KR101995328B1

KR101995328B1 - 항암 활성을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR101995328B1
Application number: KR1020180158319A
Authority: KR
Inventors: 최학종; 윤미선
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2018-12-10
Filing date: 2018-12-10
Publication date: 2019-07-02

Abstract

본 발명은 김치로부터 분리된 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102는 기존의 동물모델 및 인간 암 세포가 이식된 동물모델에서 우수한 항암 활성을 나타내므로, 사람 또는 동물의 암의 치료, 예방 또는 개선 등의 용도를 위한 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

항암 활성을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물{Lactobacillus fermentum WiKim0102 having anti-cancer activity and composition for comprising the same}

본 발명은 김치로부터 분리된 신규한 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.

암은 세계적으로 높은 사망률을 보이며, 서구 사회에서는 심혈관 질환 다음으로 가장 일반적인 사망 원인이다. 특히, 식생활이 서구화되어 고지방식의 섭취가 일반화되고, 환경 오염 물질의 급격한 증가, 음주량의 증가 등으로 대장암, 유방암, 전립선암 등이 지속적으로 증가하는 추세에 있으며, 인구의 고령화와 더불어 흡연 인구의 증가 및 대기 오염으로 인해 폐암이 증가하고 있는 실정이다. 이러한 실정에서 암의 조기 예방 및 치료를 가능하게 하여 인간 건강의 증진, 건강한 삶의 질 향상 및 인류 보건 증진에 기여할 수 있는 항암 물질의 창출이 절실히 요구되고 있다.

한편, 유산균은 인간과 동물의 구강, 장, 질, 분변, 그리고 김치와 같은 발효식품 등에 널리 분포하면서 사람과 동물의 건강과 밀접한 관련을 맺고 있다. 유산균은 정장작용, 유해균 억제, 면역조절, 혈중 콜레스테롤 저하, 항암 등 다양한 건강증진 효과를 나타내고 있다.

현재, 한국공개특허 제10-2015-0068061호에서는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 락토바실러스 메센테로이드(Lactobacillus mesenteroides) PNU (KCCM11353P)의 항암 활성을 개시하고 있고, 한국등록특허 제10-1287120호에서는 락토바실러스 플란타륨 DSR CK10[기탁번호: KFCC-11433P] 또는 락토바실러스 플란타륨 DSR M2[기탁번호: KFCC-11432P]를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학 조성물을 개시하고 있으나, 락토바실러스 퍼멘텀에 관한 항암 활성 및 우수성에 대해서는 보고된 바 없다.

한국 공개특허 공개번호 제10-2015-0068061호 한국 등록특허 등록번호 제10-1287120호

본 발명의 목적은 항암 활성이 우수한 신규한 김치 유산균 락토바실러스 퍼멘텀 균주를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 신규한 김치 유산균 락토바실러스 퍼멘텀 균주를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 신규한 김치 유산균 락토바실러스 퍼멘텀 균주를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 식품 첨가제 조성물을 제공하기 위한 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 신규한 김치 유산균 락토바실러스 퍼멘텀 균주를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 사료 조성물 또는 사료 첨가제 조성물을 제공하기 위한 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하기 위한 것이다.

이에, 본 발명자들은 김치로부터 프로바이오틱스로서 우수한 효과를 나타내면서 암의 예방 및 치료 효과를 나타내는 유산균 균주를 찾고자 노력한 결과, 항암 활성을 갖는 신규한 락토바실러스 속 유산균 균주인 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102)를 분리, 동정하여 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항암 활성이 우수한 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102 균주를 제공한다.

