CN102046207B - 药物融合物和缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及血清半寿期改进的药物融合物。这样的融合物和缀合物包含多肽、免疫球蛋白(抗体)单一可变结构域及GLP和/或毒蜥外泌肽分子。本发明还涉及包含这类药物融合物和缀合物的用途、制剂、组合物和装置。

Description

药物融合物和缀合物
本发明涉及血清半寿期得到改进的药物融合物和缀合物。这些融合物和缀合物包含免疫球蛋白(抗体)单一可变结构域(single variabledomain)及GLP和/或毒蜥外泌肽分子。本发明还涉及包含这类药物融合物和缀合物的用途、剂型、组合物和装置。
发明背景
具有可用于治疗和/或诊断目的活性的许多药物的价值有限，因为当给药后它们快速从体内清除。例如，在治疗上具有有益活性的许多多肽通过肾快速从循环中清除。因此，必需给予大的剂量才能获得所需要的治疗效果。存在对具有改进的药代动力学性质的治疗药和诊断药的需求。
在机体或全身循环中，半寿期短的这类药物之一是肠降血糖素激素例如胰高血糖素样肽1或YY肽以及毒蜥外泌肽，例如毒蜥外泌肽-4。
胰高血糖素样肽(GLP)-1是一种肠降血糖素激素，具有有效的葡萄糖依赖性促胰岛素作用和胰高血糖素抑制作用、对胰β细胞的营养作用以及对胃肠分泌和蠕动的抑制作用，它把降低血浆葡萄糖和减少血糖波动结合在一起。此外，GLP-1通过其提高饱感的能力而减少食物摄取，因此限制体重增加，并且甚至可引起体重减轻。总之，这些作用赋予GLP-1独特的特征，鉴于十分需要抗糖尿病药，特别是因为其抗高血糖作用的葡萄糖依赖性，这可使任何严重低血糖的风险降到最低。然而，其药代动力学/药效动力学特征如此，以致天然GLP-1并非是治疗有益的。因此，虽然GLP-1当连续给予时是最有效的，但是一次皮下注射的持续作用短暂。GLP-1非常容易遭受体内酶的降解，而且与二肽基肽酶IV(DPP-IV)的切割可能关系最大，因为这种切割快速发生，并产生非促胰岛素代谢物。因此根据对影响GLP-1代谢稳定性和药代动力学/药效动力学特征的因素的理解，利用GLP-1的治疗潜力的策略已成为深入研究的焦点。
已进行了广泛的研究工作以期按减缓GLP-1降解同时又保持生物活性的方式抑制所述肽酶或修饰GLP-1。WO05/027978公开了作用特征延长的GLP-1衍生物。WO02/46227公开了包含多肽(例如白蛋白)与GLP-1或类似物(这些类似物的公开内容通过引用作为可以用于本发明的GLP-1类似物的实例而结合到本文中)融合的异源融合蛋白。WO05/003296、WO03/060071、WO03/059934公开了氨基融合蛋白(amino fusion protein)，其中GLP-1与白蛋白融合以期延长该激素的半寿期。
然而，尽管作了这些努力，但仍未生产出长效的活性GLP-1。
因此，特别在糖尿病和肥胖症领域，存在对改进的GLP-1肽或同样具有特别适于治疗糖尿病和肥胖症的促胰岛素作用的其它肽(例如毒蜥外泌肽-4)的巨大需求。因此需要修饰GLP-1、毒蜥外泌肽-4和其它促胰岛素肽使其体内作用时间延长同时又保持低毒性和治疗益处。
发明概述
本发明提供一种组合物，其为融合物或缀合物并且包含以下成分或由以下成分组成：(a)促胰岛素药物或分子、或者肠降血糖素药物或分子，例如可以是毒蜥外泌肽-4或GLP-1(例如GLP-1(7-37)A8G突变体)，作为与(b)的融合物或缀合物存在，(b)DOM 7h-14(Vk)结构域抗体(dAb)，其与血清白蛋白特异性结合(DOM 7h-14的氨基酸序列见图1(h)：SEQ ID NO 8)。
还可任选存在将促胰岛素药物或肠降血糖素药物(例如毒蜥外泌肽-4和/或GLP-1)与dAb(例如与DOM7h-14dAb)连接的氨基酸接头或化学接头。接头可以是例如螺旋接头，例如图1(k)所示的螺旋接头序列：SEQ ID NO 11，或者可以是gly-ser接头，例如具有图1(l)所示的氨基酸序列：SEQ ID NO 12。
在某些实施方案中，本发明的融合物(或缀合物)可包含其它的分子，例如其它的肽或多肽。
促胰岛素药物或肠降血糖素药物(例如毒蜥外泌肽和/或GLP-1)可作为dAb的N端或C端的融合物(或缀合物)而存在。
在某些实施方案中，本发明提供包含选自以下融合物分子或者由选自以下融合物分子组成的多肽：
(a)2xGLP-1(7-37)A8G DOM7h-14 dAb融合物(DAT0114，氨基酸序列见图1(a)：SEQ ID NO 1)，
(b)毒蜥外泌肽4(G4S接头)3DOM7h-14 dAb融合物(DAT0115，氨基酸序列见图1(b)：SEQ ID NO 2)，
(c)毒蜥外泌肽4-DOM7h-14 dAb融合物(DAT0116，氨基酸序列见图1(c)：SEQ ID NO 3)，
(d)毒蜥外泌肽4、螺旋接头、DOM7h-14 dAb融合物(DAT0117，氨基酸序列见图1(d)：SEQ ID NO 4)，
(e)GLP-1(7-37)A8G(G4S接头)3DOM7h-14 dAb融合物(DAT0118，氨基酸序列见图1(e)：SEQ ID NO 5)，
(f)GLP-1(7-37)A8G DOM7h-14 dAb融合物(DAT0119，氨基酸序列见图1(f)：SEQ ID NO 6)，
(g)GLP-1(7-37)A8G、螺旋接头、DOM7h-14 dAb融合物(DAT0120，氨基酸序列见图1(g)：SEQ ID NO 7)。
本发明还提供包含上述氨基酸序列或由上述氨基酸序列组成的缀合物分子，即具有由SEQ ID NO 1-7所示的氨基酸序列的缀合物分子。
Dom 7h-14是与血清白蛋白结合的人免疫球蛋白单一可变结构域或dAb(Vk)，其氨基酸序列见图1(h)：SEQ ID NO 8。Dom7h-14 dAb的CDR区在图1(h)：SEQ ID NO 8所示氨基酸序列中用下划线表示。
本文使用的“融合物”是指包含结合血清白蛋白的DOM7h-14 dAb作为第一部分和促胰岛素药物或肠降血糖素药物作为第二部分的融合蛋白。结合血清白蛋白的dAb和所述药物或药剂作为单条连续多肽链的离散组成部分(部分)存在。第一部分(dAb)和第二部分(肠降血糖素药物或促胰岛素药物)可以通过肽键彼此直接结合或者通过合适的氨基酸或者肽或多肽接头连接。适当时，可存在额外部分，例如肽或多肽(例如第三、第四肽)和/或接头序列。第一部分可位于相对于第二部分的N端位置、C端位置或内部。在某些实施方案中，融合蛋白含有一个以上(例如1个-约20个)dAb部分。
本文使用的“缀合物”是指包含结合血清白蛋白的、促胰岛素药物或肠降血糖素药物与之共价或非共价结合的dAb的组合物。促胰岛素药物或肠降血糖素药物可直接与dAb共价结合，或者通过合适的接头部分间接结合。药物或药剂可以在任何合适的位置上与dAb结合，例如氨基端、羧基端或通过合适的氨基酸侧链(例如赖氨酸的ε氨基或半胱氨酸的巯基)。或者，药物或药剂可直接与dAb非共价结合(例如静电相互作用、疏水相互作用)或间接结合(例如通过互补结合配偶体(例如生物素和抗生物素蛋白)的非共价结合，其中一个配偶体与药物或药剂共价结合，而互补结合配偶体与dAb共价结合)。
本发明还提供本发明的任何缀合物或融合物的(基本上)纯的单体例如DAT0114、DAT0115、DAT0116、DAT0117、DAT0118、DAT0119和DAT120的单体。在一个实施方案中，它是至少98％、99％、99.5％纯或100％纯的单体。
本发明还提供编码本文所述融合物的核酸，例如编码DAT0114、DAT0115、DAT0116、DAT0117、DAT0118、DAT0119和DAT120的核酸，以及例如其中在图2(SEQ ID NO 13-23)中所示的核酸序列。本文还提供包含这些核酸的宿主细胞。
本发明另提供用于产生本发明的融合物的方法，所述方法包括在适于表达所述重组核酸的条件下维持包含编码本发明的融合物的重组核酸和/或构建体的宿主细胞，从而产生融合物。
本发明还提供包含本发明的融合物或缀合物的组合物(例如药物组合物)。
本发明还提供用于治疗患有疾病或病症的个体的方法，例如本文所述疾病或病症，例如代谢疾病，例如高血糖症、葡萄糖耐量减低(impaired glucose tolerance)、β细胞缺乏症、糖尿病(例如I型或II型糖尿病或妊娠糖尿病)或肥胖症或以过食为特征的疾病，例如它可用于例如普-威综合征(Prader-Willi syndrome)抑制食欲，并且所述方法包括给予所述个体治疗有效量的本发明的融合物或缀合物。
其它代谢紊乱包括但不限于胰岛素抵抗、胰岛素缺乏、高胰岛素血症、高血糖症、血脂异常(dyslipidemia)、高脂血症、高酮血症、高血压、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、肾衰竭、神经病(例如自主神经病、副交感神经病和多神经病)、视网膜病、白内障、代谢紊乱(例如胰岛素和/或葡萄糖代谢紊乱)、内分泌障碍、肥胖症、体重减轻、肝脏疾病(例如肝病、肝硬化和肝移植相关疾病)以及与这些疾病或病症有关的病况。
另外，可用本发明的化合物预防或治疗的糖尿病相关病症包括但不限于高血糖症、肥胖症、糖尿病性视网膜病、单神经病、多神经病、动脉粥样硬化、溃疡、心脏病、中风、贫血症、坏疽(例如脚手坏疽)、阳萎、感染、白内障、肾功能低下、自主神经系统机能障碍、白细胞功能减低、腕管综合征、杜普伊特伦挛缩(Dupuytren′s contracture)和糖尿病酮症酸中毒。
本发明还提供用于治疗或预防与血液葡萄糖升高有关的疾病的方法，所述方法包括给予患者或受治疗者至少一剂本发明的融合物或缀合物和/或药物组合物。
本发明还涉及使用本发明的缀合物或融合物调节患者对胰岛素响应性的方法，以及增加细胞摄取葡萄糖的方法，及调节细胞对胰岛素的敏感性的方法。本发明还提供刺激胰岛素合成和释放，提高脂肪、肌肉或肝组织对胰岛素摄取的敏感性，刺激葡萄糖摄取，减慢消化过程，或者阻断患者中胰高血糖素分泌的方法，所述方法包括给予所述患者本发明的融合物或缀合物，例如包括给予至少一剂本发明的药物缀合物或融合物和/或药物组合物。
本发明的融合物或缀合物和/或药物组合物可以单独给予或者与其它分子或部分组合给予，其它分子或部分例如调节患者的胰岛素敏感性、体重、心脏病、高血压、神经病、细胞代谢和/或葡萄糖、胰岛素或其它激素水平的多肽、治疗性蛋白和/或分子(例如胰岛素和/或其它蛋白质(包括抗体))、肽或小分子。在具体的实施方案中，本发明的缀合物或融合物与胰岛素(或胰岛素衍生物、类似物、融合蛋白或促分泌素)组合给予。
本发明还提供本发明的缀合物或融合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途，例如上述任意一种疾病，例如代谢紊乱，例如高血糖症、糖尿病(1型或2型糖尿病或妊娠糖尿病)或肥胖症。
本发明还涉及本文所述的融合物或缀合物用于治疗、诊断或预防中的用途。
可进一步设计或格式化(formatted)本发明的融合物或缀合物(例如融合物的dAb组分)以具有较大的流体动力学尺寸来进一步延长半寿期，例如通过连接PEG基团、血清白蛋白、运铁蛋白、运铁蛋白受体或其至少运铁蛋白结合的部分、抗体Fc区，或者通过与抗体结构域缀合。例如，可将结合血清白蛋白的dAb设计成抗体的较大的抗原结合片段(例如设计成Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、IgG、scFv)。
