JP2022532332A - 代謝性疾患を治療するための融合タンパク質 - Google Patents

代謝性疾患を治療するための融合タンパク質 Download PDF

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Abstract

本発明は、バイオテクノロジーの分野に属し、代謝性疾患を治療するための融合タンパク質とその調製方法及び用途を提供する。前記融合タンパク質は、グルカゴン類似物フラグメント及び長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントを含む。前記グルカゴン類似物フラグメントは、ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８１のアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメント、或いは、ｂ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８１と９０％以上の配列同一性を有しており、且つ、ａ）で限定したポリペプチドフラグメントの機能を持つポリペプチドフラグメント、を含む。本発明で提供する融合タンパク質は、良好な安定性を有しており、且つ、マウスに対し良好な血糖低下及び体重減少効果を有する。【選択図】図１

Description

本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、特に、代謝性疾患を治療するための融合タンパク質とその調製方法及び用途に関する。
糖尿病は、病理的特徴により、１型糖尿病と２型糖尿病に分けられる。１型糖尿病とは、主としてインスリンの分泌不足として現れるため、毎日インスリンを注射する必要がある。一方、２型糖尿病は、人体がインスリンを有効利用できないために生じる。糖尿病では、２型糖尿病の患者が圧倒的多数を占めている。また、推計によると、約８０～９０％の２型糖尿病の患者は明らかな肥満である（非特許文献１）。
２型糖尿病の治療に用いられるスルホニル尿素系やチアゾリジンジオン系等の一般的な化学薬品は血糖低下効果が明らかであるが、体重増加を招来する点が主な欠点となっている（非特許文献２）。また、例えば、デュラグルチド（Ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ、商品名：トルリシティ（登録商標））、アルビグルチド（Ａｌｂｉｇｌｕｔｉｄｅ、商品名：Ｔａｎｚｅｕｍ（登録商標））、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ、商品名：サクセンダ（登録商標）及びビクトーザ（登録商標）（それぞれ肥満治療用及び糖尿病治療用））、エキセナチド（Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ、商品名：バイエッタ（登録商標））、リキシセナチド（Ｌｉｘｉｓｅｎａｔｉｄｅ、商品名：リキスミア（登録商標））及びセマグルチド（Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅ）等の２型糖尿病に適用されるタンパク質系薬物は、主にＧＬＰ－１Ｒ（ＧＬＰ－１受容体）アゴニストである。ＧＬＰ－１Ｒアゴニストは明らかな血糖低下効果を有している。且つ、インスリンとの違いとして、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストの血糖値低下作用は厳密な血糖依存性であるため、低血糖となりにくく、体重減少効果もある。しかし、これらの薬物は治療中に副作用を有し、主には消化管への影響（例えば、吐き気）が生じるほか、体重減少の大部分が平均体重の１０％以下にとどまる。また、減量手術（Ｂａｒｉａｔｒｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ）は、肥満症の明らかな改善や糖尿病の治療を可能とするが、幅広く利用されているとは言えない。なぜなら、大部分の患者は手術のリスクや長期的な後遺症を考慮して、このような手術を受けたがらないからである（非特許文献３）。
現在、新世代の糖尿病薬の研究は、ＧＬＰ－１Ｒ／ＧＣＧＲやＧＬＰ－１Ｒ／ＧＩＰＲのようなデュアルアゴニスト、ひいては、ＧＬＰ－１Ｒ／ＧＣＧＲ／ＧＩＰＲのようなトリプルアゴニストといったデュアル又はマルチのインクレチン（Ｉｎｃｒｅｔｉｎ）受容体アゴニストに集中している（非特許文献４）。このうち、グルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ，ＧＣＧ）とＧＬＰ－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－１）の受容体は構造上関連しているが、これら２つのホルモンはグルコースの制御において完全に逆の作用を示す。臨床では、ＧＬＰ－１及びその類似物を主に糖尿病患者の血糖コントロールに用い、グルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ，ＧＣＧ）を急性低血糖症に用いている。また、近年は、多くの研究により、グルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ）には血糖値上昇のリスクはあるものの、効果的に体重を減少させられることが証明されている。且つ、より重要な点として、ＧＬＰ－１とグルカゴンはポジティブな生理学的付加作用又は相乗作用を有していると考えられる。例えば、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）とＧＬＰ－１受容体（ＧＬＰ－１Ｒ）のデュアルアゴニストは、ＧＬＰ－１Ｒ単一アゴニストに比べて体重を効果的に減少させられる。ＧＣＧＲの活性化によって血糖レベルは上昇する恐れがあるが、このリスクはＧＬＰ－１Ｒの活性化及び／又はＧＩＰＲの活性化によって適切に相殺可能である。Ｍａｔｔｈｉａｓ Ｈ．らの概説には、現時点で臨床段階又は前臨床段階にある各種ハイブリッドペプチド形式について詳細に紹介されている（非特許文献５）。また、Ａｌｅ
ｓｓａｎｄｒｏ Ｐｏｃａｉらは、オキシントモジュリン（Ｏｘｙｎｔｏｍｏｄｕｌｉｎ，ＯＸＭ）ベースのＧＬＰ－１Ｒ／ＧＣＧＲデュアルアゴニストについて報告している（非特許文献６）。或いは、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｄ．ＤｉＭａｒｃｈｉらは、ＧＣＧベースのＧＬＰ－１Ｒ／ＧＣＧＲデュアルアゴニスト（特許文献１）、更には、ＧＬＰ－１Ｒ／ＧＣＧＲ／ＧＩＰＲトリプルアゴニスト（特許文献２）について報告している。これら多重特異性のハイブリッドペプチドは、大部分がＧＬＰ－１又はＧＣＧベースであり、配列の突然変異によって活性を向上させるとともに、プロテアーゼ加水分解に抵抗している。また、これらの類似物は、大部分が２番目のセリン（Ｓｅｒ）を非天然アミノ酸Ａｉｂに突然変異させることでＤＰＰ－ＩＶの酵素分解に抵抗している。しかし、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）とイプセン（Ｉｐｓｅｎ）が共同開発していたＧＬＰ－１Ｒアゴニスト血糖値降下薬タスポグルチド（Ｔａｓｐｏｇｌｕｔｉｄｅ）（非天然アミノ酸Ａｉｂを導入）は、抗体産生率が４９％に達したことから、最終的に全ての第３相臨床試験を停止した（非特許文献７）。一方、少数ではあるが、２番目に天然のセリン（Ｓｅｒ）を維持した脂肪酸架橋のグルカゴン類似物も報告されている（非特許文献８）。当該類似物（ＭＥＤＩ０３８２）は３０個のアミノ酸を含んでおり、天然のグルカゴンと比較して、９つのアミノ酸が突然変異している。また、ＭＥＤＩ０３８２の２番目には天然アミノ酸であるＳｅｒが維持されてはいるが、１日１回の投薬回数を保つしかない。現在のところ、投薬回数を減らすために常用されている技術手段には、ＰＥＧ架橋又は脂肪酸架橋（例えば、セマグルチド（Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅ）等）があるが、この場合には化学合成や架橋の手順が関わってくるため、調製工程がやや複雑となる。
ＦＧＦ２１は、重要な代謝調節剤として、様々な代謝異常を改善可能なことが２型糖尿病の前臨床モデル（Ｔ２ＤＭ）実験で証明されている。ＦＧＦ２１は、糖尿病患者の治療薬として、インスリン感度の上昇、血糖コントロールの改善、体重減少、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）及びトリアシルグリセロールの低下、高密度リポタンパク質コレステロールレベル（ＨＤＬ－Ｃ）の上昇といった面で潜在的な作用を有している。糖尿病のマウス及びサルにおいて、ヒトＦＧＦ２１は、空腹時血清グルコース濃度の低下、空腹時血清トリアシルグリセロール、インスリン及びグルカゴン濃度の低下を可能とした。また、摂食・摂水により肥満を誘発した齧歯類モデルにＦＧＦ２１を投与したところ、投与量に依存的な総体重の減少が見られた。このことから、ＦＧＦ２１は、糖尿病、肥満、血中脂質異常及びメタボリックシンドローム等の疾病の治療において潜在力を有している。
しかし、ＦＧＦ２１は血清半減期が非常に短く、マウス体内で３０分、サルの場合には２時間である。そのため、生体内の生物活性を維持するためには、毎日注射するか、相応のＦＧＦ２１タンパク質を連続的に注入する必要がある。また、人体による研究では、肥満、血中脂質異常、ＴＤＭ２及びその他のインスリン抵抗性関連疾患の患者の体内において、循環ＦＧＦ２１レベルは往々にして上昇する。研究によれば、ＦＧＦ２１濃度の上昇とＣＶＤリスクの増加には関連性があり、更には、骨粗鬆や生殖への影響（新陳代謝の増進によるエネルギー不足）等を招来することが明らかとなっている（非特許文献９、非特許文献１０）。また、ＦＧＦファミリー配列の相同性及びＦＧＦＲ１受容体が広範囲に分布していることから、臨床においてＦＧＦ２１を大量に投与することに伴う潜在的な安全性の問題にも関心が寄せられている（非特許文献１１）。
ＧＣＧＲ／ＧＬＰ－１Ｒデュアルアゴニスト、ＧＬＰ－１Ｒ／ＧＩＰＲデュアルアゴニスト、ＧＬＰ－１Ｒ／ＧＣＧＲ／ＧＩＰＲトリプルアゴニスト及びＦＧＦ２１類似物は、いずれも糖尿病治療及び体重減少にそれぞれ用いられている。このほか、ＧＬＰ－１類似物とＦＧＦ２１をＦｃ融合することでデュアル活性タンパク質を調製したとの報告もある（非特許文献１２）。しかし、上述したように、現在のところ、グルカゴン又はオキシントモジュリンをベースに改変されたデュアルないしはトリプルのポリペプチドは、いずれも
アミノ酸の一部を非天然アミノ酸に置換することで安定性と活性を向上させる必要があり、ひいては、脂肪酸又はＰＥＧで修飾する必要もある。そのため、ＦＧＦ２１類似物との融合発現により単一分子を調製することは技術的に極めて難しい。また、現在のところ、デュアル又はマルチアゴニスト系ポリペプチドとＦＧＦ２１類似物を組み合わせて使用したとの報告もない。
米国特許第９０１８１６４Ｂ２号 米国特許第９１５０６３２Ｂ２号
Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆａｃｔ Ｓｈｅｅｔ，２０１４ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３５５（２３）：２４２７－４３，２００６ Ｏｂｅｓｉｔｙ ａｎｄ Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｎｅｗ Ｓｕｒｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｎｏｎｓｕｒｇｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ出版社，２０１５ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２２（７）：６９４－６９５，２０１６ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ，２４（１）：５１－６２，２０１６ Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５８（１０）：２２５８－２２６６，２００９ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ，３６：４９８－５０４，２０１３ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ Ｍｅｔａｂ，１８（１２）：１１７６－１１９０，２０１６ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０９（８）：３１４３-８，２０１２ Ｍｏｌ Ｍｅｔａｂ，５（８）：６９０－８，２０１６ Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ，２８１（３）：２３３－２４６，２０１７ Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２０１６
上述した従来技術の欠点に鑑みて、本発明の目的は、従来技術の課題を解決するために、代謝性疾患を治療するための融合タンパク質とその調製方法及び用途を提供することである。
上記の目的及び関連するその他の目的を実現するために、本発明は、第１の局面において、代謝性疾患を治療するための融合タンパク質を提供する。当該融合タンパク質は、グルカゴン類似物フラグメント及び長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントを含む。前記グルカゴン類似物フラグメントは、ａ）又はｂ）のポリペプチドフラグメントを含む。
ａ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８１のアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメント：
Ｘ１ＳＸ３ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＡＱＤＦＶＱＷＬＸ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｘｚ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８１）
Ｘ１は、Ｈ又はＹから選択される。Ｘ３は、Ｑ又はＥから選択される。Ｘ１６は、Ｙ、Ｎ