상기 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102)는 김치 유래의 락토바실러스 퍼멘텀 신규 균주이다. 비록 본 발명에서의 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102)를 김치에서 분리, 동정하기는 했으나, 이의 입수 경로가 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102는 프로바이오틱스로서, 유산균의 일반적인 정장 효과 및 면역 증강 효과를 갖는다. 락토바실러스 속의 유산균이 정장 효과 면역 증강 효과를 갖는 것은 잘 알려진 사실이다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 식품 첨가제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 가축의 암 예방 또는 개선용 사료 조성물 또는 사료 첨가제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 발효용 유산균 스타터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102는 기존의 동물모델 및 인간 암 세포가 이식된 동물모델에서 우수한 항암 활성을 나타내므로, 사람 또는 동물의 암의 치료, 예방 또는 개선 등의 용도를 위한 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 조성물을 CT26 세포 이식 마우스에 1회(Single) 또는 3회(Serial) 정맥 주사한 후 시간이 경과함에 따라 종양 세포의 크기가 변화하는 것을 관찰하기 위한 마우스의 종양 부분 사진을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 조성물을 CT26 세포 이식 마우스에 1회(Single) 또는 3회(Serial) 정맥 주사한 후 시간이 경과함에 따라 종양 세포의 부피 변화 및 성장율을 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 조성물을 MC38 세포 이식 마우스에 정맥 주사한 후 시간이 경과함에 따라 종양 세포의 크기가 변화하는 것을 관찰하기 위한 마우스의 종양 부분 사진을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 조성물을 MC38 세포 이식 마우스에 정맥 주사한 후 시간이 경과함에 따라 종양 세포의 부피 변화 및 성장율을 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 조성물을 CT26 세포 이식 마우스에 정맥 주사한 후 1시간 및 24시간 경과 후 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102의 조직 내 분배를 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 조성물을 MC38 세포 이식 마우스에 정맥 주사한 후 1시간 및 24시간 경과 후 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102의 조직 내 분배를 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 조성물을 HCT116 인간 대장암 세포 이식 마우스에 1회(Single) 또는 3회(Serial) 정맥 주사한 후 시간이 경과함에 따라 종양 세포의 크기가 변화하는 것을 관찰하기 위한 마우스의 종양 부분 사진을 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명에 따른 조성물을 HCT116 인간 대장암 세포 마우스에 정맥 주사하고 시간이 경과함에 따라 종양 세포의 부피 변화를 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명에 따른 조성물을 SW620 인간 대장암 세포 이식 마우스에 정맥 주사한 후 시간이 경과함에 따라 종양 세포의 크기가 변화하는 것을 관찰하기 위한 마우스의 종양 부분 사진을 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명에 따른 조성물을 SW620 인간 대장암 세포 마우스에 정맥 주사하고 시간이 경과함에 따라 종양 세포의 부피 변화를 측정한 그래프를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명에 따른 조성물을 H1650 인간 비소세포폐암 세포 이식 마우스에 정맥 주사한 후 시간이 경과함에 따라 종양 세포의 크기가 변화하는 것을 관찰하기 위한 마우스의 종양 부분 사진을 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명에 따른 조성물을 H1650 인간 비소세포폐암 세포 마우스에 정맥 주사하고 시간이 경과함에 따라 종양 세포의 부피 변화를 측정한 그래프를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

본 발명의 실시예를 통해 김치로부터 분리된 락토바실러스 퍼멘텀 균주는 미생물의 동정 및 분류를 위한 16S rRNA 염기서열 분석 결과, 서열번호 1(SEQ ID NO: 1)의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다.

따라서, 서열번호 1(SEQ ID NO: 1)의 16S rRNA 염기서열을 갖는 본 발명의 미생물을 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102)로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2018년 10월 31일자로 기탁하였다(기탁번호 KCCM12356P).

본 발명에 있어서, '프로바이오틱스(probiotics)'는 사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물'이라는 의미로 이해된다. 프로바이오틱스는 프로바이오틱 활성을 갖는 살아있는 미생물로 단일 또는 복합균주 형태로 사람이나 동물에 건조된 세포 형태나 발효산물 형태로 급여될 경우, 숙주의 장내 균총에 유익한 영향을 미칠 수 있다.

본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 암의 예방 또는 치료 효과를 가지며, 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.

상기 암은 방광암, 유방암, 흑색종양, 갑상선암, 부갑상선암, 직장암, 인후암, 후두암, 식도암, 췌장암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 두담낭암, 구강암, 결장암, 항문 부근암, 간암, 폐암 및 대장암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 암일 수 있으며, 바람직하게는 대장암 또는 폐암일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 폐암은 비소세포폐암일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 포함되는 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102는 생균체 또는 사균체로서 존재할 수 있으며, 또한 건조 또는 동결건조된 형태로 존재할 수도 있다. 다양한 조성물 내에 포함시키기 적합한 유산균의 형태 및 제제화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

상기 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐 내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 정맥 내 주입방법으로 투여할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 활용될 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연당, 옥수수감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐아세테이트, 소듐클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

나아가 해당 분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 식품 첨가제 조성물로 이용될 수 있다.

상기 식품 조성물은 건강기능식품의 형태일 수 있다.

