ基等が挙げられ、 N末端アミノ酸残基や塩基性アミノ酸残 基側鎖中のアミノ基が好適に保護される。 また、 代表的なカルボキシル保護基と しては、 例えばべンジルエステル、 メチルエステル、 t _ブチルエステル、 p— ニトロフエニルエステル等が挙げられ、 C末端アミノ酸残基や酸性アミノ酸残基 側鎖中のアミノ基が好適に保護される。
また、 本発明のペプチドは塩の形態を包含する。 本発明のペプチドが塩の形態 を成し得る場合、 その塩は医薬的に許容しうるものであればよく、 例えば、 式中 001
10
のカルボキシル基等の酸性基に対しては、 アンモニゥム塩、 ナトリウム、 力リウ ム等のアルカリ金属との塩、 カルシウム、 マグネシウム等のアルカリ土類金属と の塩、 アルミニウム塩、 亜鉛塩、 トリェチルァミン、 エタノールァミン、 モルホ リン、 ピロリジン、 ピペリジン、 ピぺラジン、 ジシクロへキシルァミン等の有機 ァミンとの塩、 アルギニン、 リジン等の塩基性アミノ酸との塩が挙げることがで きる。 式中に塩基性基が存在する場合の塩基性基に対しては、 塩酸、 硫酸、 リン 酸、 硝酸、 臭化水素酸などの無機酸との塩、 酢酸、 クェン酸、 安息香酸、 マレイ ン酸、 フマル酸、 酒石酸、 コハク酸、 タンニン酸、 酪酸、 ヒベンズ酸、 パモ酸、 ェナント酸、 デカン酸、 テオクル酸、 サリチル酸、 乳酸、 シユウ酸、 マンデル酸、 リンゴ酸等の有機カルボン酸との塩、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 -トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩が挙げることができる。
上記で具体的に配列を示したペプチド以外のぺプチドについては、 後述する本 発明の 「腸管細胞のィンスリン産生細胞への変換の誘導剤のスクリ一二ング法」 によって、 作用を確認することが きる。
本発明のペプチドは、 例えば、 化学的なペプチド合成法、 例えば固相合成法等 によって製造することができる。 また、 本発明のペプチドは、 同ペプチドをコ一 ドする D N Aを用いた遺伝子組換え技術を利用して、 大腸菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などで発現させるにより、 組換えべプチドとして製造することもできる。 前記 D N Aは、 宿主のコドン使用頻度に応じて配列を設計し、 通常の D N Aの化 学合成法にしたがって、 取得することができる。
例えば、 大腸菌を用いる場合は、 本発明のぺプチドをコ一ドする D N A配列を、 プロモーター配列、 例えばトリプ卜ファン合成酵素オペロン（t rp)プロモ一夕一、 ラク卜一スォペロン（l ac)プロモ一夕一、 ラムダファージプロモーター、 tacプロ モーター、 T7ファージプロモーターなどに連結し、 好ましくはさらにリボゾーム 結合配列、 例えばシャインーダルガルノ配列（SD配列） や、 転写終結因子などを 付加し、 適当なベクターを用いて大腸菌を形質転換する。 得られた形質転換体を、 プロモーターが機能する条件で培養することによって、 本発明のぺプチドが得ら れる。 尚、 組換え体として本発明のペプチドを製造する場合は、 前記の （a ) 〜 ( h ) の配列の N末端にメチォニン残基が付加されていてもよい。 また、 本発明のペプチドは、 直接目的とする配列を有するペプチドそのものを 発現させてもよく、 他の蛋白質との融合蛋白質として発現させてもよい。 また封 入体として菌体内に蓄積させても良く、 可溶型として菌体内に蓄積させてもよく、 あるいは菌体外に分泌させてもよい。 融合蛋白質としては、 マルト一ス結合蛋白 質 （Maltose Binding Protein) 、 ダル夕チオン S—トランスフェラーゼ （Gluta tione S-Tranferase) 、 ヒスチジン—タグ （His- Tag) 等との融合蛋白質が挙げ られる。
また、 本発明のペプチドは、 血中クリアランスを延長するための修飾が施され たものであっても良い。 例えばポリオキシアルキルポリオール基がぺプチド中の 反応性の基に結合したものであっても良い。 好ましくはポリオキシアルキルポリ オール基はポリエチレンダリコール基である。
培養物から本発明のペプチドを精製するには、 通常のペプチドの精製法、 例え ば塩析、 イオン交換クロマトグラフィー、 遠心分離などにより、 行うことができ る。 また、 DNAの化学合成、 DNA断片とベクタ一との連結、 形質転換等の方 法は、 当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。 これらの 方法は、 例えば、 Sambrook, J. , Fritsch, E, F. , and Maniatis, T. , "Molecul ar Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Labor atory Press, (2001)等に記載されている。
本発明のぺプチドを含む、 腸管細胞のィンスリン産生細胞への変換誘導剤を腸 管細胞に作用させることにより、 腸管細胞のィンスリン産生細胞への変換を誘導 することができる。 具体的には、 腸管細胞を、 本発明のぺプチド、 及び必要に応 じて成長因子の存在下で培養する。 腸管細胞としては、 例えば十二指腸、 小腸 (空腸、 回腸を含む） 、 大腸 （盲腸、 結腸、 直腸を含む） 由来の細胞が含まれる。 これらの細胞は、 哺乳動物の腸管より採取した細胞であれば特に限定されないが、 小腸細胞が好ましい。 採取の方法としては、 例えば後記実施例に示す分離方法が 挙げられるが、 これに限定されるものではない。 腸管細胞をインスリン産生細胞 へ変換誘導する際の本発明のぺプチドの濃度としては、 lmn/l〜1000nin/lが好ま しい。
上記のようにして得られるィンスリン産生細胞は、 糖尿病に罹患したヒト又は 動物の治療用の移植片として使用することができる。 したがって、 本発明は、 こ のようにして得られる移植片をヒト又は動物体内に移植する、 糖尿病の治療方法 を提供する。
また、 本発明のペプチドを、 ヒ卜をはじめ、 サル、 マウス、 ラット、 モルモッ ト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥマ、 ゥシ等種々の哺乳動物に投与す ることにより、 腸管細胞のィンスリン産生細胞への変換を誘導することができる。 このようなインスリン産生細胞の誘導は、 糖尿病の予防、 治療に有効である。 し たがって、 本発明は、 本発明のペプチドを用いた糖尿病の予防、 又は治療法、 及 び、 本発明のペプチド又は変換誘導剤を含む糖尿病の予防又は治療剤 （以下、 併 せて 「糖尿病治療剤」 という） を提供する。
以下、 本発明の変換誘導剤及び糖尿病治療剤について説明する。
本発明の変換誘導剤、 及び糖尿病治療剤の剤型としては、 注射剤、 舌下剤、 吸 入剤、 経皮パップ剤、 錠剤、 カプセル剤、 細粒剤、 シロップ剤、 座薬、 軟膏剤、 点眼剤等が挙げられる。 これらのうちでは、 注射剤、 舌下剤、 経皮パップ剤が好 ましい。 また、 剤型に応じて、 製剤上許容される賦形剤、 例えば、 乳糖、 バレイ ショデンプン、 炭酸カルシウム、 又はアルギン酸ナトリウム等を配剤してもよい。 さらに、 通常製剤に用いられるその他の材料、 例えば血清アルブミン等の蛋白質、 緩衝作用、 浸透圧調整のための塩、 担体、 賦型剤等の成分を配合しても良い。 注 射剤の場合には、 溶媒として注射用蒸留水、 生理食塩水、 リンゲル液等が使用さ れ、 これに分散剤を添加してもよい。
変換誘導剤又は糖尿病治療剤に含まれる本発明のペプチドは、 1種でもよく、 2種以上の混合物であってもよい。
本発明の糖尿病治療剤の投与量としては、 当該疾患の処置に必要な量であれば 特に限定されない。 具体的には、 前記量は、 そのような処置を必要とする対象の 種、 年齢、 性別、 体重、 経口もしくは非経口 （例えば、 静脈内、 皮下、 筋肉内、 坐薬、 注腸、 軟膏、 貼布、 舌下、 点眼等） のルート等の条件によって変化するが、 一般には、 ヒトの静脈投与では、 成人 1人 1日当り、 本発明のペプチドの量とし て、 0 . 1 gZ k g〜 1 O m g / k gの範囲であり、 好ましくは、 l g Z k g〜 l m g Z k gの範囲が挙げられる。 本発明の糖尿病治療剤は、 糖尿病および関連する耐糖機能低下を伴う疾患の治 療、 予防に有用であるが、 このような疾患としては、 例えば、 I型糖尿病 （イン スリン依存糖尿病） 、 I I型糖尿病 （インスリン非依存糖尿病） 、 栄養不良関連糖 尿病、 特定の病態や症候群に伴う別のタイプの糖尿病、 などの糖尿病や、 耐糖機 能障害、 妊娠糖尿病などを挙げることができるが、 これらに限定されることはな く、 広く糖尿病に適用される。 本発明の糖尿病治療剤は、 腸管細胞に作用してィ ンスリン産生細胞への変換を誘導し、 同細胞からインスリンを分泌させ得ると考 えられることから、 特に、 塍機能が低下した患者に対しても有効であると期待さ れる。