在本申请公开的本发明的其它实施方案中，在本发明的融合物中可以取代使用“dAb”，预期技术人员可以取代使用包含dAb的CDR(例如Dom7h-14的CDR)的结构域，其与血清白蛋白结合(例如CDR嫁接在亲和体(affibody)、SpA支架、LDL受体A类结构域或EGF结构域等合适蛋白质支架或骨架上)。因此，本公开内容从整体来看可解释为提供这类结构域代替dAb的公开内容。
在某些实施方案中，本发明提供包含促胰岛素药物或肠降血糖素药物和双特异性配体或多特异性配体的本发明的融合物或缀合物，其包含结合血清白蛋白的本发明的第一dAb(例如Dom7h-14)，以及具有与第一dAb相同或不同的结合特异性的第二dAb和任选在多特异性配体的情况下具有更多的dAb。第二dAb(或更多的dAb)可任选结合不同的靶标，例如FgFr 1c，或CD5靶标。
因此，在一个方面，本发明提供本发明的融合物或缀合物用于通过胃肠外给药的递送，例如通过皮下、肌内或静脉内注射、吸入、经鼻递送、跨黏膜递送、口服递送、递送到患者的胃肠道、直肠递送或经眼递送。在一个方面，本发明提供本发明的融合物或缀合物在制备通过下列方式递送的药物中的用途：皮下注射、吸入递送、静脉内递送、经鼻递送、跨黏膜递送、口服递送、递送到患者的胃肠道、直肠递送或经眼递送。
在一个方面，本发明提供通过下列方式递送药物至患者的方法：皮下注射、经肺递送、静脉内递送、经鼻递送、跨黏膜递送、口服递送、递送到患者的胃肠道、直肠递送或经眼递送，其中所述方法包括给予患者药学上有效量的本发明的融合物或缀合物。
在一个方面，本发明提供包含本发明的融合物或缀合物的口服剂型、注射剂型、可吸入剂型、喷雾剂型或眼用剂型。剂型可以是片剂、丸剂、胶囊剂、液体制剂或糖浆剂。在一个方面，组合物可以口服给予，例如饮料，例如以治疗肥胖症的减肥饮料销售。在一个方面，本发明提供用于直肠递送给患者的剂型，例如可以提供作为栓剂的剂型。
例如，用于胃肠外给予GLP-1化合物的组合物可按照WO03/002136(通过引用结合到本文)中所述方法制备。
例如，用于经鼻给予某些肽的组合物可按照欧洲专利号272097(属于Novo Nordisk A/S)或WO 93/18785(均通过引用结合到本文)中所述方法制备。
术语“受治疗者”或“个体”在本文定义为动物，例如哺乳动物，包括但不限于灵长类(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛科动物、绵羊类、马科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿动物或鼠科动物种类。
本发明还提供用于给予受治疗者(例如患者)本发明的组合物(例如本发明的缀合物或融合物)的药盒，所述药盒包括组合物(例如本发明的缀合物或融合物)、递药装置和任选使用说明书。组合物(例如缀合物或融合物)可以剂型(例如冻干剂型)提供。在某些实施方案中，递药装置选自注射器、吸入器、鼻内或眼内给药装置(例如喷雾器(mister)、眼鼻点滴器)和无针注射装置。
可将本发明的组合物(例如缀合物或融合物)冻干以贮存，并在临用前用合适的载体复溶。可以采用任何合适的冻干方法(例如喷雾干燥、烘烤干燥(cake drying))和/或复溶技术。本领域技术人员应当了解的是，冻干和复溶可能导致抗体活性不同程度的损失，需要调节使用水平来弥补。在具体的实施方案中，本发明提供包含本文所述冻干(冷冻干燥)组合物(例如药物缀合物、药物融合物)的组合物。优选当再水化时，冻干(冷冻干燥)组合物(例如药物缀合物、药物融合物)的活性(例如血清白蛋白的结合活性)损失不超过约20％、或不超过约25％、或不超过约30％、或不超过约35％、或不超过约40％、或不超过约45％、或不超过约50％。所述活性是在组合物(例如药物缀合物、药物融合物)冻干之前，产生所述组合物的作用所需要的量。例如，要达到和维持所需血清浓度长达所需的一段时间所需要的缀合物或融合物的量。在冻干前，可以采用任何合适的方法测定组合物(例如药物缀合物、药物融合物)的活性，并且在再水化后采用相同方法测定活性损失的量，来确定活性。
本发明还提供包含本发明的融合物或缀合物的缓释剂型，这类缓释剂型可包含本发明的融合物或缀合物以及例如透明质酸、微球或脂质体和其它药学上或药理上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。这类缓释剂型可为例如栓剂的形式。
在一个方面，本发明提供包含本发明的融合物或缀合物和药学上或生理学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。
附图简述
图1图示氨基酸序列：(a)DAT0114(SEQ ID NO 1)，(b)DAT0115(SEQ ID NO 2)，(c)DAT0116(SEQ ID NO 3)，(d)DAT0117(SEQ IDNO 4)，(e)DAT0118(SEQ ID NO 5)，(f)DAT0119(SEQ ID NO 6)(g)DAT0120(SEQ ID NO 7)(h)Dom7h-14(SEQ ID NO 8)(dAb)(CDR用下划线表示)，(i)GLP-1 7-37A(8)G(SEQ ID NO 9)，(j)毒蜥外泌肽-4(SEQ ID NO 10)，(k)螺旋接头(SEQ ID NO 11)(l)Gly-ser接头(SEQ IDNO 12)。
图2图示核酸序列：(a)DAT0114(哺乳动物构建体)(SEQ ID NO13)，(b)DAT0115(哺乳动物构建体)(SEQ ID NO 14)，(c)DAT0115(优化的大肠杆菌(E.coli)构建体)(SEQ ID NO 15)，(d)DAT0116(哺乳动物构建体)(SEQ ID NO 16)，(e)DAT0116(优化的大肠杆菌构建体)(SEQ ID NO 17)，(f)DAT0117(哺乳动物构建体)(SEQ ID NO 18)，(g)DAT0117(优化的大肠杆菌构建体)(SEQ ID NO 19)，(h)DAT0118(哺乳动物构建体)(SEQ ID NO 20)，(i)DAT0119(哺乳动物构建体)(SEQID NO 21)，(j)DAT0120(哺乳动物构建体)(SEQ ID NO 22)，(k)Dom7h-14(SEQ ID NO 23)。
图3：(a)图示小鼠肥胖症模型中给予DAT0115后体重呈剂量依赖性的减轻，(b)图示小鼠肥胖症模型中给予DAT0115的每日摄食量。
图4：图示DAT0115的DSC：实线-DAT0115迹线，虚线-与非-2-态(non-2-state)模型拟合。
图5：图示溶菌酶的DSC：实线-溶菌酶迹线，虚线-与非-2-态模型拟合(迹线重叠，因此无法观察到虚线迹线)。
图6图示DAT0115的SEC MALLS。
图7：图示DAT0117的SEC MALLS。
图8：图示DAT0120的SEC MALLS。
发明详述
在本说明书中参照实施方案，以能够清楚明了地表达说明书的方式对本发明进行了描述。预期并且应当理解的是，在不偏离本发明的情况下，可对实施方案进行各种合并或分离。
除非另有说明，否则本文使用的所有科技术语都具有本领域(例如细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学)普通技术人员通常理解的含义。采用分子、遗传和生化方法(一般参见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等，ShortProtocols in Molecular Biology(1999)，第4版，John Wiley & Sons，Inc.均通过引用结合到本文中)和化学方法的标准技术。
本文使用的术语“促胰岛素药物”是指能够刺激激素胰岛素的合成或表达或者激素胰岛素的活性，或者引起对激素胰岛素的合成或表达或者激素胰岛素的活性的刺激的化合物。已知促胰岛素药物的实例包括但不限于例如葡萄糖、GIP、GLP、毒蜥外泌肽(例如毒蜥外泌肽-4和毒蜥外泌肽-3)、PYY和OXM。
本文使用的术语“肠降血糖素”是指当葡萄糖水平正常时，或者尤其当其升高时，引起胰岛素的释放量增加的胃肠激素类型。举例来讲，它们包括GLP-1、GIP、OXM、PYY、VIP和PP(胰多肽)。
本文使用的术语“类似物”当涉及多肽时是指修饰肽，其中肽的一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸残基取代和/或其中一个或多个氨基酸残基从肽中缺失和/或其中所述肽的一个或多个氨基酸残基缺失和/或其中一个或多个氨基酸残基添加到肽中。氨基酸残基的这类添加或缺失可发生在肽的N端和/或肽的C端，或者它们可以在肽内。一个简单体系用来描述GLP-1的类似物：例如GLP-1 A8G(7-37氨基酸)表示这样的GLP-1类似物：其中天然存在的位置8上的丙氨酸被甘氨酸残基取代。按照IUPAC-IUB命名法所采用的标准氨基酸单字母缩写词描述肽类似物及其衍生物的化学式。
本文使用的“片段”当提及多肽时，是指多肽具有与完整天然存在的多肽的氨基酸序列的部分相同并非完全相同的氨基酸序列。片段可以是“独立的(free-standing)”或包含在较大的多肽内，它们在单一较大的多肽中作为一个连续区段构成一个部分或区域。举例来说，天然存在的GLP-1的片段可以包括天然存在的氨基酸1-36中的氨基酸7-36。此外，多肽的片段还可以是天然存在的部分序列的变体。例如，包含天然存在的GLP-1的氨基酸7-30的GLP-1片段还可以是在其部分序列中具有氨基酸取代的变体。
本发明合适的促胰岛素药物的实例包括GLP-1、GLP-1衍生物、GLP-1类似物或GLP-1类似物的衍生物。此外，它们包括毒蜥外泌肽-4、毒蜥外泌肽-4类似物和毒蜥外泌肽-4衍生物或片段及毒蜥外泌肽-3、毒蜥外泌肽-3衍生物和毒蜥外泌肽-3类似物。
本文使用的术语“GLP-1”是指GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-38)、GLP-1(7-39)、GLP-1(7-40)、GLP-1(7-41)、GLP-1类似物、GLP-1肽、GLP-1衍生物或突变体或片段或GLP-1类似物的衍生物。这类肽、突变体、类似物和衍生物是促胰岛素药物。
例如GLP-1可以是GLP-1(7-37)A8G突变体，其氨基酸序列见图1(i)：SEQ ID NO 9。
更多的GLP-1类似物参见国际专利申请号90/11296(The GeneralHospital Corporation)，其涉及包含GLP-1(7-36)及其功能衍生物的肽片段，具有的促胰岛素活性超过GLP-1(1-36)或GLP-1(1-37)的促胰岛素活性，并且涉及其作为促胰岛素药物的用途(通过引用结合到本文中，特别是通过药物的实例用于本发明)。
国际专利申请号WO 91/11457(Buckley等)公开了活性GLP-1肽7-34、7-35、7-36和7-37的类似物，其还可用作本发明的GLP-1药物(通过引用结合到本文中，特别是通过药物或药剂的实例用于本发明)。