상기 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률에 따라 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미(제3조 제1호)하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것(동조 제2호)을 의미한다.

상기 식품 조성물은 식품 첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 들을 들 수 있다.

본 발명의 유효성분이 포함된 식품으로는 빵, 떡류, 건과류, 캔디류, 초콜릿류, 츄잉껌, 쨈류와 같은 과자류 아이스크림류, 빙과류, 아이스크림 분말류와 같은 아이스크림 제품류 우유류, 저지방 우유류, 유당분해 우유, 가공유류, 산양유, 발효유류, 버터유류, 농축유류, 유크림류, 버터유, 자연치즈, 가공치즈, 분유류, 유청류와 같은 유가공품류 식육가공품, 알가공품, 햄버거와 같은 식육제품류 어묵, 햄, 소세지, 베이컨 등의 어육가공품과 같은 어육제품류 라면류, 건면류, 생면류, 유탕면류, 호화건먼류, 개량숙면류, 냉동면류, 파스타류와 같은 면류 과실음료, 채소류음료, 탄산음료, 두유류, 요구르트 등의 유산균음료, 혼합음료와 같은 음료 간장, 된장, 고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 식초, 소스류, 토마토케첩, 카레, 드레싱과 같은 조미식품 마가린, 쇼트닝 및 피자를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 유효성분을 포함한 음료 조성물은 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, (예를 들어, 포도당, 과당 등); 디사카라이드, (예를 들어 말토스, 슈크로스 등); 및 폴리사카라이드, (예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등)과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 가축의 암 예방 또는 개선용 사료 조성물 또는 사료 첨가제 조성물로 이용될 수 있다.

상기 조성물이 사료 첨가제로서 제조될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태로 제조될 수 있다. 상기 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산등의 유기산이나 인산 나트륨, 인산 칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 제조될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화될 수 있으며, 통상의 사료 성분을 함께 포함할 수 있다.

상기 사료 및 사료 첨가제는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제 등을 더 포함할 수 있다.

상기 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 탑드레싱으로서 또는 이들을 동물사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료 첨가제를 동물사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수전분, 락토오스, 수크로오스, 콩플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.

또한, 상기 사료 및 사료 첨가제는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료 첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

본 발명의 사료 또는 사료 첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다.

상기 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치동물, 및 실험용 설치동물뿐만 아니라, 애완동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 발효용 유산균 스타터로 이용될 수 있다.

실시예 1. 균주의 분리 및 배양

1-1. 균주의 분리 및 동정

본 발명자는 김치로부터 유산균을 분리하였다.

먼저 김치 시료를 파쇄한 후 김치 추출물의 원액을 MRS agar 배지에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 배양 후 형성된 단일 콜로니를 계대배양하여 균단일집락을 선별하였고, 선별된 균단일집락은 루프로 수거하여 MRS broth에 배양하였다. DNA 추출은 QIAamp DNA Mini Kit(QIAgen, Germany)를 사용하여 추출하였다. 추출된 DNA는 1% 아가로스 겔을 이용하여 확인하였으며, 16S rDNA gene을 증폭하기 위하여 추출된 genomic DNA를 주형으로 하여 PCR을 진행하였다. PCR 조건은 denaturation 95℃에서 1분, annealing 55℃에서 30초, extension 72℃에서 5분으로 30 사이클을 수행하였다. 얻어진 PCR 산물은 마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하여 서열을 분석하였다.

16S RNA 염기서열 분석을 통하여 최종적으로 동정하였다. 세균의 동정은 16S rDNA 서열을 National Center for Biotechnology Information(NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 검색엔진의 유사도 분석을 통해 수행하였다.

그 중 효과가 뛰어난 1종의 유산균을 세계김치연구소 미생물 유전자은행으로부터 WiKim0102의 고유번호를 부여받아 락토바실러스 퍼멘텀 (Lactobacillus fermentum) WiKim0102라 명명하고, 한국미생물보존센터에 2018년 10월 31일자로 기탁하였다(기탁번호 KCCM12356P).

본 발명의 실시예를 통해 분리된 균주는 미생물의 동정을 위한 16S rDNA 염기서열 분석 결과, SEQ ID NO: 1의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다.

