ES2279157T3 - Extracto con actividad antitumoral y antivenenosa. - Google Patents
Extracto con actividad antitumoral y antivenenosa. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de una composición que comprende un extracto de Calotropis procera, y al menos un compuesto terapéutico seleccionado del grupo que comprende un agente anticancerígeno, un anticuerpo citotóxico o un fragmento del mismo, una hormona citotóxica o un fragmento de la misma y un péptido citotóxico o un fragmento del mismo; para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
Description
Extracto con actividad antitumoral y
antivenenosa.
La presente invención se refiere al campo
médico. La invención se refiere en un primer aspecto a extractos de
la planta Calotropis procera, que tienen una actividad
farmacológica, en particular una actividad antitumoral y/o
actividad antivenenosa y a compuestos activos aislados de los
mismos. En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a
métodos para obtener dichos extractos. La invención se refiere
además en un tercer aspecto a una composición farmacéutica para el
tratamiento del cáncer que comprende una cantidad eficaz de dichos
extractos o un compuesto activo de los mismos. En un cuarto aspecto,
la presente invención se refiere al uso de los extractos o de un
compuesto activo de los mismos como un medicamento, y al uso de
dichos extractos o de un compuesto activo de los mismos en la
preparación de un medicamento para el tratamiento contra el
cáncer.
El cáncer se desarrolla en un tejido dado cuando
alguna mutación genómica perturba la cinética del ciclo celular al
aumentar la proliferación celular o disminuir la muerte celular, o
ambas. Esta perturbación lleva a un crecimiento no restringido de
una población celular genómicamente transformada. Algunas células de
esta población celular transformadas pueden cambiar al fenotipo
angiogénico, haciéndoles posible reclutar células endoteliales a
partir de tejido sano y llevar al crecimiento sostenido del tejido
tumoral neoplásico en desarrollo. Posteriormente, algunas células
migran del tejido tumoral neoplásico y colonizan tejido nuevo,
usando vasos sanguíneos o linfáticos como rutas principales de
migración. Este proceso también se conoce como el proceso
metastásico.
En la práctica, la mayoría de los agentes usados
actualmente en hospitales para tratar a pacientes de cáncer son
fármacos, que más o menos tienen como objetivo directamente la
cinética celular, es decir, la proliferación celular, del cáncer
que se combatirá. El mecanismo de funcionamiento de estos fármacos
contra el cáncer se refiere esencialmente a la ruptura del
desarrollo de células malignas al actuar sobre la cinética de la
célula. Estos fármacos incluyen agentes alquilantes, agentes
intercalantes, antimetabolitos, etc., la mayoría de los cuales
tienen como objetivo a ADN o enzimas que regulan los procesos de
duplicación y alargamiento del ADN. Estos fármacos atacan al
ADN.
Una desventaja principal de estos fármacos
supone que los fármacos no funcionan de una manera selectiva, es
decir, no seleccionan entre células normales y neoplásicas. Se usan
según el hecho de que el ADN de células que proliferan rápidamente,
es decir, células de cáncer, es más sensible a este tipo de agentes
que el ADN de las que proliferan menos rápidamente, es decir,
células normales. Sin embargo, los tumores que crecen rápidamente
no siempre son tumores que muestran altos niveles de proliferación
celular. Los tumores que crecen rápidamente también pueden incluir
tumores que muestran bajos niveles de muerte celular en comparación
con la población celular normales que se derivan de estas células
tumorales. Para estos tipos de tumores que crecen rápidamente, los
fármacos mencionados no son
eficaces.
eficaces.
Además, la gran mayoría de los fármacos usados
en el tratamiento normal del cáncer usando el enfoque de cinética
de células tienen la desventaja de ser tóxicos o incluso altamente
tóxicos, es decir, incluyen muchos efectos secundarios
perjudiciales en las células, tejidos y órganos sanos, y esto limita
su uso clínico a un número de administraciones por paciente
relativamente bajo. Además, varios de estos compuestos deben
combinarse en un régimen poliquimioterápico con el fin de tener
cualquier efecto observable contra el cáncer. A modo de evidencia,
estas combinaciones de fármacos contra el cáncer aumentan
dañinamente la toxicidad del tratamiento y también limitan el
número de administraciones que pueden aplicarse.
Se han propuesto algunos fármacos contra el
cáncer de orígenes naturales, tales como por ejemplo compuestos
antitubulina, usando un enfoque terapéutico diferente al enfoque de
la cinética de las células. Estos fármacos intentan prevenir la
migración de células cancerosas que escapan de la masa del tumor e
invaden primero el tejido adyacente estableciendo de esta manera
metástasis. Sin embargo, los compuestos de este tipo conocidos
hasta el momento también muestran efectos secundarios tóxicos
grandes, lo que limita su uso durante largos periodos de
trata-
miento.
miento.
Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad
urgente en la técnica por encontrar fármacos contra el cáncer
mejorados, que superen al menos algunas de las desventajas
mencionadas anteriormente. En consecuencia, un objetivo general de
la invención es proporcionar fármacos contra el cáncer mejorados. En
particular, la invención pretende proporcionar un fármaco contra el
cáncer mejorado, que muestra efectos secundarios mínimos.
Una realización de la presente invención es un
extracto de la planta Calotropis procera, caracterizado
porque dicho extracto tiene una actividad farmacológica, en
particular una actividad antivenenosa. En un primer aspecto, por
tanto, la presente invención se refiere al uso de una composición
que comprende un extracto de Calotropis procera según la
reivindicación 1.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
procedimiento de extracción para obtener un extracto que tiene
componentes biológicamente activos según la reivindicación 12.
Todavía en otro aspecto, la invención se refiere a un extracto
activo según la reivindicación 13.
Una realización de la presente invención es un
extracto tal como se describió anteriormente obtenido usando un
procedimiento de extracción que comprende las etapas de:
a) extraer el material de partida de dicha
planta de Calotropis procera, seleccionándose dicho material
de partida de entre frutos, partes subterráneas, partes aéreas y
sus mezclas, en un alcohol alifático, disolviendo el material de
partida en dicho alcohol, obteniendo de esta manera una suspensión
del material en dicho alcohol, agitar dicha suspensión y filtrar
dicha suspensión mediante vidrio fritado obteniendo de esta manera
un primer filtrado y una primera parte sólida;
b) extraer dicha primera parte sólida en un
alcohol alifático obteniendo de esta manera un segundo filtrado y
una segunda parte sólida;
c) combinar dicho primer y segundo filtrados
obteniendo de esta manera un filtrado combinado, y evaporar el
filtrado combinado a vacío obteniendo así el extracto.
Otra realización de la presente invención es un
extracto tal como se describió anteriormente, obtenido usando un
procedimiento de una extracción que comprende las etapas de:
a) moler el material de partida de hojas,
tallos, cortezas y raíces de Calotropis procera para dar un
polvo fino de la planta,
b) extraer el polvo de la etapa a) con
diclorometano durante al menos 6, 12, 18 o preferiblemente 24 horas
usando un extractor Soxhlet,
c) decantar el diclorometano de la etapa b), y
evaporar el filtrado, tras la filtración, para obtener una
goma.
Otra realización de la presente invención es un
extracto tal como se describió anteriormente obtenido usando un
procedimiento de extracción que comprende las etapas de:
a) moler el material de partida de hojas,
tallos, cortezas y raíces de Calotropis procera para dar un
polvo fino de la planta,
b) extraer el polvo de la etapa a) con
diclorometano durante al menos 6, 12, 18 o preferiblemente 24 horas
usando un extractor,
c) decantar el diclorometano de la etapa b) y
evaporar el filtrado, tras la filtración, para obtener una goma,
d) extraer el residuo de la etapa c) con metanol
durante al menos 6, 12, 18 o preferiblemente 24 horas usando un
extractor Soxhlet,
e) decantar el metanol de la etapa d), evaporar
el filtrado, tras la filtración, para obtener una goma,
f) someter la goma de la etapa e) a
cromatografía en columna usando gel de sílice ultrarrápido y
diclorometano-metanol como solvente, y
g) recoger una primera fracción y evaporar la
fracción para obtener una goma que tiene los componentes
biológicamente activos.
Otra realización de la presente invención es un
extracto tal como se describió anteriormente obtenido usando un
procedimiento de extracción que comprende las etapas de:
a) moler el material de partida de hojas,
tallos, cortezas y raíces de Calotropis procera para dar un
polvo fino de la planta,
b) extraer el polvo de la etapa a) con
diclorometano durante al menos 6, 12, 18 o preferiblemente 24 horas
usando un extractor Soxhlet,
c) decantar el diclorometano de la etapa b), y
evaporar el filtrado, tras la filtración, para obtener una goma,
d) extraer el residuo de la etapa c) con metanol
durante al menos 6, 12, 18 o preferiblemente 24 horas usando un
extractor Soxhlet,
e) decantar el metanol de la etapa d), evaporar
el filtrado, tras la filtración, para obtener una goma,
f) someter la goma de la etapa e) a
cromatografía en columna usando gel de sílice ultrarrápido y
diclorometano-metanol como solvente,
g) recoger una primera fracción, que tiene
componentes biológicamente activos,
h) aplicar la fracción concentrada de la etapa
g) a cromatografía en columna usando gel de sílice ultrarrápido y
hexano-acetona como solvente para dar dos
fracciones, y
i) lavar la columna tras la etapa h) con metanol
para dar una tercera fracción, que tiene los componentes
biológicamente activos.
Otra realización de la presente invención es una
composición que comprende:
- un extracto de Calotropis procera tal
como se describió anteriormente y
- al menos un compuesto terapéutico y/o un
tratamiento físico que ejerce efectos secundarios relevantes y
perjudiciales en células, tejidos u órganos relacionados, normales y
no cancerosos.
Otra realización de la presente invención es un
producto que contiene
- un extracto de Calotropis procera, tal
como se describió anteriormente y
- al menos un compuesto terapéutico y/o un
tratamiento físico que ejerce efectos secundarios perjudiciales y
relevantes en células, tejidos u órganos relacionados, normales y no
cancerosos como una preparación combinada para su administración
simultánea, separada o secuencial a un sujeto.
Otra realización de la presente invención es una
composición tal como se describió anteriormente o un producto tal
como se describió anteriormente, en los que uno de los extractos
comprende al menos dos compuestos activos seleccionados del grupo
que comprende asclepina, calactina, vorusharina, calotropina,
calotropagenina, uzarigenina, calotoxina, usharina, usharidina y
2'oxo-vorusharina.
