JP4117194B2

JP4117194B2 - ヘテロカルピン、ヒトのｇｈｒｈ−結合タンパク質

Info

Publication number: JP4117194B2
Application number: JP2002567971A
Authority: JP
Inventors: フエランデス，エリック; テング，ベング，ポーン; ソシエ，クリスチーヌ; ツリオー，クリストフ
Original assignee: ソシエテドコンセイユドルシェルシェエダアップリカーションシャンティフィック（エス．セー．エール．アー．エス．）
Priority date: 2001-02-27
Filing date: 2002-02-26
Publication date: 2008-07-16
Anticipated expiration: 2022-02-26
Also published as: IL157150A0; HUP0303244A2; AU2002241065B2; FR2821359B1; HUP0303244A3; NZ527749A; FR2821359A1; KR20030094262A; CZ20032612A3; EP1409531A2; WO2002068461A2; CN1531550A; DE60207257D1; ES2252431T3; US20040063621A1; WO2002068461A3; RU2003128963A; RU2305683C2; CA2437516A1; JP2004538254A

Description

本発明はヒトのGHRH−結合（ヒトの成長ホルモン放出ホルモン）タンパク質に関する。

成長ホルモン（"GH"）は、インスリン様成長因子Ｉ（IGF−1）の如き多数の成長因子の生産を促進し且つ多数の組織（骨格、結合組織、筋肉及び内臓）の成長を生起する、191個のアミノ酸を有するタンパク質である。GHはまた核酸、タンパク質の合成及び脂肪分解を増大し然るに尿分泌を低減させる生理活性を有する（Frohman L.A.及びKineman R.D.生理学の教本（Handbook of Physiology）、成長のホルモンコントロールKostyo，J.L.及びGoodman，H.M.編（オックスフォード大学印刷局、ニューヨーク、1999）、p.189〜221）。

GHの合成は、視床下部により分泌される正又は負の作用を有する因子によって調節される。GHの生産を制御する主たる因子は、ヒトにおいて44個のアミノ酸を有するペプチドである「成長ホルモン放出ホルモン」（GHRH）である。

GH及びGHRHは多数の疾病に関与している。これらの疾病のうちでは、特に次の疾病が挙げられる；ガン（特に前立腺ガン又は肺ガン）、巨端症、糖尿病性網膜症及び腎症；これらの病状に対しては、GHRH拮抗薬での処置が指示される。潜在的に関連する多数の疾病により、医薬産業ではGHRH拮抗薬を調査し続けている。
Frohman L.A.及びKineman R.D.の生理学の教本成長のホルモンコントロール、Kostyo J.L.及びGoodman，H.M.編、(1999) p.189〜221

それ故本発明者は今般、ヒトのGHRHを結合する特性を有する、植物起源の新規タンパク質を単離した。

従って本発明の第１の要旨は、植物のピロカルプスヘテロフィラス（Pilocarpus heterophyllus）からの抽出により得られる単離したタンパク質において、該タンパク質は大体90.9 kDaの分子量を有し且つペプチド配列SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2及びSEQ.ID.NO.3のフラグメントを含有してなり；該タンパク質はグリコシル化した形又はグリコシル化されていない形で呈示し得るものであることを特徴とする単離したタンパク質に在る。次の記載を簡素化するために、このタンパク質を以下では「ヘテロカルピン」と呼ぶ。

前記のSEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2及びSEQ.ID.NO.3配列は次の通りである；
SEQ.ID.NO.1； KLIGARYFDK
SEQ.ID.NO.2； YGEDIIVGVIDSGV
SEQ.ID.NO.3； PESESY
ペプチドを定義するために前記で用いた命名法（本明細書の残り部分においても）は「生化学命名法でのIUPAC-IUB会議」により明記された命名法であり、ここでは標準の表現によるとN−末端アミノ酸（アミノ基）は左側に見られ、C−末端アミノ酸（カルボキシル基）は右側に見られる。用語「天然のアミノ酸」は、天然のタンパク質に見出される天然のL−アミノ酸；Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Lys、Arg、Asp、Asn、Glu、Gln、Cys、Met、Phe、Tyr、Pro、Trp及びHisの１種を示している。

タンパク質がその元の環境から取出されるならばタンパク質は「単離した」と呼ばれる。特にタンパク質はそれが天然系で共存する生体材料から分離されるならば、天然のタンパク質が単離される。本発明はそのグリコシル化されていない形でのヘテロカルピンに関するのが好ましい。