1-2. 균주의 배양

상기 실시예 1-1에서 분리 및 동정한 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102 균주의 단일 콜로니를 MRS 액체배지 10㎖에 접종 후 37℃에서 24시간 동안 200rpm으로 진탕배양하였다. 배양 후, 균체를 8,000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 배양액을 제거하고, PBS(Phosphate Buffered Saline)용액으로 3회 세척하여 남아 있는 배지 성분을 제거하였다.

실시예 2. 실험동물(마우스)의 조건

실험에 사용된 실험동물은 수컷 5주령의 BALB/c 마우스(오리엔트바이오, 한국)를 공급받았고, 실내 온도 20±2℃, 습도 55±15%가 유지되는 SPF 환경의 동물 사육실에서 1주일의 안정화 기간을 거쳐 실험기간 동안 사육하였다. 사료는 항생제가 첨가되지 않은 일반적인 팰렛 사료를 공급하였고, 물은 수시로 섭취할 수 있게 하였다. 실험 진행은 세계김치연구소 동물실험윤리위원회에서 승인된 프로토콜에 따라 모든 동물 사육, 실험 및 안락사를 실시하였다. 종양 크기 변화의 관찰은 3.14 x (길이 x 높이 x 넓이)/6의 식을 사용하여 종양의 부피(mm³)를 측정하여 진행하였다.

실시예 3. CT26 및 MC38 생쥐 대장암 세포 이식 동물모델에서의 항종양 효과 분석

3-1. 세포배양

CT26 생쥐 대장암 세포(한국세포주은행, 한국)는 구입하여 사용하였으며, MC38 생쥐 대장암 세포(전남대학교 의과대학)는 제공받아 사용하였다. CT26, MC38 생쥐 대장암 세포는 10% 우태아혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 포함한 DMEM 배지(Hyclone, 미국)를 사용하여 5% CO₂, 37℃ 조건에서 배양하였다.

3-2. 세포 이식 암 동물모델의 제작

CT26 세포 이식 동물모델 제작을 위해서 6주령 BALB/c 마우스(18-21g)를 실험에 이용하였고, MC38 세포 이식 동물모델 제작을 위해서는 6주령 C57BL/6 마우스(18-21g)를 이용하였다. 배양한 생쥐 대장암 세포 CT26과 MC38은 각각 1x10⁵cell을 수확(harvest)한 후, 50㎕의 PBS에서 재부유한 후 마우스의 오른쪽 대퇴부(thigh) 피하에 주입하였다.

3-3. 항종양 효과 분석

종양이 약 80~100mm³의 부피로 형성된 CT26 세포 이식 마우스의 꼬리에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 정맥 내 주사하였다. 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102는 PBS를 이용하여 1×10¹⁰CFU/㎖ 균수로 정량하여 준비하였으며, 0.1㎖(1×10⁹ CFU)씩 실험동물에 1회 또는 3회 꼬리에 정맥주사하고, 음성대조군에는 PBS를 투여하였다. 시간 경과에 따라 CT26 세포 이식 마우스의 대장암 종양 크기의 변화를 육안으로 확인한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 음성대조군(PBS)에 비해 락토바실러스 퍼멘텀WiKim0102를 정맥 주입한 경우 12일이 경과한 후에 종양 세포가 육안으로 확인가능할 정도로 줄어든 것을 관찰하였다. 특히, 1회(Single) 주입한 경우보다, 3회(Serial) 주입한 경우가 종양의 크기가 더 크게 줄어들었음을 확인하였으며, 3회 주입한 경우 12일이 경과한 때에는 종양이 육안으로 관찰되지 않을 정도로 줄어들었음을 확인하였다.

또한, 시간 경과에 따라 CT26 세포 이식 마우스에서 종양 크기의 부피 변화를 측정한 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, CT26 세포 이식 마우스의 대장암 종양 크기가 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 1회 주사하였을 경우 18일 후에 음성대조군 대비 약 4.2배의 항종양 효과가 있음을 확인할 수 있었고, 6일 간격으로 3회 주사하였을 경우 18일 후에 음성대조군 대비 약 27.2배의 항종양 효과가 관찰되었다.