Otra realización de la presente invención es una
composición tal como se describió anteriormente, o un producto tal
como se describió anteriormente, en los que uno de los extractos
comprende al menos uno de los compuestos que están representados en
la tabla 1.
Otra realización de la presente invención es una
composición tal como se describió anteriormente o un producto tal
como se describió anteriormente, en los que la razón de peso de
extracto:compuesto terapéutico está en el intervalo de 0,001:1 a
1000:1.
Otra realización de la presente invención es una
composición tal como se describió anteriormente, o un producto tal
como se describió anteriormente, para usarse como un
medicamento.
Otra realización de la presente invención es una
composición tal como se describió anteriormente, o un producto tal
como se describió anteriormente, para usarse como un medicamento
para el tratamiento contra el cáncer.
Otra realización de la presente invención es una
composición o producto tal como se describió anteriormente, en los
que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de
mama, linfoma, sarcoma, cáncer pancreático, melanoma, cáncer
colorrectal, glioma, cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer
pulmonar de células pequeñas, cáncer de piel, cáncer de hueso,
cáncer ovárico, cáncer del SNC, cáncer renal, cáncer de vejiga,
cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata, cáncer de hígado y
cánceres hematológicos.
Otra realización de la presente invención es una
composición tal como se describió anteriormente, o un producto tal
como se describió anteriormente, que comprende además uno o más
compuestos terapéuticos adicionales.
Otra realización de la presente invención es una
composición tal como se describió anteriormente, o un producto tal
como se describió anteriormente, en los que dicho(s)
compuesto(s) terapéutico(s) es(son) un
agente(s) contra el cáncer.
Otra realización de la presente invención es una
composición tal como se describió anteriormente, o un producto tal
como se describió anteriormente, en los que el compuesto terapéutico
se selecciona del grupo que comprende adriamicina, alqueran,
ara-c, bleomicina, biCNU (carmustina), busulfán,
CCNU (lomustina), camptotecina, carboplatino, cisplatino,
ciclofosfamida, citoxan, daunorrubicina, DTIC (dacarbacina),
5-FU (fluorouracilo), fludarabina, gemcitabina
(gemzar), herceptina, hexametilmelamina, hidrea, idarrubicina,
ifosfamida, irinotecano (camptosar, CPT-11),
leustatina, metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona,
muforan, navelbina, mostaza nitrogenada, oxaliplatino, rituxan,
STI-571 (imatinib), estreptozocina, taxol, taxotere,
topotecano (hicamtina), velban, vincristina, VP-16
(etopósido), xeloda (capecitabina) o zevelina.
\newpage
Otra realización de la presente invención es una
composición tal como se describió anteriormente, o un producto tal
como se describió anteriormente, en los que el compuesto terapéutico
se selecciona del grupo que comprende adriamicina, vincristina,
camptotecina y oxaliplatino.
Otra realización de la presente invención es una
composición tal como se describió anteriormente, o un producto tal
como se describió anteriormente, en los que el(los)
compuesto(s) terapéutico(s) es(son) un
anticuerpo(s) citotóxico(s)
o un fragmento del(de los) mismo(s).
o un fragmento del(de los) mismo(s).
Otra realización de la presente invención es una
composición tal como se describió anteriormente, o un producto tal
como se describió anteriormente, en los que el(los)
compuesto(s) terapéutico(s) es(son) un
péptido(s) citotóxico(s) o un fragmento del(de
los) mismo(s).
Otra realización de la presente invención es una
composición tal como se describió anteriormente, que comprende
además un vehículo farmacéuticamente aceptable o un producto tal
como se describió anteriormente, en los que la composición y/o
el(los) compuesto(s) terapéutico(s)
comprende(n) además un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
aceptable.
Otra realización de la presente invención es un
uso de un extracto de Calotropis procera tal como se
describió anteriormente, en la preparación de un medicamento para
aliviar los efectos secundarios de uno o más compuestos
terapéuticos.
Otra realización de la presente invención es un
uso de un extracto de Calotropis procera tal como se
describió anteriormente en la preparación de un medicamento para
aumentar la dosis administrada a un individuo de uno o más
compuestos terapéuticos.
Otra realización de la presente invención es un
uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que
dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s)
tiene(n) actividad contra el cáncer.
Otra realización de la presente invención es un
uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que
dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s) se
selecciona(n) del grupo que comprende adriamicina, alqueran,
ara-c, bleomicina, biCNU, busulfán, CCNU,
carboplatino, cisplatino, ciclofosfamida, citoxan, daunorrubicina,
DTIC, 5-FU, fludarabina, gemcitabina (gemzar),
herceptina, hexametilmelamina, hidrea, idarrubicina, ifosfamida,
irinotecano (camptosar, CPT-11), leustatina,
metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, muforan,
navelbina, mostaza nitrogenada, oxaliplatino, rituxan,
STI-571, estreptozocina, taxol, taxotere, topotecano
(hicamtina), velban, vincristina, VP-16, xeloda
(capecitabina) o zevelina.
Otra realización de la presente invención es un
uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que
dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s) se
selecciona(n) del grupo que comprende adriamicina,
vincristina, camptotecina y oxaliplatino.
Otra realización de la presente invención es un
uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que
dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s)
es(son) un anticuerpo(s) citotóxico(s) o un
fragmento del mismo.
Otra realización de la presente invención es un
uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que
dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s)
es(son) una hormona(s) citotóxica(s) o un
fragmento de la misma.
Otra realización de la presente invención es un
uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que
dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s)
es(son) un péptido(s) citotóxico(s) o un
fragmento del mismo.
Otra realización de la presente invención es un
uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que
dicho extracto comprende al menos dos compuestos activos
seleccionados de asclepina, calactina, vorusharina, calotropina,
calotropagenina, uzarigenina, calotoxina, usharina y usharidina.
Otra realización de la presente invención es un
uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que
dicho extracto contiene además al menos uno de los compuestos que
están representados en la tabla 1.
Otra realización de la presente invención es un
uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que
dicho extracto se administra antes de dicho(s)
compuesto(s) terapéutico(s).
Otra realización de la presente invención es un
uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que
dicho extracto se administra tras dicho(s)
compuesto(s) terapéutico(s).
Otra realización de la presente invención es un
uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que
dicho extracto se administra al mismo tiempo que dicho(s)
compuesto(s) terapéutico(s).
Otra realización de la presente invención es un
uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que
la razón de peso de extracto:compuesto terapéutico está en el
intervalo de 0,001:1 a 1000:1.
Otra realización de la presente invención es un
procedimiento de extracción para obtener un extracto que tiene
componentes biológicamente activos que comprende las etapas de:
a) extraer el material de partida de la planta
de Calotropis procera, seleccionándose dicho material de
partida de entre frutos, partes aéreas, partes subterráneas y sus
mezclas, en un alcohol alifático, disolviendo dicho material de
partida en dicho alcohol obteniendo de esta manera una suspensión de
dicho material en dicho alcohol, agitar dicha suspensión y filtrar
dicha suspensión mediante vidrio fritado obteniendo de esta manera
un primer filtrado y una parte sólida;
b) extraer dicha primera parte sólida en un
alcohol alifático obteniendo de esta manera un segundo filtrado y
una segunda parte sólida;
c) combinar dicho primer y segundo filtrado
obteniendo de esta manera un filtrado combinado y
d) evaporar el filtrado combinado a vacío
obteniendo de esta manera dicho extracto.
Otra realización de la presente invención es un
procedimiento de extracción para obtener varios extractos que
tienen componentes biológicamente activos presentes sustancialmente
en las hojas, tallos, corteza y raíces de Calotropis
procera, que comprende las siguientes etapas:
a) moler el material de partida de hojas, tallo,
cortezas y raíces de Calotropis procera para dar un polvo
fino de la planta,
b) extraer el polvo de la etapa a) con
diclorometano durante al menos 6, 12, 18 o preferiblemente 24 horas
usando un extractor Soxhlet, y
c) decantar el diclorometano de la etapa b), y
evaporar el filtrado, tras la filtración, para obtener una
goma.
Otra realización de la presente invención es un
procedimiento de extracción tal como se describió anteriormente que
comprende además las etapas de:
d) extraer el residuo de la etapa c) con metanol
durante al menos 6, 12, 18 o preferiblemente 24 horas usando un
extractor Soxhlet
e) decantar el metanol de la etapa d), evaporar
el filtrado, tras la filtración, para obtener una goma,
f) someter la goma de la etapa e) a
cromatografía en columna usando gel de sílice ultrarrápido y
diclorometano-metanol como solvente, y
g) recoger una primera fracción que tiene los
componentes biológicamente activos y evaporar el eluyente para
obtener dicho extracto.
Otra realización de la presente invención es un
procedimiento de extracción tal como se describió anteriormente,
que comprende además las etapas de:
h) aplicar fracción de la etapa g) a
cromatografía en columna usando gel de sílice ultrarrápido y
hexano-acetona para dar dos fracciones,
i) lavar la columna tras la etapa h) con metanol
para dar una tercera fracción, que tiene los componentes
biológicamente activos.
Otra realización de la presente invención es un
procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que la
etapa b) se lleva a cabo a una temperatura de trabajo de entre 20 y
80ºC.
Otra realización de la presente invención es un
procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que la
etapa b) se repite entre una y cinco veces.
Otra realización de la presente invención es un
procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que la
duración de la etapa b) es de entre 4 horas y 48 horas.
Otra realización de la presente invención es un
procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que la
fase sólida de la etapa d) es gel de sílice.
Otra realización de la presente invención es un
procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que el
eluyente de la etapa d) es un eluyente binario, siendo la razón
entre los componentes del eluyente de entre 100:0 a 0:100.
\newpage
Otra realización de la presente invención es un
procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que los
componentes del eluyente binario comprenden un solvente alcohólico y
un solvente no polar.
Otra realización de la presente invención es un
procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que la
etapa e) se lleva a cabo a una temperatura de trabajo de entre 20 y
50ºC.
Otra realización de la presente invención es un
procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que la
fase sólida de la etapa f) es gel de sílice.
Otra realización de la presente invención es un
procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que el
eluyente de la etapa f) es un eluyente binario, siendo la razón
entre los dos componentes del eluyente de entre 100:0 a 0:100.