本発明の好ましい変更例によると、ヘテロカルピンは生体外で（in vitro）培養した植物ピロカルプスヘテロフィラスの細胞の抽出物から得られる。

更に本発明の要旨はまたモノクローナル抗体、あるいはヘテロカルピンを特異的に結合するモノクローナル抗体の抗原結合性フラグメントである。

ヘテロカルピンはヒトのGHRHを結合する特性を有する。生体外ではヘテロカルピンはヒトのGHRHを結合し、かくしてそのレセプター上でヒトのGHRHの結合中に誘発される環状AMPの合成を阻害する。生体外では、ラットにおいて、ヘテロカルピン／ヒトのGHRH錯体が血液区室中で形成され、しかも投与量依存性の要領でモル／モル比でヒトのGHRHの10μgにより誘発されるGH合成を阻害する。ヘテロカルピンはヒトのGHRHを結合する特性を有する。

これらの特性は本発明の化合物を製薬用途に適当とさせる。それ故、本発明の要旨は医薬としてグリコシル化した形の又はグリコシル化されていない形のヘテロカルピンに在る。本発明はまた活性成分としてグリコシル化した形の又はグリコシル化されていない形のヘテロカルピンを含有する製薬組成物に関し、該組成物はまた１種又はそれ以上の製薬上許容しうる賦形剤をも含有する。本発明の別の要旨は、GHRHの作用に拮抗し、増殖性の疾病（特にガン）を処置し、巨端症を処置し又は糖尿病性網膜症及び腎症を処置するのに意図した医薬を製造するためにグリコシル化した形又は非グリコシル化した形のヘテロカルピンの使用に在る。ガンに関しては、ヘテロカルピンは、カルチノイド及びスイ臓腫瘍、視床下部−下垂体神経節細胞腫、気管支、腸及び肝臓のガン腫、交感神経副腎の腫瘍、クロム親和細胞腫、下垂体腺腫及び甲状腺ガンを処置するのに意図した医薬を製造するのに特に適当である。

本発明の要旨はまた医薬として、ヘテロカルピンを特異的に結合するモノクローナル抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメントに在る。また本発明は活性成分として、ヘテロカルピンを特異的に結合するモノクローナル抗体あるいは該抗体の抗原結合性フラグメントを含有する製薬組成物に関し、該組成物は１種又はそれ以上の製薬上許容しうる賦形剤を含有している。更には、本発明は、GHRHの作用に拮抗し、増殖性の疾病（特にガン）を処置し、巨端症を処置し又は糖尿病性網膜症及び腎症を処置するのに意図した医薬を製造するために、ヘテロカルピンを特異的に結合するモノクローナル抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメントの使用に関する。ガンに関しては、前記のモノクローナル抗体又は該抗体の抗原結合性フラグメントは、カルチノイド及びスイ臓腫瘍、視床下部−下垂体神経節細胞腫、気管支、腸及び肝臓のガン腫、交感神経副腎の腫瘍、クロム親和細胞腫、下垂体腺腫及び甲状腺ガンを処置するのに意図した医薬を製造するのに特に適当である。

本発明はまたGHRHの徐放性に意図した製薬組成物中の賦形剤としてヘテロカルピンの使用に関する。本発明はまたGHRHとヘテロカルピンと１種又はそれ以上の製薬上許容しうる賦形剤とを含有している製薬組成物に関する。

最後に、本発明の別の要旨は、好ましくは生体外の培養物から生じる植物ピロカルプスヘテロフィラスの細胞からヘテロカルピンを抽出し且つ単離することができる方法に在る。これらの方法は本質的に、0〜50℃の温度で好ましくは4〜25℃で植物ピロカルプスヘテロフィラスから水で細胞を抽出する工程と、該抽出工程に続いてピロカルプスヘテロフィラス細胞からヘテロカルピン富化濾液を分離する濾過工程と、植物のピロカルプスヘテロフィラスから抽出した別成分からヘテロカルピンを分離する１回又はそれ以上の分離工程とを包含する。

第１の変更例によると、これらの抽出、単離方法は本質的に次の連続工程を包含する；
a) 0〜50℃の温度で好ましくは4〜25℃で植物のピロカルプスヘテロフィラスから水で細胞を抽出する工程、該抽出工程に続いてピロカルプスヘテロフィラス細胞からヘテロカルピン富化濾液を分離する濾過工程を行なう；
b) 例えば硫酸アンモニウムを添加することにより、抽出したタンパク質を沈澱する工程と、続いて沈澱物を分離する工程（濾過により又は好ましくは遠心分離により）；
c) 工程b)で回収した沈澱物を水中に溶解する工程；及び
d) 得られた溶液の別成分からヘテロカルピンを分離するためにゲル濾過クロマトグラフィーの工程。

別の変更例によると、これらの抽出、単離方法は本質的に次の連続工程を包含する；
a) 0〜50℃の温度で好ましくは4〜25℃で植物のピロカルプスヘテロフィラスから水で細胞を抽出する工程、該抽出工程に続いてピロカルプスヘテロフィラス細胞からヘテロカルピン富化濾液を分離する濾過工程を行なう；
b) 液−液抽出を用いて（好ましくはジクロロメタン、へプタン、ヘキサン又はシクロヘキサンの如き有機溶剤を用いることにより）好ましくは2〜4のpHで非酸化性の酸（例えば塩酸、硫酸又はリン酸）の添加により酸性化した、工程a)で得られた溶液を脱脂質化する工程；
c) 工程b)で得られた脱脂質化した溶液をポリビニルピロリドン（あるいはまたナイロン66）と接触させ続いて大孔樹脂（好ましくはポリスチレン基質の樹脂例えばレジンダイアイオン（商標名）HP-20）上で濾過することによりタンニンを除去する工程；
d) 水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムの如き塩基の添加により工程c)後に得られた濾液をアルカリ性pH（好ましくはpH9〜11）に調節する工程；
e) 溶液の別成分からヘテロカルピンを分離するためにアニオン交換樹脂上で濾過する１回又はそれ以上の工程、この工程又はこれらの濾過工程用の溶離剤は好ましくは、9〜11のpHを有し且つ場合によっては濃度勾配のある塩（例えば塩化ナトリウム又は硫酸アンモニウムの如き）を含有する緩衝剤溶液である；及び
f) 分子量に基づいて混合物の諸成分を分離する樹脂（例えばセファデックス（商標名）G25又はスーパーデックス（商標名）200HRレジン）上に工程e)で得られた溶液を通送し、該樹脂上のこの混合物を水で溶離することからなる脱塩工程。

本発明の化合物を含有する製薬組成物は、例えば粉末、丸薬、顆粒、錠剤、リポソーム、ゼラチンカプセル又は座薬の如き固体形であり得る。丸薬、錠剤又はゼラチンカプセルは該組成物を患者の小腸中に未消化のまま進行させるに十分な期間患者の胃中の胃酸又は酵素の作用から該組成物を保護しうる物質で被覆し得る。本発明の化合物はまた局所的に投与でき例えば腫瘍が実際存在する部位に投与できる。本発明の化合物はまた徐放性の方法により（例えば徐放性の組成物又は灌注ポンプを用いることにより）投与できる。適当な固体担体は例えばリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、澱粉、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン及びワックスであり得る。

本発明の化合物を含有する製薬組成物はまた例えば溶液、乳液、懸濁液又は徐放剤の如き液体形で提供できる。適当な液体担体は例えば水、有機溶剤例えばグリセロール又はグリコール例えばポリエチレングリコール並びに水に入れた種々の割合でのそれらの混合物であり得る。

本発明の医薬の投与は局所、経口、非経口方式により、筋肉内注射等により実施できる。

前記の疾病又は疾患の処置に提供すべき本発明の化合物の投与量は、投与方法、処置すべき患者の年令及び体重並びに患者の状態に応じて変化し、かかりつけの医者又は獣医によって最終的に決定される。かかりつけの医者又は獣医によって決定される量はここでは「治療上有効な量」と呼ぶ。

本発明によると、ヘテロカルピンは以下に記載した方法により製造できる。

ヘテロカルピンの製造
本発明の好ましい変更例により、植物の相異なる器官から生ずるカルス（callus）又は細胞懸濁物の生体外培養を実施した。半固体又は液体培地で培養したこれらの組織は、生物学的特性を有する化合物を生合成しうるものである。

本明細書において「カルス」とは半固体栄養培地上で培養している植物の未分化細胞の巨視的な一群を意味する。本明細書において「未分化の細胞」なる用語は、何らかの形態発生現象なしに或る条件下でカルスの形で又は細胞懸濁物の形で増殖する才能を有する細胞を示している。最後に、「細胞懸濁物」とは、液体栄養培地で培養して顕微鏡的な一群を形成できる未分化の細胞を意味する。

栄養培地、ホルモン、培養条件の選択は本発明の一体部分を成し並びにこれらの生体外培養からの抽出及び抽出物の分析も一体部分を成す。

ピロカルプスヘテロフィラス種子からの細胞を例えば以下の手法により懸濁して培養し得る。

器官は培養される前に常法により汚染除去される。生体外の胚芽器官はまた前もっての消毒を必要とすることなくカロゲネシス（callogenesis）原料として役立った。好ましい基本の栄養培地は生体外培養に普通用いた培地の１種であり；これはギャンボルグ（Gamborg）の培地［ギャンボルグ等の大豆根細胞の懸濁培養物の栄養分要件、Exp. Cell Res. (1968)，50(1)，151〜158に記載される］である。炭素源はサッカロースであるがグルコースは1〜120g/l、好ましくは大体30g/lで用い得る。巨大成分含量は２の因子だけ低減させ得る。オウキシンあるいはオウキシンとサイトキニンとを培地に添加し、その際２つのホルモン、一般には2,4−ジクロロフェノキシ酢酸とキネチンとの組合せが好ましいが、α−ナフタレン酢酸（NAA）、β−インドール酢酸（IAA）、β−インドールブタン酸（IBA)又はピロクラムをキネチン又はベンジルアミノプリン（BAP）と組合せ得る。オウキシンについては濃度は0.1〜10mg/lで変化でき（例えば1mg/lを選択できる）、サイトキニンについては濃度は0.01〜2mg/lで変化できる（例えば0.06mg/lを選択できる）。ビタミン類は種々の基本培地と組合せたビタミン類である。培養は明所又は暗所で行なう。培養温度は10℃〜33℃で変化できるが、大体23℃であるのが好ましい。培地のpHは4〜6.5よりなり、滅菌前に5.8に調節するのが好ましい。更には、寒天を培地に添加しても良いし又はしなくても良い。

一次カルスは培養の数日後に出現し、大体１ヶ月後に元の移植物から分離でき、取出し且つ継代培養でき次いで4〜8週、好ましくは6週の間隔で寒天の半固体培地（試験管中又はペトリ皿上）で培養し、かくしてカルスは新規な培地上で連続的な継代培養により数年間も保持できる。該カルスはまた2〜6週、好ましくは3週で継代培養しながら攪拌した液体培地（エルレンマイヤーフラスコ又は生体反応器）で継代培養できる。

得られた細胞株はそれらの遺伝子起源、培養条件、外観及び形態発生の不在によって区別される。

凍結乾燥したピロカルプスヘテロフィラス細胞を0〜50℃、好ましくは4〜25℃の温度で水で抽出した。かくして得られた抽出物を凍結乾燥してから適当な濃度で（例えば乾燥物質の大体30％）再溶解する。硫酸アンモニウムの濃厚溶液（例えば飽和溶液の70〜90％を表わす濃度で）の添加により沈澱したタンパク質を最小量の水に溶解させ、不溶性物質は遠心分離により回収した。次いでタンパク質をカラムクロマトグラフィーにより分離し（溶離液は水であるのが好ましい）、ヘテロカルピン（大体90.9kDaのその分子量によって同定しうる）を次いで回収できる。

ヘテロカルピンを特異的に結合する抗体の製造
本発明は結合剤例えばヘテロカルピンを特異的に結合する抗体を提供する。かかる結合剤は検知しうる程度で（例えばエリザ試験により）前記タンパク質と反応し且つ他のタンパク質とは検知しうる程に反応しないならば該結合剤はタンパク質を「特異的に結合する」と記載される。「結合」は錯体を形成するように２個の別個の分子間の非共有結合を記載する。結合能力は例えば、錯体を形成するための結合定数の測定により評価し得る。結合定数は、錯体濃度の値を錯体化されていない成分濃度の値の積により除した時に得られた数値である。結合定数が10³ L/モルに達した時２つの生成物は「結合した」と呼ばれる。結合定数は当業者に周知の方法を用いて決定しうる。

前記の条件を満足しうる何れの結合剤も結合剤と考えられる。

本発明においては、結合剤は抗体あるいは抗体のフラグメントであるのが好ましい。抗体は当業者が利用しうる何れかの技術により製造できる（Harlow & Laneの抗体：A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバーラボラトリー、1988参照）。一般には、抗体は、モノクローナル抗体の生成を含めて細胞培養技術によりあるいは組み換え抗体を製造するために細菌又は哺乳動物から宿主細胞中へ抗体遺伝子の取り込みを介して製造することができる。

別の技術のうちでは、以下に記載した技術の使用が好ましい。ヘテロカルピンを含有する免疫源を一群の哺乳動物（例えばマイス，ラット，ラビット、羊又は山羊）に注射する。この段階では、ヘテロカルピンは修飾なしに免疫源として役立ち得る。別法として、ヘテロカルピンを牛の血清アルブミン又はアオガイのヘモシアニンの如き輸送タンパク質と組合せるならば、優れた免疫応答を誘発し得る。好ましくは予定の計画表に応じて免疫源を宿主動物に注射し、該動物から定期的に採血する。かくしてヘテロカルピンに特異的なモノクローナル抗体は、例えば適当な固体担体と組合せたヘテロカルピンを用いてアフィニティクロマトグラフィーによりかかる抗血清から精製し得る。

GHRHの放出に意図した製薬組成物
これらの製薬組成物はDe Wolf & Brettの薬理学的考察（Pharmacological Reviews）(2000)、52、207〜236による雑誌及びそこで援用した参考文献に記載された方法の１つにより、ヘテロカルピンとGHRHとから特に製造できる。

但し書きがなければ、ここで用いた全ての技術的及び科学的用語は本発明が属する分野の専門家によって通常理解される意味と同じ意味を有する。同様に、ここに挙げた全ての刊行物、特許出願、全ての特許及び全ての他の参考文献は参考のため組入れてある。

次の実施例は前記の方法を例示するために提供されており、本発明の範囲を限定するものと何ら考えるべきでない。

ヘテロカルピンの取得
実施例１
生体外での細胞の培養：
ピロカルプスヘテロフィラスの種子を発芽させ、この発芽から生じる葉柄を取出す。この葉柄をギャンボルグ培地（ギャンボルグ等の大豆根細胞の懸濁培養の栄養要件、Exp. Cell Res. (1968), 50(1), 151〜158）で培養し、該培地には30g/lのサッカロースと1mg/lの2,4−ジクロロフェノキシ酢酸と0.06mg/lのキネチンとが添加されている。培養は23℃の温度で暗所で試験管中で実施した。継代培養は通常の条件下で6週毎に実施した。外観が顆粒状である細胞株はベージュ色の着色を有する。

バイオマスからの新鮮で乾燥した材料の質量増大に基づいた細胞株の成長運動は8週に亘って実施した。２本の試験管からのカルスを合し、２週間分の収穫物を成し、第１の収穫は時間０で行なう。次いでカルス及びゲロースを収穫し、凍結乾燥した。成長は静止成長段階の出現前に６週までの培養中は指数型であると見出された。

細胞培養物の抽出：
4℃で375mlの水に浸漬し、4℃で一夜放置し、次いで4℃で4時間250mlの水に浸漬することにより25ｇの凍結乾燥したピロカルプスヘテロフィラス細胞を２回抽出し、最後に4℃で125mlの水で洗浄した。かくして得られた各々の水溶液は細胞残屑を水溶液から分離するためにセライトを載置したガラスフィルターに通して真空下に濾過した。かくして合した水溶液を次いで凍結乾燥して9.4ｇの乾燥材料を得た。次いで凍結乾燥した乾燥抽出物を20℃で31mlの水に溶解して30％の乾燥抽出物を含有する溶液を得た。一定に磁気攪拌しながら17.4ｇの硫酸アンモニウムを少量ずつ添加してタンパク質留分を沈澱させる。次いでタンパク質沈澱物を20分間3000rpmでの遠心分離により硫酸アンモニウム溶液から分離した。硫酸アンモニウム溶液を傾シャし、沈澱したタンパク質を22mlの水に溶解させ、再遠心分離し、濾過して不溶物の粒子を除去した。

得られた濾液を次いでゲル濾過クロマトグラフィーにかけた。5ml/分の流速で溶離液として超純水（Water's Milli-Q）を用いて生産者の推奨により製造したスーパーデックス（商標名）200（アメルシャムファルマシアバイオテク社、参照番号17-1043-01；13μmの平均直径を有する粒子）を装填したカラム（ブッヒN°19678；L＝230mm；内径＝26mm）に濾液を注入した。40mlのフラクションをかくして収集し、活性タンパク質は第３及び第４のフラクションで見出された。これらのフラクションを凍結乾燥して大体14.2mgの活性生成物を得た。

得られた生成物の純粋さはナトリウムドデシルサルフェート（SDS PAGE）を含有する電気泳動ゲル上で単一のバンドの出現により証明される。このバンドに対応する生成物は以下ではヘテロカルピンと呼ぶ。

実施例２
実施例１に記載したのと同じ手法により生体外培養した細胞を以下に記載した方法により抽出した。

20℃で2Ｌの脱塩水を用いて100ｇの凍結乾燥したピロカルプスヘテロフィラス細胞を抽出し、該混合物を一夜攪拌下に維持した。セライトベッド（酸で前もって洗浄した：1〜2cmの厚さ）により被覆したフリット（多孔度3、直径20cm）上での吸引により細胞及び抽出物を濾過した。回収した細胞を400mlの脱塩水で洗浄してから取出す。次いで大体10mlの18％塩酸の添加により水性濾液をpH3.0に酸性化した。次いで400mlのジクロロメタンを用いて液−液抽出により、酸性化した溶液を脱脂質化した。ジクロロメタン相を傾シャし、次いで除去した。脱脂質化した溶液を回転蒸発にかけて、残留ジクロロメタンを除去した。次いで大体30ｇのポリビニルピロリドンを脱脂質化溶液（pHは大体3.0）に添加し、該混合物を大体30分間攪拌してタンニンを除去した。25ｇのセライト（前もって酸で洗浄した）と25ｇのポリビニルピロリドンとを含有する混合ベッドにより被覆したフリット（多孔度3、直径10cm）上での吸引により該混合物をベッドに通して濾過した。次いで濾液を、生産者の指示により予備活性化された400mlのダイアイオン（商標名）HP-20（三菱化学社製）のベッドに通送する。得られる濾液は次いで大体60mlの20％水酸化アンモニウム溶液の添加によりアルカリ性（pH10）とさせる。残り1ｇのセライト（酸で前もって洗浄した）をアルカリ溶液に添加してから30分後にわずかな沈澱が生じ、該アルカリ溶液を次いで膜フィルター（0.22μm）に通して吸引することにより濾過した。次いで大体2Lの濾液を、0.5ml/分の流速で、アクタ（商標名）精製器上に載置されしかもピペラジン／HCl 0.1M緩衝剤でpH10.2に予備収支したハイプレプ（商標名）Q XL 16/10カラムに通送した（ハイプレプカラム及びアクタは両者共アメルシャムバイオサイエンス社からの製品である）。次いでカラムを、pH10.2の6カラム体積の開始緩衝剤で洗浄し、0.2M濃度のNaClを含有する5カラム容量の同じ緩衝剤で洗浄し及び1M濃度のNaClを含有する10カラム体積の同じ緩衝剤で連続的に洗浄した。ヘテロカルピンの大部分は、1M濃度のNaClを含有する最初の3カラム体積の緩衝剤中に回収された。活性フラクションは溶離剤として脱塩水を用いてセファデックス（Sephadex）（商標名）G25カラム（ベッドの容量：260ml）に通送することにより脱塩した。ホールドアップ体積に対応する最初のカラム体積に見出される活性フラクションは次いで凍結乾燥して170mgのヘテロカルピンを得た。かくして得られたヘテロカルピンはSDS PAGEゲルにおいて実際上単一のバンドである。

ヘテロカルピンの特徴付け
分析及びミクロ配列決定：
試料を10％ポリアクリルアミドゲル上に装填した。移動後に、ゲルを固定し、クーマシーブルー（Coomassie blue）で着色した。

トラック1、2、3、4及び5に対応する図３に示したゲルトラックはそれぞれ分子量マーカー（アメルシャム社）、実施例１で得られた如きヘテロカルピン最終フラクションの含量の0.5、1及び2μg及び分子量マーカー（アメルシャム社）である。当業者に周知の標準計算器具（例えばViber LourmatのBio-Profil Biol Dソフトウエア）を用いて標準の分子量マーカーグラフにより分子量を測定すると、ヘテロカルピンが90.9キロダルトン（±1.6キロダルトン）の分子量を有することを示すことができる。

タンパク質のミクロ配列決定分析については、タンパク質を含有するポリアクリルアミドのバンドを切り取り、0.4μgのエンドリシン−C（シグマ社）の存在下に35℃で18時間50mMのトリス（pH8.6）と0.03％のナトリウムドデシルサルフェートとを含有する300μlの消化緩衝剤中で消化した。得られたペプチドは直径1mmのDEAE-C18インラインカラム上でHPLCにより分離した。分離勾配はアセトニトリル（2〜70％）と0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)との混合物に基づく。次いで配列決定をプロサイスシークエンサー（アプライドバイオケミカル社製）で行なった。この様にして、3個のピークを配列決定し、かくしてヘテロカルピンを独特な要領で特徴付け得る。対応の配列は本明細書においてはSEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2及びSEQ.ID.NO.3によって同定された。

糖タンパク質の分析は、SDS-PAGEゲルによって分離された糖化構造の検出により実施した。この検出系は「過ヨウ素酸−シッフ」法の変法であり、糖タンパク質の証拠を示す深紅色バンドの出現を生ずる（シグマ社）。実施例１で得られる如きヘテロカルピンについては、図４で再現した結果を得る。

ヘテロカルピンの薬理学的特性
ヒトのGHRHレセプター（h GHRH-R）の安定なトランスフェクション：
ヒトのGHRHレセプターを安定な要領で発現するヒトの胚腎臓細胞、HEK-293（Dr. Stuart Sealfon、マウントシナイメディカルスクール、ニューヨーク州、ニューヨーク市によって開発された細胞系）はDr. Kelly Mayo（ノースウエスタン大学、シカゴ、IL）から得られた。

細胞培養及び膜の調製：
安定な要領で前記のヒトのGHRHレセプターを取込んだ（transfected）HEK-293細胞は、10％の子牛胎児血清と4mMのL−グルタミン（ライフテクノロジー社）との存在下に、0.4mg/mlのG418（ライフテクノロジー社）を補充したDMEM（ダルベッコの改質イーグル培地、高グルコース含量：ライフテクノロジー社により供給される）中で培養した。50mMのHEPES（pH7.4）と5mMの塩化マグネシウム（MgCl₂）と2mMのエチレングリコール−ビス(2−アミノエチル)−N,N,N',N'−四酢酸(EGTA)と50μg/mlのバシトラシンとを含有する緩衝剤Ａ中にHEK-293細胞を均質化し、次いで同じ緩衝剤Ａ中で音波処理にかけた。かくして均質化した細胞は4℃で39,000ｇで10分間遠心分離し、緩衝剤Ａに懸濁させ、4℃で40,000ｇで10分間遠心分離した。全膜タンパク質はブラドフォード技術によって定量した。ペレット化した膜をかくして次後に用いるため−80℃で貯蔵した。

h GHRH-Rにおける競合的結合試験：
安定な要領でヒトのGHRHレセプターを取込んだHEK-293細胞の膜を、50ｍＭのHEPES（pH7.4）と5mMのMgCl₂と2nMのEGTAと50mg/mlのバシトラシンと0.5％の牛血清アルブミン（BSA）とを含有する反応緩衝剤中に100μg/mlの濃度にまで希釈した。この膜は、23℃で2時間ヘテロカルピンの増大していく濃度の存在下に200μlの最終容量で0.05ｎMの[¹²⁵I]GHRH（1〜44アミド）(アメルシャム社)と共に培養した。反応は、ポリエチレンイミンを0.1％予備装填した96個の凹み（96-well）のGF／Cフィルター上での急速濾過により停止させた。次いで、パッカードの96凹みの濾過帯域を用いて50mMのTris（pH7.4）を含有する洗浄用緩衝剤で4℃で3回フィルターを洗浄した。かくして乾燥したフィルターを20μlのシンチレーションカクテル（マイクロシント０、パッカード社）に浸漬し、トップカウント計数（パッカード社）にかけるものである。非特異活性は100nMのhGHRHの存在下で測定した。用量反応曲線がh GHRH（0.001nM〜100nM）について生成し、得られた結果を図１に示す。

環状AMPの競合的形成：
安定な要領でヒトのGHRHレセプターを取込んだHEK-293細胞を48個の凹みの培養板に散布し、3日間培養した。次いで培地を取出し、0.5％のBSAと0.5mMの3−イソブチル−1−メチルキサンチン（IBMX）との存在下に250μlのDMEM（ダルベッコの改質イーグル培地、高グルコース含量：ライフテクノロジー社により供給）を含有する培地Ｂで置換し、37℃で５分間予備培養した。予備培養期間の終了時に、ヘテロカルピンを更に20分間試験した。見出された濃度は図２に示してある。培養は100μlの0.1M HClの添加により停止させ、ある分量をフラッシュプレートキット（ニューイングランドヌクリアー社）を用いてそれらの環状AMP含量について分析した。

ラットにおけるGHの検定：
ラット（雄のスプラーグダウレイ種）におけるGHの濃度は、スピーバイオ社（スピーバイオ社、フランス）によって開発された酵素−免疫学試験により血液試料中で測定した。ラットは増大する投与量（担体のみ、1、3及び10nmol）でヘテロカルピンを静脈内注射し、次いで10分後に10μg（3nmol）のhGHRHを静脈内注射することにより処置した。hGHRHを注射してから10分後に、成長ホルモンの濃度を前記の如く血液試料中で測定した。得られた結果を図５に表わす。

増大する濃度のヘテロカルピンの関数としてヒトのGHRHレセプターにヒトのGHRHが結合するのを抑制することを表わす図表である。増大する濃度のヘテロカルピンの関数として10mMのヒトのGHRHの存在下に安定な要領でヒトのGHRHレセプターを取込んだ細胞中で環状AMPの生産を抑制することを表わす図表である。 90.9kDaの分子量を有するヘテロカルピンの存在を示すSDS-PAGEタンパク質ゲルプレートの再現を表わす説明図である。ヘテロカルピンが糖タンパク質であることを示すSDS-PAGEタンパク質ゲルプレートの再現を表わす説明図（パネルＢ）である。増大する濃度のヘテロカルピンの関数として10μgのヒトのGHRHの存在下にラットにおけるGH合成の阻害を表わす度数分布図での説明図である。

<110> S.C.R.A.S.
<120> ヘテロカルピン、ヒトのGHRH−結合タンパク質
<130> ヘテロカルピン
<140>
<141>
<150> FR 01/02631
<151> 2001-02-27
<160> 3
<170> PatentIn Ver.2.1
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> ピロカルプスヘテロフィラス
<400> 1
Lys Leu Ile Gly Ala Arg Tyr Phe Asp Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> ピロカルプスヘテロフィラス
<400> 2
Tyr Gly Glu Asp Ile Ile Val Gly Val Ile Asp Ser Gly Val
1 5 10
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> ピロカルプスヘテロフィラス
<400> 3
Pro Glu Ser Glu Ser Tyr
1 5

Claims

植物のピロカルプスヘテロフィラスからの抽出により得られる単離したタンパク質において、該タンパク質は大体90.9kDaの分子量を有し且つペプチド配列SEQ.ID.NO.1，SEQ.ID.NO.2及びSEQ.ID.NO.3のフラグメントを含有してなり；該タンパク質はグリコシル化した形又はグリコシル化されていない形で呈示し得るものであることを特徴とする単離したタンパク質。
試験管内で培養した植物ピロカルプスヘテロフィラスの細胞からの抽出物から得られたことを特徴とする請求項１記載のタンパク質。
医薬として請求項１又は２記載のタンパク質。
請求項１の単離したタンパク質を特異的に結合するモノクローナル抗体あるいは該抗体の抗原結合性フラグメント。
医薬として、請求項１の単離したタンパク質を特異的に結合するモノクローナル抗体あるいは該抗体の抗原結合性フラグメント。
活性成分として請求項１又は２記載のタンパク質並びに１種又はそれ以上の製薬上許容しうる賦形剤を含有してなる製薬組成物。
GHRHの作用を拮抗するのに意図した医薬を製造するため請求項１又は２記載のタンパク質の使用。
増殖性の疾病を処置するのに意図した医薬を製造するため請求項１又は２記載のタンパク質の使用。
ガンを処置するのに意図した医薬を製造するため請求項１又は２記載のタンパク質の使用。
巨端症を処置するのに意図した医薬を製造するため請求項１又は２記載のタンパク質の使用。
糖尿病性網膜症及び腎症を処置するのに意図した医薬を製造するため請求項１又は２記載のタンパク質の使用。
植物のピロカルプスヘテロフィラスの細胞から請求項１記載のタンパク質を抽出し且つ単離する方法において、植物のピロカルプスヘテロフィラスの細胞を0〜50℃の温度で水で抽出する工程と、該抽出工程に続いてピロカルプスヘテロフィラスの細胞から請求項１記載のタンパク質富化濾液を分離する濾過工程と、植物のピロカルプスヘテロフィラスから抽出した別成分から請求項１記載のタンパク質を分離する１回又はそれ以上の分離工程とを行なうことからなる、請求項１記載のタンパク質の抽出、単離方法。