KR20150068061A

KR20150068061A - 항암활성이 우수한 기능성 김치 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20150068061A
Application number: KR1020130153826A
Authority: KR
Inventors: 박건영; 길정하; 정지강; 김희영; 봉연주; 최금혜; 이경희
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2013-12-11
Filing date: 2013-12-11
Publication date: 2015-06-19

Abstract

본 발명은 신규한 스타터 균주인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 락토바실러스 메센테로이드(Lactobacillus mesenteroides) PNU (KCCM11353P) 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 신규한 균주는 항산화 활성이 우수하고 항암 활성이 우수할 뿐만 아니라, 이를 스타터 균주로 사용하여 발효식품을 제조할 경우, 제조된 식품의 관능미 및 품질이 우수하고, 식품 내 함유된 유산균수를 증가시키는 효과가 있어, 정장제, 생균제, 식품첨가제 및 항암제의 용도로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

항암활성이 우수한 기능성 김치 및 그 제조방법{Functional kimchi having anticancer and a method for preparing the same}

본 발명은 항암 활성이 우수한 기능성 김치 및 그 제조방법에 관한 것이다.

여러 가지 사망원인 중 암에 의한 사망자의 증가가 두드러지고 있는데, 이의 가장 큰 원인은 식이변화를 들 수 있고, 그 중에서도 육식의 비중이 높아지고 상대적으로 채식의 비중이 낮아지는 것을 들 수 있다.

또한, 고지방, 고단백 식이는 담즙과 콜레스테롤의 대사에 변화를 가져올 뿐만 아니라 이들의 대사물로부터 발암인자를 생산해내는 박테리아의 대사활동을 강화시키는 것으로 알려져 있고, 육류의 섭취가 늘어나면 장내 pH의 변화로 인해 유해 세균들의 생장을 높이게 되고 발암에 관련된 효소인 베타-글루쿠로니다제, 베타-글루코시다제, 아조레턱타제, 니트로레덕타제, 트립토판나제 등을 유도하는 것으로도 알려져 있다. 그리고 상대적으로 식이 섬유소의 섭취가 줄어들게 됨으로써 이러한 유해 세균들의 배출이 원활하지 못하게 되어 장내 질병을 유발하고 더 나아가 암과 같은 심각한 상황까지 이르게 한다.

한편, 최근 보고되고 있는 연구 결과에 따르면, 많은 유럽 국가 중 일부 국가에서 암의 발생 수치가 현저하게 낮은 국가들이 있었는데, 이들 국가의 공통점을 보면 일반적으로 발효식품들을 많이 섭취하는 국가들이었으며, 특히 핀란드, 불가리아의 경우 요구르트 등 발표식품의 섭취가 많기 때문에 암 발생률이 현저하게 낮아진다는 보고가 있었다.

또한, 우리나라의 경우도 대표적인 젖산균 발효 식품인 김치를 국민의 대부분이 섭취하고 있어 다른 나라에 비해 암 발생율이 낮은 것으로 보고된 바 있으며, 이러한 김치에는 로이코노스톡, 락토바실러스, 스트렙토코커스, 페디오코커스 등과 같은 젖산균이 함유되어 있다. 이러한 유익한 젖산균은 장내 pH를 낮춰 유해 미생물 및 병원성 미생물의 성장을 억제하는 정장 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있고, 발암성 전구물질을 발암성 물질로 전환시키는 효소들의 활성을 억제하는 효과가 있다는 사실도 보고되고 있다.

따라서 최근에는 이러한 젖산균을 이용하여 생체 유용한 기능을 갖는 기능성 발효식품을 개발하려는 연구가 시도되고 있다.

대한민국 특허출원 2007-0030016

이에 본 발명자들은 생체 유용한 기능성 김치를 제조하기 위하여 다양한 연구를 진행하던 중 김치의 제조에 있어서 기존 김치 제조방법과 달리 죽염 절임과 유산균 스타터를 추가하였을 경우 항암 활성이 우수할 뿐만 아니라 관능미가 우수한 기능성 김치를 제조할 수 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 원료인 배추의 소금절임 단계와 절임배추에 양념을 묻히는 양념단계를 구비하는 김치 제조 방법에 있어서, 상기 소금절임 단계는 배추 총 무게의 3 ~ 4 중량%에 해당하는 3회 구운 죽염으로 침지하는 절임단계를 포함하고, 상기 양념단계는 유산균 스타터를 추가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 항암 활성 김치 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 원료인 배추의 소금절임 단계와 절임배추에 양념을 묻히는 양념단계를 구비하는 김치 제조 방법에 있어서, 상기 소금절임 단계는 배추 총 무게의 3 ~ 4 중량%에 해당하는 3회 구운 죽염으로 침지하는 절임단계를 포함하고, 상기 양념단계는 유산균 스타터를 추가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 항암 활성 김치 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유산균 스타터는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 락토바실러스 메센테로이드(Lactobacillus mesenteroides) PNU (KCCM11353P)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 소금절임 단계는 3회 구운 죽염을 배추의 밑둥으로부터 1/3 지점까지 뿌리거나, 염수에 침지 후 10 ~ 20시간동안 1 ~ 10℃에서 절일 수 있다.

