KR20030094262A - 인간 ｇｈｒｈ-결합 단백질, 헤테로카르핀 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 GHRH-결합 단백질 (인간 성장 호르몬-분비 호르몬)에 관한 것이다. 필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus Heterophyllus) 식물로부터 수득된, 상기 단백질은 GHRH의 효과를 길항시키고 증식하는 질병 (특히, 암), 말단비대증 또는 당뇨 망막병증 및 신장병증을 치료하는 것을 목적으로 하는 의약을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
Description
성장 호르몬 ("GH")은 인슐린-유사 성장인자 I (Insulin-Like Growth Factor I; IGF-1)과 같은, 다수의 성장인자의 생성을 촉진하고 더 많은 조직 (골격, 결합조직, 근육 및 내장)의 성장을 유발하는 191 개의 아미노산을 가진 단백질이다. GH는 또한, 핵산, 단백질의 합성 및 지질분해를 증가시키는 반면 배뇨를 감소시키는, 생리학적 활성을 갖는다 (Frohman L.A. & Kineman, R.D.,Handbook of Physiology, Hormonal Control of Growth, edited by Kostyo, J.L. & Goodman, H.M. (Oxford Univ. Press, New York, 1999), p. 189-221).
GH의 합성은 시상하부에 의해 분비되는 양성 또는 음성 작용을 가진 인자들에 의해서 조절된다. GH의 생성을 조절하는 주요 인자는, 인간에 있어서 44 개의 아미노산을 가진 펩티드, "성장 호르몬 분비 호르몬 (Growth Hormone Releasing Hormone; GHRH)"이다.
GH 및 GHRH 는 많은 질병들에 관여된다. 이들중, 하기는 특히 언급되어져야 한다 : 암 (특히 전립선암 또는 폐암), 말단비대증, 당뇨 망막병증 및 신장병증; 이들 병상들을 위해서, GHRH 길항제로의 치료가 필요되어지고 있다. 잠재적으로 관련된 많은 질병들로 인하여, 산업은 GHRH 길항제에 대한 연구를 계속하고 있다.
출원인은 그러므로 인간 GHRH에 결합성을 가진, 식물 기원의 신규한 단백질을 단리하였다.
본 발명의 첫 번째 주제는 그러므로 식물 필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus heterophyllus)로부터의 추출에 의해 수득될 수 있는 단리된 단백질로, 이는 분자 질량이 약 90.9 kDa 이고 펩티드 서열 SEQ. ID. NO. 1, SEQ. ID. NO. 2 및 SEQ. ID. NO. 3의 단편을 함유하는 것을 특징으로 하며, 상기 단백질은 글리코실화 또는 비-글리코실화 형태로 나타낼 수 있다. 이어지는 명세서를 간략하게 하기 위해서, 본 단백질을 이후 "헤테로카르핀 (heterocarpine)"이라 칭한다.
상기 SEQ. ID. NO. 1, SEQ. ID. NO. 2 및 SEQ. ID. NO. 3 서열은 하기와 같다:
SEQ. ID. NO. 1:KLIGARYFDK
SEQ. ID. NO. 2:YGEDIIVGVIDSGV
SEQ. ID. NO. 3:PESESY
상기 펩티드를 정의하기 위해서 상기 사용된 명명법 (본 출원의 나머지에서도 같다)은 "생화학 명명법에 대한 IUPAC-IUB 위원회 (IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature)"에 의해서 상술되어지는데, 표준 표시에 따르면, N-말단 아미노산 (아미노기)는 왼쪽에 나타내고 C-말단 아미노산 (카르복실기)는 오른쪽에 나타낸다. 용어 "천연 아미노산"은 천연 단백질에서 발견된 천연 L-아미노산: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp 및 His 중 하나를 나타낸다.
단백질은 그의 본래 환경에서 떠나게 되면 "단리되어진" 것이라고 부른다. 특히, 천연 단백질은 자연계에서 공존하는 생물학적 물질로부터 분리되어지면 단리된 것이다.
본 발명은 바람직하게는 그의 비-글리코실화된 형태의 헤테로카르핀에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 변법에 따르면, 헤테로카르핀은 생체외에서 배양된 식물 필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus Heterophyllus)의 세포의 추출물로부터 수득된다.
더욱이, 본 발명의 주제는 또한 헤테로카르핀에 특이적으로 결합하는, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.
헤테로카르핀은 인간 GHRH에 결합하는 성질을 갖는다. 생체외에서, 헤테로로카르핀은 인간 GHRH에 결합하므로 그의 수용기상에 인간 GHRH가 결합하는 동안 유도되는 사이클릭 AMP 의 합성을 억제한다. 생체내에서, 쥐에 있어서, 헤테로카르핀/인간 GHRH 복합체가 혈액 구획에서 형성되고, 투여량-의존 방식에 있어서, 몰대몰 비율로 10㎍의 인간 GHRH에 의해 유도된 GH 합성을 억제한다. 헤테로카르핀은 인간 GHRH에 결합하는 성질을 갖는다.