本文使用的术语“毒蜥外泌肽-4肽”是指毒蜥外泌肽-4(1-39)、毒蜥外泌肽-4类似物、毒蜥外泌肽-4肽的片段、毒蜥外泌肽-4衍生物或毒蜥外泌肽-4类似物的衍生物。这类肽、片段、类似物和衍生物是促胰岛素药物。毒蜥外泌肽-4(1-39)的氨基酸序列见图1(j)：SEQ ID NO10。
可用于本发明的更多的毒蜥外泌肽类似物参见PCT专利公布号WO 99/25728(Beeley等)、WO 99/25727(Beeley等)、WO 98/05351(Young等)、WO 99/40788(Young等)、WO 99/07404(Beeley等)和WO 99/43708(Knudsen等)(均通过引用结合到本文中，特别是通过药物的实例用于本发明)。
本文使用的“肽”是指约2-约50个氨基酸通过肽键连接在一起。
本文使用的“多肽”是指至少约50个氨基酸通过肽键连接在一起。多肽一般包含三级结构并折叠成为功能结构域。
本文使用的“展示系统”是指其中根据所需特征(例如物理、化学或功能特征)易于选择一批多肽或肽的系统。展示系统可以是合适的多肽库或肽库(例如在溶液中、固定在合适的支持体上)。展示系统也可以是采用细胞表达系统(例如在转化、感染、转染或转导细胞中表达核酸文库，并且在细胞表面展示编码多肽)或非细胞表达系统(例如乳液区室化与展示)的系统。示例性的展示系统将核酸的编码功能与由所述核酸编码的多肽或肽的物理、化学和/或功能特性联系起来。当采用这类展示系统时，可以选出具有所需要的物理、化学和/或功能特性的多肽或肽，并且可容易地分离或回收编码选定多肽或肽的核酸。将核酸的编码功能与多肽或肽的物理、化学和/或功能特性联系起来的多个展示系统是本领域已知的，例如噬菌体展示(bacteriophage display/phagedisplay，例如噬菌粒展示)、核糖体展示、乳液区室化与展示、酵母展示、嘌罗霉素展示、细菌展示、质粒上展示、共价展示等。(参见例如EP 0436597(Dyax)、美国专利号6,172,197(McCafferty等)、美国专利号6,489,103(Griffiths等))。
本文使用的“功能(性)”是指具有生物活性(例如特异性结合活性)的多肽或肽。例如，术语“功能性多肽”包括通过抗体的抗原结合部位结合靶抗原的抗体或其抗原结合片段。
本文使用的“靶配体”是指被多肽或肽特异性或选择性结合的配体。例如，当多肽为抗体或其抗原结合片段时，靶配体可以是任何所需要的抗原或表位。与靶抗原的结合取决于具有功能性的多肽或肽。
本文使用的抗体是指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段(例如Fab、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、致密构象多特异性抗体、二硫键连接的scFv、双链抗体)，不论是来源于任何物种天然产生的抗体，还是由重组DNA技术产生；不论是从血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母分离，还是从细菌分离。
本文使用的“抗体形式(antibody format)”是指任何合适的多肽结构，其中可掺入一个或多个抗体可变结构域，从而赋予该结构对抗原的结合特异性。多种合适的抗体形式是本领域已知的，例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同二聚体和异二聚体、前述任一种的抗原结合片段(例如Fv片段(例如单链Fv(scFv)、二硫键结合的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段)、单一抗体可变结构域(例如dAb、VH、VHH、VL)以及前述任一种的修饰形式(例如通过聚乙二醇共价连接的修饰或其它合适的多聚体或人源化VHH)。
表述“免疫球蛋白单一可变结构域”是指独立于其它V区或结构域而特异性结合抗原或表位的抗体可变结构域(VH、VHH、VL)。免疫球蛋白单一可变结构域存在形式之一可以具有其它可变区或可变结构域(例如同多聚体或杂多聚体)，其中所述其它区或结构域不是单一免疫球蛋白可变结构域结合抗原所必需的(即免疫球蛋白单一可变结构域独立于其它可变区结合抗原)。“结构域抗体”或“dAb”与本文使用的术语“免疫球蛋白单一可变结构域”相同。“单一免疫球蛋白可变结构域”与本文使用的术语“免疫球蛋白单一可变结构域”相同。“单一抗体可变结构域”与本文使用的术语“免疫球蛋白单一可变结构域”相同。在一个实施方案中，免疫球蛋白单一可变结构域是人抗体可变结构域，但是还包括得自其它物种的单一抗体可变结构域，例如啮齿动物(例如参见WO 00/29004，其内容通过整体引用结合到本文中)、大斑猫鲨和驼类(Camelid)VHH dAb。驼类VHH是免疫球蛋白单一可变结构域多肽，得自包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰驼和栗色羊驼在内的物种，其产生天然缺乏轻链的重链抗体。VHH可以是人源化的。
“结构域”是折叠的蛋白质结构，具有独立于蛋白质其余部分的三级结构。结构域一般负责蛋白质的分立的功能性质，在许多情况下可以添加、剔除或转移到其它蛋白质上而又不丧失蛋白质和/或结构域的其余部分的功能。“单一抗体可变结构域”是折叠的多肽结构域，包含特有的抗体可变结构域序列。因此它包括整个抗体可变结构域和修饰可变结构域，例如，其中一个或多个环被不是抗体可变结构域所特有的序列置换，或者被截短或包含N端突出端或C端突出端的抗体可变结构域，以及可变结构域的折叠片段，其至少保持结合活性和全长结构域的特异性。
术语“文库”是指异源多肽或核酸的混合物。文库由多个成员组成，每个成员都具有单一的多肽序列或核酸序列。就此而言，“文库”与“库”是同义的。文库成员之间的序列差异负责文库中存在的多样性。文库可呈多肽或核酸的简单混合物的形式，或者可以呈用核酸文库转化的生物体或细胞的形式，例如细菌、病毒、动物或植物细胞等。在一个实施方案中，每个生物体或细胞只含有一个或有限数目的文库成员。在一个实施方案中，核酸被掺入表达载体，以供由核酸编码的多肽的表达。因此，在一个方面，文库可以呈一群宿主生物体的形式，每个生物体含有一个或多个拷贝的表达载体，所述载体含有文库的核酸形式的一个成员，可被表达产生其相应的多肽成员。因此，宿主生物体群具有编码大量不同多肽库的潜力。
本文使用的术语“剂量”是指全部一次(单位剂量)或者在规定时间间隔内分两次或更多次给予受治疗者的融合物或缀合物的量。例如，剂量可以是指在一天(24小时)(日剂量)、2天、1周、2周、3周或者一个月或更多个月的进程中给予受治疗者的融合物或缀合物的量(例如通过一次给药，或者通过两次或更多次给药)。剂量之间的间隔可以是任何需要的时间量。
表述“半寿期”是指例如由于天然机制引起的体内降解和/或清除或螯合所致，融合物或缀合物的血清或血浆浓度降至50％的时间。本发明的融合物或缀合物在体内是稳定的，且其半寿期通过与抵抗降解和/或清除或螯合的血清白蛋白分子(例如人血清白蛋白(HSA))结合而延长。这些血清白蛋白分子是天然存在的蛋白质，其本身在体内的半寿期长。对延长半寿期的分子非特异性的类似分子相比，如果某一分子的功能活性在体内持续时间更长，则该分子的半寿期延长。例如，将包含对人血清白蛋白(HSA)有特异性的dAb和肠降血糖素药物或促胰岛素药物(例如GLP-1或毒蜥外泌肽)的本发明的融合物或缀合物与其中不存在对HSA的特异性(也就是不结合HSA但结合其它分子)的相同配体进行比较。例如，它可能结合细胞上的第三靶标。本发明的融合物或缀合物的半寿期通常增加10％、20％、30％、40％、50％以上。半寿期延长2x、3x、4x、5x、10x、20x、30x、40x、50x是可能的。或者，半寿期延长高达30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x是可能的。
本文使用的“流体动力学尺寸”是指基于分子通过水溶液扩散的分子(例如蛋白质分子、配体)的表观尺寸。可对蛋白质通过溶液的扩散或运动进行处理来推导蛋白质的表观尺寸，其中尺寸用蛋白质颗粒的“斯托克斯半径(Stokes radius)”或“液体动力学半径”给出。蛋白质的“流体动力学尺寸”取决于质量和形状(构象)两者，使得具有相同分子量的两种蛋白质可能根据蛋白质的总体构象而具有不同的流体动力学尺寸。
两个序列之间“同源性”或“同一性”或“相似性”(有关术语在本文中互换使用)的计算如下进行。对序列进行比对用于最佳比较目的(例如可以在第一和第二氨基酸或核酸序列的一个或两个中引入空位用于最佳比对，出于比较目的可以忽略非同源序列)。在一个实施方案中，出于比较目的比对的参比序列的长度是该参比序列长度的至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、80％、90％、100％。然后对在相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸进行比较。如果第一序列中某一位置由第二序列相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据，则所述分子在该位置上是相同的(本文使用的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。考虑两个序列最佳比对需要引入的空位的数目和各个空位的长度，两个序列之间的百分比同一性是所述序列共有的相同位置数的函数。应用算法BLAST2Sequences，采用默认参数，来准备并确定本文定义的氨基酸和核苷酸序列比对和同源性、相似性或同一性(Tatusova，T.A.等，FEMSMicrobiol Lett，174：187-188(1999))。
核酸、宿主细胞：
本发明涉及编码本文所述的本发明的融合物(例如由SEQ ID NO13-23编码的融合物)的分离和/或重组核酸。
本文所称的“分离(的)”核酸是与其原有环境中(例如在细胞中或在核酸的混合物中，例如文库)的其它物质(例如其它核酸，例如基因组DNA、cDNA和/或RNA)分离的核酸。分离核酸可以作为载体的组成部分(例如质粒)而被分离。
本文所称的“重组”核酸是通过重组DNA方法产生的核酸，包括依靠人工重组的方法，例如采用限制性内切酶、同源重组、病毒等方法，例如克隆至载体或染色体中；以及采用聚合酶链式反应(PCR)制备的核酸。
本发明还涉及包含(一个或多个)重组核酸或表达构建体的重组宿主细胞，例如哺乳动物或微生物，所述重组核酸或表达构建体包含编码本文所述的本发明的融合物的核酸。本文还提供制备本文所述的本发明的融合物的方法，所述方法包括在适于表达融合物多肽的条件下维持本发明的重组宿主细胞，例如哺乳动物或微生物。如有需要，所述方法可另包括分离或回收融合物的步骤。
例如，可以采用适于选定的宿主细胞的任何方法(例如转化、转染、电穿孔、感染)，将编码本发明的融合物多肽的核酸分子(即一个或多个核酸分子)，或者包含这类核酸分子的表达构建体(即一个或多个构建体)导入合适的宿主细胞中产生重组宿主细胞，使得核酸分子与一个或多个表达控制元件有效连接(例如在载体中、在通过细胞内加工所产生的构建体中、整合到宿主细胞基因组)。可以将所得到的重组宿主细胞维持在适于表达的条件(例如在诱导物存在下、在合适的动物中、在补充了适当盐分、生长因子、抗生素、营养补充剂等的合适培养基中)下，从而产生编码的肽或多肽。如有需要，可以分离或回收编码的肽或多肽(例如从动物、宿主细胞、培养基、乳汁分离或回收)。该方法包括在转基因动物的宿主细胞中表达(参见例如WO 92/03918，GenPharm International)。