、Ｗ及びＨ以外のいずれかのアミノ酸から選択される。Ｘ１７は、Ｐ、Ｌ、Ｔ、Ｆ及びＨ以外のいずれかのアミノ酸から選択される。Ｘ１８は、Ｐ、Ｆ、Ｈ及びＷ以外のいずれかのアミノ酸から選択される。Ｘ１７とＸ１８は同時にＲとなることはない。Ｘ２７は、Ｍ又はＬから選択される。Ｘ２８は、Ｄ又はＡから選択される。Ｘ２９は、Ｔ又は欠失とする。Ｘｚは、ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ又はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳから選択される。
ｂ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８１と９０％以上の配列同一性を有しており、且つ、ａ）で限定したポリペプチドフラグメントの機能を持つポリペプチドフラグメント。
本発明のいくつかの実施形態において、前記ａ）のポリペプチドフラグメントは、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４４のいずれかのアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメントから選択される。
本発明のいくつかの実施形態において、前記長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントは、哺乳動物の免疫グロブリンのＦＣ部分由来である。
本発明のいくつかの実施形態において、前記長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントは、ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４～１３のいずれかのアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメント、或いは、ｄ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４～１３のいずれかと９０％以上の配列同一性を有しており、且つ、ｃ）で限定したポリペプチドフラグメントの機能を持つポリペプチドフラグメント、を含む。
本発明のいくつかの実施形態において、前記融合タンパク質は第１連結ペプチドフラグメントを更に含む。前記第１連結ペプチドフラグメントは、グルカゴン類似物フラグメントと長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントの間に位置する。好ましくは、前記第１連結ペプチドフラグメントは、Ｇ、Ｓ及び／又はＡを豊富に含む。
本発明のいくつかの実施形態において、前記第１連結ペプチドフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４～２３のいずれかのアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメントを含む。
本発明のいくつかの実施形態において、前記融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、グルカゴン類似物フラグメント、第１連結ペプチドフラグメント及び長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントを順に含む。
本発明のいくつかの実施形態において、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７１のいずれかで示される。
本発明のいくつかの実施形態において、前記融合タンパク質は、更に、ＦＧＦ２１類似物フラグメントを含む。
本発明のいくつかの実施形態において、前記ＦＧＦ２１類似物フラグメントは、ｅ）又はｆ）のポリペプチドフラグメントを含む。
ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１９のアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメント：
ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＸ １９ＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＸ ３１ＨＬＥＩＸ
３６ＥＤＧＴＶＧＸ ４３ＡＸ ４５ＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＸ ５６ＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＸ ９８ＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＸ １１８ＰＧＮＸ １２２ＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＸ １３４ＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＸ １６７ＭＶＸ １７０ Ｘ １７１ＳＱＸ １７４ＲＳＰＳＸ １７９ Ｘ １８０ Ｘ １８１；
Ｎ末端のＨＰＩＰＤＳＳは、欠失していてもよいし、一部を欠失していてもよい。Ｘ１９は、Ｒ、Ｙ、Ｖ、Ｅ又はＣから選択される。Ｘ３１は、Ａ又はＣから選択される。Ｘ３６は、Ｒ又はＫから選択される。Ｘ４３は、Ｇ又はＣから選択される。Ｘ４５は、Ａ、Ｋ、Ｅ又はＶから選択される。Ｘ５６は、Ｋ、Ｒ、Ｖ又はＩから選択される。Ｘ９８は、Ｌ、Ｒ又はＤから選択される。Ｘ１１８は、Ｌ又はＣから選択される。Ｘ１２２は、Ｋ又はＲから選択される。Ｘ１３４は、Ａ又はＣから選択される。Ｘ１６７は、Ｓ、Ａ又はＲから選択される。Ｘ１７０は、Ｇ又はＥから選択される。Ｘ１７１は、Ｐ又はＧから選択される。Ｘ１７４は、Ｇ、Ａ又はＬから選択される。Ｘ１７９は、Ｙ、Ａ又はＦから選択される。Ｘ１８０は、Ａ又はＥから選択される。Ｘ１８１は、Ｓ、Ｋから選択されるか、欠失している。
ｆ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１９と８０％以上の配列同一性を有しており、且つ、ｅ）で限定したポリペプチドフラグメントの機能を持つポリペプチドフラグメント。
本発明のいくつかの実施形態において、前記ｅ）のポリペプチドフラグメントは、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．８７～９０のいずれかのアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメントから選択される。
本発明のいくつかの実施形態において、前記融合タンパク質は第２連結ペプチドフラグメントを更に含む。前記第２連結ペプチドフラグメントは、長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントとＦＧＦ２１類似物フラグメントの間に位置する。好ましくは、前記第２連結ペプチドフラグメントは、Ｇ、Ｓ及び／又はＡを豊富に含む。
本発明のいくつかの実施形態において、前記第２連結ペプチドフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４～２３のいずれかのアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメントを含む。
本発明のいくつかの実施形態において、前記融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、グルカゴン類似物フラグメント、第１連結ペプチドフラグメント、長時間作用型タンパク質ユニットフラグメント及びＦＧＦ２１類似物フラグメントを順に含む。
或いは、前記融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、グルカゴン類似物フラグメント、第１連結ペプチドフラグメント、長時間作用型タンパク質ユニットフラグメント、第２連結ペプチドフラグメント及びＦＧＦ２１類似物フラグメントを順に含む。
本発明のいくつかの実施形態において、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９１～１１５のいずれかで示される。
本発明は、他の局面において、前記融合タンパク質をコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
本発明は、他の局面において、構造体を提供する。前記構造体は、前記分離したポリヌクレオチドを含む。
本発明は、他の局面において、発現システムを提供する。前記発現システムは、前記構造体、又はゲノムに外来遺伝子が組み込まれている前記ポリヌクレオチドを含む。
本発明は、他の局面において、請求項１７に記載の発現システムを適切な条件で培養し、当該発現システムに前記融合タンパク質を発現させ、分離及び精製により前記融合タンパク質を提供することを含む前記融合タンパク質の調製方法を提供する。
本発明は、他の局面において、前記融合タンパク質又は前記発現システムの培養物を含む薬物組成物を提供する。
本発明は、他の局面において、前記融合タンパク質、前記薬物組成物薬物の、薬物製造における用途を提供する。
本発明が他の局面において提供する前記薬物は、代謝性疾患の治療のための薬物から選択される。
図１Ａは、血清安定性の経時変化の結果を示す図である。 図１Ｂは、血清安定性の経時変化の結果を示す図である。 図２Ａは、実施例６に係る融合タンパク質のｄｂ／ｄｂマウスにおける血糖低下効果を示す図である。 図２Ｂは、実施例６に係る融合タンパク質のｄｂ／ｄｂマウスにおける血糖低下効果を示す図である。 図３は、実施例７に係る融合タンパク質がＤＩＯマウスの体重に及ぼす影響及び作用を示す図である。
本発明の発明者は、大量の探求及び研究を通じて、ＧＣＧ類似物をＦｃと融合した場合、ＧＬＰ－１Ｒ及びＧＣＧＲの活性に対する影響が全く異なることを想定外に見出したため、新たな融合タンパク質を提供することにした。前記融合タンパク質は、良好な安定性を有し、且つマウスに対し良好な血糖低下及び体重減少効果を有することから、良好な産業化の可能性を有している。以上に基づき、本発明を完成させた。
本発明において、「糖尿病」との用語は、通常、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病、及び高血糖症を誘発するその他の症状を含む。当該用語は代謝異常に用いられる。すい臓が十分なインスリンを産生できなくなるか、身体の細胞がインスリンに適切に応答できなくなることで、細胞組織のグルコース吸収効率が低下する結果、血液中にグルコースが蓄積される。１型糖尿病は、インスリン依存性糖尿病や若年発症型糖尿病とも称され、β細胞の破壊により引き起こされる。１型糖尿病は、通常、絶対的なインスリン不足を招来する。一方、２型糖尿病は、インスリン非依存性糖尿病及び成人発症型糖尿病とも称され、一般的にはインスリン抵抗性と関連する。
本発明において、「肥満」との用語は、通常、脂肪組織が過剰となることを意味する。エネルギー摂取がエネルギー消費を上回った場合に、余ったカロリーが脂肪に蓄えられることで肥満が招来される。本文中において、最適には、肥満は、健康に何らかの度合の被害をもたらす過剰な脂肪組織の形成と見なされる。本文中では、ボディマス指数（ＢＭＩ≒体重（ｋｇ）÷身長（ｍ）の２乗）が２５を超える個体を肥満と見なす。
本発明において、「インクレチン（Ｉｎｃｒｅｔｉｎ）」とは、通常、グルコース刺激に
よるインスリン分泌（グルコース依存性のインスリン分泌（ＧＳＩＳ）とも称する）を強化することで血糖をコントロールする消化管ホルモンである（Ｌａｎｃｅｔ，３６８：１６９６－７０５，２００６）。また、インクレチンは、胃排出を遅らせることで栄養の吸収速度を緩やかにし、食物の吸収を直接的に減少させることも可能である。更に、インクレチンは、腸管やα細胞からのグルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ）の分泌を抑制する。今のところ、インクレチンとしては、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）とグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）の２種類が知られている。
本発明において、「ＧＩＰ」とは、通常、１３３個のアミノ酸の前駆体（ｐｒｅ－ｐｒｏ－ＧＩＰ）をタンパク質加水分解により加工して得られる４２個のアミノ酸からなるペプチドである。これらの分子は、グルコースホメオスタシス、インスリン分泌、胃排出、腸の成長及び食物摂取の調節を含む様々な生物学的機能に関与する。
本発明において、「グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ－１）」とは、腸のＬ－細胞から分泌される３０個又は３１個のアミノ酸からなるポリペプチド型インクレチンホルモンであり、ＧＬＰ－１（７－３６）及びＧＬＰ－１（７－３７）の２種類の活性型を有する。ＧＬＰ－１は、食後に循環中に放出されて、ＧＬＰ－１受容体を活性化させることで生物活性を発揮する。ＧＬＰ－１は、グルコース依存的なインスリン分泌の促進、グルカゴン産生の抑制、胃排出の遅延、食欲の抑制等を含む多くの生物学的作用を有している（Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ，３２（１）：８－１５，２０１１）。天然ＧＬＰ－１は、ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ－ＩＶ）、ネプリライシン（ＮＥＰ）、血漿カリクレイン又はプラスミン等により急速に分解されるため、治療の潜在力が制限される。天然ＧＬＰ－１は、体内でわずか２分間程度と半減期が非常に短いことから、化学修飾及び／又は製剤形式を利用して効果を改善し、糖尿病や肥満症を治療する方法が登場している（Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ，２３（１４）：４０１１－８，２０１３、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ，２５（２）：１４５－５８，２０１６）。