상기 성질들은 본 발명의 화합물을 제약적 용도로 적합하게 한다. 그러므로, 본 발명의 주제는 또한, 의약으로서, 글리코실화 또는 비-글리코실화된 형태인 헤테로카르핀이다. 본 발명은 또한 글리콜실화 또는 비-글리코실화된 형태의 헤테로카르핀을 활성성분으로서 함유하는 제약 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 또한 하나 이상의 제약학적으로 허용가능한 부형제를 함유한다. 또 다른 주제는 GHRH의 효과를 길항시키거나, 증식하는 질병 (및 특히 암)을 치료하거나, 말단비대증을 치료하거나 또는 당뇨 망막병증 또는 신장병증을 치료하는 것을 목적으로 하는 의약을 제조하기 위한 글리코실화 또는 비-글리코실화된 형태의 헤테로카르핀의 용도이다. 암에 관하여, 헤테로카르핀은 특히 유암종 및 췌장 종양, 시상하부-뇌하수체 신경절신경종, 기관지, 장 및 간의 암종, 교감아드레날린 종양, 갈색세포종, 뇌하수체샘종 및 갑상샘 암종을 치료하는 것을 목적으로 하는 의약을 제조하기에 특히 적합하다.
본 발명의 주제는 또한, 의약으로서, 헤테로카르핀에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 본 발명은 또한 헤테로카르핀에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 활성성분으로서 함유하는 제약 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 또한 하나 이상의 제약학적으로 허용가능한 부형제를 함유한다. 더욱이 본 발명은 GHRH의 효과를 길항시키거나, 증식하는 질병 (및 특히 암)을 치료하거나, 말단비대증을 치료하거나 또는 당뇨 망막병증 또는 신장병증을 치료하는 것을 목적으로 하는 의약을 제조하기 위한, 헤테로카르핀에 특이적으로 결합하는, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도에 관한 것이다. 암에 관하여, 상기 모노클로날 항체 또는 그의 상기 항원 결합 단편은 특히 유암종 및 췌장 종양, 시상하부-뇌하수체 신경절신경종, 기관지, 장 및 간의 암종, 교감아드레날린 종양, 갈색세포종, 뇌하수체샘종 및 갑상샘 암종을 치료하는 것을 목적으로 하는 의약을 제조하기에 특히 적합하다.
본 발명은 또한 GHRH의 서방성을 목적으로하는 제약 조성물에 있어서 부형제로서의 헤테로카르핀의 용도에 관한 것이다. 이는 또한 GHRH, 헤테로카르핀 및 하나 이상의 제약학적으로 허용가능한 부형제를 함유하는 제약 조성물에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명의 또 다른 주제는 식물 필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus Heterophyllus)의 세포로부터 헤테로카르핀을 추출하고 단리시킬 수 있는 방법으로, 상기 세포는 바람직하게는 생체외 배양액으로부터 기원한다. 상기 방법들은 본질적으로 0 내지 50 ℃, 및 바람직하게는 4 내지 25 ℃의 온도에서 물로 식물 필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus Heterophyllus)로부터의 세포의 추출 단계를 포함하고, 상기 추출 단계에 이어서 필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus Heterophyllus) 세포로부터 헤테로카르핀-풍부 여액을 분리하는 여과 단계 및 식물 필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus Heterophyllus)로부터 추출된 다른 성분들로부터 헤테로카르핀의 1 회 이상의 분리 단계가 잇따른다.
첫 번째 변법에 따르면, 상기 추출 및 단리 방법들은 하기 연속적인 단계들을 필수적으로 포함한다:
a) 0 내지 50 ℃, 및 바람직하게는 4 내지 25 ℃의 온도에서 물로 식물 필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus Heterophyllus)로부터의 세포 추출 단계, 상기 추출 단계에 이어서 필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus Heterophyllus) 세포로부터 헤테로카르핀-풍부 여액을 분리하는 여과 단계;
b) 예를 들어, 황산암모늄을 첨가함으로써 추출된 단백질의 침전 단계, 이어서 침전물의 (여과에 의한 또는, 바람직하게는, 원심분리에 의한) 분리 단계;
c) 단계 b)에서 회수된 침전물을 물에 용해시키고; 및
d) 상기 용액의 다른 성분들로부터 헤테로카르핀을 분리하기 위한 겔-여과 크로마토그래피 단계.
