ES2252431T3

ES2252431T3 - Heterocarpina, una proteina que fija la ghrh humana.

Info

Publication number: ES2252431T3
Application number: ES02706900T
Authority: ES
Inventors: Eric Ferrandis; Beng Poon Teng; Christine Sohier; Christophe Thurieau
Original assignee: Societe de Conseils de Recherches et dApplications Scientifiques SCRAS SAS
Current assignee: Ipsen Pharma SAS
Priority date: 2001-02-27
Filing date: 2002-02-26
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2022-02-26
Also published as: EP1409531A2; WO2002068461A2; HUP0303244A2; ATE309269T1; HU225431B1; CA2437516A1; AU2002241065B2; NZ527749A; US7385024B2; IL157150A; PL369469A1; PL207581B1; RU2003128963A; CN1531550A; EP1409531B1; FR2821359A1; IL157150A0; BR0207578A; US20040063621A1; WO2002068461A3

Abstract

Una proteína aislada, susceptible de ser obtenida por extracción de la planta Pilocarpus heterophyllus, caracterizada porque posee una masa molecular de aproximadamente 90, 9 kDa y porque contiene los fragmentos de secuencias peptídicas SEQ. ID. NO. 1, SEQ. ID. NO. 2 y SEQ. ID. NO. 3, siendo dicha proteína susceptible de presentarse en forma glicosilada o no glicosilada.

Description

Heterocarpina, una proteína que fija la GHRH humana.

La presente invención se refiere a una proteína que fija la GHRH humana (human Growth Hormone releasing hormone u hormona liberadora de la hormona del crecimiento humana).

La hormona del crecimiento ("GH") es una proteína de 191 aminoácidos que estimula la producción de numerosos factores de crecimiento, tales como el Factor de Crecimiento Tipo Insulina (IGF-1), y desencadena el crecimiento de un gran número de tejidos (esqueleto, tejidos conectivos, músculos y vísceras). La GH posee igualmente actividades fisiológicas que aumentan la síntesis de ácidos nucleicos, proteínas y la lipólisis, disminuyendo al mismo tiempo las secreciones urinarias (Frohman-L.A. & Kineman, R.D., Handbook of Physiology, Hormonal Control of Growth, editado por Kostyo, J.L. & Goodman, H.M. (Oxford Univ. Press, New York, 1999), p. 189-221).

La síntesis de la GH está regulada por factores de acción positiva o negativa segregados por el hipotálamo. El factor mayoritario que controla la producción de GH es la "Hormona Liberadora de la Hormona del Crecimiento" (GHRH), péptido de 44 aminoácidos en la especie humana.

GH y GHRH están involucradas en numerosas enfermedades. Entre ellas, cabe citar especialmente cáncer (en particular el de próstata o el de pulmón), acromegalia, retinopatías y nefropatías diabéticas; para estas patologías se indica un tratamiento por antagonistas de GHRH. Debido al número de enfermedades potencialmente relacionadas, la industria continúa buscando antagonistas de GHRH.

Por ejemplo, en el documento WO 95/16707 se describe la utilización de derivados de la GHRH (hormona liberadora de la hormona del crecimiento) humana como antagonistas para tratar cáncer, retinopatías, acromegalia o nefropatías.

El solicitante acaba justamente de aislar una nueva proteína de origen vegetal que posee la propiedad de fijar la GHRH humana.

La invención tiene por tanto como objeto, en primer lugar, una proteína aislada susceptible de ser obtenida por extracción de la planta Pilocarpus heterophyllus, que se caracteriza por poseer una masa molecular de aproximadamente 90,9 kDa y contener los fragmentos de secuencias peptídicas SEQ. ID. NO. 1, SEQ. ID. NO. 2 y SEQ. ID. NO. 3, siendo dicha proteína susceptible de presentarse en forma glicosilada o no glicosilada. Para simplificar la exposición que se da a continuación, esta proteína se designará de aquí en adelante como "heterocarpina".

Dichas secuencias SEQ. ID. NO. 1, SEQ. ID. NO. 2 y SEQ. ID. NO. 3 son las siguientes:

	SEQ.ID.NO. 1:	KLIGARYFDK
	SEQ.ID.NO. 2:	YGEDIIVGVIDSGV
	SEQ.ID.NO. 3:	PESESY

La nomenclatura usada a continuación (al igual que en el resto de la presente solicitud) para definir los péptidos es la especificada por la "IUPAC-IUB Commissioner on Biochemical Nomenclature", en la cual, de acuerdo con la representación convencional, el aminoácido del extremo N-terminal (grupo amino) aparece a la izquierda y el aminoácido del extremo C-terminal (grupo carboxilo) aparece a la derecha. La terminología "aminoácido natural" indica uno de los L-aminoácidos naturales encontrado en las proteínas naturales: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu,Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp e His.