本発明において、「グルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ）」とは、通常、２９個のアミノ酸からなるペプチドであり、プレプログルカゴンの５３～８１番目のアミノ酸に対応している。配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で示される（Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ＆Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１６：Ｓ２８－Ｓ３４，２００６）。グルカゴン受容体が活性化することで、齧歯類動物及びヒトの双方においてエネルギー消費が増加し、食物摂取が減少することが明らかとなっている（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，６：６８９－６９７，２０１０）。また、これらの効果は齧歯類動物において安定的且つ持続的である。グルカゴンは、例えば、グリコーゲン分解及び糖新生を刺激することで、低血糖状況において血糖レベルを上昇させたり、肝臓でのケトン生成を調節したり、胆汁酸の代謝及び迷走神経による満腹感を調節したりなど、多くの生理学的効果を有している。治療において、グルカゴンは急性低血糖症に適用されている。グルカゴン受容体が活性化することで、食物摂取が減少し、動物及びヒトにおける脂肪分解と体重減少が促進される。
本発明において、「受容体アゴニスト」とは、通常、受容体と結合して天然リガンドの通常応答を誘発するポリペプチド、タンパク質又はその他の小分子とすることができる。
本発明において、「ＧＬＰ－１受容体（ＧＬＰ－１Ｒ）アゴニスト」とは、通常、ＧＬＰ－１Ｒと結合して天然ＧＬＰ－１と同様又は類似の特徴的反応を誘発可能なポリペプチド、タンパク質又はその他の小分子とすることができる。ＧＬＰ－１Ｒアゴニストは、ＧＬＰ－１Ｒを完全に又は部分的に活性化することで、細胞内における一連の下流シグナル経路の反応を誘発し、β細胞によるインスリン分泌といった相応の細胞活性を発生させる。
代表的なＧＬＰ－１Ｒアゴニストには、天然ＧＬＰ－１及びその突然変異体、類似物（例えば、エキセナチド、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）等）が含まれる。
本発明において、「ＧＬＰ－１類似物」又は「ＧＬＰ－１突然変異体」とは、いずれもＧＬＰ－１Ｒアゴニストを意味し、互換可能である。
本発明において、「グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）アゴニスト」、即ち「Ｇｌｕｃａｇｏｎ受容体アゴニスト」とは、通常、ＧＣＧＲと結合して天然グルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ）と同様又は類似の特徴的反応を誘発可能なポリペプチド、タンパク質又はその他の小分子とすることができる。ＧＣＧＲアゴニストは、ＧＣＧＲを完全に又は部分的に活性化することで、細胞内における一連の下流シグナル経路の反応を誘発し、例えば、肝細胞のグリコーゲン分解、糖新生、脂肪酸の酸化及びケトン産生作用等の相応の細胞活性を発生させる。
本発明において、「グルカゴン類似物」、「ＧＣＧ類似物」、「グルカゴン突然変異体」及び「ＧＣＧ突然変異体」は、いずれもグルカゴン受容体アゴニストを意味し、互換可能である。
本発明において、「ＦＧＦ２１」とは、通常、線維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＦＧＦ）のことであり、ヘパリン結合増殖因子（ｈｅｐａｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）とも称される。「ＦＧＦ２１」は、垂体及び視床下部から主に分泌されるポリペプチド物質の一種である。ＦＧＦは、線維芽細胞の有糸分裂や中胚葉細胞の成長促進、血管形成刺激等の様々な効果を有している。ＦＧＦ２１は、ＦＧＦファミリーの重要な構成要素である。現在のところ、当該ホルモンは、薬物として減肥薬や糖尿病治療薬の開発に用いられており、これらの薬物はすでに臨床試験段階に突入している。ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ２１関連受容体（例えば、ＦＧＦＲ１ｃ）及びその補助受容体β－ｋｌｏｔｈｏ（ＫＬＢ）を通じて生理学的作用を発揮する。
本発明において、「二量体」は、通常、免疫グロブリンの定常領域（ＦＣ）における天然の非共有結合及び共有結合の働きで形成される。特に別途指摘する場合を除き、ＦＣで形成される二量体はいずれもホモダイマーである（例えば、本発明で提供する二量体の記載）。
本発明において、「ＥＣ５０（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ５０％ ｏｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔ）」とは、通常、いずれかの薬物又は物質が、これに対応する生物学的反応の５０％を刺激するときに必要な濃度のことである。ＥＣ５０の値が低いほど、当該薬物又は物質の刺激又は活性能力が強いことを意味する。例えば、より知覚的に言えば、誘発する細胞内シグナルが強いほど、何らかのホルモン産生を引き起こす能力に優れていると表現できる。
本発明において、「低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）」とは、通常、血漿リポタンパク質の一種であり、血中コレステロールの主要なベクターである。ＬＤＬは、コレステロールを動脈壁に沈着させる傾向がある。白血球は低密度リポタンパク質を消化しようとするが、当該過程ではそれらが毒素に変性してしまう。また、変化した領域に多くの白血球が吸い込まれると、動脈壁に炎症が発生することがある。時間の経過とともに、当該過程が継続するに従い、これらのまだら状の沈着物（プラーク）が動脈壁に蓄積されることで、経路は非常に狭くなり、柔軟性を失う。そして、プラークの蓄積が過剰になると、動脈は完全に塞がれる。ＬＤＬとコレステロールで形成される複合体（ＬＤＬ－Ｃ）が動脈壁上に過剰なプラークを発生させた場合、血液は動脈内を自由に流れることができなくなる。ま
た、プラークは、動脈内で突然崩壊して血管を閉塞させ、最終的に心臓病を誘発する恐れを常に有している。
本発明において、「高密度タンパク質（ＨＤＬ）」とは、通常、動脈内のＬＤＬを除去するために有用である。ＨＤＬは清掃員としての役割を果たし、動脈からＬＤＬを除去して肝臓に戻す。
本発明において、「トリアシルグリセロール（ＴＧ）」とは、通常、別の脂肪の一種であり、飲食による過剰なエネルギーを蓄積するために用いられる。血液中の高レベルのトリアシルグリセロールは、アテローム性動脈硬化に関連する。高トリアシルグリセロールは、体重超過や肥満、身体の運動不足、喫煙、過度のアルコール消費及び高炭水化物（総カロリーの６０％超）摂取により引き起こされる。また、基礎疾患や遺伝性疾患が高トリアシルグリセロールの原因となることもある。通常、高トリアシルグリセロールを有する人は総コレステロールレベルが高く（高ＬＤＬコレステロール及び低ＨＤＬコレステロールの場合を含む）、心臓病又は糖尿病患者の多くも高トリアシルグリセロールレベルを有している。
本発明は、第１の局面において、グルカゴン類似物フラグメント及び長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントを含む融合タンパク質を提供する。前記グルカゴン類似物フラグメントは、ａ）又はｂ）のポリペプチドフラグメントを含む。
ａ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８１のアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメント：
Ｘ１ＳＸ３ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＡＱＤＦＶＱＷＬＸ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｘｚ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８１）
Ｘ１は、Ｈ又はＹから選択される。Ｘ３は、Ｑ又はＥから選択される。Ｘ１６は、Ｙ、Ｎ、Ｗ及びＨ以外のいずれかのアミノ酸から選択される。Ｘ１７は、Ｐ、Ｌ、Ｔ、Ｆ及びＨ以外のいずれかのアミノ酸から選択される。Ｘ１８は、Ｐ、Ｆ、Ｈ及びＷ以外のいずれかのアミノ酸から選択される。Ｘ１７とＸ１８は同時にＲとなることはない。Ｘ２７は、Ｍ又はＬから選択される。Ｘ２８は、Ｄ又はＡから選択される。Ｘ２９は、Ｔ又は欠失とする。Ｘｚは、ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）又はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）から選択される。
ｂ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８１と９０％以上の配列同一性を有しており、且つ、ａ）で限定したポリペプチドフラグメントの機能を持つポリペプチドフラグメント。
具体的に、前記ｂ）のアミノ酸配列とは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８１で示されるアミノ酸配列が、１又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個、１～３個、１個、２個又は３個とすることができる）のアミノ酸の置換、欠失、又は添加を経ることで得られるものであるか、或いは、Ｎ－末端及び／又はＣ－末端に１又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個、１～３個、１個、２個又は３個とすることができる）のアミノ酸を添加することで得られるものである。且つ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８１のアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメントの機能を持つポリペプチドフラグメントは、例えば、ＧＣＧＲ／ＧＬＰ－１Ｒデュアルアゴニスト活性、ＧＬＰ－１Ｒ／ＧＩＰＲデュアルアゴニスト活性、又は、ＧＬＰ－１Ｒ／ＧＣＧＲ／ＧＩＰＲトリプルアゴニスト活性を有していてもよいし、且つ、体内におけるプロテアーゼ加水分解を抑制可能としてもよい。前記ｂ）のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８１と、９０％、９３％、９５％、９７％又は９９％以上の同一性（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有していればよい。本発明の具体的実施例において、前記ａ）のフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４４のいずれかのアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメントとすることができる。本発明の発明者は、本発明でスクリーニングにより取得したＧＣＧ類似物は、２番目に天然のＳｅｒを維持していても、ＦＣとの融合後、安定性が１週間に１回の投薬回数を十分可能とするため、免疫原性の潜在的リスクが低下することを見出した。また、１６番目、１７番目及び１８番目を改変することで、エンドペプチダーゼによるＧＣＧ類似物の分解が弱まるだけでなく、ＧＣＧＲアゴニスト活性を良好に維持することも可能となる。
本発明で提供する融合タンパク質のうち、前記長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントは、哺乳動物の免疫グロブリンにおけるＦＣ部分から入手可能である。前記免疫グロブリンは、ジスルフィド結合を含むポリペプチド鎖分子であり、一般的には２本の軽鎖と２本の重鎖を有している。ここで使用する免疫グロブリンのＦＣ部分は、免疫学分野の用語として一般的な意味を有している。具体的に、当該用語は、抗体から２つの抗原結合領域（Ｆａｂフラグメント）を除去して得られる抗体フラグメントを意味している。ＦＣ部分はヒンジ領域を含んでもよく、且つ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを通過して抗体のＣ末端まで延伸している。ＦＣ部分は、更に、１又は複数のグリコシル化部位を含むことができる。人体は、効果や特徴、及び薬物動態学的特性の異なる５種類のヒト免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥを有している。ＩｇＧは、血清中の含有量が最も高い免疫グロブリンである。また、ＩｇＧは、全ての免疫グロブリンの中で血清半減期が最も長いものでもある（約２３日）。更に、前記長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントは、免疫グロブリンの完全なＦＣ部分、免疫グロブリンのＦＣ部分のフラグメント、又は免疫グロブリンのＦＣ部分の突然変異体から選択可能である。本発明に用いられる免疫グロブリンのＦＣ部分は、哺乳動物のＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４のＦＣ領域又はその突然変異体から入手可能である。好ましくは、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４のＦＣ領域又はその突然変異体から入手すればよい。また、より好ましくは、ヒトのＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦＣ領域又はその突然変異体から入手すればよい。好ましい実施形態において、ＦＣドメインの２９７番目はグリシン又はアラニンで置換される。上記の内容は、ｋａｂａｔのＥＵインデックス番号に基づいている（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））。