또 다른 변법에 따르면, 상기 추출 및 단리 방법들은 하기 연속적인 단계들을 필수적으로 포함한다:
a) 0 내지 50 ℃, 및 바람직하게는 4 내지 25 ℃의 온도에서 물로 식물 필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus Heterophyllus)로부터의 세포 추출 단계, 상기 추출 단계에 이어서 필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus Heterophyllus) 세포로부터 헤테로카르핀-풍부 여액을 분리하는 여과 단계;
b) 비-산화 산 (예를 들어, 염산, 황산 또는 인산)을 첨가하여 바람직하게는 2 내지 4 의 pH로 산성화된, a) 에서 수득된 용액의, (바람직하게는 디클로로메탄, 헵탄, 헥산 또는 시클로헥산과 같은 유기 용매를 이용하는) 액체-액체 추출법을 이용한, 탈지화 단계;
c) b) 에서 수득된 탈지화된 용액을 폴리비닐피롤리돈 (또는 역시 나일론 66)과 접촉시킨 다음 큰-구멍 수지 (바람직하게는 수지 Diaion(등록상표) HP-20과같은 폴리스티렌-기재 수지)상에서의 여과에 의한 탄닌의 제거 단계;
d) 단계 c) 이후에 수득된 여액을 수산화암모늄, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨과 같은 염기의 첨가에 의해서 알칼리 pH (바람직하게는 pH 9 내지 11)로 조절하고;
e) 용액의 다른 성분들로부터 헤테로카르핀을 분리시키기 위해 음이온-교환 수지상에서 1 회 이상의 여과 단계, 본 단계 또는 상기 여과 단계를 위한 용출액은 바람직하게는 pH 가 9 내지 11 이고 선택적으로 (예를 들어 염화나트륨 또는 황산암모늄과 같은) 염의 농도구배를 함유하는 완충용액이다;
f) 분자 질량을 기준으로 혼합물의 구성물들을 분리시키는 수지 (수지 Sephadex(등록상표) G25 또는 Superdex(등록상표) 200 HR과 같은 수지) 상에 단계 a)에서 수득된 용액을 통과시키고 상기 수지상의 상기 혼합물을 물로 용출시키는 것으로 구성된 탈염화 단계.
본 발명의 화합물을 함유하는 제약 조성물은, 예를 들어, 분말, 환제, 과립, 정제, 리포좀, 젤라틴 캡슐 또는 좌약과 같은 고형 형태일 수 있다. 환제, 정제 또는 젤라틴 캡슐은 환자의 위에서 위산 또는 효소의 작용으로부터 충분한 시간동안 조성물을 보호하여 상기 조성물을 소화되지 않은 채로 환자의 소장으로 통과시킬 수 있는 물질로 피복될 수 있다. 화합물은 또한 예를 들어 종양의 실제 위치에 국소 투여될 수 있다. 화합물은 또한 (예를 들어, 서방성 조성물 또는 살포 펌프를 이용하는) 서방성 방법에 따라서 투여될 수 있다. 적절한 고형 지지물은, 예를 들어, 인산칼슘, 스테아르산마그네슘, 탄산마그네슘, 탈크, 설탕, 락토스, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 폴리비닐피롤리딘 및 왁스일 수 있다.
본 발명의 화합물을 함유하는 제약 조성물은 또한, 예를 들어, 용액, 유액, 현탁액 또는 서방성 제제와 같은 액체 형태로 제공될 수 있다. 적절한 액체 지지체는, 예를 들어, 물, 글리세롤 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜과 같은 유기 용매, 뿐만 아니라 수중의 다양한 비율인 그들의 혼합액일 수 있다.
본 발명에 따른 의약의 투여는 국부적, 경구, 비경구 경로에 의해, 근육내 주사 등에 의해 수행될 수 있다.
상기 언급된 질병 또는 질환의 치료를 위해 제공되는, 본 발명에 따른 화합물의 투여량은 투여 방법, 치료받을 환자의 연령 및 체중 뿐만 아니라 환자의 상태에 따라서 다양하고, 진료하는 의사 또는 수의사에 의해 최종적으로 결정될 것이다. 진료하는 의사 또는 수의사에 의해 결정된 양을 본 명세서에서 "치료학적으로 효과적인 양"으로 부른다.
본 발명에 따르면, 헤테로카르핀은 이후 기재되는 방법에 의해서 제조될 수 있다.
헤테로카르핀의 제조
본 발명의 바람직한 변법에 따르면, 식물의 상이한 기관들로부터 유래된 유합조직 또는 세포 현탁액의 생체외 배양이 수행되었다. 반-고체 또는 액체 배지상에서 배양된 상기 조직은 생물학적 성질들을 가진 화합물을 생-합성할 수 있다.
본 출원에 있어서 "유합조직 (callus)"은 반-고체 영양 배지상에서 배양중식물의 미분화된 세포의 거시적인 군집을 의미한다. 본 출원에 있어서 용어 "미분화된 세포"는 어떠한 형태발생학적 현상없이 어떠한 상태하에서 유합조직 또는 세포 현탁액의 형태로 번식하는 경향을 갖는 세포를 의미한다. 마지막으로, "세포 현탁액"은 액체 영양 배지에 있어서 배양중 거시적인 군집을 형성할 수 있는 미분화된 세포를 의미한다.
영양 배지, 호르몬, 배양 조건의 선택은 본 발명의 필수적인 부분 뿐만아니라 상기 생체외 배양액으로부터의 추출 및 추출물의 분석을 형성한다.
필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus Heterophyllus) 종자로부터의 세포는 예를 들어 이후의 공정에 따라서 현탁액중에서 배양될 수 있다.