Otra realización de la presente invención es un
procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que los
componentes del eluyente binario son no polares y un solvente más
polar.
Otra realización de la presente invención es un
procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que la
razón entre los dos componentes de eluyente, no polar:polar es de
entre 50:50 y 100:0.
Otra realización de la presente invención es un
procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que el
solvente de la etapa h) es metanol.
Otra realización de la presente invención es un
procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que la
etapa e) se lleva a cabo a una temperatura de trabajo de entre 20 y
50ºC.
Otra realización de la presente invención es un
extracto activo aislado del procedimiento tal como se describió
anteriormente.
Otra realización de la presente invención es un
uso de un extracto activo tal como se describió anteriormente como
un medicamento.
Otra realización de la presente invención es un
uso de un extracto activo tal como se describió anteriormente, en
la preparación de un medicamento para el tratamiento contra el
cáncer.
Otra realización de la presente invención es el
uso de una composición según la reivindicación 1 para la preparación
de un medicamento para tratar el cáncer, en el que dicho cáncer se
selecciona del grupo que comprende cáncer de mama, linfoma,
sarcoma, cáncer pancreático, melanoma, cáncer colorrectal, glioma,
cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer pulmonar de células
pequeñas, cáncer de piel, cáncer de hueso, cáncer ovárico, cáncer
del SNC, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello,
cáncer de próstata, cáncer de hígado y cánceres hematológicos.
La presente invención se refiere además a un kit
según la reivindicación 14. Otra realización de la presente
invención es un kit que comprende un recipiente en el que está
presente un extracto de Calotropis procera tal como se
describió anteriormente, y un recipiente en el que está presente un
compuesto terapéutico.
La presente invención se refiere a extractos de
la planta Calotropis procera. En una primera realización la
invención se refiere a extractos de la planta Calotropis
procera, que tienen una actividad farmacológica, en particular
una actividad antitumoral y/o una actividad antivenenosa.
Sorprendentemente, al menos uno de los extractos según la invención
combina un efecto antitumoral con una actividad antivenenosa.
Según la presente invención el término
"actividad antitumoral", se refiere a los efectos antitumorales
in vitro, así como in vivo ejercidos por al menos uno
de los extractos o compuestos aislados de los mismos. Los efectos
antitumorales incluyen esencialmente, pero no se limitan a, una
disminución espectacular del crecimiento celular y un efecto
pro-apoptótico. Y lo que es más importante, los
extractos según la invención muestran actividad antitumoral sobre
un gran número de tipos de cánceres, tales como cáncer de mama,
cánceres de melanoma o linfoma, entre otros.
Otra característica de los extractos según la
invención abarca su actividad antivenenosa. El término "actividad
antivenenosa" se refiere a la capacidad de los extractos según la
invención o de los compuestos aislados de los mismos, para atenuar
o revertir los efectos de los compuestos o tratamientos
terapéuticos. Un "compuesto terapéutico", tal como se usa en
el presente documento, se refiere a un compuesto que ejerce un
efecto perjudicial relevante, y tóxico en células, tejidos u otros
órganos relacionados y normales, es decir, no cancerosos. Por
tanto, el término compuesto terapéutico también puede incluir un
compuesto, fármaco, tratamiento físico o medicamento, usado para
tratar una enfermedad particular, que ejerza efectos secundarios
tóxicos perjudiciales. Estos efectos secundarios se conocen por el
experto e incluyen, pero no se limitan a, cansancio, náuseas,
vómitos, úlceras, úlceras bucales, piel reseca, piel sensible, caída
del cabello, recuento reducido de glóbulos rojos y blancos. Tales
compuestos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, agentes de
quimioterapia, radiación, anticuerpos y hormonas.
Los compuestos terapéuticos útiles según la
invención incluyen los usados en la quimioterapia o que son
citotóxicos. Incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de
adriamicina, alqueran, ara-c, bleomicina, biCNU,
busulfán, CCNU, carboplatino, cisplatino, ciclofosfamida, citoxan,
daunorrubicina, DTIC, 5-FU, fludarabina, gemcitabina
(gemzar), herceptina, hexametilmelamina, hidrea, idarrubicina,
ifosfamida, irinotecano (camptosar, CPT-11),
leustatina, metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona,
muforan, navelbina, mostaza nitrogenada, oxaliplatino, rituxan,
STI-571, estreptozocina, taxol, taxotere, topotecano
(hicamtina), velban, vincristina, VP-16, xeloda
(capecitabina) o zevelina.
Otro aspecto de la invención es un agente
terapéutico que comprende uno o más agentes contra el cáncer que se
derivan de un extracto de la presente invención. Los compuestos
anticancerígenos posibles según la invención son cualquiera
extraídos de Calotropis procera tales como asclepina,
calactina, voruscharina, calotropina, calotropagenina, uzarigenina,
calotoxina, uscharina y uscharidina.
En otra realización de la invención, los
compuestos anticancerígenos son cualquiera extraídos de
Calotropis procera tal como
2''oxo-voruscharina, y derivados de los mismos tal
como se muestra en la tabla 2.
Otro aspecto de la invención es un agente
terapéutico que es un extracto de la invención. Dicho extracto puede
ser idéntico a un extracto que tenga una actividad antivenenosa.
Alternativamente, dicho extracto puede ser idéntico a un extracto
que tenga una actividad antivenenosa, con excepción de la ausencia
de uno o más compuestos activos de cualquier extracto.
Alternativamente, dicho extracto puede ser idéntico a un extracto
que tenga una actividad antivenenosa, con excepción de la presencia
de uno o más compuestos activos adicionales en cualquier extracto.
Alternativamente, dicho extracto puede ser idéntico a un extracto
que tenga una actividad antivenenosa, con excepción de la
diferencia en la concentración de uno o más compuestos activos en
cualquier extracto.
Otro aspecto de la invención es que el compuesto
terapéutico es un anticuerpo, o un fragmento del mismo. Dicho
anticuerpo demuestra actividad citotóxica. Ejemplos de anticuerpos
terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, HerceptinR,
Prostascint, Rituximab y Trastuzumab.
Otro aspecto de la invención es que el compuesto
terapéutico es una hormona, o un fragmento de la misma. Dicha
hormona demuestra actividad citotóxica. Ejemplos de hormonas
terapéuticas incluyen, pero no se limitan a, buserelina,
fluoximesterona, flutamida, formestan, noretandrolona,
noretisterona, prednisolona, prednisona y tamoxifeno.
Otro aspecto de la invención es que el compuesto
terapéutico es un péptido, o un fragmento del mismo. Dicho péptido
demuestra actividad citotóxica.
Por fragmento en referencia a un anticuerpo,
hormona o péptido se quiere decir un péptido que comprende una
parte del anticuerpo, hormona o péptido que puede reconocer el
objetivo del anticuerpo, hormona o péptido completo. El fragmento
también puede reconocer el objetivo del anticuerpo, hormona o
péptido completo. La parte puede comprender sustituciones,
deleciones o inserciones de aminoácidos, que no cambien
sustancialmente el reconocimiento del objetivo por la parte. El
número de sustituciones, deleciones o inserciones puede ser menor
que 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40,
45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400 ó
500.
Otro aspecto de la invención es que la actividad
intravenosa de los extractos permite la administración de una dosis
más alta del compuesto terapéutico. Al administrar una dosis más
alta de compuesto terapéutico, el cáncer puede tratarse en forma
más rápida y eficaz. Un individuo que reciba una dosis más alta, en
combinación con un extracto de la invención, se beneficiaría de
efectos secundarios reducidos del compuesto terapéutico.
Otro aspecto de la invención es que la actividad
antivenenosa de los extractos permite la administración de una
combinación de compuestos terapéuticos. Una terapia de combinación
seleccionaría aspectos diferentes de cáncer simultáneamente,
llevando así a un tratamiento más eficaz y eficiente. Al administrar
la combinación según la invención, el paciente padecería menos
efectos secundarios y se beneficiaría de la eficacia de la terapia
de combinación.
En otra realización, la presente invención se
refiere a los compuestos activos, aislados de los extractos. Los
términos "compuestos activos" o "componentes activos" de
los extractos, se utilizan en el presente documento como sinónimos,
y se refieren a los compuestos presentes en los extractos, que
muestran una actividad que es similar a al menos una de las
actividades definidas anteriormente de los extractos.
En todavía realización, la presente invención se
refiere a métodos para obtener los extractos de la planta
Calotropis procera.
Debido al hecho de que al menos uno de los
extractos según la invención ejerce una actividad antitumoral, los
extractos según la invención son particularmente útiles para el
tratamiento de enfermedades tales como el cáncer. Por lo tanto, en
otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones
farmacéuticas que comprenden uno de los extractos descritos
anteriormente o al menos a un compuesto activo de los mismos.
Además, ya que los extractos según la invención
ejercen también una actividad antivenenosa, también es
particularmente adecuado que se combinen con otros compuestos
terapéuticos, tales como otros medicamentos, que muestren efectos
secundarios tóxicos. Por lo tanto, en otra realización, la presente
invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende
uno de los extractos descritos anteriormente o al menos un compuesto
activo de los mismos, y un segundo compuesto, que ejerce una
actividad farmacológica que tiene efectos secundarios tóxicos.
Además, la presente invención se refiere a uno
de los extractos y/o al menos a un compuesto activo de los mismos
como un medicamento. La presente invención se refiere además al uso
de uno de los extractos o al menos un compuesto activo de los
mismos en la preparación de un medicamento para el tratamiento de
enfermedades, en particular
cáncer.
cáncer.
Otros objetos y ventajas de la presente
invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción
detallada tomada en conjunto con las figuras adjuntas.
La figura 1 describe el crecimiento global de
tipos diferentes de tumores como una función de la concentración de
un extracto según la invención.
Las figuras 2 a 11 muestran efectos in
vitro de un extracto según la invención en diferentes tipos de
líneas celulares cancerosas humanas, que son líneas celulares de
cáncer de mama en la figura 2, líneas celulares de cáncer de
sarcoma en la figura 3, líneas celulares de cáncer pancreático en la
figura 4, líneas celulares de cáncer de melanoma en la figura 5,
líneas celulares de cáncer de colon en la figura 6, líneas celulares
de cáncer de glioma en la figura 7, líneas celulares de cáncer
pulmonar en la figura 8, líneas celulares de cáncer de vejiga en la
figura 9, líneas celulares de cáncer de próstata en la figura 10 y
líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello en la figura 11.