본 발명에 따른 죽염 절임과 유산균 스타터를 이용하여 생산한 김치는 항암 활성이 우수할 뿐만 아니라 관능미 및 품질이 우수한 효과가 있다. 또한, 본 발명의 유산균 스타터로 사용된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 락토바실러스 메센테로이드(Lactobacillus mesenteroides) PNU (KCCM11353P)는 항산화 활성이 우수하고 항암 활성이 우수할 뿐만 아니라, 이를 스타터 균주로 사용하여 발효식품을 제조할 경우, 제조된 식품의 관능미 및 품질이 우수하고, 식품 내 함유된 유산균수를 증가시키는 효과가 있어, 정장제, 생균제, 식품첨가제 및 항암제의 용도로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 각각의 스타터 균주를 사용하여 제조된 김치를 대상으로 저장 시간 별 김치의 pH 변화를 측정한 것을 그래프로 나타낸 것으로서, C 는 스타터 균주를 첨가하지 않고 제조된 김치를 나타낸 것이다.
도 2는 각각의 스타터 균주를 사용하여 제조된 김치를 대상으로 저장 시간 별 산도의 변화를 측정한 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 각각의 스타터 균주를 사용하여 제조된 김치를 대상으로 저장 시간 별 탄력성의 변화를 측정한 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 각각의 스타터 균주를 사용하여 제조된 김치의 관능미를 각 항목당 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 각각의 스타터 균주를 사용하여 발효시켜 제조된 김치 내에 함유된 총 균수를 저장 시간에 따라 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 각각의 스타터 균주를 사용하여 발효시켜 제조된 김치 내에 함유된 젖산균 중 락토바실러스 속 균수를 저장 시간에 따라 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 각각의 스타터 균주를 사용하여 발효시켜 제조된 김치 내에 함유된 젖산균 중 류코노스톡 속 균수를 저장 시간에 따라 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 각각의 스타터 균주를 사용하여 발효시켜 제조된 김치의 DPPH 라디칼 소거능 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 각각의 스타터 균주를 사용하여 발효시켜 제조된 김치의 메탄올 추출물을 대장암 세포주인 HT-29 세포에 처리한 후, 염증 관련 유전자인 iNOS 유전자의 발현 억제 정도를 RT-PCR을 수행하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 각각의 스타터 균주를 사용하여 발효시켜 제조된 김치의 메탄올 추출물을 대장암 세포주인 HT-29 세포에 처리한 후, 염증 관련 유전자인 COX-2 유전자의 발현 억제 정도를 RT-PCR을 수행하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 원료인 배추의 소금절임 단계와 절임배추에 양념을 묻히는 양념단계를 구비하는 김치 제조 방법에 있어서, 상기 소금절임 단계는 배추 총 무게의 3 ~ 4 중량%에 해당하는 3회 구운 죽염으로 침지하는 절임단계를 포함하고, 상기 양념단계는 유산균 스타터를 추가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 항암 활성 김치 제조방법을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명자들은 항암 활성이 우수한 김치를 제조하기 위하여 죽염 절임과 유산균 스타터를 이용하여 김치를 제조하였는데, 본 발명에서 사용한 죽염절임 방법은 배추 무게의 3 ~ 4 중량%에 해당하는 3회 구운 죽염을 계량하여 첨가하였는데, 3회 구운 죽염은 염수로 녹여 배추를 침지하거나, 배추의 밑둥으로부터 1/3 지점까지만 뿌린 후 배추 무게와 동일한 무게의 물 주머니 또는 다른 무거운 물체를 얹어 절이는 방법으로 10 ~ 20시간동안 1 ~ 10℃에서 절이고 흐르는 물에 2 ~ 4회 세척 후 2 ~ 4시간동안 탈수시키는 방법으로 배추를 소금절임 하였다.