기관들은 배양되기 전에 통상적인 방법들에 따라서 오염제거된다. 소식물(plantule) 기관은 생체외에서 또한 미리 살균할 필요없이 칼로제네시스 (callogenesis) 출발 물질로서 제공되었다. 바람직한 기본적인 영양 배지는 생체외 배양을 위해 통상적으로 사용되는 배지중 하나이다: 이는 갬보그(Gamborg) 배지이다 (Gamborg et al., Nutrient requirements of suspension cultures of Soybean root cells,Exp. Cell Res.(1968),50(1), 151-158 기재). 탄소원은 사카로스이지만 글루코스가 또한 1 내지 120 g/l, 바람직하게는 약 30 g/l의 농도로 사용될 수 있다. 거대-원소 함량은 또한 2의 인자에 의해서 감소될 수 있다. 옥신 또는 옥신 및 사이토키닌은 두 호르몬, 일반적으로 2,4-디클로로페녹시아세트산 및 키네틴의 조합을 위해서 배지에 첨가되지만, α-나프탈렌아세트산 (NAA), β-인돌아세트산 (IAA), β-인돌부탄노산 (IBA) 또는 피클로람이 또한 키네틴 또는 벤질아미노푸린 (BAP)와 조합될 수 있다. 농도는 옥신에 대해서는 0.1 내지 10 ㎎/l (예를 들어, 1 ㎎/l이 선택될 수 있다), 및 사이토키닌에 대해서는 0.01 내지 2 ㎎/l (예를 들어, 0.06 ㎎/l이 선택될 수 있다)으로 다양할 수 있다. 비타민은 상이한 기본 배지들과 관련되는 것들이다. 배양은 밝게 또는 어둡게 수행된다. 온도는 10 ℃ 내지 33 ℃로 다양할 수 있지만 바람직하게는 약 23 ℃ 이다. 배지의 pH는 멸균전에 4 내지 6.5 이고 바람직하게는 5.8 로 조정된다. 더욱이, 아가는 배지에 첨가될 수도 또는 첨가되지 않을 수도 있다.
일차적인 유합조직은 배양한 지 며칠 후에 나타나고 본래 이식물로부터 분리되고, 약 1 개월 후에 제거되어 계대배양된 다음 4 내지 8 주, 바람직하게는 6 주의 간격으로 아가 반-고체 배지 (튜브내 또는 페트리디쉬내) 상에서 배양되고, 그러므로 유합조직은 새로운 배지상에서 연속적인 계대배양에 의해서 수년간 유지될 수 있다. 유합조직은 또한 2 내지 6 주, 바람직하게는 3 주 때의 계대배양액을 가지고 교반되는 액체 배양 배지 (얼렌마이어 플라스크 또는 바이오반응기)내에서 계대배양될 수 있다.
수득된 균주는 그들의 유전적 기원, 배양 조건, 외형 및 형태발생학의 부재에 의해서 구별된다.
동결건조된 필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus Heterophyllus) 세포를 0 ℃ 내지 50 ℃, 및 바람직하게는 4 내지 25 ℃의 온도에서 물로 추출한다. 상기 수득된 추출물을 동결건조시킨 다음 적절한 농도 (예를 들어, 건조 물질의 약 30 %)로 재용해시킨다. 황산암모늄의 농축된 용액(예를 들어, 포화 농도의 70 내지 90 % 를 나타내는 농도)의 첨가에 의해 침전된 단백질을 최소한의 물에 용해시키고 불용성 물질을 원심분리에 의해 회수한다. 단백질을 이어서 컬럼 크로마토그래피 (용출액은 바람직하게는 물이다)에 의해 분리하고 헤테로카르핀 (약 90.9 kDa의 분자 질량에 의해 정의가능)을 이어서 회수할 수 있다.
헤테로카르핀에 특이적으로 결합하는 항체의 제조
본 발명은 헤테로카르핀에 특이적으로 결합하는 항체와 같은 결합제를 제공한다. 이와 같은 제제를, 상기 단백질과는 검출가능한 수준으로 반응하고 다른 단백질들과는 검출가능하게 반응하지 않는다면, "특이적으로 결합하는" 단백질이라고 칭한다. "결합"은 복합체가 형성되도록 2 개의 분리된 분자 사이에서의 비공유 연결을 의미한다. 결합능은, 예를 들어 복합체의 형성에 대한 결합 상수를 측정함으로써 평가될 수 있다. 결합 상수는 복합체 농도의 수치를 비-복합화된 성분 농도 수치의 생성물로 나누는 경우 수득되는 수치이다. 2 개의 생성물을, 결합 상수가 103 l/몰에 도달하는 경우, "결합되어진" 것으로 부른다. 결합 상수는 당 분야의 숙련자에게 이미 공지된 방법들을 이용하여 결정될 수 있다.
상기 기준을 만족할 수 있는 임의의 제제가 결합제로 간주될 수 있다.