Las figuras 12 a 16 representan efectos in
vitro de un extracto según la invención en la cinética del ciclo
celular de células que corresponden a cinco líneas celulares
humanas diferentes, HCT-15 (figura 12), RPMI
(figura 13), A172 (figura 14), J82 (figura 15) y Hs683 (figura 16).
La parte superior de las figuras muestra el crecimiento celular
completo, como el porcentaje de células cancerosas vivas para
controlar células a diferentes dosis del extracto. Las partes
medias e inferiores de las figuras muestran el efecto de la cinética
del ciclo celular del extracto a diferentes concentraciones tras 24
horas y 72 horas respectivamente. El significado estadístico se
evaluó con la prueba t de Student en el que *: p < 0,05, **: p
< 0,01: ***: p < 0,001.
Las figuras 17 a 20 representan los efectos
inductores de apoptosis e inductores de necrosis in vitro de
un extracto según la invención en células que corresponden a cuatro
líneas celulares humanas diferentes, HCT-15 (figura
17), A172 (figura 18), J82 (figura 19) y Hs683 (figura 20). La parte
superior de las figuras muestra los efectos inductores de apoptosis
e inductores de necrosis del extracto a diferentes dosis tras 24
horas, la parte inferior de las figuras tras 72 horas.
La figura 21 representa los efectos de un
extracto según la invención en un modelo de cáncer de linfoma in
vivo. El extracto mencionado se administró mediante inyección
peritoneal a dosis de 2,5 mg/kg; 5 mg/kg y 10 mg/kg de extracto en
ratones portadores de tumor de linfoma P388. La figura 21A
representa los efectos de un extracto en el peso de ratones control
(no tratados) y en ratones tratados. La figura 21B representa los
efectos del extracto en el crecimiento tumoral en ratones control y
en ratones tratados.
La figura 22 representa los efectos de un
extracto según la invención en un modelo de cáncer de linfoma in
vivo. Dicho extracto se administró mediante inyección
intraperitoneal a dosis de 0,63 mg/kg; 1,25 mg/kg y 2,5 mg/kg de
extracto en ratones portadores de tumor de linfoma P388. La figura
22A representa los efectos del extracto en el peso de ratones
control y ratones tratados. La figura 22B representa los efectos de
dicho extracto en el crecimiento tumoral en ratones control y
ratones tratados.
La figura 23 representa los efectos de un
extracto según la invención en un modelo de cáncer de melanoma in
vivo. Dicho extracto se administró mediante inyección
intraperitoneal a dosis de 2,5 mg/kg: 1,25 mg/kg y 0,63 mg/kg de
extracto en ratones portadores de melanoma B16. La figura 23A
representa los efectos del extracto en el peso de ratones control
(no tratados) y ratones tratados. La figura 23B representa los
efectos del extracto en el crecimiento tumoral en ratones control y
en ratones tratados.
La figura 24 representa los efectos de un
extracto según la invención en un modelo de cáncer de melanoma in
vivo. El extracto se administró vía oral a dosis de 0,36
mg/kg;1,25 mg/kg y 2,5 mg/kg de extracto en ratones portadores de
melanoma B16. La figura 24A representa los efectos en el peso de
ratones control y ratones tratados. La figura 24B representa los
efectos del extracto en el crecimiento de tumor en ratones control y
en ratones
tratados.
tratados.
La figura 25 representa los efectos de un
extracto según la invención en un modelo de cáncer de mama in
vivo. El extracto se administró mediante inyección
intraperitoneal a dosis de 2,5 mg/kg; 5 mg/kg y 10 mg/kg de extracto
en ratones portadores de cáncer de mama MXT-HI. La
figura 25A representa los efectos del extracto en el peso de
ratones control (no tratados) y ratones tratados. La figura 25B
representa los efectos del extracto en el crecimiento tumoral en
ratones control y ratones tratados.
La figura 26 representa el ajuste general
estadístico para los ratones portadores de cáncer de mama
MXT-HI de los grupos de prueba (es decir, inyección
intraperitoneal de los ratones a dosis de extracto de 2,5 mg/kg; 5
mg/kg y 10 mg/kg) y el grupo de control, con respecto a la
supervivencia (análisis estadístico de
Kaplan-Meier).
La figura 27 representa los efectos de un
extracto según la invención a dosis de 5 mg/kg y 1,25 mg/kg en la
cantidad de glóbulos blancos, glóbulos rojos, hemoglobina y
concentración de hematocrito en el día tres tras la inyección
peritoneal en ratones en comparación con ratones control (en la
figura la dosis de extracto "blanco" es de 1,25 mg/kg).
Las figuras 28 a 35 ilustran los efectos
antivenenosos de extractos según la invención cuando se combinan
con compuestos antitumorales adriamicina o vincristina o
camptotecina u oxaliplatino.
La planta Calotropis procera, que
pertenece a la familia de las Asclepiadaceae, es una planta
que crece en África y Asia. Esta planta se usa en la medicina
tradicional y también se ha estudiado con respecto a un número
considerable de usos tales como un antipirético, antimalárico,
antidiarreico, analgésico, antiinflamatorio gástrico, protector de
mucosas y como un insecticida, antitusivo, antibacteriano, en
curación de heridas y relajante muscular. Se sabe que los tallos,
flores y hojas de Calotropis procera contienen ciertos
compuestos conocidos como cardenólidos. Recientemente, se ha
atribuido la actividad cardiotóxica a estos cardenólidos, y se les
utiliza en tratamientos de seres humanos para tratar insuficiencias
cardíacas.
Inesperadamente, la presente invención se
refiere a al menos un extracto según la invención de la planta
Calotropis procera que muestra otro tipo de actividad, en
particular una "actividad antitumoral". Además, se demostró
que al menos un extracto según la invención muestra efectos
antitumorales in vitro así como in vivo. Dicho
extracto según la invención induce una reducción espectacular en el
crecimiento celular y muestra una actividad
pro-apoptótica. Estas propiedades se ilustran
adicionalmente en los ejemplos 3 y 4. Además, los inventores han
demostrado in vivo que al menos uno de los extractos según la
invención es altamente activo contra varios tipos de cánceres. Tal
como se muestra en los ejemplos descritos más adelante, el extracto
según la invención es altamente activo contra varios tipos de
cánceres. Como se muestra en los ejemplos descritos más adelante,
el extracto según la invención ejerce efectos antitumorales
significativos en varios modelos de tumor probados, lo cual
representa un amplio grupo de tipos de tumores histológicos,
incluyendo cáncer de mama, linfomas, melanomas. Estos modelos son
clínicamente relevantes toda vez que imitan etapas clínicas
específicas de cánceres humanos.
Sorprendentemente, el extracto según la
invención es altamente activo a dosis relativamente bajas. Dicho
extracto puede ejercer una actividad antitumoral a bajas dosis en
el intervalo de 0,4 a 2,2 mg/kg y preferiblemente en el intervalo
de 0,5 a 2 mg/kg. La alta actividad antitumoral a bajas dosis indica
que los extractos son altamente activos. Sorprendentemente, como
también quedará claro cuando se lean los ejemplos más adelante, el
extracto según la invención muestra efectos antitumorales
significativamente más altos cuando se somete a ensayo a dosis
crónicamente bajas, es decir, 0,6 mg/kg a 1,25 mg/kg, que a dosis
altas, es decir a dosis de 5 mg/kg a 10 mg/kg. El índice de Dosis
Tolerada Máxima (MTD) del extracto según la invención, en referencia
a la cantidad máxima del extracto, que se puede administrar en
forma de dosis única a animales sanos, es de 20 mg/kg de extracto.
Este valor indica que el extracto según la invención tiene un amplio
intervalo terapéutico.
Los términos "toxicidad" o "efectos
tóxicos" se refieren al (a los) efecto(s)
perjudicial(es) que un compuesto puede tener en células,
tejidos u órganos sanos. Otra propiedad importante de un extracto
según la invención incluye su bajo nivel de toxicidad. Se demostró
que el extracto mencionado no induce cambios hematológicos in
vivo, no induce pérdida de peso o muestra efectos secundarios
menores en diferentes tipos de órganos y tejidos. De hecho, el
nivel de toxicidad del extracto según la invención es
sorprendentemente bajo. El extracto según la invención combina las
características esenciales de una buena actividad antitumoral, de
bajo nivel de toxicidad y una inducción mínima de efectos
secundarios perjudiciales.
Además, los extractos de la planta Calotropis
procera según la invención muestran también una "actividad
antivenenosa". Tal como se mencionó anteriormente, el término
"actividad antivenenosa", tal como se usa en el presente
documento, se refiere a la capacidad de los extractos según la
invención para atenuar o revertir los efectos secundarios
perjudiciales de compuestos. Sorprendentemente, los inventores han
demostrado que la combinación de un extracto según la invención con
otros compuestos terapéuticos, que tienen efectos secundarios
perjudiciales, permite que los efectos secundarios indeseables del
compuesto terapéutico sean reducidos. Por ejemplo, el ejemplo 8
ilustra que la combinación de un extracto según la invención con
compuestos contra el cáncer bien conocidos, tales como vincristina
o adriamicina, camptotecina u oxaliplatino, hace posible la
reducción de algunos efectos producidos por la toxicidad a células
normales inducidos por estos compuestos contra el cáncer.
La actividad antivenenosa es evidente cuando al
menos uno de los extractos según la invención se administra antes
del compuesto terapéutico, es decir, se administran secuencialmente.
Es un aspecto de la invención administrar un extracto previo a
cualquier momento antes de que el compuesto terapéutico se
administre. Un aspecto adicional de la invención es administrar un
extracto no más de 336, 312, 288, 264, 240, 216, 192, 168, 144, 120,
96, 72, 48, 24, 20, 16, 12, 8, 4, 2, 1, ó 0,5 horas antes de que se
administre el compuesto terapéutico.
\newpage
La actividad antivenenosa también es evidente
cuando al menos uno de los extractos según la invención se
administra al mismo tiempo que el compuesto terapéutico, es decir,
como una composición, mediante administración simultánea o
separada.
La actividad antivenenosa también es evidente
cuando al menos uno de los extractos según la invención se
administra tras el compuesto terapéutico es decir, se administra
secuencialmente. Es un aspecto de la invención administrar un
extracto en cualquier momento una vez que el compuesto terapéutico
se haya administrado. Es un aspecto más de la invención administrar
el extracto a menos de 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 48, 72, 96,
120, 144, 168, 192, 216, 240, 264, 288, 312 ó 366 horas una vez que
el compuesto terapéutico se haya administrado.