또한, 종양이 약 80~100mm³의 부피로 형성된 MC38 세포 이식 마우스의 꼬리에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 정맥 내 주사하였다. 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102는 PBS를 이용하여 1×10¹⁰CFU/㎖ 균수로 정량하여 준비하였으며, 0.1㎖(1×10⁹CFU)씩 실험동물에 1회 꼬리에 정맥주사하고, 음성대조군에는 PBS를 투여하였다. 시간 경과에 따라 MC38 세포 이식 마우스의 대장암 종양 크기의 변화를 육안으로 확인한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 음성대조군(PBS)에 비해 락토바실러스 퍼멘텀WiKim0102를 정맥 주입한 경우에 종양 세포가 육안으로 확인가능할 정도로 줄어든 것을 관찰할 수 있었다. 15일이 경과한 때에는 종양이 육안으로 관찰되지 않을 정도로 줄어들었음을 관찰할 수 있었다.

또한, 시간 경과에 따라 MC38 세포 이식 마우스에서 종양 크기의 부피 변화를 측정한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, MC38 세포 이식 마우스의 대장암 종양 크기가 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 1회 주사하였을 경우 12일 후에 음성대조군 대비 약 23.8배의 항종양 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

상기 실험결과를 통해 본 발명자들은 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102의 항종양 효과가 우수하며, 특히 연속적인 투여를 한 경우에 더욱 우수한 항종양 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 락토바실러스 퍼멘텀WiKim0102 주사 후 생물학적 분배(biodistribution study)

락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 CT26 세포와 MC38 세포가 이식된 마우스의 꼬리에 정맥 주사한 후 1시간과 24시간이 경과한 후에 종양 조직을 적출하여 균질화한 후 MRS agar 배지에 도말하였다. 도말한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하여 생성된 콜로니를 계수하여 CFU/g 조직을 계산하였다. 종양 조직과 다른 주요 장기 조직의 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102 표적화 정도를 비교하기 위해 간장 및 비장 조직 역시 동일한 조건으로 균질화하여 박테리아를 계수하였고, 그 결과를 도 5(CT26 세포 이식 마우스) 및 도 6(MC38 세포 이식 마우스)에 나타내었다.

도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, CT26과 MC38 세포가 이식된 암 동물모델 모두의 경우에서 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102이 주사된 후 1시간 후부터 종양 조직에서 1×10⁷ CFU/g 이상의 균수가 관찰되었고, 24시간 후에도 종양 조직의 균수가 유지되는 것이 확인되었다.

상기 결과로부터 CT26 세포와 MC38 세포가 이식된 마우스 모델에서 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102이 종양 조직에 축적되며, 효과적으로 표적화됨을 확인할 수 있었다.

실시예 5. HCT116, SW620(인간 대장암)세포와 H1650(인간 비소세포폐암)세포 이식 동물모델에서의 항종양 효과 분석

5-1. 세포배양

HCT116인간 대장암 세포와 SW620 인간 대장암 세포(한국세포주은행, 한국)는 구입하여 사용하였으며, H1650 인간 비소세포폐암 세포(전남대학교 의과대학)는 제공받아 사용하였다. 이들 HCT116, SW620 및 H1650 세포는 10% 우태아혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 포함한 RPMI 1640 배지(Hyclone, 미국)를 사용하여 5% CO₂, 37℃ 조건에서 배양하였다.

5-2. HCT116, SW620 그리고 H1650 세포 이식 암 동물모델의 제작

HCT116, SW620 및 H1650 세포 이식 암 동물모델 제작을 위해서 주령 BALB/c 마우스(17-20g)를 실험에 이용하였다. 배양된 HCT116, SW620 및 H1650 세포는 각각 5x10⁶cell을 수확(harvest)한 후, 50㎕의 PBS에서 재부유한 후 마우스의 오른쪽 대퇴부(thigh) 피하에 주입하였다.

5-3. HCT116, SW620 대장암 세포에 대한 항종양 효과 분석

종양이 약 80~100mm³의 부피로 형성된 HCT116 및 SW620 대장암 세포 이식 마우스의 꼬리에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 정맥 내 주사하였다. 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102는 PBS를 이용하여 1×10¹⁰CFU/㎖ 균수 또는 5×10⁹CFU/㎖로 정량하여 준비하였다. HCT116 인간 대장암 세포가 이식된 암 동물모델에는 준비된 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 0.1㎖(1×10⁹ CFU) 씩 1회 또는 6일 간격으로 3회, 0.1㎖(5×10⁸CFU)씩 1회 또는 6일 간격으로 3회 마우스의 꼬리에 정맥 주사하였고, SW620 인간 대장암 세포가 이식된 암 동물모델에는 준비된 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 0.1㎖(1×10⁹ CFU) 씩 마우스의 꼬리에 1회 정맥 주사하였다. 음성대조군에는 동일하게 PBS를 투여하고, 26일 동안 시간 경과에 따른 종양 크기의 변화를 육안으로 확인한 결과 및 종양 크기의 부피 변화를 나타낸 그래프를 도 7 내지 도 10에 나타내었다.