본 발명에 있어서, 결합제는 바람직하게는 항체 또는 그의 단편이다. 항체는 당 분야의 숙련자에게 이용가능한 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다 (참고: Harlow and Lane,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 일반적으로, 항체들은 모노클로날 항체의 생성을 포함하는 세포 배양 방법에 의해 또는 재조합 항체들을 생성하기 위한 박테리아 또는 포유류로부터의 숙주 세포내로 항체 유전자의 형질전환을 통해 생성될 수 있다. 다른 방법들 중, 이후 기재된 방법들의 이용이 바람직하다. 헤테로카르핀을 함유하는 면역원을 일군의 포유류 (예를 들어, 마우스, 쥐, 토끼, 양 또는 염소)에 주입한다. 상기 단계에서, 헤테로카르핀은 변형없이 면역원으로서 제공될 수 있다. 이와는 달리, 헤테로카르핀이 소의 혈청 알부민 또는 삿갓조개 헤모시아닌과 같은 운반 단백질과 조합된다면 우세한 면역 반응이 유도될 수 있다. 면역원을, 바람직하게는 예정된 스케쥴에 따라서, 숙주 동물에 주입하고, 상기 동물들로부터 주기적으로 채혈한다. 헤테로카르핀에 특이적인 폴리클로날 항체를 상기 항혈청으로부터, 예를 들어, 적절한 고형 지지체와 연결된 헤테로카르핀을 이용한 친화 크로마토그래피에 의해서 정제할 수 있다.
GHRH의 분비를 목적으로 하는 제약 조성물:
상기 조성물은 저널 [De Wolf and Brett,Pharmacological Reviews(2000),52, 207-236] 및 본 명세서에서 인용되는 참고문헌에 기재된 방법들중 하나에 따라서 헤테로카르핀 및 GHRH 로부터 특히 제조될 수 있다.
달리 특정된 바 없으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서의 보통 전문가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 유사하게, 본 명세서에서 언급되는 모든 공보, 특허출원, 모든 특허 및 모든 기타 참고문헌들은 참고문헌으로서 포함된다.
하기 실시예들은 상기 공정들을 설명하기 위해서 제시된 것으로 본 발명의 범위를 국한시키는 것으로 결코 간주되어서는 안된다.
헤테로카르핀의 수득
실시예 1:
생체외 세포의 배양:
필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus heterophyllus) 종자를 발아시키고 상기 발아로부터 생성된 줄기를 제거한다. 상기 줄기를 30 m/l의 사카로즈, 1 ㎎/l의 2,4-디클로로페녹시아세트산 및 0.06 ㎎/l의 키네틴이 첨가된 갬버그 배지 (Gamborg medium; Gamborg et al, Nutrient requirements of suspension cultures of Soybean root cells,Exp, Cell Res.(1968),50(1), 151-158)에서 배양한다. 배양은 23 ℃의 온도의 튜브내에서 어둠하에 수행된다. 통상적인 조건하에서 6 주 마다 계대배양을 수행한다. 외형이 과립상인 균주는 베이지색의 색소를 형성한다.
생물체 총량으로부터 비건조된 및 건조된 물질의 질량의 증가를 기준으로, 균주의 성장 운동을 8 주에 걸쳐 수행하였다. 2 개의 튜브로부터의 유합조직을 합쳐 주 2회의 수확을 구성하고, 첫 번째 수확은 시간 0에서 일어난다. 유합조직 및 겔로스(gelose)를 이어서 수확하여 동결건조시킨다. 성장 정지상이 나타나기 전의 배양 6 주 까지는 성장이 기하급수적으로 늘어나는 것으로 관찰된다.
세포 배양액의 추출:
25 g의 동결건조된 필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus heterophyllus) 세포를 4 ℃ 인 375 ml의 물에 침지시켜 2 회 추출하고 4 ℃에서 하룻밤 방치한 다음 4 ℃ 인 250 ml의 물에 4 시간 동안 침지하고 마지막으로 4 ℃ 인 125 ml의 물로 세척한다. 상기 수득된 각 수용액을 셀라이트가 얹혀진 유리 필터를 통해 진공하에 여과시켜 수용액으로부터 세포 잔해를 분리한다. 상기 합하여진 수용액들을 이어서 동결건조시켜 9.4 g의 건조된 물질을 수득한다. 동결건조된 건조 추출물을 이어서 20 ℃ 인 31 ml의 물에 용해시켜 30 % 의 건조 추출물을 함유하는 용액을 수득한다. 17.4 g의 황산암모늄을 일정한 자석 교반하에 소량씩 첨가하여 단백질 분획을 침전시킨다. 단백질 침전물을 이어서 3000 rpm으로 20 분간 원심분리하여 황산암모늄 용액으로부터 분리한다. 황산암모늄 용액을 가만히 따라내고 침전된 단백질을 22 ml의 물에 용해시키고, 다시 원심분리하고 여과시켜 불용성 입자를 제거한다.
수득된 여액을 이어서 겔-여과 크로마토그래피한다. 제조자의 추천에 따라 제조된 슈퍼덱스™200 (Amersham Pharmacia Biotech, reference no. 17-1043-01; 평균 직경이 13 ㎛인 입자)로 충진되고 용출액으로서 초고순도의 물 (Water's Milli-Q)을 이용하고 유속이 분당 5 ml인 컬럼 (Buchi N˚19678, L = 230 ㎜; 내부 직경 = 26 ㎜)에 주입한다. 40 ml 분획들을 이어서 수합하고 활성 단백질은 세 번째 및 네 번째 분획에서 발견된다. 상기 분획들을 동결건조시켜 약 14.2 ㎎ 의 활성 생성물을 수득한다.