En administración secuencial, los extractos
pueden administrarse una vez, o cualquier número de veces y en
varias dosis antes y/o tras la administración del compuesto
terapéutico. La administración secuencial se puede combinar con
administración simultánea o secuencial.
Los extractos según la invención comprenden uno
o varios compuestos activos, es decir, compuestos presentes en un
extracto según la invención, que muestran una actividad similar a al
menos una de las actividades definidas anteriormente en un extracto
según la invención. Las actividades principales de al menos uno de
los extractos son actividad antitumoral y una actividad
antivenenosa. Tal como entenderá el experto en la técnica, un
compuesto activo presente en los extractos puede ejercer sólo una
de estas propiedades, o incluso ambas de estas propiedades.
En otra realización, al menos uno de los
extractos según la invención comprende al menos dos de los
compuestos activos seleccionados del grupo que comprende asclepina,
calactina, voruscharina, calotropina, calotropagenina, uzarigenina,
calotoxina, uscharina y uscharidina, 2''oxovoruscharina.
Tal como se entenderá, los extractos según la
invención pueden contener además uno o más compuestos activos, que
no pertenecen al grupo de los cardenólidos, y otros compuestos. En
otra realización, los extractos contienen al menos uno de los
compuestos representados en la tabla 1.
En otra realización, la presente invención se
refiere a un compuesto activo aislado de los extractos según la
invención.
En otra realización de la invención, un
compuesto activo del extracto es
2''oxo-voruscharina. En un aspecto de la invención
es la actividad contra el cáncer y/o antivenenosa de dicho compuesto
(compuesto A) y los derivados (compuestos B a H) del mismo como se
muestra en la tabla 2.
Según otra realización, un extracto según la
invención puede obtenerse mediante una extracción alcohólica, en
particular mediante una extracción con metanol.
En otra realización, la presente invención se
refiere a un método para obtener un extracto según la invención,
que comprende las etapas de:
a) extraer el material de partida de la planta
Calotropis procera, seleccionándose dicho material de partida
de entre frutos, partes aéreas, partes subterráneas y sus mezclas,
en un alcohol alifático, disolviendo dicho material de partida en
dicho alcohol obteniendo de esta manera una de dicho material en
dicho alcohol, agitar dicha suspensión y filtrar la suspensión
mediante vidrio fritado obteniendo así un primer filtrado y una
primera parte sólida;
b) extraer dicha primera parte sólida en un
alcohol alifático obteniendo de esta manera un segundo filtrado y
una segunda parte sólida;
c) combinar el primero y segundo filtrados
obteniendo de esta manera un filtrado combinado y
d) evaporar el filtrado combinado a vacío
obteniendo de esta manera un residuo aceitoso.
En una realización preferida, el material de
partida de la planta Calotropis procera se selecciona de
partes subterráneas, en particular de las raíces.
En otra realización, el alcohol alifático usado
para extraer el material de partida según la invención es metanol.
Todavía en otra realización, el residuo obtenido en el procedimiento
de extracción se recoge en un solvente, en particular en un
solvente farmacéuticamente aceptable.
En otra realización, la presente invención se
refiere a extractos para obtener un material según la invención,
que comprende las etapas de:
a) moler el material de partida de hojas,
tallos, cortezas y raíces de Calotropis procera para dar un
polvo fino de la planta;
b) extraer el polvo de la planta a) con
diclorometano durante al menos 6, 12, 18 o preferiblemente 24 horas
usando un extractor Soxhlet;
c) decantar el diclorometano de la etapa b), y
evaporar el filtrado, tras la filtración, para dar una goma;
d) extraer el residuo de la etapa c) con metanol
durante al menos 6, 12, 18 o preferiblemente 24 horas usando un
extractor Soxhlet;
e) decantar el metanol de la etapa d), evaporar
el filtrado, tras la filtración, para formar una goma;
f) someter la goma de la etapa e) a
cromatografía en columna usando gel de sílice ultrarrápido y
diclorometano-metanol como solvente;
g) recoger una primera fracción;
h) aplicar la fracción concentrada de la etapa
g) a cromatografía en columna usando gel de sílice ultrarrápido y
hexano:acetona como solvente para dar dos fracciones;
i) lavar la columna tras la etapa h) con metanol
para dar una tercera fracción.
Los extractos según la presente invención
incluyen los obtenidos de la etapa c), etapa g) y etapa i).
Un aspecto de la invención es que las
extracciones se llevan a cabo de una manera compatible con conservar
la integridad de los compuestos biológicamente activos contenidos
en el extracto. Estas precauciones se conocen por el experto en la
técnica.
Gracias a las interesantes propiedades de al
menos uno de los extractos descritos en el presente documento, en
particular su actividad antitumoral, su actividad antivenenosa, su
bajo nivel de toxicidad y/o su alta actividad a bajas dosis,
el(los) extracto(s) según la invención o los
compuestos activos de los mismos son particularmente adecuados para
usarse como un medicamento para el tratamiento de enfermedades, y en
particular para tratar cáncer.
En otra realización, la invención se refiere al
uso de un extracto según la invención, o un compuesto activo del
mismo, como un medicamento.
En todavía otra realización, la invención se
refiere también al uso de al menos un extracto según la invención,
o un compuesto activo del mismo, en la preparación de un medicamento
para el tratamiento contra el cáncer. En particular, dicho extracto
según la invención, o un compuesto activo del mismo, se usa para la
preparación de un medicamento en el tratamiento de un cáncer.
Ejemplos de cánceres que pueden tratarse según la invención
incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, linfoma, sarcoma,
cáncer pancreático, melanoma, cáncer colorrectal, glioma, cáncer
pulmonar de células no pequeñas, cáncer pulmonar de células
pequeñas, cáncer de piel, cáncer de hueso, cáncer ovárico, cáncer
del SNC, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello,
cáncer de próstata, cáncer de hígado y cáncer hematológico.
Tal como se mencionó anteriormente, los
extractos según la invención comprenden también una actividad
antivenenosa. Los inventores han demostrado que una combinación de
un extracto según la invención o compuestos activos del mismo con
un segundo compuesto que tiene efectos secundarios perjudiciales,
hace posible una reducción de la actividad tóxica de este segundo
compuesto, sin reducir su actividad terapéutica. Por lo tanto, los
extractos de Calotropis procera según la invención también
se pueden combinar en un medicamento con otros compuestos, en
particular con otros compuestos contra el cáncer.
En otra realización, la presente invención se
refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento contra
el cáncer, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un
extracto de Calotropis procera según la invención o un
compuesto activo del mismo, y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
En otra realización, la presente invención se
refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento contra
el cáncer que comprende:
- una cantidad terapéuticamente eficaz de un
extracto de Calotropis procera según la invención o un
compuesto activo del mismo,
- una cantidad terapéuticamente eficaz de un
compuesto terapéutico y
- un vehículo farmacéuticamente aceptable.
El término "cantidad terapéuticamente
eficaz" tal como se usa en el presente documento, significa la
cantidad de al menos un extracto o compuesto activo o agente
farmacéutico que provoca la respuesta biológica medicinal en un
tejido, sistema, animal o humano que se busca por un investigador,
veterinario, doctor médico u otro clínico, que incluye el alivio de
los síntomas de la enfermedad que se está tratando.
La composición farmacéutica se puede preparar de
una manera conocida por un experto en la técnica. Para este fin, un
extracto según la invención y/o cualquier compuesto activo del
mismo, uno o más vehículos farmacéuticos sólidos o líquidos y, si
se desea, en combinación con otros compuestos farmacéuticamente
activos, se llevan a una forma de administración o forma de dosis
adecuada que después se puede usar como un producto farmacéutico en
medicina humana o medicina veterinaria.
Las formas particulares de la composición
farmacéutica pueden ser, por ejemplo, disoluciones, suspensiones,
emulsiones, cremas, comprimidos, cápsulas, pulverizadores nasales,
liposomas o micro-depósitos, especialmente
composiciones en forma ingerible por vía oral o inyectable estéril,
por ejemplo, suspensiones o supositorios acuosos u oleaginosos
inyectables y estériles. La forma preferida de composición
contemplada es la forma sólida seca, que incluye cápsulas,
gránulos, comprimidos, píldoras, bolos y polvos. El vehículo sólido
puede comprender uno o más vehículos, por ejemplo, lactosa, cargas,
agentes disgregantes, aglutinantes, por ejemplo, celulosa,
carboximetilcelulosa o almidón o agentes
anti-adherencia, es decir, estearato de magnesio,
para evitar que los comprimidos se adhieran al equipo de
preparación de comprimidos. Los comprimidos, píldoras y bolos pueden
formarse con el fin de que se disgreguen rápidamente o para
proporcionar una lenta liberación del principio activo.
Además, gracias a su actividad antivenenosa, los
extractos según la invención o compuestos activos de los mismos,
también son particularmente adecuados para combinarse con otros
compuestos terapéuticos con los que ejercen una actividad
farmacológica que tienen efectos secundarios tóxicos, tales como
otros medicamentos, que muestran efectos secundarios tóxicos.
El "compuesto terapéutico, que ejerce una
actividad farmacológica que tiene efectos secundarios tóxicos"
puede incluir cualquier compuesto que se usa para el tratamiento de
alguna enfermedad pero que induce efectos tóxicos no deseados.
Preferiblemente, estos compuestos son compuestos que se usan en el
tratamiento contra el cáncer. Por ejemplo, un extracto según la
invención o compuestos activos del mismo se puede combinar con uno o
más de otros compuestos que tengan un efecto antitumoral. Ya que
dos o más compuestos que tienen un efecto antitumoral se combinan,
se puede obtener una actividad antitumoral mejorada. Además, estas
combinaciones también hacen posible reducir los efectos secundarios
tóxicos, que se inducen por uno o varios de los compuestos
antitumorales.
Una combinación de un extracto según la
invención o compuestos activos del mismo con otro compuesto
terapéutico puede incluir un uso separado del extracto o compuesto
activo del mismo y el otro compuesto terapéutico. En particular, la
combinación puede incluir el uso de un extracto según la invención o
compuestos activos del mismo antes (pretratamiento), al mismo
tiempo o después (postratamiento) del uso de otro compuesto
terapéutico.