도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, HCT116 및 SW620 인간 대장암 세포가 이식된 암 동물모델에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 주입한 경우 종양의 크기가 육안으로 관찰이 가능할 만큼 줄어드는 것이 관찰되었으며, 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 0.1㎖(5×10⁸CFU)로 투여한 경우보다 0.1㎖(1×10⁹ CFU) 씩 투여한 경우에 종양 축소 효과가 우수함을 확인하였다. 특히, HCT116 인간 대장암 세포가 이식된 암 동물모델에서는 3회 투여한 경우 1회 투여한 경우보다 종양 크기의 축소 효과가 우수함을 확인하였다.

또한, 도 9 및 도 10에 나타난 바와 같이, HCT116 및 SW620 인간 대장암 세포가 이식된 암 동물모델에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 주입한 경우 종양 크기의 부피가 확연히 줄어드는 것을 수치적으로 확인할 수 있었다. HCT116 인간 대장암 세포가 이식된 암 동물모델에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 1×10⁹CFU/0.1㎖로 1회 또는 3회 주사하였을 경우 26일 후에 음성대조군과 비교하여 각각 약 4.2배와 약 27.2배의 항종양 효과가 관찰되었고, 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 5×10⁸CFU/0.1㎖로 3회 주사하였을 경우 26일 후에 음성대조군과 비교하여 약 2.9배의 항종양 효과가 관찰되었다. 한편, SW620 인간 대장암 세포가 이식된 암 동물모델에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 1×10⁹CFU/0.1㎖로 1회 주사하였을 경우 26일 후에 음성대조군과 비교하여 약 2.1배의 항종양 효과가 관찰되었다.

상기 결과로부터, 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102을 1회 주사하는 경우보다 3회 주사하는 경우 종양의 성장을 저해하는데 더욱 우수한 효과가 나타났다. 따라서 종양의 효과적인 치료를 위해서는 적절한 간격에 따른 주사 투여법이 1회 주사보다 더 효과적이며, 생쥐 대장암 세포 뿐 아니라 인간 대장암 세포가 이식된 동물모델에서도 우수한 항암 활성을 갖는다는 것을 확인하였다.

5-4. H1650 비소세포폐암에 대한 항종양 효과 분석

종양이 약 80~100mm³의 부피로 형성된 H1650 비소세포폐암 세포 이식 마우스의 꼬리에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 정맥 내 주사하였다. 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102는 PBS를 이용하여 1×10¹⁰CFU/㎖ 균수 또는 5×10⁹CFU/㎖로 정량하여 준비하였다. H1650 인간 비소세포폐암 세포가 이식된 암 동물모델에는 준비된 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102 0.1㎖(1×10⁹ CFU)를 마우스의 꼬리에 1회 정맥 주사하였다. 음성대조군에는 동일하게 PBS를 투여하고, 21일 동안 시간 경과에 따른 종양 크기의 변화를 육안으로 확인한 결과 및 종양 크기의 부피 변화를 나타낸 그래프를 도 11 내지 도 12에 나타내었다.

도 11에 나타난 바와 같이, H1650 비소세포폐암 세포가 이식된 암 동물모델에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 주입한 경우 종양의 크기가 육안으로 관찰이 가능할 만큼 줄어드는 것이 관찰되었다.

또한, 도 12에 나타난 바와 같이, H1650 비소세포폐암 세포가 이식된 암 동물모델에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 주입한 경우 종양 크기의 부피가 확연히 줄어드는 것을 수치적으로 확인할 수 있었다. H1650 비소세포폐암 세포가 이식된 암 동물모델에 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 주사하였을 경우 21일 후에 음성대조군과 비교하여 약 1.8배의 항종양 효과가 관찰되었다.