Se dice que una proteína está "aislada" cuando se ha dispuesto fuera de su entorno original. En particular, una proteína natural está aislada si se ha separado del material biológico con el que coexiste en el sistema natural.

La invención se refiere preferentemente a heterocarpina en forma no glicosilada.

Según una variante preferida de la invención, la heterocarpina se obtiene a partir de un extracto de células de la planta Pilocarpus heterophyllus cultivadas in vitro.

Además, la invención tiene igualmente como objeto un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión al antígeno de éste, que fija específicamente la heterocarpina.

La heterocarpina posee la propiedad de fijar la GHRH humana. In vitro, la heterocarpina fija la GHRH humana e inhibe así la síntesis de AMP cíclico inducida durante la fijación de la GHRH humana sobre su receptor. In vivo y en ratas, se forma el complejo heterocarpina/GHRH humana en el torrente sanguíneo e inhibe de manera dependiente de la dosis la síntesis de GH inducida por 10 \mug de GHRH humana en relación mol a mol. La heterocarpina posee la propiedad de fijar la GHRH humana.

\newpage

Estas propiedades convierten a los compuestos de la invención en aptos para su utilización farmacéutica. La invención tiene por tanto igualmente como objeto, en calidad de medicamento, la heterocarpina, en forma glicosilada o no glicosilada. La invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que contienen, en calidad de principio activo, heterocarpina en forma glicosilada o no glicosilada, comprendiendo también dicha composición uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables. La invención tiene además como objeto la utilización de heterocarpina en forma glicosilada o no glicosilada para preparar medicamentos destinados a antagonizar los efectos de la GHRH, tratar enfermedades proliferativas (y especialmente el cáncer), tratar acromegalia o tratar retinopatías o nefropatías diabéticas. En lo que se refiere al cáncer, la heterocarpina se adaptará particularmente para preparar un medicamento destinado a tratar tumores carcinoides y pancreáticos, gangliocitomas hipotálamo-hipofisarios, carcinomas bronquiales, intestinales y hepáticos, tumores simpático-adrenérgicos, feocromocitomas, adenomas hipofisarios y carcinomas tiroideos.

La invención tiene todavía como objeto, en calidad de medicamento, un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión al antígeno de éste, que fija específicamente la heterocarpina. La invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende, en calidad de principio activo, un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión al antígeno de éste, que fija específicamente la heterocarpina, comprendiendo también dicha composición uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables. La invención se refiere además a la utilización de un anticuerpo monoclonal o de un fragmento de unión al antígeno de éste, que fija específicamente la heterocarpina, para preparar medicamentos destinados a antagonizar los efectos de la GHRH, tratar enfermedades proliferativas (y especialmente el cáncer), tratar acromegalia o tratar retinopatías o nefropatías diabéticas. En lo que se refiere al cáncer, dicho anticuerpo monoclonal o dicho fragmento de unión al antígeno de éste se adaptarán particularmente para preparar un medicamento destinado a tratar tumores carcinoides y pancreáticos, gangliocitomas hipotálamo-hipofisarios, carcinomas bronquiales, intestinales y hepáticos, tumores simpático-adrenérgicos, feocromocitomas, adenomas hipofisarios y carcinomas tiroideos.

La invención se refiere además a la utilización de la heterocarpina como excipiente en una composición farmacéutica destinada a la liberación prolongada de GHRH. La invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende GHRH, heterocarpina y uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables.

Finalmente, constituyen otros objetos de la invención los procedimientos que permiten extraer y aislar heterocarpina a partir de células de la planta Pilocarpus heterophyllus, proviniendo dichas células preferentemente de cultivos in vitro. Estos procedimientos comprenden esencialmente una etapa de extracción de células de la planta Pilocarpus heterophyllus con agua a una temperatura de 0º a 50ºC, de preferencia de 4º a 25ºC, estando seguida dicha etapa de extracción por una etapa de filtración, con el fin de separar el filtrado rico en heterocarpina de las células de Pilocarpus heterophyllus, y de una o varias etapas de separación de la heterocarpina de los otros compuestos extraídos de la planta Pilocarpus heterophyllus.

Según una primera variante, estos procedimientos de extracción y aislamiento comprenden esencialmente las etapas sucesivas siguientes:

a): una etapa de extracción de células de la planta Pilocarpus heterophyllus con agua a una temperatura de 0º a 50ºC, de preferencia de 4º a 25ºC, estando seguida dicha etapa de extracción por una etapa de filtración, con el fin de separar el filtrado rico en heterocarpina de las células de Pilocarpus heterophyllus;

b): una etapa de precipitación de las proteínas extraídas, por ejemplo, mediante adición de sulfato de amonio, seguida por una etapa de separación del precipitado (mediante filtración o, de preferencia, mediante centrifugación);

c): disolución en agua del precipitado recuperado en la etapa b); y,

d): una etapa de cromatografía de filtración en gel con el fin de separar la heterocarpina de los otros componentes de la disolución.