Alternativamente, una combinación de un extracto
o compuestos activos del mismo con otro compuesto terapéutico
también puede incluir una mezcla de ambos elementos. Por lo tanto,
en una realización preferida, la presente invención se refiere a
una composición farmacéutica que comprende un primer componente,
siendo dicho primer componente un extracto descrito anteriormente o
al menos un compuesto activo del mismo, y un segundo componente,
comprendiendo dicho segundo componente un compuesto terapéutico, que
ejerce una actividad farmacológica que tiene efectos secundarios
tóxicos.
Un aspecto de la invención es un producto que
contiene un extracto de Calotropis procera y un compuesto
terapéutico para su administración simultánea, separada o
secuencial a un sujeto. Un aspecto de la invención es que el
producto puede usarse según la invención.
Por administración simultánea se quiere decir
que los dos componentes se administran a un sujeto al mismo tiempo.
Por ejemplo, como una mezcla de los dos componentes. Ejemplos
incluyen, pero no se limitan a, una disolución administrada por vía
intravenosa, un comprimido, líquido, crema tópica, etc., en el que
cada preparación comprende ambos componentes.
Por administración separada se quiere decir que
los dos componentes se administran a un sujeto al mismo tiempo o
sustancialmente al mismo tiempo, pero los componentes están
presentes en el producto como preparaciones separadas y no
mezcladas. Por ejemplo, los dos componentes pueden estar presentes
en el producto como comprimidos individuales. Los comprimidos
pueden administrarse al sujeto al tragar ambos comprimidos al mismo
tiempo, o un comprimido directamente tras el otro.
Por administración secuencial se quiere decir
que los dos componentes se administran a un sujeto secuencialmente
y los componentes están presentes en el producto como preparaciones
separadas no mezcladas. Existe un intervalo de tiempo entre dosis.
Por ejemplo, un componente podría administrarse hasta 336, 312, 288,
264, 240, 216, 192, 168, 144, 120, 96, 72, 48, 24, 20, 16, 12, 8,
4, 2, 1 ó 0,5 horas tras el otro componente.
En la administración secuencial, el extracto
puede administrarse una vez, o cualquier número de veces y en
varias dosis antes y/o tras la administración del compuesto
terapéutico. La administración secuencial puede combinarse con
administración simultánea o secuencial.
Otro aspecto de la presente invención es un kit
que comprende un recipiente en el que está presente un extracto de
Calotropis procera, y un recipiente en que está presente un
compuesto terapéutico. Un extracto según la invención y un
compuesto terapéutico según la invención se describieron
anteriormente.
Al mencionar un kit que comprende un recipiente
en el que está presente un extracto de Calotropis procera, y
un recipiente en el que está presente un compuesto terapéutico, se
debe entender que el kit puede contener una sola dosis, o una
pluralidad de dosis, reflejadas en dos recipientes individuales, dos
recipientes individuales que pueden contener cada uno, una
pluralidad de dosis o una pluralidad de recipientes individuales que
pueden contener cada uno, una sola dosis. Se debe entender que el
kit puede comprender más de un kit terapéutico, cada compuesto
terapéutico en un recipiente separado, o una mezcla de compuestos
terapéuticos en un solo recipiente.
Los recipientes pueden ser cualquiera conocido
en la técnica de la medicina. Pueden ser viales, paquetes de
blister, jeringas, botellas resellables, botellas con medios de
suministro, aspiradores, botellas de goteo, parches, aplicadores,
supositorios.
Los recipientes separados hacen posible extraer
el compuesto terapéutico que se administrará simultáneamente, por
separado o secuencialmente.
Gracias a las propiedades antitumorales
favorables de al menos uno de los extractos según la presente
invención, dichos extractos son particularmente útiles en el
tratamiento de individuos que padecen cáncer. Gracias a su bajo
nivel de toxicidad y a sus efectos secundarios mínimos, el uso de
uno de los extractos en una composición farmacéutica para el
tratamiento contra el cáncer incluirá efectos secundarios mínimos.
Como consecuencia, el extracto según la invención se puede usar
durante un periodo de tiempo más largo en el tratamiento contra el
cáncer.
En particular, en una realización preferida, la
invención se refiere al uso de una composición según la
reivindicación 1 para preparar un medicamento para tratar cáncer,
en el que el cáncer se selecciona del grupo que comprende, pero sin
limitarse a, cáncer de mama, linfoma, sarcoma, cáncer pancreático,
melanoma, cáncer colorrectal, glioma, cáncer pulmonar de células no
pequeñas, cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer de piel,
cáncer de hueso, cáncer ovárico, cáncer del SNC, cáncer renal,
cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata,
cáncer hepático y cáncer hematológico.
Para estos fines, la composición farmacéutica de
la presente invención puede administrarse por vía oral, por vía
parenteral, es decir, incluyendo inyecciones subcutánea,
intravenosa, intramuscular, inyección intraesternal o técnicas de
infusión, por pulverización de inhalación o por vía rectal, en
formulaciones unitarias de dosis que contengan vehículos,
adyuvantes y excipientes farmacéuticamente aceptables y no tóxicos
convencionales.
Según la presente invención, dicha composición
farmacéutica puede administrarse por separado en diferentes
momentos durante el curso del tratamiento o concurrentemente en
formas de combinación individuales o divididas. Por tanto, la
presente invención debe entenderse que abarca todos estos regímenes
de tratamiento simultáneo o alternante y el término
"administración" se debe interpretar en consecuencia.
Esencialmente, los modos primarios de
tratamiento contra el cáncer de tumor sólido comprenden cirugía,
radioterapia y quimioterapia, por separado y en combinación. Los
extractos según la invención son adecuados para su uso en
combinación con estas técnicas médicas. Los extractos según la
invención pueden ser útiles para aumentar la sensibilidad de
células tumorales a la radiación en radioterapia y también para
potenciar o aumentar el daño a tumores por agentes quimioterápicos.
Los extractos según la invención también pueden ser útiles para
sensibilizar células tumorales resistentes a fármacos múltiples. Los
extractos según la invención son compuestos terapéuticos útiles
para su administración junto con otros compuestos terapéuticos que
dañen el ADN, para potenciar su efecto.
Se entenderá que la composición farmacéutica
según la invención puede administrarse a los seres humanos en
niveles de dosis específicos y a la frecuencia de dosificación
específica que puede variarse para cualquier paciente particular y
que dependerá de una variedad de factores incluyendo la edad, peso
corporal, salud general, sexo, dieta, modo y tiempo de
administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos, la
gravedad del estado particular del paciente que se someta al
tratamiento.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la
presente invención. Estos ejemplos no se deben considerar como
limitantes del alcance de la invención. Un primer ejemplo ilustra la
extracción de extractos según la invención de la planta
Calotropis procera. Los ejemplos 2 a 4 se refieren a la
caracterización antitumoral in vitro de un extracto según la
invención. Los ejemplos 5 a 7 describen la caracterización
antitumoral in vivo de un extracto según la invención. El
ejemplo 8 ilustra los efectos antivenenosos de los extractos según
la invención.
Un extracto (extracto A) según la invención se
aisló de las raíces de planta Calotropis procera (familia
Asclepiadiaceae) mediante metanol. Este extracto se denomina
además el extracto A (para adaptar). Alrededor de 10 gramos de
planta se pusieron en un matraz Erlenmeyer con 150 ml de metanol. La
suspensión se agitó magnéticamente durante 12 horas y luego se
agitó sobre una frita de vidrio. El sólido restante se extrajo una
segunda vez con metanol durante dos horas. Ambos filtrados se
combinaron y se evaporaron a vacío mediante el uso de un evaporador
giratorio. El residuo constituía el extracto metanólico y se
denomina más adelante en el presente documento extracto A.
El análisis del extracto A reveló la presencia
de varios tipos de compuestos. Un grupo particular de compuestos
identificado en dicho extracto A comprende cardenólidos tales como
asclepina, calactina, vorusharina, calotropina, calotropagenina,
uzarigenina, usharina y usharidina. Además, algunos otros
compuestos, presentes en el extracto A comprenden, pero no se
limitan a, 3-O-ACETILCALOTROPINA,
ALFA-AMIRINA, BENZOATO DE
ALFA-AMIRINA, ALFA-CALOTROPEOL,
ALFA-LACTUCEROL, ACETATO DE
ALFA-LACTUCERILO, ISOVALERATO DE
ALFA-LACTUCERILO, ARABINOSA, BENZOILISOLINOLONA,
BENZOILLINEOLONA, BETA-AMIRINA, BENZOATO DE
BETA-AMIRINA, BETA-CALOTROPEOL,
BETA-SITOSTEROL, CAUTCHOUC, COROGLAUCOGENINA;
COROTOXIGENINA; D-GLUCOSAMINA, FRUGOSIDA, GIGANTEOL,
GIGANTINA, GLUCOSA, HISTAMINA, ISOGIGANTEOL, ISOLACTUCEROL,
ISOLINEOLONA, LAURANO LINEOLONA, ACIDO LINOLEICO, ACIDO LINOLENICO,
ALCOHOL MELISILICO, MUDARINA, ACIDO OLEICO, ACIDO PALMITICO,
PROCEROSIDA, PSEUDOCALOTROPAGENINA, RAMNOSA ESTIGMAESTEROL,
SIRIOGENINA TARAXASTEROL, BENZOATO DE TARAXASTEROL y TRIPSINA.
Otros extractos según la invención, se aislaron
mediante un método que comprende las etapas de:
a) moler el material de partida de hojas,
tallos, cortezas y raíces de Calotropis procera para dar un
polvo fino de la planta,
b) extraer el polvo de la etapa a) con
diclorometano durante 24 horas usando un extractor Soxhlet,
c) decantar el diclorometano de la etapa b) y
evaporar el filtrado (tras la filtración) para formar una goma,
d) extraer el residuo de la etapa c) con metanol
durante 24 horas usando un extractor Soxhlet,
e) decantar el metanol de la etapa c), evaporar
el filtrado (tras la filtración) para formar una goma,
f) someter la goma de la etapa e) a
cromatografía en columna usando gel de sílice ultrarrápido y
diclorometano-metanol como solvente,
g) recoger una primera fracción,
h) aplicar la fracción concentrada de la etapa
g) a cromatografía en columna usando gel de sílice ultrarrápido y
hexano-acetona como solvente para dar dos
fracciones,
i) lavar la columna tras la etapa h) con metanol
para dar una tercera fracción.
El extracto aislado en la etapa c) se denomina
más adelante en el presente documento extracto B. El extracto
aislado en la etapa g) se denomina más adelante en el presente
documento extracto C. El extracto aislado en la etapa i) se
denomina más adelante en el presente documento extracto D.
Este ejemplo ilustra las actividades
antitumorales del extracto A según la invención en diferentes tipos
de cáncer.
Para caracterizar las actividades in
vitro del extracto A, se llevaron a cabo pruebas MTT. La prueba
MTT, que es una prueba bien conocida en la técnica, es una técnica
indirecta que rápidamente mide, es decir, en el plazo de 5 días, el
efecto de un producto dado en el crecimiento global de una línea
celular. Esta prueba mide el número de células vivas
metabólicamente activas que pueden transformar el producto MTT
(bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio),
que tiene un color amarillento, en el producto azul formazán
mediante la reducción mitocondrial llevada a cabo solamente por
células vivas. La cantidad de formazán obtenido al final del
experimento se mide con un espectrofotómetro y es directamente
proporcional al número de células vivas.
Cuarenta y ocho líneas celulares de cáncer
humano, descritas en la tabla 2, se probaron en presencia del
extracto A. Estas líneas celulares cubrieron diez tipos
histológicos, siendo de cáncer pancreático, sarcoma, cáncer de
mama, melanoma, cáncer de colon, glioma, cáncer pulmonar, cáncer de
vejiga, cáncer de próstata y cáncer de cabeza y cuello. Se dejó que
las células crecieran en micropocillos de placas 96 pocillos de
fondo plano con 100 \mul de suspensión celular por pocillo y
entre 3.000 y 5.000 células/pocillo dependiendo del tipo de célula.
Cada línea celular se sembró en su propio medio de cultivo de
células, tal como se indica en la tabla 2.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ \cr}
\newpage
Tras un periodo de incubación de 24 horas a 37ºC
el medio de cultivo se reemplazó con 100 \mul de medio reciente
en el que se disolvió el extracto A a las diferentes concentraciones
de 0,01 \mug/ml, 0,05 \mug/ml, 0,1 \mug/ml, 0,5 \mug/ml, 1
\mug/ml, 5 \mug/ml, 10 \mug/ml, 50 \mug/ml y 100 \mug/ml.
Cada condición experimental se llevó a cabo en sextuplicado.
Tras 72 horas de incubación a 37ºC con el
fármaco, es decir, condiciones experimentales o sin el fármaco, es
decir control, el medio se reemplazó por 100 \mul de MTT a la
concentración de 1 mg/ml disuelto en RPMI. Los micropocillos se
incubaron después durante tres horas a 37ºC y se centrifugaron a 400
g durante 10 minutos. Se eliminó el MTT y los cristales de
formación formados se disolvieron en 100 \mul de DMSO. Los
micropocillos se agitaron durante 5 minutos y se leyeron sobre un
espectrofotómetro a 2 longitudes de onda a 570 nm que corresponde a
la longitud de onda de absorbancia de formazán máxima, y a 630 nm,
que es la longitud de onda del ruido de fondo.
Para cada condición experimental, se calculó la
DO promedio asociada con el error estándar de la media (SEM) para
cada condición, es decir, 6 pocillos. El porcentaje de células vivas
restantes se calculó en comparación con el control. Los resultados
de estos experimentos se representan 1 a 11.
La figura 1 representa los resultados globales
para diez tipos histológicos. Tal como se indica, el extracto A
ejerció un efecto antitumoral de todos los tipos histológicos
probados. Las líneas celulares tumorales humanas derivadas de la
vejiga presentaron una sensibilidad del extracto A que fue más débil
que los nueve tipos histológicos restantes. Se determinó la
concentración a la que el extracto vegetal mató el 50% de la
población celular, el llamado valor de CI_{50}. El valor de
CI_{50} comprendía entre 0,5 \mug/ml y 1 \mug/ml para las
líneas celulares emitidas de las líneas celulares de mama y
páncreas. Un efecto antitumoral más importante con un valor de
CI_{50} de 0,5-0,1 \mug/ml se obtuvo para líneas
celulares de cáncer de sarcoma, melanoma, pulmón, cabeza y cuello y
colorrectal. Las células de cáncer de próstata PC3 mostraron una
sensibilidad marcada, con un valor de CI_{50} en el intervalo de
0,01 a 0,05 \mug/ml.
Tal como se ilustra en la figura 1, el valor de
CI_{50} promedio de las 5 líneas celulares de cáncer de mama
varía entre 0,5 y 1 \mug/ml. El crecimiento global de las cinco
líneas celulares de cáncer de mama individuales
T-47D, MDA-MB-231,
ZR-75-1, MCF-7 y
Hs578T, se ilustra adicionalmente en la figura 2. Las líneas
celulares T-47D,
MDA-MB-231,
ZR-75-1 y Hs578T mostraron
sensibilidades similares al extracto A, mientras que las células
MCF-7 tuvieron su crecimiento global reducido más
rápidamente que los restantes cuatro modelos de cáncer de mama.
Tal como se ilustra en la figura 1, el valor de
CI_{50} promedio de las 7 líneas celulares de cáncer de sarcoma
(véase la tabla 2) osciló entre 0,5 y 0,1 \mug/ml. El crecimiento
global de las líneas celulares individuales se ilustra
adicionalmente en la figura 3. El extracto A indujo el efecto
antitumoral más importante en la línea celular A204. De hecho, el
valor de CI_{50} pareció ser de entre 0,1 y 0,05 \mug/ml. La
línea celular Hs729 se consideró la menos sensible de las 7 líneas
celulares de sarcoma. No obstante mostró valores de CI_{50} para
el extracto A que oscilaban entre 1 y 5 \mug/ml.
Tal como se ilustra en la figura 1, el valor de
CI_{50} promedio de las siete líneas celulares de cáncer
pancreático (véase la tabla 2) osciló entre 0,5 y 0,1 \mug/ml.
Crecimientos globales similares fueron observados para 6 de las 7
líneas celulares de cáncer pancreático (figura 4). De estas 7 líneas
celulares, Panc-1 pareció ser la más sensible al
extracto A y Hs766T la menor. Los valores de CI_{50} de estas 2
líneas variaron entre 0,1 y 0,5 \mug/ml, y entre 1 y 5 \mug/ml,
respectivamente.
Tal como se ilustra en la figura 1, el valor de
CI_{50} promedio de las 5 líneas celulares de cáncer de melanoma
(véase la tabla 2) osciló entre 0,5 y 0,1 \mug/ml. El extracto
según la invención redujo el crecimiento global de todas las líneas
celulares de melanoma en más del 60% a concentraciones iguales a o
más altas que 5 \mug/ml (figura 5). Malme-3M y
G-361 fueron las más sensibles de las 5 líneas
celulares de melanoma. Mostraron un crecimiento global similar,
oscilando el valor de CI_{50} entre 0,1 y 0,5 \mug/ml.
Tal como se ilustra en la figura 1, el valor de
CI_{50} promedio de las 7 líneas celulares de cáncer de colon
(véase la tabla 2) osciló entre 0,5 y 0,1 \mug/ml. De las
diferentes líneas celulares de cáncer colorrectal probadas (figura
6), la línea LoVo tuvo un valor de CI_{50} de alrededor de 0,1
\mug/ml y se consideró que era la línea colorrectal más sensible.
La línea celular tumoral SW948 se consideró que era la menos
sensible, oscilando el valor de CI_{50} entre 0,5 y 1
\mug/ml.
Tal como se ilustra en la figura 1, el valor de
CI_{50} de las 7 líneas celulares de cáncer de glioma humano
(véase la tabla 2) osciló entre 0,5 y 0,1 \mug/ml. Hs683 fue la
línea celular más sensible al extracto (figura 7). Su valor de
CI_{50} fue de casi 0,05 \mug/ml. En contraposición, el
crecimiento de las células A172 no resultó afectado por el extracto
A a concentraciones de desde 0,01 hasta 10 \mug/ml. El valor de
CI_{50} osciló entre 10 y 50 \mug/ml.
Tal como se ilustra en la figura 1, el valor de
CI_{50} promedio de las 2 líneas de cáncer pulmonar de células no
pequeñas humano (NSCLC) osciló entre 0,1 y 0,5 \mug/ml. La figura
8 muestra que ambas líneas fueron sensibles al extracto A.
Tal como se ilustra en la figura 1, el valor de
CI_{50} promedio de las 2 líneas celulares de cáncer de vejiga
humano (véase la tabla 2) osciló entre 50 y 100 \mug/ml. Las 2
líneas mostraron diferencias marcadas en lo que se refiere a la
sensibilidad al extracto A (figura 9). De hecho, a 5 \mug/ml de
extracto A se redujo el crecimiento global de la línea celular T24
en más del 80% mientras que el crecimiento global de la línea
celular J82 sólo disminuyó en un 32% a 100 \mug/ml. La línea
celular J82 pareció muy débilmente sensible al extracto A.
El crecimiento global de una línea celular de
cáncer de próstata (la línea celular PC3) se evaluó mediante el
ensayo MTT cuando las células se estaban tratando con el extracto A.
El extracto A indujo una inhibición de crecimiento global de
aproximadamente el 90% a entre 100 \mug/ml y 0,5 \mug/ml. El
valor de CI_{50} fue de alrededor de 0,1 \mug/ml (figura
10).
Tal como se ilustra en la figura 1, el valor de
CI_{50} promedio de las 5 líneas celulares de cáncer de cabeza y
cuello osciló entre 0,1 y 0,5 \mug/ml. Se observaron crecimientos
completos similares para cuatro de las cinco líneas celulares de
cáncer de cabeza y cuello (figura 11). De estas 5 líneas celulares,
SCC9 pareció ser menos sensible. No obstante mostró valores de
CI_{50} para el extracto A de alrededor de 5 \mug/ml.
En resumen, los extractos A según la invención
ejercen un efecto antitumoral espectacular en cuarenta y seis de
las cuarenta y ocho líneas celulares de cáncer humano sometidas a
ensayo en los experimentos descritos anteriormente. Estos efectos
antitumorales corresponden a disminuciones marcadas en el
crecimiento global de estos modelos de cáncer humano que
representan un grupo muy amplio de tipos histológicos.