本発明で提供する融合タンパク質のうち、前記長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントは、ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４～１３のいずれかのアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメント、或いは、ｄ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４～１３のいずれかと９０％以上の配列同一性を有しており、且つ、ｃ）で限定したポリペプチドフラグメントの機能を持つポリペプチドフラグメント、を含む。具体的に、前記ｄ）のアミノ酸配列とは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４～１３のいずれかで示されるアミノ酸配列が、１又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個、１～３個、１個、２個又は３個とすることができる）のアミノ酸の置換、欠失、又は添加を経ることで得られるものであるか、或いは、Ｎ－末端及び／又はＣ－末端に１又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個、１～３個、１個、２個又は３個とすることができる）のアミノ酸を添加することで得られるものである。且つ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４～１３のいずれかのアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメントの機能を持つポリペプチドフラグメントは、例えば、融合タンパク質全体のＤＰＰ－ＩＶ抵抗性を向上可能とする。上記ｄ）のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４～１３のいずれかと９０％、９３％、９５％、９７％又は９９％以上の類似性を有していればよい。本発明の好ましい実施例において、ＦＣドメインは、ヒトＩｇＧ１から入手することができ、且つ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３で示される。本発明
の他の好ましい実施例において、前記ＦＣドメインはヒトＩｇＧ４由来であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９で示される。また、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９のように、発現産物の均一性を高めるために、前記ＦＣの鎖末端のＫを除去してもよい。本発明で提供する好ましいＧＣＧ類似物をＦＣと融合することで、極めて高いＤＰＰ－ＩＶ抵抗性が得られる。これに対し、現在のところ、ＦＣとの融合によりＧＣＧ類似物のＤＰＰ－ＩＶ酵素抵抗性を向上させられる旨を開示した従来技術は存在しない。且つ、薬効学実験の結果、安定性が１週間に１回の投薬回数を可能とすることが明らかとなった。融合によってこのような効果が達成されることは、現在のところ前例がない。また、２番目のＳｅｒを維持することで、免疫原性のリスクが低下するほか、ＧＣＧＲのアゴニスト活性が最大限保持されるため、体重減少効果を効果的に達成可能となる。
本発明で提供する融合タンパク質には、更に、第１連結ペプチドフラグメントが含まれていてもよい。前記第１連結ペプチドフラグメントは、通常、グルカゴン類似物フラグメントと長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントの間に位置する。また、通常、前記第１連結ペプチドフラグメントは、Ｇ、Ｓ及び／又はＡを豊富に含むフラグメントとすることができる。例えば、前記第１連結ペプチドフラグメントは、グリシンＧ、セリンＳ及びアラニンＡから構成可能であり、当業者は、適切なＧ、Ｓ及びＡの含有量比率を選択すればよい。好ましくは、１２：３：１、又は１２：１：３、又は１２：１：２、又は１２：２：１等とし、且つ、Ｓ又はＡが欠失していていもよい。例えば、ＧとＡの比率を４：１としてもよいし、ＧとＳの比率を４：１としてもよい。本発明の具体的実施例において、前記第１連結ペプチドフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４～２３のいずれかのアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメントを含む。
本発明で提供する融合タンパク質において、前記融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、グルカゴン類似物フラグメント、第１連結ペプチドフラグメント及び長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントを順に含むことができる。本発明の具体的実施例において、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７１のいずれかで示される。
本発明で提供する融合タンパク質において、前記融合タンパク質は、ＦＧＦ２１類似物フラグメントを更に含む。前記ＦＧＦ２１類似物フラグメントは、ｅ）又はｆ）のポリペプチドフラグメントを含むことができる。
ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１９のアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメント：
ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＸ １９ＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＸ ３１ＨＬＥＩＸ ３６ＥＤＧＴＶＧＸ ４３ＡＸ ４５ＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＸ ５６ＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＸ ９８ＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＸ １１８ＰＧＮＸ １２２ＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＸ １３４ＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＸ １６７ＭＶＸ １７０ Ｘ １７１ＳＱＸ １７４ＲＳＰＳＸ １７９ Ｘ １８０ Ｘ １８１；
Ｎ末端のＨＰＩＰＤＳＳは、欠失していてもよいし、一部を欠失していてもよい。Ｘ１９は、Ｒ、Ｙ、Ｖ、Ｅ又はＣから選択される。Ｘ３１は、Ａ又はＣから選択される。Ｘ３６は、Ｒ又はＫから選択される。Ｘ４３は、Ｇ又はＣから選択される。Ｘ４５は、Ａ、Ｋ、Ｅ又はＶから選択される。Ｘ５６は、Ｋ、Ｒ、Ｖ又はＩから選択される。Ｘ９８は、Ｌ、Ｒ又はＤから選択される。Ｘ１１８は、Ｌ又はＣから選択される。Ｘ１２２は、Ｋ又はＲから選択される。Ｘ１３４は、Ａ又はＣから選択される。Ｘ１６７は、Ｓ、Ａ又はＲから選択される。Ｘ１７０は、Ｇ又はＥから選択される。Ｘ１７１は、Ｐ又はＧから選択され
る。Ｘ１７４は、Ｇ、Ａ又はＬから選択される。Ｘ１７９は、Ｙ、Ａ又はＦから選択される。Ｘ１８０は、Ａ又はＥから選択される。Ｘ１８１は、Ｓ、Ｋから選択されるか、欠失している。
ｆ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１９と９０％以上の配列同一性を有しており、且つ、ｅ）で限定したポリペプチドフラグメントの機能を持つポリペプチドフラグメント。
具体的に、前記ｆ）のアミノ酸配列とは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１９で示されるアミノ酸配列が、１又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個、１～３個、１個、２個又は３個とすることができる）のアミノ酸の置換、欠失、又は添加を経ることで得られるものであるか、或いは、Ｎ－末端及び／又はＣ－末端に１又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個、１～３個、１個、２個又は３個とすることができる）のアミノ酸を添加することで得られるものである。且つ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１９のアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメントの機能を持つポリペプチドフラグメントは、例えば、天然ＦＧＦ２１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８７）と同一又は類似の生物学的機能を有するものとすることができる。上記ｆ）のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１９と８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％又は９９％以上の配列同一性を有していればよい。前記ＦＧＦ２１類似物フラグメントのアミノ酸配列は、例えば、米国特許第２０１４０２１３５１２号、米国特許第８１８８０４０号、米国特許第９４９３５３０号、国際公開第２０１６１１４６３３号、米国特許第２０１５０２９１６７７号、米国特許第９４２２３５３号、米国特許第８５４１３６９号、米国特許第７６２２４４５号、米国特許第７５７６１９０号、米国特許第２００７０１４２２７８号、米国特許第９００６４００号又は米国特許第２０１３０２５２８８４号等の特許又は特許出願に記載されているＦＧＦ２１類似物又は突然変異体のアミノ酸配列から選択可能である。本発明の具体的実施例において、前記ｅ）のポリペプチドフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８７～９０のいずれかのアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメントから選択される。
本発明で提供する融合タンパク質には、更に、第２連結ペプチドフラグメントが含まれていてもよい。前記第２連結ペプチドフラグメントは、通常、長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントとＦＧＦ２１類似物フラグメントの間に位置する。また、通常、前記第２連結ペプチドフラグメントは、Ｇ、Ｓ及び／又はＡを豊富に含むフラグメントとすることができる。例えば、前記第２連結ペプチドフラグメントは、グリシンＧ、セリンＳ及びアラニンＡから構成可能であり、当業者は、適切なＧ、Ｓ及びＡの含有量比率を選択すればよい。好ましくは、１２：３：１、又は１２：１：３、又は１２：１：２、又は１２：２：１等とし、且つ、Ｓ又はＡが欠失していていもよい。例えば、ＧとＡの比率を４：１としてもよいし、ＧとＳの比率を４：１としてもよい。本発明の具体的実施例において、前記第２連結ペプチドフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４～２３のいずれかのアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメントを含む。
本発明で提供する融合タンパク質において、前記融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、グルカゴン類似物フラグメント、第１連結ペプチドフラグメント、長時間作用型タンパク質ユニットフラグメント及びＦＧＦ２１類似物フラグメントを順に含んでもよいし、グルカゴン類似物フラグメント、第１連結ペプチドフラグメント、長時間作用型タンパク質ユニットフラグメント、第２連結ペプチドフラグメント及びＦＧＦ２１類似物フラグメントを順に含んでもよい。本発明の具体的実施例において、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９１～１１５のいずれかで示される。本発明における動物体内の薬効に関する実施例では、式ＩＩで示される融合タンパク質群（Ａ３５２Ｌ１Ｆ６Ｌ５Ｍ２）は、同一投与量の式Ｉで示される融合タンパク質（Ａ３５２Ｌ１Ｆ６）＋
ＦＧＦ２１類似物（Ｆ６Ｌ５Ｍ２）併用投与群に比べて著しい体重減少効果を有していた。つまり、当該融合タンパク質Ａ３５２Ｌ１Ｆ６Ｌ５Ｍ２は副作用が低く、安全性が向上する可能性のあることが証明された（実施例７）。
本発明は、第２の局面において、本発明の第１の局面で提供した融合タンパク質をコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
本発明は、第３の局面において、構造体を提供する。前記構造体は、本発明の第２の局面で提供した分離したポリヌクレオチドを含む。通常、前記構造体は、前記分離したポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに挿入することで作製し、取得することが可能である。当業者は、適切な発現ベクターを選択すればよい。例えば、前記発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＢｕｄＣＥ４．１、ｐＥＥ１４．１、ｐＰＩＣ９等が含まれるが、これらに限らない。
本発明は、第４の局面において、発現システムを提供する。前記発現システムには、本発明の第３の局面で提供した構造体、或いは、ゲノムに外来遺伝子が組み込まれている本発明の第２の局面で提供したポリヌクレオチドが含まれる。前記発現システムは宿主細胞とすることができる。前記宿主細胞は、上述した融合タンパク質を発現可能である。前記宿主細胞は、真核細胞及び／又は原核細胞とすることができ、より具体的には、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母等とすることが可能であり、更に具体的には、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ等とすることが可能である。
本発明は、第５の局面において、本発明の第１の局面で提供した融合タンパク質の調製方法を提供する。当業者は、適切な方法を選択して前記融合タンパク質を調製すればよく、例えば、固相合成法を使用可能である。例えば、前記融合タンパク質の調製方法は、本発明の第４の局面で提供した発現システムを適切な条件で培養し、当該発現システムに前記融合タンパク質を発現させ、その後、分離及び精製により前記融合タンパク質を提供することを含み得る。
本発明は、第６の局面において、本発明の第１の局面で提供した融合タンパク質又は本発明の第４の局面で提供した発現システムの培養物を含む薬物組成物を提供する。前記薬物組成物は、更に、薬学的に許容可能なベクターを含んでもよい。前記ベクターは、各種の賦形剤及び希釈剤を含むことができる。これらのベクター自体は必須の活性成分ではなく、且つ、適用後に過剰な毒性を生じることもない。適切なベクターは、当業者が熟知するものとする。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．，１９９１）より、薬学的に許容可能なベクターについての十分な議論を得ることができる。