Según otra variante, estos procedimientos de extracción y aislamiento comprenden esencialmente las etapas sucesivas siguientes:

b): una etapa de desengrasado de la disolución obtenida en a), acidificada por adición de un ácido no oxidante (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico) a un pH preferentemente comprendido entre 2 y 4, por medio de una extracción líquido-líquido (de preferencia, mediante la utilización de un disolvente orgánico, como diclorometano, heptano, hexano o ciclohexano);

c): una etapa de eliminación de taninos, mediante contacto de la disolución desengrasada obtenida en b) con polivinilpirrolidona (o también con nilón 66), seguida por una filtración a través de una resina de poros grandes (preferentemente, una resina a base de poliestirenos, como la resina Diaion® HP-20);

d): conversión a pH alcalino (preferentemente, entre pH 9 y 11) del filtrado obtenido después de la etapa c) mediante adición de una base, como hidróxido de amonio, hidróxido de sodio o hidróxido de potasio;

e): una o varias etapas de filtración a través de una resina cambiadora de aniones, siendo preferentemente el eluyente para esta o estas etapas de filtración una disolución tampón que posee un pH entre 9 y 11 y que contiene eventualmente gradientes de concentración de una sal (como, por ejemplo, cloruro de sodio o sulfato de amonio), con el fin de separar la heterocarpina de los otros componentes de la disolución; y,

f): una etapa de desalinización consistente en el paso de la disolución obtenida en la etapa e) a través de una resina que separa los constituyentes de una mezcla en función de su masa molecular (como la resina Sephadex® G25 o Superdex® 200 HR) y elución con agua de esta mezcla en dicha resina.

Las composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto de la invención pueden estar en forma sólida, como por ejemplo, en forma de polvo, píldoras, gránulos, comprimidos, liposomas, cápsulas y supositorios. Las píldoras, comprimidos o cápsulas pueden estar revestidas por una sustancia capaz de proteger a la composición de la acción del ácido gástrico o de las enzimas en el estómago del individuo durante un periodo de tiempo suficiente para permitir a la composición pasar al intestino delgado de este último sin ser digerida. El compuesto puede también administrarse localmente, por ejemplo, en el mismo local del tumor. El compuesto puede también administrarse según un proceso de liberación prolongada (por ejemplo, mediante la utilización de una composición de liberación prolongada o de una bomba de perfusión). Los soportes sólidos apropiados pueden ser, por ejemplo, fosfato de calcio, estearato de magnesio, carbonato de magnesio, talco, azúcares, lactosa, dextrina, almidón, gelatina, celulosa, celulosa de metilo, carboximetilcelulosa de sodio, polivinilpirrolidina y cera.

Las composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto de la invención pueden igualmente presentarse en forma líquida, por ejemplo, disoluciones, emulsiones, suspensiones o una formulación de liberación prolongada. Los soportes líquidos apropiados pueden ser, por ejemplo, agua, disolventes orgánicos, tales como glicerol o glicoles, tal como poli(etilenglicol), así como sus mezclas en agua en proporciones variadas.

La administración de un medicamento según la invención podrá efectuarse por vía tópica, oral, parenteral, mediante inyección intramuscular, etc.

La dosis de un compuesto según la presente invención, prevista para el tratamiento de enfermedades o desarreglos anteriormente mencionados, varía según el modo de administración, edad y peso corporal del individuo a tratar, así como en función del estado de este último, y será decidida en definitiva por el médico o el veterinario que trata el caso. Tal cantidad determinada por el médico o el veterinario que trata el caso se denomina en este documento "cantidad terapéuticamente eficaz".

Según la invención, se puede preparar heterocarpina mediante el procedimiento que se describe a continuación.

Preparación de heterocarpina

Según una variante preferida de la invención, se han efectuado cultivos in vitro de callos o de suspensiones celulares obtenidos de diferentes órganos de la planta. Estos tejidos cultivados sobre medio semisólido o líquido son capaces de biosintetizar compuestos que poseen propiedades biológicas.

En la presente solicitud, se entiende por "callo" una aglomeración macroscópica de células indiferenciadas de plantas en cultivo sobre un medio nutritivo semisólido. En la presente solicitud, se designan como "células indiferenciadas" células que poseen bajo ciertas condiciones aptitud para multiplicarse en forma de callo o de suspensión celular sin fenómeno de morfogénesis. Finalmente, se entiende por "suspensión celular" células indiferenciadas que pueden formar aglomeraciones microscópicas en cultivo en un medio nutritivo líquido.