참고로 본 발명에서 용어 “스타터(starter)"란 식품의 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제로, 발효식품 제조 시 첨가함으로써 숙성된 식품에서 지배적으로 생장하는 미생물을 말하며, 본 발명의 목적상 스타터란, 발효 식품의 맛을 일정하게 조절하게 할 뿐만 아니라 우수한 관능미를 가질 수 있도록 제공하는 미생물, 즉, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 락토바실러스 메센테로이드(Lactobacillus mesenteroides) PNU (KCCM11353P)를 필수적으로 포함하는 제제를 의미한다.

또한, 본 발명에 따른 상기 스타터는 액상 제제, 분말 제제 등으로 제형화 할 수 있으며, 바람직하게는 분말제제로 사용할 수 있다. 이는 스타터 미생물 균주를 발효 식품에 첨가하는 경우 균 배양액에서 분리한 젖은 형태의 균체를 첨가하는 것이 일반적이지만 액상 제형은 보관이 어렵고 유통 중 품질유지가 어려워 이를 상품으로 유통시키기 어려운 단점이 있으나, 분말 제제는 공급, 품질 유지 및 사용이 용이하다는 장점이 있다. 따라서 이러한 분말 제제는 배양된 각각의 균주를 원심분리 등의 방법으로 수집하여 동결 건조시켜 수득할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 대표적인 발효식품 중 하나인 김치의 제조에 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 락토바실러스 메센테로이드(Lactobacillus mesenteroides) PNU (KCCM11353P) 균주를 스타터로 사용한 결과, 제조된 김치의 pH의 감소 속도와 산도 속도가 스타터를 사용하지 않은 군 및 다른 종류의 스타터를 사용한 군에 비해 발효가 빠르게 진행되는 것으로 나타났다(도 1 및 도 2 참조). 뿐만 아니라, 이렇게 빠른 발효 과정에도 불구하고 본 발명의 스타터 균주로 제조된 김치의 경우 다른 군들에 비해 탄력성이 우수하고, 관능미가 우수한 것으로 나타났다(도 3 및 도 4 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 ①락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 ②락토바실러스 메센테로이드(Lactobacillus mesenteroides) PNU (KCCM11353P) 균주들을 김치의 제조에 스타터로 사용하여 발효시킬 경우, 관능미가 개선된 우수한 품질의 김치를 제조할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

본 발명에서 사용된 상기 ①번 균주는 출원번호: 10-2013-0010986에 신균주 특허로 출원한 바 있고, ②번 균주는 출원번호: 10-2013-0010986에 신균주 특허로 출원한 바 있다.

본 발명에 따른 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 락토바실러스 메센테로이드(Lactobacillus mesenteroides) PNU (KCCM11353P) 균주는 우수한 항산화 활성을 갖는 특징이 있는데, 즉 본 발명의 일실시예에 따르면 본 발명의 신균주를 사용하여 제조된 김치 추출물이 다른 종류의 스타터 균주 및 스타터 균주를 사용하지 않고 제조된 김치 추출물 보다 DPPH 라디칼 및 히드록실 라디칼 소거 활성이 우수한 것으로 나타났다(도 8 및 표 1 참조).

일반적으로 활성산소는 호기성 생물이 이용하는 산소분자가 산화과정에 이용되면서 여러 대사과정에서 생성되어 조직을 공격하고 세포를 손상시키는 산화력이 강한 산소를 말하는 것으로서, 혈액순환 장애, 환경오염, 스트레스 등이 원인으로 추정된다. 수퍼옥시드음이온, 과산화효소, 히드록실라디칼, 일중항산소등이 활성산소종에 포함되며, 이중 히드록실 라디칼은 화학적 반응이 크며 생체 내의 산화원인이 되어 DNA에 손상을 주거나 돌연변이를 유발하는 물질로 알려져 있다.

따라서 이들 활성산소를 소거하는 물질의 경우, 활성 산소로 인해 유발되는 각종 질환을 예방 및 치료할 수 있는 의약품의 소재로 개발될 수 있다.

이러한 점에서 볼 때 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 락토바실러스 메센테로이드(Lactobacillus mesenteroides) PNU (KCCM11353P) 균주는 활성산소 소거능이 우수하여 상기 균주를 김치의 제조에 사용할 경우, 항산화 활성이 우수한 김치를 제조할 수 있다.