本発明は、第７の局面において、薬物製造における本発明の第１の局面で提供した融合タンパク質、本発明の第６の局面で提供した薬物組成物の用途を提供する。前記薬物は、代謝性疾患の治療のための薬物から選択可能である。代謝性疾患は、メタボリックシンドロームとすることができる。通常、メタボリックシンドロームの特徴には以下のリスク因子が含まれ得る（例えば、３種類以上が含まれ得る）。
（１）腹部肥満（腹部の内部又は周囲の脂肪組織が過剰）。
（２）アテローム性動脈硬化をもたらす血中脂質異常、血中脂質のバランスの乱れ（高トリアシルグリセロール、低ＨＤＬコレステロール及び高ＬＤＬコレステロールを含む）。これにより、動脈壁へのプラークの蓄積が増大する。
（３）血圧の上昇。
（４）インスリン抵抗性又は耐糖能の異常。
（５）血栓様状態。例えば、血液中の高フィブリン又はＰＡＩ－１（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－１）。
（６）炎症促進状態。例えば、血液中のＣ反応性タンパク質の上昇。
また、その他のリスク因子として、老化、ホルモンバランスの乱れ、及び遺伝要因が含まれる。
本発明の具体的実施例において、本発明で提供する融合タンパク質は、マウスに対して良好な血糖低下及び体重減少効果を有していたため、肥満症又は糖尿病の治療に適用可能なことが実証された。例えば、本発明の融合タンパク質は、通常、食欲低下、食物摂取の減少、患者の体内脂肪レベルの低下、エネルギー消費の上昇等のメカニズムによって治療を行うことができる。
本発明は、第８の局面において、治療有効量の本発明の第１の局面で提供した融合タンパク質、本発明の第４の局面で提供した発現システムの培養物、又は本発明の第６の局面で提供した薬物組成物を個体に適用することを含む治療方法を提供する。
本発明において、「治療」との用語には、所望の薬学的及び／又は生理学的効果をもたらし得る予防的、治愈的又は緩和的処置が含まれる。また、その効果とは、好ましくは、疾病の１又は複数の症状を医療的に減少させられること、或いは、疾病を完全に除去できること、或いは、疾病の発生を停滞、遅延させられること、及び／又は、疾病の進行又は悪化のリスクを低下させられることを意味する。
本発明において、「個体」とは、通常、ヒト、ヒト以外の霊長類、又はその他の哺乳動物（例えば、犬、猫、馬、羊、ブタ、牛等）を含む。「個体」は、前記製剤や試薬キットを利用するか、製剤を併用した治療により利益を得ることができる。
本発明において、「治療有効量」とは、通常、適切な投与期間の経過後に、上記で列挙した疾病の治療効果を達成可能な用量を意味する。
本文中において、配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）とは、比較に関わる配列の同一残基のパーセンテージを意味する。当該分野において周知の演算ソフトを利用することで、２つ又は複数の標的配列について配列同一性を演算可能である。これらのソフトウエアは、例えばＮＣＢＩから取得することができる。
周知のように、ＧＬＰ－１類似物、Ｅｘｅｎｄｉｎ－４等のインクレチン（Ｉｎｃｒｅｔｉｎ）系ホルモンタンパク質は、患者に吐き気や嘔吐等の副作用をもたらす。また、このことは投与量に関連している。そこで、望ましい血糖レベルを維持可能としつつ、できる限り投与量を減少させれば、理論的には、患者にとって望ましくない副作用を緩和させられる。このほか、骨粗鬆や生殖に対するＦＧＦ２１の影響についての報告も見られる（Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ，７５（２）：１２１－５，２０１５、Ｍｏｌ Ｍｅｔａｂ，５（８）：６９０－８，２０１６）。理論的に、薬物の副作用の発生リスクは投与量に正比例する。また、糖尿病薬の分野では、薬物の安全性に対する要求が極めて高い。発明者は、本発明における前記融合タンパク質は、低い投与量でも血糖及び体重について良好なコントロール効果が得られるとともに、消化管に対する影響も小さく、
投与量を大幅に減少させられることから、潜在的な副作用発生リスクが明らかに低下することを見出した。
本発明で提供する融合タンパク質の細胞における生物学的活性実験では、ＧＬＰ－１Ｒ及びＧＣＧＲアゴニスト活性を含むｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞活性の測定に、いずれもルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを使用した。この方法は、ＧＬＰ－１Ｒ及びＧＣＧＲが活性化したあと、下流のｃＡＭＰ経路が活性化可能になるとの原理に基づいている。また、ＦＧＦ２１及びその類似物の活性測定は、ＦＧＦ２１シグナル経路関連遺伝子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランスフェクションし、信号が引き起こす蛍光の変化を検出することで行った。Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ．Ｃｈａｂｅｎｎｅら及びＲｉｃｈａｒｄ Ｄ．ＤｉＭａｒｃｈｉらは、グルカゴンのＣ末端にＥｘｅｎｄｉｎ－４のＣ末端における低分子ペプチドｃｅｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）を追加することで、ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性が０．７％から１．６％まで上昇し、約２倍向上したことを報告している（Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．４（６）：１３２２－１３３１，２０１０、及び米国特許第９０１８１６４Ｂ２号）。しかし、ＧＣＧＲアゴニスト活性とＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性の比率はわずか３５：１程度であった。このほか、Ｅｖｅｒｓ Ａらの報告（Ｊ Ｍｅｄ
Ｃｈｅｍ．；６０（１０）：４２９３－４３０３，２０１７）によると、ＧＣＧ類似物のＣ末端にｃｅｘ配列を追加したあと、ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性は逆に３倍程度低下し、ＧＣＧＲアゴニスト活性は１４倍程度低下したという（文中の表２、ペプチド７及び８）。つまり、天然グルカゴンのＣ末端にＥｘｅｎｄｉｎ－４のＣ末端におけるペプチドｃｅｘ配列ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）を単純に追加しただけでは、ＧＬＰ－１Ｒのアゴニスト活性が明らかに向上することはなく、更に弱まることすらある。一方、グルカゴン、ＧＬＰ－１のような低分子ペプチドとＦｃ、及びアルブミンのようなベクター融合タンパク質を融合発現する場合には、往々にして立体障害により活性が著しく低下する（Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，１４：５８８－５９５，２００８）。且つ、このような活性の変化は予測不可能である。
本発明の発明者は、配列の異なるＧＣＧ類似物をＦｃと融合した場合、ＧＬＰ－１Ｒ及びＧＣＧＲの活性に対する影響が全く異なることを想定外に見出した。また、ＧＣＧ類似物のＣ末端にｃｅｘ又は類似の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２～３）を別途追加してからＦＣ鎖に融合した場合には、ＧＣＧ類似物をＦＣ鎖に直接融合した場合と比較して、ｃｅｘ配列を含む構造によるＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性の維持率は明らかに向上し、最高で２００倍以上も向上した（実施例の表２）。しかし、ＧＣＧＲアゴニスト活性の維持率はほぼ変わらず、逆にやや低下した。
タンパク質の安定性について述べると、天然グルカゴンは、２番目のＤＰＰ－ＩＶ分解部位及び１６～１８番目のＳＲＲ部位を含む多くの高感度の分解部位を有している。Ｆｃが活性タンパク質の化学的安定性及び血清安定性を向上可能にすると考える報告はあるものの、Ｎ末端に露出を要するＧＬＰ－１又はグルカゴン類似物については、Ｆｃの作用を一概に論じることはできないと思われる。天然のＧＬＰ－１又はグルカゴンはＦｃと融合したあとも、３７℃の血清条件で明らかな分解が観察される。そこで、本発明では、天然グルカゴンをベースに、１６～１８番目のプロテアーゼ加水分解に抵抗する突然変異を導入することで安定性を増加させるとともに、２７番目と２８番目を改変することでアミノ酸の脱アミド及び酸化の発生を防止した。そして、これらの突然変異体をＦｃと融合させることで、安定性が一段と向上した。本発明で提供する融合タンパク質の安定性実験では、７２時間経過しても６０％程度のＧＣＧＲアゴニスト活性を検出可能であった。また、このとき、ｃｅｘ配列を含む天然グルカゴンをＦｃと融合して形成された二量体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５２）については、如何なる活性もほとんど検出されなかった。
現在、ほぼ全てのオキシントモジュリン（Ｏｘｙｎｔｏｍｏｄｕｌｉｎ）及びグルカゴン
をベースに設計・開発されているＧＣＧＲ、ＧＬＰ－１Ｒ、ＧＩＰＲマルチアゴニストは、いずれも２番目にＤＰＰ－ＩＶ抵抗性の突然変異を導入している。例えば、Ｌ型をＤ型アミノ酸に突然変異させたり（Ｌ－ＳｅｒをＤ－Ｓｅｒに突然変異）、非天然アミノ酸Ａｉｂを導入したりしている（Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２４：５１－６２，２０１６）。しかし、本発明の実施例において、２番目に天然のＬ－Ｓｅｒを保持する二量体融合タンパク質は、非常に高い血清安定性を示し、２４時間経過しても明らかなＤＰＰ－ＩＶ分解の兆候は見られなかった。一方、ＦＣと融合しなかった対応ポリペプチドは、ＤＰＰ－ＩＶによって急速に加水分解された（表３）。本発明の発明者は、天然グルカゴンとＦＣを融合した活性タンパク質Ａ００１Ｌ１Ｆ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５１）と、Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ．Ｃｈａｂｅｎｎｅらの報告によるＧｌｕｃａｇｏｎ－ｃｅｘとＦＣを融合した活性タンパク質Ａ０１２Ｌ１Ｆ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５２）を対照とし、ＦＣ融合によって安定性が向上するか否かを検証した。しかし、Ａ００１Ｌ１Ｆ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５１）及びＡ０１２Ｌ１Ｆ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５２）は、いずれも明らかなＤＰＰ－ＩＶ抵抗性の兆候を示さなかった（実施例４）。且つ、実施例４では、更に、同じく１６～１８番目を突然変異させたＧＣＧ類似物のＦＣ融合タンパク質であっても、安定性の差が極めて大きいことが示された。タンパク質の空間構造は極めて複雑である。そのため、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８１を満たす突然変異は、ペプチド鎖内部の安定性を向上させるだけでなく、ＧＣＧ類似物とＦＣ鎖間の相互作用する立体配座を変化させる可能性があり、これにより、融合タンパク質のＮ末端の安定性が更に向上した。血清アルブミン（例えば、ＨＳＡ）との結合によりタンパク質の安定性向上に有利となり得るとの報告（例えば、リラグルチド）もあるが、２番目を突然変異させていなければ、半減期を１２時間以上持続させることはできない。即ち、１週間に１回の投薬回数を可能とすることはできない。これに対し、本発明で提供するＧＣＧ類似物薬は、薬物代謝及び薬効試験において、一般的に報告されている１日１回（例えば、アルブミンと結合したリラグルチド）ではなく、１週間に１回の投薬回数で十分なことが示された。また、天然アミノ酸を維持することで免疫原性のリスクが更に低下し、化学架橋を回避できるため、調製過程がより簡易的且つ便利となる。
本発明では、更に、レプチン受容体欠失２型糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）マウスの随時血糖実験を行った。そのうち、１つの実施例において、ｄｂ／ｄｂ随時血糖実験を行ったところ、本発明の融合タンパク質を適用したマウスは、リラグルチドの場合よりも明らかな血糖低下効果を示したほか、良好な体重減少効果も示した。
本発明では、更に、ＤＩＯマウスの体重減少実験を行った。ＧＣＧＲアゴニストは潜在的な体重減少効果を有するという数多くの報告がある。しかし、天然グルカゴンは分解されやすく、且つ分子量が小さいため、製剤としての潜在力は高くない。現在のところ、グルカゴン類似物は、主として急性低血糖症状に用いられている。また、長時間作用型のＧＣＧ類似物を糖尿病患者の体重減少に適用したとの臨床報告も数多くなされている。周知のように、肥満は糖尿病患者のインスリン抵抗性を誘発する原因の１つであり、体重減少量は血糖降下薬を評価するための重要な指標の１つとなっている。また、本発明の融合タンパク質をＤＩＯマウスに適用したところ、体重の明らかな減少が見られた。
本発明における融合タンパク質は、１週間又はそれ以上の間隔で１回使用するのに適しているという潜在的な薬物動態学的特性を有する。投与量は、適用回数と形式、治療を受ける被験者の年齢、性別、体重及び一般的状況、治療の状況及び重大性、治療対象の何らかの合併症、及び当業者にとって自明なその他の要因に基づき決定される。且つ、治療を受ける者の状況とその他の病理状況に基づいて、本発明の融合タンパク質は、１又は複数のその他の治療用の活性化合物又は物質と組み合わせて適用及び応用することが可能である。例えば、選択可能なその他の治療用の活性化合物には、抗糖尿病薬、抗高脂血症薬、抗肥満薬、抗高血圧薬、及び糖尿病に起因するか糖尿病に関連する合併症を治療するための
試薬が含まれるが、これらに限らない。
