DE69838147T2

DE69838147T2 - Verbindungen und methoden zur modulierung von occludin-abhängiger gewebepermeabilität

Info

Publication number: DE69838147T2
Application number: DE69838147T
Authority: DE
Inventors: Orest W. Westmount BLASCHUK; Barbara J. Kemptville GOUR; James Matthew Ottawa SYMONDS
Original assignee: Adherex Technologies Inc
Current assignee: Fennec Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-12-31
Filing date: 1998-12-30
Publication date: 2008-05-29
Anticipated expiration: 2018-12-31
Also published as: US6110747A; DE69838147D1; US6248864B1; JP2002509073A; AU764790B2; EP1042365B1; EP1042365A1; AU1866599A; CA2351624A1; WO1999035166A1; ATE368054T1; ES2292211T3; US6310177B1

Description

TECHNISCHER BEREICH
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Verfahren zur Regulation Occludinvermittelter Prozesse und insbesondere auf die Verwendung von Regulationsmitteln, die eine Occludin-Zelladhäsions-Erkennungssequenz und/oder einen Antikörper aufweist, welcher eine derartige Sequenz zur Hemmung von Funktionen, wie Zelladhäsion und die Bildung von Gewebe-Permeabilitätsbarrieren, spezifisch erkennt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zelladhäsion ist ein komplexer Prozess, der für die Aufrechterhaltung der Gewebeintegrität und die Erzeugung physikalischer und Permeabilitätsbarrieren im Körper wichtig ist. Alle Gewebe sind in diskrete Kompartimente, von denen jedes aus einem zu ähnlichen Zelltypen gehörenden spezifischen Zelltyp besteht, gegliedert. Eine derartige Adhäsion löst die Bildung interzellulärer Verbindungsstellen aus (d.h. ohne weiteres abgrenzbare Kontaktstellen an den Oberflächen benachbarter Zellen, die zusammengehören), auch bekannt als tight junctions, gap junctions, Fleck-Desmosomen und Band-Desmosomen. Die Bildung solcher Verbindungsstellen führt zu physikalischen und Permeabilitätsbarrieren, die die unbehinderte Passage von Zellen und anderen biologischen Substanzen von einem Gewebekompartiment in das nächste einschränken. Beispielsweise bestehen Blutgefäße aller Gewebe aus Endothelzellen. Damit die Bestandteile aus dem Blut in ein gegebenes Gewebekompartiment eintreten können, müssen sie zuerst aus dem Lumen des Blutgefäßes durch die von den Endothelzellen dieses Gefäßes gebildete Barriere dringen. In ähnlicher Weise müssen Substanzen, um über den Darm in den Körper zu gelangen, zunächst die durch die Epithelzellen dieses Gewebes gebildete Barriere dringen. Um durch die Haut in das Blut zu gelangen, müssen sowohl Epithel- als auch Endothelzellschichten durchdrungen werden.
Zelladhäsion wird durch spezifische Zelloberflächen-Adhäsionsmoleküle (CAMs) vermittelt. Es gibt viele unterschiedliche CAM-Familien, einschließlich Immunoglubin-, Integrin-, Selektin- und Cadherin-Superfamilien, wobei jeder Zelltyp eine einmalige Kombination dieser Moleküle exprimiert.
Cadherine sind eine sich schnell ausdehnbare Familie kalziumabhängiger CAMs (Munro et al., In: Cell Adhesion and Invasion in Cancer Metastasis. P. Brodt. ed., S. 17-34 ff., RG Landes Co. (Austin TX, 1996). Cadherine (abgekürzt CADs) sind Membranglykoproteine, die allgemein Zelladhäsion durch homophile Interaktionen fördern (ein CAD auf der Oberfläche einer Zelle bindet sich an ein identisches CAD auf der Oberfläche einer anderen Zelle). Es wurde gezeigt, dass Cadherine Epithel-, Endothel-, Nerven- und Krebszellen regulieren, wobei auf unterschiedlichen Zelltypen unterschiedliche CADs exprimiert wurden. Zum Beispiel wird N (neural)-Cadherin vorwiegend durch Nerven-, Endothel- und einer Vielzahl von Krebszellentypen exprimiert. E (epithelial)-Cadherin wird vorwiegend durch Epithelzellen exprimiert. VE (vaskular endothelial)-Cadherin wird vorwiegend durch Endothelzellen exprimiert. Andere CADs sind das P (plazental)-Cadherin, das in der menschlichen Haut vorkommt und das R (retinal)-Cadherin. Eine ausführliche Diskussion über Cadherine liefert Munro SB et al., 1996, In: Cell Adhesion and Invasion in Cancer Metastasis, P. Brodt, Ed., S. 17-34 ff. (RG Landes Company, Austin TX) und Lampugnani und Dejana, Curr. Opin. Cell Biol. 9:674-682, 1997.
CAD-vermittelte Zelladhäsion löst eine Kaskade von Ereignissen aus, die zur Bildung von interzellulären Verbindungen und schließlich zur Entstehung von Permeabilitätsbarrieren zwischen Gewebekompartimenten führt. Die interzelluläre Verbindung, die direkt für die Bildung von Permeabilitätsbarrieren, welche die Diffusion von Flüssigkeiten durch parazelluläre Zwischenräume verhindert, verantwortlich ist, ist als tight junction oder zonula occludens bekannt (Anderson and van Itallie, Am. J. Physiol. 269:G457-G475; Lampugnani und Dejana, Curr. Opin. Cell Biol. 9:674-682, 1997).
Occludin ist eine transmembrale Komonente von tight junctions (Furuse et al., J. Cell Biol. 123:1777-1788, 1993; Furuse et al., J. Cell Sci. 109:429-435, 1996). Dieses Protein scheint von allen Endothelzelltypen sowie den meisten Epithelzelltypen exprimiert zu werden. Occludin ist ein integrales Membranprotein (1), das aus zwei extrazellulären Domänen (EC1 und EC2), vier die Plasmamembran querenden hydrophoben Domänen (TM1-TM4) und drei zytoplasmatischen Domänen (CP1-CP3) besteht. Die Strukturen aller bekannten Occludine von Säugern sind ähnlich (2; Ando-Akatsuka et al., J. Biol. Chem. 133:43-47, 1996).
Es wird angenommen, das Occludin direkt bei der Zelladhäsion und bei der Bildung von tight junctions beteiligt ist (Furuse et al., J. Cell Sci. 109:429-435, 1996; Chen et al., J. Cell Biol. 138:891-899, 1997). Es wurde eingeführt, dass Occludin die Zelladhäsion durch homophile Interaktionen fördert (ein Occludin an der Oberfläche einer Zelle bindet sich an ein identisches Occludin an der Oberfläche einer anderen Zelle). Eine ausführliche Diskussion zu Occludinstruktur und -funktion liefern Lampugnani und Dejana, Curr. Opin. Cell Biol. 9:674-682, 1997.
Obwohl Zelladhäsion für bestimmte normale physiologische Funktionen erforderlich ist, gibt es Situationen, in denen der Umfang an Zelladhäsion unerwünscht ist. Zum Beispiel implizieren viele Krankheitserscheinungen (wie Autoimmunkrankheiten und Entzündungskrankheiten) eine anormale Zelladhäsion. Zelladhäsion kann auch bei Transplantatabstoßung eine Rolle spielen. Unter solchen Umständen könnte die Regulation von Zelladhäsion wünschenswert sein.
Weiterhin erzeugen aus Zelladhäsion entstehende Permeabilitätsbarrieren Schwierigkeiten für den Transport von Arzneimitteln durch den Körper hin zu bestimmten Geweben und Tumoren. Beispielsweise sind Hautpflaster ein zweckdienliches Mittel für die Verabreichung von Arzneimitteln durch die Haut. Die Verwendung von Hautpflastern war jedoch aufgrund der epithelialen und endothelialen Zellbarrieren auf kleine, hydrophobe Moleküle beschränkt. In ähnlicher Weise kleiden Endothelzellen die Blutkapillaren aus, die für Arzneimittel weitgehend impermeabel sind, und die Blut-Hirnschranke hat eine gezielte Pharmakotherapie zum Zentralnervensystem behindert. Zusätzlich entwickeln viele feste Tumore innen liegende Barrieren, die den Transport von Antitumor-Arzneimitteln und Antikörpern zu den inneren Zellen einschränken.
Versuche den Durchlass der Arzneimittel durch solche Barrieren hindurch zu erleichtern, basieren im Allgemeinen auf spezifischen Rezeptoren oder Trägerproteinen, die die Moleküle durch Barrieren hindurch in vivo transportieren. Doch solche Verfahren sind oft aufgrund niedriger endogener Transportgeschwindigkeiten oder mangelhafter Wirkungsweisen zwischen Trägerproteinen und Arzneimitteln ineffizient. Obwohl durch den Einsatz einer Vielfalt von chemischen Wirkstoffen, die die Zelladhäsion stören, eine verbesserte Wirksamkeit erreicht wurde, werden solche Mittel typischerweise mit unerwünschten Nebenwirkungen in assoziiert; sie können invasive Vorgehensweisen der Verabreichung erforderlich machen und können irreversible Wirkungen zur Folge haben.
Dementsprechend gibt es im Fach einen Bedarf an Verbindungen, die Zelladhäsion regulieren und den Arzneimitteltransport durch die Permeabilitätsbarrieren hindurch ohne derartige Nachteile verbessern. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf und liefert weitere damit in Verbindung stehende Vorteile.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt, wie in den anhängenden Ansprüchen beansprucht, Verbindungen bereit zur Regulation von Occludin-vermittelter Zelladhäsion und zur Bildung von Permeabilitätsbarrieren. In bestimmten Aspekten weisen die hier bereitgestellten Verbindungen eine Occludin-CAR-Sequenz oder eine Variante davon mit der Fähigkeit zur Regulation Occludinvermittelter Zelladhäsion auf. Diese Verbindungen sind zyklische Peptide, die die Sequenz LYHY (SEQ.-ID-Nr. 1) aufweisen. In bestimmten Ausführungsformen haben derartige zyklische Verbindungen die folgende Formel:
wobei X₁ und X₂ optional sind und, falls vorhanden, voneinander unabhängig aus der Gruppe bestehend aus Aminosäureresten und Kombinationen daraus, in denen die Reste durch Peptidbindungen verbunden sind, ausgewählt werden, und wobei X₁ und X₂ voneinander unabhängig in der Größenordnung zwischen 0 und 10 Resten vorliegen, derartig, dass die Summe der in X₁ und X₂ enthaltenen Reste zwischen 1 und 12 beträgt, wobei Y₁ und Y₂ voneinander unabhängig aus der Gruppe bestehend aus Aminosäureresten ausgewählt werden und wobei eine kovalente Bindung zwischen den Resten Y₁ und Y₂ gebildet wird, und wobei Z₁ und Z₂ optional sind und, falls vorhanden, voneinander unabhängig aus der Gruppe bestehend aus Aminosäureresten und Kombinationen daraus ausgewählt werden, wobei die Reste durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind. Derartige zyklische Peptide können Modifikationen wie eine N-Azetyl- oder N-Alkoxylbenzyl-Gruppe und/oder eine C-terminale Amid- oder Estergruppe aufweisen. Zyklische Peptide können beispielsweise über eine Disulfidbindung; eine Amidbindung zwischen terminalen funktionellen Gruppen, zwischen Restseitenketten oder zwischen einer terminalen funktionellen Gruppe und einer Restseitenkette; einer Thioetherbindung oder δ₁δ₁-Ditryptophan oder eines Derivates von diesen zyklisiert werden.
Für Vergleichszwecke werden für Verbindungen lineare Peptide offenbart, die die Sequenz LYHY (SEQ.-ID-Nr. 1) oder eine Variante davon aufweisen. Solche Peptide haben vorzugsweise 4-30 Aminosäurereste in der Länge, vorzugsweise 5-16 Aminosäurereste und noch bevorzugter 6-9 Aminosäurereste.
In weiteren Aspekten der vorliegenden Erfindung werden Mittel zur Regulation der Zelladhä sion bereit gestellt, die ein wie oben beschriebenes zyklisches Peptid aufweisen. In spezifischen Ausführungsformen können derartige Regulationsmittel mit einem oder mehreren Zielwirkstoff(en) (targeting agent), einem Arzneimittel, einem festen Träger oder einem Trägermolekül oder mit einem nachweisbaren Marker verbunden sein. Für Vergleichszwecke werden Mittel zur Regulation der Zelladhäsion geliefert, die eine Sequenz QYLYHYCVVD (SEQ.-ID-Nr. 2) und Derivate der vorerwähnten Sequenz aufweisen, geliefert, die eine oder mehrere C-terminale, N-terminale und/oder Seitenketten-Modifikationen aufweisen.
In noch weiteren Aspekten werden Regulationsmittel zur Zelladhäsion bereit gestellt, die einen Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon aufweisen, der/das sich spezifisch an eine durch ein Occludin gebundene Zelladhäsions-Erkennungssequenz bindet.
Weiterhin kann jedes der oben genannten Mittel zur Regulation der Zelladhäsion weiterhin eines oder mehrere von Folgendem aufweisen: (a) eine Zelladhäsions-Erkennungssequenz, die durch ein Adhäsionsmolekül außer Occludin gebunden ist, wobei die Zelladhäsions-Erkennungssequenz durch einen Linker von jeglicher/n zyklischen LYHY-Sequenz(en) separiert ist; und/oder (b) einen Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment daraus, das sich spezifisch an eine Zelladhäsions-Erkennungssequenz bindet, welche mit einem Adhäsionsmolekül außer Occludin gebunden ist.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin bereit pharmazeutische Verbindungen, die ein wie oben beschriebenes Regulationsmittel zur Zelladhäsion in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweisen. Derartige Verbindungen können weiterhin ein Arzneimittel aufweisen. Zusätzlich oder alternativ können derartige Verbindungen ein oder mehrere von Folgenden aufweisen:: (a) ein Peptid, das eine Zelladhäsions-Erkennungssequenz aufweist, die durch ein Adhäsionsmolekül außer Occludin gebunden ist, und/oder (b) einen Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment daraus, das sich spezifisch an eine Zelladhäsions-Erkennungssequenz bindet, welche mit einem Adhäsionsmolekül außer Occludin, gebunden ist.
Es werden Verfahren zur Regulation von Zelladhäsion offenbart, die das Inkontaktbringen einer Cadherin-exprimierenden Zelle mit einem wie oben beschriebenen Mittel zur Regulation der Zelladhäsion aufweisen.
In einem derartigen Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung Verfahren für eine Erhöhung der Gefäßpermeabilität bei einem Säuger bereit, die die Verabreichung eines wie oben beschriebenen Regulationsmittels zur Zelladhäsion an einen Säuger aufweisen, wobei das Regulationsmittel die Occludin-vermittelte Zelladhäsion hemmt.
In einem anderen Aspekt werden Verfahren zur Reduktion von unerwünschter Zelladhäsion in einem Säuger bereit gestellt, die die Verabreichung eines wie oben beschriebenen Regulationsmittels zur Zelladhäsion an einen Säuger aufweisen, wobei das Regulationsmittel die Occludinvermittelte Zelladhäsion hemmt.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung Verfahren zur Verbesserung des Arzneimitteltransports durch die Haut eines Säugers bereit, die das Inkontaktbringen der Epithelzellen eines Säugers mit einem wie oben beschriebenen Regulationsmittels zur Zelladhäsion und ein Arzneimittel umfassen, wobei das Regulationsmittel die Occludin-vermittelte Zelladhäsion hemmt und wobei der Schritt des Inkontaktbringens so ausgeführt wird, dass Bedingungen und Zeit für die Passage des Arzneimittels durch die Epithelzellen ausreichend sind.
Die vorliegende Offenbarung stellt weiterhin Verfahren für die Verbesserung des Arzneimitteltransports zu einem Tumor in einem Säuger bereit, die die Verabreichung eines wie oben beschriebenen Regulationsmittels der Zelladhäsion an einen Säuger umfassen, wobei das Regulationsmittel die Occludin-vermittelte Zelladhäsion hemmt.
In weiteren Aspekten stellt die vorliegende Offenbarung Verfahren für die Behandlung von Krebs in einem Säuger bereit, die die Verabreichung eines wie oben beschriebenen Regulationsmittels zur Zelladhäsion umfassen, wobei das Regulationsmittel die Occludin-vermittelte Zelladhäsion hemmt.
Die vorliegende Offenbarung stellt weiterhin Verfahren für die Hemmung von Angiogenese in einem Säuger bereit, die die Verabreichung eines wie oben beschriebenen Regulationsmittels zur Zelladhäsion in einem Säuger umfassen, wobei das Regulationsmittel die Occludin-vermittelte Zelladhäsion hemmt.
In weiteren Aspekten stellt die vorliegende Offenbarung Verfahren für die Verbesserung des Arzneimitteltransports in das Zentralnervensystem eines Säugers bereit, die die Verabreichung eines wie oben beschriebenen Regulationsmittels von Zelladhäsion an ein Säuger umfassen, wobei das Regulationsmittel die Occludin-vermittelte Zelladhäsion hemmt.
In weiteren Aspekten werden Verfahren zur Regulation des Immunsystems eines Säugers bereit gestellt, die die Verabreichung eines wie oben beschriebenen Regulationsmittels umfassen, wobei das Regulationsmittel die Occludin-vermittelte Funktion hemmt.
Die vorliegende Offenbarung stellt weiterhin Verfahren zur Regulation der Bildung von Epithelzell-tight junctions bereit, die die Verabreichung eines Regulationsmittels zur Zelladhäsion, welches die zyklische Sequenz LYHY aufweist, an einen Säuger umfassen. In bestimmten Ausführungsformen können derartige Regulationsmittel die Bildung von Epithelzellen-tight junctions stimulieren.
In anderen Aspekten stellt die vorliegende Offenbarung Verfahren für die Hemmung der Entstehung von Diarrhöe bei einem Patienten bereit, die die Verabreichung eines Regulationsmittels zur Zelladhäsion mit der zyklischen Sequenz LYHY an einen Patienten umfassen, wobei das Regulationsmittel die Zelladhäsion der Epithelzellen stimuliert.
Die vorliegende Offenbarung stellt Verfahren für die Verbesserung von Wundheilung in einem Säuger bereit, die das Inkontaktbringen der Wunde in einem Säuger mit dem oben beschriebenen Regulationsmittel zur Zelladhäsion umfassen, wobei das Regulationsmittel die Occludinvermittelte Zelladhäsion fördert.
In einem verwandten Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung Verfahren zur Förderung der Adhäsion von einem in einem Säuger implantierten Fremdgewebe bereit, die das Inkontaktbringen einer Stelle des Implantat-Fremdgewebes in einem Säuger mit einem wie oben beschriebenen Regulationsmittel zur Zelladhäsion umfassen, wobei das Regulationsmittel die Occludin-vermittelte Zelladhäsion fördert.
Die vorliegende Offenbarung stellt weiterhin Verfahren zur Einleitung von Apoptose in einer Occludin-exprimierenden Zelle bereit, die das Inkontaktbringen einer Occludin-exprimierenden Zelle mit einem wie oben beschriebenen Regulationsmittel zur Zelladhäsion umfassen, wobei das Regulationsmittel die Occludin-vermittelte Zelladhäsion hemmt.
Diese und andere Aspekte der Erfindung werden durch Bezugnahme der folgenden ausführlichen Beschreibung und der beigefügten Skizzen verdeutlicht.
KURZE BESCHREIBUNG DER SKIZZEN
1 zeigt ein Diagramm, in dem die Struktur eines menschlichen Occludins dargestellt ist. Die zwei extrazellulären Domänen sind mit EC1 und EC2 benannt, die vier hydrophoben Domänen, die die Plasmamembran queren, sind durch TM1-TM4 dargestellt und die drei zytoplasmatischen Domänen sind als CP1-CP3 gekennzeichnet. Die Occludin-Zelladhäsions-Erkennungssequenz LYHY (Leu-Tyr-His-Tyr; SEQ.-ID Nr. 1) ist zusammen mit den flankierenden Aminosäureresten in EC2 gezeigt und durch • gekennzeichnet.
2 zeigt die Aminosäuresequenzen der Occludin-EC2-Domänen von Säugern: Mensch (SEQ.-ID-Nr. 5), Maus (SEQ.-ID-Nr. 6), Hund (SEQ.-ID-Nr. 7) und Rattenkänguru (SEQ.-ID-Nr. 8) zusammen mit der Konsensussequenz, die durch Einsatz von ClustalW-Alignment von Proteinsequenzen erhalten wurde. Die Occludin-Zelladhäsions-Erkennungssequenz LYHY (Leu-Tyr-His-Tyr: SEQ.-ID-Nr. 1) zusammen mit den flankierenden Aminosäureresten ist fett gedruckt.
3A-3D veranschaulichen die Strukturen der repräsentativen zyklischen Peptid-Regulationsmittel.
4A und 4B zeigen Immunofluoreszenz-Bilder von Monolayerkulturen von menschlichen Aorta-Endothelzellen, die für Occludin (rote Farbe) und VE-Cadherin (grüne Farbe) immunmarkiert sind. Die Kolokalisation von Occludin und VE-Cadherin ist durch gelbe Farbe gekennzeichnet. Pfeile zeigen die Zwischenräume zwischen den Zellen an. Die Zellen wurden entweder nicht behandelt (4A) oder eine Stunde lang 100μg/ml H-QYLYHYCVVD-OH (SEQ.-ID-Nr. 2; 4B) ausgesetzt.
5 zeigt ein Foto des rasierten Rückens einer Ratte, die eine subdermale Doppel-Injektion mit entweder phosphatgepufferter Salzlösung, phosphatgepufferter Salzlösung enthaltend Azetyl-QYLYHYCVVD-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 2; Peptid 1) H-QYLYHYCVVD-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 2; Peptid 2) oder H-QYLYHYCVVD-OH (SEQ.-ID-Nr. 2; Peptid 3) bei einer Konzentration von 100μg/ml, 15 Minuten später gefolgt von einer einzelnen Injektion mit Evans-Blau in die Schwanzvene, erhalten hatte. Das Foto wurde 15 Minuten nach der Injektion des Farbstoffs aufgenommen.
6 zeigt ein Histogramm, das die optischen Dichten der aus den in 5 gezeigten herausgeschnittenen Injektionsstellen angefertigten Dimethylformamid-Extrakten darstellt und das zeigt, dass mehr Farbstoff aus den mit H-QYLYHYCVVD-OH (SEQ.-ID-Nr. 2; Peptid 3) injizierten Stellen extrahiert wurde, als an Stellen, die mit entweder phosphatgepufferter Salzlösung oder mit Azetyl-QYLYHYCVVD-NH₂, (SEQ.-ID-Nr. 2; Peptid 1) oder mit H-QYLYHYCVVD-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 2; Peptid 2) injiziert wurden.
7 zeigt ein Foto des rasierten Rückens einer Ratte, die eine subdermale Doppel-Injektion mit entweder phosphatgepufferter Salzlösung, phosphatgepufferter Salzlösung enthaltend Azetyl-CLYHYC-NH₂, (SEQ.-ID-Nr. 3, Peptid 4) oder H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3; Peptid 5) bei einer Konzentration von 100μg/ml, 15 Minuten später gefolgt von einer einzelnen Injektion mit Evans-Blau in die Schwanzvene, erhalten hat. Das Foto wurde 15 Minuten nach der Injektion des Farbstoffs aufgenommen.
8 zeigt ein Histogramm zu den optischen Dichten von Dimethylformadid-Extrakten, die hergestellt wurden aus den herausgeschnittenen Stellen des rasierten Rückens einer Ratte, welche subdermale Doppel-Injektionen mit entweder phosphatgepufferter Salzlösung, phosphatgepufferter Salzlösung enthaltend Azetyl-CLYHYC-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 3; Peptid 4) oder H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3; Peptid 5) bei einer Konzentration von 100μg/ml EvansBlau in die Schwanzvene, erhalten hat.