La elección del medio nutritivo, hormonas y condiciones de cultivo forman parte integrante de la invención, así como la extracción y análisis del extracto a partir de estos cultivos in vitro.

Las células de granos de Pilocarpus heterophyllus pueden cultivarse en suspensión, por ejemplo, según el procedimiento que se dará posteriormente.

Los órganos se descontaminan según los métodos habituales antes de iniciar el cultivo. Órganos de plántulas in vitro han servido igualmente como material de partida para la callogénesis sin necesitar de desinfección previa. El medio nutritivo de base preferido es uno de los medios normalmente utilizados para cultivos in vitro: se trata del medio Gamborg (descrito en Gamborg et al., Nutrient requirements of suspension cultures of Soybean root cells, Exp. Cell Res. (1968), 50(1), 151-158). La fuente de carbono es sacarosa, si bien puede igualmente emplearse glucosa en concentración de 1 a 120 g/L, de preferencia aproximadamente 30 g/L. Se puede igualmente disminuir el contenido en macro-elementos por un factor 2. Se añade al medio una auxina o bien una auxina y una citoquinina, con preferencia para la asociación de las 2 hormonas, en general ácido 2,4-diclorofenoxiacético y quinetina, si bien ácido \alpha-naftalenoacético (ANA), ácido \beta-indolacético (AIA), ácido \beta-indolbutanoico (AIB) o picloram pueden también combinarse con la quinetina o la bencilaminopurina (BAP). La concentración puede variar de 0,1 a 10 mg/L para la auxina (se puede escoger, por ejemplo, 1 mg/L) y de 0,01 a 2 mg/L para la citoquinina (se puede escoger, por ejemplo, 0,06 mg/L). Las vitaminas son las asociadas a los diferentes medios de base. Los cultivos se efectúan a la luz o en la oscuridad. La temperatura puede variar de 10ºC a 33ºC, si bien será preferentemente de aproximadamente 23ºC. El pH del medio está comprendido entre 4 y 6,5, ajustándose preferentemente a 5,8 antes de la esterilización. Además, puede añadirse o no agar al medio.

Los callos primarios aparecen después de algunos días de cultivo y se pueden separar del implante de origen, recogerse y transplantarse después de aproximadamente 1 mes, cultivándose seguidamente sobre un medio semisólido gelosado (en tubo o en caja de Petri), con transiciones de 4 a 8 semanas, de preferencia 6 semanas, pudiéndose así conservar un callo durante años mediante transplantes sucesivos sobre medios nuevos. Se puede igualmente transplantar el callo en un medio de cultivo líquido en agitación (matraz erlenmeyer o biorreactor) con transplantes cada 2 a 6 semanas, de preferencia 3 semanas.

Las cepas obtenidas se distinguen por el origen genético, condiciones de cultivo, aspecto y ausencia de morfogénesis.

Las células de Pilocarpus heterophyllus liofilizadas se extraen con agua a una temperatura de 0º a 50ºC, de preferencia de 4º a 25ºC. El extracto así obtenido se liofiliza antes de redisolverlo a una concentración adecuada (por ejemplo, aproximadamente 30% de materia seca). Las proteínas precipitadas por adición de una disolución concentrada de sulfato de amonio (por ejemplo, una concentración que representa de 70% a 90% de la concentración de saturación) se disuelven en la cantidad mínima de agua y las materias insolubles se recuperan por centrifugación. A continuación, se separan las proteínas mediante cromatografía en columna (siendo el eluyente de preferencia agua) y la heterocarpina (identificable por su masa molecular, de aproximadamente 90,9 kDa) puede entonces recuperarse.

Preparación de anticuerpos que fijan específicamente heterocarpina

La presente invención proporciona agentes de fijación, como los anticuerpos que fijan específicamente heterocarpina. Se dice que tal agente "fija específicamente" una proteína si reacciona a nivel detectable (por ejemplo, mediante un ensayo ELISA) con dicha proteína y no reacciona de manera detectable con otras proteínas. "La fijación" se refiere a una asociación no covalente entre 2 moléculas separadas, de tal manera que se forma un complejo. La capacidad de fijación puede evaluarse, por ejemplo, mediante la determinación de la constante de fijación para la formación del complejo. La constante de fijación es el valor obtenido cuando el valor de la concentración del complejo se divide entre el producto de los valores de las concentraciones de los componentes no complejados. Se dice que 2 productos están "fijados" cuando la constante de fijación alcanza 103 L/mol. La constante de fijación se puede determinar mediante la utilización de métodos bien conocidos por expertos en la técnica.

Cualquier agente capaz de responder a los criterios anteriormente expuestos puede considerarse como un agente de fijación.

En la presente invención, el agente de fijación es preferentemente un anticuerpo o un fragmento de éste. Los anticuerpos pueden prepararse por cualquier técnica disponible para el experto en la técnica (véase Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). En general, los anticuerpos pueden producirse mediante técnicas de cultivo celular que incluyen la generación de anticuerpos monoclonales, o bien vía transfecciones de genes de anticuerpos en células anfitrionas de bacterias o mamíferos, con el fin de producir anticuerpos recombinantes.

Entre otras técnicas, se prefiere emplear las que se describen a continuación. Se inyecta un inmunógeno que contiene heterocarpina a un grupo de mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, corderos o cabras). En esta etapa, la heterocarpina puede servir de inmunógeno sin modificación. Alternativamente, puede inducirse una respuesta inmunitaria superior si la heterocarpina se une a una proteína de transporte, como albúmina de suero bovino o hemocianina de lapa. Se inyecta el inmunógeno en el animal anfitrión, de preferencia según un esquema predeterminado, y se extrae sangre de los animales periódicamente. Así, pueden purificarse anticuerpos policlonales específicos de heterocarpina a partir de tales antisueros, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad, utilizando heterocarpina acoplada a un soporte sólido adecuado.

Composiciones farmacéuticas destinadas a la liberación de GHRH

Estas composiciones pueden prepararse especialmente a partir de heterocarpina y GHRH según alguno de los métodos descritos en la revista de De Woolf and Brett, Pharmacological Reviews (2000), 52, 207-236 y las referencias citadas en la misma.

A no ser que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que el normalmente entendido por un especialista en el campo al que pertenece esta invención. Igualmente, todas las publicaciones, solicitudes de patentes, todas las patentes y todas las demás referencias mencionadas en este documento se incorporan como referencia.

Los ejemplos siguientes se presentan con objeto de ilustrar los procedimientos anteriormente expuestos, no debiendo considerarse en ningún caso como un límite al ámbito de la invención.

Obtención de heterocarpina Ejemplo 1 Cultivo de células in vitro

Se hace germinar un grano de Pilocarpus heterophyllus y se recoge el tallo emergente de esta germinación. Dicho tallo se cultiva en un medio de Gamborg (Gamborg et al., Nutrient requirements of suspension cultures of Soybean root cells, Exp. Cell Res. (1968), 50(1), 151-158) al que se han añadido 30 g/L de sacarosa, 1 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético y 0,06 mg/L de quinetina. El cultivo se lleva a cabo en tubos a una temperatura de 23ºC y en la oscuridad. Se efectúan transplantes cada 6 semanas en las condiciones habituales. Las cepas, de aspecto granuloso, poseen una coloración beige.

Se ha llevado a cabo durante 8 semanas un estudio cinético del crecimiento de las cepas basado en el aumento de masa de materia fresca y seca de la biomasa. Se juntan los callos de 2 tubos constituyéndose una colecta bisemanal, de manera que la primera colecta tiene lugar a tiempo 0. A continuación, se recogen y liofilizan callos y gelosa. Se comprueba que el crecimiento es exponencial hasta 6 semanas de cultivo, antes de la aparición de una fase estacionaria de crecimiento.

Extracción de los cultivos celulares

Se extraen 2 veces por inmersión en 375 mL de agua a 4ºC 25 g de células de Pilocarpus heterophyllus liofilizadas, se dejan durante la noche a 4ºC y seguidamente en 250 mL de agua a 4ºC durante 4 horas, lavándose finalmente con 125 mL de agua a 4ºC. Cada disolución acuosa así obtenida se filtra a vacío a través de un filtro de vidrio recubierto con celite, con objeto de separar los fragmentos celulares de la disolución acuosa. Las disoluciones acuosas así combinadas se liofilizan a continuación, para obtener 9,4 g de materia seca. Seguidamente, se disuelve el extracto seco liofilizado en 31 mL de agua a 20ºC, para obtener una disolución que contiene 30% de extracto seco. Se añaden en pequeñas porciones y con agitación magnética constante 17,4 g de sulfato de amonio, con objeto de precipitar la fracción proteica. A continuación, se separa el precipitado proteico de la disolución de sulfato de amonio por centrifugación a 3000 rpm durante 20 minutos. Se decanta la disolución de sulfato de amonio y las proteínas precipitadas se disuelven en 22 mL de agua, se vuelven a centrifugar y se filtran para eliminar las partículas insolubles.

El filtrado obtenido se somete a continuación a una cromatografía de filtración en gel. El filtrado se inyecta en una columna (Buchi n° 19678, L = 230 mm; diámetro interno = 26 mm) rellena con Superdex^{TM} 200 (Amersham Pharmacia Biotech, referencia n° 17-1043-01; partículas de 13 \mum de diámetro medio) preparada según las recomendaciones del fabricante, utilizándose agua ultra-pura (Agua Milli-Q) como eluyente, con un flujo de 5 mL por minuto. Se recogen así fracciones de 40 mL, encontrándose la proteína activa en la tercera y cuarta fracción. Estas fracciones se liofilizan para obtener aproximadamente 14,2 mg de producto activo.

La pureza del producto obtenido se demuestra por la aparición de una única banda en el gel de electroforesis que contiene dodecil sulfato de sodio (SDS PAGE). El producto correspondiente a esta banda se designa de aquí en adelante como heterocarpina.

Ejemplo 2

Las células cultivadas in vitro, según el mismo procedimiento descrito anteriormente en el ejemplo 1, se extraen según el método que se describe a continuación.

Se extraen 100 g de células de Pilocarpus heterophyllus liofilizadas mediante 2 litros de agua desmineralizada a 20ºC, manteniéndose la mezcla en agitación durante una noche. Las células y el extracto se filtran por succión en una placa de vidrio sinterizado (porosidad 3, diámetro de 20 cm) recubierta con una capa de celite (previamente lavado con ácido; 1 a 2 cm de espesor). Las células recuperadas se lavan con 400 mL de agua desmineralizada antes de ser eliminadas. El filtrado acuoso se acidifica a continuación a pH 3 por adición de aproximadamente 10 mL de ácido clorhídrico al 18%. Seguidamente, se desengrasa la disolución acidificada mediante extracción líquido-líquido con 400 mL de diclorometano. Se decanta la fase de diclorometano y seguidamente se elimina. La disolución desengrasada se somete a evaporación rotativa para eliminar el diclorometano residual. A continuación, se añaden aproximadamente 30 g de polivinilpirrolidona a la disolución desengrasada (pH de aproximadamente 3) y se agita la mezcla durante aproximadamente 30 minutos para eliminar los taninos. La mezcla se filtra por succión en una placa de vidrio sinterizado (porosidad 3, diámetro de 10 cm) recubierta con una capa mixta compuesta por 25 g de celite (previamente lavado con ácido) y 25 g de polivinilpirrolidona. A continuación, se pasa el filtrado a través de una capa de 400 mL de Diaion® HP-20 (Mitsubishi Chemical Company) preactivado según las instrucciones del fabricante. Seguidamente, el filtrado resultante se alcaliniza (pH 10) mediante adición de aproximadamente 60 mL de una disolución de hidróxido de amonio al 20%. Después de 30 minutos de reposo aparece una ligera precipitación. Se añade 1 g de celite (previamente lavado con ácido) a la disolución alcalina, que se filtra a continuación por succión a través de un filtro de membrana (0,22 \mum). Seguidamente, se pasan aproximadamente 2 litros de filtrado a través de una columna HiPrep® Q XL 16/10, montada sobre un purificador Akta® y pre-equilibrada a pH 10,2 mediante un tampón piperazina/HCl 0,1 M, con un flujo de 0,5 mL por minuto (la columna HiPrep® y el purificador Akta® son ambos productos de la firma Amersham Biosciences). A continuación, se lava la columna sucesivamente con 6 volúmenes de columna del tampón inicial a pH 10,2; 5 volúmenes de columna del mismo tampón que contiene una concentración 0,2 M de NaCl; y 10 volúmenes de columna del mismo tampón que contiene una concentración 1 M de NaCl. La mayor parte de la heterocarpina se recupera en los tres primeros 3 volúmenes de la columna de tampón que contiene la concentración 1 M de NaCl. Las fracciones activas se desalinizan por paso a través de una columna Sephadex® G25 (volumen del relleno: 260 mL) mediante utilización de agua desmineralizada como eluyente. Las fracciones activas, encontradas en el primer volumen de columna correspondiente al volumen muerto, se liofilizan a continuación, para obtener 170 mg de heterocarpina. La heterocarpina así obtenida es prácticamente mono-banda en gel SDS PAGE.

Caracterización de heterocarpina Análisis y micro-secuenciación

Se cargan las muestras en gel de poliacrilamida al 10%. Después de la migración, los geles se fijan y tiñen al azul de Coomassie.

Las bandas del gel representadas en la Figura 3, correspondientes a las bandas 1, 2, 3, 4 y 5 son, respectivamente, el marcador de peso molecular (Amersham), 0,5, 1 y 2 \mug del contenido de la fracción final de una heterocarpina tal como la obtenida en el ejemplo 1 y el marcador de masa molecular (Amersham). La determinación de la masa molecular mediante una curva estándar del marcador de masa molecular utilizando herramientas informáticas clásicas, bien conocidas por los expertos en la técnica (por ejemplo, el logicial Bio-Profil BioID de Viber Lourmat), permite demostrar que la heterocarpina posee una masa molecular de 90,9 kiloDaltons (\pm 1,6 kiloDaltons).