また、 本発明の変換誘導剤または糖尿病治療剤は、 通常用いられる糖尿病治療 剤と併用して用いることもできる。 通常用いられる糖尿病治療剤とは、 例えば、 インスリン製剤、 インスリン誘導体、 インスリン様作用剤、 インスリン分泌促進 剤、 インスリン抵抗性改善剤、 ビグアナイド剤、 糖新生阻害剤、 糖吸収阻害剤、 腎糖再吸収阻害剤、 /3 3アドレナリン受容体ァゴニスト、 グルカゴン様ペプチド - 1 ( 7 - 3 7 ) 、 グルカゴン様ペプチド一 1 ( 7 - 3 7 ) 類縁体、 グルカゴン 様ペプチド— 1受容体ァゴニスト、 ジぺプチジルぺプチダーゼ IV阻害剤、 アルド ース還元酵素阻害剤, 終末糖化産物生成阻害剤., グリコーゲン合成酵素キナーゼ 一 3阻害薬 グリコーゲンホスホリラーゼ阻害薬、 抗高脂血症薬、 食欲抑制剤、 リパーゼ阻害薬、 血圧降下剤、 末梢循環改善薬、 抗酸化剤、 糖尿病性神経障害治 療薬などの 1種又は 2種以上の組む合わせや混合物が挙げられる。
組み合わせて使用される薬剤の具体的な化合物や処置すべき好適な疾患につい て下記の通り例示するが、 本発明の内容はこれらに限定されるものではなく、 具 体的な化合物においてはそのフリー体、 及び/又はその他の薬理学的に許容され る塩を含む。
インスリン製剤としては、 N P H、 レンテ、 ウルトラレンテ、 経肺吸収可能な インスリンなどが挙げられる。
ィンスリン誘導体とは、 ィンスリンから誘導されるタンパク質又はペプチドで インスリン作用を保持しているものをいい、 例えばリスプ口、 B10Asp、 グラルギ ン (gl argine) などが挙げられる。 インスリン様作用剤とは、 細胞への糖取り込み促進作用などのインスリンの生 理作用を、 ある程度インスリンに依存せずに発揮することによって、 血糖降下作 用を発揮する、 インスリン誘導体以外のものをいい、 例えばインスリン受容体キ ナ一ゼ刺激薬 （例えば L— 78328 1、 TER— 1 741 1、 CLX- 090 1、 1 1 ー 6 1 3など） 、 バナジウムなどが挙げられる。
インスリン分泌促進剤とは、 塍臓 /3細胞に作用し、 血液中へのインスリン分泌 を増加させることによって、 血糖降下作用を発揮するものをいい、 例えばスルホ ニルゥレア剤 （例えば、 トルプタミド、 クロルプロパミド、 トラザミド、 ァセト へキサミ ド、 ダリクラジド、 グリメピリ ド、 グリピジド、 ダリベンクラミド （グ リブリ ド） など） 、 メグリチニド類 (例えば、 ナテグリニド、 レパグリニド、 ミ チグリニドなど） 、 スルホニルゥレア剤 · メグリチニド類以外の ATP感受性カリ ゥムチャネル阻害剤 (例えば BTS- 67-582など) などが挙げられる。
ィンスリン抵抗性改善剤とは、 ィンスリンの標的組織におけるィンスリンの作 用を増強することによって、 血糖降下作用を発揮するものをいい、 例えば、 ペル ォキシソ一ム増殖薬活性化受容体 (PPAR) ァァゴ二スト （例えば、 ピオダリタヅ ン、 ロシグリタゾン、 卜ログリタゾン、 シグリタゾンなどのチアゾリジンジオン 系化合物、 あるいは G 1— 262570、 GW— 1 929、 J TT— 5 0 1、 Y M— 440などの非チアゾリジンジオン系化合物など） 、 PPARrアン夕ゴニスト
(例えばビスフエノール Aジグリシジルェ一テル (bisphenol A diglycidyl eth er) 、 L G— 1 00641など） 、 PPAR αァゴニスト (クロフィブラ一卜、 ベザ フィブラ一卜、 クリノフイブラートなどのフイブラート系化合物、 あるいは非フ ィブラ一ト系化合物など) 、 PPARa/rァゴニス卜 (例えば KRP— 2 97な ど） 、 レチノイド X受容体ァゴニスト （例えば L G— 1 00268など） 、 レチ ノィド X受容体アンタゴニスト (例えば HX53 1など） 、 プロテインチロシン ホスファタ一ゼ— 1 B阻害剤 （例えば PTP— 1 12など） などが挙げられる。 ビグアナィド剤とは、 肝臓における糖新生抑制作用や組織での嫌気的解糖促進 作用あるいは末梢におけるインスリン抵抗性改善作用などによって、 血糖降下作 用を発揮するものをいい、 例えば、 メトホルミン、 フェンホルミン、 ブホルミン などが挙げられる。 糖新生阻害剤とは、 主に糖新生を阻害することによって、 血糖降下作用を発揮 するものをいい、 例えば、 グルカゴン分泌抑制剤 （例えば M&B 3 9 8 9 0 A など） 、 グルカゴン受容体アンタゴニスト （例えば C P— 9 9 7 1 1、 NNC- 92— 1 68 7、 L— 1 68 049、 BAY2 7— 9 9 5 5など） 、 ダルコ一ス 一 6一ホスファターゼ阻害剤などが挙げられる。
糖吸収阻害剤とは、 食物中に含まれる炭水化物の消化管における酵素消化を阻 害し、 体内への糖の吸収を阻害又は遅延することによって、 血糖降下作用を発揮 するものをいい、 例えば、 一ダルコシダーゼ阻害剤 （例えばァカルボース、 ボ ダリボース、 ミグリ トールなど） 、 α—アミラーゼ阻害剤 （例えば ΑΖΜ— 1 2 7など) などが挙げられる。
腎糖再吸収阻害剤とは、 腎尿細管中の糖の再吸収を阻害することによって、 血 糖降下作用を発揮するものをいい、 例えば、 ナトリウム依存性グルコース輸送体 阻害剤 (例えば Τ一 1 0 9 5、 フロリジンなど) などが挙げられる。
β 3アドレナリン受容体ァゴニストとは、 脂肪における β 3ァドレナリン受容 体を刺激し、 脂肪酸酸化を亢進させてエネルギーを消費させることによって、 肥 満症、 高インスリン血症の改善作用を発揮するものをいい、 例えば、 CL一 3 1 6243, ΤΑΚ— 6 7 7などが挙げられる。
グルカゴン様ペプチド一 1 (7— 3 7) 類縁体としては、 例えば、 ェキセンジ ン一 4、 ΝΝ— 2 2 1 1などが挙げられ、 グルカゴン様ペプチド一 1 (7 - 3 7) 受容体ァゴニストとしては、 例えば、 ΑΖΜ- 1 34などが挙げられ、 ジぺ プチジルぺプチダーゼ IV阻害剤としては、 例えば、 NVP - DP P - 7 2 8など が挙げられる。 グルカゴン様ペプチド一 1 (7— 3 7) 類縁体、 グルカゴン様べ プチドー 1 (7 - 3 7) 受容体ァゴニスト、 ジぺプチジルぺプチダ一ゼ IV阻害剤 及びグルカゴン様ペプチド— 1 (7— 3 7) は細胞におけるグルカゴン様べプチ ドー 1 (7— 3 7) の作用を模倣又は増強することによって、 糖尿病改善作用を 発揮するものをいう。
アルドース還元酵素阻害剤とは、 糖尿病性合併症の処置に好ましいもののうち、 糖尿病性合併症を発症する組織において認められる、 高血糖状態の持続に起因す るポリオール代謝経路の亢進によって過剰に蓄積される細胞内ソルビトールを、 アルド一ス還元酵素を阻害することによって低下させるものをいい、 例えば、 ェ パルレスタツト、 トルレスタツト、 フィダレスタツト、 ゼネレス夕ットなどが挙 げられる。
終末糖化産物生成阻害剤とは、 糖尿病性合併症の処置に好ましいもののうち、 糖尿病状態における高血糖状態の持続によって亢進する終末糖化産物の生成を阻 害することによって細胞障害を軽減させるものをいい、 例えば、 N N C— 3 9— 0 0 2 8、 O P B— 9 1 9 5などが挙げられる。
グリコーゲン合成酵素キナーゼー 3阻害薬としては、 例えば、 S B— 2 1 6 7 6 3、 C H I R— 9 8 0 1 4などが挙げられ、 グリコーゲンホスホリラーゼ阻害 薬としては、 例えば C P— 9 1 1 4 9などが挙げられる。
抗高脂血症薬としては、 例えば、 ヒドロキシメチルダルタリルコェンザィム A (HMGCoA)還元酵素阻害剤 （例えばブラパスタチン、 シンパスタチン、 フルパスタ チン、 ァ卜ルバス夕チンなど) 、 フイブラート系薬剤 (例えばクロフイブラート、 ベザフイブラート、 シンフイブラートなど） 、 胆汁酸排泄促進薬などが挙げられ る。
食欲抑制薬としては、 例えば、 シブトラミン、 マジンドールなどが挙げられ、 リパーゼ阻害薬としては、 例えば、 オルリス夕ットなどが挙げられる。
血圧降下剤としては、 例えば、 アンジォテンシン変換酵素阻害薬 （例えばカブ 卜プリル、 ァラセプリルなど) 、 アンジォテンシン 11受容体拮抗薬 (例えばカン デサルタンシレキセチル、 バルサルタンなど） 、 カルシウム拮抗薬 (例えばシル ニジピン、 アムロジピン、 二カルジピンなど) 、 利尿薬 (例えばトリク口ルメチ アジド、 スピロノラクトンなど） 、 交感神経遮断薬 （例えばクロ二ジン、 レセル ピンなど） などが挙げられる。
末梢循環改善薬としては、 例えば、 ィコサベント酸ェチルなどが挙げられる。 抗酸化剤としては、 例えば、 リポ酸、 プロブコールなどが挙げられる。
糖尿病性神経障害治療薬としては、 例えば、 メコバラミン、 塩酸メキシレチン などが挙げられる。
本発明のぺプチドは、 腸管細胞のィンスリン産生細胞への変換の誘導剤のスク リーニングに利用することができる。 本発明によって、 腸管細胞をインスリン産 生細胞に変換することが可能となったので、 腸管細胞を用いて変換誘導剤をスク リーニングすることができる。 その際に、 本発明のペプチドは、 陽性コントロー ルとして使用される。 具体的には、 スクリーニングは、 例えば以下の工程により 行われる。
(a) 腸管細胞を被検物質の存在下で培養する工程、
(b) 培養後の細胞について、 インスリン産生細胞のマーカーの発現を測定する 工程、 および
(c) 被検物質存在下での前記マーカーの発現と、 前記変換誘導剤存在下での前 記マーカーの発現とを比較する工程。
前記スクリーニング法に使用する腸管細胞は、 哺乳動物の腸管より採取した細 胞であれば特に限定されないが、 後記実施例に示す方法で分離された小腸細胞が 好ましい。 該細胞と被検物質又は変換誘導剤との反応は、 通常、 3 5〜40°C、 数時間〜数十日、 好ましくは、 3 6. 5〜3 7. 5°Cで、 1〜2 0日間培養する。 被検物質又は変換誘導剤との反応後、 該細胞のインスリン産生細胞への変換の有 無、 及び状況を調べる。
腸管細胞がィンスリン産生細胞に変換したか否かは、 そのィンスリン産生細胞 マーカーの発現を測定することにより確認することができる。 ここでィンスリン 産生細胞マーカーとは、 インスリン産生細胞において特異的に発現、 産生 （分 泌） している蛋白質又はそれをコードする遣伝子であって、 例えばインスリンの 産生及び分泌を調べることにより確認できる。 また、 塍内分泌細胞分化を制御す る転写因子群 [ニューロゲニン（neurogenin) 3 (ngn3) 、 neuroD/BETA2、 pax-4、 Nkx6. 肝細胞核因子（hepatocyte nuclear factor) 6 (酵- 6) ] も、 前記マー 力一として使用することができる。
本発明のペプチドは、 腸管細胞のインスリン産生細胞への変換の阻害剤のスク リーニングにも利用することができる。 このスクリーニングは、 例えば以下のェ 程により行われる。
(a' ) 腸管細胞を、 本発明のペプチド、 及び被検物質の存在下で培養する工程、 及び
(b' ) 培養後の細胞について、 インスリン産生細胞のマ一カーの発現を測定す る工程。
さらに、 本発明のペプチドは、 腸管細胞のインスリン産生細胞への変換誘導活 性を有するプレブログルカゴンペプチドの部分ペプチドに対する受容体を探索す る方法に利用することができる。 この方法は、 例えば以下の工程により行われる。
( a") 動物由来の遺伝子を動物細胞に遺伝子導入する工程、
(b") (a" ) で得られた遺伝子導入細胞に、 本発明のペプチドを作用させ、 同誘導剤中のペプチドと遺伝子導入細胞との結合、 又は、 遺伝子導入細胞の変化 を観察する工程。 実施例
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明の範囲はこれら実施 例に限定されるものではない。
<実施例 1 >各種組織由来細胞に対する本発明のぺプチドの作用
胎生 Π.5日マウスの各種組織の細胞を、 GLP- 1 (1-37) (10nmol/l) または GLP - 1 (7-37) (10nmol/l) 添加群と、 非添加コントロール群に分けて培養し、 培養 8日後にィンスリンおよびグルカゴンに対する抗体を用いて二重染色を行った。 具体的には、 以下のようにして行った。
塍臓、 肝臓、 胃、 十二指腸、 小腸 （空腸 回腸、 結腸を含む） の組織標本を、 胎生 17.5日の C57BL/6マウスより顕微鏡下で採取した。 これらの組織を、 5mMの Ca C (pH7.4) と 0.1%のコラゲナーゼを含有するハンクス液 (Hanks Balanced Sol ution, Gibco BRL社、 Ca不含） に浸漬し、 10〜20分間 37°Cでインキュベートした 後、 静かにピペッティングして消化した。
得られた細胞を培地で洗浄した後、 6ゥエル組織培養用プレートに、 5X104細 胞 /cm2の細胞密度にして播種し、 培養開始 24時間後に、 GLP- 1 (1-37) 或いは GL P-1 (7-37) を添加した。 更に 8日間培養を続けた後、 リン酸緩衝液 （以下、
「PBS」 という） で 3回洗浄し、 ^パラホルムアルデヒド一リン酸緩衝液に 5分 間、 25%アセトン Zメタノールに 1分間浸潰して固定した。 尚、 GLP- 1 (1-37) 及 び GLP- 1 (7-37) は、 シグマ （SIGMA) より購入した。 引続き、 各ゥエルを 0.05% Tween20/PBSで洗浄し、 0.2% Triton X100に 1時間 浸漬した。 その後、 抗インスリンャギ抗体 （Santa Cruz) と抗グルカゴンマウス 抗体 （Sigma) を各ゥエルに加え、 4°Cで 16時間インキュベートした後、 ゥエル を洗浄し、 Alexa488を結合した抗ャギ IgGロバ抗体 （Molecular Probes) 、 又は C y3を結合した抗マウス IgGロバ抗体 （Jackson ImmunoResearch Laboratories In c.) を各ゥエルに加え、 4 で 4時間インキュベートした。 ゥエルを洗净した後、 レーザースキャン顕微鏡 （Zeiss LSM510) を用いて細胞を観察し、 インスリン及 びグルカゴンの産生を調べた。
その結果、 滕臓、 胃、 肝臓、 及び十二指腸の細胞では、 GLP- 1 (1-37) 添加群、 GLP-1 (7-37) 添加群及び非添加群との間で、 ィンスリン陽性細胞数及びグルカ ゴン陽性細胞の相違は観察されなかった。 一方、 腸細胞では、 GLP- 1 (1-37) 添 加群においてのみインスリン陽性細胞が観察された。 また、 それらインスリン陽 性細胞のすべてはグルカゴン共陽性であった。 ぐ実施例 2 >胎仔マウスへの in vivo GLP-1 (1-37) 投与の影響
妊娠マウスに対し、 胎生 10.5〜Π.5日までの 7日間、 毎日同時刻に GLP- 1 (1-3 7) (lOnmol) を腹腔内注射した。 出生後、 新生仔マウスの小腸と大腸の組織切 片を インスリンおょぴグルカゴンに対する抗体を用いて二重染色を行った。 具 体的には以下のようにして行った。
小腸 (空腸と回腸を含む) 及び大腸の各組織を、 4%パラホルムアルデヒドーリ ン酸緩衝液中に、 4 で一夜浸漬した後、 O.C.T.コンパウンドに包埋し、 切片標 本を作製した。 切片標本を乾燥し、 アセトン固定した後、 -20°Cで一夜乾燥し、 P BS-Tween 20で洗浄した後、 0.2% Triton X100に 1時間浸漬した。 その後、 抗ィ ンスリンャギ抗体 (Santa Cruz) 又は抗グルカゴンマウス抗体 (Sigma) 、 及び A lexa488を結合した抗ャギ IgGロバ抗体、 又は Cy3を結合した抗マウス IgGロバ抗体 を用いて、 インスリンおよびグルカゴンの免疫染色を行った。
その結果、 どちらの組織においても、 腸上皮の全般にわたりインスリン陽性の 腸上皮細胞が多数観察された。 インスリン陽性細胞の数は、 大腸よりも小腸の方 が多かった。 <実施例 3 >ィンスリン陽性細胞の糖尿病モデルマウスへの移植試験 胎生 14.5日のマウスから採取した空腸を、 タイプ Iコラーゲンゲル （Nitta Ge latin Inc.) に包埋して、 50nMの GLP- 1 (1-37) および 50nMの PDGF存在 (Platele t Derived Growth Factor) 下で器官培養を行った。 培養液中のインスリンは、 マウスインスリン検出キット （Shibayagi) を用い、 添付プロトコールに従って 測定した。 その結果、 インスリンの分泌が認められた。
器官培養開始 2日目の空腸を、 糖尿病モデルマウスの腹腔内に移植した。 同マ ウスは、 移植 3日前に 200mg/kgのストレブトゾトシン （以下、 「STZ」 という） を投与して I型糖尿病モデルにしたもので、 血糖値が 300- 350mg/dlとなったもの である。 同様にして、 GLP-1 (1-37) 非存在下で培養した空腸細胞を糖尿病モデ ルマウスに移植した。
その結果、 GLP-1 (1-37) で処理した空腸細胞を移植したマウスでのみ、 血糖 値の低下が観察され、 移植 4週後には 125- 225mg/dl、 8週後には 75-100mg/dlま で低下した。 ぐ実施例 4 >分化細胞の詳細な解析
培養腸細胞に対する GLP- 1 (1-37) の効果を、 定量的 PCR法を用いて、 以下に示 すように詳細に解析した。 く 1 >GLP-1 (1-37) の濃度依存的効果
GLP-1 (1-37) の濃度を 0、 5、 10、 50nmo 1/1の 4種類に分けて、 実施例 3と同 様にして空腸の器官培養を行い、 培養 8日後にインスリン遺伝子 （プレブ口イン スリン I、 プレブ口インスリン II) 、 及び滕内分泌細胞分化を制御する転写因子 群 [ニューロゲニン（neurogenin) 3 (ngn3) 、 neuroD/BETA2 pax— 4、 Nkx6.1、 肝細胞核因子（hepatocyte nuclear factor) 6 (HNF-6) ] 、 並びに、 GLP- 1受容 体 （GLP- 1R) 、 プレブログルカゴン、 塍十二指腸ホメォボックス（pancreas duod enal homeobox) 1 (pdx-1) 、 及びポジティブコントロールとして、 ヒポキサン チンホスホリボシレトランスフェラ——ゼ (hypoxanthine phosphoribosyl transf e rase, HPRT) の発現量を、 RT-PCRにより解析した。
RT - PCRは、 文献 (Hepatology. 32 : 1230-1239) に記載の方法に従い、 以下の プライマーを用いて行った。
GLP-1R (配列番号 3、 4) 、 プレブ口インスリン I (配列番号 5、 6) 、 プレ プロインスリン Π (配列番号 7、 8) 、 プレブログルカゴン （配列番号 9、 1 0 ) 、 pdx-1 (配列番号 1 1、 1 2) 、 ngn3 (配列番号 1 3、 1 4) 、 neuroD (配列番号 1 5、 1 6) 、 pax- 4 (配列番号 1 7、 1 8) Nkx6.1 (配列番号 1 9、 20 HNF-6 (配列番号 2 1、 22 HPRT (配列番号 2 3、 24) 。
その結果、 GLP-1 (1-37) を低濃度 （5nmol/l) 加えるだけで、 インスリン遺伝 子の発現が認められた （図 1) 。 また、 インスリン遺伝子発現と一致して、 脖内 分泌細胞分化を制御する転写因子群の発現上昇が観察された。
一方で、 GLP-1 (1-37) 添加群における GLP- 1受容体 （GLP-1R) 、 プレブログル 力ゴン、 滕十二指腸ホメォボックス（pancreas duodenal omeobox) 1 (pdx-1) の発現は、 GLP-1 (1-37) 非添加群に比べ変化はなかった。
<2>GLP- 1機能阻害実験
GLP-1 (1-37) (10 1/1) とともに、 GLP-1Rアンタゴニストである exendin (9-39) を 0、 10、 100、 lOOOmnol/1の濃度で同時に添加した以外は、 く 1 >と同 様にして空腸細胞を培養し、 インスリン遺伝子及び各種遺伝子の発現量を解析し た （培養期間 8日） 。
その結果、 プレプロインスリン プレプロインスリン II、 および ngn3の発現 がほぼ認められなくなり、 腸細胞におけるィンスリン遣伝子の発現が GLP - 1 (1-3 7) の働きによるものであることが判明した。 一方で、 プレブログルカゴン、 dx - 1の発現は、 exendin (9-39) の影響を受けなかった。
<3>GLP- 1と他の成長因子との比較
GLP-1 (1-37) (10nmol/l) の存在下、 又は非存在下で、 これまで、 滕内分泌 細胞の増殖や分化を制御することが報告されているァクチビン（activin A)、 ベ —夕セルリン（be cellulin)、 肝細胞成長因子（hepatocyte growth factor) (HG F) 、 上皮細胞成長因子（epidermal growth factor) (EGF) を添加して、 < 1〉 と同様にして空腸細胞を培養して、 各種遺伝子の発現量を解析した （培養期間 8 曰） 。 その結果、 GLP- 1 (1-37) を添加した場合に限り、 プレブ口インスリン I、 プレ プロインスリン I I、 および ngn3の高発現が認められた。 一方で、 プレブログルカ ゴン、 pdx- 1の発現に変 は見られなかった。
以上の解析結果から、 GLP- 1 ( 1-37) は腸細胞特異的に作用し、 種々の滕内分 泌細胞分化制御因子 （pdx- 1ではなく、 ngn3を中心としたカスケ一ド） の発現を 変化させることで、 腸細胞に対しィンスリン遺伝子発現を誘導することが示唆さ れた。
<実施例 5 >STZ糖尿病モデルラットに対する血糖低下効果
Wi s tar系雄性ラットに、 生後 2日齢より 12日齢までの 10日間、 80 g/headの GLP - 1 ( 1-37) または PBSを 1日 1回腹腔内に投与した。 投与開始後 7日目 （9日齢） に 7 5mg/kgの STZを皮下投与し糖尿病を誘発した。 PBS投与ラッ卜の一部には STZの代 わりにクェン酸緩衝液を投与し、 正常対照とした。 その後、 餌および水を由摂取 させて 42日目に尾静脈より採血し血糖の測定を行った。 血糖測定は、 採取した全 血サンプルを用いて、 常法に従ってグルコースォキシダーゼ法により行った。 表 2に示すように、 糖尿病対照群の血糖値は正常対照群に比べて約 5倍上昇して いたが、 GLP- 1 ( 1-37) 投与群では糖尿病対照群に比べて有意に低下していた。 表 2 血糖値 (mg/dl) 正常対照群 (n=6) U 5 ± 8
糖尿病対照群 (n=l l) 575 ± 99 * *
糖尿病 · GLP-1 (1-37)投与群 (n=6) 430土 89 * * # #
U： pく 0. 01 vs 正常対照群、 ##： pく 0. 01 vs 糖尿病対照群
Tukey- Kramerの検定
<実施例 6 >GLP-1 (1-37)を投与した STZ糖尿病モデルラットの腸管におけるィン スリン遺伝子発現
GLP- 1 (1-37)の血糖低下効果が認められたので、 GLP- 1 (1- 37)投与群の腸管にお けるインスリン産生の有無を下記の方法で調べた。 6匹の Wi s tar系雄性ラッ卜に、 生後 2日齢より 12日齢までの 10日間、 80 g/headの GLP- 1 (1-37)または PBSを 1日 1 回腹腔内に投与した。 投与開始後 7日目 （9日齢） に 75mg/kgの STZを皮下投与し、 糖尿病を誘発した。 PBS投与ラットの一部には、 STZの代わりにクェン酸緩衝液を 投与し、 正常対照とした。 その後、 餌および水を由摂取させて 42日目に剖検をお こない塍臓、 胃、 腸管、 肺を採取した。 各臓器から I SOGEN (NIPP0NGENE) を用 いて RNA を調製した後、 RT- PCR法によりプレブ口インスリン Iおよびプレブ口 インスリン I Iの mRNA を定量した。 PCRプライマ一配列として、 プレブ口インスリ ン Iは配列番号 1 5及び 2 6、 プレブ口インスリン I Iは配列番号 2 7及び 2 8に それぞれ示すオリゴヌクレオチドを用いた。
その結果、 全ての個体で、 プレプロインスリン Iとプレプロインスリン I Iの遺 伝子発現が腸管において顕著に上昇していることが確認された。 一方、 脖臓、 胃、 肺では発現は認められなかった。 以上、 本発明を好適な実施形態を示して説明したが、 本発明の範囲を逸脱せず に種々の改変を行い、 均等な物及び方法を使用し得ることは当業者に明白である。 前記の引用文献、 及び特願 2003- 61836及び特願 2003- 358111の優先権書類は、 引 用によりそのまま本願に包含される。 産業上の利用の可能性
本発明により、 腸管細胞のインスリン産生細胞への変換誘導剤、 及び新規な糖 尿病治療剤並びに糖尿病治療方法が提供される。

Claims

請求の範囲
1. プレブログルカゴンペプチドの部分ペプチドであって、 少なくともプレ プログルカゴンぺプチドの 92位〜 97位のアミノ酸配列を含む部分ペプチドを 有効成分として含有することを特徴とする、 腸管細胞のィンスリン産生細胞への 変換誘導剤。
2. 前記部分ペプチドが、 下記 （a) 〜 （j ) のいずれかのアミノ酸配列を 有し、 かつ、 腸管細胞のインスリン産生細胞への変換誘導活性を有するペプチド である、 請求項 1に記載の腸管細胞のィンスリン産生細胞への変換誘導剤。
(a) 配列番号 1のアミノ酸番号 92〜97からなるアミノ酸配列。
(b) 配列番号 1のアミノ酸番号 92〜1 1 7からなるアミノ酸配列。
(c) 配列番号 1のアミノ酸番号 92〜1 24からなるアミノ酸配列。
(d) 配列番号 1のアミノ酸番号 92〜1 28からなるアミノ酸配列。
(e) 配列番号 1のアミノ酸番号 92 1 79からなるアミノ酸配列。
( f ) 配列番号 1のァミノ酸番号 84 97からなるアミノ酸配列。
(g) 配列番号 1のアミノ酸番号 84 1 1 7からなるアミノ酸配列。
(h) 配列番号 1のアミノ酸番号 84 1 24からなるアミノ酸配列。
( i ) 配列番号 1のァミノ酸番号 84 1 79からなるアミノ酸配列。
(j ) 前記 （b) 〜 （ i) のアミノ酸配列において、 1又は数個のアミノ酸残基 の置換、 欠失、 挿入又は付加を含むアミノ酸配列。
3. プレブログルカゴンペプチドの部分ペプチドであって、 下記 (k) 又は ( 1 ) のいずれかのアミノ酸配列を有し、 かつ、 腸管細胞のインスリン産生細胞 への変換誘導活性を有するペプチドを有効成分として含有することを特徴とする、 腸管細胞のィンスリン産生細胞への変換誘導剤。
(k) 配列番号 1のアミノ酸番号 92〜128からなるアミノ酸配列。
( 1 ) 配列番号 1のアミノ酸番号 92〜128からなるアミノ酸配列において、
1又は数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入又は付加を含むアミノ酸配列。
4. 請求項 1〜 3のいずれか一項に記載の腸管細胞のィンスリン産生細胞へ の変換誘導剤を含む糖尿病治療剤。
5. 腸管細胞に請求項 1〜 3のいずれか一項に記載の腸管細胞のィンスリン 産生細胞への変換誘導剤を作用させてインスリン産生細胞に変換した細胞を含む 移植片。
6. 下記工程を含む腸管細胞のィンスリン産生細胞への変換の誘導剤のスク リーニング法；
(a) 腸管細胞を被検物質又は請求項 1〜 3のいずれか一項に記載の変換誘導剤 の存在下で培養する工程、
(b) 培養後の細胞について、 インスリン産生細胞のマーカーの発現を測定する 工程、 および
(c) 被検物質存在下での前記マーカーの発現と、 前記変換誘導剤存在下での前 記マーカ一の発現とを比較する工程。
7. 下記工程を含む腸管細胞のィンスリン産生細胞への変換の阻害剤のスク リーニング法。
(a' ) 腸管細胞を、 請求項 1〜3のいずれか一項に記載の腸管細胞のインスリ ン産生細胞への変換誘導剤、 及び被検物質の存在下で培養する工程、 及び (b' ) 培養後の細胞について、 インスリン産生細胞のマーカ一の発現を測定す る工程。
8. 下記工程を含む、 腸管細胞のィンスリン産生細胞への変換誘導活性を有 するプレブログルカゴンぺプチドの部分べプチドに対する受容体を探索する方法
(a") 動物由来の遺伝子を動物細胞に遺伝子導入する工程、
(b") (a") で得られた遺伝子導入細胞に、 請求項 1〜3のいずれか一項に 記載の腸管細胞のィンスリン産生細胞への変換誘導剤を作用させ、 同誘導剤中の ペプチドと遺伝子導入細胞との結合、 又は、 遺伝子導入細胞の変化を観察するェ 程。
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