수득된 생성물의 순도는 소듐 도데실술페이트을 함유하는 전기영동 겔 (SDS PAGE)상에서 단일 밴드의 형태로 증명된다. 상기 밴드에 상응하는 생성물을 이후 헤테로카르핀으로 명명한다.
실시예 2:
상기 실시예 1에 기재된 것과 동일한 공정에 따라서 생체외 배양된 세포를 이후 기재되는 방법에 따라서 추출한다.
100 g의 동결건조된 필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus heterophyllus) 세포를 20 ℃에서 2 리터의 탈염수를 이용하여 추출하고, 혼합물을 하룻밤 교반하에 유지시킨다. 세포 및 추출물을 셀라이트 베드(산으로 미리 세척; 1 내지 2 ㎝ 두께)로 덮힌 프릿(다공도 3, 직경 20 ㎝)상에서 흡입에 의해 여과한다. 회수된 세포를 400 ml의 탈염수로 세척한 후 제거한다. 수성 여액을 이어서 약 10 ml의 18% 염산을 첨가하여 pH 3.0 으로 산성화시킨다. 산성화된 용액을 이어서 400 ml의 디클로로메탄을 이용하여 액체-액체 추출법으로 탈지화시킨다. 디클로로메탄상을 가만히 따라낸 다음 제거한다. 탈지화된 용액을 회전 증발시켜 잔류하는 디클로로메탄을 제거한다. 약 30 g의 폴리비닐피롤리돈을 이어서 탈지화된 용액 (pH 약 3.0)에 첨가하고 혼합물을 약 30 분간 교반하여 타닌을 제거한다. 상기 혼합액을 25 g의 셀라이트 (산으로 미리 세척) 및 25 g의 폴리비닐피롤리돈을 함유하는 혼합된 베드로 덮힌 프릿(다공도 3, 직경 10 ㎝)상에서 흡입에 의해 베드를 통해 여과시킨다. 여액을 이어서 제조자의 지시에 따라 미리-활성화시킨 400 ml의 Diaion(등록상표) HP-20 (Mitsubishi Chemical Company)의 베드를 통해 통과시킨다. 생성된 여액은 이어서 약 60 ml의 20% 수산화암모늄 용액의 첨가에 의해 알칼리 (pH 10)로 된다. 30 분의 안정 후 약간의 침전이 나타난다. 1 g의 셀라이트 (산으로 미리 세척)를 상기 알칼리 용액에 첨가하고 이어서 막 필터 (0.22 ㎛)를 통해 흡입에 의해 여과시킨다. 약 2 리터의 여액을 이어서, Akta(등록상표) 청정건위에 올려지고 피페라진/HCl 0.1 M 완충액으로 pH 10.2 로 예비-평형화된, HiPrep(등록상표) Q XL 16/10 컬럼을 통해 분당 0.5 ml의 유속으로 통과시킨다 (HiPrep(등록상표) 컬럼 및 Akta(등록상표) 청정건은 모두 Amersham Biosciences 사의 제품이다). 상기 컬럼을 이어서 6 배의 컬럼 부피인 pH 10.2 의 출발 완충용액 , 5 배의 컬럼 부피인 0.2 M 농도의 NaCl을 함유하는 동일한 완충액; 및 10 배의 컬럼 부피인 1 M 농도의 NaCl을 함유하는 동일한 완충액으로 연속적으로 세척한다. 대부분의 헤테로카르핀이 1 M 농도의 NaCl을 함유하는 완충액의 처음 3 배의 컬럼 부피에서 회수된다. 활성 분획들을 용출액으로서 탈염수를 이용하는 Sephadex(등록상표) G25 컬럼 (베드 부피: 260 ml)을 통과시켜 탈염화시킨다. 보유 부피에 상응하는 첫 번째 컬럼 부피에서 발견된, 활성 분획들을 이어서 동결 건조시켜 170 mg의 헤테로카르핀을 수득한다. 상기 수득된 헤테로카르핀은 SDS PAGE 겔상에서 사실상 단일 밴드이다.
헤테로카르핀의 특징
분석 및 마이크로-서열분석:
시료를 10% 폴리아크릴아미드 겔상에 부하한다. 이동 후, 겔을 고정시키고 코마씨 블루로 염색한다.
트랙 1, 2, 3, 4 및 5에 상응하는 도 3에 나타낸 겔 트랙들은 각기 분자량 마커 (Amersham), 0.5, 1 및 2 ㎍ 함량의 실시예 1에서 수득된 최종 헤테로카르핀 분획 및 분자 질량 마커 (Amersham)이다. 당 분야의 숙련자에게 잘 알려진 표준계산법(예를 들어, Viber Lourmat's Bio-Profil Bio 1D 소프트웨어)을 이용하여 표분 분자 질량 마커에 의해 분자 질량의 결정은 헤테로카르핀이 90.9 킬로달톤 (±1.6 킬로달톤)의 분자 질량을 갖는다는 것을 보여줄 수 있다.