代謝性疾患（例えば、メタボリックシンドローム）は、冠状動脈疾患や、血管のプラーク蓄積に関係するその他の疾病リスクの増加に関連している。例えば、脳卒中や末梢血管疾患は、アテローム性動脈硬化症心血管疾患（ＡＳＣＶＤ）を引き起こす。メタボリックシンドロームの患者は、初期のインスリン抵抗性状態から完全な２型糖尿病に進行する可能性があり、ＡＳＣＶＤのリスクが更に増大する。何らかの特定の理論に限らず、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム及び血管疾患の関係は、インスリン刺激による血管拡張障害、酸化ストレスの増大に伴うインスリン抵抗性に関わるアベイラビリティの低下、及び脂肪細胞産生ホルモン（例えば、アディポネクチン）異常を含む１又は複数の共通の発症メカニズムに関与し得る（Ｌｔｅｉｆ，Ｍａｔｈｅｒ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２０（増刊Ｂ）：６６Ｂ－７６Ｂ，２００４）。
本発明の融合タンパク質は、更に、肥満症の治療にも適用可能である。いくつかの局面において、本発明の融合タンパク質は、食欲低下、食物摂取の減少、患者の体内脂肪レベルの低下、エネルギー消費の上昇等のメカニズムによって肥満症を治療する。
いくつかの潜在的な実施方案において、本発明の融合タンパク質は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の治療に適用可能である。ＮＡＦＬＤは、広域スペクトルの肝臓疾患であり、その範囲は、単純性脂肪肝（脂肪変性）から非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変（肝臓の不可逆的な末期瘢痕を形成）に至る。ＮＡＦＬＤの全ての病期は、いずれも肝細胞中の脂肪の蓄積を伴う。単純性脂肪肝では、何らかの脂肪やトリアシルグリセロールが肝細胞中に異常に蓄積してはいるが、炎症や瘢痕の形成は見られない。ＮＡＳＨでは、脂肪の蓄積が程度の異なる肝臓の炎症（肝炎）及び瘢痕の形成（線維化）に関与する。また、炎症細胞は肝細胞を破壊し得る（肝細胞の壊死）。「脂肪変性肝炎」や「脂肪変性壊死」との用語における脂肪変性とは脂肪浸潤を意味する。また、肝炎とは肝臓内の炎症を意味し、壊死とは破壊された肝細胞を意味する。ＮＡＳＨでは、最終的に肝臓の瘢痕形成（線維化）が誘発され、続いて不可逆的な末期の瘢痕形成（肝硬変）が生じる。ＮＡＳＨにより誘発される肝硬変は、ＮＡＦＬＤスペクトルの最終段階であり、且つ最も深刻な病期にあたる。
以上述べたように、本発明で提供する融合タンパク質は、半減期が長いとの利点を有しており、通常は、１週間に１回又はそれよりも長い投薬回数を可能にすると考えられる。このほか、前記融合タンパク質は、明らかな血糖低下及び体重減少効果を有しており、且つ、ｉｎ ｖｉｖｏ／ｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性に優れ、免疫原性が低い。また、前記融合タンパク質は、非天然アミノ酸を導入する必要がなく、化学合成や架橋の手順が不要である。よって、組換え手法による調製が可能となり、調製工程が極めて簡略化される。
以下に、特定の具体的実施例を通じて、本発明の実施形態につき説明する。なお、当業者であれば、本明細書で開示する内容から本発明のその他の利点及び効果を容易に理解可能である。更に、本発明は、その他の異なる具体的実施形態によっても実施又は応用可能である。また、本明細書の各詳細は、異なる視点及び応用に基づき、本発明の精神を逸脱しないことを前提に各種の補足又は変更が可能である。
本発明の具体的実施形態について更に記載する前に、本発明の保護の範囲は後述する特定の具体的実施方案に限らないと解釈すべきである。また、本発明の実施例で使用する用語は特定の具体的実施方案を記載するためのものであって、本発明の保護の範囲を制限するものではないと解釈すべきである。
実施例で数値範囲を示している場合には、本発明において別途説明している場合を除き、
各数値範囲の２つの端点及び２つの端点間の任意の数値をいずれも選択可能であると解釈すべきである。また、別途定義している場合を除き、本発明で使用するあらゆる技術及び科学用語は、当業者により一般的に理解される意味と等しい。更に、実施例で使用している具体的方法、デバイス、材料のほかに、当業者による従来技術の理解及び本発明の記載に基づいて、本発明の実施例で述べる方法、デバイス、材料と類似又は同等の従来技術における任意の方法、デバイス及び材料を用いて本発明を実現してもよい。
別途説明している場合を除き、本発明で開示する実験方法、検出方法、作製方法は、いずれも当該分野において一般的な分子生物学、生化学、クロマチン構造及び分析、分析化学、細胞培養、組換えＤＮＡ技術及び関連分野における一般的技術を用いている。これらの技術は、従来の文献で完全に説明されており、具体的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１、Ａｕｓｕｂｅｌ等，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９、及び、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９等、を参照すればよい。
式Ｉで示される融合タンパク質の調製：
本実施例で調製した融合タンパク質は式Ｉで表され、具体的構造は、Ａ－Ｌ－Ｆ（式Ｉ）である。好ましくは、ＧＣＧ類似物フラグメント（式ＩのＡに対応）、連結ペプチドフラグメント（式ＩのＬに対応）、及びＦｃ（式ＩのＦに対応）を融合して得られる二量体融合タンパク質のアミノ酸配列は、後述の表１に示す通りとする。
二量体融合タンパク質のアミノ酸配列を知った上で、当業者は、従来技術を用いて当該融合タンパク質を調製することができる。この場合、ＦＣ配列を備えているため、高親和性及び高特異性のＰｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂クロマトグラフィーによってタンパク質を精製可能である。ここでは、実行可能な調製方法を１つだけ例示的に提供する。
調製過程は、下記の通りとした。
（１）タンパク質配列及びアミノ酸コドン表に基づいてＤＮＡ配列を設計した。次に、組換えタンパク質のＡ、Ｌ、Ｆに対応するポリヌクレオチドＤＮＡフラグメントをそれぞれ調製した。各ＤＮＡフラグメントは、一般的な固相合成技術により合成及び連結可能であった。
（２）プライマーを設計してネステッドＰＣＲ増幅を行い、Ａ、Ｌ、Ｆにそれぞれ対応するＤＮＡフラグメントを連結することで目的遺伝子を取得した。ＰＣＲ連結技術（プライマー設計、ＰＣＲによる突然変異の導入及び酵素切断等を含む）は、当業者が熟知する公知の技術とした。なお、当業者は、本実施例のＰＣＲ連結過程は唯一の方法ではなく、例えば、遺伝子合成によっても目的遺伝子を取得可能であると解釈すべきである。目的遺伝
子を取得したあと、目的遺伝子を哺乳動物細胞の発現ベクターｐＴＴ５（Ｙｖｅｓ Ｄｕｒｏｃｈｅｒ）にクローニングして、大腸菌Ｔｏｐ１０Ｆ’に形質転換した。そして、陽性クローンが鑑定されたあと、５００ｍｌのＬＢ培地に移植して一晩培養し、遠心分離により菌体を収集してから、オメガ社製Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ（登録商標）エンドフリープラスミドマキシキット又は類似の方法でプラスミドを抽出した。
（３）ＨＥＫ２９３Ｆ細胞へのトランスフェクション及び細胞の発現：１．０ｍｇのプラスミドを取り、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地（サーモフィッシャー社）を用いて２５ｍｌまで希釈した。次に、３．０ｍｇのＰＥＩ（線形、２５ＫＤ）を取り、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地を用いて２５ｍｌまで希釈してから、プラスミド溶液に加えて均一に混合し、室温で３０分間インキュベートした。また、同時に、対数増殖期のＨＥＫ２９３Ｆ細胞（生存率＞９５％）を取ってカウントし、１１００ｒｐｍで１０分間遠心分離したあと上清を捨て、４５０ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地を用いて細胞を再懸濁した。ＰＥＩプラスミド混合液のインキュベートが終了したあと、これを細胞懸濁液に加え、３７℃、５％ＣＯ２、１４０ ＲＰＭで振蕩培養した。そして、７時間後に、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地を１０００ｍｌの２９３ ＳＦＭ ＩＩ培地（サーモフィッシャー社）に交換して、引き続き７日間培養した。
（４）組換えタンパク質の精製：細胞培養液を８０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ間の高速遠心分離にかけて上清を取得し、予め平衡溶液（２０ｍＭ ＰＢ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７）で平衡させたＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（博格隆（上海）生物技術有限公司）にサンプル投入した。そして、再び平衡させたあと、１００％溶出させた（溶出液は０．１Ｍ Ｇｌｙ－ＨＣｌ、ｐＨ３．０）。続いて、採取管に中和液（１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を予め投入してから、溶出サンプルを採取した。最後に、中和液を溶出サンプルの体積の１／１０加え、一般的なブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法でタンパク質濃度を測定した。
（５）組換えタンパク質の物理・化学的性質の鑑定：精製により取得した組換えタンパク質をＨＰＬＣ分析したところ、純度は９５％以上であった。
式Ｉで示される融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞活性測定：
実施例１で取得した融合タンパク質につき、ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性測定及びＧＣＧＲアゴニスト活性測定を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ活性測定を行った。
ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性測定：
ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性測定には、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを使用した。ヒト由来ＧＬＰ－１Ｒ遺伝子を哺乳動物細胞の発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１にクローニングし、組換え発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－ＧＬＰ－１Ｒを作製した。また、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）全長遺伝子をｐＣＲＥ－ＥＧＦＰプラスミドにクローニングし、ＥＧＦＰ遺伝子を置換して、ｐＣＲＥ－Ｌｕｃ組換えプラスミドを取得した。次に、ｐＣＤＮＡ３．１－ＧＬＰ－１ＲとｐＣＲＥ－Ｌｕｃプラスミドをモル比１：１０の比率でＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、安定トランスフェクション発現株をスクリーニングすることで、組換えＣＨＯ／ＧＬＰ－１Ｒ安定トランスフェクション細胞株を取得した。
９ｃｍの細胞培養シャーレ内で、１０％ＦＢＳ及び３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて細胞を培養した。そして、コンフルエンシーが９０％程度となった時点で培養上清を捨て、２ｍｌのパンクレアチンを加えて３ｍｉｎ間消化したあと、２ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を加えて中和し、１５ｍｌの遠沈管に移した。これを１
０００ｒｐｍで５ｍｉｎ間遠心分離したあと上清を捨て、１０％ＦＢＳ及び３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む２ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を加えて再懸濁し、カウントした。続いて、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて細胞を５×１０５細胞／ｍｌまで希釈し、９６ウェルマイクロプレートに１ウェルあたり１００μｌ（即ち、５×１０４／ウェル）でプレーティングした。これにより、単層培養したあと、０．２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に交換して培養した。そして、９６ウェルマイクロプレートにプレーティングした細胞から上清を捨てたあと、精製した組換えタンパク質（表１及び表２）又は天然グルカゴン（チャイニーズ ペプチド カンパニー（中国語表記：杭州中▼タイ▲生化有限公司）、ＧＬＵＣ－００４）と天然ＧＬＰ－１（チャイニーズ ペプチド
カンパニー、ＧＬＵＣ－０１６Ｂ）を対照とし、０．２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で一連の所定濃度まで希釈してから、細胞培養ウェルに１００μｌ／ウェルで加え、６ｈの刺激後に測定した。測定は、ルシフェラーゼレポーターアッセイキット（Ｌｕｃｉｆｅｒｓａｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｋｉｔ、Ｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｃａｔ：６８－ＬｕｃｉＲ－Ｓ２００）の説明書に従って行った。
ＧＣＧＲアゴニスト活性の測定方法：
ＧＣＧＲアゴニスト活性測定にも同様に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを使用した。ＧＣＧＲ遺伝子を哺乳動物細胞の発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１にクローニングし、組換え発現プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－ＧＣＧＲを作製した。ＣＨＯ細胞へのトランスフェクション及び安定トランスフェクション細胞株ＣＨＯ／ＧＣＧＲの作製については上記と同様とした。
結果は、表１に示す通りとなった。
Figure 2022532332000002
表１のタンパク質番号は、ＧＣＧ類似物ポリペプチドのコード番号＋連結ペプチドのコード番号＋ＦＣのコード番号、とのルールに従った。例えば、Ａ３８２Ｌ１Ｆ６は、ＧＣＧ類似物ポリペプチドＡ３８２とコード番号Ｆ６のＩｇＧ Ｆｃをコード番号Ｌ１の連結ペプチドで融合して得られたことを示す。
このほか、Ｅｘｅｎｄｉｎ－４のＣ末端配列を持たないその他の二量体融合タンパク質であるＧ２３２Ｌ１Ｆ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８２）、Ｇ３５２Ｌ１Ｆ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８３）、Ｇ３８２Ｌ１Ｆ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８４）、Ｇ３９５Ｌ１Ｆ６（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．８５）、Ｇ４０２Ｌ１Ｆ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８６）についても、ＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性測定及びＧＣＧＲアゴニスト活性測定を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ活性測定を行った（調製及び精製の方式は実施例１と同様）。
測定結果を本発明の組換えタンパク質と比較したところ、結果は表２に示す通りとなった。
Figure 2022532332000003
説明：ａは、Ｅｘｅｎｄｉｎ－４のＣ末端延伸ペプチドＣｅｘ（本発明では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２～３のいずれか）の追加前後におけるＧＬＰ－１Ｒアゴニストの活性比率である。
ｂは、米国特許第９０１８１６４Ｂ２号の表２に開示されている天然グルカゴン及びＧｌｕｃａｇｏｎ ＣｅｘのＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性データに基づき算出した比率である。
ｃは、Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ．Ｃｈａｂｅｎｎｅら（Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ．Ｃｈａｂｅｎｎｅ等，Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．４（６）：１３２２－１３３１、２０１０）の文中の表１に開示されている天然グルカゴン及びＧｌｕｃａｇｏｎ ＣｅｘのＧＬＰ－１Ｒアゴニスト活性データに基づき算出した比率である。
表２に示したように、本発明におけるＥｘｅｎｄｉｎ－４のＣ末端配列を含むＧＣＧ類似物ポリペプチドを連結ペプチドによりＦｃと融合して二量体を調製した場合には、ＧＬＰ－１Ｒに対するアゴニスト活性が２００倍以上も向上したが、ＧＣＧＲに対するアゴニスト活性に明らかな差は見られなかった。反対に、Ａ００１Ｌ１Ｆ６とＡ０１２Ｌ１Ｆ６の比率はわずか２１程度であった。
式Ｉで示される融合タンパク質におけるＤＰＰ－ＩＶ酵素耐性の安定性：
精製した融合タンパク質を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（０．０５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを
含む）に溶解し、最終濃度を５μＭとしてから、最終濃度１０ｎＭの組換えＤＰＰ－ＩＶ酵素を加えた。これを３７℃で２４時間水浴したあと、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＧＣＧＲ細胞活性を測定した。ここで、活性維持率≒（ＤＰＰ－ＩＶ酵素処理後の活性／処理前の活性）×１００％とした。
本実施例では、２番目に非天然アミノ酸Ａｉｂ又はＤ－Ｓｅｒを導入したＧＣＧ類似物を対照として用いた。
ＧＤＳｅｒＧＳ：Ｈ－Ｄ－Ｓｅｒ－ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＱＡＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７９）；
ＧＡｉｂＧＳ：Ｈ－Ａｉｂ－ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＱＡＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８０）；
Ａ１２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０）、Ａ１３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２）、Ａ１７５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３）、Ａ３５２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４２）、Ａ３８２（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．４３）及びＡ３９５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４４）を本実施例における安定性実験の対照として用いた。
結果は、表３に示す通りとなった。
Figure 2022532332000004
式Ｉで示される融合タンパク質の血清安定性実験：
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイ：
（１）融合タンパク質を取り、限外濾過によって濃縮してから、２０ｍＭ ＰＢ ｐＨ７．４で１．６ｍｇ／ｍｌまで希釈した。そして、これを除菌濾過したあと、血清（ＦＢＳ、ＧＥＭＩＮＩ ９００－１０８、Ａ９７Ｅ００Ｇ）を用いて１０倍に希釈し、均一に混合してから滅菌遠沈管に分割した。
（２）一方で、グルカゴン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、チャイニーズ ペプチド カンパニー、ＧＬＵＣ－００４）を取り、０．２ｍｇ／ｍｌまで希釈した。そして、これを除菌濾過したあと、血清を用いて１０倍に希釈し、均一に混合してから滅菌遠沈管に分割した。
（３）前記サンプルのうち１～２本を－２０℃で凍結保存し、対照とした。残りのサンプルは３７℃のインキュベーターに配置し、異なるタイミングでサンプリングしてＧＣＧＲアゴニスト活性を測定した。
（４）ＣＨＯ／ＧＣＧＲ細胞を２回継代したあと、９６ウェルマイクロプレートにプレーティングしてサンプルの活性を測定した。相対的な活性の経時変化は図１Ａ～Ｂに示す通りとなった。図１の結果から明らかなように、Ａ０７３Ｌ１Ｆ６、Ａ０８９Ｌ１Ｆ６、Ａ１２３Ｌ１Ｆ６、Ａ１３５Ｌ１Ｆ６、Ａ１３７Ｌ１Ｆ６、Ａ１７５Ｌ１Ｆ６、Ａ１８７Ｌ１Ｆ６、Ａ２０９Ｌ１Ｆ６、Ａ２３２Ｌ１Ｆ６、Ａ２６６Ｌ１Ｆ６、Ａ２７１Ｌ１Ｆ６、Ａ３０７Ｌ１Ｆ６、Ａ３５２Ｌ１Ｆ６、Ａ３８２Ｌ１Ｆ６、Ａ３９５Ｌ１Ｆ６は、血清中での安定性がその他の融合タンパク質に比べて明らかに高かった。
残存活性：０時間の活性値を１００％とし、この値とその後のタイミングで測定した値を比較して残留活性を取得した。
式ＩＩで示される融合タンパク質の調製及び活性測定：
本実施例で調製した融合タンパク質は式ＩＩで表され、具体的構造は、Ａ－Ｌ１－Ｆ－Ｌ２－Ｂ（式ＩＩ）である。ＡはＧＣＧ類似物フラグメント、Ｆは長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントである。ＢはＦＧＦ２１類似物フラグメントであって、天然ＦＧＦ２１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８７）又はその誘導体とすることができる。また、Ｌ１は連結ペプチドフラグメントであって、配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４～２３のいずれかから選択可能である。Ｌ２は連結ペプチドフラグメントであって、存在しなくてもよいし、配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４～２３のいずれかから選択してもよい。調製したアミノ酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９１～１１５で示され、対応するコード番号を表４に記載している。
Ａ－Ｌ１－Ｆ－Ｌ２－Ｂ（式ＩＩ）のアミノ酸配列を知った上で、当業者は従来技術を用いて当該融合タンパク質を調製することができる。この場合、ＦＣ配列を備えているため、高親和性及び高特異性のＰｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂クロマトグラフィーによってタンパク質を精製可能である。具体的方法については実施例１の調製方法を参照すればよい。精製により取得した組換えタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動又はアミノ酸配列検証にかけたところ、いずれも予測と一致していた。また、天然ＦＧＦ２１及びＦＧＦ２１類似物の調製については、Ｘｕ Ｊらの報告を参考にして（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．；２４（６）：９１５－２５，２０１３）、以下の点を修正した。即ち、発現ベクターをＰＥＴ３０、宿主菌をＢＬ２１（ＤＥ３）（中国メルク社）に変更した。また、封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）は洗浄液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２Ｍ尿素、ｐＨ ８．０）で４回洗浄し、計量した。次に、（１：１０の質量体積比で）封入体０．１ｇにつき１ｍｌの変性剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、８Ｍ ｕｒｅａ、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ ８．５）を加え、室温で振蕩器により軽く混合して５ｈ以上溶解した。そして、これを１：１００～２００の比率で希釈し、リフォールディングさせた。続いて、変性剤をゆっくりとリフォールディング液に滴下した。滴下過程では常に攪拌を続けた。滴下完了後、タンパク質を含んだリフォールディング液を４℃で２４ｈ放置した。そして、終了後に０．４５μｍの濾過膜で濾過し、クロマトグラフィーで精製した。また、対照品Ｆ９Ｌ５Ｗ及びＦ９Ｌ５Ｍ２の具体的方法については、実施例１の調製方法を参照すればよい。
活性測定細胞の作製：
ピューロマイシン耐性遺伝子ｐａｃをＰＣＲ増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）にクローニングして、元のＧ４１８耐性遺伝子と置換した。また、ＧＡＬ４ＤＢＤ－ＥＬＫ１、ＩＲＥＳ、ＫＬＢ（β－ｋｌｏｔｈｏ）遺伝子をＰＣＲ増幅し、ｐｃＤＮＡ－Ｐｕｒｏプラスミドに順にクローニングして、細胞のトランスフェクション及びスクリーニングに用いるプラスミドｐｃＤＮＡ－ＧＡＬ４ＤＢＤ－ＥＬＫ１－ＩＲＥＳ－ＫＬＢ－Ｐｕｒｏを作製した。次に、作製した組換えプラスミドとｐＦＲ－Ｌｕｃプラスミド（アジレント社）をオメガ社製Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ（登録商標）エンドフリープラスミドマキシキットで抽出し、
準備した。細胞のトランスフェクション過程は次の通りであった。
即ち、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１ウェルあたり３×１０５個で６マイクロプレートにプレーティングし、一晩培養した。
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地で細胞を２回洗浄したあと、２ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を加えた。次に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（６μｌ）：ｐＦＲ－Ｌｕｃ（４．６μｇ）：ｐｃＤＮＡ－ＧＡＬ４ＤＢＤ－ＥＬＫ１－ＩＲＥＳ－ＫＬＢ－Ｐｕｒｏ（１μｇ）の比率で細胞トランスフェクション試薬を配合した。これを２０ｍｉｎ間静置したあと、ゆっくりと６マイクロプレートに加えつつ、均一に混合した。そして、６ｈ培養したあと、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２で引き続き培養した。その後、ＦＧＦ２１活性応答を有する安定トランスフェクション細胞株をスクリーニングにより取得した。
細胞の活性測定：
細胞がシャーレ全体に成長したあと、パンクレアチンで消化し、細胞懸濁液を調製した（１×１０５細胞／ｍｌ、ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ＋１μｇ／ｍｌのピューロマイシン）。これを９６ウェルマイクロプレートに１ウェルあたり１００μｌでプレーティングし、一晩培養した。続いて、濃度勾配を有する測定対象サンプルを加え、６ｈ作用させたあと、ルシフェラーゼレポーターアッセイキット（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｃａｔ：６８－ＬｕｃｉＲ－Ｓ２００）を用いて蛍光検出を行った。結果は、表４に示す通りとなった。
Figure 2022532332000005
表中のタンパク質番号は、ＧＣＧ類似物ポリペプチドのコード番号＋連結ペプチドのコード番号＋ＦＣのコード番号＋連結ペプチドのコード番号＋ＦＧＦ２１類似物のコード番号、とのルールに従った。例えば、Ａ３８２Ｌ１Ｆ６Ｌ５Ｍ２は、ＧＣＧ類似物ポリペプチドＡ３８２とコード番号Ｆ６のＩｇＧ Ｆｃをコード番号Ｌ１の連結ペプチドで連結してから、更に、コード番号Ｌ５の連結ペプチドによってコード番号Ｍ２のＦＧＦ２１類似物と連結することで、融合タンパク質を作製したことを示す。
融合タンパク質をｄｂ／ｄｂマウスに連続投与したあとの随時血糖測定
レプチン受容体欠失２型糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）マウスの血糖低下実験を行った。主に、体重、非空腹時血糖、投与前ＯＧＴＴ反応の３つの指標に従って、ｄｂ／ｄｂマウスをスクリーニングし、均等に群分けした。各群は１０匹とし、過剰に大きい又は小さい個体はできる限り排除した。次に、表５に示した投与量で皮下注射を行った。４日ごとに１回投与し、１回目を０日目、最後を１６日目とした。陰性対照群には生理食塩水（ＰＢＳ）（５μｌ／ｇ体重）、陽性対照群にはリラグルチド（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重）を皮下注射する方式で、１日１回投与し、連続１８日間投与した。１回目の注射前、及び２ｄ、６ｄ、１０ｄ、１４ｄ、１８ｄの午前９時に随時血糖値を測定した。随時血糖の変化の結果は図２に示すようになった。
図２Ａ及び図２Ｂに示したように、表５の融合タンパク質によるｄｂ／ｄｂマウスの血糖低下効果は、陽性対照のリラグルチドよりも明らかに優れていた。
Figure 2022532332000006
誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスに連続投与した場合の薬効研究：
本実施例の目的は、異なるデュアル融合タンパク質がＤＩＯマウスの体重に及ぼす影響及び作用を研究することである。７週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに高脂質飼料（６０％ｋｃａｌ ｆｒｏｍ ｆａｔ）を与えて１６週間飼育を続け（合計２３週間）、体重が約５５ｇとなった時点で実験を行った。飼育条件は、１２ｈ明期／１２ｈ暗期、自由摂食、個別ケージで飼育とし、投与１日前に体重及び体重増加曲線に従ってマウスを群分けした（８匹／群）。そして、その翌日に皮下投与処理を行った。２０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重の投与量で４日に１回投与し、その他の日はＰＢＳを偽注射した。投与は２８日間連続で行った。一方、陰性対照群には、５μｌ／ｇ体重で生理食塩水（ＰＢＳ）を注射した。また、陽性対照群にはリラグルチド（４０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重）を１日１回投与した。そして、マウスの体重を毎日測定し、摂食・摂水量を記録した。マウスは最後の投与から５日目に殺処理し、眼窩から採血して血漿標本を－８０℃で保管した。そして、各群の動物の投与前及び殺処理時の平均体重の変化を計算した。結果は図３に示す通りとなった。
以上述べたように、本発明は従来技術における様々な欠点を解消しており、高度な産業上の利用価値を有している。
上記の実施例は本発明の原理と効果を例示的に説明するものにすぎず、本発明を制限するものではない。本技術を熟知する者であれば、本発明の精神及び範囲を逸脱しないことを前提に、上記の実施例を補足又は変形可能である。従って、当業者が本発明で開示した精神及び技術的思想から逸脱することなく完成させるあらゆる等価の補足又は変形もまた本発明の特許請求の範囲に含まれる。

Claims (21)

  1. 融合タンパク質であって、グルカゴン類似物フラグメント及び長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントを含み、前記グルカゴン類似物フラグメントは、
    ａ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８１のアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメント：
    Ｘ１ＳＸ３ＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＡＱＤＦＶＱＷＬＸ２７Ｘ２８Ｘ２９ＸｚＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８１；
    （Ｘ１は、Ｈ又はＹから選択され、Ｘ３は、Ｑ又はＥから選択され、Ｘ１６は、Ｙ、Ｎ、Ｗ及びＨ以外のいずれかのアミノ酸から選択され、Ｘ１７は、Ｐ、Ｌ、Ｔ、Ｆ及びＨ以外のいずれかのアミノ酸から選択され、Ｘ１８は、Ｐ、Ｆ、Ｈ及びＷ以外のいずれかのアミノ酸から選択され、Ｘ１７とＸ１８は同時にＲとなることはなく、Ｘ２７は、Ｍ又はＬから選択され、Ｘ２８は、Ｄ又はＡから選択され、Ｘ２９は、Ｔ又は欠失とし、Ｘｚは、ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ又はＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳから選択される）、或いは、
    ｂ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８１と９０％以上の配列同一性を有しており、且つ、ａ）で限定したポリペプチドフラグメントの機能を持つポリペプチドフラグメント、を含む融合タンパク質。
  2. 前記ａ）のポリペプチドフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４４のいずれかのアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメントから選択されることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 前記長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントは、哺乳動物の免疫グロブリンのＦＣ部分由来であることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
  4. 前記長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントは、
    ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４～１３のいずれかのアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメント、或いは、
    ｄ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４～１３のいずれかと９０％以上の配列同一性を有しており、且つ、ｃ）で限定したポリペプチドフラグメントの機能を持つポリペプチドフラグメント、を含むことを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質。
  5. 前記融合タンパク質は第１連結ペプチドフラグメントを更に含み、前記第１連結ペプチドフラグメントは、グルカゴン類似物フラグメントと長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントの間に位置し、好ましくは、前記第１連結ペプチドフラグメントはＧ、Ｓ及び／又はＡを豊富に含むことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
  6. 前記第１連結ペプチドフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４～２３のいずれかのアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメントを含むことを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。
  7. 前記融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、グルカゴン類似物フラグメント、第１連結ペプチドフラグメント及び長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントを順に含むことを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。
  8. 前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７１のいずれかで示されることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
  9. 前記融合タンパク質は、更に、ＦＧＦ２１類似物フラグメントを含むことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
  10. 前記ＦＧＦ２１類似物フラグメントは、
    ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１９のアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメント：
    ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＸ １９ＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＸ ３１ＨＬＥＩＸ ３６ＥＤＧＴＶＧＸ ４３ＡＸ ４５ＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＸ ５６ＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＸ ９８ＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＸ １１８ＰＧＮＸ １２２ＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＸ １３４ＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＸ １６７ＭＶＸ １７０Ｘ１７１ＳＱＸ １７４ＲＳＰＳＸ １７９ Ｘ １８０ Ｘ １８１ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１９；
    （Ｎ末端のＨＰＩＰＤＳＳは、欠失していてもよいし、一部を欠失していてもよく、Ｘ１９は、Ｒ、Ｙ、Ｖ、Ｅ又はＣから選択され、Ｘ３１は、Ａ又はＣから選択され、Ｘ３６は、Ｒ又はＫから選択され、Ｘ４３は、Ｇ又はＣから選択され、Ｘ４５は、Ａ、Ｋ、Ｅ又はＶから選択され、Ｘ５６は、Ｋ、Ｒ、Ｖ又はＩから選択され、Ｘ９８は、Ｌ、Ｒ又はＤから選択され、Ｘ１１８は、Ｌ又はＣから選択され、Ｘ１２２は、Ｋ又はＲから選択され、Ｘ１３４は、Ａ又はＣから選択され、Ｘ１６７は、Ｓ、Ａ又はＲから選択され、Ｘ１７０は、Ｇ又はＥから選択され、Ｘ１７１は、Ｐ又はＧから選択され、Ｘ１７４は、Ｇ、Ａ又はＬから選択され、Ｘ１７９は、Ｙ、Ａ又はＦから選択され、Ｘ１８０は、Ａ又はＥから選択され、Ｘ１８１は、Ｓ、Ｋから選択されるか、欠失している）、或いは、
    ｆ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１９と８０％以上の配列同一性を有しており、且つ、ｅ）で限定したポリペプチドフラグメントの機能を持つポリペプチドフラグメント、を含み、
    好ましくは、前記ｅ）のポリペプチドフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８７～９０のいずれかのアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメントから選択されることを特徴とする請求項９に記載の融合タンパク質。
  11. 前記融合タンパク質は第２連結ペプチドフラグメントを更に含み、前記第２連結ペプチドフラグメントは、長時間作用型タンパク質ユニットフラグメントとＦＧＦ２１類似物フラグメントの間に位置し、好ましくは、前記第２連結ペプチドフラグメントはＧ、Ｓ及び／又はＡを豊富に含むことを特徴とする請求項９に記載の融合タンパク質。
  12. 前記第２連結ペプチドフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４～２３のいずれかのアミノ酸配列で示されるポリペプチドフラグメントを含むことを特徴とする請求項１１に記載の融合タンパク質。
  13. 前記融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、グルカゴン類似物フラグメント、第１連結ペプチドフラグメント、長時間作用型タンパク質ユニットフラグメント及びＦＧＦ２１類似物フラグメントを順に含み、
    或いは、前記融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、グルカゴン類似物フラグメント、第１連結ペプチドフラグメント、長時間作用型タンパク質ユニットフラグメント、第２連結ペプチドフラグメント及びＦＧＦ２１類似物フラグメントを順に含むことを特徴とする請求項１１に記載の融合タンパク質。
  14. 前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９１～１１５のいずれかで示されることを特徴とする請求項１３に記載の融合タンパク質。
  15. 請求項１～１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、分離したポリヌクレオチド。
  16. 請求項１５に記載の分離したポリヌクレオチドを含む構造体。
  17. 請求項１６に記載の構造体、又はゲノムに外来遺伝子が組み込まれている請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含む発現システム。
  18. 請求項１～１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質の調製方法であって、
    請求項１７に記載の発現システムを適切な条件で培養し、当該発現システムに前記融合タンパク質を発現させ、分離及び精製により前記融合タンパク質を提供することを含む調製方法。
  19. 請求項１～１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質、又は請求項１７に記載の発現システムの培養物を含む薬物組成物。
  20. 請求項１～１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１９に記載の薬物組成物の、薬物製造における用途。
  21. 前記薬物は、代謝性疾患の治療のための薬物から選択されることを特徴とする請求項２０に記載の用途。
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