Para el análisis por micro-secuenciación de proteína, se recorta la banda de poliacrilamida que contiene la proteína y se digiere en 300 \muL de tampón de digestión, que contiene Tris 50 mM (pH 8,6) y 0,03% de dodecil sulfato de sodio, a 35ºC durante 18 horas en presencia de 0,4 \mug de endolisina-C (Sigma). Los péptidos obtenidos se separan mediante HPLC en una columna en línea de DEAE-C18 de 1 mm de diámetro. El gradiente de separación se basa en una mezcla de acetonitrilo (de 2% a 70%) y ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA). La secuenciación se realiza a continuación en un secuenciador Procise (Applied Biosystem). Así, se secuencian tres picos, lo que permite caracterizar la heterocarpina de manera unívoca. Las secuencias correspondientes se identifican en la presente solicitud como SEQ. ID. NO. 1, SEQ. ID. NO. 2 y SEQ. ID. NO. 3.

El análisis de glicoproteínas se lleva a cabo por detección de estructuras azucaradas de las glicoproteínas separadas por gel SDS-PAGE. Este sistema de detección es una modificación de los métodos "Periodic acid-Schiff" y lleva a la aparición de bandas magenta cuando se identifican glicoproteínas (Sigma). En el caso de una heterocarpina como la obtenida en el ejemplo 1, se obtiene el resultado que se reproduce en la Figura 4.

Propiedades farmacológicas de la heterocarpina Transfecciones estables del receptor humano de la GHRH (hGHRH-R)

Las células humanas embrionarias de riñón HEK-293 (un linaje celular desarrollado por el Dr. Stuart Sealfon, Mount Sinai Medical School, New York, New York), que expresan de manera estable el receptor humano de la GHRH, han sido proporcionadas por el Dr. Kelly Mayo (Northwestern University, Chicago, TL).

Cultivo celular y preparación membranaria

Las células HEK-293 transfectadas de manera estable con el receptor humano de la GHRH anteriormente descritas se cultivan en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco, alto contenido en glucosa; proporcionado por Life Technologies) suplementado con 0,4 mg/mL de G418 (Life Technologies) en presencia de 10% de suero fetal de vaca y de L-glutamina 4 mM (Life Technologies). Las células se homogeneizan en tampón A, que contiene HEPES 50 mM (ph 7,4), cloruro de magnesio (MgCl_{2}) 5 mM, ácido etilenglicol-bis(2-amino-etil)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA) 2 mM y 50 \mug/mL de bacitracina, y seguidamente se someten a sonicación en el mismo tampón A. Las células así homogeneizadas se centrifugan a 39000 g a una temperatura de 4ºC durante 10 minutos, se suspenden en el tampón A y se vuelven a centrifugar a 40000 g a una temperatura de 4ºC durante 10 minutos. Las proteínas totales membranarias se cuantifican mediante la técnica de Bradford. Las membranas tratadas se almacenan así a -80ºC para utilización posterior.

Ensayo de unión competitiva sobre hGHRH-R

Las membranas de las células HEK-293 transfectadas de manera estable con el receptor humano de la GHRH se diluyen a una concentración de 100 \mug/mL en el tampón de reacción que contiene HEPES 50 mM (pH 7,4), MgCl_{2} 5 mM, EGTA 2 mM, 50 \mug/mL de bacitracina y 0,5% de albúmina de suero bovina (BSA). Las membranas se incuban con [^{125}]GHRH(1-44 amida) (Amersham) 0,05 nM en un volumen final de 200 \muL, en presencia de concentraciones crecientes de heterocarpina, durante 2 horas a una temperatura de 23ºC. La reacción se detiene mediante filtración rápida en filtros de 96 pocillos GF/C precargados con polietilenimina al 0,1%. Los filtros se lavan seguidamente tres veces a una temperatura de 4ºC con el tampón de lavado que contiene Tris 50 mM (ph 7,4), mediante la utilización de una estación de filtración Packard de 96 pocillos. Los filtros así secados se sumergen en 20 \muL de cóctel de centelleo (Microscint O, Packard) y se someten a recuento en un equipamiento Topcount (Packard). La actividad no específica se determina en presencia de hGHRH 100 nM. Se genera para hGHRH una curva dosis-respuesta (0,001 nM-100 nM). Los resultados obtenidos están representados en la Figura 1.

Formación competitiva de AMP cíclico

Las células HEK-293 transfectadas de manera estable con el receptor humano de la GHRH se distribuyen en placas de cultivo de 48 pocillos y se cultivan durante 3 días. Se retira a continuación el medio de cultivo, se sustituye por el medio B, que contiene 250 \muL de DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco, alto contenido en glucosa; proporcionado por Life Technologies) en presencia de 0,5% de BSA, 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), y se preincuba durante 5 minutos a una temperatura de 37ºC. Al final del periodo de incubación, se ensaya la heterocarpina durante 20 minutos adicionales. Las concentraciones observadas están recogidas en la Figura 2. La incubación se detiene por adición de 100 \muL de HCl 0,1 M y se analizan porciones alícuotas con respecto a su contenido en AMP cíclico mediante el uso de un conjunto FlashPlate (New England Nuclear).