本文所述的本发明的融合物多肽还可以在合适的体外表达系统中产生，例如通过化学合成或通过任何其它合适的方法。
如本文所描述和举例说明的一样，本发明的融合物或缀合物一般以高亲和力结合血清白蛋白。
例如，本发明的融合物或缀合物可以约5微摩尔-约100pM，例如约1微摩尔-约100pM，例如400-800nm，例如约600nm的亲和力(KD；KD＝Koff(kd)/Kon(ka)[通过表面等离子共振测定)结合人血清白蛋白。
本发明的融合物或缀合物可以在大肠杆菌中或在毕赤酵母(Pichia)菌种(例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))中表达。在一个实施方案中，当在大肠杆菌或毕赤酵母菌种(例如巴斯德毕赤酵母)、或在哺乳动物细胞培养物中(例如CHO，或HEK 293细胞)表达时，以至少约0.5mg/L的量分泌融合物。虽然当本文所述的融合物或缀合物在大肠杆菌或毕赤酵母菌种或哺乳动物细胞中表达时是可分泌的，但是它们可采用任何合适的方法制备，例如合成化学方法或不使用大肠杆菌或毕赤酵母菌种的生物生产方法。
在某些实施方案中，本发明的融合物和缀合物当给予有效量时，在动物模型中是有效的，例如WO 2006/059106中披露的动物模型(例如公布的WO 2006/059106第104-105页)或本文实施例中描述的动物模型。有效量一般为约0.0001mg/kg-约10mg/kg(例如约0.001mg/kg-约10mg/kg、例如约0.001mg/kg-约1mg/kg、例如约0.01mg/kg-约1mg/kg、例如约0.01mg/kg-约0.1mg/kg)。疾病模型是本领域技术人员公认的，用于预测在人体中的治疗功效。
一般来讲，本发明的融合物和缀合物可以纯的形式与药学上或生理学上合适的载体一起使用。这些载体通常可包括任何包括盐水和/或缓冲介质在内的水溶液或含醇/水溶液、乳液或悬浮液。胃肠外溶媒可包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖(Ringer′s dextrose)、葡萄糖和氯化钠及乳酸盐化林格氏液。如果需要将多肽复合物保持在悬浮液中，则可从羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐等增稠剂选择合适的生理学上可接受的辅助剂。
静脉用溶媒包括液体及营养补充物和电解质补充物，例如林格氏葡萄糖型补充物。还可存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack(1982)Remington′s PharmaceuticalSciences，第16版)。可以使用多种合适的剂型，包括缓释剂型。
本发明的药物组合物的给药途径可以是本领域普通技术人员通常已知的任何给药途径。对于疗法，可以根据标准技术，给予任何患者本发明的药物融合物或缀合物。
可以通过任何合适的方式给药，包括胃肠外、静脉内、肌内、腹膜内、口服、经皮、经由肺途径，或者适当时，用导管直接输注。剂量和给药频率将取决于患者的年龄、性别和健康状况、同时给予的其它药物、禁忌症和临床工作人员要考虑的其它参数。根据适应情况，给药可以是局部性的或是全身性的。
在一个实施方案中，本发明提供用于递送至肺部的经肺剂型，其包含(a)本发明的缀合物和融合物，和(b)药学上可接受的缓冲剂，且其中所述组合物包含液滴，且组合物中存在约40％以上(例如50％以上)的液滴，其大小范围为小于约6微米，例如约1微米-约6微米，例如小于约5微米，例如约1-约5微米。例如这些组合物尤其适于通过直接性局部经肺递送而给予受治疗者。例如，这些组合物可以直接给予肺部，例如通过吸入法，例如通过使用喷雾器装置。经肺递送的这些组合物可包含生理学上可接受的缓冲液，其pH范围介于约4-约8之间，例如约7-约7.5，且粘度约等于含有1.2％(w/v)蔗糖的约2％-约10％PEG 1000的50mM磷酸缓冲液的溶液粘度。
可将本发明的融合物或缀合物冻干以贮存，并且在临用前用合适的载体复溶。已经证实该技术对于常规免疫球蛋白是有效的，可以采用现有技术已知的冻干和复溶技术。本领域技术人员应当了解的是，冻干和复溶可能导致抗体活性不同程度的损失(例如对于常规免疫球蛋白，比起IgG抗体，IgM抗体的活性损失往往较大)，必需调节升高使用水平予以弥补。
对于预防运用，例如当给予患有前驱糖尿病或胰岛素抵抗的个体时，还可以相似或略为较低的剂量给予含有本发明的融合物或缀合物的组合物来预防、抑制或延迟疾病的发生(例如保持缓解或静止，或防止急性期)。临床技术人员将能够确定治疗、抑制或防止疾病的适当的给药间隔。当给予本发明的融合物或缀合物治疗、抑制或防止疾病时，可以给予多达每天四次、每周两次、每周一次、每两周一次、一月一次或每两月一次，剂量为例如约0.0001mg/kg-约10mg/kg(例如约0.001mg/kg-约10mg/kg、例如约0.001mg/kg-约1mg/kg、例如约0.01mg/kg-约1mg/kg、例如约0.01mg/kg-约0.1mg/kg)。
与治疗前的这类症状相比，或者与未用这类组合物或其它适当对照治疗的个体(人或模型动物)的这类症状相比，如果一种或多种症状减轻(例如达至少10％或临床评价量表中的至少一分)，则使用本文所述组合物进行的治疗或疗法被视为“有效”。症状显然将随所靶定的疾病或病症的确切性质而改变，但是普通临床工作人员或技术人员仍可测定。
同样，与未用组合物治疗的相似个体(人或动物模型)的这类症状相比，如果一种或多种症状的发生或严重程度延迟、减轻或消除，则使用本文所述组合物进行的预防是“有效的”。
本发明的融合物和缀合物可以作为单独给予的组合物使用，或者可与其它治疗剂或活性剂(例如其它多肽或肽或小分子)联用。这些其它的药剂可包括各种药物，例如二甲双胍、胰岛素、格列酮类(例如罗格列酮(rosaglitazone))、免疫抑制剂、免疫刺激剂。
本发明的融合物和缀合物与一种或多种其它治疗剂/活性剂一起给予和/或配制在一起。当本发明的融合物或缀合物与其它治疗剂一起给予时，融合物或缀合物可在其它治疗剂给药之前、同时、一起或之后给予。本发明的融合物或缀合物和其它治疗剂一般以提供重叠的治疗效果的方式给予。
半寿期：
延长促胰岛素药物或肠降血糖素药物(例如GLP-1或毒蜥外泌肽配体)的半寿期对于体内应用是有益的。本发明通过提供体内半寿期延长的促胰岛素药物或肠降血糖素药物(例如GLP和毒蜥外泌肽)并且这些分子的功能活性因此在机体内有较长的持续时间，从而解决了这个问题。
如本文所述，与单独的促胰岛素药物或肠降血糖素药物相比，本发明的组合物(即包含本文所述的融合物或缀合物)可显著地延长体内血清或血浆半寿期和/或增加AUC和/或延长平均驻留时间(MRT)。另外，促胰岛素药物或肠降血糖素药物的活性在本发明的组合物(例如缀合物或融合物)中一般来说基本上不改变。然而，本发明组合物的活性与单独的促胰岛素药物或肠降血糖素药物相比的某些改变是可接受的，并且一般通过改进本发明的缀合物或融合物的药代动力学性质而得到弥补。例如，本发明的药物缀合物或融合物以比单独的药物低的亲和力结合药物靶，但是由于药物组合物的药代动力学性质得到改进(例如延长的体内血清半寿期、较大的AUC)，因此与单独的药物相比时，具有大致相等或较好的功效。另外，由于本发明的缀合物或融合物的半寿期延长，与单独的促胰岛素药物或肠降血糖素药物相比，它们可以较低频率给药，例如将它们以一月一次或一周一次给予患者，并且与仅给予促胰岛素药物或肠降血糖素药物相比，它们还在血液中保持较恒定的促胰岛素药物或肠降血糖素药物水平，从而达到所需要的治疗或预防效果。
药代动力学分析和配体半寿期测定方法为本领域技术人员所熟知。有关详情可参见Kenneth，A等：Chemical Stability ofPharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists和Peters等，Pharmacokinetc analysis：A Practical Approach(1996)。还可参照“Pharmacokinetics”，M Gibaldi和D Perron，Marcel Dekker出版，第2版，前版本修订版(1982)，其中披露了药代动力学参数，例如tα和tβ半寿期及曲线下面积(AUC)。
半寿期(t1/2α和t1/2β)及AUC和MRT可以从配体的血浆或血清浓度相对于时间的曲线确定。可以运用WinNonlin分析包(可获自Pharsight Corp.，Mountain View，CA94040，USA)，例如制作曲线模型。在第一期(α期)，配体主要在患者体内进行分布，其中一些排除。第二期(β期)是末期，此时配体已经完成分布，并且血清浓度随配体从患者体内清除而下降。tα半寿期是第一期的半寿期，tβ半寿期是第二期的半寿期。此外，还可应用本领域众所周知的非区室拟合模型来测定半寿期。
在一个实施方案中，本发明提供清除半寿期(例如在人体内)的范围约12小时以上、例如约12小时-约21天、例如约24小时-约21天、例如约2-8天、例如约3-4天的本发明的融合物或缀合物。
还可将本发明的融合物或缀合物进一步设计或格式化成具有较大的流体动力学尺寸，例如通过与PEG基团、血清白蛋白、运铁蛋白、运铁蛋白受体或至少其运铁蛋白结合部分、抗体Fc区连接，或者通过与抗体结构域缀合。
流体动力学尺寸可采用本领域众所周知的方法测定。例如，凝胶过滤层析法可以用来测定配体的流体动力学尺寸。用于测定配体的流体动力学尺寸的合适的凝胶过滤基质(例如交联琼脂糖基质)是众所周知且易获得的。
本发明的组合物，即包含本文所述的融合物和缀合物的组合物，提供若干进一步的优势。结构域抗体组分是非常稳定的，较抗体和抗体的其它抗原结合片段小，通过在大肠杆菌或酵母(例如巴斯德毕赤酵母)中表达可以高收率产生，且结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段可容易地从来源于人的文库或从任何理想的物种中选择。因此，与一般在哺乳动物细胞(例如人、人源化或嵌合抗体)中产生的治疗剂相比，包含结合血清白蛋白的dAb的本发明的组合物可更容易地产生，并且可以使用无免疫原性的dAb(例如人dAb可用于治疗或诊断人的疾病)。
当促胰岛素药物或肠降血糖素药物是含有dAb结合血清白蛋白的药物组合物的组成部分时，促胰岛素药物或肠降血糖素药物的免疫原性可降低。因此，本发明提供融合物或缀合物组合物，其可具有较少免疫原性(与例如单独的促胰岛素药物或肠降血糖素相比)或在含有结合血清白蛋白的dAb的药物组合物的情况下可基本上无免疫原性。因此，可以随时间推移重复给予受治疗者这类组合物，同时由受治疗者免疫系统产生的抗药抗体所致的功效损失最小。