9 zeigt ein Histogramm, das den durchschnittlichen elektrischen Widerstand durch MDCK-Zellmonolayer darstellt, welche 24 Stunden lang in einem Medium allein (Kontrolle) oder einem Medium enthaltend H-QYLYHYCVVD-NH₂ (Peptid 2), H-QYLYHYCVVD-COOH (Peptid 3) oder N-Ac-CLYHYC-NH₂ (Peptid 4) bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml kultiviert wurden. Es wurden doppelte Messungen vorgenommen und die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie oben festgestellt liefert die vorliegende Erfindung Regulationsmittel zur Zelladhäsion, die Peptide aufweisen, welche zur Regulation von Occludin-vermittelten Vorgängen, wie Zelladhäsion, in der Lage sind.
Um eine Occludin-vermittelte-Zelladhäsion zu regulieren, wird im Allgemeinen eine Occludinexprimierende Zelle entweder in vivo oder in vitro mit einem Mittel zur Regulation zur Zelladhäsion (hier auch als „Regulationsmittel" bezeichnet) in Kontakt gebracht. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wurde herausgefunden, dass die zweite extrazelluläre Domäne (EC2) des Occludins eine CAR-Sequenz beinhaltet, die die Bildung von Permeabilitätsbarrieren fördert. Dementsprechend kann ein Regulationsmittel mindestens ein zyklisches Peptid aufweisen, das eine Occludin-Zelladhäsions-Erkennungs (CAR, cell adhesion recognition)-Sequenz LYHY beinhaltet.
Bestimmte hier beschriebene Regulationsmittel hemmen Zelladhäsion. Derartige Regulationsmittel können im Allgemeinen beispielsweise zur Behandlung von Krankheiten oder anderen Leiden, die durch unerwünschte Zelladhäsion charakterisiert sind, oder zur Verbesserung des Arzneimitteltransports zu einem spezifischen Gewebetumor eingesetzt werden. In anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung können bestimmte Regulationsmittel zur Förderung von Zelladhäsion verwendet werden (z.B. zur Verbesserung oder Entfernung von Nahtstichen oder zur Verbesserung von Wundheilung). Bestimmte hier gelieferte Regulationsmittel haben die Fähigkeit, die Bildung von tight junctions in Epithelzellen, aber nicht in Endothelzellen zu stimulieren. Derartige Wirkstoffe können beispielsweise für die Behandlung von Diarrhöe eingesetzt werden.
REGULATIONSMITTEL FÜR ZELLADHÄSION
Der Begriff „zyklisches Peptid", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Peptid oder Salz davon, das aufweist: (1) eine intramolekulare kovalente Bindung zwischen zwei nicht benachbarten Resten und (2) mindestens eine Occludin-CAR-Sequenz. Die intramolekulare Bindung kann eine Rückgrat-Rückgrat-, Seitenketten-Rückgrat- oder Seitenketten-Seitenketten-Bindung sein (d.h. ter minale funktionelle Gruppen eines linearen Peptids und/oder Seitenketten-funktionelle Gruppen eines terminalen oder internen Rests können zum Erreichen von Cyclisierung verbunden werden). Bevorzugte intramolekulare Bindungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Disulfid-, Amid- und Thioether-Bindungen.
In bestimmten Ausführungsformen kann ein wie oben beschriebenes Regulationsmittel Zelladhäsion bei Epithelzellen, nicht jedoch bei Endothelzellen fördern. Es wurde im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass bestimmte eine LYHY-Sequenz aufweisende Regulationsmittel die Endothel- und Epithelzellen in unterschiedlicher Weise beeinflussen, die Bildung von tight junctions in Epithelzellen fördern. Derartige Wirkstoffe umfassen H-QYLYHYCVVD-COOH und N-Ac-CLYHYC-NH₂. Terminale funktionelle Gruppen können die Aktivität von Peptid-Regulationsmitteln in Epithel- und Endothelzellen beeinflussen.
In anderen Ausführungsformen, in denen die Förderung von Zelladhäsion erwünscht ist, kann ein Regulationsmittel der Erfindung im Allgemeinen zusätzlich multiple Occludin-CAR-Sequenzen und/oder Antikörper enthalten, die sich, wie oben beschrieben, zusammen mit Linker speziell an solche Sequenzen binden. Die Förderung von Zelladhäsion kann auch, wie weiter unten diskutiert, durch die Bindung von multiplen Regulationsmitteln an ein Trägermolekül oder -material erreicht werden.
Ein wie hier beschriebenes Regulationsmittel kann zusätzlich eine CAR-Sequenz für ein oder mehrere unterschiedliche Adhäsionsmoleküle (einschließlich, aber nicht beschränkt auf andere CAMs) und/oder einen oder mehrere Antikörper oder Fragmente davon, die sich an derartige Sequenzen binden, aufweisen. Linker können, müssen aber nicht, dazu verwendet werden, derartige CAR-Sequenz(en) und/oder Antikörper-Sequenz(en) von der/den LYHY-Sequenz(en) und/oder voneinander zu separieren. Derartige regulierende Wirkstoffe können im Allgemeinen in Verfahren eingesetzt werden, in denen es erwünscht ist, die durch multiple Adhäsionsmoleküle vermittelte Zelladhäsion gleichzeitig zu stören. „Adhäsionsmolekül" bezieht sich hier auf irgendein Molekül, das Zelladhäsion über einen Rezeptor auf der Zelloberfläche vermittelt. Adhäsionsmoleküle umfassen klassische Cadherine; atypische Cadherine wie Cadherin-11 (OB-Cadherin), Cadherin-5 (VE-Cadherin), Cadherin-6 (K-Cadherin), Cadherin-7, Cadherin-8, Cadherin-12 (Br-Cadherin, Cadherin-14, Cadherin-15, und PB-Cadherin; andere nichtklassische Cadherine wie Desmocolline (dsc) und Desmogleine (dsg); Claudin; Integrine; und Angehörige aus der Immunoglobulin-Supergen-Familie wie N-CAM und PECAM). Bevorzugte CAR-Sequenzen für die Inklusion in ein Regulationsmittel umfassen: (a) His-Ala-Val (HAV), das von klassischen Cadherinen gebunden wird; (b) Arg-Gly-Asp (RGD), das von Integrinen gebunden wird (siehe Cardarelli et al., J. Biol. Chem. 267:23159-23164, 1992); (c) KYSFNYDGSE (SEQ.-ID-Nr. 11), das von N-CAM gebunden wird; (d) Claudin-CAR-Sequenzen, welche mindestens vier aufeinanderfolgende Aminosäuren aufweisen, die vorhanden sind in einer Claudin-Region mit der Formel: Trp-Lys/Arg-Aaa-Baa-Ser/Ala-Tyr/Phe-Caa-Gly (SEQ.-ID-Nr. 47), wobei Aaa, Baa und Caa unabhängig voneinander ausgewählte Aminosäurereste beschreiben; Lys/Arg ist eine Aminosäure, die Lysin oder Arginin ist; Ser/Ala ist eine Aminosäure, die Serin oder Alanin ist; und Tyr/Phe ist eine Aminosäure, die Tyrosin oder Phenylalanin ist; und (e) nichtklassische Cadherin-CAR-Sequenzen, die mindestens drei aufeinanderfolgende Aminosäuren aufweisen, die vorhanden sind in einer nichtklassischen Cadherin-Region mit der Formel: Aaa-Phe-Baa-Ile/Leu/Val-Asp/Asn/Glu-Caa-Daa/Ser/Thr/Asn-Gly (SEQ.-ID-Nr. 48), wobei Aaa, Baa, Caa und Daa unabhängig voneinander ausgewählte Aminosäurereste sind; Ile/Leu/Val ist eine Aminosäure, die aus der Gruppe bestehend aus Isoleucin, Leucin und Valin ausgewählt ist. Asp/Asn/Glu ist eine Aminosäure, die aus der Gruppe bestehend aus Aspartat, Asparagin und Glutamat ausgewählt ist; und Ser/Thr/Asn ist eine Aminosäure, die aus der Gruppe bestehend aus Serin, Threonin oder Asparagin ausgewählt ist. Repräsentative Claudin-CAR-Sequenzen umfassen IYSY (SEQ.-ID-Nr. 49), TSSY (SEQ.-ID-Nr. 50), VTAF (SEQ.-ID-Nr. 51) und VSAF (SEQ.-ID-Nr. 52). Repräsentative nichtklassische Cadherin-CAR-Sequenzen umfassen die VE-Cadherin-CAR-Sequenz DAE; die OB-Cadherin-CAR-Sequenz DDK, EEY und EAQ; die dsg-CAR-Sequenz NQK, NRN und NKD und die dsc-CAR-Sequenzen EKD und ERD.
Ein Linker kann irgendein Molekül sein (einschließlich Peptid- und/oder Nicht-Peptid-Sequenzen sowie einzelne Aminosäuren oder andere Moleküle), das keine CAR-Sequenz enthält und das mit mindestens zwei Peptid-Sequenzen kovalent verbunden werden kann. Wird ein Linker verwendet, können LYHY (SEQ.-ID-Nr. 1)-enthaltende Peptide und andere Peptid- oder Protein-Sequenzen über Kopf-Schwanz (d.h. der Linker kann mit der Carboxyl- oder Aminogruppe jeder Peptid-Sequenz kovalent verknüpft werden), Kopf-Seitenkette und/oder Schwanz-Seitenkette verbunden werden. Regulationsmittel, die einen oder mehrere Linker aufweisen, können lineare oder verzweigte Strukturen bilden. In einer Ausführungsform weisen Regulationsmittel mit einer verzweigten Struktur drei verschiedene CAR-Sequenzen, wie RDG, LYHY (SEQ.-ID-Nr. 1) und HAV auf. In einer anderen Ausführungsform können Regulationsmittel der Erfindung mit einer verzweigten Struktur, z.B. LYHY (SEQ.-ID-Nr. 1), zusammen mit einer oder mehreren einer Claudin-CAR-Sequenz; eine VE-Cadherin-CAR-Sequenz; einer dsg-CAR-Sequenz und/oder einer dsc-CAR Sequenz aufweisen. Linker erzeugen vorzugsweise einen Abstand zwischen CAR-Sequenzen zwischen 0,1 und 10.000 nm, bevorzugter zwischen 0,1 und 400 nm. Ein Separationsabstand zwischen den Erkennungsstellen kann im Allgemeinen entsprechend der gewünschten Funktion des Regulati onsmittels festgelegt werden. Für Inhibitoren der Zelladhäsion sollte der Linkerabstand gering sein (0,1 bis 400 nm). Für Enhancer der Zelladhäsion sollte der Linkerabstand zwischen 400 und 10.000 nm betragen. Ein Linker, der für solche Zwecke verwendet werden kann, ist (H₂N(CH₂)_nCO₂H)_m, oder Derivate davon, wobei sich n zwischen 1 und 10 und m zwischen 1 und 4000 befindet. Wenn z.B. Glycin (H₂NCH₂CO₂H) oder ein Multimer davon als Linker verwendet wird, entspricht jede Glycin-Einheit, die durch Berechnung ihrer niedrigsten Energie-Konformation ermittelt wird, wenn sie unter Einsatz molekularer Simulationstechniken mit anderen Aminosäuren verbunden wird, einem Verbindungsabstand von 2,45 Angström oder 0,245 nm. In ähnlicher Weise entspricht Aminopropionsäure einem Bindungsabstand von 3,73 Angström, Aminobuttersäure entspricht 4,96 Angström, Aminopentansäure 6.30 Angström und Aminohexansäure 6,12 Angström. Andere Linker, die verwendet werden können, werden für den Fachmann naheliegend sein und umfassen z.B. Linker, die auf Wiederholungseinheiten von 2,3-Diaminopropionsäure, Lysin und/oder Ornithin beruhen. 2,3-Diaminopropionsäure kann einen Linkerabstand von entweder 2,51 oder 3,11 Angström erzeugen, je nachdem, ob das Seitenketten-Amino oder das terminale Amino zur Bindung verwendet wird. In Ähnlicherweise kann Lysin einen Bindungsabstand von entweder 2,44 oder 6,95 Angström und Ornithin von 2,44 oder 5,61 Angström liefern. Peptid- und Nicht-Peptid-Linker können im Allgemeinen unter Einsatz irgendeines in Fachkreisen bekannten geeigneten Verfahrens in ein Regulationsmittel integriert werden.
Die Gesamtzahl der CAR-Sequenzen (einschließlich der Occludin-CAR-Sequenz(en), mit oder ohne andere aus einem oder mehreren Adhäsionsmolekülen abgeleiteten CAR-Sequenzen) in einem Regulationsmittel kann zwischen 1 und einer großen Anzahl wie 100, vorzugsweise zwischen 1 und 10 und bevorzugter noch zwischen 1 und 5 liegen. Peptid-Regulationsmittel, die multiple CAR-Sequenzen aufweisen, beinhalten typischerweise zwischen 4 und 1000 Aminosäureresten, vorzugsweise zwischen 4 und 50 Resten. Wenn Nicht-Peptid-Linker eingesetzt werden, ist jede CAR-Sequenz des Regulationsmittels in einem Peptid, das im Allgemeinen 4 bis 50 Reste, vorzugsweise 4 bis 25 Reste, bevorzugter 4 bis 16 Reste und noch bevorzugter 4 bis 15 Reste lang ist, vertreten sein. Ein zusätzlicher Rest/Zusätzliche Reste, der/die auf der N-terminalen und/oder der C-terminalen Seite einer CAR-Sequenz vorhanden sein können/kann, kann/können aus den Sequenzen abgeleitet werden, die die LYHY-Sequenz in natürlich auftretenden Occludinen mit oder ohne Aminosäure-Substitutionen und/oder anderen Modifikationen flankieren. Flankierende Sequenzen für Occludine bei Säugern sind in 2 und in SEQ.-ID-Nr. 5-8 dargestellt. Alternativ können zusätzliche auf einer oder beiden Seite(n) der CAR-Sequenz(en) vorhandene Reste ohne Verbindung zu einer endogenen Sequenz sein (z.B. Reste, die Reinigung, oder eine andere Manipulation fördern und/oder Reste mit einer Ziel- oder einer anderen Funktion).
Ein Regulationsmittel kann eine Sequenz beinhalten, die die Occludin-CAR-Sequenz auf einer oder beiden Seiten flankiert, um die Potenz oder Spezifität zu steigern. Eine geeignete flankierende Sequenz zur Steigerung der Potenz umfasst, ist aber nicht beschränkt auf eine endogene in einem Occludin vorhandene Sequenz (dargestellt z.B. in 2).
Um die Herstellung von Regulationsmitteln mit einer gewünschten Potenz zu fördern, können das Kernresonanzspektroskopie (NMR)- und andere Rechenverfahren eingesetzt werden, um die Konformation eines Peptids zu bestimmen, die eine bekannte Potenz überträgt. Die Nutzung von NMR ist weit für die strukturelle Analyse von Molekülen verbreitet. Kreuzpeak-Intensitäten in nuklearen Overhauser-Verstärkungs (NOE)-Spektren, Kopplungskonstanten und chemische Verschiebungen hängen von der Konformation einer Verbindung ab. NOE-Daten liefern den Interprotonenabstand zwischen den Protonen durch die Zwischenräume. Diese Information kann verwendet werden, um die Berechnung der niedrigsten Energiekonformation für die LYHY (SEQ.-ID-Nr. 1) -Sequenz zu erleichtern. Die Konformation kann dann mit Gewebespezifität korreliert werden, um die Identifizierung von Peptiden, die in ähnlicher Weise gewebespezifisch sind oder eine verbesserte Gewebespezifität aufweisen, zu ermöglichen.
Regulationsmittel können Polypeptide oder Salze davon sein, die nur durch Peptidbindungen gebundene Aminosäurereste beinhalten, oder können Nicht-Peptidregionen, wie Linker, enthalten.

Peptidbereiche eines Regulationsmittels können Reste von L-Aminosäuren, D-Aminosäuren oder Kombinationen aus diesen aufweisen. Aminosäuren können aus natürlichen oder nichtnatürlichen Quellen stammen, vorausgesetzt, es ist mindestens eine Aminogruppe und mindestens eine Carboxylgruppe im Molekül vorhanden; α- und β-Aminosäuren werden im Allgemeinen bevorzugt. Die 20 üblicherweise in Proteinen vorzufindenden L-Aminosäuren sind in Tab. 1 mit den konventionellen Drei- oder Ein-Buchstaben-Abkürzungen und die entsprechenden D-Aminosäuren sind durch ein Einbuchstabensymbol in Kleinbuchstaben symbolisiert. Tabelle 1 Einbuchstaben- und Dreibuchstaben-Abkürzungen für Aminosäuren

A	Ala	Alanin
R	Arg	Arginin
D	Asp	Asparaginsäure
N	Asn	Asparagin
C	Cys	Cystin
Q	Gin	Glutamin
E	Glu	Glutaminsäure
G	Gly	Glycin
H	His	Histidin
I	Ile	Isoleucin
K	Leu	Leucin
L	Lys	Lysin
M	Met	Methionin
F	Phe	Phenylalanin
P	Pro	Prolin
S	Ser	Serin
T	Thr	Threonin
W	Trp	Tryptophan
Y	Tyr	Tyrosin
V	Val	Valin

Ein Regulationsmittel kann auch seltene Aminosäuren (wie 4-Hydroxyprolin oder Hydroxylysin), organische Säuren oder Amide und/oder Derivate von gewöhnlichen Aminosäuren enthalten, wie Aminosäuren, die das C-terminale Carboxylat verestert (z.B. Benzyl, Methyl oder Äthylester) oder amidiert haben und/oder Modifikationen der N-terminalen Aminogruppe (z.B. Acetylierung oder Alkoxycarbonylierung) mit oder ohne einer großen Vielfalt von Seitenketten-Modifikationen und/oder Substitutionen (z.B. Methylierung, Benzylierung, t-Butylierung, Tosylierung, Alkoxycarbonylierung und dergleichen) aufweisen.
Bevorzugte Derivate umfassen Aminosäuren mit einer C-terminalen Amidgruppe. Andere Reste als die von gewöhnlichen Aminosäuren, die in einem Regulationsmittel vorhanden sein können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf 2-Mercaptoprolin, Omithin, Diaminobutansäure, α-Aminoadipinsäure, m-Aminomethylbenzoe-Säure und α,β-Diaminopropionsäure.
Ein Regulationsmittel kann ein zyklisches Peptid von einer der folgenden Sequenzen aufweisen: CLYHYC (SEQ.-ID-Nr. 3), CYLYHYC (SEQ.-ID-Nr. 40), CQYLYHYC (SEQ.-ID-Nr. 41), KQYLYHYD (SEQ.-ID-Nr. 42), YLYHY (SEQ.-ID-Nr. 43), QYLYHY (SEQ.-ID-Nr. 44) oder KLYHYD (SEQ.-ID-Nr. 45). Regulationsmittel, die Derivate aus einer der hier aufgeführten Sequenzen (d.h. Sequenzen mit einer oder mehreren C-terminalen-, N-terminalen- und/oder Seitenket ten-Modifikationen) beinhalten, sind auch Bestandteil der vorliegenden Erfindung.
Hier beschriebene Peptid-Regulationsmittel (und Peptid-Anteile von Regulationsmitteln) können durch in Fachkreisen gut bekannte Verfahren, einschließlich chemischer Synthese und rekombinanter DNA-Verfahren, synthetisiert werden. Für Regulationsmittel, die bis zu ungefähr 50 Reste lang sind, kann die chemische Synthese unter Einsatz von Standardlösungen oder Verfahren der Fest-Phasenpeptidsynthese, in denen eine Peptidbindung durch direkte Kondensation der α-Aminogruppe einer Aminosäure mit der α-Carboxylgruppe der anderen Aminosäure unter Eliminierung eines Wassermoleküls auftritt, ausgeführt werden. Peptidbindungssynthese durch die oben beschriebene direkte Kondensation erfordert die Unterdrückung des reaktiven Charakters der Aminogruppe der ersten und der Carboxylgruppe der zweiten Aminosäure. Die Maskierungssubstituenten müssen deren sofortige Entfernung ermöglichen, ohne den Zerfall des labilen Peptidmoleküls zu bewirken.
In der Lösungsphase-Synthese kann eine breite Vielfalt an Kupplungsverfahren und Schutzgruppen verwendet werden (siehe Gross und Meienhofer, Hrsg., „The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Bnd. 1-4 (Academic Press, 1979); Bodansky und Bodansky, „The Practice of Peptide Synthesis", 2. Ed. (Springer Verlag, 1994)). Weiterhin sind intermediäre Reinigung und lineare Vergrößerung möglich. In Fachkreisen wird erkennbar sein, dass die Lösungssynthese die Beachtung der Hauptketten- und Seitenkettenschutzgruppen und des Aktivierungsverfahrens erfordert. Weiterhin ist sorgfältige Segmentselektion notwendig, um die Racemisierung während der Segmentkondensation zu minimieren. Ein weiterer Faktor sind ist die Beachtung der Löslichkeits-Aspekte.
Fest-Phasenpeptidsynthese verwendet während der organischen Synthese als Träger ein unlösliches Polymer. Die Peptidketten mit dem Polymer als Träger ermöglichen die Anwendung einfacher Wasch- und Filterungsschritte anstelle von umständlichen Reinigungen in Zwischenschritten. Fest-Phasenpeptidsynthese kann im Allgemeinen gemäß dem Verfahren von Merrifield et al. J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963, durchgeführt werden, das die Anknüpfung eine linearen Peptidkette an einen Harzträger unter Verwendung geschützter Aminosäuren beinhaltet. Fest-Phasenpeptidsynthese setzt typischerweise entweder die Boc- oder die Fmoc-Strategie ein. Die Boc-Strategie verwendet ein 1%-ig quervernetztes Polystyrolharz. Die Standard-Schutzgruppe für α-Amino-Funktionen ist die tert-Butyloxycarbonyl (Boc)-Gruppe. Diese Gruppe kann mit verdünnten Lösungen starker Säuren, wie 25%-iger Trifluoressigsäure (TFA) entfernt werden. Die nächste Boc-Aminosäure wird typischerweise unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) an das Aminoacyl-Harz gekoppelt. Nach der Beendigung der Kopplung wird das Peptid-Harz mit wasser freiem HF behandelt, um die Benzyl-Ester-Bindung zu spalten und das freie Peptid freizusetzen. Seitenketten-funktionelle Gruppen werden üblicherweise während der Synthese von Benzylabgeleiteten Blockierungsgruppen, die ebenfalls von HF abgespalten wurden, blockiert. Das freie Peptid wird dann mit einem geeigneten Lösungsmittel vom Harz extrahiert, gereinigt und charakterisiert. Neu synthetisierte Peptide können z.B. durch Gelfiltrierung, HPLC, Extraktionschromatographie und/oder durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt werden und z.B. durch Massenspektrometrie oder Aminosäurensequenzanalyse charakterisiert werden. Bei der Boc-Strategie können C-terminal amidierte Peptide unter Verwendung von Benzhydrylamin- oder Methyl-Benzhydrylaminharzen, die Peptid-Amide direkt nach der Abspaltung von HF liefern, erhalten werden.
In den oben diskutierten Verfahren, hängt die Selektivität der Seitenketten-Blockierungsgruppen und der Peptid-Harz-Bindung von den Unterschieden in der Geschwindigkeit der azidolytischen Abspaltung ab. Es wurden Orthoganol-Systeme vorgestellt, in denen die Seitenketten-Blockierungsgruppen und die Peptid-Harz-Bindung in jedem Syntheseschritt vollkommen stabil zum für die Entfernung der α-Schutzgruppe verwendeten Reagenten sind. Das üblichste dieser Verfahren beinhaltet den 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-Ansatz. In diesem Verfahren sind die Seitenkettenschutzgruppen und die Peptid-Harz-Bindung vollkommen stabil zu den zur Abspaltung der N-α-Fmoc-Gruppe verwendeten sekundären Aminen. Der Seitenketten-Schutz und die Peptid-Harz-Bindung werden durch milde Acidolyse abgespalten. Der wiederholte Kontakt mit der Base macht das Merrifield-Harz für die Fmoc-Chemie ungeeignet und es werden im Allgemeinen an das Harz gebundene p-Alkoxybenzyl-Ester verwendet. Entschützung und Spaltung werden im Allgemeinen unter Verwendung von TFA durchgeführt.
Für einen Fachmann wird erkennbar sein, dass in einer Festphasensynthese Entschützungs- und Kupplungsreaktionen zum Abschluss gebracht werden und, dass die Seitenketten-Blockierungsgruppen während der gesamten Synthese stabil sein müssen. Weiterhin ist die Festphasensynthese im Allgemeinen am besten dann geeignet, wenn Peptide im kleinen Maßstab hergestellt werden sollen.
N-Acetylierung des N-terminalen Restes kann durch eine Reaktion des letzten Peptids mit dem essigsauren Anhydrid vor der Abspaltung vom Harz erreicht werden. C-Amidierung kann unter Einsatz eines geeigneten Harzes wie Methylbenzhydrylamin-Harz unter Verwendung der Boc-Technik erreicht werden.
Für längere Regulationsmittel werden für die Synthese rekombinante Verfahren bevorzugt. Bei solchen Verfahren kann der ganze oder ein Teil eines Regulationsmittels in lebenden Zellen unter Verwendung einer Auswahl von dem Fachmann für die entsprechende Wirtszelle bekannten Expressionsvektoren synthetisiert werden. Geeignete Wirtszellen können Zellen von Bakterien, Hefezellen, Zellen von Säugern, Insekten, Pflanzen, Algen und andere tierische Zellen (z.B. Hybridem, CHO, Myelom) umfassen. Die auf diese Weise exprimierten DNA-Sequenzen können Abschnitte (portions) eines endogenen Occludins oder eines anderen Adhäsionsmoleküls kodieren. Solche Sequenzen können auf der Grundlage bekannter cDNA- oder genomischer Sequenzen (siehe Blaschuk et al., J. Mol. Biol. 211:679-682, 1990) hergestellt oder durch Sequenzen, die durch das Screening einer geeigneten Bibliothek mit Sonden, deren Design auf bekannten Occludin-Sequenzen basiert, isoliert werden. Solche Screens können im Allgemeinen wie in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (und den darin zitierten Bezugnahmen) durchgeführt werden. Es kann auch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Oligonukleotid-Primeren in Verfahren, die in Fachkreisen gut bekannt sind, angewandt werden, um Nukleinsäure-Moleküle, die das ganze oder einen Abschnitt eines endogenen Adhäsionsmoleküls kodieren, zu isolieren. Um ein Nukleinsäure-Molekül zu generieren, das ein gewünschtes Regulationsmittel kodiert, kann eine endogene Occludin-Sequenz unter Verwendung allgemein bekannter Techniken modifiziert werden. Es können z.B., wie oben diskutiert wurde, eine oder mehrere CAR-Sequenzen-kodierende Abschnitte, mit oder ohne Separation von Linker-kodierenden Nukleinsäurebereichen, verbunden werden. Alternativ können Abschnitte der gewünschten Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung allgemein bekannter Verfahren synthetisiert werden und dann miteinander ligiert werden, um eine das Regulationsmittel verschlüsselnde Sequenz zu bilden.
Wie oben festgestellt wurde, kann ein Regulationsmittel einen oder mehrere zyklische Peptide beinhalten. Derartige zyklische Peptide können nur eine CAR-Sequenz oder zusätzlich eine oder mehrere andere Adhäsionsmolekül-Bindestellen, die CARs oder keine CARs sind, beinhalten. Derartige zusätzliche Sequenzen können durch einen Linker separiert werden (d.h. ein oder mehrere Peptide, die nicht aus einer CAR-Sequenz oder anderen Adhäsionsmolekül-Bindestellen abgeleitet sind, wie oben beschrieben). In einer derartigen Ausführungsform weist ein Regulationsmittel ein zyklisches Peptid auf, das zwei LYHY (SEQ.-ID-Nr. 1)-Sequenzen beinhaltet. In einer anderen Ausführungsform beinhaltet ein zyklisches Peptid eine LYHY (SEQ.-ID-Nr. 1)-Sequenz und eine von einem unterschiedlichen CAM erkannte CAR-Sequenz. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird die zweite CAR-Sequenz aus Fibronektin (d.h. RGD); einem klassischen Cadherin (d.h. HAV); einem Claudin oder einem nichtklassischen Cadherin abgeleitet, wie oben beschrieben.
Zyklische Peptide, die mindestens eine Occludin-CAR-Sequenz enthalten, können kovalent mit entweder zyklischen oder linearen Peptiden, die mindestens eine von einem unterschiedlichen CAM erkannte CAR-Sequenz enthalten, verbunden sein, wie oben beschrieben. Unter Verwendung eines Linkers können zyklische LYHY-enthaltende Peptide und andere zyklische oder lineare Peptid- oder Proteinsequenzen Kopf-Schwanz (d.h. der Linker kann kovalent an die Carboxyl- oder Aminogruppe jeder Peptidsequenz gebunden werden), Kopf-Seitenkette und/oder Schwanz-Seitenkette verbunden werden. Regulationsmittel, die einen oder mehr Linker aufweisen, können lineare oder verzweigte Strukturen bilden. In einer Ausführungsform umfassen Regulationsmittel mit einer verzweigten Struktur multiple unterschiedliche CAR-Sequenzen, wie verschiedene Kombinationen aus LYHY (SEQ.-ID-Nr. 1), RGD, HAV, Claudin-CAR-Sequenz(en) und/oder nichtklassische Cadherin-CAR-Sequenz(en).
Zusätzlich zur/zu der/den CAR-Sequenz(en) umfassen zyklische Peptide im Allgemeinen mindestens einen zusätzlichen Rest, so dass die Größe des zyklischen Peptidringes zwischen 5 und ca. 15 Resten, vorzugsweise zwischen 5 und 10 Resten aufweist. Ein derartiger/Derartige zusätzliche(r) Rest(e) kann/können auf der N-terminalen und/oder C-terminalen Seite einer CAR-Sequenz vorhanden sein und kann/können aus Sequenzen, die die endogene Occludin-CAR-Sequenz flankieren, mit oder ohne Aminosäure-Substitutionen und/oder anderen Modifikationen abgeleitet werden.
Alternativ können zusätzliche Reste, die auf einer der beiden Seiten der CARS Sequenz(en) vorhanden sind, nicht in Verbindung zu einer endogenen Sequenz stehen (z.B. Reste, die die Cyclisierung fördern).
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen, die unten diskutiert werden, werden relativ kleine zyklische Peptide, die keine signifikanten die LYHY-Sequenz flankierenden Sequenzen enthalten, zur Regulation der Occludin-vermittelten Zelladhäsion bevorzugt. Derartige Peptide können eine N-Acetylgruppe und eine C-Amidgruppe (z.B. der 6-Reste-Ring N-AcCLYHYC-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 3) enthalten. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kennzeichnen die unterstrichenen Peptidsequenzen zyklische Peptide, wobei die Cyclisierung durch jedes hier gelieferte geeignete Verfahren durchgeführt wird.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen kann ein zyklisches Peptid Sequenzen enthalten, die die LYHY (SEQ.-ID-Nr. 1)-Sequenz in einem nativen Occludin-Molekül an einer oder beiden Seiten flankieren. Aus derartigen Sequenzen kann eine erhöhte Potenz resultieren. Geeignete flankierende Sequenzen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die im natürlichen Occludin auftretende endogene Sequenz. Um die Herstellung von zyklischen Peptiden mit einer erhöhten Potenz zu erleichtern, können Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Rechenverfahren eingesetzt werden, um die Konformation eines Peptids, das eine erhöhte Potenz überträgt, zu bestimmen, wie oben beschrieben.
Die hier beschriebenen zyklischen Peptide können Reste von L-Aminosäuren, D-Aminosäuren oder einer Kombination aus diesen enthalten. Ein zyklisches Peptid kann auch eine oder mehrere seltene Aminosäuren (wie 4-Hydroxyprolin oder Hydroxvlysin), organische Säuren oder Amide und/oder Derivate von gewöhnlichen Aminosäuren, wie Aminosäuren, die das C-terminale Carboxylat verestert (z.B. Benzyl, Methyl oder Äthylester) oder amidatiert haben und/oder Modifikationen der N-terminalen Aminogruppe (z.B. Azetylierung oder Alkoxycarbonylierung), mit oder ohne eine aus einer breiten Auswahl an Seitenketten-Modifikationen und/oder -substitutionen (z.B. Methylierung, Benzylierung, t-Butylierung, Tosylierung, Alkoxycarbonylierung und dergleichen) haben. Bevorzugte Derivate umfassen Aminosäuren mit einer N-Acetylgruppe (derartig, dass die Aminogruppe, die den N-Terminus des linearen Peptids vor der Cyclisierung repräsentiert, acetyliert ist) und/oder eine C-terminale Amidgruppe (d.h. der Carboxy-Terminus des linearen Peptids wird vor der Cyclisierung amidiert). Andere Reste als gewöhnliche Aminosäuren, die in einem zyklischen Peptid vorhanden sein können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Penicillamin, β,β-Tetramethylen-Cystein, β,β-Pentamethylen-Cystein, β-Mercaptopropionsäure, β,β-Pentamethylen-β-Mercaptopropionsäure, 2-Mercaptobenzol, 2-Mercaptoanilin, 2-Mercaptoprolin, Omithin, Diaminobuttersäure, α-Aminoadipinsäure, m-Aminomethylbenzoesäure und α,β-Diaminopropionsäure.
Die hier beschriebenen zyklischen Peptide können durch in Fachkreisen gut bekannte Verfahren, einschließlich rekombinanter DNA-Verfahren und chemische Synthese, synthetisiert werden. Im Anschluss an die Synthese eines linearen Peptids (unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren) mit oder ohne N-Acetylierung und/oder C-Amidierung kann die Cyclisierung durch irgendeines aus der Auswahl von in Fachkreisen gut bekannten Verfahren erreicht werden. In einer Ausführungsform kann eine Bindung zwischen reaktiven Aminosäure-Seitenketten erzeugt werden. Beispielsweise kann eine Disulfidbrücke aus einem linearen Peptid, das zwei Thiol-enthaltende Reste aufweist, durch Oxidieren des Peptids unter Verwendung eines aus der Reihe der zur Auswahl stehenden Verfahren gebildet werden. Bei einem dieser Verfahren können Disulfid-Bindungen durch Luftoxidation von Thiol über einem Zeitraum von einigen Tagen erzeugt werden, wobei entweder basische oder neutrale wässrige Medien verwendet werden. Das Peptid wird in stark verdünnter Form verwendet, um Aggregation und intermolekulare Nebenreaktionen zu minimieren. Dieses Verfahren weist den Nachteil auf, langsam zu sein, hat jedoch den Vorteil, dass nur H₂O als Nebenprodukt entsteht. Alternativ können für die Bildung von Disulfid-Bindungen stark oxidieren de Wirkstoffe wie I₂ und K₃Fe(CN)₆ verwendet werden. Der Fachmann wird erkennen, dass dabei Vorsicht geboten ist, damit die sensitiven Seitenketten aus Met, Tyr, Trp oder His nicht oxidieren. Durch diese Verfahren hergestellte zyklische Peptide benötigen eine Reinigung unter Verwendung von Standardverfahren, aber diese Oxidation ist auch bei sauren ph-Werten anwendbar. Als Beispiel können stark oxidierende Wirkstoffe verwendet werden, um die unten dargestellte Cyclisierung (SEQ.-ID-Nr. 19 und 20) durchzuführen, wobei der unterstrichene Teil cyclisiert ist: FmocCysAsp(t-Bu)GlyTyr(1-Bu)ProLys(Boc)Asp(t-Bu)CysLys(t-Bu)Gly-OMe → FmocCysAsp(t-Bu)GlyTyr(t-Bu)ProLys(Boc)Asp(t-Bu)CysLys(t-Bu)Gly-OMe
Oxidierende Wirkstoffe ermöglichen auch eine gleichzeitige Entschützung/Oxidation von geeigneten S-geschützten linearen Vorläufersubstanzen (precursors), um eine verfrühte nichtspezifische Oxidation von freiem Cystein zu vermeiden, wie unten (SEQ.-ID-Nr. 21 und 22) dargestellt, wobei X und Y = S-Trt oder S-Acm: BocCvs(X)GlyAsnLeuSer(t-Bu)Thr(t-Bu)Cys(Y)MetLeuGlyOH → BocCysGlyAsnLeuSer(t-Bu)Thr(t-Bu)CysMetLeuGlyOH
DMSO ist im Unterschied zu I₂, und K₃Fe(CN)₆ ein schonender Oxidator, der keine oxidativen Nebenreaktionen der oben genannten nukleophilen Aminosäuren verursacht. DMSO ist mit H₂O bei allen Konzentrationen mischbar und Oxidationen können bei saurem bis neutralem pH-Wert mit unschädlichen Nebenprodukten durchgeführt werden. Methyltrichlorsilan-Diphenylsulfoxid kann alternativ als Oxidator zur gleichzeitigen Entschützung/Oxidation von S-Acm, S-Tacm oder S-t-Bu von Cystein eingesetzt werden, ohne, dass andere nukleophile Aminsäuren betroffen werden. Es gibt keine Polymerprodukte, die aus der intermolekularen Bildung der Disulfid-Bindung entstehen. Im Beispiel unten (SEQ.-ID-Nr. 23 und 24) steht X für Acm, Tacm oder t-Bu: H-Cys(X)TyrIleGlnAsnCys(X)ProLeuGly-NH₂ → H-CysTyrIleGlnAsnCysProLeuGly-NH₂
Geeignete Thiol-enthaltende Reste für die Verwendung in derartigen Oxidationsverfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Cystein, β,β-Dimethyl-Cystein (Penicillamin oder Pen), β,β-Tetramethylen-Cystein (Tmc), β,β-Pentamethylen-Cystein (Pmc), β-Mercaptopropionsäure (Mpr), β,β-Pentamethylen-β-Mercaptopropionsäure (Pmp), 2-Mercaptobenzol, 2-Mercaptoanilin und 2-Mercaptoprolin. Peptide, die derartige Reste enthalten, werden durch die folgenden repräsentativen Formeln veranschaulicht, in denen der unterstrichene Teil cyclisiert ist. N-Acetylgruppen sind durch N-Ac gekennzeichnet und C-terminale Amidgruppen sind durch-NH₂ dargestellt:
Einem Fachmann wird ohne weiteres naheliegend sein, dass in jeder dieser repräsentativen Formeln statt einem oder beiden der angeführten Thiol-enthaltenden Reste jegliches der oben aufgeführten Thiol-enthaltenen Reste eingesetzt werden kann.
In einer anderen Ausführungsform kann die Cyclisierung durch die Bildung einer Amid-Bindung erreicht werden. Beispielsweise kann eine Peptidbindung zwischen terminalen funktionellen Gruppen (d.h. die Amino- und Carboxy-Termini eines linearen Peptids vor der Cyclisierung) gebildet werden. Zwei solcher zyklischen Peptide sind YLYHY (SEQ.-ID-Nr. 18) und OYLYHY (SEQ.-ID-Nr. 17). In einer anderen derartigen Ausführungsform umfasst das zyklische Peptid eine D-Aminosäure (z.B. yLYHY; SEQ.-ID-Nr. 18). Alternativ kann die Cyclisierung durch eine Verknüpfung eines Terminus mit einer Restseitenkette oder unter Verwendung von zwei Seitenketten, wie bei KLYHYD (SEQ.-ID-Nr. 36) oder KQYLYHYD (SEQ.-ID-Nr. 37), mit oder ohne eine N-terminale Acetylgruppe und/oder ein C-terminales Amid, durchgeführt werden. Reste, die in der Lage sind, eine Lactambindung zu bilden, umfassen Lysin, Omithin (Orn), α-Aminoadipinsäure, m-Aminomethylbenzoesäure, α,β-Diaminopropionsäure, Glutamat oder Aspartat.
Verfahren zur Bildung von Amidbindungen sind in Fachkreisen gut bekannt und basieren auf anerkannten Prinzipien der chemischen Reaktivität. In einem dieser Verfahren kann Carbodiimidvermittelte Lactambindung durch Reaktion der Carbonsäure mit DCC, DIC, EDAC oder DCCI erreicht werden, was zur Bildung einer O-Acylurea führt, die sofort mit der freien Aminogruppe zur Reaktion gebracht werden kann, um die Cyclisation zu beenden. Die Bildung der inaktiven N-Acylurea, die aus der O→ N-Migration resultiert, kann verhindert werden durch eine Umwandlung der O-Acylurea in ein aktives Ester durch Reaktion mit einer N-Hydroxy-Bindung wie 1-Hydroxybenzotriazol, 1-Hydroxysuccinimid, 1-Hydroxynorbornen Carboxamid oder Äthyl-2-Hydroximin-2-Cyanoacetat.
Zusätzlich zur Minimierung der O→ N-Migration können diese Zusatzstoffe auch als Katalysatoren während der Cyclisierung dienen und die Verringerung der Racemization unterstützen. Alternativ kann Cyclisierung unter Verwendung der Azid-Methode, in der ein reaktives Azid-Zwischenprodukt über ein Hydrazid aus einem Alkylester generiert wird, durchgeführt werden. Die Hydrazinolyse des terminalen Esters erfordert die Verwendung einer t-Butyl-Gruppe für den Schutz der Seitenketten-Carboxylfunktionen in der Acylierungskomponente. Diese Einschränkung kann überwunden werden durch die Verwendung von Diphenylphosphoryl-Säure (DPPA), welche ein Azid direkt nach der Reaktion mit einer Carboxylgruppe versieht. Die langsame Reaktivität von Aziden und die Bildung von Isocyanaten aufgrund ihrer Disproportionierung schränken die Zweckmäßigkeit dieses Verfahrens ein. Das gemischte Anhydridverfahren zur Lactambildung ist aufgrund der einfachen Beseitigung von Reaktionsnebenprodukten weit verbreitet. Das Anhydrid wird nach der Reaktion des Carboxylat-Anions mit einem Alkyl-Chloroformiat oder Pivaloylchlorid gebildet. Der Angriff der Amino-Komponente wird dann durch den Elektronendonor-Effekt der Alkoxygruppe oder die sterische Größe der Pivaloylchlorid-t-Butyl-Gruppe, die den Angriff auf die falsche Carbonyl-Gruppe abschirmt, zum Carbonylkohlenstoff der Acylierungs-Komponente geführt. Gemischte Anhydride mit Phosphorsäurederivaten wurden ebenfalls erfolgreich eingesetzt. Alternativ kann die Cyclisierung unter Verwendung von aktiviertem Ester durchgeführt werden. Die Anwesenheit von Elektronenentzugs-Substituenten auf dem Alkoxykohlenstoff von Ester erhöht deren Suszeptibilität für Aminolyse. Die hohe Reaktivität von Ester von p-Nitrophenol, N-Hydroxyverbindungen und polyhalogen-Phenolen hat diese „aktiven Ester" für die Synthese von Amidbindungen nützlich gemacht. In den vergangenen Jahren haben sich Benzotriazolyloxy-tris-(Dimethylamino) Phosphonium-Hexafluorophosphosphat (BOP) und seine gleichartigen Vertreter als vorteilhafte Kupplungsreagenzien erwiesen. Ihre Leistung ist im Allgemeinen besser, als die bewährten Reaktionen der Carbodiimid-Amidbildung.
In einer weiteren Ausführungsform kann eine Thioether-Bindung zwischen der Seitenkette eines Thiol-enthaltenden Rests und einer entsprechend derivatisierten α-Aminosäure gebildet werden. Als Beispiel kann eine Lysin-Seitenkette durch die Carbodlimid-Kupplungsmethode (DCC, EDAC) an Bromessigsäure gekuppelt werden und dann mit der Seitenkette von einem der oben erwähnten Thiol-enthaltenden Reste in Reaktion treten, um eine Thioether-Bindung zu bilden. Um Dithioether zu bilden, kann jedes zwei-Seitenketten-enthaltendes Thiol mit Dibromoethan und Diisopropylamin in DMF in Reaktion treten. Beispiele für Thiol-enthaltende Bindungen sind unten dargestellt:
Die Cyclisierung kann auch durch Verwendung von δ₁,δ₁-Ditryptophan (d.h. Ac-Trp-Gly- Gly-Trp-OMe) (SEQ.-ID-Nr. 38) erreicht werden, wie dargestellt:
Repräsentative Strukturen zyklischer Peptide sind in 3 dargestellt. In 3 sind bestimmte zyklische Peptide, die in der Lage zur Regulation von Zelladhäsion sind (links gezeigt) ähnlichen inaktiven Strukturen gegenübergestellt (rechts). Die hier angeführten Strukturen und Formeln sind ausschließlich zu Illustrationszwecken geliefert und erheben keinen Anspruch auf Vollständigkeit der hier beschriebenen zyklischen Peptide.
Wie oben erwähnt, kann ein Regulationsmittel an Stelle (oder zusätzlich zu) einer Occludin-CAR-Sequenz einen Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon aufweisen. Von einem hier verwendeten Antikörper oder einem antigenbindenden Fragment wird gesagt, dass es sich an eine Occludin-CAR-Sequenz (mit oder ohne flankierende Aminosäuren) „spezifisch bindet", wenn es zu einem nachweisbaren Niveau mit einem Peptid reagiert, das diese Sequenz enthält, und nicht nachweisbar mit Peptiden reagiert, die eine unterschiedliche CAR-Sequenz oder eine Sequenz enthalten, in der die Anordnung von Aminosäureresten in der Occludin-CAR-Sequenz und/oder der flankierenden Sequenz verändert ist. Derartige Antikörperbindungseigenschaften können unter Verwendung von ELISA beurteilt werden, wie beschrieben in Newton et al., Develop Dynamics 197:1-13, 1993.
Polyklonale und monoklonale Antikörper können gegenüber einer Occludin-CAR-Sequenz, die konventionelle Verfahren einsetzt, bevorzugt werden. Siehe dazu z.B. Harlow and Lane: Antibodes: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. In einem solchen Verfahren wird ein Immunogen, das die Occludin-CAR-Sequenz aufweist, zunächst in eines aus der breiten Vielfalt von Säugern injiziert (z.B. Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schaf oder Ziegen). Das kleinere Immunogen (d.h. weniger als ungefähr 20 Aminosäuren) sollten mit einem Trägerprotein, wie Rinder-Serumalbumin oder einem Hämocyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke, verbunden werden. Nach einer oder mehreren Injektionen werden die Tiere periodisch zur Ader gelassen. Polyklonale Antikörper, die spezifisch für die CAR-Sequenz sind, können dann von derartigen Antisera beispielsweise durch Affinitätschromatographie unter Verwendung des Regulationsmittels oder eines antigenen Bereichs davon, der an einen geeigneten festen Träger gekuppelt ist, gereinigt werden.
Monoklonale Antikörper, die spezifisch für die Occludin-CAR-Sequenz sind, können zum Beispiel unter Verwendung des Verfahrens von Kohler und Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976, und Verbesserungen dazu hergestellt werden. Zusammengefasst beinhalten diese Verfahren die Herstellung von immortalen Zelllinien, die in der Lage sind, Antikörper mit der gewünschten Spezifität von Milzzellen zu produzieren, welche von einem wie oben beschriebenen immunisierten Tier erhalten wurden. Die Milzzellen werden zum Beispiel durch Fusion mit einer Myelomzelle als Fusionspartner, vorzugsweise einer, die syngenetisch mit dem immunisierten Tier ist, immortalisiert. Einzelne Kolonien werden ausgewählt und ihre Kultur-Supernatanten auf Bindungsaktivität gegenüber dem Reguliatonsmittel oder dem antigenen Teil davon getestet. Hybridomen mit hoher Reaktionsfähigkeit und Spezifität werden bevorzugt.
Monoklonale Antikörper können von den Supernatanten wachsender Hybridom-Kolonien mit oder ohne die Verwendung verschiedener in Fachkreisen gut bekannter Verfahren isoliert werden. Kontaminanten können von den Antikörpern mit konventionellen Verfahren, wie Chromatographie, Gelfiltrierung, Ausfällung und Extraktion, entfernt werden. Antikörper mit der gewünschten Aktivität können im Allgemeinen durch die Immunfluoreszenz-Analyse von Gewebeabschnitten, Zelle oder anderen Proben, in denen sich das Ziel-Occludin befindet, identifiziert werden.
In bestimmten Ausführungsformen kann die Verwendung von antigenbindenden Fragmenten von Antikörpern bevorzugt werden. Solche Fragmente beinhalten Fab-Fragmente, die unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt werden können. Zusammengefasst kann Immunoglobulin von Kaninchen-Serum durch Affinitätschromatographie auf Protein-A-Brutkolonien gereinigt (Harlow und Lane: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, 1988; Siehe insbesondere S. 309) und mit Papain aufgeschlosssen werden, um Fab- und Fc-Fragmente zu ergeben. Die Fab- und Fc-Fragmente können durch Affinitätschromatographie auf Protein-A-Brutkolonien separiert werden (Harlow und Lane, 1988, Seiten 628-29).
BEWERTUNG DER AKTIVITÄT DES REGULATIONSMITTELS
Wie oben erwähnt sind die hier beschriebenen Regulationsmittel in der Lage, Occludinvermittelte Zelladhäsion zu regulieren. Die Fähigkeit eines Wirkstoffs, Zelleadhäsion zu regulieren, kann im Allgemeinen in vitro durch Testen der Wirkung auf die Endothel- und/oder Epithelzelladhäsion, z.B. unter Verwendung eines aus der Auswahl an Immunfärbungs-Protokollen und/oder Plattenkulturversuchen bewertet werden. Im Allgemeinen ist ein Regulationsmittel ein Hemmstoff der Zelladhäsion, wenn der Kontakt der Testzellen mit dem Regulationsmittel unter Verwendung einer oder mehrerer der hier gelieferten repräsentativen Analysen zu einer nachweisbaren Störung der Zelladhäsion fahrt. Regulationsmittel, die Zelladhäsion fördern (z.B. Wirkstoffe, die multiple LYHY (SEQ.-ID-Nr. 1)-Sequenzen aufweisen und/oder mit einem Trägermolekül oder -material verbunden sind) werden als Regulatoren der Zelladhäsion betrachtet, wenn sie in der Lage sind, die Zelladhäsion zu fördern, wie beurteilt wurde durch Plattenkulturversuche, um entweder die Endothel- oder Epithelzelladhäsion auf ein Regulationsmittel, das auf ein Trägermaterial, wie Gewebe-Kulturplastik, befestigt wurde, zu bewerten.
Die Fähigkeit eines Wirkstoffs zur Regulation von Zelleadhäsion kann im Allgemeinen in vivo durch Bewertung der Wirkung auf Gefäßpermeabilität unter Verwendung der Miles-Analyse (McClure et al., J. Pharmacological & Toxicological Methods 32:49-52, 1994) bewertet werden. Zusammengefasst kann ein in Frage kommendes Regulationsmittel in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei einer Konzentration von 100 μg/ml gelöst werden. Adulten Ratten können 100 μg von jeder Peptidlösung durch subdermale Injektionen in ihre rasierten Rücken, gefolgt von einer 15 Minuten später erfolgenden einfachen Injektion von 250 μl mit 1% in PBS gelöstem Evans-Blau in ihre Schwanzvenen, gegeben werden. Die subdermalen Injektionsstellen können visuell aufgrund des Erscheinens des blauen Farbstoffs verfolgt werden. Sobald der Farbstoff erscheint (ungefähr 15 Minuten nach der Injektion), kann jede subdermale Injektionsstelle ausgeschnitten, gewogen und 24 Stunden lang in 1 ml Dimethylformamid gelegt werden, um den Farbstoff zu extrahieren. Die optische Dichte der Farbstoffextrakte kann dann bei 620 nm bestimmt werden. Im Allgemeinen verursacht die Injektion von 0,1 ml mit dem Regulationsmittel (bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml) in die Rücken der Ratten eine Zunahme der Farbstoffspeicherung von mindestens 50% an den Injektionsstellen im Vergleich zu Farbstoffspeicherung an Stellen, in die PBS injiziert worden ist.
Die Wirkung eines Regulationsmittels auf die Endothelzelladhäsion kann im Allgemeinen unter Verwendung von Verfahren zur Immunolokalisierung bewertet werden. Menschliche Aorta-Endothelzellen (HAEC) können auf Fibronektin-beschichteten Deckgläschen (Fibronektin kann aus Sigma, St. Louis, MO, erhalten werden) gemäß der Verfahren nach Jaffe et al., J. Clin. Invest. 52:2745-2756, 1973, kultiviert werden. Zusammengefasst können menschliche Endothelzellen in EGM (Endothelzell-Wachstumsmedium; Clonetics, San Diego, CA) bewahrt und für Experimente in Passus 4 verwendet werden. Konfluente Kulturen von HAEC können entweder einem in Frage kommenden Regulationsmittel (letzte Konzentration 100 μg/ml EGM) oder ausschließlich EGM 1 Stunde lang ausgesetzt werden. Die Zellen werden dann 30 Minuten lang bei 4°C in 95 %-igen Äthanol fixiert, gefolgt von einer 1-Minute andauernden Fixierung in Aceton bei 4°C (Furuse et al., J. Cell Biol. 123:1777-1788, 1993). Nach der Fixierung können die Zellen mit entweder Maus-anti-VE-Cadherin-Antikörpern (Hemeris, Sassenage, France; verdünnt 1:250 in 0,1% in PBS gelöstem Magermilchpulver) oder Kaninchen-anti-Occludin-Antikörper (Zymed, South San Francisco, CA; verdünnt 1:300 in 0,1% in PBS gelöstem Magermilchpulver), eine Stunde lang bei 37°C getestet werden. Die Zellen können dann mit 0,1% in PBS gelöstem Magermilchpulver gewaschen werden (drei Waschgänge, 5 Minuten/Wäsche) und mit sekundären Antikörpern (Esel-anti-Maus Cy3 oder Esel-anti-Kaninchen Cy5, verdünnt 1:250 in 0,1% in PBS gelöstem Magermilchpulver; Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., Westgrove, PA), eine Stunde lang bei 37°C getestet werden. Die Zellen können dann wieder mit in 0,1 % in PBS gelöstem Magermilchpulver gewaschen und in eine Lösung bestehend aus 50% Glycerol und 50% PBS präpariert werden, der Phenylendiamin (Sigma, St. Louis, MO) zur letzten Konzentration von 1 mg/ml beigefügt worden ist. Die Probe kann dann unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops Bio-Rad MRC 1000 mit Laser Sharp Software Version 2.1T (Bio-Rad. Hercules, CA) analysiert werden. Im Allgemeinen führen 0,1 mg/ml des Regulationsmittels zum Erscheinen von interzellulären Zwischenräumen in den Monolayerkulturen und zu einem Rückgang von mindestens 50% in der Oberflächenexpression von Occludin und VE-Cadherin, im Unterschied zu Monolayerkulturen, die dem Regulationsmittel nicht ausgesetzt wurden.
Bei bestimmten Zelladhäsionsversuchen resultiert der Zusatz eines Regulationsmittels zu den Occludin-exprimierenden Zellen in einer Störung der Zelladhäsion. Eine hier verwendete „Occludin-exprimierende Zelle" kann irgendein Zelltyp sein, der Occiudin bei einem nachweisbaren Niveau auf der Zelloberfläche exprimiert, wobei Standardverfahren wie immunocytochemische Tests (z.B. Blaschuk und Farookhi, Dev. Biol. 136:564-567, 1989) angewandt werden. Occludinexprimierende Zellen umfassen Endothel-, Epithel- und/oder Krebszellen. Zum Beispiel können solche Zellen unter Standardbedingungen, die Zelladhäsion in Abwesenheit des Regulationsmittels erlauben, plattiert werden. Bei Vorhandensein des Regulationsmittels (z.B.100 μg/mL) kann innerhalb von 24 Stunden eine Störung der Zelladhäsion durch die Beobachtung des Zurückziehens der Zellen voneinander visuell ermittelt werden.
In einem anderen derartigen Test kann die Wirkung eines Regulationsmittels auf eine normale Rattennieren (NRK)-Zelle bewertet werden. Gemäß eines repräsentativen Verfahrens können NRK-Zellen (ATCC #1571-CRL) mit 10-20.000 Zellen pro 35mm Gewebekulturflaschen, die DMEM mit 10%-igem FCS enthalten, plattiert und periodisch subkultiviert werden (Laird et al., J. Cell Biol. 131:1193-1203, 1995). Die Zellen können geerntet und in 35mm Gewebekulturflaschen, die 1mm Deckgläschen enthalten, umplattiert und inkubiert werden, bis sie 50-65% konfluent sind (24-36 Stunden). In dieser Zeit können die Deckgläschen auf eine 24-er Wellplatte transferiert, einmal mit frischem DMEM gewaschen und dann dem Regulationsmittel bei einer Konzentration von beispielsweise 0,1 mg/mL 24 Stunden lang ausgesetzt werden. Frisches Regulationsmittel kann dann hinzugefügt werden und die Zellen für weitere 24 Stunden gelassen werden. Die Zellen können 10 Minuten lang mit 100%-igem Methanol fixiert und drei Mal mit PBS gewaschen werden. Deckgläschen können für 1 Stunde in 2%-igem BSA/PBS blockiert und für eine weitere Stunde in Anwesenheit eines Kaninchen-anti-Occludin-Antikörpers ((Zymed, South San Francisco, CA) und eines Maus-anti-E-Cadherin-Antikörpers (Transduction Labs. Verdünnung 1:250) inkubiert werden. Primäre und sekundäre Antikörper können in 2%-igem BSA/PBS verdünnt werden. Nach der Inkubation im primären Antikörper können die Deckgläschen jeweils drei Mal 5 Minuten lang in PBS gewaschen und eine Stunde lang mit Esel-anti-Maus-Cy3 und Esel-anti-Kaninchen-Cy5 eine Stunde lang bei 37°C inkubiert werden (Jackson Immunresearch Laberatories Inc., Westgrove, PA). Nach weiteren Wäschen in PBS (3 × 5min) können die Deckgläschen aufgelegt werden und mit einem konfokalen Mikroskop betrachtet werden.
Bei Abwesenheit des Regulationsmittels bilden die NRK-Zellen charakteristisch enge adhärente Monolager mit einer Pflastersteinmorphologie, in der die Zellen eine polygonale Form zeigen. NRK-Zellen, die mit einem Regulationsmittel behandelt werden, der die Occludin-vermittelte Zell adhäsion stört, können innerhalb von 48 Stunden Behandlungszeit mit 0,1 mg/mL des Regulationsmittels eine nichtpolygonale und spitz zulaufende Morphologie annehmen (d.h. die Form eines Fibroblasten). Es erscheinen Zwischenräume in konfluenten Kulturen derartiger Zellen. Weiterhin induziert 0,1 mg/mL eines derartigen Regulationsmittels eine sofort sichtbare Reduktion der Zelloberflächenfärbung von Occludin und E-Cadherin von mindestens 75% innerhalb von 48 Stunden, wie mit der Immunofluoreszenz-Mikroskopie (Laird et al., J. Cell Biol. 131:1193-1203, 1995) eingeschätzt wurde.
Ein dritter Zelladhäsionsversuch beinhaltet die Bewertung der Wirkung eines Regulationsmittels auf die Permeabilität von adhärenten Endothelzell-Monolayern. Die Wirkungen eines Regulationsmittels auf die Permeabilität von Endothelzell-Monolayern können unter der Verwendung der Protokolle von Ehringer et al, J. Cell. Physiol. 167:562-569, 1996, begutachtet werden. HAEC kann auf Einsätze (inserts) in 24-er Wellplatten ausgesät werden (Becton-Dickenson, Franklin Lake, NJ) und in EGM kultiviert werden. Konfluente Zell-Monolayer können entweder einem Regulationsmittel (letzte Konzentration 100μg/ml EGM) oder eine Stunde lang ausschließlich EGM ausgesetzt werden. Die Einsätze können dann auf 24-er Kulturplatten (Becton-Dickenson) für Permeabilitätsversuche übertragen werden. Es kann Perfusat (0,5 % Rinder-Serumalbumin, Fraktion V (Sigma) gelöst in 15 mM HEPES, pH-Wert 7,4) und FITC-Dextran (50μl/ml HEPES-Puffer; MW 12 kDa; Sigma) kann jedem Well hinzugefügt (1ml/Well bzw. 50μl/Well) und die Zellen können 30min lang bei 37°C inkubiert werden. Aliquote von 100μl können dann von der unteren Kammer (chamber) entfernt und die optische Dichte der Lösung bei einer Wellenlänge von 450nm bestimmt werden. Im Allgemeinen resultiert die Anwesenheit von 100μg/mL des Regulationsmittels, das die Permeabilität von Endothelzell-Monolagern fördert, nach 1 Stunde in einer statistisch signifikanten Zunahme der Menge an Markern im Rezeptorkompartiment.
Ein noch weiterer Versuch bewertet die Wirkung eines Occludin-Regulationsmittels auf den elektrischen Widerstand in einem Zell-Monolayer. Beispielsweise können Madin Darby Kaninchen-Nieren (MDCK)-Zellen dem in einem Medium gelösten Regulationsmittel ausgesetzt werden (z.B. bei einer letzten Konzentration von 0,5 mg/ml für einen Zeitraum von 24 Stunden). Die Wirkung auf den elektrischen Widerstand kann unter Verwendung von Standardverfahren gemessen bewertet werden. Dieser Versuch bewertet die Wirkung eines Regulationsmittels auf die Bildung von tight junctions in Epithelzellen. Im Allgemeinen sollte sich die Anwesenheit von 500μg/mL des Regulationsmittels nach 24 Stunden auf eine statistisch signifikante Erhöhung oder Verminderung des elektrischen Widerstands auswirken.
MODIFIKATION UND ZUBEREITUNG DES REGULATIONSMITTELS
Ein hier beschriebenes Regulationsmittel kann, muss aber nicht, mit einem oder mehreren zusätzlichen Molekülen verbunden sein. Insbesondere kann es für bestimmte Anwendungen nützlich sein, multiple Regulationsmittel (die identisch sein können, aber nicht müssen) an ein Trägermaterial, derartig wie Einzelmoleküle (z.B. Hämocyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke) oder einen fester Träger, derartig wie eine polymere Matrix (die als Membran oder Mikrostruktur, wie z.B. ein ultradünner Film formuliert sein kann), eine Behälteroberfläche (z.B. die Oberfläche einer Gewebekulturplatte oder die innere Oberfläche eines Bioreaktors) oder ein Kügelchen (bead) oder ein anderes Teilchen, das aus einer Auswahl an Materialien einschließlich Glas, Plastik oder Keramik hergestellt werden kann, zu binden. Für bestimmte Anwendungen werden biologisch abbaubare Trägermaterialien bevorzugt, derartig wie Cellulose und Derivate davon, Collagen, Spinnenseide oder eines aus der Auswahl an Polyester (z.B. aus Hydroxysäuren und/oder Lactonen abgeleitete) oder Fäden (siehe U.S. Patent-Nr. 5.245.012 ). In bestimmten Ausführungsformen können Regulationsmittel und Moleküle, die (eine) andere CAR-Sequenz(en) (z.B. eine HAV-Sequenz) aufweisen, an einen Träger, derartig wie z.B. eine polymere Matrix, vorzugsweise in alternierender Weise, gebunden werden.
Geeignete Verfahren zur Bindung eines Regulationsmittels an ein Trägermaterial hängen von der Zusammensetzung des Trägers und der intendierten Verwendung ab und werden dem Fachmann ohne weiteres naheliegend sein. Die Bindung kann im Allgemeinen durch eine nichtkovalente Assoziation, derartig wie Adsorption oder Affinität oder vorzugsweise über kovalente Bindung erreicht werden (die eine direkte Bindung zwischen einem Regulationsmittel und funktionellen Gruppen am Träger oder eine Verbindung über ein quervernetzendes Agens sein kann). Die Bindung eines Regulationsmittels durch Adsorption kann durch Kontakt in einem geeigneten Puffer mit einem festen Träger in einem geeigneten Zeitraum erreicht werden. Die Kontaktzeit hängt von der Temperatur ab, beträgt aber im Allgemeinen zwischen ungefähr 5 Sekunden und 1 Tag und typischerweise zwischen ca. 10 Sekunden und 1 Stunde.
Die kovalente Bindung eines Regulationsmittels an ein Molekül oder an einen festen Träger kann im Allgemeinen durch eine erste Reaktion des Trägermaterials mit einem bifunktionalen Reagens, das auch mit einer funktionellen Gruppe, wie Hydroxyl, Thiol, Carboxyl, Keton oder einer Aminogruppe reagiert, auf dem Regulationsmittel erreicht werden. Beispielsweise kann ein Regulationsmittel gebunden sein an einen geeigneten polymeren Träger oder eine Beschichtung unter Verwendung von Benzoquinon, durch Kondensation einer Aldehydgruppe auf dem Träger mit einem Amin und einem aktiven Hydrogen auf dem Regulationsmittel oder durch Kondensation einer Aminogruppe auf dem Träger mit einer Carbonsäure auf dem Regulationsmittel. Ein bevorzugtes Verfahren für das Erzeugen einer Bindung wird über Aminogruppen unter Verwendung von Glutaraldehyd bewirkt. Ein Regulationsmittel kann mit Cellulose über Esterbindungen verbunden sein. In ähnlicher Weise können Amidbindungen für die Bindung zu anderen Molekülen wie Hämocyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke oder anderen Trägermaterialien geeignet sein. Multiple Regulationsmittel und/oder andere CAR-Sequenzen aufweisende Moleküle können z.B. durch zufällige Kupplung (random coupling) gebunden werden, in der äquimolare Mengen derartiger Moleküle mit einem Matrixträger gemischt werden und sie sich zufallsmäßig verkuppeln können.
Obwohl die hier beschriebenen Regulationsmittel sich vorzugsweise an spezifische Gewebe oder Zellen binden können und somit ausreichend sein können, um eine gewünschte Stelle in vivo anzuzielen, kann es für bestimmt Anwendungen von Vorteil sein, einen zusätzlichen Zielwirkstoff einzubeziehen. Dementsprechend kann ein Zielwirkstoff auch oder alternativ mit einem Regulationsmittel verbunden werden, um das Anzielen auf ein oder mehrere spezifische Gewebe zu erleichtern. Ein hier verwendeter "Zielwirkstoff" beinhaltet hier irgendeine Substanz (wie eine Verbindung oder eine Zelle), die, wenn sie mit einem Regulationsmittel verbunden wird, den Transport des Regulationsmittels zu einem Zielgewebe verbessert und sich auf diese Weise die vor Ort befindende Konzentration des Regulationsmittels erhöht. Zielwirkstoffe umfassen Antikörper oder Fragmente von diesen, Rezeptoren, Liganden und andere Moleküle, die Zellen oder im Zielgewebe oder in der Nähe davon binden. Bekannte Zielwirkstoffe umfassen Serumhormone, Antikörper gegen Zelloberflächenantigen, Lectine, Adhäsionsmoleküle, Liganden, die Tumorzelloberflächen binden, Steroide, Cholesterin, Lymphokine, fibrinolytische Enzyme und solche Arzneimittel und Proteine, die sich an einer gewünschten Zielstelle binden. Zu den vielen monoklonalen Antikörpern, die als Zielwirkstoffe dienen können, zählen Anti-TAC oder andere Interleukin-2-Rezeptor-Antikörper; 9.2.27 und NR-ML-05, reaktiv mit dem 250-Kilodalton-human-Melanom-assoziierten Proteoglycan; und NR-LU-10, reaktiv mit einem Pankarzinom-Glykoprotein. Ein Antikörper-Zielwirkstoff kann ein intaktes (ganzes) Molekül, ein Fragment davon oder ein funktionelles Equivalent davon sein. Beispiele für Antikörperfragmente sind F(ab')2, -Fab', Fab und F[v]-Fragmente, die durch konventionelle Verfahren oder durch genetische oder Proteintechnologie hergestellt werden können. Die Verbindung ist im Allgemeinen kovalent und kann z.B. durch direkte Kondensation oder andere Reaktionen durch bi- oder multifunktionale Linker erreicht werden.
In bestimmten Ausführungsformen kann es nützlich sein, auch oder alternativ ein Arzneimittel an ein Regulationsmittel zu binden. Der Begriff „Arzneimittel" bezieht sich hier auf alle bioaktiven Wirkstoffe, die zur Verabreichung an einen Säuger vorgesehen sind, um eine Krankheit oder ein anderes unerwünschtes Leiden zu verhindern oder zu behandeln. Arzneimittel umfassen Hormone, Wachstumsfaktoren, Proteine, Peptide und andere Verbindungen. Die Verwendung bestimmter spezifische Arzneimittel im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird im Folgenden diskutiert.
Die wie hier beschriebenen Regulationsmittel können in einer pharmazeutischen Verbindung auftreten. Eine pharmazeutische Verbindung weist ein oder mehrere Regulationsmittel in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch oder physiologisch akzeptablen Trägern, Verdünnungsmitteln oder Trägerstoffen auf. Solche Verbindungen können Puffer (z.B. neutralgepufferte Salzlösung oder phosphatgepufferte Salzlösung), Kohlenhydrate (z.B. Glucose, Mannose, Sukrose oder Dextran), Mannitol, Proteine, Polypeptide oder Aminosäuren wie Glycin, Antioxidanten, Chelatbildner wie EDTA oder Glutathion, Adjuvans (z.B. Aluminiumhydroxid) und/oder Konservierungsmittel aufweisen. In noch anderen Ausführungsformen können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung als ein Lyophilisat formuliert sein. Ein oder mehrere Regulationsmittel (allein oder in Kombination mit einem Zielwirkstoff und/oder Arzneimittel) können, aber müssen nicht, unter Anwendung von allgemein bekannter Technologie in Liposome verkapselt werden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können für jede geeignete Wiese der Verabreichung, einschließlich z.B. topisch, oral, nasal, intravenös, intrakranial, intraperitoneal, subkutan oder intramuskulär formuliert werden.
Für bestimmte unten diskutierte Ausführungsformen kann eine pharmazeutische Verbindung weiterhin einen Regulator zur Zelladhäsion aufweisen, der außer Occludin von einem oder mehreren Molekülen vermittelt wird. Derartige Regulatoren können im Allgemeinen wie oben beschrieben hergestellt werden, wobei eine oder mehrere Nicht-Occludin-CAR-Sequenzen und/oder Antikörper dazu statt der Occludin-CAR-Sequenz und Antikörper integriert werden. Derartige Verbindungen sind besonders nützlich für Situationen, in denen es wünschenswert ist, die von multiplen Zelladhäsionsmolekülen, wie von Cadherinen (z.B. klassische Cadherine, E-Cadherin, Dsg und Dsc); Integrinen; Angehörigen der Immunoglobulin-Supergenfamilie (wie N-CAM und PECAM); und Claudinen vermittelte Zelladhäsion zu hemmen. Bevorzugte CAR-Sequenzen für die Verwendung in einem derartigen Regulator beinhalten HAV, RGD und CAR-Sequenzen von Claudin, VE-Cadherin, dsg und dsc.
Eine pharmazeutische Verbindung kann auch, oder alternativ, einen oder mehrere Arzneimittel beinhalten, welche mit einem Regulationsmittel verbunden oder frei in der Verbindung vorhanden sein können. Praktisch jedes Arzneimittel kann in Kombination mit einem wie hier beschriebenen Regulationsmittel für eine Vielfalt von Zwecken, die unten beschrieben sind, verabreicht wer den. Beispiele für die Arzneimittelarten, die mit einem Regulationsmittel verabreicht werden können, umfassen Analgetika, Anästhetika, antianginale Arzneimittel und Antimykotika, Antibiotika, Antikrebsmittel (z.B. Taxol oder Mitomycin C), entzündungshemmende Arzneimittel (z.B. Ibuprofen und Indomethacin), Anthelminthika Antidepressiva, Antidote, Antiemetika, Antihistamine, Antihypertensiva, Antimalariamittel, Antimikrotubula-Wirkstoffe (z.B. Colchicin oder Vinca-Alkaloide), Antimigräne-Wirkstoffe, Antimikrobiale, Antiphsychotika, Antipyretika, Antiseptika, antisignalisierende Wirkstoffe (z.B. Protein-Kinase-C-Inhibitoren oder Inhibitoren intrazellulärer Kalziummobilisierung), Antiarthritika, Antithrombin-Wirkstoffe, Antituberkulotika, Antitussiva, Antivirale, Appetitzügler, herzwirksame Arzneimittel, Arzneimittel gegen chemische Abhängigkeits, Kathartika, chemotherapeutische Wirkstoffe, Koronarmittel, zerebrale oder periphere Vasodilatoren, kontrazeptive Wirkstoffe, Depressiva, Diuretika, Expektorantia, Wachstumsfaktoren, Hormonwirkstoffe, Hypnotika, Immunosuppressiva, narkotische Antagonisten, Parasympathomimetika, Sedativa, Stimulanten, Sympathomimetika, Toxine (z.B. Choleratoxin). Tranquilizer und urinäre Antiinfektiva.
Für Bildgebungszwecke kann jedes aus der Auswahl an diagnostischen Wirkstoffen in eine pharmazeutische Verbindung aufgenommen werden, unabhängig davon, ob es an ein Regulationsmittel gebunden oder frei in der Verbindung ist. Diagnostische Wirkstoffe umfassen jede Substanz, die verabreicht wird, um die physiologische Funktion eines Patienten zu erklären, während andere physiologische Funktionen im Allgemeinen unbeeinflusst bleiben. Diagnostische Wirkstoffe beinhalten Metalle, radioaktive Isotope und Radioopaque-Wirkstoffe (z.B. Gallium, Technetium, Indium, Strontium, Jod, Barium, Brom und phosphorhaltige Wirkstoffe), strahlendurchlässige Wirkstoffe, Kontrastmittel, Farbstoffe (z.B. fluoreszierende Farbstoffe und Chromophore) und Enzyme, die eine kolorimetrische oder fluorometrische Reaktion katalysieren. Im Allgemeinen können solche Wirkstoffe unter Verwendung einer Auswahl solcher wie den oben beschriebenen Techniken gebunden werden und in jeder Orientierung auftreten.
Die hier beschriebenen Verbindungen können als Teil einer ununterbrochenen Freigabeformulierung verabreicht werden (d.h. in einer Formulierung als Kapsel oder Tupfer (sponge), die eine langsame Freigabe der Regulationsmittel nach der Verabreichung bewirken. Solche Zubereitungen können mit gut bekannten Technologien hergestellt und z.B. durch orale, rektale oder subkutane Implantation oder durch Implantation an die gewünschte Zielstelle verabreicht werden. Formulierungen für die ununterbrochene Freigabe können ein Regulationsmittel enthalten, das in einer Träger-Matrix verteilt und/oder in einem von einer geschwindigkeits-kontrollierenden Kontrollmembran umgebenen Reservoir enthalten ist (siehe dazu z.B. Europäische Patentanmeldung 710,491 A ).
Träger für die Verwendung in einer solchen Zubereitungsform sind biokompatibel und können auch biologisch abbaubar sein; vorzugsweise liefert die Zubereitung ein relativ konstantes Freigabeniveau an Regulationsmitteln. Die Menge der Regulationsmittel, die in einer ununterbrochenen Freigabeformulierung enthalten ist, ist von der Stelle der Implantation, der Geschwindigkeit und erwarteten Dauer der Freigabe und der Art der zu behandelnden oder zu verhindernden Krankheit des Behandelten abhängig.
Pharmazeutische Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in einer für die zu behandelnde (oder vorzubeugende) Krankheit geeigneten Weise verabreicht werden.
Geeignete Dosierungen und eine geeignete Verabreichungsdauer und -häufigkeit werden durch Faktoren, wie dem Leiden des Patienten, dem Typ und der Schwere der Krankheit des Patienten und dem Verabreichungsverfahren bestimmt. Im Allgemeinen sorgt eine angemessene Dosierungs- und Behandlungsweise für eine ausreichende Menge des/der Regulationsmittels, um einen therapeutischen und/oder prophylaktischen Nutzen zu liefern. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann ein Regulationsmittel oder eine pharmazeutische Verbindung, wie hier beschrieben, in der Verabreichungsdosierung von 0,001 bis 50 mg/Kg Körpergewicht reichen, vorzugsweise von 0,1 bis 20 mg/Kg, bei einer Einnahmeverordnung von einfachen oder mehrfachen Dosierungen täglich. Für die topische Verabreichung weist eine Creme typischerweise eine Menge des Regulationsmittels zwischen 0,00001% und 1%, vorzugsweise zwischen 0.0001% und 0,2 % und noch bevorzugter zwischen 0,01% und 0,1% auf. Flüssige Verbindungen enthalten typischerweise eine Menge des Regulationsmittels zwischen 10 ng/ml und 5 mg/ml, vorzugsweise zwischen 10 μg und 2 mg/mL. Geeignete Dosierungen können im Allgemeinen durch experimentelle Modelle und/oder klinische Versuche ermittelt werden. Im Allgemeinen wird die Verwendung der minimalen Dosierung, die ausreichend für eine effektive Therapie ist, bevorzugt. Patienten können im Allgemeinen auf therapeutische Wirksamkeit beobachtet werden, wobei geeignete Tests für die zu behandelnde oder verhindernde Krankheit angewandt werden, die dem Fachmann bekannt sind.
ANWENDUNGSVERFAHREN DES REGULATIONSMITTELS
Im Allgemeinen können die hier beschriebenen Regulationsmittel und Verbindungen für die Regulation der Adhäsion von Occludin-exprimierenden Zellen in vitro und/oder in vivo eingesetzt werden. Wie oben beschrieben, können Regulationsmittel, die für Zwecke angewandt werden, welche die Störung der Occludin-vermittelten Zelladhäsion betreffen, eine Occludin-CAR-Sequenz, multiple Occludin-CAR-Sequenzen in der Nähe und/oder einen Antikörper (oder ein antigenbindendes Fragment davon), das die Occludin-CAR-Sequenz erkennt, beinhalten. Wenn es erwünscht ist, auch die durch andere Adhäsionsmoleküle vermittelte Zelladhäsion zu stören, kann ein Regulationsmittel zusätzlich eine oder mehrere CAR-Sequenzen aufweisen, die von derartigen Adhäsionsmolekülen (und/oder Antikörpern von Fragmenten von diesen, die derartige Sequenzen binden), die vorzugsweise voneinander und von der Occludin-CAR-Sequenz durch Linker separiert sind, gebunden werden. Wie oben erwähnt, können solche Linker eine oder mehrere Aminosäuren aufweisen oder nicht. Für die Förderung der Zelladhäsion kann ein Regulationsmittel multiple Occludin-CAR-Sequenzen oder Antikörper (oder Fragmente), die vorzugsweise durch Linker voneinander separiert sind, enthalten und/oder können an ein Einzelmolekül oder an ein Trägermaterial gebunden sein, wie oben beschrieben.
Bestimmte Verfahren, die die hier beschriebenen Unterbrechung von Zelladhäsion beinhalten, haben einen Vorteil gegenüber früheren Verfahren, indem sie den Transport von Molekülen, die groß sind und/oder durch Barrieren hindurch von Occludin-exprimierenden Zellen transportiert werden. Wie im Folgenden näher beschrieben wird, können die hier beschriebenen Regulationsmittel auch dazu verwendet werden, um Zelladhäsion in einer Reihe von anderen Zusammenhängen zu stören oder zu fördern. In jeder der hier beschriebenen Verfahren können ein er mehrere Regulationsmitteln im Allgemeinen allein oder zusammen mit einer pharmazeutischen Verbindung verabreicht werden. In jedem hier beschriebenen spezifischen Verfahren, kann, wie oben erwähnt, ein Zielwirkstoff eingesetzt werden, um die lokale Konzentration des Regulationsmittels an der Zielstelle zu erhöhen.
Die vorliegende Offenbarung liefert auch Verfahren zur Erhöhung der Gefäßpermeabilität in einem Säuger durch die Verabreichung eines oder mehrerer Regulationsmittel oder pharmazeutischer Verbindungen. Es wurde im Zusammenhang mit der vorliegenden Verbindung herausgefunden, dass Endothel-Zelladhäsion durch lineare und zyklische Peptide, die eine Occludin-CAR-Sequenz LYHY (SEQ.-ID-Nr. 1) enthalten, gestört werden kann. In Blutgefäßen führt Endothel-Zelladhäsion zu verminderter Gefäßpermeabilität. Dementsprechend können Regulationsmittel, die eine wie hier beschriebene Occludin-vermittelte Endothel-Zelladhäsion stören, die Gefäßpermeabilität erhöhen und damit den Arzneimitteltransport zu früher unerreichbaren Geweben, wie das Gehirn, erleichtern.
Ein bevorzugtes Regulationsmittel für die Verwendung in derartigen Verfahren ist H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3) und die eine derartige Sequenz oder Derivate davon aufweisenden Regulationsmittel mit einem oder mehreren C-terminalen, N-terminalen und/oder Seitenketten-Modifikationen. Bevorzugte Regulationsmittel umfassen Fab-Fragmente, die entweder gegen H-QYLYHYCVVD-OH (SEQ.-ID-Nr. 2) oder H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3) gerichtet sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein Regulationsmittel in der Lage, die durch multiple Adhäsionsmoleküle vermittelte Zelladhäsion zu stören. Zum Beispiel kann ein einfach verzweigtes Regulationsmittel (oder multiple an ein Einzelmolekül oder Trägermaterial gebundene Wirkstoffe) Occludin und Cadherin-vermittelte Zelladhäsion stören und auf diese Weise tight junctions und adherens junctions stören. Multifunktionale Regulationsmittel, die die Occludin-CAR-Sequenz-LYHY (SEQ.-ID-Nr. 1) aufweisen, die mit (vorzugsweise durch einem Linker) mit einer oder mehreren der klassischen Cadherin-CAR-Sequenz, einer Claudin-CAR-Sequenz, einer OB-Cadherin-CAR-Sequenz und/oder einer VE-Cadherin-CAR-Sequenz verbunden sind, werden auch bevorzugt. Alternativ kann ein separater Regulator einer Nicht-Occludin-vermittelten Zelladhäsion zusammen mit den/dem Regulationsmittel(n) entweder innerhalb der gleichen pharmazeutischen Verbindung oder separat verabreicht werden. Bevorzugte Antikörper-Regulationsmittel, die zusammen mit den Occludin Regulationsmitteln eingesetzt werden können, umfassen Fab-Fragmente, die gegen eine N-Cadherin-CAR-Sequenz, wie FHLRAHAVDINGNQV-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 4), gerichtet sind.
In bestimmten Ausführungsformen umfassen bevorzugte Regulationsmittel für die Verwendung in derartigen Verfahren Peptide, die in der Lage sind, sowohl Endothel- also auch Tumorzelladhäsion zu verringern. Derartige Regulationsmittel können eingesetzt werden, um die Penetration von Antitumor-Therapie oder Diagnostik-Wirkstoffen (z.B. Monoklonale Antikörper) durch Endothelzell-Permeabilitätsbarrieren und Tumorbarrieren hindurch zu erleichtern. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein Regulationsmittel in der Lage, durch multiple Adhäsionsmoleküle vermittelte Zelladhäsion zu stören. Zum Beispiel kann ein einfach verzweigtes Regulationsmittel (oder multiple mit einem Einzelmolekül oder Trägermaterial verbundene Wirkstoffe) Occludin-, Claudin-, VE-Cadherin-, Dsc- und Dsg- vermittelte Zelladhäsion stören. Alternativ kann ein separater Regulator von nicht-Occludin-vermittelter Zelladhäsion zusammen mit dem/den Regulationsmittel(en) entweder in der gleichen pharmazeutischen Verbindung oder separat davon verabreicht werden. Bevorzugte Antikörper-Regulationsmittel, die zusammen mit den Occludin-regulierenden Wirkstoffen eingesetzt werden können, umfassen Fab-Fragmente, die entweder gegen eine N-Cadherin-CAR-Sequenz wie FHLRAHAVDINGNQV-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 4) oder eine E-Cadherin-CAR-Sequenz, wie LFSHAVSSNG-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 39) gerichtet sind.
Die Behandlung mit einem Regulationsmittel kann beispielsweise vor der Verabreichung eines therapeutischen oder diagnostischen Anti-Tumor-Wirkstoffs (z.B. ein monoklonaler Antikörper oder ein anderes Makromolekül), eines antimikrobiellen Wirkstoffs oder eines entzündungshemmenden Wirkstoffs geeignet sein, um die Konzentration derartiger Wirkstoffe in der Nähe des Ziel tumors, Organismus oder der Entzündung zu erhöhen, ohne die Gesamtdosis für den Patienten zu erhöhen. Regulationsmittel für den Einsatz in derartigen Verfahren können an einen Zielwirkstoff gebunden sein, um die lokale Konzentration des Regulationsmittels weiter zu erhöhen, obwohl eine systemische Verabreichung eines vasoaktiven Wirkstoffs sogar in Abwesenheit eines Zielwirkstoffs die Perfusion bestimmter Tumore relativ zu anderen Geweben verstärkt. Geeignete Zielwirkstoffe beinhalten Antikörper und andere Moleküle, die sich spezifisch an Tumorzellen oder an Komponenten mit strukturell abnormalen Blutgefäßen binden. Beispielsweise kann ein Zielwirkstoff ein Antikörper sein, der sich an ein Fibrinabbauprodukt oder ein Zellenzym, wie Peroxidase, das von Granolozyten oder anderen Zellen in nekrotischen oder entzündeten Geweben freigesetzt wird, bindet.
Die Verabreichung über intravenöse Injektion oder die transdermale Verabreichung werden im Allgemeinen bevorzugt. Effektive Dosierungen sind im Allgemeinen ausreichend, um die Lokalisierung eines anschließend verabreichten diagnostischen oder therapeutischen Wirkstoffs so lange zu erhöhen, bis die klinische Therapiewirksamkeit an Diagnosegenauigkeit zu einem statistisch signifikanten Maß erreicht ist. Ein Vergleich kann zwischen behandelten und unbehandelten Tumor-Wirtstieren, denen eine equivalente Dosis des diagnostischen oder therapeutischen Wirkstoffs verabreicht wird, angestellt werden.
In weiteren Aspekten liefert die vorliegende Offenbarung Verfahren, in denen die Zelladhäsion herabgesetzt wird. In einem solchen Aspekt werden Verfahren zur Reduzierung unerwünschter Zelladhäsion durch Verabreichung eines Regulationsmittels geliefert. Unerwünschte Zelladhäsion kann auftreten zwischen Tumorzellen und normalen Zellen oder zwischen normalen Zellen im Ergebnis von Chirurgie, Verletzung, Chemotherapie, Krankheit, Entzündung oder andere Krankheiten, die die Zelllebensfähigkeit oder -funktion gefährden. Ein bevorzugtes Regulationsmittel für den Einsatz in derartigen Verfahren ist H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3) und Regulationsmittel, die eine derartige Sequenz oder Derivate davon aufweisen. Ein bevorzugtes Antikörper-Regulationsmittel umfasst Fab-Fragmente, die gegen entweder H-QYLYHYCVVD-OH (SEQ.-ID-Nr. 2) oder H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3) gerichtet sind. Weiterhin kann ein Regulationsmittel einen oder mehrere einer Claudin-CAR-Sequenz, eine CAR-Sequenz für ein nichtklassisches Cadherin (wie VE-Cadherin, OB-Cadherin, dsc oder dsg), eine RGD-Sequenz und/oder eine HAV-Sequenz, die durch einen Linker von der Occludin-CAR-Sequenz separiert ist, aufweisen. Alternativ können separate Regulatoren von Cadherin- und Integrin-vermittelter Zelladhäsion in Verbindung mit dem/den Regulationsmittel(en) entweder in der gleichen pharmazeutischen Verbindung oder separat davon verabreicht werden. Im Allgemeinen wird eine topische Verabreichung des/der Regulati onsmittel(s) bevorzugt, aber auch andere Mittel können verwendet werden. Vorzugsweise weist eine flüssige Verbindung für die topische Verabreichung (zum Beispiel physiologisches Salz aufweisend) eine wie oben beschriebene Menge an Regulationsmitteln und noch bevorzugter zwischen 10μg/mL und 1mg/mL auf. Cremes können im Allgemeinen in oben beschriebener Weise formuliert werden. Die topische Verabreichung im chirurgischen Bereich kann einmal am Ende des chirurgischen Eingriffs durch Wässerung der Wunde oder als intermittierende oder kontinuierliche Wässerung unter Verwendung postoperativer Wunddrainagen oder durch speziell gelegte Drainagen an einer entzündeten, verletzten oder kranken Stelle oder in Fällen, in denen ein chirurgischer Eingriff nicht ausgeführt werden muss, erfolgen. Alternativ kann eine parenterale oder transkutane Verabreichung zum Erreichen ähnlicher Wirkungen eingesetzt werden.
In einem anderen Aspekt werden Verfahren für die Verbesserung des Arzneimitteltransports durch die Haut eines Säugers geliefert. Die transdermale Zuführung von Arzneimitteln ist ein zweckdienliches und nichtinvasives Verfahren, das eingesetzt werden kann, um einen relativ konstanten Spiegel eines Arzneimittels im Blut zu erreichen. Um den Arzneimitteltransport über die Haut zu unterstützen, ist es im Allgemeinen notwendig, die Adhäsion zwischen den Epithelzellen (Keratinozyten) und den Endothelzellen in der Mikrovaskulatur zu stören. Beim Einsatz gegenwärtig verfügbarer Verfahren können nur kleine, unbeladene Moleküle in vivo durch die Haut transportiert werden. Die hier beschriebenen Verfahren sind diesem Grad an Beschränkung nicht unterworfen. Dementsprechend kann eine breite Vielfalt an Arzneimitteln für die systemische oder topische Verabreichung über die epithelialen und endothelialen Zellschichten der Haut transportiert werden. Derartige Arzneimittel können zu Melanomen transportiert werden oder in den Blutstrom des Säugers zum weiteren Transport zu anderen Stellen innerhalb des Körpers eintreten.
Um den Arzneimitteltransport durch die Haut zu verbessern, werden ein hier beschriebenes Regulationsmittel und ein Arzneimittel mit der Hautoberfläche in Verbindung gebracht. Ein bevorzugtes Regulationsmittel für den Einsatz in solchen Verfahren ist H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3) und Regulationsmittel oder Derivate davon, die eine derartige Sequenz aufweisen. Bevorzugte Antikörper-Regulationsmittel umfassen Fab-Fragmente, die entweder gegen H-QYLYHYCVVD-OH (SEQ.-ID-Nr. 2) oder gegen H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3) gerichtet sind. Multifunktionale Regulationsmittel, die eine Occludin-CAR-Sequenz aufweisen, verbunden mit einer oder mehreren einer Claudin-CAR-Sequenz, VE-Cadherin-CAR-Sequenz, dsc-CAR-Sequenz, dsg-CAR-Sequenz, RGD-Sequenz, und/oder HAV-Sequenz, können auch zur Störung der Zelladhäsion eingesetzt werden. Alternativ kann ein separater Regulator einer nicht-Occludin-vermittelten Zelladhäsion zusammen mit dem/n Regulationsmittel(n) entweder in der gleichen pharmazeutischen Verbindung oder separat davon verabreicht werden. Der Kontakt kann durch direkte Applikation des Regulationsmittels, das im Allgemeinen in einer Verbindung als Creme oder Gel formuliert wird, oder unter Verwendung eines aus der Vielfalt von Hautkontaktgeräten zur transdermalen Applikation hergestellt werden (wie beschriebenen in der Europäischen Patentanmeldungs-Nr. 566,816 A ; U.S. Patent-Nr. 5,613,958 ; U.S. Patent-Nr. 5,505,956 ). Ein Hautpflaster liefert ein zweckdienliches Verabreichungsverfahren (insbesondere bei Zubereitungen mit langsamer Freigabe). Solche Pflaster können ein Speicher für Regulationsmittel und Arzneimittel, welcher von der der Haut, durch die das Arzneimittel diffundiert, durch eine Membran abgetrennt ist, enthalten. Bei anderen Pflasterformen kann das Regulationsmittel und das Arzneimittel in einem Polymer oder einer Adhäsionsmatrix gelöst oder dorthin suspendiert werden, welche(s) dann in direkten Kontakt mit der Haut des Patienten gesetzt wird. Das Regulationsmittel und das Arzneimittel können dann von der Matrix in die Haut diffundieren. In der gleichen Verbindung oder in dem Hautpflaster kann/können (ein) Regulationsmittel und (ein) Arzneimittel enthalten sein, oder sie können auch davon separat verabreicht werden, obwohl die zeit- und ortgleiche Verabreichung bevorzugt wird. Im Allgemeinen variiert die Menge des über die Haut verabreichten Regulationsmittels in Abhängigkeit von der Art der behandelten oder vorgebeugten Erkrankung, kann jedoch in oben beschriebener Weise variieren. Solche Niveaus können durch geeignete Anpassungen an das verwendete Gerät oder durch die Anwendung einer Creme mit der oben beschriebenen Formulierung erreicht werden. Der Transfer des Arzneimittels durch die Haut und zum Zielgewebe kann auf der Grundlage von in vivo-Untersuchen, unter Verwendung von beispielsweise eines Franz-Zellapparates (Franz cell Apparatus), vorausgesagt werden und durch geeignete Mittel, die dem Fachmann naheliegend sind, in vivo bewertet werden. Beispielsweise liefert die Beobachtung des Serumniveaus des verabreichten Arzneimittels über eine Zeit lang eine einfache Bestimmungsmöglichkeit über den Arzneimitteltransfer durch die Haut.
Der hier beschriebene transdermale Arzneimitteltransport ist besonders nützlich in Situationen, in denen eine konstante Rate an Arzneimitteltransport wünschenswert ist, um schwankende Arzneimittelspiegel im Blut zu vermeiden. Morphin ist beispielsweise ein Analgetikum, das üblicherweise sofort nach einem chirurgischen Eingriff verwendet wird. Wird es intermittierend in einer parentalen Form verabreicht (intramuskulär, intravenös), fühlt sich der Patient gewöhnlich während der ersten Stunde schläfrig, während der nächsten 2 Stunden wohl und hat in der letzten Stunde Schmerzen, weil der Blutspiegel nach der Injektion schnell ansteigt und vor Ablauf des 4-Stunden-Intervals, das bis zur erneuten Injektion vorgesehen ist, unter das gewünschte Niveau sinkt. Die hier beschriebene transdermale Verabreichung erlaubt die Beibehaltung konstanter Spiegel über lange Zeiträume (z.B. Tage), was gleichzeitig eine geeignete Schmerzkontrolle sowie geistige Wachheit erlaubt. Insulin liefert ein weiteres derartiges Beispiel. Viele Diabetis-Patienten müssen einen konstanten Basisspiegel an Insulin, der sich von dem zu den Mahlzeiten notwendigen Niveau unterscheidet, beibehalten. Der Basisspiegel kann durch die hier beschriebene transdermale Verabreichung von Insulin aufrechterhalten werden. Auch Antibiotika können in konstanten Raten verabreicht werden, wodurch ein konstanter bakterizider Blutspiegel beibehalten wird, während hohe Spiegel vermieden werden, die oft für Toxizität verantwortlich sind (z.B. Gentamicin, bei dem der Spiegel typischerweise zu hoch ist, was zu Nierengiftigkeit führt).
Der Arzneimitteltransport nach den Verfahren der vorliegenden Erfindung liefert auch ein zweckdienliches Verfahren für die Arzneimittelverabreichung. Beispielsweise ist es häufig aufgrund der Schwierigkeit im Zusammenhang mit dem Finden von Venen von akzeptablem Durchmesser für das Legen von Kathetern besonders schwierig, Neugeborenen und Kinder parenterale Arzneimittel zu verabreichen. Andererseits haben Neugeborene und Kleinkinder oft eine relativ große Hautoberfläche im Vergleich zu Erwachsenen. Der transdermale Arzneimitteltransport erlaubt eine einfachere Handhabung solcher Patienten und ermöglicht die Durchführung von bestimmten Behandlungen zu Hause, die heute nur in Krankenhäusern geleistet werden können. Weitere Patienten, die typischerweise ähnliche Schwierigkeiten mit venöser Katheterisierung haben, sind Patienten, die mit Chemotherapie behandelt werden oder Patienten mit Dialyse. Weiterhin ist die transdermale Verabreichung für Patienten, die in einer längeren Therapie behandelt werden, zweckdienlicher, als die parenterale Verabreichung.
Die hier beschriebene transdermale Verabreichung erlaubt auch die Umgehung des Gastrointestinaltrakts in Situationen, in denen die parenterale Verwendung unpraktisch wäre. Zum Beispiel gibt es einen zunehmenden Bedarf an Verfahren, die für die Verabreichung von therapeutischen kleinen Peptiden und Proteinen, die typischerweise im Gastrointestinaltrakt aufgeschlossen werden, geeignet sind. Die hier beschriebenen Verfahren ermöglichen die Verabreichung solcher Verbindungen und die einfache Verabreichung über längere Zeiträume hinweg. Patienten, die wegen anhaltendem Ileus oder bestimmten gastrointestinalen Krankheiten, die die Arzneimittelaufnahme einschränken, Probleme mit der Absorption durch ihren Gastrointestinaltrakt haben, können ebenfalls von den hier beschriebenen Arzneimitteln mit Formulierungen für die transdermale Anwendung profitieren.
Weiterhin gibt es viele klinische Situationen, in denen es schwierig ist, Compliance zu erhalten. Beispielsweise sind Patienten mit geistigen Problemen (z.B. Patienten mit Alzheimer-Krankheit oder Psychose) leichter behandelbar, wenn eine konstante Zuführungsrate an Arzneimitteln gegeben ist, ohne sich auf die Fähigkeit des Patienten verlassen zu müssen, die Arzneimittel zu bestimmten Tageszeiten einzunehmen. Auch Patienten, die einfach vergessen, ihre Arzneimittel einzunehmen, werden dies weniger tun, wenn sie nur in regelmäßigen Abständen ein Hautpflaster anlegen müssen (z.B. alle 3 Tage). Patienten mit Krankheiten, die keine Symptome aufweisen, wie Patienten mit Hypertonie, sind besonders gefährdet, die Einnahme, ihre Arzneimittel in der verordneten Weise zu vergessen.
Für Patienten, die vielfache Arzneimittel einnehmen, können Vorrichtungen zur transdermalen Anwendung, wie Hautpflaster, mit Kombinationen aus Arzneimitteln, die häufig zusammen eingenommen werden, formuliert werden. Beispielsweise wird vielen Patienten mit Herzinsuffizienz Digoxin in Kombination mit Furosemid verabreicht. Die Kombination aus beiden Arzneimitteln in einem einzelnen Hautpflaster erleichtert die Verabreichung, reduziert das Risiko von Fehlern (die richtigen Pillen zur richtigen Zeit einzunehmen ist für ältere Menschen oft verwirrend), senkt die psychologische Belastung, „so viele Pillen" einzunehmen, mindert ausgelassene Dosierungen aufgrund von unregelmäßigen Aktivitäten und verbessert Compliance.
Die hier beschriebenen Verfahren sind besonders für Menschen geeignet, finden aber auch eine Reihe von Anwendungen im Veterinärbereich, wie die Verabreichung von Wachstumsfaktoren oder Hormonen (z.B. zur Fruchtbarkeitskontrolle) bei einem Tier.
Wie oben erwähnt, kann eine Reihe von Arzneimitteln gemäß der hier gelieferten Verfahren verabreicht werden. Einige Beispiele von Arzneimittelkategorien, die transdermal verabreicht werden können, umfassen entzündungshemmende Arzneimittel (z.B. bei Arthritis und anderen Leiden) wie alle NSAID, Indomethacin, Prednison, usw.; Analgetika (besonders, wenn die orale Absorption, wie nach einem chirurgischen Eingriff nicht möglich ist, und die parenterale Verabreichung nicht zweckdienlich oder erwünscht ist), einschließlich Morphium, Kodein, Demerol, Acetaminophen und Kombinationen aus diesen (z.B. Kodein plus Acetaminophen); Antibiotika wie Vancomycin (das nicht vom GI-Trakt absorbiert wird und häufig intravenös gegeben wird) oder eine Kombination aus INH und Rifampicin (z.B. für Tuberkulose); Antikoagulanten wie Heparin (das nicht gut vom G1-Trakt absorbiert wird und im Allgemeinen parenteral gegeben wird, was zu Schwankungen im Blutspiegel mit einem erhöhten Risiko zu Blutungen bei hohem Spiegel führt und das Risiko der Ineffizienz bei niedrigen Spiegeln birgt) und Warfarin (das vom GI-Trakt absorbiert wird, aber aufgrund des typischerweise der Abdominalchirurgie folgenden Ileus nicht sofort verabreicht werden kann); Antidepressiva (z.B. in Situationen, in denen Compliance ein Problem darstellt, wie bei der Alzheimer-Krankheit oder wenn das Beibehalten stabiler Blutspiegelwerte zu einer signifikanten Reduzierung anticholinerger Nebenwirkungen und einer besseren Verträglichkeit durch den Patienten führt), wie Amitriptylin, Imipramin, Prozac, etc.; Antihypertensiva (um z.B. Compliance zu verbessern und die mit schwankenden Blutspiegelwerten verbundenen Nebenwirkungen zu reduzieren), wie Diuretika und Beta-Blocker (die durch das gleiche Pflaster verabreicht werden können; z.B. Furosemid und Propanolol); Antipsychotika (z.B. um Compliance und die Verabreichung der Arzneimittel von Seiten der Pflegenden und Familienangehörigen zu erleichtern), wie Haloperidol und Chlorpromazin; und Anxiolytika oder Sedativa (z.B. um die nach oraler Verabreichung mit hohen Blutspiegelwerten verbundene Vigilanzreduktion zu vermeiden und einen kontinuierlichen Nutzen zu ermöglichen, indem die therapeutischen Mengen den ganzen Tag über konstant gehalten werden).
Es können zahlreiche weitere Arzneimittel in der hier beschriebenen Weise verabreicht werden, einschließlich natürlich auftretender und synthetischer Hormone, Wachstumsfaktoren, Proteine und Peptide. Zum Beispiel können Insulin und menschliche Wachstumshormone, Wachstumsfaktoren wie Erythropoietin, Interleukine und Inteferone über der Haut verabreicht werden.
Durch die vorliegende Erfindung werden auch Ausstattungen für das Verabreichen eines Arzneimittels über die Haut eines Säugers geliefert. Derartige Ausstattungen weisen im Allgemeinen eine Vorrichtung zur transdermalen Anwendung (z.B. ein Hautpflaster) in Kombination mit oder imprägniert mit einem oder mehreren Regulationsmitteln auf. In solchen Ausstattungen kann zusätzlich auch ein Arzneimittel enthalten sein.
In einem verwandten Aspekt kann der Einsatz der hier beschriebenen Regulationsmittel für die Verbesserung der Hautpermeabilität auch die Probenahme des Blutkompartiments durch passive Diffusion erleichtern, indem das Feststellen und/oder die Messung des Spiegels spezifischer im Blut zirkulierender Moleküle ermöglicht werden. Beispielsweise wird es bei der Anwendung eines oder mehrerer Regulationsmittel auf der Haut dem Hautpflaster ermöglicht, wie ein Schwamm zu funktionieren, indem es eine kleine Menge Flüssigkeit, die die repräsentative Probe des Serums enthält, zu speichert. Das Pflaster wird dann nach einem spezifizierten Zeitraum entfernt und durch geeignete Verfahren auf die interessante Verbindung hin analysiert (z.B. ein Arzneimittel, Hormon, Wachstumsfaktor, Metabolit oder Marker). Alternativ kann ein Pflaster mit Reagenzien imprägniert sein, um eine Farbänderung zu ermöglichen, wenn eine bestimmte Substanz (z.B. ein Enzym) entdeckt wird. Substanzen, die auf diese Weise ermittelt werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf illegale Drogen wie Kokain, HIV-Enzyme, Glucose und PSA. Diese Technologie ist von besonderem Nutzen für Heim-Prüfausrüstungen.
In einem weiteren Aspekt werden Verfahren zur Transportverbesserung eines Arzneimittels zu einem Tumor in einem Säuger geliefert, die die Verabreichung eines Regulationsmittels in Kombination mit einem Arzneimittel an einen tumorbefallenen Säuger umfassen. Ein bevorzugtes Regu lationsmittel für den Einsatz in solchen Verfahren ist H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3) sowie Regulationsmittel, die eine derartige Sequenz oder Derivate davon aufweisen. Bevorzugte Antikörper-Regulationsmittel beinhalten Fab-Fragmente, die gegen entweder H-QYLYHYCVVD-OH (SEQ.-ID-Nr. 2) oder H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3) gerichtet sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein Regulationsmittel in der Lage, durch multiple Adhäsionsmoleküle vermittelte Zelladhäsion zu stören. Beispielsweise kann ein einfach verzweigtes Regulationsmittel (oder multiple mit einem Einzelmolekül oder Trägermaterial verbundene Wirkstoffe) Occludin-, klassische Cadherin-, Integrin- und nichtklassische Cadherin- (z.B. Dsc und Dsg) vermittelte Zelladhäsion stören und somit tight junctions, adherens junctions und Desmosomen stören. Multifunktionale Regulationsmittel, die eine an eine RGD-Sequenz und/oder CAR-Sequenz(en) gebundene Occludin-CAR-Sequenz für einen oder mehrere von einem klassischen Cadherin, Claudin oder nichtklassischen Cadherin (z.B. OB-Cadherin, VE-Cadherin, dsc oder dsg) aufweisen, können zur Störung von Zelladhäsion eingesetzt werden. Alternativ kann ein separater Regulator einer nicht-Occludinvermittelten Zelladhäsion zusammen mit dem/den Regulationsmittel(en), entweder in der gleichen pharmazeutischen Verbindung oder separat davon verabreicht werden. Bevorzugte Antikörper-Regulationsmittel, die zusammen mit den Occludin-Regulationsmitteln verwendet werden können, beinhalten Fab-Fragmente, die entweder gegen eine N-Cadherin-CAR-Sequenz (wie FHLRAHAVDINGNQV-NH₂: SEQ ID-Nr. 4) oder eine E-Cadherin-CAR-Sequenz LFSHAVSSNG-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 39) gerichtet sein können.
Vorzugsweise werden das Regulationsmittel und das Arzneimittel in der gleichen Verbindung oder Arzneimittelzuführungs-Vorrichtung vor der Verabreichung formuliert. Im Allgemeinen kann ein Regulationsmittel den Arzneimitteltransport zu jeglichem Tumor verbessern und das Verabreichungsverfahren auf Grundlage des Ziellumortyps ausgewählt werden. Zum Beispiel kann für Melanome und andere zugängliche Tumore die oben beschriebene Injektion oder topische Verabreichung bevorzugt werden (z.B. können Metastasen von primären Ovarialtumoren durch das Spülen der Peritonealhöhle mit der Verbindung behandelt werden). Andere Tumore (z.B. Harnblasentumore) können durch Injektion mit dem Regulationsmittel und dem Arzneimittel (wie Mitomycin C) in die Tumorstelle behandelt werden. In anderen Fällen kann die Verbindung systemisch und zielgerichtet an den Tumor verabreicht werden, indem eines aus der Vielfalt spezifischer Zielwirkstoffe eingesetzt wird. Geeignete Arzneimittel können durch den Fachmann auf Grundlage des zu behandelnden Karzinoms festgestellt werden (z.B. Mitomycin C für Harnblasenkrebs). Im Allgemeinen variiert die Menge des verabreichten Regulationsmittels in Abhängigkeit vom Verabreichungsverfahren und der Art des Tumors innerhalb der oben genannten Spektren, vorzugsweise zwischen ca. 1μg/mL und ca. 2mg/mL und noch bevorzugter zwischen ca. 10μg/mL und 1mg/mL. Der Transfer des Arzneimittels zum Zieltumor kann durch geeignete Mittel, die dem Fachmann naheliegend sind, beurteilt werden. Arzneimittel können auch markiert werden (z.B. unter Verwendung von Radionukliden), um eine direkte Verfolgung des Transfers zum Zieltumor unter Verwendung von Standardbildgebungsverfahren zu ermöglichen.
In einem verwandten Aspekt liefert die vorliegende Offenbarung Verfahren zur Behandlung von Krebs und/oder zur Hemmung von Metastasen bei einem Säuger. Krebstumore sind unkontrolliert wachsende feste Zellmassen, die ihre Nahrungszufuhr über Blutgefäße benötigen. Die Bildung neuer Kapillaren sind eine Grundvoraussetzung für das Tumorwachstum und das Entstehen von Metastasen. Die Verabreichung von hier beschriebenen Regulationsmitteln kann das Wachstum solcher Blutgefäße stören, wodurch eine effektive Therapie für den Krebs und/oder die Hemmung der Metastasen geliefert wird.
Regulationsmittel können auch eingesetzt werden, um Leukämie zu behandeln. Ein bevorzugtes Regulationsmittel für den Einsatz in derartigen Verfahren sind H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3) sowie Regulationsmittel, die derartige Sequenzen oder Derivate davon aufweisen. Bevorzugte Antikörper-Regulationsmittel umfassen Fab-Fragmente, die gegen H-QYLYHYCVVD-OH (SEQ.-ID-Nr. 2) oder H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3) gerichtet sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein Regulationsmittel in der Lage, durch multiple Adhäsionsmoleküle vermittelte Zelladhäsion zu stören. Zum Beispiel kann ein einfach verzweigtes Regulationsmittel (oder multiple Wirkstoffe, die mit einem Einzelmolekül oder einem Trägermaterial verbunden sind) Occludin-, klassische Cadherin-, Integrin-, Dse- und Dsg- vermittelte Zelladhäsion stören und somit tight junctions, adherens junctions, fokale Kontakte und Desmosomen stören. Multifunktionale Regulationsmittel, die eine Occludin-CAR-Sequenz aufweisen, welche mit einem oder mehreren von Claudin-CAR-Sequenz, VE-Cadherin-CAR-Sequenz, Dsc-CAR-Sequenz, Dsg-CAR-Sequenz, RGD-Sequenz, OB-Cadherin-CAR-Sequenz und/oder HAV-Sequenz verbunden sind, können zur Störung von Zelladhäsion eingesetzt werden. Alternativ kann ein separater Regulator der nicht-Occludin-vermittelten Zelladhäsion zusammen mit dem/den Regulationsmittel(en) entweder in der gleichen pharmazeutischen Verbindung oder separat davon verabreicht werden. Bevorzugte Antikörper-Regulationsmittel, die zusammen mit den Occludin-Regulationsmitteln eingesetzt werden können, umfassen Fab-Fragmente, die entweder gegen eine N-Cadherin-CAR-Sequenz, wie FHLRAHAVDINGNQV-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 4) oder eine E-Cadherin-CAR-Sequenz, wie LFSHAVSSNG-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 39) gerichtet sein können. Ein Regulationsmittel kann allein (z.B. über die Haut) oder in einer pharmazeutischen Verbindung verabreicht werden. Für Melanome und bestimmte andere zugängliche Tumore kann die oben beschriebene Injektion oder die topische Verabreichung bevorzugt werden. Für ovariale Krebse kann das Spülen der Peritonealhöhle mit einer Verbindung, die einen oder mehrere Regulationsmittel aufweist, Metastasen von Ovarealtumorzellen verhindern. Andere Tumore (z.B. Harnblasentumore, bronchiale Tumore oder tracheale Tumore) können durch Injektion des Regulationsmittels in das Cavum behandelt werden. In anderen Fällen kann die Verbindung systemisch verabreicht werden und unter Anwendung einer Vielfalt von oben beschriebenen spezifischen Zielwirkstoffen auf den Tumor gerichtet sein. Im Allgemeinen variiert die verabreichte Menge an Regulationsmitteln in Abhängigkeit von Verabreichungsverfahren und Krebstyp, variiert jedoch innerhalb der oben beschriebenen Spektren. Die Wirksamkeit der Krebsbehandlung oder der Hemmung von Metastasen kann unter Verwendung gut bekannter klinischer Beobachtungsverfahren, wie die Beobachtung der Werte von Serumtumormarkern (z.B. CEA oder PSA), beurteilt werden.
In einer weiteren verwandten Hinsicht kann ein Regulationsmittel verwendet werden, um Angiogenese (d.h. das Wachstum von Blutgefäßen von vorhandenen Blutgefäßen) in einem Säuger zu hemmen. Die Hemmung von Angiogenese kann zum Beispiel bei Patienten mit Krankheiten wie Krebs oder Arthritis von Vorteil sein. Ein bevorzugtes Regulationsmittel für den Einsatz in solchen Verfahren ist H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3) und Regulationsmittel, die derartige Sequenzen oder Derivate davon aufweisen. Ein bevorzugtes Antikörper-Regulationsmittel umfasst Fab-Fragmente, die gegen H-QYLYHYCVVD-OH (SEQ.-ID-Nr. 2) oder H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3) gerichtet sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein Regulationsmittel dazu in der Lage, die durch multiple Adhäsionsmoleküle vermittelte Zelladhäsion zu stören. Zum Beispiel kann ein einfach verzweigtes Regulationsmittel (oder multiple Wirkstoffe, die mit einem Einzelmolekül oder einem Trägermaterial verbunden sind) Occludin-, klassische Cadherin- und Integrin- vermittelte Zelladhäsion stören und somit tight junctions, adherens junctions und fokale Kontakte stören. Multifunktionale Regulationsmittel, die eine Occludin-CAR-Sequenz aufweisen, welche an eine oder mehrere von Claudin-CAR-Sequenz, VE-Cadherin-CAR-Sequenz, dsc-CAR-Sequenz, dsg-CAR-Sequenz, RGD-Sequenz, und/oder HAV-Sequenz gebunden ist, können verwendet werden, um Zelladhäsion zu stören. Alternativ kann ein separater Regulator von nicht-Occludin-vermittelter Zelladhäsion zusammen mit dem/den Regulationsmittel(en) entweder in der gleichen pharmazeutischen Verbindung oder separat davon verabreicht werden. Ein bevorzugtes Antikörper-Regulationsmittel, das zusammen mit Occludin-Regulationsmitteln eingesetzt werden kann, umfasst Fab-Fragmente, die gegen eine N-Cadherin-CAR-Sequenz, wie FHLRAHAVDINGNQV-NH₂, (SEQ.-ID-Nr. 4) gerichtet ist.
Die Wirkung eines besonderen Regulationsmittels auf Angiogenese kann im Allgemeinen durch Wirkungsbeurteilung des Wirkstoffs auf die Blutgefäßbildung ermittelt werden. Eine derartige Ermittlung kann im Allgemeinen z.B. unter Verwendung des Hühner-Chorioallantois-Membran-Assays (Iruela-Arispe et al. Molecular Biology of Cell 6:327-343, 1995) durchgeführt werden. Zusammengefasst kann ein Regulationsmittel in eine aus Vitrogen bestehende Matrix bei einer oder mehreren Konzentrationen (z.B. zwischen ca. 5 und 50μg/Matrix) überschichtet werden. Die Matrix/Matrizen kann/können dann auf die Hühner-Chorioallantois-Membranen aufgetragen werden. Nach 24 Stunden kann die Wirkung des Regulationsmittels unter Verwendung einer Computer-gestützten morphometrischen Analyse bestimmt werden.
Ein Regulationsmittel sollte Angiogenese bei einer Konzentration von 50μg/Matrix zu mindestens 25% hemmen.
Der Zusatz eines wie oben beschriebenen Zielwirkstoffs kann insbesondere dann von Nutzen sein, wenn die Verabreichung systemisch ist. Geeignete Verabreichungs- und Dosierungsmodi hängen von der zu behandelnden oder vorzubeugenden Krankheit ab, allerdings eignet sich im Allgemeinen die Verabreichung durch Injektion. Die Dosierungen können in der oben beschriebenen Weise variieren. Die Wirksamkeit der Hemmung kann grob durch die eine Unfähigkeitsanalyse der Tumore, ihr Wachstum aufrechtzuerhalten, sowie mikroskopisch durch das Beobachten der Abwesenheit von Nerven in der Peripherie des Tumors abgeschätzt werden.
In einem noch weiteren verwandten Aspekt liefert die vorliegende Offenbarung Verfahren zur Induktion von Apoptose in einer Occludin-exprimierenden Zelle. Im Allgemeinen können von Krebs betroffene Patienten aus einem solchen Heilverfahren einen Nutzen ziehen. Ein bevorzugtes Regulationsmittel für die Verwendung in solchen Verfahren ist H-CLYHYC (SEQ.-ID-Nr. 3) sowie ein Regulationsmittel, das Sequenzen oder Derivate davon aufweist. Bevorzugte Antikörper-Regulationsmittel umfassen Fab-Fragmente, die gegen H-QYLYHYCVVD-OH (SEQ.-ID-Nr. 2) oder H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3) gerichtet sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein Regulationsmittel in der Lage, durch multiple Adhäsionsmoleküle vermittelte Zelladhäsion zu stören. Beispielsweise kann ein einfach verzweigtes Regulationsmittel (oder multiple Wirkstoffe, die mit einem Einzelmolekül oder Trägermaterial verbunden sind) Occludin-, klassische Cadherin-, und Integrin- vermittelte Zelladhäsion stören und somit tight junctions, adherens junctions und fokale Kontakte stören. Multifunktionale Regulationsmittel, die die Occludin-CAR-Sequenz aufweisen, welche an eine oder mehrere von Claudin-CAR-Sequenz, nicht-klassische Cadherin-CAR-Sequenz (z.B. VE-Cadherin, OB-Cadherin, dsc oder dsg), RGD-Sequenz and/oder HAV-Sequenz gebunden ist, können zur Störung der Zelladhäsion eingesetzt werden. Alternativ kann ein separater Regulator der nicht-Occludin-vermittelten Zelladhäsion zusammen mit dem/den Regulationsmittel(n) entweder in der gleichen pharmazeutischen Verbindung oder separat davon verabreicht werden. Bevorzugte Antikörper-Regulationsmittel, die zusammen mit den Occludin-Regulationsmitteln verwendet werden können, umfassen Fab-Fragmente, die entweder gegen eine N-Cadherin-CAR-Sequenz, wie FHLRAHAVDINGNQV-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 4) oder eine E-Cadherin-CAR-Sequenz, wie LFSHAVSSNG-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 39) gerichtet sein kann.
Die Verabreichung von Regulationsmitteln zur Induktion von Apoptose kann topisch über Injektion oder mit anderen Mitteln durchgeführt werden und der Zusatz eines Zielwirkstoffs kann insbesondere dann von Nutzen sein, wenn die Verabreichung systemisch ist. Geeignete Verabreichungs- und Dosierungsmodi sind abhängig von Lage und Art der Zellen, für die die Induktion von Apoptose erwünscht ist, die Dosierungen variieren jedoch im Allgemeinen im oben beschriebenen Bereich. Eine Biopsie kann ausgeführt werden, um die Induktionsstufe der Apoptose zu bewerten.
Die vorliegende Offenbarung liefert Verfahren zur Verbesserung des Arzneimitteltransports in das Zentralnervensystem eines Säugers. Die Blut-Hirnschranke ist weitgehend undurchlässig für die meisten neuroaktiven Wirkstoffe und der Transport von Arzneimitteln ins Gehirn eines Säugers erfordert häufig invasive Eingriffe. Unter Verwendung eines hier beschriebenen Regulationsmittels ist der Transport jedoch beispielsweise möglich als systemische Verabreichung einer regulierenden Wirkstoff-Arzneimittel-Ziel-Wirkstoffkombination, Injektion eines Regulationsmittels (allein oder in Kombination mit einem Arzneimittel und/oder Zielwirkstoff) in die Halsschlagader oder unter Verwendung eines ein Regulationsmittel aufweisendes Hautpflasters an den Kopf des Patienten. Ein bevorzugtes Regulationsmittel zum Einsatz in solchen Verfahren ist H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3) sowie Regulationsmittel, die derartige Sequenzen oder Derivate davon aufweisen. Bevorzugte Antikörper-Regulationsmittel umfassen Fab-Fragmente, die entweder gegen H-QYLYHYCVVD-OH (SEQ.-ID-Nr. 2) oder H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3) gerichtet sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein Regulationsmittel in der Lage, durch multiple Adhäsionsmoleküle vermittelte Zelladhäsion zu stören. Zum Beispiel kann ein einfach verzweigtes Regulationsmittel (oder multiple Wirkstoffe, die an ein Einzelmolekül oder Trägermaterial gebunden sind) Occludin- und Cadherin- vermittelte Zelladhäsion und somit tight junctions und adherens junctions stören. Multifunktionale Regulationsmittel, die die Occludin-CAR-Sequenz aufweisen, welche an eine oder mehrere von Claudin-CAR-Sequenz, VE-Cadherin-CAR-Sequenz, OB-Cadherin-CAR-Sequenz und/oder HAV-Sequenz gebunden ist, kann zur Störung von Zelladhäsion eingesetzt werden. Alternativ kann ein separater Regulator der nicht-Occludin-vermittelten Zelladhäsion zusammen mit dem/den Regulationsmittel(en) entweder in der gleichen pharmazeutischen Verbindung oder separat davon verabreicht werden. Bevorzugte Antikörper-Regulationsmittel, die zusammen mit den Occludin-Regulationsmitteln verwendet werden können, umfassen Fab-Fragmente, die gegen die N-Cadherin-CAR-Sequenz FHLRAHAVDINGNQV-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 4) gerichtet sind.
Im Allgemeinen variiert die Menge der verabreichten Regulationsmittel in der oben beschriebenen Weise und in Abhängigkeit von der behandelten oder vorgebeugten Krankheit. Die Arzneimittelzuführung in das Zentralnervensystem kann durch geeignete, dem Fachmann naheliegende Mittel, wie Magnetresonanztomographie (MRI) oder PET-Scan (Positronen-Emissions-Tomographie) beurteilt werden.
In weiteren Aspekten können die hier beschriebenen Regulationsmittel zur Regulation des Immunsystems eines Säugers in verschiedener Weise verwendet werden. Regulationsmittel können im Allgemeinen eingesetzt werden, um spezifische Stufen bei Zell-Interaktionen während einer Immunantwort oder der Verbreitung von malignen Lymphozyten zu regulieren. Zum Beispiel kann ein hier beschriebenes Regulationsmittel bei der Behandlung von Krankheiten, die mit einer übermäßigen Entwicklung von sonst normalen T-Zellen verbunden sind, zum Einsatz kommen. Ohne die Absicht zu haben, durch eine besondere Theorie gebunden zu werden, wird davon ausgegangen, dass die Interaktion von Occludin mit reifenden T-Zellen und B-Zellen-Teilmengen zum Schutz dieser Zellen vor programmiertem Zelltod beiträgt. Ein Regulationsmittel kann solche Interaktionen, die zur Induktion von programmiertem Zelltod führen, verringern. Dementsprechend können Regulationsmittel verwendet werden, um bestimmte Arten von Diabetes und Rheumtoidarthritis besonders bei jungen Kindern, bei denen die Cadherin-Expression auf thymischen Pre-T-Zellen am stärksten ist, zu behandeln.
Regulationsmittel können auch Patienten verabreicht werden, die an bestimmten Hautkrankheiten leiden (wie Haut-Lymphome), akute B-Zell-Leukämie und übermäßige Immunreaktionen, die auch das humorale Immun-System und die Generation von Immunglobulin-Bildung betreffen, wie allergieempfindliche Reaktionen und Antikörper-vermittelte Transplantatabstoßung. Außerdem können Patienten mit zirkulierenden Cadherin-positiven malignen Zellen (z.B. bei Einnahmeverordnungen, in denen Chemotherapie oder Strahlungstherapie einen Großteil der malignen Zellen im Knochenmark und anderen lymphartigen Geweben eliminiert) von der Behandlung mit einem Regulationsmitteln profitieren. Eine solche Behandlung kann auch für Patienten, die von einer Transplantation von peripheren Blutstammzellen betroffen sind, nützlich sein.
Bestimmte bevorzugte Regulationsmittel für die Verwendung in solchen Verfahren umfassen jene, die einen oder mehrere zusätzliche CAR-Sequenzen, wie eine Claudin-CAR-Sequenz, HAV, RGD, eine VE-Cadherin-CAR-Sequenz und/oder KYSFNYDGSE (SEQ.-ID- Nr. 63) aufweisen.
Wie oben erwähnt kann/können solche zusätzliche(n) Sequenz(en) über einen Linker von einer Occludin-CAR-Sequenz separiert werden. Alternativ kann ein separater Regulator der Cadherin-, Claudin-, Integrin- und/oder N-CAM-vermittelten Zelladhäsion zusammen mit dem/den Regulationsmittel(n) entweder in der gleichen pharmazeutischen Verbindung oder separat davon verabreicht werden.
In den oben erwähnten Verfahren wird/werden das/die Regulationsmittel vorzugsweise systemisch verabreicht (üblicherweise durch Injektion) oder topisch. Ein Regulationsmittel kann mit einem Zielwirkstoff verbunden sein. Zum Beispiel kann das Abzielen auf das Knochenmark nützlich sein. Eine geeignete Dosierung ist dann ausreichend, wenn eine statistisch signifikante Herabsetzung der Population von Cadherin-exprimierenden B- und/oder T-Zellen und/oder eine Verbesserung in der klinischen Manifestation der behandelten Krankheit bewirkt werden. Typische Dosierungen befinden sich im Allgemeinen im oben beschriebenen Bereich.
In bestimmten anderen Aspekten liefert die vorliegende Erfindung Verfahren zur Adhäsionsverbesserung von Occludin-exprimierenden Zellen. In bestimmten Ausführungsformen kann ein Regulationsmittel an einen festen Träger gebunden sein, was zu einer Matrix führt, die multiple Regulationsmittel aufweist. In einer derartigen Ausführungsform ist der Träger eine polymere Matrix, an die Regulationsmittel und Moleküle, die (eine) andere CAR-Sequenz(en) aufweist/aufweisen, gebunden werden (z.B. können Regulationsmittel und Moleküle, die HAV und RGD-Sequenzen aufweisen, vorzugsweise in einer alternierenden Weise, an die gleiche Matrix gebunden werden). Derartige Matrizen können in Zusammenhängen verwendet werden, in denen es erwünscht ist, die von multiplen Zelladhäsionsmolekülen vermittelte Adhäsion zu erhöhen. Alternativ kann das Regulationsmittel selbst multiple Occludin-CAR-Sequenzen oder Antikörper (oder Fragmente davon) aufweisen, die von Linker in der oben beschriebenen Weise separiert werden. Auf die eine oder andere Weise besteht die Funktion des/der Regulationsmittel(s) in einem „biologischen Leim" für die Bindung von multiplen Occludin-exprimierender Zellen in einer Vielfalt von Zusammenhängen.
In einem derartigen Aspekt können Regulationsmittel, die multiple Occludin-CAR-Sequenzen und/oder multiple Regulationsmittel aufweisen, welche mit einem Einzelmolekül oder Trägermaterial verbunden sind, verwendet werden, um Wundheilung zu verbessern und/oder Narbengewebe bei einem Säuger zu reduzieren. Peptide, die zur Generierung eines geeigneten Regulationsmittels mit einem Träger und/oder miteinander über einen Linker verbunden sein können, umfassen, sind aber sind nicht beschränkt auf H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3) und Regulationsmittel, die derartige Sequenzen und Derivate von diesen aufweisen. Bevorzugte Antikörper-Regulationsmittel umfassen Fab-Fragmente, die entweder gegen HQYLYHYCVVD-OH (SEQ.-ID- Nr. 2) oder gegen H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3) gerichtet sind. Regulationsmittel, die an eine biokompatible und biologisch abbaubare Matrix, wie Cellulose oder Collagen, gebunden sind, werden besonders bevorzugt. Für die Verwendung in solchen Verfahren sollte ein Regulationsmittel eine freie Amino-Hydroxyl-Gruppe aufweisen. Die Regulationsmittel werden der Wunde im Allgemeinen topisch verabreicht, wo sie die Schließung der Wunde erleichtern können und Nahtstiche verbessern oder sogar wieder ersetzen können. In ähnlicher Weise kann die Verabreichung von Matrix-gebundenen Regulationsmitteln die Zelladhäsion bei Hauttransplantation und prosthetischen Implantaten erleichtern und die Dauer und den Nutzen der Collagen-Injektion steigern. im Allgemeinen variiert die Menge der Matrix-gebundenen verabreichten Regulationsmittel für eine Wunde, Transplantat oder Implantat in Abhängigkeit von der Schwere und/oder der Art der Wunde, Transplantat oder Implantat, kann jedoch im oben diskutierten Bereich variieren. Multifunktionale Regulationsmittel, die eine Occludin-CAR-Sequenz aufweisen, welche an ein oder mehrere von Claudin-CAR-Sequenz, nichtklassische Cadherin-CAR-Sequenz (z.B. VE-Cadherin, OB-Cadherin, dsc oder dsg), RGD-Sequenz und/oder HAV-Sequenz gebunden sind, können als potente Stimulatoren für Wundheilung und/oder die Reduzierung von Gewebenarben verwendet werden. Alternativ können ein oder mehrere separate Regulatoren der Cadherin-, Claudin-, Integrin-, Dsc- und/oder Dsg- vermittelten Zelladhäsion zusammen mit dem/den Regulationsmittel(en) entweder in der gleichen pharmazeutischen Verbindung oder separat davon verabreicht werden.
In einem weiteren Aspekt können eine oder mehrere Regulationsmittel mit der inneren Oberfläche einer Gewebekulturplatte oder einem anderen Zellkulturträger, wie für die Verwendung in einem Bioreaktor, verbunden sein. Eine derartige Verbindung kann mit irgendeinem in der oben beschriebenen Weise geeigneten Verfahren durchgeführt werden. Regulationsmittel, die in dieser Weise gebunden sind, können im Allgemeinen verwendet werden, um Occludin-exprimierende Zellen zu immobilisieren. Zum Beispiel können mit einem oder mehreren Regulationsmittel(n) beschichtete Schalen oder Platten in einer Vielzahl von Versuchen und Screens dazu verwendet werden, Occludin-exprimierende Zellen zu immobilisieren.
In Bioreaktoren (d.h. Systeme für die Herstellung von Zellen oder Organellen in großem Umfang) können Regulationsmittel im Allgemeinen genutzt werden, um den Zellkontakt zu verbessern und das Zeltwachstum zu stabilisieren. Regulationsmittel können auch in Bioreaktoren verwendet werden, um die Bildung und Funktion von hoch differenzierten Organellen, die beispielsweise aus verstreuten Populationen von fötalen Säugerzellen abgeleitet sind, zu verbessern. Bioreaktoren, die Biomatrizen von (einem) Regulationsmittel(n) enthalten, können ebenfalls verwendet werden, um die Herstellung von spezifischen Proteinen zu erleichtern.
Hier beschriebene Regulationsmittel können im Zusammenhang mit einer Vielfalt von Bioreaktor-Strukturen verwendet werden. Im Allgemeinen ist ein Bioreaktor mit einer Innenoberfläche ausgestaltet, die ausreicht, um große Mengen adhärenter Zellen zu tragen. Diese Oberfläche kann unter Verwendung von Membranen, Röhren, Mikrotiterwells, Säulen, Hohlfasern, Rollflaschen, Platten, Schalen, Kügelchen (beads), oder einer Kombination aus diesen geschaffen werden. Ein Bioreaktor kann kompartimentiert sein. Das Trägermaterial innerhalb eines Bioreaktors kann irgendein in Fachkreisen bekanntes geeignetes Material sein; vorzugsweise löst sich oder schwillt das Trägermaterial nicht in Wasser. Bevorzugte Trägermaterialien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf synthetische Polymere wie Acryle, Vinyle, Polyäthylen, Polypropylen, Polytetrafluorethylen, Nylons, Polyurethane, Polyamide, Polysulfone und Poly-(Ethylen-Terephthalat); Keramik; Glas und Kieselerde.
In bestimmten Aspekten können Regulationsmittel verwendet werden, um die Bildung von tight junctions in Epithelzellen zu stimulieren. Es wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass bestimmte Peptid-Regulationsmittel, die die Adhäsion von Endothelzellen hemmen, die Adhäsion von Epithelzellen stimulieren können. Derartige Wirkstoffe umfassen N-Ac-CLYHYC-NH₂, und andere derartige Wirkstoffe können ohne weiteres unter Verwendung der hier gelieferten Versuche nachgewiesen werden. Wirkstoffe, die die Adhäsion von Epithelzellen stimulieren, können in jedem Zusammenhang, in dem eine derartige selektive Stimulation erwünscht ist, verwendet werden. Zum Beispiel ist bekannt, dass Diarrhöe eine Folge von Toxinen ist, die tight junctions in intestinalen Epithelzellen stören (siehe z.B. Philpott et al. Infect. Immun. 66:1680-1687, 1998; Spitz et al., Am. J. Physiol. 268:G374-379, 1995; Fasano et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:5242-5246, 1991). Regulationsmittel, die die Bildung von tight junctions stimulieren, können Patienten in der hier beschriebenen Weise verabreicht werden, um Diarrhöe zu hemmen. Derartige Wirkstoffe können zum Beispiel oral verabreicht werden.
Andere Aspekte der vorliegenden Erfindung liefern Verfahren zum Einsatz von Antikörpern, die für diagnostische oder Versuchszwecke gegenüber Regulationsmitteln aufgeworfen werden. Versuche beinhalten typischerweise einen Antikörper zur Feststellung der An- oder Abwesenheit von Occludin (frei oder an der Zelloberfläche) oder eines proteolytischen Fragments, das die EC2-Domäne in einer geeigneten biologischen Probe, wie Tumor- oder normale Gewebebiopsien, Blut-, Lymphknoten-, Serum- oder Harnproben, Gewebe, Homogenat oder ein anderes aus diesem von einem Patienten erhaltenen Extrakt, enthält.
Es gibt eine Vielzahl von dem Fachmann bekannten Versuchsformaten für die Verwendung eines Antikörpers, um ein Zielmolekül in einer Probe festzustellen. Siehe z.B. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Zum Beispiel kann der Versuch in einem Western Blot-Format durchgeführt werden, wobei eine Proteinzubereitung von der biologischen Probe zur Gelelektrophorese gegeben, auf eine geeignete Membran transferiert und dieser eine Reaktion mit dem Antikörper erlaubt wird. Die Anwesenheit des Antikörpers auf der Membran kann dann unter Einsatz einer geeigneten, unten beschriebenen Nachweisreagenz festgestellt werden.
In einer weiteren Ausführungsform beinhaltet der Versuch den Einsatz von immobilisierten Antikörpern auf einem festen Träger, der das Ziel-Occludin oder ein proteolytisches Fragment davon, das die EC2-Domäne beinhaltet und die CAR-Sequenz umfasst, bindet, und dieses vom Rest der Probe entfernt. Das gebundene Occludin kann dann unter Verwendung eines zweiten Antikörpers oder Reagenz, der/das eine Reportergruppe enthält, festgestellt werden. Alternativ kann ein konkurrierender Versuch angewandt werden, in dem das Occludin mit einer Reportergruppe markiert wird und ihm die Möglichkeit gegeben wird, sich nach der Inkubation des Antikörpers mit der Probe an den unbeweglichen Antikörper zu binden. Der Umfang, in dem die Komponenten der Probe die Bindung des markierten Occludins an den Antikörper hemmen, gibt Hinweis auf die Reaktivität der Probe mit dem unbeweglichen Antikörper und in der Folge auf die in der Probe enthaltene Menge an Occludin.
Der feste Träger kann irgendein dem Fachmann bekanntes Material, an das der Antikörper gebunden werden kann, sein, wie ein Well in einer Mikrotierplatte, ein Nitrozellulosefilter oder eine andere geeignete Membran. Alternativ kann der Träger ein Kügelchen oder Scheibe sein, wie aus Glas, Glasfaser, Latex oder Plastik wie Polystyrol oder Polyvinylchlorid. Der Antikörper kann auf dem festen Träger unter Einsatz einer Vielfalt von dem Fachmann bekannten Verfahren, die in der Patent- und Wissenschaftsliteratur umfangreich beschrieben sind, immobilisiert werden.
In bestimmten Ausführungsformen besteht der Versuch für die Feststellung von Occludin in einer Probe in einem doppelten Antikörper-Sandwich-Versuch. Dieser Versuch kann ausgeführt werden, indem zuerst der auf einem festen Träger, der üblicherweise das Well einer Mikrotierplatte ist, immobilisierte Antikörper mit der biologischen Probe in Kontakt gebracht wird, so dass es dem Occludin in der Probe ermöglicht wird, sich an den immobilisierten Antikörper zu binden (eine 30-minütige Inkubationszeit bei Raumtemperatur ist im Allgemeinen ausreichend). Die ungebundene Probe wird dann von dem immobilisierten Occludin-Antikörper-Komplex entfernt und ein zweiter Antikörper (der eine Reportergruppe wie ein Enzym, Farbstoff, Radionuklid, lumineszierende Gruppe, fluoreszierende Gruppe oder Biotin aufweist), der in der Lage zur Bindung an einer anderen Stelle auf dem Occludin ist, wird hinzugefügt. Die Menge des zweiten Antikörpers, der am fes ten Träger gebunden bleibt, wird dann unter Einsatz eines für die bestimmte Reportergruppe geeigneten Verfahrens bestimmt. Das angewandte Verfahren für die Ermittlung der Reportergruppe hängt von der Art der Reportergruppe ab. Für radioaktive Gruppen sind im Allgemeinen Szintillationszähler oder Autoradiographie geeignet. Spektroskopische Verfahren können eingesetzt werden, um Farbstoffe, lumineszierende Gruppen und fluoreszierende Gruppen zu ermitteln. Biotin kann unter Einsatz von Avidin, das an eine andere Reportergruppe (gewöhnlich eine radioaktive oder fluoreszierende Gruppe oder ein Enzym) gebunden ist, ermittelt werden. Enzym-Reportergruppen können im Allgemeinen durch Zusatz von Substrat (im Allgemeinen für einen bestimmten Zeitraum), gefolgt von einer spektroskopischen oder anderen Analyse der Reaktionsprodukte, nachgewiesen werden. Es können Standards und Standardzusätze unter Verwendung gut bekannter Verfahren eingesetzt werden, um das Niveau an Occludin in einer Probe zu bestimmen.
Die vorliegende Erfindung liefert auch Ausstattungen für die Verwendung in derartigen Immunoassays. Weiterhin beinhalten im Allgemeinen ein oder mehrere zusätzliche Kompartimente oder Behälter einer Ausstattung Elemente, wie Reagenzien, Puffer und/oder Waschlösungen, die im Immunoassay verwendet werden.
In weiteren Aspekten können Regulationsmittel oder Antikörper (oder Fragmente davon) verwendet werden, um die Zell-Identifizierung und -Sortierung in vitro oder die Bildgebung in vivo zu erleichtern, was die Selektion von Zell-exprimierendem Occludin (oder anderen Occludin-Niveaus) erlaubt.
Vorzugsweise ist/sind der/die Regulationsmittel für die Verwendung in derartigen Verfahren an einen nachweisbaren Marker gebunden. Geeignete Marker sind in Fachkreisen gut bekannt und umfassen Radionuklide, Lumineszenten, Fluoreszenzen, Enzyme, Farbstoffe, konstante Immunoglobulin-Domänen und Biotin. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Regulationsmittel an einen Fluoreszenzmarker, wie Fluoreszin, mit Zellen in Kontakt gebracht, die dann durch Durchflusszytometrie (FACS) analysiert werden.
Antikörper oder Fragmente davon können auch in Screens von kombinatorischen oder anderen nicht-Peptid-basierten Bibliotheken eingesetzt werden, um andere Verbindungen, die in der Lage zur Regulation Occludin-vermittelter Zelladhäsion sind, zu identifizieren. Derartige Screens können im Allgemeinen unter Verwendung von ELISA oder eines anderen dem Fachmann bekannten Verfahrens zur Feststellung von Verbindungen mit ähnlicher Form und Struktur wie das Regulationsmittel, durchgeführt werden. Im Allgemeinen können in derartigen Screens die Kontaktierung einer Expressions-Bibliothek, welche Testverbindungen mit einem Antikörper herstellt, sowie die Ermittlung des Niveaus an Antikörpern, die an die in Frage kommenden Verbindungen gebun den sind, beinhaltet sein. Verbindungen, zu denen der Antikörper eine stärkere Affinität hat, können in der hier beschriebenen Weise weiter charakterisiert werden, um die Fähigkeit zur Regulation von Occludin-vermittelter-Zelleadhäsion zu bewerten.
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung und nicht dem Zweck einer Abgrenzung.
BEISPIEL 1
Herstellung von repräsentativen zyklischen Peptiden
Dieses Beispiel veranschaulicht die Fest-Phasensynthese von repräsentativen linearen und zyklischen Peptiden als Regulationsmittel.
Die Peptide wurden an ein Methylbenzhydrylamin-Harz (MBHA-Harz) für die C-terminalen Amid-Peptide gefügt. Die traditionellen Merrifield-Harze wurden für alle C-terminalen sauren Peptide verwendet. Die Bags eines Polypropylen-Matrix-Materials wurden mit dem Harz gefüllt und in Dichlormethan getränkt. Die Harz-Pakete wurden drei Mal mit 5%-igem Diisopropylethylamin in Dichlormethan und dann mit Dichlormethan gewaschen. Die Pakete wurden dann sortiert und in eine Nalgene-Flasche platziert, die eine Lösung der interessanten Aminosäure in Dichlormethan enthält. Es wurde eine gleiche Menge an Diisopropylcarbodiimid (DIC) in Dichlormethan hinzugefügt, um die Kupplungsreaktion zu aktivieren. Die Flasche wurde eine Stunde lang geschüttelt, um die Beendigung der Reaktion sicherzustellen. Die Reaktionsmischung wurde abgeschieden und die Pakete mit DMF gewaschen. Das N-α-Boc wurde durch Acidolyse unter einer 30 Minuten lang andauernden Anwendung einer 55%-igen TFA in Dichlormethan entfernt, wobei das TFA-Salz der Aminogruppe zurückblieb. Die Bags wurden gewaschen und die Synthese durch das Wiederholen des gleichen Verfahrens fertiggestellt, wobei die entsprechenden Aminosäuren in der Kupplungsphase substituiert wurden. Die Acetylierung des N-Terminals wurde durch Reaktion der Peptid-Harze mit einer Lösung aus essigsaurem Anhydrid in Dichlormethan in Anwesenheit von Diisopropylethylamin durchgeführt. Das Peptid wurde dann Seitenketten-entschützt und spaltete sich bei 0°C in Anwesenheit von Anisol als Karbokation-Fängersubstanz mit flüssigem HF vom Harz ab.
Die rohen Peptide wurden durch Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie gereinigt. Gereinigte lineare Vorläufersubstanzen (precursors) der zyklischen Peptide wurden in 75%-er Essigsäure bei einer Konzentration von 2-10mg/mL aufgelöst. Es wurde tropfenweise eine 10%-ige Lösung aus Jod in Methanol hinzugegeben, bis eine stabile Färbung erreicht wurde. Dann wurde der Mischung eine 5%-ige Askorbinsäurelösung in Wasser bis zur Entfärbung beigefügt. Die Disulfidbrücken-enthaltenden Verbindungen wurden dann mit HPLC gereinigt und durch analytische HPLC und Massenspektroskopische Analyse charakterisiert.
BEISPIEL 2
Entwicklung eines Modellsystems zur Beurteilung von Endothelzelladhäsion
Dieses Beispiel veranschaulicht einen Versuch zur Endothelzelladhäsion für die Wirkungsbewertung von Occludin-Regulationsmitteln auf Endothelzelladhäsion.
A. Zellkultur
Menschliche Endothelzellen (HAEC) der Aorta wurden auf Fibronektin (Sigma, St. Louis, MO) gemäß der Vorgehensweisen von Jaffe et al., J. Clin. Invest. 52:2745-2756, 1973, kultiviert. Die Zellen wurden in einem EGM (Endothelzellwachstumsmedium; Clonetics, San Diego, CA) gehalten und für Experimente in Passus 4 verwendet.
B. Verfahren zur Immunlokalisierung von Occludin und VE-Cadherin
HAEC wurden auf den Fibronektin-beschichteten Deckgläschen kultiviert. Konfluente Kulturen von HAEC wurden 1 Stunde lang linearen Peptiden (letzte Konzentration 100μg/ml EGM) oder ausschließlich EGM ausgesetzt. Die Zellen wurden dann 30 Minuten lang bei 4°C in 95%-igem Ethanol fixiert, gefolgt von einer Fixierung in Aceton für 1 Minute bei 4°C (Furuse et al., J. Cell Biol. 123:1777-1788, 1993). Nach der Fixierung konnten die Zellen bei Zimmertemperatur lufttrocknen. Die Zellen wurden entweder mit Maus-anti-VE-Cadherin-Antikörpern (Hemeris, Sassenage, France; verdünnt 1:250 in 0,1% in Magermilchpulver gelöstem PBS) oder Kaninchen-anti-Occludin-Antikörpern (Zymed, South San Francisco, CA; verdünnt in 1:300 in 0,1% in Magermilchpulver gelöstem in PBS) 1 Stunde lang bei 37°C getestet. Die Zellen wurden dann mit 0,1% in PBS gelöstem Magermilchpulver gewaschen (drei Waschgänge, 5 Minuten/Wäsche) und dann mit sekundären Antikörpern (Esel-anti-Maus-Cy3 oder Esel-anti-Kaninchen-Cy5 verdünnt 1:250 in 0,1% in PBS gelöstes Magermilchpulver; Jackson Immunoresearch Laborstories Inc., Westgrove, PA) 1 Stunde lang bei 37°C getestet. Die Zellen wurden nochmals in 0,1% in PBS gelöstem Magermilchpulver gewaschen und in eine aus 50% Glycerol und 50% PBS bestehende Lösung gegeben, der Phenylenediamin (Sigma, St. Louis, MO) bei einer letzten Konzentration von 1mg/ml beigefügt worden war. Die Probe wurde unter Anwendung eines Bio-Rad MRC 1000 konfokalen Mikroskops mit Laser Sharp Software Version 2.1T (Bio-Rad, Herkules, CA) analysiert. Der Färbung für Occludin wurde die Pseudofarbe rot zugewiesen, wohingegen VP-Cadherin die Pseudofärbung grün unter Anwendung des Confocal Assistent 4.02 Software zugewiesen wurde. Die Immunofluoreszenz-Bilder von Monolayerkulturen menschlicher Endothelzellen der Aorta, welche für Occludin (rote Farbe) und VE-Cadherin (grüne Farbe) immunmarkiert sind, sind in 4A und 4B dargestellt. Die Kolokalisation von Occludin und VE-Cadherin wird durch gelbe Farbe angezeigt. Pfeile zeigen Zwischenräume zwischen den Zellen an. Es wird darauf hingewiesen, dass Endothelzellen sich voneinander zurückziehen, wenn sie in Anwesenheit von H-QYLYHYCVVD-OH (SEQ.-ID-Nr. 2; 4B) kultiviert werden, was zeigt, dass die Adhäsion zwischen den Zellen herabgesetzt ist. Weiterhin bilden die Zellen keine pflastersteinartigen Monolager, wenn sie diesem Peptid ausgesetzt werden. Es wird ebenfalls darauf hingewiesen, dass die Oberflächenexpression von sowohl VE-Cadherin als auch von Occludin in mit H-QYLYHYCVVD-OH (SEQ.-ID-Nr. 2) behandelten Zellen im Vergleich zum VE-Cadherin und Occludin-Expressionsniveau von unbehandelten Zellen stark reduziert ist.
BEISPIEL 3
Auswirkung repräsentativer Regulationsmittel auf die Gefäßpermeabilität
Dieses Beispiel veranschaulicht einen Gefäßpermeabilitäts-Versuch zur Bewertung der Wirkungen von Occludin-Regulationsmitteln auf Endothelzell-Permeabilität in vivo.
A. Miles-Versuch zur Gefäßpermeabilität
Die Fähigkeit zyklischer und linearer Peptide, Gefäßpermeabilität zu erhöhen, wurde unter Ausnutzung des Miles-Versuchs bewertet (McClure et al., J. Pharmacological & Toxikological Meth. 32:49-521994). Die Peptide wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei einer Konzentration von 100μg/ml gelöst. Adulten Ratten wurden 100μg subdermale Injektionen einer jeden Peptidlösung in ihre rasierten Rücken gegeben, 15 Minuten später gefolgt von einer einfachen 250μl-Injektion mit 1%-igem Evans-Blau gelöst in PBS in ihre Schwanzvenen. Die Stellen der subdermalen Injektion wurden visuell auf das Erscheinen von blauem Farbstoff hin untersucht. Sobald der Farbstoff erschien (15 Minuten nach der Injektion), wurde jede subdermale Injektionsstelle herausgeschnitten, gewogen, und 24 Stunden in 1ml Dimethylformamid platziert, um den Farbstoff zu extrahieren. Die optische Dichte des Farbextrakts wurde auf 620nm bestimmt.
Die Wirkungen der Injektion von entweder phosphatgepufferter Salzlösung. phosphatgepufferter Salzlösung enthaltend Acetyl-QYLYHYCVVD-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 2) H-QYLYHYCVVD-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 2) oder HQYLYHYCVVD-OH (SEQ.-ID-Nr. 2) an den Stellen entlang des ra sierten Rücken einer Ratte auf die Anhäufung von Evans-Blau an den Injektionsstellen ist in 5 gezeigt. Es ist zu beachten, dass mehr Farbstoff an den Stellen extrahiert wurde, die mit H-QYLYHYCVVD-OH (SEQ.-ID-Nr. 2) injiziert wurden, als an Stellen, die entweder mit phosphatgepufferter Salzlösung oder Azetyl-QYLYHYCVVD-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 2) oder H-QYLYHYCVVD-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 2) injiziert wurden.
6 zeigt ein Histogram, das die optischen Dichten von Dimethylformamid-Extrakten veranschaulicht, die aus den in 5 dargestellten ausgeschnittenen Injektionsstellen hergestellt wurden. Es ist zu beachten, dass mehr Farbstoff aus den Stellen extrahiert wurde, die mit H-QYLYHYCVVD-OH (SEQ.-ID-Nr. 2) injiziert wurden, also aus Stellen, die mit entweder phosphatgepufferter Salzlösung, Azetyl-QYLYHYCVVD-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 2) oder H-QYLYHYCVVD-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 2) injiziert wurden.
Die Wirkungen der Injektion mit entweder phosphatgepufferter Salzlösung, phosphatgepufferter Salzlösung, die das Azetyl-CLYHYC-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 3) oder H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr.3) enthält, in Stellen entlang des rasierten Rücken einer Ratte auf die Anhäufung von Evans-Blau an den Injektionsstellen ist in 7 gezeigt. 8 zeigt ein Histogramm, das die optischen Dichten von Dimethylformamid-Extrakten darstellt, die aus den ausgeschnittenen Stellen des rasierten Rückens einer Ratte hergestellt wurden, welche Injektionen mit entweder phosphatgepufferter Salzlösung oder phosphatgepufferte Salzlösung, enthaltend das Azetyl-CLYHYC-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 3) oder H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3), bei einer Konzentration von 100μg/ml, 15 Minuten später gefolgt von einer einzelnen Injektion von Evans-Blau in die Schwanzvene, erhalten hatten. Es ist zu beachten, dass mehr Farbstoff aus den mit H-CLYHYC-OH (SEQ.-ID-Nr. 3) injizierten Stellen extrahiert wurde, als von Stellen, die entweder mit phosphatgepufferter Salzlösung oder Azetyl-CLYHYC-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 3) injiziert wurden.
BEISPIEL 4
Die Wirkung von repräsentativen Regulationsmitteln auf den elektrischen Widerstand am Zell-Monolayer
Dieses Beispiel veranschaulicht einen Versuch zum elektrischen Widerstand für die der Wirkungensbewertung von Occludin-Regulationsmitteln auf Epithelzelladhäsion.
Madin-Darby-Kaninchen-Nieren (MDCK)-Zellen wurden in Millicell-Behälter (Millipore, Redford. MA) bei einer Dichte von 300.000 Zellen pro Millicell-Behälter und in Dulbecco's Modified Eagle-Medium (DMEM: Sigma, St. Louis, MO) enthaltend 5% fötales Kalb-Serum (Sigma, St. Louis. MO) plattiert. Die Monolager wurden dem Regulationsmittel, das in einem Medium bei einer letzten Konzentration von 0,5 mg/ml für einen Zeitraum von 24 Stunden gelöst wurde, ausgesetzt. Der elektrische Widerstand wurde unter Verwendung eines EVOM (epitheliales Voltohmmeter, World Precision Instruments, Sarasota, FL) gemessen. Zur Zeit der Messung kann den Millicell-Einsätzen ein frisches Medium mit oder ohne das Regulationsmittel zugefügt werden.
9 zeigt ein Histogramm, das den mittleren elektrischen Widerstand an MDCK-Zellmonolayern, die 24 Stunden lang im Medium allein (Kontrolle) oder in einem Medium, enthaltend H-QYLYHYCVVD-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 2; Peptid 2), H-QYLYHYCVVD-COOH (SEQ.-ID-Nr. 2, Peptid 3) oder N-Ac-CLY14YC-NH₂ (SEQ.-ID-Nr. 3; Peptid 4), bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml kultiviert wurden, darstellt. Doppelte Messungen wurden durchgeführt und Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung. Es wurde herausgefunden, dass das Peptid 2 den elektrischen Widerstand reduzierte, während die Peptide 3 und 4 den elektrischen Widerstand am Monolager im Verhältnis zur Kontroll-Position erhöhten. Diese Ergebnisse beweisen die Fähigkeit von Occludin-Regulationsmitteln, die Bildung von tight junctions in Epithelzellen zu regulieren. Insbesondere bestimmte Wirkstoffe (wie die Peptide 3 und 4, oben) stimulieren die Bildung von tight junctions in Epithelellen.
Sequenz Listing

Claims

Ein zyklisches Peptid mit der Sequenz LYHY (SEQ.-ID-Nr. 1), wobei das besagte zyklische Peptid die Occludin-vermittelte Zelladhäsion reguliert.
Ein zyklisches Peptid gemäß Anspruch 1 mit der Formel:
wobei X₁ und X₂ optional sind und, falls vorhanden, voneinander unabhängig aus der Gruppe bestehend aus Aminosäureresten und Kombinationen daraus ausgewählt werden, wobei die Reste durch Peptidbindungen verbunden sind und wobei X₁ und X₂ voneinander unabhängig in der Größeordnung von 0 bis 10 Resten vorliegen, so dass die Summe der in X₁ und X₂ enthaltenen Reste zwischen 1 und 12 beträgt; wobei Y₁ und Y₂ voneinander unabhängig aus der Gruppe bestehend aus Aminosäureresten ausgewählt werden und wobei eine kovalente Bindung zwischen den Resten Y₁ und Y₂ gebildet wird; und wobei Z₁ und Z₂ optional sind und, falls vorhanden, voneinander unabhängig aus der Gruppe bestehend aus Aminosäureresten und Kombinationen daraus ausgewählt werden, wobei die Reste durch Peptidbindungen verbunden sind
Ein zyklisches Peptid gemäß Anspruch 2, wobei Z₁ nicht vorhanden ist und Y₁ eine N-Acetylgruppe aufweist.
Ein zyklisches Peptid gemäß Anspruch 2, wobei Z₂ nicht vorhanden ist und Y₂ eine C-terminale Amidgruppe aufweist.
Ein zyklisches Peptid gemäß Anspruch 2, wobei Y₁ und Y₂ über eine Disulfidbindung kovalent verbunden sind.
Ein zyklisches Peptid gemäß Anspruch 5, wobei Y₁ und Y₂ jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Penicillamin, β,β-Tetramethylencystein, β,β-Penta methylencystein, β-Mercaptopropionsäure, β,β-Pentamethylen-β-Mercaptopropionsäure und 2-Mercaptoprolin ausgewählt werden.
Ein zyklisches Peptid gemäß Anspruch 5, wobei Y₁ und Y₂ Cysteinreste oder Derivate davon sind.
Ein zyklisches Peptid gemäß Anspruch 7, das ferner eine N-Acetylgruppe aufweist.
Ein zyklisches Peptid gemäß Anspruch 7, das ferner eine C-terminale Amidgruppe aufweist.
Ein zyklisches Peptid gemäß Anspruch 2, wobei Y₁ und Y₂ über eine Amidbindung kovalent verbunden sind.
Ein zyklisches Peptid gemäß Anspruch 10, wobei die besagte Amidbindung zwischen terminalen funktionalen Gruppen gebildet wird.
Ein zyklisches Peptid gemäß Anspruch 10, wobei die besagte Amidbindung zwischen Restseitenketten gebildet wird.
Ein zyklisches Peptid gemäß Anspruch 10, wobei die besagte Amidbindung zwischen einer terminalen funktionalen Gruppe und einer Restseitenkette gebildet wird.
Ein zyklisches Peptid gemäß Anspruch 10, wobei: (a) Y₁ aus der Gruppe bestehend aus Lysin, Ornithin und Derivaten davon ausgewählt wird und Y₁ aus der Gruppe bestehend aus Aspartat, Glutamat und Derivaten davon selektiert wird. (b) Y₂ aus der Gruppe bestehend aus Lysin, Ornithin und Derivaten davon ausgewählt wird und Y₁ aus der Gruppe bestehend aus Aspartat, Glutamat und Derivaten davon ausgewählt wird.
Ein zyklisches Peptid gemäß Anspruch 2, wobei Y₁ und Y₂ über eine Thioetherbindung kovalent verbunden sind.
Ein zyklisches Peptid gemäß Anspruch 2, wobei Y₁ und Y₂ jeweils Tryptophan oder ein Derivat davon sind, so dass die besagte kovalente Bindung ein δ₁δ_i-Ditryptophan oder ein Derivat davon erzeugt.
Ein zyklisches Peptid gemäß Anspruch 2, wobei das besagte zyklische Peptid eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus CLYHYC (SEQ.-ID-NR. 3), CYLYHYC (SEQ.-ID-NR. 40), COYLYHYC (SEQ.-ID-NR. 41), KOYLYHYD (SEQ.-ID-NR. 42), YLYHY (SEQ.-ID-NR. 43), OYLYHY (SEQ.-ID-NR. 44), KLYHYD (SEQ.-ID-NR. 45) und Derivaten der vorstehenden Sequenzen ausgewählt wird, die eine oder mehrere C-terminale, N-terminale und/oder Seitenkettenmodifikationen haben.
Ein Mittel zur Regulation der Zelladhäsion, das ein zyklisches Peptid gemäß einem der Ansprüche 1-17 aufweist.
Ein Mittel zur Regulation der Zelladhäsion, das einen Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon aufweist, das sich speziell an eine Occludin-CAR-Sequenz bindet, die die Sequenz LYHY (SEQ.-ID-NR. 1) aufweist und aus 4-16 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten innerhalb eines nativen Occludinmoleküls besteht.
Ein Mittel zur Regulation der Zelladhäsion gemäß Anspruch 18, wobei das besagte Regulationsmittel die Occludin-vermittelte Endothelzelladhäsion hemmt, zur Verwendung in einer Methode zur Erhöhung der Gefäßdurchlässigkeit bei einem Säuger, was die Verabreichung des besagten Mittels zur Regulation der Zelladhäsion an einen Säuger umfasst.
Ein Mittel zur Regulation der Zelladhäsion gemäß Anspruch 18, wobei das besagte Regulationsmittel die Occludin-vermittelte Zelladhäsion eines Säugers hemmt, zur Verwendung in einer Methode zur Reduzierung der unerwünschten Zelladhäsion bei einem Säuger, was die Verabreichung des besagten Mittels an einen Säuger umfasst.
Ein Mittel zur Regulation der Zelladhäsion gemäß Anspruch 18, wobei das besagte Regulationsmittel die Occludin-vermittelte Zelladhäsion hemmt, zur Verwendung in einer Methode zur Behandlung von Krebs bei einem Säuger, was die Verabreichung des besagten Mittels an einen Säuger umfasst.
Ein Mittel zur Regulation der Zelladhäsion gemäß Anspruch 22, wobei der besagte Krebs aus der Gruppe bestehend aus Karzinomen, Leukämie und Melanomen ausgewählt wird.
Ein Mittel zur Regulation der Zelladhäsion gemäß Anspruch 18, wobei das besagte Regulationsmittel die Occludin-vermittelte Zelladhäsion hemmt, zur Hemmung der Angiogenese bei einem Säuger, was die Verabreichung des besagten Mittels an einen Säuger umfasst.
Ein Mittel zur Regulation der Zelladhäsion gemäß Anspruch 18, wobei das besagte Regulationsmittel die Occludin-vermittelte Zelladhäsion hemmt, zur Verwendung in einer Methode zur Verbesserung der Arzneimittelabgabe an das zentrale Nervensystem eines Säugers, was die Verabreichung des besagten Mittels an einen Säuger umfasst.
Ein Mittel zur Regulation der Zelladhäsion gemäß Anspruch 18, wobei das besagte Regulationsmittel die Occludin-vermittelte Zelladhäsion erhöht, zur Verwendung in einer Methode zur Verbesserung der Wundheilung eines Säugers, was das Inkontaktbringen des besagten Mittels mit der Wunde eines Säugers umfasst.
Ein Mittel zur Regulation der Zelladhäsion gemäß Anspruch 18, wobei das besagte Regulationsmittel die Occludin-vermittelte Zelladhäsion erhöht, zur Verwendung in einer Methode zur Verbesserung der Adhäsion von Fremdgewebe, das bei einem Säuger transplantiert wird, was das Inkontaktbringen des besagten Mittels mit der Stelle der Implantation des Fremdgewebes bei einem Säuger umfasst.
Ein Mittel zur Regulation der Zelladhäsion gemäß Anspruch 18, wobei das besagte Regulationsmittel die Occludin-vermittelte Zelladhäsion hemmt, zur Verwendung in einer Methode zur Induzierung der Apoptose in einer Occludin-exprimierenden Zelle, was das Inkontaktbringen einer Occludin-exprimierenden Zelle mit dem besagten Mittel umfasst.
Ein Mittel zur Regulation der Zelladhäsion gemäß Anspruch 18 zur Verwendung in einer Methode zur Regulation des Immunsystems eines Säugers, was die Verabreichung des besagten Mittels an einen Säuger umfasst.
Ein Mittel zur Regulation der Zelladhäsion gemäß Anspruch 18 zur Verwendung in einer Methode zur Regulation der Bildung von tight junctions in Epithelzellen, was die Verabreichung des besagten Mittels an einen Säuger umfasst.
Ein Mittel zur Regulation der Zelladhäsion gemäß Anspruch 30, wobei das Re gulationsmittel die Bildung von tight junctions in Epithelzellen anregt.
Ein Mittel zur Regulation der Zelladhäsion gemäß Anspruch 18, wobei das besagte Regulationsmittel die Epithelzelladhäsion anregt, zur Verwendung in einer Methode zur Hemmung der Entstehung von Durchfall bei einem Patienten, was die Verabreichung des besagten Mittels an einen Patienten umfasst.
Ein Mittel zur Regulation der Zelladhäsion gemäß Anspruch 32, wobei das Mittel oral verabreicht wird.
Ein Mittel gemäß Anspruch 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27 oder 28, wobei das besagte Regulationsmittel eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus CLYHYC (SEQ.-ID-NR. 3), CYLYHYC (SEQ.-ID-NR. 40), CQYLYHYC (SEQ.-ID-NR. 41), KQYLYHYD (SEQ.-ID-NR. 42), YLYHY (SEQ.-ID-NR. 43), OYLYHY (SEQ.-ID-NR. 44), KLYHYD (SEQ.-ID-NR. 45) und Derivaten der vorangehenden Sequenzen ausgewählt wird, die eine oder mehrere C-terminale, N-terminale und/oder Seitenkettenmodifikationen haben.
Ein Mittel zur Regulation der Zelladhäsion gemäß Anspruch 18 und ein Arzneimittel, wobei das besagte Regulationsmittel die Occludin-vermittelte Zelladhäsion hemmt, zur Verwendung in einer Methode zur Verbesserung der Abgabe eines Arzneimittels durch die Haut eines Säugers, was das Inkontaktbringen des besagten Mittels und des Arzneimittels mit den Epithelzellen eines Säugers umfasst und wobei der Schritt des Inkontaktbringens unter Bedingungen und innerhalb einer Zeit durchgeführt wird, die ausreichen, um den Durchgang des besagten Arzneimittels durch die besagten Epithelzellen zu ermöglichen.
Ein Mittel zur Regulation der Zelladhäsion gemäß Anspruch 18 und ein Arzneimittel, wobei das besagte Regulationsmittel die Occludin-vermittelte Zelladhäsion hemmt, zur Verwendung in einer Methode zur Verbesserung der Abgabe eines Arzneimittels an den Tumor eines Säugers, was die Verabreichung des besagten Mittels an einen Säuger umfasst.
Ein Mittel und ein Medikament gemäß Anspruch 35, wobei das besagte Regulationsmittel in den Blutstrom des besagten Säugers gelangt.
Ein Mittel und ein Arzneimittel gemäß Anspruch 35, wobei das besagte Regulationsmittel eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus CLYHYC (SEQ.-ID-NR. 3), CYLYHYC (SEQ.-ID-NR. 40), CQYLYHYC (SEQ.-ID-NR. 41), KQYLYHYD (SEQ.-ID- NR. 42), YLYHY (SEQ.-ID-NR. 43), OYLYHY (SEQ.-ID-NR. 44), KLYHYD (SEQ.-ID-NR. 45) und Derivaten der vorangehenden Sequenzen ausgewählt wird, die eine oder mehrere C-terminale, N-terminale und/oder Seitenkettenmodifikationen haben.