단백질 마이크로-서열 분석을 위해서, 단백질을 함유하는 폴리아크릴아미드 밴드를 잘라내어 0.4 ㎍의 엔돌리신-C (Sigma)의 존재하에 35 ℃에서 18 시간 동안 50 mM 트리스 (pH 8.6), 0.03% 소듐 도데실술페이트를 함유하는 분해 완충액 300 ㎕ 내에서 분해시킨다. 수득된 펩티드를 직경이 1 ㎜인 DEAE-C18 인-라인 컬럼상에서 HPLC에 의해 분리시킨다. 분리 농도구배는 아세토니트릴 (2 내지 70 %) 및 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)의 혼합물을 기준으로 한다. 이어서 서열분석을 프로사이스 시퀀서 (Procise sequencer; Applied Biosystem)상에서 수행한다. 상기 방법으로, 3 개의 피크를 서열분석함으로써 독특한 방식으로 헤테로카르핀을 특성화하는 것이 가능하다. 상응하는 서열들은 SEQ. ID. NO. 1, SEQ. ID. NO. 2 및 SEQ. ID. NO. 3 으로 본 출원에서 정의된다.
당단백질의 분석은 SDS-PAGE 겔에 의해 분리된 당단백질의 당 구조의 검출에 의해 수행된다. 상기 검출 시스템은 "주기적 산-시프 (Periodic Acid-Schiff)" 방법의 변형이고 당단백질의 증거를 보여주는 마젠타색 밴드의 모습을 나타낸다 (Sigma). 실시예 1 에서 수득된 바와 같은 헤테로카르핀에 대해서, 도 4에서 재현된 결과가 수득된다.
헤테로카르핀의 약리학적 성질
인간 GHRH 수용기 (hGHRH-R)의 안정한 형질전환:
안정한 방식으로 인간 GHRH 수용기를 발현하는 인간 배아 신장 세포, HEK-293 (a cell line developed by Dr. Stuart Sealfon, Mount Sinai Medical School, New York, New York)를 켈리 마이오 박사 (Northwestern University, Chicago, IL)로부터 수득하였다.
세포 배양 및 세포막 제조:
안정한 방식으로 상기 기재된 인간 GHRH 수용기로 형질전환된 HEK-293 세포를, 10 % 의 소태아 혈청 및 4 mM 의 L-글루타민 (Life technologies)의 존재하에 0.4 ㎎/ml 의 G418 (Life technologies)이 추가공급된 DMEM (둘베코 변형된 이글배지; Dulbecco's modified Eagle's medium, 글루코스 고함량; Life technologies 사제) 에서 배양한다. 세포를 50 mM의 HEPES (pH 7.4), 5 mM의 염화마그네슘 (MgCl2), 2 mM의 에틸렌글리콜-비스(2-아미노-에틸)-N,N,N',N'-테트라아세트산 (EGTA) 및 50 ㎍/ml의 바시트라신을 함유하는 완충액 A로 균질화시킨 다음 동일한 완충액 A 내에서 초음파처리한다. 상기 균질화된 세포를 4 ℃에서 39,000 g로 10 분간 원심분리하고, 완충액 A 에 현탁시킨 다음 4 ℃에서 40,000 g로 10 분간 재-원심분리한다. 막 단백질 전부를 브래드포드 방법으로 정량한다. 펠렛화된 막을 이어서 다음 사용을 위해 -80 ℃에서 보관한다.
hGHRH-R에 대한 경쟁적 결합 시험:
안정한 방식으로 인간 GHRH 수용기로 형질전환된 HEK-293 세포의 막을 50 mM HEPES (pH 7.4), 5 mM 의 MgCl2, 2 mM의 EGTA, 50 ㎍/ml의 바시트라신 및 0.5 %의소 혈청 알부민 (BSA)를 함유하는 반응 완충액중에 100 ㎍/ml의 농도로 희석한다. 상기 막을 증가하는 농도의 헤테로카르핀의 존재하에 최종 부피 200 ㎕로 0.05 nM의 [125I]GHRH (1-44 아미드) (Amersham)와 함께 23 ℃에서 2 시간 동안 항온배양한다. 상기 반응을 폴리에틸렌이민으로 0.1% 예비-부하된 96-웰 GF/C 필터상에서 급속 여과에 의해 정지시킨다. 필터를 이어서 50 mM 트리스 (pH 7.4)를 함유하는 세척 완충액으로 팩커드 96-웰 여과 스테이션을 이용하여 4 ℃에서 3 회 세척한다. 이어서 건조된 필터를 20 ㎕의 섬광 칵테일 (Microscint O, Packard)내에 침지시키고 톱카운트 카운팅 (Topcount counting; Packard)을 수행한다. 비-특이적 활성은 100 nM의 hGHRH의 존재하에서 측정한다. 투여량-반응 곡선이 hGHRH (0.001 nM - 100 nM)에 대해 나타나고, 수득된 결과들은 도 1에 포함된다.