또한 본 발명에서 제공하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 락토바실러스 메센테로이드(Lactobacillus mesenteroides) PNU (KCCM11353P) 균주는 우수한 항암 활성을 갖는 특징이 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 균주를 이용하여 제조된 김치 추출물을 인간 결장암 세포주에 농도별로 처리한 결과, 처리 농도에 비례하여 암 세포의 성장이 저해되는 것으로 나타났고(표 2 참조), 나아가 염증 관련 유전자인 iNOS 및 COX-2의 유전자 발현도 저해하는 것으로 나타났다(도 9 및 도 10 참조).

참고로 염증은 세포나 조직이 어떠한 원인에 의해 손상을 받으면 그 반응을 최소화하고 손상된 부위를 원상으로 회복시키려는 일련의 방어목적으로 나타나는 상처나 질병에 반응하는 인체의 면역 반응으로, 자외선이나 활성산소, 스트레스 등이 염증성 인자를 활성화시켜 각종 질병 및 피부의 노화를 일으킨다.

염증의 특징 중 하나는 프로스타글란딘을 생성하는 시클로옥시게나제(cyclooxygenase; COX) 및 류코트리엔(leukotriene)을 생성하는 5-리폭시게나제(5-lipoxygenase) 경로에 의해 대사되는 아라키돈산(arachidonic acid)의 산소첨가반응의 증가이다. 프로스타글란딘 및 류코트리엔은 염증의 매개체이다. 따라서 COX 또는 리폭시게나제 활성 억제는 큰 관심사이다. COX 효소는 COX-1 및 COX-2의 2개의 형태가 있으며 COX-2가 염증 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다.

따라서 COX-2 효소를 억제하는 것이 비가역적인 COX-1 억제와 관련된 부작용 없이 염증을 감소시킬 수 있는 효과적인 방법일 수 있다[Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2003 Nov;69(5):329-37, Neurosurgery. 2005 Mar;56(3):590-604].

또한, 다른 하나의 강력한 염증 매개물인 나이트릭옥사이드(Nitric Oxide; NO)는 NO 합성 효소인 나이트릭옥사이드신타제(Nitric Oxide synthase; NOS)에 의해 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 생성되며 UV와 같은 스트레스나 엔도톡신, 사이토카인에 의해 많은 타입의 세포에서 발생된다. 이러한 염증 자극들은 세포내의 유도성 NOS(inducible NOS; iNOS)의 발현을 증가시킴으로 NO를 발생시키고 대식세포를 활성화시켜 염증 반응을 일으키며 이러한 염증 반응은 암의 진행을 가속화 시킨다.

이러한 점에서 볼 때 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 락토바실러스 메센테로이드(Lactobacillus mesenteroides) PNU (KCCM11353P) 균주들을 스타터로 이용하고, 기존의 소금 절임 대신 3회 구운 죽염을 이용하여 죽염 절임을 하여 김치를 제조하는 방법을 제공할 수 있으며, 이러한 방법으로 제조된 김치는 항산화 활성 및 항암 활성을 가지고 있을 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

본 발명의 김치 제조방법

<1-1> 절임배추

배추 무게의 3.5%에 해당하는 3회 구운 죽염을 계량하여 첨가하였는데, 3회 구운 죽염은 물에 녹여 염수로 만들어 배추를 침지하거나, 배추의 밑둥으로부터 1/3 지점까지만 뿌린 후 배추 무게와 동일한 무게의 물 주머니 또는 다른 무거운 물체를 얹어 15시간동안 4℃에서 절이고 흐르는 물에 3회 세척 후 3시간동안 탈수시켰다.

<1-2> 스타터의 첨가

본 발명자들은 항암 활성이 있는 김치를 제조하기 위하여 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)PNU - 기탁번호 KCCM11352P(일명 "LP 전주”라고 명명함)과 락토바실러스 메센테로이드(Lactobacillus mesenteroides )PNU - 기탁번호 KCCM11353P(일명 "LM" 이라고 명명함) 유산균을 김치 1g당 10⁶CFU으로 조절하여 첨가하였다. 준비한 유산균 스타터를 3000rpm에서 10분간 원심분리하고 액체배지를 제거하여 생성된 펠렛을 생리식염수로 2회 세척(washing)하여 양념소에 첨가하였다. 김치 1g당 10⁶CFU에 해당하는 유산균을 첨가하기 위하여 김치 1kg당 10⁸CFU으로 조절한 유산균을 첨가하였다.

<1-3> 김치 제조

부산대학교의 항암김치 레시피를 사용하여 김치를 제조하였다. 항암김치는 절인배추 100(중량g)에 대해 고춧가루 2.5g, 마늘 2.8g 생강 0.6g 무 11g, 설탕 1g, 파 2g, 갓 7.5g, 산초 0.1g, 배 2.8g, 버섯다시마물 32.8g, 겨우살이 추출물0.05g의 비율로 혼합하여 양념을 만들었다. 무와 파, 배는 3-4cm 길이로 채썰고 무채에 고춧가루 갠 것을 넣어 버무린 다음 나머지 양념을 넣어 죽염을 첨가하여 최종 염도를 2.2%로 조절하였고 혼합한 양념소를 배추에 버무려 김치를 제조하였다.

이상과 같은 김치 제조과정에서 대조군으로는 스타터 균주로 알려진 락토바실러스 플란타룸 KCTC 3099 균주를 스타터 균주로 사용한 군 및 스타터 균주를 첨가하지 않은 군을 사용하였고 그 외 다른 방법은 상기 기술된 방법과 동일한 과정으로 김치를 제조하였다.

< 실시예 2>

본 발명의 방법으로 제조한 김치의 pH 및 산도 측정

상기 실시예 2에서 제조된 각각의 김치들을 대상으로 김치의 pH 및 산도를 측정하였다. pH는 실온에서 pH meter(M220, Corming, MA, USA)로 측정하였고, 산도는 AOAC 표준시험법에 따라 김치 즙을 20배 희석하여 이 시료에 0.1N NaOH를 가하여 pH 8.4가 될 때까지 소비된 0.1N NaOH mL 수로 측정하였다. 적정한 값은 젖산(lactic acid)의 함량 %로 환산하여 나타내었으며, 그 수식을 하기에 기재된 바와 같다.

그 결과, 본 발명의 죽염 절임과 스타터를 첨가하여 발효시킨 김치가 스타터를 첨가하지 않은 김치보다 pH의 감소 속도가 더 빠르게 나타나는 것으로 확인되었고(도 1 참조), 산도의 증가도 죽염 절임과 스타터를 첨가하여 발효시킨 김치가스타터를 첨가하지 않은 김치에 비해 속도가 빠르게 나타나 발효가 빨리 진행되는 것으로 나타났다(도 2 참조).

이러한 결과를 토대로 본 발명자들은 본 발명의 방법으로 제조된 김치는 기존의 김치보다 발효가 빨리 진행되어 발효 시간을 단축시킬 수 있는 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

본 발명의 방법으로 제조한 김치의 탄력성 측정

또한, 본 발명자들은 상기 실시예에서 제조한 김치를 대상으로 ,김치 조직의 탄성을 조사하였는데, 탄성 정도는 rheometer(CR-100, Sun Scientific Co., Japan)을 이용하여 측정하였다. 탄력성 측정에 사용된 시료는 김치 밑동으로부터 5cm 아래의 두께가 0.5cm가 되는 부분을 3 cm × 4 cm의 크기로 썰어 사용하였고, 각 시료마다 5회 반복 측정하여 이 값의 평균값을 구하였다.

탄력성 측정 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 각 김치별 탄성 정도는 서로 유의적인 차이는 없었으나 스타터를 첨가하지 않은 김치에 비해 죽염 절임과 스타터를 첨가하여 발효시킨 김치가 빨리 숙성한 것에 비해 탄력성의 감소가 적어 조직의 물러짐이 감소한 것으로 나타났다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 방법으로 제조된 김치의 경우 발효 식품의 탄력성을 좋은 상태로 오래 동안 유지시킬 수 있어 보다 식감이 좋은 식품을 제조할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

본 발명의 방법으로 제조한 김치의 관능 평가

김치의 관능 평가는 반복된 램덤화 완전 블록 계획(replicated randomized complete block design)에 따라서 훈련된 15명의 관능요원이 평가하였다. 평가 내용은 정량적 묘사분석 방법(quantitative descriptive analysis)을 사용하여 주관적 항목으로 종합적 외관(overall appearance), 종합적 평가(overall acceptability), 냄새(smell), 조직감(texture)을 평가하고, 객관적 항목으로 미각적 지각인 짠맛(salty flavor), 쓴맛(bitter flavor), 신맛(sour flavor), 군덕맛(mold flavor), 탄산맛(refresh flavor)을 평가하였다. 그 정도는 1에 가까울수록 감지 불가능 한 것으로 평가하였고, 9에 가까울수록 극도로 강하게 감지하는 것으로 나타내었다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 죽염 절임과 스타터를 첨가하여 발효시킨 김치가 스타터를 첨가하지 않은 김치보다 종합적 평가와 조직감이 더 높은 점수로 평가되었다.

< 실시예 5>

본 발명의 방법으로 제조한 김치의 총균 및 젖산균 수 측정

총균수의 측정은 평판계수법(plate count technique)을 이용하여 측정하였는데, 상기 실시예에서 제조한 각 김치를 착즙하여 얻은 김치액을 멸균한 증류수로 단계별로 희석하여, 미리 가열 용해하고 냉각한 플레이트 카운트 아가(plate count agar; Difco, Detroit, MI, USA)에 0.1mL 씩 분주하여 도말하였다. 37°C에서 24-48시간 동안 배양기에서 호기 배양하고, 배양된 균의 colony 수를 계수하여 생성 콜로니 개수(colony forming units per gram, CFU/g)로 총균수를 측정하였다.

또한, 젖산균수의 측정은 총균수 측정과 동일한 방법으로 Leuconostoc sp .는 Leuconostoc 선택배지로 페닐에틸 알콜(phenylethyl alcohol)과 수크로스를 첨가한 PES medium(phenylethyl alcohol sucrose agar medium)를 사용하여 20°C에서 3-4일간 평판 배양하였다. 또한, Lactobacillus sp . 는 Lactobacillus 선택용 배지(LBS medium)에 Pediococcus의 생육을 억제하기 위하여 아세트산과 소듐 아세테이트를 첨가한 modified LBS agar medium(m-LBS medium)을 사용하여 37°C에서 3-4일간 평판 배양하여 나타난 colony수를 계수하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 총균수는 모두 발효 6일차에서 10⁸ cfu/g로 상승한 것으로 나타났고, 죽염 절임과 스타터를 첨가하여 발효시킨 김치와 스타터를 첨가하지 않은 김치가 비슷한 양상으로 변화하는 것을 알 수 있었다. 또한, 스타터를 첨가하지 않은 김치는 제조 즉시에는 가장 낮은 총균수를 보였으나 이후 죽염 절임과 스타터를 첨가하여 발효시킨 김치와 비슷하게 성장하여 빠른 증가율을 보였다.

또한, 김치의 신맛과 시원한 탄산맛을 내는 숙성에 관여하는 젖산균인 Lactobacilus sp . 및 Lueconostoc sp .의 경우, 김치가 숙성되면서 균수가 증가하는 것으로 나타났다(도 6 및 도 7 참조).

특히, 젖산균수의 측정 결과, 발효 4일차에 Lactobacillus sp .의 수는 스타터를 첨가하지 않은 김치보다 스타터를 첨가한 김치에서 10배 가량 높게 함유되어 있는 것으로 나타났으며, Lueconostoc sp .의 수는 스타터를 첨가하지 않은 김치보다 10²배 이상 많이 함유되어 있다는 것이 나타나, 궁극적으로 본 발명의 방법으로 제조된 김치는 기존의 김치보다 맛과 기능성을 개선시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 6>

본 발명에서 분리 및 동정한 신균주의 항산화 활성 분석

<6-1> DPPH 라디칼 소거능 분석

상기 실시예에서 제조한 김치들을 대상으로 착즙하여 3,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 5%, 2% 농도로 각각 희석한 후 다음의 실험에 사용하였다. 김치착즙 시료 100 μL와 1.5 × 10⁴ M DPPH (1,1-diphenyl-2-pic rylhydrazul) 메탄올 용액 100 μL 를 96-well plate에 혼합하여 빛이 차단된 상태에서 30분간 방치 한 후 분광광도계(UV.VIS Spectrophotometer, Jasco, Japan)을 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 이때 스타터 균주를 첨가하지 않은 대조군과 스타터 균주를 첨가한 실험군과의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내었다. 한편, DPPH는 free radical을 가지고 있어 항산화 능력이 있는 물질과 반응하게 되면 안정한 형태로 돌아가면서 흡광도가 감소하게 된다.

측정 결과, 다른 종류의 스타터를 첨가한 김치와 스타터를 첨가하지 않은 김치의 DPPH radical 소거 효과는 LP전주 균주의 경우 60.63%, LP3099 균주는 61.45%, LM 균주는 59.91%, LP전주+LM을 혼합한 혼합균주는 54.53%, LP3099+LM의 혼합균주는 51.32%의 DPPH 소거능을 보인 반면, 스타터를 첨가하지 않은 김치(도면에서 C의 막대 그래프)는 35%의 DPPH 소거능만을 보여 스타터를 첨가한 김치가 유의적으로 높은 항산화 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었으며, 특히 LP전주를 스타터로 첨가한 김치가 다른 김치에 비해 유의적으로 높은 DPPH 라디칼 소거능을 가지고 있었고, 스타터를 첨가하지 않은 김치에 비해 약 1.7배 정도 높은 효과가 있음을 알 수 있었다(도 8 참조). 나아가 본 발명에서 사용한 2가지 균주를 혼합하여 사용하는 경우 단독 균주 사용에 비해서는 라디칼 소거능이 조금 감소하긴 하였으나, 스타터를 첨가하지 않은 군에 비해 유의적으로 라디칼 소거능이 있는 것으로 확인됨에 따라 상기 균주를 혼합하여 사용할 수도 있다는 것을 알 수 있었다.

<6-2> 히드록시 라디칼 소거능 분석

400 μM FeCl₃, 400 μM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA), 400 μM ascorbic acid, 6 mM deoxyribose, 20 mM phosphate buffer(pH 7.4)와 상기 <7-1>에서 사용한 농도별 시료용액을 각각 0.2mL씩 혼합하여 1.4 mL 반응 용액을 만든 다음, 3 mM H₂O₂ 0.2 mL 첨가하여 Fenton 반응에 따라 37°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 혼합액에 2.8 % trichloroacetic acid(TCA) 1.0mL와 1.0% thiobarbituric acid(TBA) 1.0mL를 첨가하여 끓는 물에서 20분간 반응시킨 후 냉각시켜 540nm에서 UV-VIS spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

참고로, 히드록시 라디칼(Hydroxyl radical)은 활성산소 중에서 화학적으로 반응성이 가장 크며 생체내의 산화원인이 되며 DNA 손상을 주거나 돌연변이를 유발하는 물질로 알려져 있다. 첨가한 스타터 종류에 따른 김치의 히드록시 라디칼 소거효과를 측정한 결과는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

이러한 결과를 통해, 스타터를 첨가하지 않은 김치에 비해 죽염 절임과 스타터를 첨가하여 발효시킨 김치에서 과산화수소 소거능이 유의적으로 높게 나타났고, LP전주를 스타터로 하여 제조한 김치가 다른 김치에 비해 높은 소거 효과를 갖는 것으로 나타났다.

< 실시예 7>

본 발명에서 분리 및 동정한 신균주의 항암 활성 분석

본 발명자들은 본 발명의 방법으로 제조된 김치가 항암 활성을 가지는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

(1) 사용시약 및 기기

세포배양을 위해 RPMI 1640, fetal bovine serum(FBS), 0.05% trypsin-0.02% EDTA 및 penicillin-streptomycin(100 units/mL)은 GIBCO사(USA)로부터 구입하여 사용하였고, 세포배양은 CO₂ incubator(Forma, model MCO 96, Japan)를 사용하였다.

(2) 세포주(Cell line)와 세포의 배양

HT-29 인체 결장암세포(HT-29 human colon carcinoma cell)는 한국세포주은행(서울의대)으로부터 분양 받아 실험에 사용하였다. 100units/mL의 penicillin-streptomycin과 10%의 FBS가 함유된 RPMI 1640을 사용하여 37°C, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2-3회 refeeding하고 6-7일 만에 PBS로 세척한 후 0.05% trypsin-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 6-7일 마다 계대배양하면서 실험에 사용하였다. 계대배양시 각각의 passage number로 기록하였고 passage number가 10회 이상일 때는 새로운 암세포를 액체질소 탱크로부터 꺼내어 다시 배양하여 실험하였다.

(3) MTT assay

배양된 암세포를 96well plate에 well당 2×10⁴ cells/mL이 되도록 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 96 well plate의 배지를 제거하고, 상기 실시예 <6-1>에서 수득한 김치 착즙액(시료)와 김치의 메탄올 추출물을 농도별로 희석하여 100 μL씩 첨가한 다음, 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 48시간 배양하였다. 48시간 후 시료를 제거한 다음 phosphate buffered saline(PBS)에 5 mg/mL의 농도로 제조한 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide(MTT) 용액과 배지를 혼합하여 100μL를 첨가하여 동일한 배양 조건에서 4시간 동안 배양하였다. 이때 생성된 포르마잔 결정은 DMSO에 녹여 ELISA reader(model 680, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 540nm에서 흡광도를 측정하였고 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

분석 결과, 각기 다른 종류의 스타터를 첨가한 김치와 스타터를 첨가하지 않은 김치로부터 수득한 착즙액 및 김치 추출물을 농도에 따라 in vitro HT-29 인체 결장암세포에 처리한 결과, 스타터를 첨가하지 않은 김치에 비해 죽염 절임과 스타터를 첨가하여 발효시킨 김치가 유의적으로 높은 암세포 성장 저해율을 나타내었으며 여러 스타터 첨가 김치 중에 LP전주 균주를 사용하여 제조된 김치는 가장 높은 암세포 성장 저해율을 나타내었다.

< 실시예 8>

본 발명에서 분리 동정한 신균주의 염증 관련 유전자 발현 억제 효과 분석

나아가 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 신균주가 암 세포에서 발현되고 있는 염증 관련 유전자의 발현을 억제하는 활성이 있는지 조사하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 유전자 발현은 ExiCycler((Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)으로 측정하였는데, 이를 위해 배양한 암세포를 6well plate에 well당 2×10⁶ cells/mL이 되도록 분주하고 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양한 후 배지를 제거하고, 새 배지에 김치의 메탄올 추출물을 5mg/mL 농도로 첨가한 다음, 동일한 조건에서 48시간 배양하였다. 48시간 후 PBS로 1회 세척한 다음 trizol로 6 well plate에 부착된 cell을 모아 1,200rpm에서 3분간 원심분리한 다음 cell을 모아 RT-PCR을 수행하여 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현을 측정하였다.

그 결과, 염증유발 단백질로 알려진 iNOS과 COX-2의 유전자 발현은 죽염 절임과 스타터를 첨가하여 발효시킨 김치의 경우, 스타터 균주를 사용하지 않은 대조군에 배해 iNOS와 COX-2의 발현이 억제되는 것으로 나타났는데, 특히 LP전주 균주를 사용하여 제조한 김치는 이들 단백질의 발현을 가장 효과적으로 억제시키는 활성이 있는 것으로 나타났다(도 9 및 도 10 참조).

< 실시예 9>

본 발명의 방법으로 제조한 김치의 대장암 예방 효과 분석

통상적으로 대장암에 대한 실험에 이용되는 실험방법으로 Balb/c mouse 6주령을 윤리적으로 이용하여 본 발명의 죽염 절임과 스타터를 첨가하여 발효시킨 김치의 대장암의 예방효과를 실험하였다.즉, 이를 위해 실험 시작일에 AOM을 투여하고 2주 후에 2% DSS를 1주일간 음수로 자유 섭취하도록 하였다. 또한 2주간 휴식기를 가진 후에 1주간 DSS를 자유섭취한 후 다시 2주간의 휴식기를 가지도록 하였다. 이후 본 발명의 방법으로 제조한 김치시료는 DSS를 처음 투여하는 시점(실험 시작 2주 후)부터 실험 시작 6주까지 경구투여하였다. 이상과 같은 마우스 모델을 대상으로 진행한 상기 실험 진행 모델은 도 11에 나타내었다.

분석 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이 대장암을 유도시킨 동물의 대장을 적출한 후 대장의 tumor 수를 관찰한 결과, 죽염 절임과 스타터를 첨가하여 발효시킨 김치가 스타터를 첨가하지 않은 김치보다 종양의 발생 수가 적었고, 특히 LP PNU를 첨가하여 제조한 김치에서 유의적으로 종양의 생성수가 낮은 것을 관찰되었다. 또한 LM PNU과 함께 LP PNU를 첨가한 경우 LM PNU과 LP 3099를 첨가하였을 때 보다 종양의 발생이 적은 것으로 나타났다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에 대한 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

원료인 배추의 소금절임 단계와 절임배추에 양념을 묻히는 양념단계를 구비하는 김치 제조 방법에 있어서,
상기 소금절임 단계는 배추 총 무게의 3 ~ 4 중량%에 해당하는 3회 구운 죽염으로 침지하는 절임단계를 포함하고,
상기 양념단계는 유산균 스타터를 추가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 항암 활성 김치 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 유산균 스타터는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) PNU (KCCM11352P) 또는 락토바실러스 메센테로이드(Lactobacillus mesenteroides) PNU (KCCM11353P)인 것을 특징으로 하는 항암 활성 김치 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 소금절임 단계는 3회 구운 죽염을 배추의 밑둥으로부터 1/3 지점까지 뿌리거나, 염수에 침지 후 10 ~ 20시간동안 1 ~ 10℃에서 절인 것을 특징으로 하는 항암 활성 김치 제조방법.