Dosis de GH en ratas

Los niveles de GH en ratas (machos, Sprague Dawley) se miden en muestras sanguíneas mediante un ensayo enzimo-inmunológico desarrollado por Spi-Bio (Spi-Bio, Francia). Se tratan las ratas con inyección intravenosa de heterocarpina en dosis crecientes (vehículo solo, 1, 3 y 10 nmoles) y seguidamente, 10 minutos después, con inyección intravenosa de 10 \mug (3 nmoles) de hGHRH. Los niveles de la hormona del crecimiento se miden diez minutos después de la inyección de hGHRH en muestras de extracción sanguínea como se ha descrito anteriormente. Los resultados obtenidos están representados en la Figura 5.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una curva que representa la inhibición de fijación de la GHRH humana al receptor de la GHRH humana en función de concentraciones crecientes de heterocarpina.

La Figura 2 es una curva que representa la inhibición de producción de AMP cíclico en células transfectadas de manera estable con el receptor de GHRH humana en presencia de GHRH humana 10 nM en función de concentraciones crecientes de heterocarpina.

La Figura 3 es la reproducción de una placa de gel de proteína SDS-PAGE que muestra la presencia de heterocarpina, que posee un peso molecular de 90,9 kDa.

La Figura 4 es la reproducción de una placa de gel de proteína SDS-PAGE que muestra que la heterocarpina es una glicoproteína (Apartado B).

La Figura 5 es una representación en forma de histogramas que representan la inhibición de síntesis de GH en ratas en presencia de 10 \mug de GHRH humana en función de concentraciones crecientes de heterocarpina.

<110> Société de Conseils de Recherches et d'Application

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<120> Heterocarpina, una proteína que fija la GHRH humana

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<130> Heterocarpina

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<140>

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<141>

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<150> FR 01/02631

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<151> 2001-02-27

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<160> 3

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Pilocarpus Heterophyllus

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<400> 1

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\sa{Lys Leu Ile Gly Ala Arg Tyr Phe Asp Lys}

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<210> 2

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Pilocarpus Heterophyllus

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<400> 2

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\sa{Tyr Gly Glu Asp Ile Ile Val Gly Val Ile Asp Ser Gly Val}

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<210> 3

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Pilocarpus Heterophyllus

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<400> 3

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\sa{Pro Glu Ser Glu Ser Tyr}

Claims

1. Una proteína aislada, susceptible de ser obtenida por extracción de la planta Pilocarpus heterophyllus, caracterizada porque posee una masa molecular de aproximadamente 90,9 kDa y porque contiene los fragmentos de secuencias peptídicas SEQ. ID. NO. 1, SEQ. ID. NO. 2 y SEQ. ID. NO. 3, siendo dicha proteína susceptible de presentarse en forma glicosilada o no glicosilada.

2. Una proteína según la reivindicación 1, caracterizada porque se ha obtenido a partir de un extracto de células de la planta Pilocarpus heterophyllus cultivadas in vitro.

3. Un medicamento que contiene una proteína según la reivindicación 1 ó 2.

4. Un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión al antígeno de éste, que fija específicamente la proteína aislada de la reivindicación 1.

5. Un medicamento que contiene un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión al antígeno de éste, que fija específicamente la proteína aislada de la reivindicación 1.

6. Una composición farmacéutica que contiene, en calidad de principio activo, una proteína según la reivindicación 1 ó 2, así como uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables.

7. Utilización de una proteína según la reivindicación 1 ó 2 para preparar un medicamento destinado a actuar como antagonista de los efectos de la GHRH.

8. Utilización de una proteína según la reivindicación 1 ó 2 para preparar un medicamento destinado a tratar enfermedades proliferativas, en particular el cáncer.

9. Utilización de una proteína según la reivindicación 1 ó 2 para preparar un medicamento destinado a tratar acromegalia.

10. Utilización de una proteína según la reivindicación 1 ó 2 para preparar un medicamento destinado a tratar retinopatías y nefropatías diabéticas.

11. Procedimiento de extracción y aislamiento de la proteína según la reivindicación 1 a partir de células de la planta Pilocarpus heterophyllus, que comprende una etapa de extracción de células de la planta Pilocarpus heterophyllus con agua a una temperatura de 0º a 50ºC, siendo seguida dicha etapa de extracción por una etapa de filtración, con el fin de separar el filtrado rico en heterocarpina de las células de Pilocarpus heterophyllus, y de una o varias etapas de separación de la heterocarpina de los otros componentes extraídos de la planta Pilocarpus heterophyllus.