양방검정 t-test는 음성대조군과 락토바실러스 퍼멘텀WiKim0102 처리군 사이에 종양 성장에서 통계적으로 유의미한 차이를 결정하였다. P < 0.05는 모든 종양성장 그래프 분석에 대하여 유의미하게 고려되었다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12356P

20181031

<110> Korea Food Research Institute <120> Lactobacillus fermentum WiKim0102 having anti-cancer activity and composition for comprising the same <130> KP181207-03_WiKim0102 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1383 <212> DNA <213> Lactobacillus fermentum <400> 1 cacctgattg attttggtcg ccaacgagtg gcggacgggt gagtaacacg taggtaacct 60 gcccagaagc gggggacaac atttggaaac agatgctaat accgcataac aacgttgttc 120 gcatgaacaa cgcttaaaag atggcttctc gctatcactt ctggatggac ctgcggtgca 180 ttagcttgtt ggtggggtaa ggcctaccaa ggcgatgatg catagccgag ttgagagact 240 gatcggccac aatgggactg agacacggcc catactccta cgggaggcag cagtagggaa 300 tcttccacaa tgggcgcaag cctgatggag caacaccgcg tgagtgaaga agggtttcgg 360 ctcgtaaagc tctgttgtta aagaagaaca cgtatgagag taactgttca tacgttgacg 420 gtatttaacc agaaagtcac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg 480 caagcgttat ccggatttat tgggcgtaaa gagagtgcag gcggttttct aagtctgatg 540 tgaaagcctt cggcttaacc ggagaagtgc atcggaaact ggataacttg agtgcagaag 600 agggtagtgg aactccatgt gtagcggtgg aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg 660 gcgaaggcgg ctacctggtc tgcaactgac gctgagactc gaaagcatgg gtagcgaaca 720 ggattagata ccctggtagt ccatgccgta aacgatgagt gctaggtgtt ggagggtttc 780 cgcccttcag tgccggagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac gaccgcaagg 840 ttgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 900 aagctacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcttgcg ccaaccctag agatagggcg 960 tttccttcgg gaacgcaatg acaggtggtg catggtcgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1020 gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgttacta gttgccagca ttaagttggg 1080 cactctagtg agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggacgacgt cagatcatca 1140 tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggac ggtacaacga gtcgcgaact 1200 cgcgagggca agcaaatctc ttaaaaccgt tctcagttcg gactgcaggc tgcaactcgc 1260 ctgcacgaag tcggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc 1320 gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gagagtttgt aacacccaaa gtcggtgggg 1380 taa 1383

Claims

서열번호 1로 나타나는 16S rRNA를 가지며, 기탁번호 KCCM12356P의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) WiKim0102.
락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 대장암 또는 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
제2항에 있어서,
상기 폐암은 비소세포폐암인 것을 특징으로 하는 대장암 또는 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제2항에 있어서,
상기 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여의 방법으로 투여 가능한 것을 특징으로 하는 대장암 또는 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제5항에 있어서,
상기 비경구 투여의 방법은 정맥주사 투여인 것인, 대장암 또는 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제2항에 있어서,
상기 조성물은 생균 형태인 것을 특징으로 하는 대장암 또는 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 대장암 또는 폐암의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제8항에 있어서,
상기 식품은 건강기능식품인, 대장암 또는 폐암의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제8항에 있어서,
상기 식품은 김치, 간장, 된장, 고추장, 음료 및 발효유로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 식품인 것을 특징으로 하는 대장암 또는 폐암의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 대장암 또는 폐암의 예방 또는 개선용 식품 첨가제 조성물.
락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 가축의 대장암 또는 폐암 예방 또는 개선용 사료 조성물.
제12항에 있어서,
상기 가축은 돼지, 소, 말, 양, 토끼, 염소, 쥐, 햄스터, 기니피그, 개, 고양이, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 메추라기, 잉어, 붕어 및 송어로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 가축의 대장암 또는 폐암 예방 또는 개선용 사료 조성물.
락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102(Lactobacillus fermentum, WiKim0102, 기탁번호 KCCM12356P) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 가축의 대장암 또는 폐암 예방 또는 개선용 사료 첨가제 조성물.
삭제
제2항, 제4항 내지 제7항 중 어느 하나의 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 대장암 또는 폐암의 예방 또는 치료 방법.
제16항에 있어서,
상기 투여의 방법 및 투여량은 정맥주사의 방법으로 락토바실러스 퍼멘텀 WiKim0102를 1×10¹⁰CFU/㎖ 농도로 0.1㎖ 투여하는 것인, 대장암 또는 폐암의 예방 또는 치료 방법.
제17항에 있어서,
상기 투여의 기간 및 횟수는 6일 간격으로 3회 투여하는 것인, 대장암 또는 폐암의 예방 또는 치료 방법.