另外，与单独的促胰岛素药物或肠降血糖素相比，本文所述缀合物或融合物组合物的安全特性可能提高，副作用降低。例如，由于dAb的血清白蛋白结合活性所致，本发明的融合物和缀合物在血管循环中的停留时间延长。另外，本发明的融合物和缀合物在全身给药(例如血管内给药)后，基本上不能够穿越血脑屏障并在中枢神经系统中蓄积。因此，与单独的促胰岛素药物或肠降血糖素药物相比，给予本发明的融合物或缀合物具有较大安全性且副作用降低。同样，与单独的所述药物相比，融合物或缀合物对特定器官(例如肾或肝)的毒性降低。
实施例：
实施例1：GLP-1(A8G)或毒蜥外泌肽-4和DOM7h-14 AlbudAb的遗传融合物的表达
将在位置8的丙氨酸被甘氨酸置换的毒蜥外泌肽-4或GLP-1(7-37)([Gly8]GLP-1)作为与DOM7h-14(一种结合血清白蛋白的结构域抗体(dAb)(albudab)，其氨基酸序列见下文)的融合物克隆至pTT-5载体(可获自CNRC，Canada)中。在每种情况下，GLP-1或毒蜥外泌肽-4位于构建体的5’端，dAb位于3’端。用图1(A-G)中所示氨基酸序列制备了总共7个构建体(DAT0114、DAT0115、DAT0116、DAT0117、DAT0118、DAT0119、DAT0120)。不存在接头、或者存在gly-ser接头(G4S)或螺旋接头(Arai，R.，H.Ueda等(2001)。″Design ofthe linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusionprotein(设计有效分离双功能融合蛋白的结构域的接头).″Protein Eng14(8)：529-32.456)或有由在GLP-1或毒蜥外泌肽-4和dAb之间的第二GLP-1部分组成的接头。所包括的接头作为间隔基，将GLP-1或毒蜥外泌肽-4在空间上与dAb分隔开以防止在GLP-1或毒蜥外泌肽-4与GLP-1受体之间的结合出现位阻现象。构建体的序列见图1(A-G)。
采用碱性裂解在大肠杆菌中制备无内毒素的DNA(使用无内毒素的质粒Giga试剂盒，可获自Qiagen CA)，并用来转染HEK293E细胞(可获自CNRC，Canada)。使用每培养瓶333μl 293fectin(Invotrogen)和250μg DNA，以1.75x106个细胞/ml，转染至250ml/培养瓶的HEK293E细胞中，并且于30℃表达5天。离心收获上清液后，通过亲和纯化法在蛋白质L上进行纯化。蛋白质成批与装填在柱中的树脂结合，用10柱体积的PBS洗涤。蛋白质用50ml 0.1M甘氨酸(pH 2)洗脱，用Tris(pH 8)中和。用SDS-PAGE凝胶鉴定预期大小的蛋白质，大小见下表1。
表1：DAT0114、DAT0115、DAT0116、DAT0117、DAT0118、DAT0119、DAT0120构建体的分子量
  融合蛋白   预期分子量
  DAT0114   18256
  DAT0115   16896
  DAT0116   15950
  DAT0117   19798
  DAT0118   15936
  DAT0119   15318
  DAT0120   18895
实施例2：表示结合血清白蛋白的GLP-1和毒蜥外泌肽-4 AlbudAb融合物：
通过表面等离子共振(Biacore AB，可获自GE Healthcare)对GLP-1和毒蜥外泌肽-4 AlbudAb融合物进行了分析，获得有关亲和力的信息。使用用血清白蛋白包被的CM5 Biacore芯片(羧甲基化葡聚糖基质)进行了分析。将约1000共振单位(resonance unit，RU)的每种待测血清白蛋白(人、大鼠和小鼠血清白蛋白)在乙酸缓冲液(pH 5.5)中固定。Biocore AB的流动吸收池1是未包被、封闭的阴性对照，流动吸收池2用人血清白蛋白(HSA)(815RU)包被，流动吸收池3用大鼠血清白蛋白(RSA)(826RU)包被，流动吸收池4用小鼠血清白蛋白(MSA)(938RU)包被。使各种受测融合物分子在如上述实施例中所述的哺乳动物组织培养物中表达。
通过稀释至BIACORE HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES(pH 7.4)、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20)并且流经BIACORE芯片来制备各种浓度的融合物分子(以16nM-2μM的范围)。
将结合速率和解离速率曲线拟合至KD区域中由dAb的浓度所产生的迹线，由BIACORE迹线计算亲和力(KD)。将亲和力(KD)概括于下表2中：
表2：与人、大鼠和小鼠血清白蛋白结合的GLP-1和毒蜥外泌肽-4AlbudAb
Figure BPA00001271918400251
上述结果表明，融合物分子保持与所有类型的血清白蛋白结合的能力，这就表明很可能在体内具有延长的半寿期。
实施例3：GLP-1和毒蜥外泌肽-4 AlbudAb融合物在GLP-1受体结合测定法(GLP-1R BA)中具有活性：
将融合物经缓冲液交换至100mM NaVl、20mM柠檬酸(pH 6.2)中。同时，以2x105个细胞/ml将CHO 6CRE GLP1R细胞(CHO K1细胞(可获自美国典型组织保藏中心(American Type Tissue Collection，ATCC))，用驱动萤光素酶报道基因的6个cAMP应答元件并且同时用人GLP-1受体稳定转染)接种在悬浮培养基中。保持悬浮培养24小时。然后将细胞稀释至含有2mM L谷氨酰胺(2.5x105个细胞/ml)的15mM HEPES缓冲液(可获自Sigma)中，分配到装有10μl/孔待测化合物的384孔板中。在加入实验对照后，将板放回37℃和5％CO2的培养箱中达3小时。孵育后，按照试剂盒中所述方法，将稳定的glo萤光素酶底物(可获自Promega)加入各孔中，板用自粘式封板器(WeberMarking Systems Inc.目录号607780)密封。将板放入读数器(Viewlux，Perkin Elmer)中，预孵育5分钟后，读取荧光，并将结果绘图。在10μM白蛋白存在或不存在时对各种浓度的化合物进行了测定，在有和没有白蛋白时，对剂量反应曲线进行拟合。计算EC50，概括于下表3。
表3：GLP-1受体结合测定法(GLP-1R BA)中GLP-1和毒蜥外泌肽-4AlbudAb融合物的活性
Figure BPA00001271918400261
上述结果表明，所有经测试的融合物分子都保持与GLP-1受体结合的潜能。结果还表明在血清白蛋白存在时也保持这种潜能。因此，这些融合物分子很可能在体内保持结合GLP-1受体的能力。
实施例4：在HEK 293哺乳动物组织培养物中表达DAT0115、DAT0116、DAT0117和DAT0120，然后通过蛋白质L亲和俘获和离子交换层析法进行纯化：
本实验的目的是产生用于体内和体外表征的蛋白质。蛋白质在HEK 293E细胞的哺乳动物组织培养物中由前述pTT-5载体表达。简单地说，制备不含内毒素的DNA，纯化后用来转染HEK293E细胞。蛋白质表达在振荡培养箱于30℃进行5天，将培养物离心，收获上清液(含有目标蛋白质)。通过蛋白质L琼脂糖层流亲和树脂(树脂，GEHealthcare；实验室偶联蛋白质L)上的亲和俘获，从上清液中纯化出蛋白质。然后用10柱体积的PBS洗涤树脂，再用5柱体积的0.1M甘氨酸(pH 2.0)洗脱蛋白质。用1柱体积的1M Tris甘氨酸(pH 8.0)中和。在此情况下(与前述实施例不同)，然后进行进一步的纯化。将蛋白质(tris-甘氨酸溶液)经缓冲液交换至20mM乙酸(pH 5.0)中后，使用Akta在1个(或2个，平行实验)用20mM乙酸(pH 5.0)预平衡的6ml resourceS柱(GE healthcare)中加样。用相同缓冲液洗涤后，蛋白质经由0-0.75M或0-1M NaCl梯度/20mM乙酸(pH 5.0)洗脱。然后通过SDS-PAGE电泳法和质谱法鉴定适当大小的流分，然后合并制备最终的蛋白质样品。然后将蛋白质经缓冲液交换至20mM柠檬酸(pH 6.2)、100mMNaCl中，并浓缩至0.5mg/ml和5mg/ml之间。将蛋白质经0.2μM过滤器过滤以确保无菌。蛋白质然后用于下述实施例。
实施例5：DAT0115、DAT0116、DAT0117和DAT0120进行1、3和6次冻融循环后的稳定性比较：
本项研究的目的是比较DAT0115、DAT0116、DAT0117和DAT0120经1、3和6次冻融循环的稳定性。每种蛋白质在HEK 293E细胞的哺乳动物组织培养物中由pTT-5载体表达，如上所述在蛋白质L亲和树脂上进行纯化，接着进行离子交换层析法。将蛋白质经缓冲液交换至20mM柠檬酸、100mM NaCl中后，用相同缓冲液稀释为0.5mg/ml。然后将0.5ml等分量的每种蛋白质(微量离心管中)进行0、1、3或6次冻融循环，每次循环包括在干冰上3分钟，接着在37℃水浴中2分钟。(在实验期间观察到，在37℃下2分钟足够使蛋白质溶液完全融化)。在完成所需要的冻融循环次数后，将蛋白质样品保存在2-8℃下直到进一步分析。然后通过SDS PAGE电泳法、GLP-1R结合测定法、Superdex 75柱大小排阻层析法和质谱法对蛋白质进行了分析。观察到经过1、3或6次冻融循环，所有四种蛋白质的SDS-PAGE谱、GLP-1R BA的潜能和质谱与基线相比没有显著变化。SEC分析中的最大峰高受影响，对于DAT0115、DAT-116、DAT0117和DAT0120，在6次冻融循环后所保持的最大高度分别为78％、86％、104％和57％。可以得出结论，比起其它三种蛋白质，DAT0120对冻融循环较不稳定。
表4：DAT0115、DAT0116、DAT0117和DAT0120经1、3和6次冻融循环的稳定性比较结果
  样品   冻融循环数  峰高(mAU)   ％最大峰高
  DAT0115   0  49   100％
  DAT0115   1  43   89％
  DAT0115   3  40   82％
  DAT0115   6  38   78％
  DAT0116   0  29   100％
  DAT0116   1  28   95％
  DAT0116   3  26   91％
  DAT0116   6  25   86％
  DAT0117   0  34   100％
  DAT0117   1  34   99％
  DAT0117   3  35   103％
  DAT0117   6  35   104％
  DAT0120 0   0  35   100％
  DAT0120 1   1  24   70％
  DAT0120 3   3  21   59％
  DAT0120 6   6  20   57％
实施例6：在II型糖尿病db/db小鼠模型中证实DAT0115的持续作用：
本项研究的目的是测定DAT0115对db/db小鼠口服葡萄糖耐量的作用持续时间。在开始实验前三天通过降低葡萄糖水平对动物进行分选，然后分批。将每批中的一只动物分配到26个研究组的每一组中。这就确保了在每个研究组中平均起始葡萄糖水平相似。