사이클릭 AMP의 경쟁적 형성:
안정한 방식으로 인간 GHRH 수용기로 형질전환된 HEK-293 세포를 48-웰 배양 플레이트에 분배하고 3 일간 배양한다. 배양 배지를 이어서 제거하고, 0.5 %의 BSA, 0.5 mM의 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX)의 존재하에서 250 ㎕의 DMEM (둘베코 변형된 이글배지; Dulbecco's modified Eagle's medium, 글루코스 고함량; Life technologies 사제)를 함유하는 배지 B 로 대체하고, 37 ℃에서 5분간 예비-항온배양한다. 예비-항온배양 기간의 마지막에, 헤테로카르핀을 20 분 더 시험한다. 관찰된 농도를 도 2에 기록한다. 100 ㎕의 0.1 M HCl을 첨가하여 상기 항온배양을 정지시키고, 플래쉬플레이트 키트 (FlashPlate kit; New England Nuclear)를 이용하여 그들의 사이클릭 AMP 에 대해서 분량을 분석한다.
쥐에 있어서 GH의 검정:
쥐 (Sprague Dawley 수컷)에 있어서 GH의 수준을 Spi-Bio 사에 의해 개발된 효소-면역 시험 (Spi-Bio, France)에 의해 혈액 시료에서 측정한다. 증가하는 투여량 (운반체만, 1, 3 및 10 nmol)의 헤테로카르핀을 정맥내 주사한 다음, 10 분 후 10 ㎍ (3 nmol)의 hGHRH를 정맥내 주사하여 쥐를 처치한다. hGHRH 주사한 지 10 분 후, 성장 호르몬 수준을 상기 기재된 바와 같이 혈액 시료에서 측정한다. 수득된 결과를 도 5 에 나타낸다.
본 발명은 인간 GHRH-결합 (human Growth Hormone releasing hormone; 인간 성장 호르몬 분비 호르몬) 단백질에 관한 것이다.
도 1은 헤테로카르핀의 증가하는 농도의 작용으로써 인간 GHRH 수용기상에 인간 GHRH의 결합의 억제를 나타내는 그래프이다.
도 2는 헤테로카르핀의 증가하는 농도의 작용으로써 10 nM의 인간 GHRH의 존재하에 안정한 방식으로 인간 GHRH 수용기로 형질전환된 세포에서 사이클릭 AMP의 생성 억제를 나타내는 그래프이다.
도 3은 분자량이 90.9 kDa인 헤테로카르핀의 존재를 보여주는 SDS-PAGE 단백질 겔 플레이트의 재현이다.
도 4는 헤테로카르핀이 당단백질인 것을 보여주는 SDS-PAGE 단백질 겔 플레이트의 재현이다 (판넬 B).
도 5는 헤테로카르핀의 증가하는 농도의 작용으로써 10 ㎍의 인간 GHRH의 존재하에 쥐에서 GH 합성의 억제를 나타내는 히스토그램 형태의 표시이다.
Claims (11)
- 분자 질량이 약 90.9 kDa이고, 펩티드 서열 SEQ. ID. NO. 1, SEQ. ID. NO. 2 및 SEQ. ID. NO. 3의 단편을 함유하고; 단백질이 글리코실화 또는 비-글리코실화된 형태로 제시될 수 있는 것을 특징으로 하는, 식물 필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus Heterophyllus)로부터의 추출에 의해 수득될 수 있는 단리된 단백질.
- 제1항에 있어서, 생체외에서 배양된 식물 필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus Heterophyllus)의 세포로부터의 추출물로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 의약으로서의 단백질.
- 제1항의 단리된 단백질에 특이적으로 결합하는, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항의 단리된 단백질에 특이적으로 결합하는, 의약으로서의 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 활성성분으로서, 제1항 또는 제2항에 따른 단백질 및 하나 이상의 제약학적으로 허용가능한 부형제를 함유하는 제약 조성물.
- GHRH의 효과를 길항시키는 것을 목적으로 하는 의약을 제조하기 위한 제1항 또는 제2항에 따른 단백질의 용도.
- 증식하는 질병, 특히 암을 치료하는 것을 목적으로 하는 의약을 제조하기 위한 제1항 또는 제2항에 따른 단백질의 용도.
- 말단비대증을 치료하는 것을 목적으로 하는 의약을 제조하기 위한 제1항 또는 제2항에 따른 단백질의 용도.
- 당뇨 망막병증 및 신장병증을 치료하는 것을 목적으로 하는 의약을 제조하기 위한 제1항 또는 제2항에 따른 단백질의 용도.
- 0 내지 50 ℃의 온도에서 물에 의한 식물 필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus Heterophyllus)의 세포 추출 단계를 포함하고, 상기 추출 단계에 이어서 필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus Heterophyllus)의 세포로부터 헤테로카르핀-풍부 여액을 분리하기 위한 여과 단계 및 식물 필로카르퍼스 헤테로필러스 (Pilocarpus Heterophyllus)로부터 추출된 다른 성분들로부터 헤테로카르핀의 하나 이상의 분리 단계들을 포함하는, 식물 필로카르퍼스 헤테로필러스 (PilocarpusHeterophyllus)의 세포로부터의 헤테로카르핀의 추출 및 단리 방법.
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| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |