JP6076509B2 - クロストリジウム属の菌の毒素産生抑制活性を有するペプチド - Google Patents

Description

本発明は、ペプチドおよび該ペプチドを利用したクロストリジウム属の菌の毒素産生抑制剤に関する。本発明はまた、クロストリジウム・ブチリカムの培養液を利用したクロストリジウム属の菌の毒素産生抑制剤に関する。

嫌気性細菌であるクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の菌は、土壌、河川、海水、生物の腸など、自然界に広く生息し、食中毒や感染症の原因菌としても知られている。

クロストリジウム属の菌の一種であるウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）もまた、そのような食中毒・感染症の原因菌のひとつである。ウェルシュ菌は多種の毒素を分泌し、重篤な感染症であるガス壊疽を引き起こすことでも知られている。ウェルシュ菌が分泌する毒素としては、アルファ−毒素（ホスホリパーゼＣ、遺伝子名：ｐｌｃ）、シーター−毒素（ヘモリシン、遺伝子名：ｐｆｏＡ）、カッパ−毒素（コラゲナーゼ、遺伝子名：ｃｏｌＡ）等が知られている。

非特許文献１には、ウェルシュ菌において、ＶｉｒＲ／ＶｉｒＳシステムと呼ばれる制御系によって、これらの毒素の産生が遺伝子レベルで正に制御されていることが記載されている。

クロストリジウム属をはじめとするグラム陽性菌は、外界の環境に対応してオートインデューサーを分泌する。分泌されたオートインデューサーは菌に作用し、毒素産生を促す。グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）では、チオラクトン構造を有するある種のペプチドがオートインデューサーとして機能し、ＡｇｒＡ／ＡｇｒＣシステムを介して毒素産生を促進することが知られている。非特許文献２には、黄色ブドウ球菌のオートインデューサーペプチドに対するホモログをウェルシュ菌が有しており、当該ホモログがＶｉｒＲ／ＶｉｒＳシステムを介して毒素の産生を促進することが開示されている。

非特許文献３や４には、クロストリジウム属の菌であるクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）やボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）が、ＶｉｒＲやＶｉｒＳのホモログをコードする遺伝子を有していることが記載されている。

非特許文献３には、オートインデューサーペプチドＡｇｒＤをコードする遺伝子を、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）などのクロストリジウム属の菌が有していることが記載されている。

清水 徹，日本細菌学雑誌（２００４），５９（２），第３７７−３８５頁 Ｏｈｔａｎｉ， Ｋ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（２００９），１９１，第３９１９−３９２７頁 Ｓｅｂａｉｈｉａ， Ｍ．ら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７），１７，第１０８２−１０９２頁 Ｃｏｏｋｓｌｅｙ， Ｃ．Ｍ．ら，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１０），７６，第４４４８−４４６０頁

クロストリジウム属の菌は食中毒や重篤な感染症の原因菌であり、クロストリジウム属の菌によってもたらされるこれらの健康被害を予防・制御する技術の開発が強く要望されている。

クロストリジウム属の菌の増殖を、抗生物質の使用によって阻害するという手段も用いられているが、耐性菌が発生するという問題が存在する。

したがって、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、クロストリジウム属の菌による食中毒や感染症等の健康被害を予防、治療および／または制御する手段を提供することを目的とする。

本願発明者らは、驚くべきことに、クロストリジウム・ブチリカムとクロストリジウム属の菌との共培養により、クロストリジウム菌の毒素産生を抑制し得ることを見出した。当該事実に基づき、クロストリジウム属の菌の毒素産生を抑制し得る成分について、鋭意研究を行った。その結果、ある種の構造を有するペプチドを用いることによって上記課題が解決されることを見出し、本発明の完成に至った。本発明は、以下の内容をその骨子とする。

（１） 下記式（１）：

式（１）中、Ｒ^１は水素原子、アミノ酸およびその誘導体、ならびに置換または無置換の、炭素数１〜１０のアシル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびフェニルイソチオシアネート基からなる群から選択され、Ｘ^１およびＸ^２はそれぞれ独立にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^３およびＸ^４は任意のアミノ酸である、ただし、Ｘ^２がＰｈｅのときはＸ^４がＴｈｒであり、Ｘ^４がＡｌａのときはＸ^１がＡｌａであり、Ｘ^４がＴｈｒのときはＸ^３がＴｒｐまたはＡｌａである；
で表わされるペプチド。

（２） 下記式（２）：

式（２）中、Ｒ^２は水素原子、アミノ酸およびその誘導体、ならびに置換または無置換の、炭素数１〜１０のアシル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびフェニルイソチオシアネート基からなる群から選択され、Ｘ^５およびＸ^６はそれぞれ独立にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^７およびＸ^８は任意のアミノ酸であり、ＺはＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群から選択される、ただし、Ｘ^６がＰｈｅのときはＸ^８がＴｈｒであり、Ｘ^８がＡｌａのときはＸ^５がＡｌａであり、Ｘ^８がＴｈｒのときはＸ^７がＴｒｐまたはＡｌａである；
で表わされるペプチド。

（３） クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）を培養した培養液または前記培養液の乾燥物を有効成分として含有する、クロストリジウム属の菌の毒素産生抑制剤。

図１は、環化した合成ペプチドを、逆相ＨＰＬＣにより精製した際の、クロマトグラムを示す。 図２は、図１におけるフラクション４を分析した、ＭＳスペクトルである。 図３は、Ｎ末端保護基（Ｆｍｏｃ）を除去した合成ペプチドを、逆相ＨＰＬＣにより精製した際の、クロマトグラムを示す。 図４は、図３におけるフラクション３２を分析した、ＭＳスペクトルである。 図５は、本発明に係るペプチドによる、ウェルシュ菌のシーター−毒素の遺伝子発現を確認した結果である。環状ＣＦＷＡＨ（レーン４）またはペプチド６ｎ（レーン５）がウェルシュ菌の毒素産生抑制活性を有することを示す。 図６は、共培養実験に用いたプレートおよび実験の様子を示す模式図である。 図７は、クロストリジウム・ブチリカムとウェルシュ菌とを共培養した場合における、ウェルシュ菌の毒素遺伝子の発現量を確認したノーザンブロットの結果である。クロストリジウム・ブチリカムが培地中に分泌する成分によって、ウェルシュ菌の毒素遺伝子発現が抑制されることを示す。 図８は、クロストリジウム・ブチリカムのａｇｒＤ遺伝子をウェルシュ菌内で発現させた場合の、ウェルシュ菌の毒素遺伝子の発現量を確認したノーザンブロットの結果である。 図９は、ＡｇｒＤ_ｃｂ−チオラクトンおよびＡｇｒＤ_ｃｂ−ラクタムによるウェルシュ菌の毒素産生抑制活性を確認した定量ＰＣＲの結果である。 図１０は、実施例５における培養時のＯＤ値の変化を示す。 図１１は、実施例５におけるＥＳＩ−ＭＳ分析結果を示す。

クロストリジウム属の菌による食中毒や感染症を予防・制御するために従来使用されてきた抗生物質とは異なり、本発明はクロストリジウム属の菌の毒素産生を抑制するものであり、耐性菌が発生しにくいという利点がある。以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。また、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。

また、本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味し、「重量」と「質量」、「重量％」と「質量％」及び「重量部」と「質量部」は同義語として扱う。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０〜２５℃）／相対湿度４０〜５０％の条件で測定する。

本発明によれば、クロストリジウム属の菌による食中毒や感染症等の健康被害を予防、治療および／または制御することができる。本発明に係るペプチドは、特に、ウェルシュ菌によってもたらされる健康被害の予防、治療および／または制御に有効である。また、本発明に係るクロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）を培養した培養液または前記培養液の乾燥物を有効成分として含有する剤を用いることにより、クロストリジウム属の菌の毒素産生を抑制し得る。

［ペプチド］
本発明の第１の形態は、下記式（１）：

で表わされるペプチドを提供する。

本明細書において、別途に言及されない限り、「アミノ酸」は、Ｄ型またはＬ型のいずれであってもよいα―アミノ酸を指すが、好ましくはＬ型のα―アミノ酸である。

式（１）における窒素原子および水素原子は、システイン残基のアミノ基に由来する。式（１）におけるカルボニル基は、Ｘ^４のカルボキシル基に由来する。式（１）における硫黄原子は、システイン残基のチオール基に由来する。式（１）においては、システイン残基のチオール基と、Ｘ^４のカルボキシル基とがチオラクトンを形成し、環化している。

式（１）において、Ｒ^１は水素原子、アミノ酸およびその誘導体、ならびに置換または無置換の、炭素数１〜１０のアシル基、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）およびフェニルイソチオシアネート基からなる群から選択される。なお、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）や９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）は、ペプチド合成において汎用される、代表的なアミノ基の保護基である。また、フェニルイソチオシアネート基は、フェニルイソチオシアネートとアミノ酸のアミノ基との反応によって形成される、アミノ酸配列分析において汎用される基である。Ｒ^１がアミノ酸またはその誘導体の場合、Ｒ^１のカルボキシル基の炭素原子と式（１）の窒素原子とで、ペプチド結合を形成する。

上記「アミノ酸の誘導体」としては、例えばオルニチン、サルコシン、デスモシン、イソデスモシン、ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸等が挙げられる。上記アシル基は、飽和または不飽和の、炭素数１〜１０の直鎖または分岐鎖のものが該当し、具体的にはホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレニル基、イソバレニル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、オクタノイル基、アクリロイル基、メタクリロイル基等が挙げられるが、これらに限定されない。

式（１）のＲ^１において、アシル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、フェニルイソチオシアネート基の置換基としては、本発明の効果が得られる限りにおいて特に限定されず、任意の置換基を採用できるが、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基等の脂肪族炭化水素基；シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等の脂環式炭化水素基；フェニル基などの芳香族炭化水素基；ヒドロキシル基；メトキシ基、エトキシ基等のアルコキシ基；アリルオキシ基等のアルケニルオキシ基；フェノキシ基等のアリールオキシ基；ベンジルオキシ基等のアラルキルオキシ基；アセチルオキシ基、プロピオニルオキシ基等のアシルオキシ基；カルボキシル基；アセチル基、プロピオニル基、ベンゾイル基等のアシル基；オキソ基；フッ素原子、塩素原子、臭素原子等のハロゲン原子等が挙げられる。

式（１）において、Ｒ^１は水素原子、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびベンジルオキシカルボニル基からなる群から選択されることが好ましく、より好ましくは水素原子、またはベンジルオキシカルボニル基である。

式（１）において、好ましくは、Ｒ^１は水素原子、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびベンジルオキシカルボニル基からなる群から選択され、Ｘ^１およびＸ^２はそれぞれ独立にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^３はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^４は任意のアミノ酸である、ただし、Ｘ^２がＰｈｅのときはＸ^４がＴｈｒであり、Ｘ^４がＡｌａのときはＸ^１がＡｌａであり、Ｘ^４がＴｈｒのときはＸ^３がＴｒｐまたはＡｌａである。

式（１）において、Ｘ^１はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択されるが、好ましくは、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択される。すなわち、本発明のある実施形態では、Ｒ^１は水素原子、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびベンジルオキシカルボニル基からなる群から選択され、Ｘ^１はＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^２はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^３はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^４は任意のアミノ酸である、ただし、Ｘ^２がＰｈｅのときはＸ^４がＴｈｒであり、Ｘ^４がＡｌａのときはＸ^１がＡｌａであり、Ｘ^４がＴｈｒのときはＸ^３がＴｒｐまたはＡｌａである。式（１）において、Ｘ^１はＰｈｅ、Ｌｅｕ、およびＡｌａからなる群から選択されることがさらに好ましい。すなわち、本発明のある実施形態では、Ｒ^１は水素原子、またはベンジルオキシカルボニル基であり、Ｘ^１はＰｈｅ、Ｌｅｕ、およびＡｌａからなる群から選択され、Ｘ^２はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^３はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^４は任意のアミノ酸である、ただし、Ｘ^２がＰｈｅのときはＸ^４がＴｈｒであり、Ｘ^４がＡｌａのときはＸ^１がＡｌａであり、Ｘ^４がＴｈｒのときはＸ^３がＴｒｐまたはＡｌａである。

式（１）において、Ｘ^２はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択されるが、好ましくは、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択される。すなわち、本発明のある実施形態では、Ｒ^１は水素原子、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびベンジルオキシカルボニル基からなる群から選択され、Ｘ^１はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^２はＰｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^３はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^４は任意のアミノ酸である、ただし、Ｘ^２がＰｈｅのときはＸ^４がＴｈｒであり、Ｘ^４がＡｌａのときはＸ^１がＡｌａであり、Ｘ^４がＴｈｒのときはＸ^３がＴｒｐまたはＡｌａである。式（１）において、Ｘ^２はＰｈｅ、またはＴｒｐであることがさらに好ましい。すなわち、本発明のある実施形態では、Ｒ^１は水素原子、またはベンジルオキシカルボニル基であり、Ｘ^１はＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^２はＰｈｅ、またはＴｒｐであり、Ｘ^３はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^４は任意のアミノ酸である、ただし、Ｘ^２がＰｈｅのときはＸ^４がＴｈｒであり、Ｘ^４がＡｌａのときはＸ^１がＡｌａであり、Ｘ^４がＴｈｒのときはＸ^３がＴｒｐまたはＡｌａである。

式（１）において、Ｘ^３は任意のアミノ酸であるが、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる群から選択されることが好ましく、Ａｌａ、Ｔｒｐ、およびＰｈｅからなる群から選択されることがより好ましい。すなわち、本発明のある実施形態では、Ｒ^１は水素原子、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびベンジルオキシカルボニル基からなる群から選択され、Ｘ^１およびＸ^２はそれぞれ独立にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^３はＡｌａ、Ｔｒｐ、およびＰｈｅからなる群から選択され、Ｘ^４は任意のアミノ酸である、ただし、Ｘ^２がＰｈｅのときはＸ^４がＴｈｒであり、Ｘ^４がＡｌａのときはＸ^１がＡｌａであり、Ｘ^４がＴｈｒのときはＸ^３がＴｒｐまたはＡｌａである。別の実施形態では、Ｒ^１は水素原子、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはベンジルオキシカルボニル基からなる群から選択され、Ｘ^１はＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^２はＰｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^３はＡｌａ、Ｔｒｐ、およびＰｈｅからなる群から選択され、Ｘ^４は任意のアミノ酸である、ただし、Ｘ^２がＰｈｅのときはＸ^４がＴｈｒであり、Ｘ^４がＡｌａのときはＸ^１がＡｌａであり、Ｘ^４がＴｈｒのときはＸ^３がＴｒｐまたはＡｌａである。

式（１）において、Ｘ^４は任意のアミノ酸であるが、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＳｅｒからなる群から選択されてもよい。すなわち、式（１）中、Ｒ^１は水素原子、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびベンジルオキシカルボニル基からなる群から選択され、Ｘ^１およびＸ^２はそれぞれ独立にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^３は任意のアミノ酸であり、Ｘ^４はＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＳｅｒからなる群から選択される、ただし、Ｘ^２がＰｈｅのときはＸ^４がＴｈｒであり、Ｘ^４がＡｌａのときはＸ^１がＡｌａであり、Ｘ^４がＴｈｒのときはＸ^３がＴｒｐまたはＡｌａである。より好ましくは、式（１）において、Ｒ^１は水素原子、またはベンジルオキシカルボニル基であり、Ｘ^１はＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^２はＰｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^３はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^４はＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＳｅｒからなる群から選択される、ただし、Ｘ^２がＰｈｅのときはＸ^４がＴｈｒであり、Ｘ^４がＡｌａのときはＸ^１がＡｌａであり、Ｘ^４がＴｈｒのときはＸ^３がＴｒｐまたはＡｌａである。さらに好ましくは、Ｘ^４はＨｉｓ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＳｅｒからなる群から選択される。すなわち、本発明の一実施形態では、式（１）において、Ｒ^１は水素原子、またはベンジルオキシカルボニル基であり、Ｘ^１はＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^２はＰｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^３はＡｌａ、Ｔｒｐ、およびＰｈｅからなる群から選択され、Ｘ^４はＨｉｓ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＳｅｒからなる群から選択される、ただし、Ｘ^２がＰｈｅのときはＸ^４がＴｈｒであり、Ｘ^４がＡｌａのときはＸ^１がＡｌａであり、Ｘ^４がＴｈｒのときはＸ^３がＴｒｐまたはＡｌａである。

本発明の更に好ましい実施形態においては、式（１）において、Ｒ^１は水素原子、またはベンジルオキシカルボニル基であり、Ｘ^１はＰｈｅ、Ｌｅｕ、およびＡｌａからなる群から選択され、Ｘ^２はＰｈｅ、またはＴｒｐであり、Ｘ^３はＡｌａ、Ｔｒｐ、およびＰｈｅからなる群から選択され、Ｘ^４はＨｉｓ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＳｅｒからなる群から選択される、ただし、Ｘ^２がＰｈｅのときはＸ^４がＴｈｒであり、Ｘ^４がＡｌａのときはＸ^１がＡｌａであり、Ｘ^４がＴｈｒのときはＸ^３がＴｒｐまたはＡｌａである。

式（１）において、Ｒ^１が水素原子であり、Ｘ^１がＰｈｅであり、Ｘ^２がＴｒｐであり、Ｘ^３がＡｌａであり、Ｘ^４がＨｉｓである、配列番号１で表わされる配列が、特に好ましい。

この他、式（１）において特に好ましい配列を、配列番号２０〜２２、３１、３３および３５として以下に示す。

本発明のある態様においては、下記式（２）：

で表わされるペプチドを提供する。式（２）中、Ｒ^２は水素原子、アミノ酸およびその誘導体、ならびに置換または無置換の、炭素数１〜１０のアシル基、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）およびフェニルイソチオシアネート基からなる群から選択され、Ｘ^５およびＸ^６はそれぞれ独立にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^７およびＸ^８は任意のアミノ酸であり、ＺはＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群から選択される、ただし、Ｘ^６がＰｈｅのときはＸ^８がＴｈｒであり、Ｘ^８がＡｌａのときはＸ^５がＡｌａであり、Ｘ^８がＴｈｒのときはＸ^７がＴｒｐまたはＡｌａである。

式（２）におけるカルボニル基は、Ｘ^８のカルボキシル基に由来する。式（２）における窒素原子は、Ｚのアミノ基に由来する。式（２）においては、Ｚの窒素原子と、Ｘ^８のカルボキシル基とが置換（Ｒ^２が水素原子ではない場合）または無置換（Ｒ^２が水素原子の場合）のラクタムを形成し、環化している。

式（２）において、Ｒ^２は水素原子、アミノ酸およびその誘導体、ならびに置換または無置換の、炭素数１〜１０のアシル基、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）、フェニルイソチオシアネート基からなる群から選択される。Ｒ^２がアミノ酸またはその誘導体の場合、Ｒ^２のカルボキシル基の炭素原子と式（２）の窒素原子とで、アミド結合を形成する。

上記「アミノ酸の誘導体」としては、上記の式（１）についてのものと同様である。また、式（２）のＲ^２における、アシル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、フェニルイソチオシアネート基の置換基についても、上記の式（１）についてのものと同様である。

式（２）において、Ｒ^２は水素原子、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびベンジルオキシカルボニル基からなる群から選択されることが好ましく、より好ましくは水素原子、またはベンジルオキシカルボニル基である。

式（２）において、好ましくは、Ｒ^２は水素原子、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびベンジルオキシカルボニル基からなる群から選択され、Ｘ^５およびＸ^６はそれぞれ独立にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^７はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^８は任意のアミノ酸であり、ＺはＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群から選択される、ただし、Ｘ^６がＰｈｅのときはＸ^８がＴｈｒであり、Ｘ^８がＡｌａのときはＸ^５がＡｌａであり、Ｘ^８がＴｈｒのときはＸ^７がＴｒｐまたはＡｌａである。

式（２）において、Ｘ^５はＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択されることが好ましい。すなわち、本発明のある実施形態では、Ｒ^２は水素原子、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびベンジルオキシカルボニル基からなる群から選択され、Ｘ^５はＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^６はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^７はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^８は任意のアミノ酸であり、ＺはＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群から選択される、ただし、Ｘ^６がＰｈｅのときはＸ^８がＴｈｒであり、Ｘ^８がＡｌａのときはＸ^５がＡｌａであり、Ｘ^８がＴｈｒのときはＸ^７がＴｒｐまたはＡｌａである。式（２）において、Ｘ^５はＰｈｅ、Ｌｅｕ、およびＡｌａからなる群から選択されることがさらに好ましい。すなわち、本発明のある実施形態では、Ｒ^２は水素原子、またはベンジルオキシカルボニル基であり、Ｘ^５はＰｈｅ、Ｌｅｕ、およびＡｌａからなる群から選択され、Ｘ^６はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^７はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^８は任意のアミノ酸であり、ＺはＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群から選択される、ただし、Ｘ^６がＰｈｅのときはＸ^８がＴｈｒであり、Ｘ^８がＡｌａのときはＸ^５がＡｌａであり、Ｘ^８がＴｈｒのときはＸ^７がＴｒｐまたはＡｌａである。

式（２）において、Ｘ^６はＰｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択されることが好ましい。すなわち、本発明のある実施形態では、Ｒ^２は水素原子、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびベンジルオキシカルボニル基からなる群から選択され、Ｘ^５はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^６はＰｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^７はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^８は任意のアミノ酸であり、ＺはＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群から選択される、ただし、Ｘ^６がＰｈｅのときはＸ^８がＴｈｒであり、Ｘ^８がＡｌａのときはＸ^５がＡｌａであり、Ｘ^８がＴｈｒのときはＸ^７がＴｒｐまたはＡｌａである。式（２）において、Ｘ^６はＰｈｅ、またはＴｒｐであることがさらに好ましい。すなわち、本発明のある実施形態では、Ｒ^２は水素原子、またはベンジルオキシカルボニル基であり、Ｘ^５はＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^６はＰｈｅ、またはＴｒｐであり、Ｘ^７はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^８は任意のアミノ酸であり、ＺはＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群から選択される、ただし、Ｘ^６がＰｈｅのときはＸ^８がＴｈｒであり、Ｘ^８がＡｌａのときはＸ^５がＡｌａであり、Ｘ^８がＴｈｒのときはＸ^７がＴｒｐまたはＡｌａである。

式（２）において、Ｘ^７は任意のアミノ酸であるが、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる群から選択されることが好ましく、Ａｌａ、Ｔｒｐ、およびＰｈｅからなる群から選択されることがより好ましい。すなわち、本発明のある実施形態では、Ｒ^２は水素原子、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびベンジルオキシカルボニル基からなる群から選択され、Ｘ^５およびＸ^６はそれぞれ独立にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^７はＡｌａ、Ｔｒｐ、およびＰｈｅからなる群から選択され、Ｘ^８は任意のアミノ酸であり、ＺはＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群から選択される、ただし、Ｘ^６がＰｈｅのときはＸ^８がＴｈｒであり、Ｘ^８がＡｌａのときはＸ^５がＡｌａであり、Ｘ^８がＴｈｒのときはＸ^７がＴｒｐまたはＡｌａである。別の実施形態では、Ｒ^２は水素原子、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびベンジルオキシカルボニル基からなる群から選択され、Ｘ^５はＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^６はＰｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^７はＡｌａ、Ｔｒｐ、およびＰｈｅからなる群から選択され、Ｘ^８は任意のアミノ酸であり、ＺはＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群から選択される、ただし、Ｘ^６がＰｈｅのときはＸ^８がＴｈｒであり、Ｘ^８がＡｌａのときはＸ^５がＡｌａであり、Ｘ^８がＴｈｒのときはＸ^７がＴｒｐまたはＡｌａである。

式（２）において、Ｘ^８はＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＳｅｒからなる群から選択されてもよい。すなわち、式（２）中、Ｒ^２は水素原子、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびベンジルオキシカルボニル基からなる群から選択され、Ｘ^５およびＸ^６はそれぞれ独立にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^７は任意のアミノ酸であり、Ｘ^８はＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＳｅｒからなる群から選択され、ＺはＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群から選択される、ただし、Ｘ^６がＰｈｅのときはＸ^８がＴｈｒであり、Ｘ^８がＡｌａのときはＸ^５がＡｌａであり、Ｘ^８がＴｈｒのときはＸ^７がＴｒｐまたはＡｌａである。より好ましくは、式（２）において、Ｒ^２は水素原子、またはベンジルオキシカルボニル基であり、Ｘ^５はＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^６はＰｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^７はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^８はＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＳｅｒからなる群から選択され、ＺはＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群から選択される、ただし、Ｘ^６がＰｈｅのときはＸ^８がＴｈｒであり、Ｘ^８がＡｌａのときはＸ^５がＡｌａであり、Ｘ^８がＴｈｒのときはＸ^７がＴｒｐまたはＡｌａである。さらに好ましくは、Ｘ^８はＨｉｓ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＳｅｒからなる群から選択される。すなわち、本発明の一実施形態では、式（１）において、Ｒ^２は水素原子、またはベンジルオキシカルボニル基であり、Ｘ^５はＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^６はＰｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^７はＡｌａ、Ｔｒｐ、およびＰｈｅからなる群から選択され、Ｘ^８はＨｉｓ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＳｅｒからなる群から選択される、ただし、Ｘ^６がＰｈｅのときはＸ^８がＴｈｒであり、Ｘ^８がＡｌａのときはＸ^５がＡｌａであり、Ｘ^８がＴｈｒのときはＸ^７がＴｒｐまたはＡｌａである。

式（２）において、ＺはＣｙｓであることが好ましい。すなわち、式（２）中、Ｒ^２は水素原子、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、およびベンジルオキシカルボニル基からなる群から選択され、Ｘ^５およびＸ^６はそれぞれ独立にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^７およびＸ^８は任意のアミノ酸であり、ＺはＣｙｓである、ただし、Ｘ^６がＰｈｅのときはＸ^８がＴｈｒであり、Ｘ^８がＡｌａのときはＸ^５がＡｌａであり、Ｘ^８がＴｈｒのときはＸ^７がＴｒｐまたはＡｌａである。より好ましくは、Ｒ^２は水素原子、またはベンジルオキシカルボニル基であり、Ｘ^５はＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択され、Ｘ^６はＰｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^７はＡｌａ、Ｔｒｐ、およびＰｈｅからなる群から選択され、Ｘ^８はＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＳｅｒからなる群から選択され、ＺはＣｙｓである、ただし、Ｘ^６がＰｈｅのときはＸ^８がＴｈｒであり、Ｘ^８がＡｌａのときはＸ^５がＡｌａであり、Ｘ^８がＴｈｒのときはＸ^７がＴｒｐまたはＡｌａである。

本発明の更に好ましい実施形態においては、式（２）において、Ｒ^２は水素原子、またはベンジルオキシカルボニル基であり、Ｘ^５はＰｈｅ、Ｌｅｕ、およびＡｌａからなる群から選択され、Ｘ^６はＰｈｅ、またはＴｒｐであり、Ｘ^７はＡｌａ、Ｔｒｐ、およびＰｈｅからなる群から選択され、Ｘ^８はＨｉｓ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＳｅｒからなる群から選択され、ＺがＣｙｓである、ただし、Ｘ^６がＰｈｅのときはＸ^８がＴｈｒであり、Ｘ^８がＡｌａのときはＸ^５がＡｌａであり、Ｘ^８がＴｈｒのときはＸ^７がＴｒｐまたはＡｌａである。

式（２）において、Ｒ^２が水素原子であり、Ｘ^５がＰｈｅであり、Ｘ^６がＴｒｐであり、Ｘ^７がＡｌａであり、Ｘ^８がＨｉｓであり、ＺがＣｙｓである、配列番号２３で表わされる配列が、特に好ましい。

この他、式（２）において特に好ましい配列を、配列番号２４〜２６、３２、３４および３６として以下に示す。

各アミノ酸は、その側鎖の相違に基づいて、類似の性質を有するアミノ酸と置換しうることが、本願技術分野においては知られている（保存的置換）。Ｐｈｅは、例えば、非極性アミノ酸であるＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅや芳香族アミノ酸であるＴｙｒと置換しうる。Ｔｒｐは、例えば、非極性アミノ酸であるＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅや芳香族アミノ酸であるＴｙｒと置換しうる。Ａｌａは、例えば、非極性アミノ酸であるＰｈｅ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅと置換しうる。Ｈｉｓは、例えば、塩基性アミノ酸であるＬｙｓまたはＡｒｇと置換しうる。Ｃｙｓは、極性があり電荷を持たないアミノ酸であるＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＧｌｎと置換しうる。

一方、式（１）で表されるペプチドにおいて、Ｘ^４がＡｌａのときはＸ^１がＡｌａであり、Ｘ^４がＴｈｒのときはＸ^３がＴｒｐまたはＡｌａである。さらに、式（２）で表されるペプチドにおいて、Ｘ^８がＡｌａのときはＸ^５がＡｌａであり、Ｘ^８がＴｈｒのときはＸ^７がＴｒｐまたはＡｌａである。すなわち、Ｘ^４またはＸ^８がＡｌａ、またはＴｈｒの場合は、ペプチド中の所定の位置において上記のような保存的置換が、例外的に成立しない。これは、式（１）におけるシステインとチオラクトン構造を、または式（２）におけるＺとラクタム構造を形成するＸ^４またはＸ^８のアミノ酸種によって、ウェルシュ菌ＶｉｒＳへの結合が制約されるためであると考えられる。なお、上記メカニズムは推定であり、本発明の技術的範囲をなんら制限するものではない。

本発明の効果は以下のメカニズムに基づくものと考えている。すなわち、細胞外シグナルに対するセンサーであるＶｉｒＳに対して、式（１）で表わされるチオラクトン構造を有する、所定の長さのペプチドがアンタゴニストとして機能することにより、ＶｉｒＲ／ＶｉｒＳシステムの下流で制御される毒素遺伝子の発現が抑制されることによるものと考えられる。また、細胞外シグナルに対するセンサーであるＶｉｒＳに対して、式（２）で表わされる置換または無置換のラクタム構造を有する、所定の長さのペプチドがアンタゴニストとして機能することにより、ＶｉｒＲ／ＶｉｒＳシステムの下流で制御される毒素遺伝子の発現が抑制されることによるものと考えられる。また、上記ペプチド配列において、芳香族アミノ酸の位置（特に、式（１）で表わされるペプチドにおけるＸ^２、および式（２）で表わされるペプチドにおけるＸ^６）と関係した３次元的構造が、ＶｉｒＳへの結合活性に影響しているのではないかと考えられる。Ｘ^２またはＸ^６がＰｈｅのときに上記のような保存的置換が例外的に成立しない理由も、ＶｉｒＳへの結合活性と関連しているのではないかと考えられる。なお、上記メカニズムは推定であり、本発明の技術的範囲をなんら制限するものではない。

式（１）または式（２）で表わされるペプチドは、当業者であれば任意の方法によって製造することができる。例えば、直鎖状ペプチドを固相合成法により合成し、または宿主細胞に発現させ、その後、該直鎖状ペプチドを環化することによって得られる。式（１）または式（２）で表わされるペプチドは、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）を培養した培養液から従来公知の方法により精製・単離されたものであっても良い。

固相合成法によってペプチドを合成する場合は、特に制限されるものではないが、例えばＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）合成法や、ベンジルオキシカルボニル法、Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）合成法等、当業者に公知の方法が採用できる。Ｆｍｏｃ合成法を例に説明すると、樹脂（例えば、Ｗａｎｇレジン、または２−クロロトリエチルクロリドレジン）等の固相に結合させたＦｍｏｃ−アミノ酸から、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の塩基を用いて、保護基であるＦｍｏｃ基を除去する。その後、次のＦｍｏｃ−アミノ酸を反応させる操作を繰り返すことで、目的の配列を有するペプチドが合成できる。カイザーテスト等の呈色反応によって、脱保護反応を確認することもできる。樹脂からのペプチドの切り離しや、側鎖の保護基の脱保護などの除去反応では、酸（例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））やアルカリ（例えば、ピペリジン）処理を行えばよい。アルカリ処理によって脱保護をする場合、処理時間を短くする（例えば約３分）ことによって式（１）で表わされるチオラクトン構造を有するペプチドを優先的に、処理時間を長く（例えば１５分〜１時間）することによって式（２）で表わされるラクタム構造を有するペプチドを優先的に得ることができる。または、式（２）で表わされるラクタム構造を有するペプチドは、式（１）で表わされるチオラクトン構造を有するペプチドをアンモニア等によってアルカリ転化処理することによっても得ることができる。

宿主細胞にペプチドを発現させて調製する場合は、任意のプロモーターの下流に、所望のペプチド配列（例えば、Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ（配列番号１））をコードするポリヌクレオチドを組込んだベクターを宿主細胞に導入する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルスまたはファージなどが挙げられる。プロモーターは、宿主細胞に応じて適宜選択できるが、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｓｐａプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦプロモーター等が例示できる。宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の原核細胞；酵母；カビ；ＨＥＫ−２９３細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞；バキュロウィルスによる昆虫細胞；カイコ等の個体、などが挙げられる。宿主細胞への導入方法は、マイクロインジェクション、カルシウムリン酸法、エレクトロポレーション、リポソームを用いたトランスフェクションなど、当業者に公知の方法を採用できる。宿主細胞が合成したペプチドは、透析、カラム処理、洗浄等、任意の方法で精製、回収すればよい。

上記方法にて得た直鎖状のペプチドは、ＰｙＢＯＰ（ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム）やＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド）等のカップリング試薬を用いた反応により、環化することができる。例えば、上記ペプチド濃度が０．５〜２ｍｇ／ｍｌ程度となるようにＮ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）等に溶解し、１〜５当量程度のＰｙＢＯＰとジメチルアミノピリジンとを加え、１〜２０時間程度反応させればよい。カップリング反応は、室温でもよいが、２０〜５０℃程度に加温しても良い。また、Ｎ_２等の不活性ガス雰囲気下で行っても良い。

上記反応によって得られた環状ペプチドは、固相抽出（例えば、ウォーターズ社製のＳｅｐ−Ｐａｃ（登録商標）等を用いることができる。）や液体クロマトグラフィー（例えば、逆相ＨＰＬＣ）等、当業者に公知の方法によって精製・単離できる。また、合成された環状ペプチドの構造は、ＭＳ（例えば、ＥＳＩ−ＭＳ）や^１ＨＮＭＲなど、当業者に公知の手段によって確認できる。

［毒素産生抑制剤］
本発明の第２の形態は、式（１）のペプチドを有効成分として含有する、クロストリジウム属の菌の毒素産生抑制剤を提供する。本発明の他の実施形態では、クロストリジウム属の菌の毒素産生抑制のための、式（１）のペプチドの使用、が提供される。

本発明の別の実施形態では、式（２）のペプチドを有効成分として含有する、クロストリジウム属の菌の毒素産生抑制剤を提供する。本発明のさらに別の実施形態では、クロストリジウム属の菌の毒素産生抑制のための、式（２）のペプチドの使用、が提供される。

クロストリジウム属の菌は、ガス壊疽、大腸炎、家畜や家禽の壊死性腸炎、下痢症、エンテロトキセミア、蜂巣炎、子宮感染、菌血症、食中毒、破傷風等の健康被害を引き起こす原因菌である。

本発明において、クロストリジウム属の菌とは、クロストリジウム属のうちクロストリジウム・ブチリカム以外の種の菌を意味し、例えば、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・ノビイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ）などであり、好ましくはウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）およびボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）からなる群から選択され、本発明はウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）に特に好適に用いられる。

クロストリジウム属の菌が産生する毒素としては、特に制限されるものではないが、例えばＶｉｒＲ／ＶｉｒＳシステムの下流で制御されうる毒素である。より具体的には、アルファ−毒素（ホスホリパーゼＣ）、シーター−毒素（ヘモリシン）、カッパ−毒素（コラゲナーゼ）、毒素調節ＲＮＡ（ＶＲ−ＲＮＡ）によって制御される毒素、α−クロストリパイン、コラーゲンアドヘジン、ベータ２−毒素、溶血毒素、ミュー−毒素（ヒアルロニダーゼ）、エンテロトキシン、シアリダーゼ、デルタ−毒素（ヘモリシン）、ニュー−毒素（ＤＮａｓｅ）、ノイラミニダーゼなどが例示できる。

本発明によれば、上記のようなクロストリジウム属の菌によって引き起こされる健康被害を予防、治療および／または制御することができる。

本発明の毒素産生抑制剤は、所望の効果を発揮するのに十分な量（すなわち、有効量）の式（１）で表わされるペプチドを含有する。または、本発明の毒素産生抑制剤は、所望の効果を発揮するのに十分な量（すなわち、有効量）の式（２）で表わされるペプチドを含有する。毒素産生抑制剤は、式（１）で表わされるペプチドまたは式（２）で表わされるペプチドのみから構成されてもよいが、製剤化のために許容されうる添加剤を併用して、常法に従い、経口製剤または非経口製剤として調製されることが好ましい。このような製剤化のために許容されうる添加剤としては、例えば、賦形剤、安定剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、甘味料、着色料、香料、緩衝剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、結合剤、増粘剤、分散剤、懸濁化剤、崩壊剤、制菌剤、界面活性剤などを挙げることができる。剤形は特に制限されず、適宜設定すればよいが、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤、溶液、懸濁液、乳濁液、ローション剤、注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤、貼付剤などである。

式（１）で表わされるペプチドは、保存期間中に、転化反応が自然進行して式（２）で表わされるペプチドへと構造変化する場合がある。また、式（２）で表わされるペプチドを、式（１）で表わされるペプチドを原料として合成した場合などは、式（２）で表わされるペプチドは、精製後であっても少量の式（１）で表わされるペプチドを含み得る。したがって、上記の毒素産生抑制剤において、「式（１）で表わされるペプチド」は不純物程度の式（２）で表わされるペプチドを含んでもよく、また、「式（２）で表わされるペプチド」は不純物程度の式（１）で表わされるペプチドを含んでもよい。また、上記の毒素産生抑制剤は、式（１）で表わされるペプチドと式（２）で表わされるペプチドとを、任意の割合で含むものであっても良い。この場合、式（１）で表わされるペプチドと式（２）で表わされるペプチドとの割合は特に制限されないが、例えば、１：１０００〜１０００：１（重量比）である。

本発明の第３の形態は、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）を培養した培養液または前記培養液の乾燥物を有効成分として含有する、クロストリジウム属の菌の毒素産生抑制剤を提供する。本発明の他の実施形態では、クロストリジウム属の菌の毒素産生抑制のための、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）を培養した培養液または前記培養液の乾燥物の使用、が提供される。

バクテリアが生産したオートインデューサーペプチドは通常、細胞外に分泌される。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）が分泌するＡｇｒＤ（配列番号２）は、以下の式（３）で表わされる構造であると推定されている。

一方、クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ ５８８（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ＭＩＹＡＩＲＩ ５８８）は、黄色ブドウ球菌のＡｇｒＤのホモログであると推定される、以下の配列のオートインデューサーペプチドＡｇｒＤをコードする遺伝子を有している。

クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ ５８８が有するＡｇｒＤには、式（１）または式（２）で表わされるペプチドの配列に相当する配列が含まれる。本発明の技術的範囲を制限するものではないが、クロストリジウム・ブチリカムの培養液による、ウェルシュ菌をはじめとするクロストリジウム属の菌の毒素産生抑制活性は、次のメカニズムによるのではないかと考えている。すなわち、クロストリジウム・ブチリカムの培養液が、式（１）または式（２）で表わされるペプチドであるＡｇｒＤを含むことにより、ウェルシュ菌をはじめとするクロストリジウム属の菌の毒素産生抑制活性が発揮されるのではないかと推定される。なお、上記メカニズムは推定であり、本発明の技術的範囲をなんら制限するものではない。

クロストリジウム・ブチリカムは、栄養のバランスがとれている間は分裂増殖を繰り返す（栄養細胞）が、そのバランスが崩れると菌体内に胞子を生じる芽胞形成性かつ嫌気性のグラム陽性桿菌である。嫌気性細菌に限らず、多くの細菌は、栄養細胞の形態を有する際には、乾燥状態で放置されると容易に死滅する。しかしながら、芽胞は休止細胞であるため、乾燥、熱や化学薬品などの様々な外的環境に対して強い抵抗性を有し、保存には好都合である。

また、上述したように、クロストリジウム・ブチリカムは芽胞形成性であり、芽胞の状態にある際には、様々な外的環境に対して抵抗性を有する。このため、クロストリジウム・ブチリカムが芽胞の形態で人や動物に経口投与されると、胃酸、腸液や胆汁酸などの消化液と接しても、クロストリジウム・ブチリカムは完全には死滅せずに小腸下部から大腸に至るまでの発酵部位にも到達し増殖することが可能となる。

さらに、クロストリジウム・ブチリカムは、生菌剤、飼料添加物や食品として広く市販されており、人や家畜などの哺乳動物に長期間にわたって投与しても全く副作用を認めず、高い安全性が確認されている。

本発明に用いることができるクロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）としては、クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ、クロストリジウム・ブチリカム（ＦＥＲＭ Ｐ−１１８６８）、クロストリジウム・ブチリカム（ＦＥＲＭ Ｐ−１１８６８）、クロストリジウム・ブチリカム（ＦＥＲＭ Ｐ−１１８６９）、クロストリジウム・ブチリカム（ＦＥＲＭ Ｐ−１１８７０）、クロストリジウム・ブチリカム・Ｐｒａｚｍｏｗｓｋｉ １８８０（ＮＢＲＣ １３９４９）、クロストリジウム・ブチリカム・Ｐｒａｚｍｏｗｓｋｉ １８８０（ＮＢＲＣ ３３１５）、クロストリジウム・ブチリカム・Ｐｒａｚｍｏｗｓｋｉ １８８０（ＮＢＲＣ ３８５８）、クロストリジウム・ブチリカム・ＡＴＣＣ８５９（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ＡＴＣＣ ８５９）、クロストリジウム・ブチリカム・ＡＴＣＣ８６０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ＡＴＣＣ ８６０）、クロストリジウム・ブチリカム・ＡＴＣＣ３６２７（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ＡＴＣＣ ３６２７）、クロストリジウム・ブチリカム・ＡＴＣＣ１９３９８（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １９３９８）が例示できる。好ましくは、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）は、クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ ５８８（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ＭＩＹＡＩＲＩ ５８８、ＦＥＲＭ ＢＰ−２７８９）、クロストリジウム・ブチリカム ミヤイリ５８５（ＦＥＲＭ ＢＰ−０６８１５）、クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ５９５（ＦＥＲＭ ＢＰ−０６８１６）及びクロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ６３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−０６８１７）からなる群より選択される１種以上であり、より好ましくはクロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ ５８８（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ＭＩＹＡＩＲＩ ５８８、ＦＥＲＭ ＢＰ−２７８９）である。なお、クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ ５８８株は、１９８１年５月１日付で通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現在の独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター）（〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）にＦＥＲＭ ＢＰ−２７８９として寄託され、１９９０年３月６日付で、ブダペスト条約に基づく国際寄託機関に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２７８９として寄託されている。

本発明の第３の形態に係る毒素産生抑制剤は、クロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液または前記培養液の乾燥物を有効成分として含有する。

クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリは生菌剤としてミヤリサン製薬株式会社から市販されており、人や動物に長期に投与しても全く副作用の無いものであるため、本発明における使用にとって特に好適である。なお、有効成分であるクロストリジウム・ブチリカムとしては、１種のみが単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。

本発明において、クロストリジウム・ブチリカムの培養物、すなわち「クロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液または前記培養液の乾燥物」は、既知の微生物の培養方法、例えば、特願平０８−２５２０８８号に開示された方法により得られる。その一実施態様を下記に示す：クロストリジウム・ブチリカムを１．０（ｗ／ｖ）％ペプトン、１．０（ｗ／ｖ）％酵母エキス、１．０（ｗ／ｖ）％コーンスターチおよび０．２（ｗ／ｖ）％沈降炭酸カルシウムからなる培地に１０^５〜１０^６個／ｍＬになるように接種し、３７℃にて４８時間静置培養することにより、「クロストリジウム・ブチリカムの培養液」を得る。「培養液の乾燥物」を得るためには、得られた培養液を０〜８０℃、好ましくは１０〜２０℃で、１〜２４時間、好ましくは５〜１８時間風乾等による乾燥処理を行う。または０〜８０℃、好ましくは１０〜２０℃、０．０５〜５００Ｔｏｒｒ（７Ｐａ〜６６．７ｋＰａ）、好ましくは１〜１００Ｔｏｒｒ（１３３Ｐａ〜１３．３ｋＰａ）で、１〜２４時間、好ましくは２〜１５時間減圧乾燥処理すればよい。乾燥物を得るためには、スプレードライ、フリーズドライなどを用いても良い。

本発明のクロストリジウム・ブチリカムの培養に使用する培地は、使用する菌株の種類等によっても異なるが、使用するクロストリジウム・ブチリカムが資化しうる炭素源、適量の窒素源、無機塩およびビタミン類などのその他の栄養素を含有する培地であれば、合成培地または天然培地のいずれでもよい。

例えば、本発明による培地中で使用される炭素源の例として、使用する菌株が資化できる炭素源であれば特に制限されない。炭素源としては、必ずしも糖に制限されないが、菌体の増殖を考慮すると、使用する細菌が利用可能な糖または糖を含むものが好ましく使用される。使用できる炭素源の具体例としては、資化性を考慮して、セロビオース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、マンノース、メリビオース、ラフィノース、サリシン、スターチ、スクロース、トレハロース、キシロース、デキストリン、溶性デンプンおよび糖蜜等が挙げられる。これらの炭素源のうち、スターチ、グルコース、フルクトース、スクロースおよび糖蜜が好ましく使用される。上記した炭素源を、使用するクロストリジウム・ブチリカムを考慮して、１種または２種以上選択して使用してもよい。この際、炭素源の添加濃度は、使用するクロストリジウム・ブチリカムや炭素源の種類および使用する培地の炭素源以外の培地組成等によっても異なるが、通常０．５〜５（ｗ／ｖ）％、好ましくは２〜４（ｗ／ｖ）％である。

また、窒素源およびビタミン類としては、例えば、肉エキス、ペプトン、ダイズペプトン、プロテアーゼペプトン、酵母エキス、肝臓エキス、消化血清末、大豆または小麦の加水分解物、大豆粉末、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物等の有機窒素化合物および硫酸アンモニウムなどのアンモニウム塩が挙げられる。これらの窒素源のうち、ペプトン、ダイズペプトン、プロテアーゼペプトン、酵母エキス、消化血清末、肉エキス、肝臓エキス、コーンスティープリカー、および大豆または小麦の加水分解物が好ましく使用される。上記した窒素源およびビタミン類を、使用するクロストリジウム・ブチリカムの生育を向上させるために、１種または２種以上選択して使用してもよい。この際、上記窒素源の添加濃度は、使用する菌株や窒素源の種類および使用する培地の窒素源以外の培地組成等によっても異なるが、窒素源を多く含むペプトンを使用する際には、通常０．５〜４（ｗ／ｖ）％、好ましくは１〜３（ｗ／ｖ）％であり、窒素源およびビタミン類を多く含む味液やコーンスティープリカーを使用する際には、通常０．５〜５（ｗ／ｖ）％、好ましくは１〜４（ｗ／ｖ）％であり、さらに、ビタミン類を多く含む酵母エキスあるいは肉エキスを使用する際には、通常０．５〜４（ｗ／ｖ）％、好ましくは１〜３（ｗ／ｖ）％である。

さらに、無機塩としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、モリブデン、ストロンチウム、ホウ素、銅、鉄、スズおよび亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、酪酸塩、プロピオン酸塩、塩化物等のハロゲン化物、および酢酸塩等から選ばれた１種または２種以上を使用することができる。また、培地中に、必要に応じて、消泡剤、植物油、界面活性剤、血液および血液成分、抗生物質などの薬剤、植物または動物ホルモンなどの生理活性物質、チオグリコール酸塩やシステインなどの還元剤等を適宜添加してもよい。

本発明において行われる培養の条件は、本発明に使用するクロストリジウム・ブチリカムの生育の範囲（ｐＨや温度等）等の生理学的性質によって異なるが、クロストリジウム・ブチリカムは偏性嫌気性であるため、通気しない、または窒素もしくは炭酸ガスを通気しながら、または培地中に還元剤を加えることにより酸化還元電位を下げるなどによって、嫌気的条件下で培養されることが必要である。その際の培養条件は、使用される菌株の生育の範囲、培地の組成や培養法によって適宜選択され、本菌株が増殖できる条件であれば特に制限されない。具体的には、培養温度は、通常２０〜４２℃、好ましくは３５〜４０℃である。

また、本発明において、クロストリジウム・ブチリカムの培養は、培養中に産生される酸をアルカリで中和することにより増殖が促進されるため、予め培地に炭酸カルシウムを添加してもよい。この際、炭酸カルシウムの添加量は、通常０．１〜４（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．２〜２．５（ｗ／ｖ）％である。または、上記中和工程を、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウムおよび炭酸カリウム等のアルカリ水溶液によって培地のｐＨを設定ｐＨの範囲内に抑えながら行ってもよい。なお、アルカリ水溶液を使用する場合には、「設定ｐＨ」とは、培養期間中に予め設定されている培地のｐＨを意味し、「設定ｐＨの範囲」とは、培養期間中に許容されるｐＨの範囲であり、一般的には、設定ｐＨ±許容差で表わす。本発明によると、設定ｐＨは、通常５．０〜７．５、好ましくは５．５〜６．５の範囲内で設定され、設定ｐＨの範囲は、設定ｐＨ±０．５、望ましくは設定ｐＨ±０．２である。

なお、本発明において、培養を行う間の培地のｐＨは、菌の接種時では中性付近、より好ましくは６．５〜７．５とする。なお、アルカリ水溶液を使用する場合には、酸素が混入しないように緩やかに攪拌しながら設定ｐＨの範囲内に入るよう維持することが好ましい。このように菌の接種時および菌の増殖時のｐＨを制御することによって、菌密度を飛躍的に増大させることができる。

本発明による培養において、クロストリジウム・ブチリカムの初期培養濃度は、クロストリジウム・ブチリカムが生育できる範囲であれば特に制限されず、通常、クロストリジウム・ブチリカムの培養で行われるものと同様である。具体的には、通常１０^４〜１０^７個／ｍＬ、好ましくは１０^５〜１０^６個／ｍＬである。

好ましくは、クロストリジウム・ブチリカムの培養液は、対数増殖中期以降のものである。本明細書において「対数増殖中期」とは、増殖を開始してから定常期に達するまでのおよそ中間の時期を指し、例えば波長６６０ｎｍにおけるＯＤ値が０．５〜１．０を示す時期であることをいう。本発明において好ましく用いられるクロストリジウム・ブチリカムの対数増殖中期以降の培養液は、ウェルシュ菌の毒素産生抑制活性を示す限り特に制限されないが、例えば、培養開始から５００時間以内に回収されたものであり、より好ましくは１００時間以内に回収されたものである。

本発明の毒素産生抑制剤においては、培養液または培養液の乾燥物を有効成分として用いても良いが、培養液を乾燥する前に遠心分離し、遠心分離等によって得られる菌（菌体や芽胞）を含む沈殿もしくは上清、またはこれらの乾燥物を有効成分として用いても良い。すなわち、本発明のある実施形態では、クロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液を遠心分離して得られる菌（菌体および／もしくは芽胞）を含む沈殿もしくは上清、または前記沈殿もしくは前記上清の乾燥物を有効成分として含む、毒素産生抑制剤が提供される。

クロストリジウム・ブチリカムを経口的に摂取すると、上述のように小腸下部から大腸に到達して増殖する。従って、遠心分離等によって得られる菌（菌体や芽胞）を含む沈殿を経口投与することによって、プロバイオティクス的な効果が期待できる。一方、クロストリジウム属の菌が分泌するＡｇｒＤは水溶性であることから、遠心分離等によって得られる上清を回収することによって、上清に分泌されたＡｇｒＤを含む画分を得て、注射剤や塗布剤等に利用することもできる。

遠心分離の条件は特に制限されるものではないが、例えば２，０００〜６，０００ｇで１０〜３０分である。菌（菌体や芽胞）を含む沈殿または上清を乾燥する方法は、上記の「培養液の乾燥物」を得る方法が適宜参酌される。

こうして得られた培養液、または培養液をさらに遠心分離して得られた沈殿もしくは上清から、さらに当業者に公知の方法を用いて、本発明に係るペプチドを濃縮・精製しても良い。濃縮の方法は特に制限されないが、透析、限外濾過、液体クロマトグラフィーなど、当業者に知られた方法を採用し、実施例に示す手段によって毒素産生抑制の効果を確認しつつ、活性の高い画分を回収すればよい。本発明に係る培養液、または培養液をさらに遠心分離して得られた沈殿もしくは上清には、上記の濃縮物や精製物も含まれる。

本実施形態におけるクロストリジウム属の菌や、クロストリジウム属の菌が産生する毒素については、本発明に係るペプチドを含有する毒素産生抑制剤について上述した事項が参酌される。

本発明の毒素産生抑制剤は、所望の効果を発揮するのに十分な量（すなわち、有効量）の、クロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液または前記培養液の乾燥物を含有する。本発明の別の実施形態においては、毒素産生抑制剤は、所望の効果を発揮するのに十分な量（すなわち、有効量）の、クロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液を遠心分離して得られる菌を含む沈殿もしくは上清、または前記沈殿もしくは前記上清の乾燥物を含有する。毒素産生抑制剤は、培養液もしくはその乾燥物、または培養液の上清もしくは沈殿、もしくはこれらの乾燥物により構成されてもよいが、製剤化のために許容され得る添加剤を併用して、常法に従い、経口製剤または非経口製剤として調製されることが好ましい。製剤化のために許容され得る添加剤としては、本発明に係るペプチドを含有する毒素産生抑制剤について上述した事項が参酌される。

［クロストリジウム属の菌による健康被害を予防および／または治療する方法］
本発明のある実施形態では、式（１）で表わされるペプチドの有効量を患者に投与することを含む、クロストリジウム属の菌による健康被害を予防および／または治療する方法を提供する。本発明の別の実施形態では、式（２）で表わされるペプチドの有効量を患者に投与することを含む、クロストリジウム属の菌による健康被害を予防および／または治療する方法を提供する。

本発明のある実施形態では、クロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液または前記培養液の乾燥物の有効量を患者に投与することを含む、クロストリジウム属の菌による健康被害を予防および／または治療する方法を提供する。本発明の別の実施形態では、クロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液を遠心分離して得られる菌（菌体および／もしくは芽胞）を含む沈殿もしくは上清、または前記沈殿もしくは前記上清の乾燥物の有効量を患者に投与することを含む、クロストリジウム属の菌による健康被害を予防および／または治療する方法を提供する。

ここで、「有効量」とは、クロストリジウム属の菌による健康被害の予防および／または治療といった所望の効果を発揮するうえで少なくとも必要とされる有効成分の量を意味する。また、「患者」とは、特に制限するものではないが、例えばヒト；イヌ、ネコ等のペット；マウス、ラット等の実験動物；ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ等の家禽類；ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜；魚類等を意味する。

毒素産生抑制剤における上記記載は、適宜変更されて本実施形態に適用される。

［医薬組成物］
本発明の第４の形態は、式（１）で表わされるペプチド、またはクロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液もしくは前記培養液の乾燥物を有効成分として含有する毒素産生抑制剤を含む、医薬組成物を提供する。本発明の別の実施形態では、式（２）で表わされるペプチド、またはクロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液もしくは前記培養液の乾燥物を有効成分として含有する毒素産生抑制剤を含む、医薬組成物を提供する。本発明のある実施形態では、クロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液を遠心分離して得られる菌（菌体および／もしくは芽胞）を含む沈殿もしくは上清、または前記沈殿もしくは前記上清の乾燥物を有効成分として含有する毒素産生抑制剤を含む、医薬組成物を提供する。

医薬組成物は、当業者に適切と考えられるいずれの投与経路によって投与されても良い。例えば、医薬組成物は、経口、経静脈、筋肉内、髄腔内、腹腔内、経皮（例えば塗り薬として）または吸入投与されうる。本発明の医薬組成物は、これらの各投与形態に応じて、薬理学的に許容される担体を含む。薬理学的に許容される担体としては、特に限定されるものではないが、例えば、乳糖、デンプン等の賦形剤；デキストリン、セルロース等のバインダー；水、有機溶剤等の溶剤；ワセリン、ミツロウ、パラフィン等の基剤等が挙げられる。

医薬組成物における有効成分の配合割合は、特に限定されるものではないが、医薬組成物全体に対して、毒素産生抑制剤が例えば０．００１〜５０重量％である。

さらに、本発明の医薬組成物は、前記の有効成分に加えて、抗生物質、ビタミン類（例えば、ビタミンＣ、ビタミンＥ）、アミノ酸類、ペプチド類、ミネラル類（例えば、亜鉛、鉄、銅、マンガンなど）、核酸、多糖類、脂肪酸類、生薬等を任意に含有しても良い。抗生物質としては、特に制限されるものではないが、例えばペニシリンやアンピシリン等のペニシリン系抗生物質、セファマイシン等のセフェム系抗生物質、バンコマイシン等のグリコペプチド系抗生物質、メロペネム等のカルバペネム系抗生物質、クロラムフェニコール系抗生物質、テトラサイクリン、ドキシサイクリン等のテトラサイクリン系抗生物質、エリスロマイシン等のマクロライド系抗生物質等が挙げられる。

本発明の医薬組成物の用量は、処置すべき症状や病態、年齢等によって適宜変更すればよいが、例えば有効成分として０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重である。

本発明の医薬組成物は、ヒトまたは非ヒト動物のいずれに投与されるものであっても良い。

［飲食品］
本発明の第５の形態は、式（１）で表わされるペプチド、またはクロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液もしくは前記培養液の乾燥物を有効成分として含有する毒素産生抑制剤を含む、飲食品を提供する。本発明の別の実施形態では、式（２）で表わされるペプチド、またはクロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液もしくは前記培養液の乾燥物を有効成分として含有する毒素産生抑制剤を含む、飲食品を提供する。本発明のある実施形態では、クロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液を遠心分離して得られる菌（菌体および／もしくは芽胞）を含む沈殿もしくは上清、または前記沈殿もしくは前記上清の乾燥物を有効成分として含有する毒素産生抑制剤を含む、飲食品を提供する。

本発明に係る毒素産生抑制剤を含む飲食品は、飲食品を摂取した生体内のみならず、摂取前の食品中において、クロストリジウム属の菌が毒素を産生することをも抑制しえる。クロストリジウム属の菌は耐熱性の芽胞を形成するため、加熱によっても容易には殺菌されない。従って、本発明は、加熱殺菌が困難であったり、加熱殺菌が不十分であったりする飲食品においても、クロストリジウム属の菌の毒素産生を抑制し得るという点において利点がある。

本発明において、「飲食品」は、医薬以外のものであって、哺乳動物が経口摂取可能な形態のものであれば特に制限はなく、その形態も液状物（溶液、懸濁液、乳濁液など）、半液体状物、粉末、または固体成形物のいずれのものであってもよい。このため飲食品は、例えば飲料の形態であってもよく、また、サプリメントのような栄養補助食品の錠剤形態であってもよい。

飲食品として具体的には、例えば、即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品などの即席食品類；清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、栄養飲料、アルコール飲料などの飲料類；パン、パスタ、麺、ケーキミックス、唐揚げ粉、パン粉などの小麦粉製品；飴、キャラメル、チューイングガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、デザート菓子などの菓子類；ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、たれ類、ドレッシング類、つゆ類、カレー・シチューの素類などの調味料；加工油脂、バター、マーガリン、マヨネーズなどの油脂類；乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、アイスクリーム類、クリーム類などの乳製品；魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品などの水産加工品；畜肉ハム・ソーセージなどの畜産加工品；農産缶詰、ジャム・マーマレード類、漬け物、煮豆、シリアルなどの農産加工品；冷凍食品；栄養食品などが挙げられる。

本発明に係る飲食品は、クロストリジウム属の菌による健康被害を受けているか、またはそのリスクが高い者に対して好適に使用することができる。ここで、リスクが高い者としては、例えば、体組成や食生活をはじめとする各種の指標を考慮して、または、健康診断等の診断・診察から、当該リスクが高いと判断された者や、そのようなリスクが高いと本人または周囲の者から認識されるに至った者が含まれる。

本発明において「飲食品」には、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、疾病リスク低減表示が付された食品、または、病者用食品のような分類のものも包含される。

本発明の飲食品においては、上述した有効成分に加えて、他の機能を有する成分をさらに添加してもよい。また例えば、日常生活で摂取する食品、健康食品、機能性食品、サプリメント（例えば、カルシウム、マグネシウム等のミネラル類、ビタミンＫ等のビタミン類を１種以上含有する食品）に本発明の有効成分を配合することにより、本発明による効果に加えて、他の成分に基づく機能を併せ持つ飲食品を提供することができる。

飲食品における有効成分の配合割合は、特に限定されるものではないが、飲食品乾燥重量に対して、毒素産生抑制剤が例えば０．００１〜５０重量％である。

［飼料］
本発明の第６の形態は、式（１）で表わされるペプチド、またはクロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液もしくは前記培養液の乾燥物を有効成分として含有する毒素産生抑制剤を含む、飼料を提供する。本発明の別の実施形態では、式（２）で表わされるペプチド、またはクロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液もしくは前記培養液の乾燥物を有効成分として含有する毒素産生抑制剤を含む、飼料を提供する。本発明のある実施形態では、クロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液を遠心分離して得られる菌（菌体および／もしくは芽胞）を含む沈殿もしくは上清、または前記沈殿もしくは前記上清の乾燥物を有効成分として含有する毒素産生抑制剤を含む、飼料を提供する。

本発明に係る飼料は、非ヒト動物、例えばイヌ、ネコ等のペット；マウス、ラット等の実験動物；ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、アイガモ、キジ等の家禽類；ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜；サケ、アユ、マグロ、ブリ、ヒラメ、タイ、ウナギ、エビ類等の魚介類などに投与されるものであるが、これらに限定されない。

クロストリジウム属の菌による健康被害として、特にニワトリをはじめとする家禽類におけるウェルシュ菌感染症が例示できる。ブロイラー生産におけるウェルシュ菌の感染症による被害は深刻であり、ときには斃死率が５０％に至ることもある。本発明に係る毒素産生抑制剤を含む飼料を投与することにより、家禽類におけるウェルシュ菌感染症を有効に予防、抑制および／または治療することが期待される。

本発明の飼料の原料としては、特に限定されないが、例えばトウモロコシ、こうりゃん、大麦、小麦、コメ、小麦粉、米粉、大豆粉、米ぬか、大豆粕、なたね粕、ふすま、コーングルテンミール、コーングルテンフィード、脱脂粉乳、魚粉、デンプン、セルロース、ビタミン類、ビール酵母、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等である。飼料形状も特に制限されず、例えばペレット、粉末飼料、固形飼料、液体飼料、サイレージ等に上述の毒素産生抑制剤を添加するなど、任意に設定できる。飼料における有効成分の配合割合は、特に限定されるものではないが、飼料乾燥重量に対して、毒素産生抑制剤が例えば０．０１〜１０重量％である。

［実施態様］
（１） 下記式（１）：

式（１）中、Ｒ^１は水素原子、アミノ酸およびその誘導体、ならびに置換または無置換の、炭素数１〜１０のアシル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびフェニルイソチオシアネート基からなる群から選択され、Ｘ^１およびＸ^２はそれぞれ独立にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^３およびＸ^４は任意のアミノ酸である、ただし、Ｘ^２がＰｈｅのときはＸ^４がＴｈｒであり、Ｘ^４がＡｌａのときはＸ^１がＡｌａであり、Ｘ^４がＴｈｒのときはＸ^３がＴｒｐまたはＡｌａである；
で表わされるペプチド。

（２） 前記式（１）中、Ｘ^２がＰｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択される、（１）に記載のペプチド。

（３） 前記式（１）中、Ｘ^４がＨｉｓ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＳｅｒからなる群から選択される、（１）または（２）に記載のペプチド。

（４） 前記式（１）中、Ｒ^１が水素原子、またはベンジルオキシカルボニル基である、（１）〜（３）のいずれか１つに記載のペプチド。

（５） 前記式（１）中、Ｘ^３がＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる群から選択される、（１）〜（４）のいずれか１つに記載のペプチド。

（６） 前記式（１）中、Ｘ^１がＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択される、（１）〜（５）のいずれか１つに記載のペプチド。

（７） 下記式（２）：

式（２）中、Ｒ^２は水素原子、アミノ酸およびその誘導体、ならびに置換または無置換の、炭素数１〜１０のアシル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびフェニルイソチオシアネート基からなる群から選択され、Ｘ^５およびＸ^６はそれぞれ独立にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^７およびＸ^８は任意のアミノ酸であり、ＺはＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなる群から選択される、ただし、Ｘ^６がＰｈｅのときはＸ^８がＴｈｒであり、Ｘ^８がＡｌａのときはＸ^５がＡｌａであり、Ｘ^８がＴｈｒのときはＸ^７がＴｒｐまたはＡｌａである；
で表わされるペプチド。

（８） 前記式（２）中、ＺがＣｙｓである、（７）に記載のペプチド。

（９） 前記式（２）中、Ｘ^６がＰｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択される、（７）または（８）に記載のペプチド。

（１０） 前記式（２）中、Ｘ^８がＨｉｓ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＳｅｒからなる群から選択される、（７）〜（９）のいずれか１つに記載のペプチド。

（１１） 前記式（２）中、Ｒ^２が水素原子、またはベンジルオキシカルボニル基である、（７）〜（１０）のいずれか１つに記載のペプチド。

（１２） 前記式（２）中、Ｘ^７がＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる群から選択される、（７）〜（１１）のいずれか１つに記載のペプチド。

（１３） 前記式（２）中、Ｘ^５がＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択される、（７）〜（１２）のいずれか１つに記載のペプチド。

（１４） （１）〜（１３）のいずれか１つに記載のペプチドを有効成分として含有する、クロストリジウム属の菌の毒素産生抑制剤。

（１５） クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）を培養した培養液または前記培養液の乾燥物を有効成分として含有する、クロストリジウム属の菌の毒素産生抑制剤。

（１６） 前記クロストリジウム・ブチリカムが、クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ ５８８（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ＭＩＹＡＩＲＩ ５８８、ＦＥＲＭ ＢＰ−２７８９）である、（１５）に記載のクロストリジウム属の菌の毒素産生抑制剤。

（１７） 前記クロストリジウム属の菌が、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）である、（１４）〜（１６）のいずれか１つに記載の毒素産生抑制剤。

（１８） （１４）〜（１７）のいずれか１つに記載の毒素産生抑制剤を含む、医薬組成物。

（１９） （１４）〜（１７）のいずれか１つに記載の毒素産生抑制剤を含む、飲食品。

（２０） （１４）〜（１７）のいずれか１つに記載の毒素産生抑制剤を含む、飼料。

本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。なお、特記しない限り、作業は室温（２５℃）で行った。

＜実施例１＞
下記の手法により、式（１）で表わされるペプチド（環状ＣＦＷＡＨ）を合成し、ウェルシュ菌に対する毒素産生抑制活性を確認した。

［ペプチドの合成］
以下の方法により、直鎖状のペプチド（ペプチド配列：Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ（配列番号１））を合成した。なお、カイザーテストには、Ｋａｉｓｅｒ ｔｅｓｔ ｋｉｔ（国産化学社製）を用いた。
（１）０．３ｍｍｏｌ相当の樹脂（Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（１−Ｔｒｔ）−Ｗａｎｇレジン）（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製）を量り取り、ペプチド合成用の振とう管に入れた。
（２）６ｍｌのＤＭＦ（関東化学社製）を加えて６０分振とうし、樹脂を膨潤させた。
（３）６ｍｌのＤＭＦで樹脂を３回洗浄した。
（４）１２ｍｌの２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン（関東化学社製）／ＤＭＦで樹脂を洗浄した。
（５）６ｍｌの２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＤＭＦを添加し、６０分振とうした。
（６）カイザーテストを行った。
（７）６ｍｌのＤＭＦで樹脂を３回洗浄した。
（８）６ｍｌのＮＭＰ（Ｎ−メチル−２−ピロリジニン、関東化学社製）で３回洗浄した。
（９）以下の試薬をそれぞれ別の試験管で調製した。
Ｆｍｏｃ−アミノ酸 ０．９ｍｍｏｌ／ＮＭＰ ３ｍｌ
ＤＣＣ（関東化学社製） ０．９ｍｍｏｌ／ＮＭＰ １．５ｍｌ
ＨＯＢＴ・Ｈ_２Ｏ ０．９ｍｍｏｌ／ＮＭＰ １．５ｍｌ
（ＨＯＢＴ・Ｈ_２Ｏ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、国産化学社製）
なお、Ｆｍｏｃ−アミノ酸としては、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（以上、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（国産化学社製）を、この順番で用いた。Ｂｏｃはｔ−ブチルオキシカルボニル基を、Ｔｒｔはトリチル基を指す。
（１０）上記３種の試薬を振とう管に加え、３時間以上振とうした。
（１１）カイザーテストによって脱保護反応を確認した。
（１２）６ｍｌのＮＭＰで３回、６ｍｌのＤＭＦで３回、樹脂を洗浄した。
（１３）（３）から（１２）までの操作を計４回繰り返し、ペプチドを伸長させた。
（１４）６ｍｌのメタノール（ナカライテスク社製）で樹脂を３回洗浄した。
（１５）得られた樹脂付きペプチドを、真空乾燥機にて乾燥させた。

なお、表６におけるアミノ酸６〜８残基のペプチドについても、上述の方法に準じて、使用するＦｍｏｃ−アミノ酸を適宜追加して合成した。

［樹脂および側鎖の保護基の除去］
上述の方法により得られた樹脂付きペプチドについて、側鎖の保護基および樹脂の除去反応を行った。
（１）乾燥させた樹脂付きペプチド５０ｍｇをフラスコに入れ、以下の組成の切断カクテルを加えて室温で６０分間攪拌した。

（２）ＰＴＦＥ膜（φ０．２μｍ、関東化学社製）で濾過し、６０ｍｌの冷ジエチルエーテル（関東化学社製）を添加した。
（３）４℃で一晩静置し、ペプチドを析出させた。
（４）ＰＴＦＥ膜（φ４．５μｍ、４７ｍｍ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）で吸引濾過し、析出したペプチドを回収した。
（５）回収したペプチドを、５００μｌのＤＭＳＯに溶解し、Ｓｅｐ−ｐａｋ（登録商標）（Ｃ１８）ｐｌｕｓカラム（ウォーターズ社製）により精製し、６０％（ｖ／ｖ）ＣＨ_３ＣＮ／超純水溶出画分を回収した。
（６）６０％（ｖ／ｖ）ＣＨ_３ＣＮ／超純水溶出画分を濃縮乾固し、凍結乾燥することにより、側鎖の保護基および樹脂を除去した直鎖状のペプチドを得た。

［ペプチドの環化］
上述の方法により得られた直鎖状のペプチドを、以下の方法により環化し、チオラクトン構造を有するペプチド（環状Ｆｍｏｃ−ＣＦＷＡＨ）を合成した。
（１）直鎖状ペプチド１０ｍｇをフラスコに量り取り、４ｍｌのＮ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）（関東化学社製）を加えて溶解させた。
（２）２０ｍｇのＰｙＢＯＰ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製）と２０ｍｇのジメチルアミノピリジン（Ｍｅｒｃｋ社製）を添加した。
（３）Ｎ_２ガスを充填し、室温で攪拌しながら１０時間程度攪拌した。
（４）８０ｍｌの氷冷超純水に、反応液を少しずつ添加した。
（５）Ｓｅｐ−ｐａｋ（登録商標）（Ｃ１８）ｐｌｕｓカラム（ウォーターズ社製）により精製し、６０％（ｖ／ｖ）ＣＨ_３ＣＮ／超純水溶出画分を回収した。
（６）試料を濃縮乾固、凍結乾燥した後、１ｍｌのＤＭＳＯに溶解させた。
（７）逆相ＨＰＬＣにより、試料を精製した。逆相ＨＰＬＣの測定条件は以下の通りである。
使用機器：ＬＣ−２０００Ｐｌｕｓシリーズ（日本分光社製）
カラム ：Ｉｎｔｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３ ２０×１５０ｍｍ（ＧＬサイエンス社製）流速 ：１０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：２８０ｎｍ

逆相ＨＰＬＣによるクロマトグラムを図１に示す。各フラクションをＥＳＩ−ＭＳに供したところ、フラクション４において目的の分子イオンピークが［Ｍ＋Ｈ］^＋ ｍ／ｚ＝８６７に確認された。フラクション４のＥＳＩ−ＭＳによる分析結果を図２に示す。ＥＳＩ−ＭＳの分析条件を以下に示す。

（ＥＳＩ−ＭＳの分析条件）
使用機器 ：液体クロマトグラフ飛行時間型質量分析計ＪＭＳ−Ｔ１００ＬＣ（日本電子社製）
溶媒 ：Ａ液：超純水／０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ、Ｂ液：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ
流速 ：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
サンプル注入量：約５μｌ
混合比率 ：Ｂ液＝２０％
（８）逆相ＨＰＬＣにおけるフラクション４を濃縮乾固した後、凍結乾燥し、環状ペプチド（環状Ｆｍｏｃ−ＣＦＷＡＨ）を得た。

［Ｎ末端保護基（Ｆｍｏｃ）の除去］
上述の方法により得られた環状のペプチドを、短時間ピペリジンで処理することにより、Ｎ末端保護基（Ｆｍｏｃ）を除去した。
（１）０．１ｍｇの環状Ｆｍｏｃ−ＣＦＷＡＨを２０μｌのＤＭＦに溶解し、２０μｌの２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン（国産化学社製）／ＤＭＦを添加して３分間室温で静置した。
（２）３６０μｌの１５％（ｖ／ｖ）ＣＨ_３ＣＮ／１％（ｖ／ｖ）酢酸（シグマ・アルドリッチ社製）を添加した。
（３）反応液をＳｅｐ−ｐａｋ（登録商標）（Ｃ１８）ｐｌｕｓカラム（ウォーターズ社製）により精製し、６０％（ｖ／ｖ）ＣＨ_３ＣＮ／超純水溶出画分を回収した。
（４）試料を濃縮乾固、凍結乾燥した後、１ｍｌのＤＭＳＯに溶解させた。
（５）逆相ＨＰＬＣにより、試料を精製した。逆相ＨＰＬＣの測定条件は以下の通りである。
使用機器：ＬＣ−２０００Ｐｌｕｓシリーズ（日本分光社製）
カラム ：Ｉｎｔｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３ ２０×１５０ｍｍ（ＧＬサイエンス社製）
流速 ：１０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：２２０ｎｍ

逆相ＨＰＬＣによるクロマトグラムを図３に示す。各フラクションをＥＳＩ−ＭＳに供したところ、フラクション３２において目的の分子イオンピークが［Ｍ＋Ｈ］^＋ ｍ／ｚ＝６４４に確認された。フラクション３２のＥＳＩ−ＭＳによる分析結果を図４に示す。なお、ＥＳＩ−ＭＳの分析条件は上述のとおりである。
（８）逆相ＨＰＬＣにおけるフラクション３２を濃縮乾固した後、凍結乾燥し、式（１）で表わされるチオラクトン構造を有する環状ペプチド（環状ＣＦＷＡＨ）を得た。

なお、表６におけるアミノ酸６〜８残基のペプチドについても、上述の方法に準じて、チオラクトン構造を有する環状ペプチドとして得た。表６において、環状Ｆｍｏｃ−ＣＦＷＡＨ（ペプチド５ｎ）およびペプチド６ｎが本発明に相当する。

また、上記合成方法において、工程（１）のピペリジンによる脱保護の時間を３分から１５分に延長することで、式（２）で表わされるラクタム構造を有するペプチドを優先的に得ることができる。

［ウェルシュ菌に対する環状ＣＦＷＡＨの毒素産生抑制活性］
ウェルシュ菌ｓｔｒａｉｎ １３（金沢大学大学院医学系研究科・細菌感染症制御学講座保存株）を１０ｍｌのＴＳＦ培地（トリプトン４０ｇ、ソイトン４ｇ、フルクトース５ｇ／Ｌ）にて、３７℃で６時間培養した。その後、５００μｌの培養液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ×５分）し、菌体を回収した。

菌体ペレットを５００μｌのＴＳＦ培地にて再懸濁した。チオラクトン構造を有する下記の５〜８残基の環状ペプチドをＤＭＳＯに溶解し、それぞれ最終１０μＭになるように培地に加え、３７℃にて２．５時間インキュベートした。その後、ホットフェノール法によりトータルＲＮＡを調製した。すなわち、２ｍｌのウェルシュ菌培養液を１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去した。菌体を２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１００μｌの溶液Ａに懸濁した。さらに１００μｌのクエン酸飽和フェノール（ｐＨ４．３）を混和して、６５℃恒温槽にて５分間振とうさせた。その後、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して水層を回収し、エタノール沈殿にてＲＮＡを析出させ、トータルＲＮＡを調製した。調製したトータルＲＮＡは、５０μｌの水に溶解させた。

シーター−毒素（ｐｆｏＡ）遺伝子プローブを用いて、ノーザンブロット解析を行った。すなわち、調製したトータルＲＮＡ １０μｇを尿素にて変性し、アガロース電気泳動にて分離し、ナイロンメンブレンに転写した。ＡｌｋＰｈｏｓ−Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、ＰＣＲで増幅（配列番号１０および１１のプライマーを使用、鋳型：ウェルシュ菌ｓｔｒａｉｎ １３のゲノムＤＮＡ、ポリメラーゼ：ＥＸ―Ｔａｑ（タカラバイオ社製）、ＰＣＲ条件：９８℃×３分、９８℃×３０秒→５２℃×３０秒→６８℃×３０秒，３０サイクル）した毒素遺伝子ＤＮＡをラベル化した。ナイロンメンブレン上の遺伝子を、ラベル化ＤＮＡ（プローブ）とＲａｐｉｄ−ｈｙｂバッファー中（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で５５℃で２時間ハイブリダイズさせた。２×ＳＳＰＥバッファー／０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳおよび０．７×ＳＳＣバッファー／０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳでナイロンメンブレンを洗浄した。シグナルの検出には、ＣＤＰｓｔａｒ化学発光法を用いた。

ノーザンブロット解析の結果を図５に示す。図５中、レーン１は１０ｍｌの、レーン２は５００μｌの無添加培地でインキュベートした結果を、レーン３は１０μｌのＤＭＳＯを培地に添加してインキュベートした結果を、レーン４〜７はそれぞれ環状ＣＦＷＡＨ（ペプチド５ｎ）、ペプチド６ｎ、ペプチド７ｎまたはペプチド８ｎを終濃度１０μＭになるように培地に添加してインキュベートした結果を示す。図５に示す通り、環状ＣＦＷＡＨ（ペプチド５ｎ）、またはペプチド６ｎに毒素発現抑制活性がみられ、環状ＣＦＷＡＨ（ペプチド５ｎ）で特に高い活性が認められた。

以上より、式（１）で表わされるペプチドが、クロストリジウム属の菌に対して毒素産生抑制活性を有することが示された。

＜実施例２＞
下記の手法により、クロストリジウム・ブチリカムの培養液による、クロストリジウム属の菌の毒素産生抑制活性を確認した。

［共培養実験］
ウェルシュ菌ｓｔｒａｉｎ １３、クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ ５８８（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ＭＩＹＡＩＲＩ ５８８、ＦＥＲＭ ＢＰ−２７８９、ミヤリサン製薬株式会社より入手）、またはクロストリジウム・ブチリカム・ＡＴＣＣ１９３９８（ＡＴＣＣより購入）をＧＡＭ培地（ＧＡＭブイヨン（日水製薬株式会社製）、組成：５９．０ｇ（１Ｌ分）中、ペプトン１０．０ｇ、ダイズペプトン３．０ｇ、プロテアーゼペプトン１０．０ｇ、消化血清末１３．５ｇ、酵母エキス５．０ｇ、肉エキス２．２ｇ、肝臓エキス１．２ｇ、ブドウ糖３．０ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３．０ｇ、溶性デンプン５．０ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇ、ｐＨ７．１）で一晩、３７℃で培養した。培養液をそれぞれ２ｍｌ採取して遠心分離し（１５，０００ｒｐｍ×５分）、菌体を回収した。菌体ペレットを２ｍｌのＧＡＭ培地にて２回洗浄し、２ｍｌのＧＡＭ培地に懸濁した。

共培養には、カップ付き培養プレート（ＴＨＩＮＣＥＲＴＳ，Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，６５７６４１）を用いた。共培養に使用したプレートの模式図を、図６に示す。培養プレートの各ウェル底面と、各ウェルに挿入されたカップの底面とは、接触していない。カップ底面はポアサイズ０．４μｍの膜で構成されているため、ウェル内の上層（カップ内）と下層（カップ底面より下の領域）とは、ポアサイズ０．４μｍの膜で仕切られている。

培養ウェル内の下層に、４．５ｍｌのＧＡＭ培地および上記で調製した５００μｌのクロストリジウム・ブチリカムの懸濁液（クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ ５８８またはクロストリジウム・ブチリカム・ＡＴＣＣ１９３９８）を加えた。コントロールとして、別のウェルの下層には、上記クロストリジウム・ブチリカムの懸濁液の代わりに５００μｌのＧＡＭ培地を入れた。ウェル内の上層に、４．５ｍｌのＧＡＭ培地を入れ、３７℃で嫌気培養した。クロストリジウム・ブチリカムから産生された物質のうち、膜を通過できる物質は、嫌気培養中に上層のＧＡＭ培地中に拡散する。

培養５時間または７時間後、上記で調製した５００μｌのウェルシュ菌を上層に加え、再度３７℃で嫌気培養（共培養）した。共培養開始から２時間後および３時間後に、カップ上のウェルシュ菌からホットフェノール法にてトータルＲＮＡを調製した。

［マイクロアレイ解析］
マイクロアレイ解析はＯｈｔａｎｉらの方法（Ｏｈｔａｎｉ，Ｋ．ら，Ａｎａｅｒｏｂｅ （２０１０），１６：２５８−２６４）に準じて行った。すなわち、コントロールのウェルシュ菌から調製したトータルＲＮＡをＣｙ５で、クロストリジウム・ブチリカムと共培養したウェルシュ菌から調製したトータルＲＮＡをＣｙ３で、それぞれラベル化した。蛍光色素Ｃｙ３およびＣｙ５はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅより購入した。ラベル化反応には、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（インビトロジェン製）を用いた。

ラベル化ＲＮＡを、ウェルシュ菌カスタムＤＮＡマイクロアレイ（国立大学法人九州大学農学研究院 久原哲教授より分与）にハイブリダイズさせた。マイクロアレイは、ＧＥＯデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）におけるアクセッションナンバーＧＰＬ９７６５のものを使用した。マイクロアレイ上の各遺伝子ＤＮＡスポットの蛍光強度を、マイクロアレイ用スキャナー（富士フィルム社製）にて測定し、各遺伝子の発現比（共培養／コントロール）を計算した。データ解析にはＲおよびｌｉｍｍａ（Ｌｉｎｅａｒ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｄａｔａ）ソフトウェアを用い、ｐ値が０．０５未満のとき、遺伝子発現に有意な変動があったものとみなした。

培養５時間後にウェルシュ菌を上層に加えたときの、マイクロアレイ実験の結果の一部を、表７に示す。表７において、下線のある数値は、クロストリジウム・ブチリカムとの共培養によって遺伝子発現が有意に抑制されているものを示す。クロストリジウム・ブチリカム培養液から拡散した物質がウェルシュ菌に作用し、これらの遺伝子群の発現が抑制されたことを示す。

発現が抑制された遺伝子群には、アルファ−毒素（ｐｌｃ）、カッパ−毒素（ｃｏｌＡ）など、毒素をコードする遺伝子が含まれていた。

［ノーザンブロット解析］
前述のマイクロアレイで確認された遺伝子発現の抑制を、ノーザンブロット解析により確認した。なお、ノーザンブロットは上述の方法にて行った。遺伝子プローブとしては、上述のＰＣＲ法にて調製したアルファ−毒素（ｐｌｃ、配列番号１２および１３のプライマーを使用）、シーター−毒素（ｐｆｏＡ、配列番号１０および１１のプライマーを使用）、カッパ−毒素（ｃｏｌＡ、配列番号１４および１５のプライマーを使用）、毒素調節ＲＮＡ（ＶＲ−ＲＮＡ、図７におけるＶＲ、配列番号１６および１７のプライマーを使用）、およびＶｉｒＲ／ＶｉｒＳシステムに調節される遺伝子（ＣＰＥ０８４５、図７における０８４５、配列番号１８および１９のプライマーを使用）を用いた。

ノーザンブロット解析の結果を図７に示す。図７において、「ＧＡＭ」のレーンは下層にＧＡＭ培地を入れた場合の結果を、「ｓｔ１３」のレーンはウェルシュ菌の単培養の場合の結果を、「Ｍｉｙａ」のレーンはクロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ ５８８と共培養したときの結果を、「ＡＴＣＣ」のレーンはクロストリジウム・ブチリカム・ＡＴＣＣ１９３９８と共培養したときの結果をそれぞれ示す。また、「Ａ５」および「Ｂ５」は、培養５時間後にウェルシュ菌を上層に加えたときの結果を、「Ａ７」および「Ｂ７」は、培養７時間後にウェルシュ菌を上層に加えたときの結果をそれぞれ示す。

図７に示す通り、クロストリジウム・ブチリカムとの共培養によって、いずれの遺伝子も著しく発現が減少していることが確認された。

以上より、クロストリジウム・ブチリカムから培地中に分泌された成分が、クロストリジウム属の菌において毒素産生を抑制することが確認された。従って、クロストリジウム・ブチリカムの培養液が、クロストリジウム属の菌に対して毒素産生抑制活性を有することが示された。また、図７より、クロストリジウム属の菌に対する毒素産生抑制活性は、クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ ５８８において特に優れていることが分かる。

［クロストリジウム・ブチリカムａｇｒＤ遺伝子による毒素遺伝子発現の抑制］
クロストリジウム・ブチリカムａｇｒＤ遺伝子を、ウェルシュ菌内で発現させたときの、ウェルシュ菌の毒素遺伝子発現に対する効果を検討した。

クロストリジウム・ブチリカムのａｇｒＤ領域のＤＮＡ断片を、ＰＣＲにて調製した。ポリメラーゼとしてはＫＯＤ（東洋紡社製）を用い、９５℃×３分、９８℃×１０秒→５２℃×３０秒→６８℃×２分，３０サイクル、の条件にて増幅した。なお、鋳型としては、クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ ５８８から抽出したゲノムＤＮＡを用いた。ＤＮＡ調製は定法に従って行った。プライマーとしては、以下のものを用いた。

ＰＣＲの増幅産物を制限酵素ＳｍａＩで処理し、ウェルシュ菌と大腸菌のシャトルベクターｐＪＩＲ ４１８にクローニングした。

ウェルシュ菌ｓｔｒａｉｎ １３（野生株、図８における「１３／」）または、ａｇｒＤ変異株（ウェルシュ菌ｓｔｒａｉｎ １３由来、図８における「ＴＳ２３０／」）に、クロストリジウム・ブチリカムのａｇｒＤ遺伝子をもつプラスミド（図８における「ａｇｒｂｕ」）または組み換え前のシャトルベクター（図８における「４１８」）をエレクトロポレーション法により導入した。ベクター上にはクロラムフェニコール耐性遺伝子がコードされているので、エレクトロポレーション後は、クロラムフェニコールでプラスミドをもつウェルシュ菌コロニーを選択した。

エレクトロポレーション後、ウェルシュ菌をＧＡＭ培地にて３７℃で培養した。培養開始から３時間後に上述の方法でトータルＲＮＡを調製した。上述の方法に準じてノーザンブロット解析を行い、遺伝子発現を確認した。結果を図８に示す。

図８より、クロストリジウム・ブチリカムａｇｒＤ遺伝子をウェルシュ菌内で発現させることで、ウェルシュ菌のｐｆｏＡ、ｃｏｌＡおよびｐｌｃの発現が低下することが確認された。

以上より、クロストリジウム・ブチリカムのＡｇｒＤが、クロストリジウム属の菌において毒素産生を抑制することが示された。

＜実施例３＞
下記の手法により、式（１）で表わされるペプチド（ＡｇｒＤ_ｃｂ−チオラクトン）および式（２）で表されるペプチド（ＡｇｒＤ_ｃｂ−ラクタム）を合成し、ウェルシュ菌に対する毒素産生抑制活性を確認した。

［ＡｇｒＤ_ｃｂ−チオラクトンの合成］
（１）化学合成されたＴｒｔＲｅｓｉｎ（Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）−ｒｅｓｉｎ）／Ｚ基（ベンジルオキシカルボニル基）付きペプチド（Ｚ基−ＣＦＷＡＨ−ＴｒｔＲｅｓｉｎ）を、株式会社スクラムより購入した。２９０ｍｇの樹脂付き乾燥ペプチドを、上記組成の切断カクテル１０ｍｌに加え、室温で５時間撹拌した。その後、実施例１と同様の方法により樹脂の除去を行い、樹脂を除去した直鎖状のＺ基付きペプチドを得た。
（２）直鎖状のＺ基付きペプチドを用いて、実施例１と同様の方法によりＰｙＢＯＰを用いた脱水環化反応を行った。これにより、環状Ｚ基−ＣＦＷＡＨを得た。
（３）次に、ＴＦＡ／チオアニソールを用いてＮ末端保護基であるＺ基を除去した。すなわち１１ｍｇの上記環状Ｚ基−ＣＦＷＡＨを、下記の切断カクテル（２）に加え、室温で１２．５時間撹拌した。

（４）氷冷した２００ｍｌの５％（ｖ／ｖ）ＣＨ_３ＣＮ／超純水／０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡに反応液を少量ずつ添加し、反応を停止させた。
（５）反応液をＳｅｐ−ｐａｋ（登録商標）（Ｃ１８）ｐｌｕｓカラム（ウォーターズ社製）により精製し、３０％（ｖ／ｖ）ＣＨ_３ＣＮ／超純水／０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ溶出画分を回収した。
（６）試料を濃縮乾固、凍結乾燥した後、ＤＭＳＯに溶解させた。
（７）上記の条件で逆相ＨＰＬＣによる精製を行った後、試料を乾固させてＡｇｒＤ_ｃｂ−チオラクトン（ＣＦＷＡＨ）を得た。

［ＡｇｒＤ_ｃｂ−ラクタムの合成］
次に、アルカリ転化反応により式（２）で表されるペプチド（ＡｇｒＤ_ｃｂ−ラクタム）を合成した。
（１）上記の方法で合成したＡｇｒＤ_ｃｂ−チオラクトンをＤＭＳＯに溶解し、１０μｇ／μｌ溶液を調製した後、超純水を加えて３μｇ／μｌ溶液に希釈した。
（２）１０μｌの上記溶液に、２８％（ｗ／ｗ）アンモニア水溶液１０μｌを加え、３７℃で３０分間反応させた。
（３）反応液に０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液１２０μｌを加えて反応を停止させた後、５％酢酸を用いてｐＨを約７に調整した。
（４）上記の条件で逆相ＨＰＬＣによる精製を行い、得られた各フラクション中を上記条件にてＥＳＩ−ＭＳにより分析し、目的のｍ／ｚ＝６４５を含むフラクションを回収した。
（５）得られたペプチドフラクションを乾固し、ＡｇｒＤ_ｃｂ−ラクタム（ＣＦＷＡＨ）を得た。

［ウェルシュ菌に対する環状ＣＦＷＡＨの毒素産生抑制活性］
ＡｇｒＤ_ｃｂ−チオラクトンおよびＡｇｒＤ_ｃｂ−ラクタムを用いて、ウェルシュ菌の毒素産生抑制活性を評価した。

ウェルシュ菌ｓｔｒａｉｎ １３を２ｍｌのＧＡＭ培地にて、３７℃で５時間培養した。その後、終濃度１０μＭのＡｇｒＤ_ｃｂ−チオラクトンまたはＡｇｒＤ_ｃｂ−ラクタムを含むＴＳＦ培地にウェルシュ菌培養液を添加し、３７℃で２．５時間培養した。その後、培養液を遠心分離して菌体を回収した後、実施例１と同様の方法によりトータルＲＮＡを調製した。対照区として、本発明にかかるペプチドを含まない培地で培養したウェルシュ菌から調製したトータルＲＮＡを用いた。

定量ＰＣＲを行い、ウェルシュ菌におけるシーター−毒素（ｐｆｏＡ）をコードする遺伝子発現を評価した。なお、定量ＰＣＲには配列番号２７（ＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＣＴＴＡＴＧＧ）および配列番号２８（ＧＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＴＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧ）のプライマー、およびＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ（登録商標） ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ ＩＩ （Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製）を用いた。ハウスキーピング遺伝子としては、１６Ｓ ｒＲＮＡを用いた（配列番号２９：ＡＧＴＴＡＣＡＧＴＣＣＡＧＡＧＡＧＴＣＧ、配列番号３０：ＴＡＴＣＴＡＧＡＧＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＧ）。測定は、リアルタイムＰＣＲシステム Ｍｘ３０００Ｐ ＱＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アジレントテクノロジー社製）にて４２℃×５分→９５℃×１０秒→（９５℃×５秒→６０℃×２０秒→７２℃×３２秒）×４０サイクルの条件で行った。結果を図９に示す。

図９に示す通り、ＡｇｒＤ_ｃｂ−チオラクトンおよびＡｇｒＤ_ｃｂ−ラクタムによって、ウェルシュ菌のシーター−毒素（ｐｆｏＡ）をコードする遺伝子発現が抑制されていることがわかる。ウェルシュ菌シーター−毒素（ｐｆｏＡ）をコードする遺伝子の発現量を指標として、ＡｇｒＤ_ｃｂ−チオラクトンおよびＡｇｒＤ_ｃｂ−ラクタムについて、毒素産生抑制活性のＩＣ_５０を求めたところ、両者とも１０μＭであった。

ＡｇｒＤ_ｃｂ−チオラクトンは少ない合成ステップで得られるという利点がある。一方、ＡｇｒＤ_ｃｂ−ラクタムはＡｇｒＤ_ｃｂ−チオラクトンよりも構造的に安定であるという利点がある。

＜実施例４＞
実施例（３）の手法に準じて、式（１）におけるＲ^１、およびＸ^１〜Ｘ^４がそれぞれ表９のアミノ酸であるチオラクトン構造を有する環状ペプチドを合成し、ウェルシュ菌シーター−毒素（ｐｆｏＡ）をコードする遺伝子発現を定量ＰＣＲ測定した。なお、表９におけるＺ基（ベンジルオキシカルボニル基）付きペプチドは、上記のＰｙＢＯＰを用いた脱水環化反応後、ＴＦＡ／チオアニソールを行わずに、Ｓｅｐ−ｐａｋ（登録商標）（Ｃ１８）ｐｌｕｓカラム（ウォーターズ社製）および逆相ＨＰＬＣにて精製することにより得た。

ウェルシュ菌シーター−毒素（ｐｆｏＡ）をコードする遺伝子の発現量を指標として、各環状ペプチドの毒素産生抑制活性についてＩＣ_５０を求めた。なお、表９において、「アゴニスト」はｐｆｏＡ遺伝子発現が上昇した（アゴニスト活性を有する）ことを、「活性なし」は毒素産生抑制活性（アンタゴニスト活性）またはアゴニスト活性のいずれも確認されなかったことを示す。

アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性の発現には、ＶｉｒＳに対してペプチドが結合できる（結合活性を有する）ことが必要であると考えられる。表９において、Ｚ基−ＣＬＷＦＴ−Ｂｚｌ基（ウェルシュ菌のアミノ酸配列）、およびＺ基−ＣＬＷＦＡにおいてアゴニスト活性が、また、Ｚ基−ＣＡＷＡＡ、Ｚ基−ＣＬＷＡＴ、およびＺ基−ＣＬＦＷＴにおいてアンタゴニスト活性が認められた一方で、Ｚ基−ＣＬＡＦＴにおいてはアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性のいずれも認められなかった。この結果から、Ｘ^２が芳香族アミノ酸であることにより、ＶｉｒＳに対する結合活性が向上するものと考えられる。

Ｚ基−ＣＬＷＦＴ−Ｂｚｌ基（ウェルシュ菌のアミノ酸配列）はアゴニストである一方、Ｚ基−ＣＬＷＦＳはアンタゴニストであった。この結果から、Ｘ^４がＴｈｒであることがアゴニスト活性に必要であると考えられる。

＜実施例５＞
クロストリジウム・ブチリカムがＡｇｒＤを細胞外へ分泌していること確認した。

まず、以下の条件で培養を行い、分析用サンプルを回収した。すなわち、１０ｍＬのブレインハートインフュージョン培地（ＢＨＩ培地）（ＢＤ社製）にクロストリジウム・ブチリカム ＭＩＹＡＩＲＩ ５８８を１コロニー接種し、嫌気チャンバー内（窒素８０％／水素１０％／二酸化炭素１０％）、３７℃で一晩培養した。培養液を６００ｍＬのＢＨＩ培地（１Ｌの三角コルベン使用）に１％接種し、嫌気チャンバー内（３７℃）で培養した。培養中、ＯＤ６６０ｎｍを継時で測定し、ＯＤ６６０ｎｍが０．２０９（培養３．７５時間、対数増殖期前期、図１０におけるａ）、０．６６０（培養４．５時間、対数増殖期中期、図１０におけるｂ）、１．６４８（培養５．１時間、対数増殖期後期、図１０におけるｃ）、および１．１３０（培養２４時間、対数増殖静止期、図１０におけるｄ）のタイミングで培養液を回収した。回収の際は、１２０ｍＬの培養液を分取し、５０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収して分析用サンプルとした。培養時のＯＤ値の変化を、図１０に示す。

次に、回収した培養上清０．４ｍｌにアンモニア水溶液（２８％（ｗ／ｗ））１０μｌと２−メルカプトエタノール１．５μｌを添加して、３７℃で３時間インキュベートした（アンモニア処理）。反応液に０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを１２０μｌ添加して中和した後、酢酸エチル６０μｌを加え、撹拌混和後に８０００ｒｐｍ×５分（４℃）で遠心分離した。酢酸エチル層を回収し、酢酸エチルを留去した後、回収した固形分をＤＭＳＯ５０μｌに溶解してＥＳＩ−ＭＳ分析に供した。

（ＥＳＩ−ＭＳの分析条件）
使用機器 ：液体クロマトグラフ飛行時間型質量分析計ＪＭＳ−Ｔ１００ＬＣ（日本電子社製）
カラム ：ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ１８， ５μｍ， ２．１×５０ｍｍ（アジレントテクノロジー社製）
溶媒 ：Ａ液：超純水／０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ、Ｂ液：ＣＨ_３ＣＮ／０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ
検出質量数 ：ｍ／ｚ＝６４５
流速 ：０．２ ｍｌ／分
ＨＰＬＣ溶出条件：

ＥＳＩ−ＭＳの分析結果を図１１に示す。図１１中のａ〜ｄは、それぞれ図１０におけるａ〜ｄの時点で回収したサンプルであることを示す。

図１１に示す通り、対数増殖期中期以降においてｍ／ｚ＝６４５に目的のピークが検出された。ピーク強度は対数増殖後期では増加し、静止期でも同等の強度のピークが検出された。なお、培養液をアンモニア処理せずに同様の方法にて分析したところ、ｍ／ｚ＝６４５に目的のピークは観察されなかった。よって、ｍ／ｚ＝６４５のピークは、培養液中に分泌された環状ＣＦＷＡＨ（チオラクトン）が、上記のアンモニア処理によってラクタムに転化したものであると考えられる。

以上より、クロストリジウム・ブチリカム ＭＩＹＡＩＲＩ ５８８は環状ＣＦＷＡＨ（チオラクトン）を培養液中に分泌していると推定された。

分泌された環状ＣＦＷＡＨ（チオラクトン）を含むクロストリジウム・ブチリカムの培養液は、おそらくはＶｉｒＳに対してアンタゴニストとして機能することにより、ウェルシュ菌の毒素産生を抑制するものと考えられる。

好ましい実施形態の上記実施例および説明は、特許請求の範囲によって定義される本発明を限定するものというより、例示するものとして解釈されるべきである。本明細書で引用された全ての刊行物は、その全体が本明細書中に参照によって組込まれる。容易に理解されるように、上述した特徴の多数の変形および組み合わせは、特許請求の範囲に記載の本発明から逸脱することなく利用されることができる。そのような変形は、本発明の範囲からの逸脱とはみなされず、全てのそのような変形は、特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

本出願は、２０１４年２月７日に出願された日本特許出願番号２０１４−０２２８１１号、および２０１４年１０月１６日に出願された日本特許出願番号２０１４−２１１９６２号に基づいており、その開示内容は、参照され、全体として、組み入れられている。

〔配列番号：５〕
アミノ酸６残基からなる環状ペプチド。
〔配列番号：６〕
アミノ酸７残基からなる環状ペプチド。
〔配列番号：７〕
アミノ酸８残基からなる環状ペプチド。
〔配列番号：８〕
クロストリジウム・ブチリカムａｇｒＤを含むＤＮＡ断片の増幅のためのＰＣＲプライマー配列。
〔配列番号：９〕
クロストリジウム・ブチリカムａｇｒＤを含むＤＮＡ断片の増幅のためのＰＣＲプライマー配列。
〔配列番号：１０〕
ウェルシュ菌ｐｆｏＡを含むＤＮＡ断片の増幅のためのＰＣＲプライマー配列。
〔配列番号：１１〕
ウェルシュ菌ｐｆｏＡを含むＤＮＡ断片の増幅のためのＰＣＲプライマー配列。
〔配列番号：１２〕
ウェルシュ菌ｐｌｃを含むＤＮＡ断片の増幅のためのＰＣＲプライマー配列。
〔配列番号：１３〕
ウェルシュ菌ｐｌｃを含むＤＮＡ断片の増幅のためのＰＣＲプライマー配列。
〔配列番号：１４〕
ウェルシュ菌ｃｏｌＡを含むＤＮＡ断片の増幅のためのＰＣＲプライマー配列。
〔配列番号：１５〕
ウェルシュ菌ｃｏｌＡを含むＤＮＡ断片の増幅のためのＰＣＲプライマー配列。
〔配列番号：１６〕
ウェルシュ菌ＶＲ−ＲＮＡを含むＤＮＡ断片の増幅のためのＰＣＲプライマー配列。
〔配列番号：１７〕
ウェルシュ菌ＶＲ−ＲＮＡを含むＤＮＡ断片の増幅のためのＰＣＲプライマー配列。
〔配列番号：１８〕
ウェルシュ菌ＣＰＥ０８４５を含むＤＮＡ断片の増幅のためのＰＣＲプライマー配列。
〔配列番号：１９〕
ウェルシュ菌ＣＰＥ０８４５を含むＤＮＡ断片の増幅のためのＰＣＲプライマー配列。
〔配列番号：２７〕
ウェルシュ菌ｐｆｏＡの定量ＰＣＲ用プライマー配列。
〔配列番号：２８〕
ウェルシュ菌ｐｆｏＡの定量ＰＣＲ用プライマー配列。
〔配列番号：２９〕
ウェルシュ菌１６Ｓ ｒＲＮＡの定量ＰＣＲ用プライマー配列。
〔配列番号：３０〕
ウェルシュ菌１６Ｓ ｒＲＮＡの定量ＰＣＲ用プライマー配列。

Claims (13)

1. 下記式（１）：
   
   式（１）中、Ｒ^１は水素原子、アミノ酸、オルニチン、サルコシン、デスモシン、イソデスモシン、ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸および３−アミノイソ酪酸、ならびに置換または無置換の、炭素数１〜１０のアシル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびフェニルイソチオシアネート基からなる群から選択され、Ｘ ^１ 、Ｘ ^２ 、Ｘ ^３ およびＸ ^４ が下記（１−１）〜（１−４）のいずれかで表わされるペプチド：
   （１−１） Ｘ^１ はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ ^２ はＰｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^３はＡｌａであり、Ｘ^４はＨｉｓ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、およびＳｅｒからなる群から選択される、ただし、Ｘ^２がＰｈｅのときはＸ^４がＴｈｒであり、Ｘ^４がＡｌａのときはＸ^１がＡｌａである；
   （１−２） Ｘ ^１ はＡｌａであり、Ｘ ^２ はＴｒｐであり、Ｘ ^３ はＰｈｅであり、Ｘ ^４ はＡｌａである；
   （１−３） Ｘ ^１ はＬｅｕであり、Ｘ ^２ はＴｒｐであり、Ｘ ^３ はＰｈｅであり、Ｘ ^４ はＳｅｒである；
   （１−４） Ｘ ^１ はＬｅｕであり、Ｘ ^２ はＰｈｅであり、Ｘ ^３ はＴｒｐであり、Ｘ ^４ はＴｈｒである。
2. 前記式（１）中、Ｒ^１が水素原子、またはベンジルオキシカルボニル基である、請求項１に記載のペプチド。
3. 前記（１−１）において、Ｘ^１がＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択される、請求項１または２に記載のペプチド。
4. 前記（１−１）において、Ｘ ^１ 、Ｘ ^２ 、Ｘ ^３ およびＸ ^４ が下記（１−５）〜（１−８）のいずれかで表わされる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド：
   （１−５） Ｘ ^１ はＰｈｅであり、Ｘ ^２ はＴｒｐであり、Ｘ ^３ はＡｌａであり、Ｘ ^４ はＨｉｓである；
   （１−６） Ｘ ^１ はＬｅｕであり、Ｘ ^２ はＴｒｐであり、Ｘ ^３ はＡｌａであり、Ｘ ^４ はＴｈｒである；
   （１−７） Ｘ ^１ はＡｌａであり、Ｘ ^２ はＴｒｐであり、Ｘ ^３ はＡｌａであり、Ｘ ^４ はＡｌａである；
   （１−８） Ｘ ^１ はＬｅｕであり、Ｘ ^２ はＴｒｐであり、Ｘ ^３ はＡｌａであり、Ｘ ^４ はＳｅｒである。
5. 下記式（２）：
   
   式（２）中、Ｒ^２は水素原子、アミノ酸、オルニチン、サルコシン、デスモシン、イソデスモシン、ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸および３−アミノイソ酪酸、ならびに置換または無置換の、炭素数１〜１０のアシル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびフェニルイソチオシアネート基からなる群から選択され、ＺはＣｙｓであり、Ｘ ^５ 、Ｘ ^６ 、Ｘ ^７ およびＸ ^８ が下記（２−１）〜（２−４）のいずれかで表わされるペプチド：
   （２−１） Ｘ^５ はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ ^６ はＰｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群から選択され、Ｘ^７ はＡｌａであり、Ｘ ^８ はＨｉｓ、Ａｌａ、ＴｈｒおよびＳｅｒからなる群から選択される、ただし、Ｘ^６がＰｈｅのときはＸ^８がＴｈｒであり、Ｘ^８がＡｌａのときはＸ^５がＡｌａである；
   （２−２） Ｘ ^５ はＡｌａであり、Ｘ ^６ はＴｒｐであり、Ｘ ^７ はＰｈｅであり、Ｘ ^８ はＡｌａである；
   （２−３） Ｘ ^５ はＬｅｕであり、Ｘ ^６ はＴｒｐであり、Ｘ ^７ はＰｈｅであり、Ｘ ^８ はＳｅｒである；
   （２−４） Ｘ ^５ はＬｅｕであり、Ｘ ^６ はＰｈｅであり、Ｘ ^７ はＴｒｐであり、Ｘ ^８ はＴｈｒである。
6. 前記式（２）中、Ｒ^２が水素原子、またはベンジルオキシカルボニル基である、請求項５に記載のペプチド。
7. 前記式（２−１）において、Ｘ^５がＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択される、請求項５または６に記載のペプチド。
8. 前記（２−１）において、Ｘ ^５ 、Ｘ ^６ 、Ｘ ^７ およびＸ ^８ が下記（２−５）〜（２−８）のいずれかで表わされる、請求項５〜７のいずれか１項に記載のペプチド：
   （２−５） Ｘ ^５ はＰｈｅであり、Ｘ ^６ はＴｒｐであり、Ｘ ^７ はＡｌａであり、Ｘ ^８ はＨｉｓである；
   （２−６） Ｘ ^５ はＬｅｕであり、Ｘ ^６ はＴｒｐであり、Ｘ ^７ はＡｌａであり、Ｘ ^８ はＴｈｒである；
   （２−７） Ｘ ^５ はＡｌａであり、Ｘ ^６ はＴｒｐであり、Ｘ ^７ はＡｌａであり、Ｘ ^８ はＡｌａである；
   （２−８） Ｘ ^５ はＬｅｕであり、Ｘ ^６ はＴｒｐであり、Ｘ ^７ はＡｌａであり、Ｘ ^８ はＳｅｒである。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含有する、クロストリジウム属の菌の毒素産生抑制剤。
10. クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）を培養した培養液または前記培養液の乾燥物を有効成分として含有する、クロストリジウム属の菌の毒素産生抑制剤であって、
    前記クロストリジウム属の菌が、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）である、毒素産生抑制剤。
11. 前記クロストリジウム・ブチリカムが、クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ ５８８（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ＭＩＹＡＩＲＩ ５８８、ＦＥＲＭ ＢＰ−２７８９）である、請求項１０に記載の毒素産生抑制剤。
12. 前記クロストリジウム属の菌が、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）である、請求項９に記載の毒素産生抑制剤。
13. 請求項９〜１２のいずれか１項に記載の毒素産生抑制剤を含む、医薬組成物、飲食品、または飼料。