在口服葡萄糖负荷前5小时、24小时、48小时、72小时、96小时或120小时，以1mg/Kg、0.3mg/Kg或0.1mg/Kg皮下给予DAT0115(按上述方法在HEK293细胞中产生并纯化)。(不是在每个时间点都给予所有剂量，有关详情见下表)。对于0.1mg/Kg和0.3mg/Kg剂量在达到并包括24小时的时间点上，以及对于1mg/Kg剂量在达到并包括72小时的时间点上，与溶媒治疗的db/db小鼠相比，在口服葡萄糖耐量试验(OGTT)的2小时时间内，DAT0115显著降低葡萄糖AUC。作为阳性对照以42μg/Kg给予的毒蜥外泌肽-4，在口服葡萄糖药丸前5小时给予时，在OGTT后同样显著降低葡萄糖AUC。下表5表示与溶媒相比，各个DAT0115研究组AUC降低的百分比。星号表示采用错误发现率校正与溶媒比较的DAT0115的P＜0.05。
表5：表示各个DAT0115研究组与溶媒相比的AUC降低百分比。(星号表示采用错误发现率校正与溶媒比较的DAT0115的P＜0.05)
Figure BPA00001271918400291
实施例7：DAT0115在饮食诱发的肥胖(DIO)小鼠肥胖症模型中的功效确证：
本项研究的目的是使用已建立的小鼠饲养模型(饮食诱发的肥胖小鼠)确定摄食量并因此产生的体重是否受DAT0115治疗的影响。这可以用于人的预测。雄性C57Bl/6小鼠(购自Taconic)用60％kcal高脂肪的辐射照射后的食物喂肥12周，然后转移到实验室内部设施中。抵达时，将小鼠在控制温度和湿度的房间(70-72℉，湿度＝48-50％，5AM/5PM光照周期)内各个关养在α-dri垫料上。将食物更换为45％高脂肪食物，使动物适应环境18天。在给予试验化合物前，一天一次给小鼠皮下注射盐水达3天，监测摄食量。将小鼠分批后分组，使得在组间或组内的体重和摄食量无差异。在研究当天，使用5ml/kg注射体积，如下皮下给予每组8只小鼠：三组给予DAT0115(低、中和高剂量)，一组给予阴性对照分子(DOM7h-14 AlbudAb，但是无毒蜥外泌肽4缀合物)，一组给予毒蜥外泌肽-4阳性对照。
表6：确定DAT0115在饮食诱发的肥胖(DIO)小鼠的肥胖症模型中的功效的方案
Figure BPA00001271918400301
每天测量每日摄食量和体重达10天。与DOM7h-14对照相比，DAT0115显示体重和摄食量呈剂量依赖性的降低(参见图3a和图3b)。因此得出结论，这项小鼠研究的数据支持DAT0115将是良好的临床候选药的设想。
实施例8：II型糖尿病小鼠模型中DAT0115、DAT0116和DAT0117的血浆半寿期的测定
本项研究的目的是测定II型糖尿病小鼠模型(db/db小鼠)中DAT0115、DAT0116和DAT0117的血浆清除特征，并且从结果计算PK参数。按照较早描述的方法制备DAT0115、DAT0116和DAT0117蛋白：简单地说，使用HEK293E细胞在哺乳动物组织培养物中表达蛋白质，使用蛋白质L-琼脂糖亲和树脂成批吸收，接着用甘氨酸(pH2.0)洗脱后用Tris(PH 8.0)中和从而纯化。随后是Resource S柱离子交换层析法(使用0-1M盐梯度/20mM乙酸(pH 5.0))。然后合并含有所需蛋白质的流分，经缓冲液交换至100mM NaCl、20mM柠檬酸(pH 6.2)中。将蛋白质过滤除菌，经缓冲液交换，并除去内毒素，体内使用前测定。
未禁食雄性db/db小鼠(瘦蛋白受体的LEPr db纯合子小鼠缺陷型，具有瘦蛋白受体基因(lepr)突变)组经皮下或静脉内给予1mg/KgDAT0115、DAT0116或DAT0117。在给药前、在静脉内给药后0.25小时、0.5小时、1小时、4小时、7小时、12小时、24小时、36小时、48小时和60小时；以及在给药前、在皮下给药后0.5小时、1小时、4小时、7小时、12小时、24小时、36小时、48小时和60小时，通过尾部放血(terminal bleed)采集血样，并制备血浆。将血浆样品冷冻，稍后解冻用于DAT0115、DAT0116或DAT0117水平的分析，适当时通过固相萃取法和LC/MS/MS检测蛋白质片段(来自蛋白质的毒蜥外泌肽4部分)的存在。然后运用WinNonLin软件，使用计算的血浆水平拟合药代动力学参数。将皮下和静脉内给药后的半寿期和生物利用度概括于下表。由结果(见下表7)可以断定，在II型糖尿病小鼠模型中所有三种化合物具有所需要的药代动力学参数。因此，这些分子在糖尿病病人中都有可能具有良好的PK参数，本研究支持选择DAT0115或DAT0116优于选择DAT0117。
表7：II型糖尿病小鼠模型中DAT0115、DAT0116和DAT0117的血浆半寿期
Figure BPA00001271918400321
实施例9：在大鼠中测定DAT0115、DAT0116、DAT0117的血浆半寿期：
本项研究的目的是测定大鼠中DAT0115、DAT0116和DAT0117的血浆清除特征并从结果计算PK参数。DAT0115、DAT0116和DAT0117蛋白按照较早描述的方法制备：简单地说，使用HEK293E细胞在哺乳动物组织培养物中表达蛋白质，使用蛋白质L-琼脂糖亲和树脂成批吸收，接着用甘氨酸(pH 2.0)洗脱后用Tris(PH 8.0)中和从而纯化。随后是Resource S柱离子交换层析法(使用0-1M盐梯度/20mM乙酸(pH 5.0))。然后合并含有所需蛋白质的流分，经缓冲液交换至100mM NaCl、20mM柠檬酸(pH 6.2)中。将蛋白质过滤除菌，经缓冲液交换，体内使用前进行定量测定(Qced)。
为了测定血浆半寿期，给各组3只大鼠静脉内(iv)或皮下(s.c)一次注射0.3mg/Kg(iv)或1.0mg/Kg(sc)的DAT0115、DAT0116或DAT0117。在72小时内，通过从尾静脉放血，来获得血浆样品，通过LC/MS/MS分析以测定融合物片段(得自融合物的毒蜥外泌肽4部分)的存在。然后运用WinNonLin软件，使用计算的血浆水平拟合药代动力学参数。将皮下和静脉内给药后的半寿期和生物利用度概括于下表8中。由结果可以断定，在大鼠中所有三种化合物都具有需要的药代动力学参数。因此，所有这些分子在人体中都有可能具有良好的PK参数，本项研究支持选择DAT0115优于选择DAT0116或DAT0117。
表8：皮下和静脉内给药后的半寿期和生物利用度
Figure BPA00001271918400331
实施例10：猕猴中DAT0115的血浆半寿期的测定：
本项研究的目的是测定DAT0115在非人类灵长类(猕猴)的药代动力学参数，从而可以比率缩小参数以及给出DAT0115在人体中是否可能具有良好PK特征的最佳指标。DAT0115毒蜥外泌肽4 AlbudAb融合物在HEK293E细胞的哺乳动物组织培养物中表达，并按照较早描述的方法纯化。简单地说，使用蛋白质L-琼脂糖亲和树脂将蛋白质成批吸收，接着用甘氨酸(pH 2.0)洗脱，其后用Tris(PH 8.0)中和从而纯化。随后是在Resource S柱上进行离子交换层析法(使用0-1M盐梯度/20mM乙酸(pH 5.0))。然后合并含有所需蛋白质的流分，经缓冲液交换至100mM NaCl、20mM柠檬酸(pH 6.2)中。
对蛋白质进行广泛的定量定性测定(包括SDS-PAGE、质谱法、活性测定法：GLP-1R-BA、pH检查、等渗容摩检查)，过滤除菌，并除去内毒素。然后将经证实具有低内毒素(＜0.05EU/mg蛋白质)的蛋白质用于体内研究。
本项研究中使用6只雌性猕猴(食蟹猴(Macaca fascicμlaris)；Charles River Laboratories BRF，Houston，TX，Primate Products，Miami，FL and/or Covance Research Products，Inc.，Alice，TX)。在初次给药时猴约2-9岁(体重范围为2-5千克)。在控制环境的室内(64F-84F；30-70％相对湿度)，将猴各个关养在不锈钢笼中，12小时光/暗循环。给雌性猴每天两次提供Monkey Diet#5038(PMI NutritionInternational，Richmond，IN)的6块饼干，每天分配新鲜水果。按照剂量组(3个皮下和3个静脉内)，由皮下或静脉内给予每只动物试验化合物(DAT0115)。剂量为0.1mg/Kg。在给药当天，每只猴的第一次饲喂在给药后约1小时内进行(如果研究有关步骤需要将动物从其本地关养室移出较长时间，则延长到给药后2.5小时)。第二次饲喂在第一饲喂后不短于2小时。为了环境性丰富起见，在活力检查时或其前后，或者在适应或研究相关步骤之后作为奖励方法，给每只猴提供额外的水果、豆科植物和/或蔬菜(例如葡萄、小胡萝卜、花生)。经过滤的自来水(由Aqua Pennsylvania，Inc.供应并进行定期分析)可随意摄取。
在给药前(0小时)及在给药后5分钟(仅静脉内组)、0.5小时、4小时、8小时、24小时、48小时、96小时、144小时、192小时、288小时、336小时、504小时和672小时，从股血管采集血浆样品(约2ml)。(在静脉内剂量组仅从一只动物采集PK样品到24小时，因此PK拟合不包括该动物)。样品分析通过质谱法进行，数据拟合运用WinNonLin拟合软件。对于静脉内给药(n＝2)，PK参数如下：T1/2 67小时，MRT 46小时，Vz 327ml/Kg，Cl 3.3ml/小时/Kg；对于皮下给药(n＝3)：T1/268小时，MRT 98小时，Vz 306ml/Kg，Cl 3.1ml/小时/Kg。计算生物利用度为99％。
从本项研究(和得自与猕猴和人血清白蛋白的biacore结合数据)可以得出结论，DAT0115在猕猴中的68小时皮下给药半寿期(如上所述)使人相信该分子在人体内的半寿期很可能足够长，从而可以每周一次(或更低频率)给药。
实施例11：测定DAT0115在猕猴中的PD
如上所述在猕猴中进行了PK研究。该研究的主要目的是测定猕猴中DAT0115的药代动力学参数(如之前的实施例中所述)，但第二目的是获得DAT0115化合物在狝猴中的功效指标(对于统计显著性，该研究没有足够说服力)。为了达到第二个目的，在研究过程中对猴的饼干消耗量进行了监测。注意到在给药后的日子里，全部猴的摄食量有减少趋势。可以得出结论，这可能是由于已充分证明的该分子的毒蜥外泌肽4组成部分作为食欲抑制药的作用。因此，DAT0115在体内具有活性。为了确保动物的健康，大部分时间除了摄食饼干之外还摄食水果等。
表9：猕猴每日消耗的饼干量(在第1天给予DAT0115)
Figure BPA00001271918400351
实施例12：采用表面等离子共振分析结合大鼠、猕猴和人血清白蛋白的DAT0115毒蜥外泌肽-4 AlbudAb融合物：
表达和纯化DAT0115后通过表面等离子共振(Biacore，GEHealthcare)分析获得有关亲和力的信息。使用用生物素化血清白蛋白包被的链霉抗生物素芯片(SA)进行了分析。将200-1000共振单位(RU)的各血清白蛋白固定在芯片上。流动吸收池1是未包被的，流动吸收池2用HAS包被，流动吸收池3用RSA包被，流动吸收池4用CSA包被。制备多种浓度的融合物(15.6nM-2μM的范围，通过稀释到BIACORE HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES(pH7.4)、0.15M NaCl、3mMEDTA、0.005％表面活性剂P20)中，并流过BIACORE芯片。
在KD区内，将结合速率和解离速率曲线与由dAb的浓度产生的迹线拟合，从BIACORE迹线计算亲和力(KD)。将亲和力(KD)概括于下表中：
表10：DAT0115的亲和力(KD)
  血清白蛋白类型   DAT0115
  HSA   600nm
  RSA   2μM
  CSA   2μM
实施例13：通过示差扫描量热法(DSC)对DAT0115热变性的表征：
本实验的目的是使用配备了自动进样器的毛细池微热量计VP-DSC(Microcal)，通过DSC(示差扫描量热法)监测DAT0115的热变性。使蛋白质过夜透析至20mM柠檬酸(pH 6.2)、100mM NaCl中，过滤，然后配制为1mg/ml的浓度，用280nm下的吸光度测定。经过滤的透析缓冲液用作所有样品的参比。DSC在180℃/小时的加热速率下进行。在每次加样之前，先注射入1％decon溶液，然后注入缓冲液清洗毛细池，并提供仪器基线或者基础值。运用Origin 7 Microcal软件分析所得到的迹线。由样品迹线减去自参比缓冲液得到的DSC迹线。利用样品的精确摩尔浓度进行计算(用Origin自动进行)。选择在转换前后上基线和下基线线性区域的基线设置，使用三次连接函数连接。将所得曲线与非-2-态模型拟合，得到表观Tm和ΔH/ΔHv值。
将DAT0115的迹线与非-2-态转换模型拟合，其表观Tm为56.3℃。拟合优度令人满意(参见图4)。对照迹线、溶菌酶、使用同一设备运行都得到质量良好的数据，如预期一样具有精确拟合。(所得到的溶菌酶的表观Tm为76.2℃，这与文献中报告的一致(参见图5))。因此，可以得出结论，该实验提供可靠的数据，表明DAT0115是解链温度为56.3℃的分子，这是临床候选药可接受的。
实施例14：溶液状态下DAT0115、DAT0117和DAT0120通过SECMALLS的表征：
本实验的目的是通过SEC MALLS测定溶液状态下的DAT0115、DAT0117和DAT0120。将样品纯化，并透析至适当的缓冲液(PBS)中，透析后过滤，测定浓度，并调节至1mg/ml。BSA和HAS均购自Sigma，无需进一步纯化便可使用。
仪器使用详情：
将备有自动进样器(SIL-20A)的Shimadzu LC-20AD ProminenceHPLC系统和SPD-20A Prominence UV/Vis检测器与Wyatt Mini DawnTreos(MALLS，多角度激光扫描检测器)和Wyatt Optilab rEX DRI(差示折光率)检测器连接。检测器按下列顺序连接-LS-UV-RI。RI仪和LS仪两者在488nm波长下操作。使用TSK2000(Tosoh corporation)或BioSep2000(Phenomenex)柱(两者均为硅胶型HPLC柱，具有类似的分离范围，为1-300kDa)，流动相为50mM或200mM磷酸缓冲液(含有或不含盐)(pH 7.4)或1xPBS。所采用的流速为0.5ml/分钟或1ml/分钟，调节运转时间以反映不同的流速(45分钟或23分钟)，并且预期不会对分子的分离产生显著影响。将蛋白质在PBS中制备成浓度为1mg/ml，注入体积为100μl。光散射检测器按照生产商的说明书用甲苯标定。将UV检测器输出和RI检测器输出与光散射仪连接，以便用Wyatt ASTRA软件同时采集来自全部3个检测器的信号。BSA在PBS流动相(0.5ml/分钟或1ml/分钟)中的若干次注入在Tosoh TSK2000柱中运行，用Wyatt软件采集UV、LS和RI信号。然后按照生产商的说明书，运用ASTRA软件对迹线进行了分析，对于谱带增宽，将信号归一化、进行比对和校正。然后对校准常数取平均，并输入用于未来样品操作的模板中。
绝对摩尔质量计算：
将100μl 1mg/ml样品注入适当预平衡的柱中。
在SEC柱后，样品流过允许测定绝对摩尔质量的3个联机检测器-UV、MALLS(多角度激光扫描)和DRI(差示折光率)。在柱中发生的稀释约为10倍，因此测定该处在溶液状态中的浓度为100μg/ml，或约8μM dAb。
常常在批量样品方式下执行的ASTRA以及Zimm制图技术的计算基础是Zimm方程式[J.Chem.Phys.16，1093-1099(1948)]：
R 0 K * c = MP ( θ ) - 2 A 2 c M 2 P 2 ( θ ) (方程式1)
其中
·c为溶剂中溶质分子的质量浓度(g/ml)
·M为重均摩尔质量(g/mol)
·A2为第二位力系数(mol mL/g2)
·K*＝4p2n0 2(dn/dc)2l0 -4NA-1为光学常数，其中n0为在入射辐射(真空)波长下溶剂的折射率，l0为入射辐射(真空)波长，用纳米表示，NA为阿伏伽德罗数，等于6.022x1023mol-1，dn/dc为相对于溶质浓度变化，溶剂-溶质溶液的差示折光率的增量，用mL/g表示(该因子必需使用dRI检测器单独测量)。
·P(q)为从理论上推导的形态因子，约等于1-2μ2<r2>/3！+…，其中μ＝(4π/λ)sin(θ/2)，<r2>为均方半径。P(q)是分子的z-均尺寸、形状和结构的函数。
·Rq为超瑞利比(cm-1)
该方程式假定为垂直偏振入射光且对c2阶是有效的。
为了用拟合Rq/K*c相对sin2(q/2)的Zimm拟合方法进行计算，我们需要将方程式1的倒数展开成为一阶c：
K * c R 0 = l MP ( &theta; ) + 2 A 2 c 方程式2
在这种情况下合适的结果为
M = ( K * c R 0 - 2 A 2 c ) - 1 方程式3
和
< r 2 > = 3 m 0 &lambda; 2 M 16 &pi; 2 方程式4
其中
Figure BPA00001271918400393
方程式5
计算通过ASTRA软件自动进行，获得相对于每个测定部分(slices)的摩尔质量的曲线图[Astra手册]。
将从层析图观察到的每个峰值的曲线图得到的摩尔质量与一个单位蛋白质的预期分子量进行了比较。这让我们得出有关溶液状态的蛋白质的结论。
实验数据：
DAT0115
将100μl 1mg/ml DAT0115注入用20mM柠檬酸、0.1M NaCl(pH6.2)平衡后的Superdex 200柱中。将流速设定为0.5ml/分钟。蛋白质以单峰洗脱出来，透过峰的整个宽度确定分子量为17.4kDa(预期单体分子量为16.9kDa)。洗脱效率为100％。参见图6。(HSA对照如预期一样，证实了DAT0115的实验结果。它洗脱出两个峰，分子量为64kDa(单体)和110kDa(二聚体)。由于该峰内的蛋白质的量非常少，因此HSA二聚体的分子量可能不是非常精确)。
DAT0117
将100μl 1mg/ml DAT0117注入在50mM磷酸缓冲液(pH 7.4)中平衡的TSK2000柱中。将流速设定为1ml/分钟。约50％的DAT0117注入量以两个重叠峰由柱中洗脱出来，分子量为35-45kDa左右(二聚体以上)，这表明了在本文的试验条件下强大的自缔合能力。(BSA对照如预期一样，证实了DAT0117实验结果，得到摩尔质量为61kDa和146kDa(单体和二聚体)的两个峰)。有关SEC Mal结果参见图7。
DAT0120
将100μl 1mg/ml DAT0117注入用50mM磷酸缓冲液(pH7.4)平衡的TSK2000柱中。将流速设定为1ml/分钟。约50％的DAT0120注入量以略微的不对称峰从GF柱中洗脱出来，测定的分子量为25kDa左右。这表明了在本文的试验条件下DAT0120自缔合，蛋白质似乎处于快速的单体-二聚体平衡中。(BSA对照如预期一样，证实了DAT0120实验结果，得到摩尔质量为61kDa和146kDa(单体和二聚体)的两个峰)。有关SEC Mal结果参见图8。
从上述这些实验中得出结论，与具有显著自缔合的其它2种分子相比，DAT0115在本文所用条件下的自缔合显著较少(甚至可能没有)。溶液中的单体状态可能对于体内作用及制备期间的上游和下游步骤都是优选的，因此，DAT0115可能是有关溶液状态对于临床进展的最理想的分子。
实施例15：无需使用亲和基质蛋白质L由哺乳动物表达物中纯化：
DAT0120和DAT0115均由HEK 293上清液中纯化。各蛋白质都在HEK 293E细胞的哺乳动物组织培养物中由pTT-5载体表达。1mlMEP Hypercel树脂柱用PBS平衡，用0.1M氢氧化钠洗涤，然后用PBS再次平衡。将200ml上清液以2.5ml/分钟加入柱中，然后将柱用PBS洗涤后，用0.1M甘氨酸(pH 2)洗脱。
洗脱后，样品用1/5体积的1M Tris(pH 8)中和，并贮存在室温下。样品在贮存后略有沉积，使用steriflip装置过滤后脱盐。
两个26/10 HiPrep脱盐柱用20mM乙酸钠(pH 5)(测量值pH 5.3)以10ml/分钟平衡，加入0.1M NaOH清洗后，在20mM乙酸钠(pH 5)中再次平衡。
使DAT0115脱盐进入20mM乙酸钠(pH 5)后，加入用20mM乙酸钠(pH 5)(实测5.2)平衡的1ml HiTrap SPFF中。将柱洗涤后，使之进行20mM乙酸钠(pH 5)、1M NaCl的0-100％梯度洗脱，收集吸光度超过5mAus的洗脱流分，通过SDS-PAGE进行了分析。
在SP FF流分贮存过夜后，样品经0.2μM过滤，加入用20mM柠檬酸钠(pH 6.2)、100mM NaCl平衡的2X26/10 HiPrep脱盐柱中。将洗脱液在20ml离心浓缩器中浓缩，过滤除菌，以1/10和1/200的稀释度测定内毒素。按两种稀释度测定内毒素，1/10稀释度得到30Eu/ml的值，其尖峰回收率(spike recovery)为250。1/200试验得到＜10.8Eu/ml的值，其尖峰回收率为126％。使用ID 27823，送出样品用于MS分析。在高负载中，可观察到在80kDa标记下以及在110-160kDa标记之间存在低水平污染物。样品的纯度显示大于95％。
Figure IPA00001271917900011
Figure IPA00001271917900021
Figure IPA00001271917900041
Figure IPA00001271917900061
Figure IPA00001271917900091
Figure IPA00001271917900101
Figure IPA00001271917900121
Figure IPA00001271917900131
Figure IPA00001271917900141

Claims (55)

1.一种融合物，其包含以下成分或由以下成分组成：(a)促胰岛素药物或肠降血糖素药物，其作为与(b)的融合物存在，(b)DOM7h-14结构域抗体(dAb)，其结合血清白蛋白并且其氨基酸序列如图1(h)(SEQ ID NO8)中所示。
2.权利要求1的融合物，其中所述药物是毒蜥外泌肽-4或GLP-1分子。
3.权利要求1或2的融合物，其中所述药物选自(a)GLP-1(7-37)A8G突变型，其氨基酸序列如图1(i)(SEQ ID NO9)所示，或(b)毒蜥外泌肽-4分子，其氨基酸序列如图1(j)(SEQ ID NO10)所示。
4.权利要求1或2的融合物，其包含连接所述药物和dAb的氨基酸接头或化学接头。
5.权利要求4的融合物，其中所述氨基酸接头是具有图1(k)(SEQ ID NO11)所示氨基酸序列的螺旋接头，或具有图1(l)(SEQ IDNO12)所示氨基酸序列的gly-ser接头。
6.权利要求1或2的融合物，其中所述促胰岛素药物或肠降血糖素药物作为融合物的组成部分存在于dAb的N端或C端。
7.权利要求6的融合物，所述融合物包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：
(a)2xGLP-1A8G DOM7h-14融合物(DAT0114)
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRHGEGTFTSDVSSYLEGQ
AAKEFIAWLVKGRDIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASQWIGSQLS
WYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPED
FATYYCAQGAALPRTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO 1)
(b)毒蜥外泌肽4、(G4S)3接头、DOM7h-14融合物(DAT0115)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGG
GGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQK
PGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYY
CAQGAALPRTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO 2)
(c)毒蜥外泌肽4DOM7h-14融合物(DAT0116)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGDIQMTQSP
SSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQ
SGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQGTK
VEIKR
(SEQ ID NO 3)
(d)毒蜥外泌肽4、螺旋接头、DOM7h-14融合物(DAT0117)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGKEAAAKE
AAAKEAAAKELAAKEAAAKEAAAKEAAAKELAADIQMTQSPSSLS
ASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGV
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQGTKVEI
KR
(SEQ ID NO4)
(e)GLP-1A8G、(G4S)3接头、DOM7h-14融合物(DAT0118)
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGGGSGGGGSGGGGSD
IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLI
MWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPR
TFGQGTKVEI KR
(SEQ ID NO 5)
(f)GLP-1A8G、PSS接头、DOM7h-14融合物(DAT0119)
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGPSSDIQMTQSPSSLSAS
VGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID NO 6)
(g)GLP-1A8G、螺旋接头、DOM7h-14融合物(DAT0120)
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGKEAAAKEAAAKEAA
AKELAAKEAAAKEAAAKEAAAKELAADIQMTQSPSSLSASVGDRVT
ITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGS
GTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQGTKVEIKR
(SEQ ID NO 7)
8.权利要求1或2的融合物，其中所述dAb进一步格式化以增加其流体动力学大小，所述格式化的方法为：将选自以下的分子与所述dAb连接：PEG基团、血清白蛋白、运铁蛋白、运铁蛋白受体或至少其运铁蛋白结合部分、抗体Fc区。
9.权利要求1或2的融合物，其包含进一步的肽或多肽部分。
10.权利要求1或2的融合物，其包含具有与Dom7h-14dAb相同或不同的结合特异性的另外的dAb部分。
11.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-10中任一项的融合物以及药学上或生理上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
12.权利要求11的药物组合物，所述药物组合物包含其它治疗剂/活性剂。
13.一种组合物，所述组合物包含(a)权利要求1-10中任一项的融合物，和(b)其它治疗剂/活性剂，其用于单独、序贯或同时给予受治疗者。
14.用于治疗或预防代谢疾病和紊乱的权利要求11-13中任一项的组合物。
15.权利要求14的组合物，其中所述疾病和紊乱选自：高血糖症、葡萄糖耐量减低、β细胞缺乏症、糖尿病、肥胖症、以过食为特征的疾病。
16.权利要求15的组合物，其中所述糖尿病为I型或II型糖尿病或妊娠糖尿病。
17.权利要求1-10中任一项的融合物在制备治疗或预防代谢疾病和紊乱的药物中的用途。
18.权利要求1-10中任一项的融合物在制备用于通过皮下、静脉内或肌内注射递送给受治疗者的药物中的用途。
19.权利要求1-10中任一项的融合物在制备用于胃肠外、口服、直肠、经黏膜、眼、肺或胃肠道递送的药物中的用途。
20.一种口服剂型、注射剂型、吸入剂型或喷雾剂型，所述剂型包含权利要求1-10中任一项的融合物。
21.一种缓释剂型，所述缓释剂型包含权利要求1-10中任一项的融合物。
22.权利要求21的缓释剂型，所述缓释剂型为栓剂形式。
23.一种冻干剂型，所述冻干剂型包含权利要求1-10中任一项的融合物。
24.一种递药装置，所述递药装置装有权利要求1-10中任一项的融合物。
25.一种分离或重组核酸，所述核酸编码权利要求1-7中任一种融合物。
26.一种核酸，所述核酸编码权利要求7的融合物。
27.一种载体，所述载体包含权利要求25或26的核酸。
28.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求25或26的核酸或者权利要求27的载体。
29.一种产生融合多肽的方法，所述多肽包含以下成分或由以下成分组成：(a)促胰岛素药物或肠降血糖素药物，作为与(b)的融合物存在，(b)DOM7h-14结构域抗体(dAb)，其结合血清白蛋白并且具有图1(h)所示氨基酸序列，所述方法包括在适于所述核酸或载体表达的条件下培养权利要求28的宿主细胞，从而产生融合多肽。
30.权利要求1-10中任一项的融合物在制备用于治疗或预防患者的血液葡萄糖升高相关疾病或病症的药物中的用途。
31.权利要求1-10中任一项的融合物在制备用于刺激患者的胰岛素产生和/或增加胰岛素敏感性的药物中的用途。
32.一种缀合物，其包含以下成分或由以下成分组成：(a)促胰岛素药物或肠降血糖素药物，其作为与(b)的缀合物存在，(b)DOM7h-14结构域抗体(dAb)，其结合血清白蛋白并且其氨基酸序列如图1(h)(SEQ ID NO 8)中所示。
33.权利要求32的缀合物，其中所述药物是毒蜥外泌肽-4或GLP-1分子。
34.权利要求32或33的缀合物，其中所述药物选自(a)GLP-1(7-37)A8G突变型，其氨基酸序列如图1(i)(SEQ ID NO 9)所示，或(b)毒蜥外泌肽-4分子，其氨基酸序列如图1(j)(SEQ ID NO 10)所示。
35.权利要求32或33的缀合物，其包含连接所述药物和dAb的氨基酸接头或化学接头。
36.权利要求35的缀合物，其中所述氨基酸接头是具有图1(k)(SEQ ID NO 11)所示氨基酸序列的螺旋接头，或具有图1(l)(SEQ IDNO 12)所示氨基酸序列的gly-ser接头。
37.权利要求32或33的缀合物，其中所述dAb进一步格式化以增加其流体动力学大小，所述格式化的方法为：抗体结构域缀合到所述dAb。
38.权利要求32或33的缀合物，其包含进一步的肽或多肽部分。
39.权利要求32或33的缀合物，其包含具有与Dom7h-14 dAb相同或不同的结合特异性的另外的dAb部分。
40.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求32-39中任一项的缀合物以及药学上或生理上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
41.权利要求40的药物组合物，所述药物组合物包含其它治疗剂/活性剂。
42.一种组合物，所述组合物包含(a)权利要求32-39中任一项的缀合物，和(b)其它治疗剂/活性剂，其用于单独、序贯或同时给予受治疗者。
43.用于治疗或预防代谢疾病和紊乱的权利要求40-42中任一项的组合物。
44.权利要求43的组合物，其中所述疾病和紊乱选自：高血糖症、葡萄糖耐量减低、β细胞缺乏症、糖尿病、肥胖症、以过食为特征的疾病。
45.权利要求44的组合物，其中所述糖尿病为I型或II型糖尿病或妊娠糖尿病。
46.权利要求32-39中任一项的缀合物在制备治疗或预防代谢疾病和紊乱的药物中的用途。
47.权利要求32-39中任一项的缀合物在制备用于通过皮下、静脉内或肌内注射递送给受治疗者的药物中的用途。
48.权利要求32-39中任一项的缀合物在制备用于胃肠外、口服、直肠、经黏膜、眼、肺或胃肠道递送的药物中的用途。
49.一种口服剂型、注射剂型、吸入剂型或喷雾剂型，所述剂型包含权利要求32-39中任一项的缀合物。
50.一种缓释剂型，所述缓释剂型包含权利要求32-39中任一项的缀合物。
51.权利要求50的缓释剂型，所述缓释剂型为栓剂形式。
52.一种冻干剂型，所述冻干剂型包含权利要求32-39中任一项的缀合物。
53.一种递药装置，所述递药装置装有权利要求32-39中任一项的缀合物。
54.权利要求32-39中任一项的缀合物在制备用于治疗或预防患者的血液葡萄糖升高相关疾病或病症的药物中的用途。
55.权利要求32-39中任一项的缀合物在制备用于刺激患者的胰岛素产生和/或增加胰岛素敏感性的药物中的用途。
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