Este ejemplo ilustra el efecto cistostático del
extracto A según la invención. Según los experimentos llevados a
cabo por medio del ensayo colorimétrico MTT descrito en el ejemplo
2, está claro que el extracto A disminuye espectacularmente el
crecimiento global de la mayoría de las cuarenta y ocho líneas
celulares de cáncer humano sometidas al ensayo MTT. En los
siguientes ejemplos se investigó si ese extracto inducía la
disminución en el crecimiento global y corresponde ya sea a las
modificaciones que se producen a los niveles de la cinética del
ciclo celular (ejemplo 3), o a la inducción de la apoptosis (véase
ejemplo 4), o a ambas.
El ciclo celular está dividido en general en
varias fases que comprenden una fase G0/G1, S y G2/M. Las
modificaciones que tienen lugar en torno a las proteínas que
controlan la proliferación celular y/o muerte celular pueden
constituir un objetivo de los compuestos activos, presentes en el
extracto A. Las modificaciones a la cinética del ciclo celular
pueden investigarse por medio de citometría de flujo usando
diferentes fluoróforos, por ejemplo yoduro de propidio, acridina
naranja y bromuro de etidio, etc. La citometría de flujo hace
posible que cada célula cancerosa (que corre a varios miles) se
localice en el ciclo celular.
Los cambios en el patrón de histograma de ADN se
utilizan por tanto para caracterizar el mecanismo de acción de
varios compuestos terapéuticos. Los datos que resultan del análisis
de citometría de flujo se procesan gráfica o matemáticamente para
derivar así en cálculos significativos de los compartimientos G1, S
y G2/M. La mayor parte del procesamiento matemático se basa en
ciertos modelos y suposiciones.
Las líneas celulares se sembraron en matraces
(25 cm^{2} de área) que contenían 7 ml de medio de cultivo. Tras
48 horas de incubación a 37ºC, el medio de cultivo de las células se
reemplazó por medio reciente en el que el extracto A se había
disuelto a concentraciones que matan el 50%, (CI_{50}), el 30%
(=CI_{30}) y el 10% (CI_{10}) de la población celular. Tras 24
horas o 72 horas de tratamiento, las células se recogieron en
suspensión, se lavaron en solución salina tamponada con fosfato
(PBS) a 4ºC y se permeabilizaron con etanol al 70% (a 4ºC) durante
la noche a -20ºC. Las células se lavaron entonces con PBS y se
incubaron con disolución de yoduro de propidio (80 \mug/ml)
durante 30 minutos a 37ºC y posteriormente se mantuvieron a 4ºC
durante la noche. Se añadió ribonucleasa A (3% v/v) para inducir la
ruptura del ADN de doble cadena. El retrato del ciclo celular se
estableció para cada muestra. Un programa de software específico
incorporado en el citómetro de flujo se usó para definir en forma
precisa el porcentaje de células en las diferentes fases del ciclo
celular. Cada fase del ciclo celular se notificó en lo que se
refiere a la superficie pico y se calculó como un porcentaje. La
superficie del ciclo celular completo fue del 100%. Cada experimento
se llevó a cabo tres veces. Se calculó el porcentaje promedio de
cada fase diferente y el error estándar de la media relacionada.
Cada fase del ciclo celular de una condición dada se comparó con la
misma fase del ciclo celular de células control, es decir, células
no tratadas.
El extracto A es altamente eficaz contra líneas
celulares tumorales humanas. Las concentraciones usadas en los
experimentos de citrometría de flujo se seleccionaron según los
resultados de MTT (ejemplo 2). Se probaron las cinco líneas
celulares de cáncer humano Hs683 (glioma), J82 (vejiga), A172
(glioma), RPMI (cabeza y cuello) y HCT-15 (colon) y
se determinaron las dosis que mataron al 10, 30 y 50 por ciento de
las células (tabla 3) para investigar así si el extracto A promovía
una acumulación en una de las fases del ciclo celular cuando los
cultivos se trataron durante 24 ó 72 horas con concentraciones cada
vez más altas de extracto A.
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Los análisis del ciclo de células
HCT-15 (figura 12) mostraron que la distribución de
la población celular fue similar al control tras 24 horas del
tratamiento independientemente de las concentraciones sometidas a
prueba. Por otro lado, una población S importante apareció en las
células tratadas con 0,25 \mug/ml de extracto durante 72 horas.
La fracción S representó el 21% de las células en control y alcanzó
el 59% tras el tratamiento con el extracto A a 0,25 \mug/ml. El
incremento en la fracción S estuvo acompañado por una pérdida de las
células en la fase G0/G1. La población G0/G1 sufrió una marcada
disminución del 71% al 29%.
Los análisis del ciclo celular RPMI (figura 13)
mostraron que la distribución de la población celular tratada con
el extracto A a 0,05 \mug/ml fue similar al control tras 24 horas
de tratamiento. Se observó un débil aumento en la fase S a 0,1 y
0,25 \mug/ml. Por el contrario, se produjo un gran aumento en la
población S cuando la línea celular RPMI se incubó durante 72 horas
con el extracto A a las tres concentraciones probadas. Hubo
aproximadamente un 71%, 69% y 62% de células en la fase S cuando el
extracto A se sometió a ensayo a 0,05 \mug/ml, 0,1 \mug/ml y
0,25 \mug/ml, respectivamente. De manera concomitante, el
porcentaje de células en la fase G0/G1 disminuyó marcadamente y la
fase G2/M aumentó ligeramente, alcanzando el 29% de la población
celular.
La línea celular A172 se trató con el extracto A
a 10 y 25 \mug/ml, lo que corresponde a la CI_{10} y a la
CI_{50}. Los resultados (figura 14) mostraron que cualesquiera que
sean las concentraciones probadas, el extracto A induce un aumento
en la fase G0/G1 tras 24 horas de tratamiento. El treinta y nueve
por ciento de las células estuvieron en la fase G0/G1 en el control
mientras que las células tratadas con el extracto A alcanzaron el
60%. En forma concomitante con acumulación en la fase G0/G1, se
observó una ligera acumulación en la fase G2/M a la concentración
más alta probada. El efecto observado tras 24 horas de tratamiento
desapareció tras 72 horas. De hecho, no se observó cambio
significativo alguno en las diferentes fases del ciclo celular.
La línea celular J82 es apenas sensible al
extracto (véase el ensayo MTT). Las concentraciones seleccionadas
para la citrometría de flujo correspondieron a aproximadamente
CI_{10} e CI_{30} (figura 15). Tras 24 horas de tratamiento se
obtuvo una ligera acumulación en la fase G0/G1 cualquiera que fuera
la concentración probada. Por otro lado, el 30 y el 47%,
respectivamente, de la población celular estuvo en la fase S, cuando
las células se trataron durante 72 horas con el extracto A a 50 y
100 \mug/ml mientras que la condición de control alcanzaba
solamente el 18%. A 100 \mug/ml, también se pudo observar una
acumulación en la fase G2/M.
Tras 24 horas de tratamiento con el extracto A a
0,05 \mug/ml, las células Hs683 se habían acumulado en la fase
G0/G1 y habían logrado el 70% en comparación con el control (58%)
(figura 16). Se observó concomitantemente una disminución en el
porcentaje de células en la fase S. De la misma manera, a ambas
concentraciones, la mayoría de las células estuvieron en la fase
G0/G1 tras 72 horas de tratamiento. De hecho, más del 60% de las
células estuvieron en esta fase, mientras que las células en esta
fase en el control representaron el 46% de la población
celular.
celular.
En conclusión, el extracto A induce
principalmente una acumulación en la fase G0/G1 y bajo estas
circunstancias esto indica que el extracto A tiene un efecto
citostático.
\newpage
Este ejemplo ilustra el efecto
pro-apoptótico del extracto A según la
invención.
La muerte celular puede producirse de dos formas
diferentes, ya sea accidentalmente o programada genéticamente. La
muerte celular accidental, también denominada necrosis, se produce
esencialmente como resultado de, por ejemplo, una agresión física o
biológica. La apoptosis se refiere a la forma de muerte celular que
es muerte celular genéticamente programada y que se produce bajo
condiciones fisiológicas normales. Tras la inducción de la
apoptosis, se induce una cascada de acontecimientos en la célula,
que comprende la activación de receptores de muerte celular, la
activación de una serie de proteasas citosólicas, la formación de
cuerpos apoptóticos y la fragmentación del ADN.
El efecto del extracto A en la ruta de la
apoptosis se investigó en las cuatro líneas celulares de cáncer
humano: Hs683 (glioma), J82 (vejiga), A172 (glioma) y
HCT-15 (colon).
Las células se sembraron en matraces (25
cm^{2} de área) que contenían 7 ml de medio de cultivo. Tras una
incubación de 48 horas a 37ºC, el medio de cultivo de células se
reemplazó por medio reciente en el que el extracto A según la
invención estaba disuelto a diferentes concentraciones que mataron
al 50% y al 30% de la población celular. Tras 24 ó 72 horas de
tratamiento las células se recogieron en suspensión y se contaron.
Se centrifugaron 250.000 células durante 10 minutos a 1.700 rpm a
4ºC. El sedimento se lavó con PBS a 4ºC y se incubó con anexina
V-FITC y disolución de yoduro de propidio durante 15
minutos a 4ºC en la oscuridad. Para cada muestra, se recogieron los
datos de aproximadamente 10.000 células en una escala logarítmica.
El software incorporado en el citómetro de flujo se usó para
definir en forma precisa el porcentaje de células en la ruta
apoptótica y/o necrótica, y las células normales. Cada experimento
se llevó a cabo dos veces. Se calculó la media de porcentaje de la
ruta apoptótica y la necrótica y el error estándar de la media
relacionada. Cada condición se comparó con el control, siendo las
células no
tratadas.
tratadas.
Se observó un incremento de cuatro veces de
células HCT-15 apoptóticas cuando las células se
trataron por el extracto A a 0,25 \mug/ml durante 24 horas en
comparación con las células control (figura 17). La línea celular
A172 pareció acoplarse en una ruta de apoptosis y necrosis cuando
las células se trataron durante 24 horas por el extracto A a 25
\mug/ml (figura 18). Esta tendencia se mantuvo tras 72 horas de
tratamiento. El tratamiento con el extracto A indujo la apoptosis
de las células J82 de una manera dependiente de concentración, lo
cual es particularmente claro 72 horas tras el tratamiento (figura
19). También se observó un aumento en el porcentaje de células
necróticas a ambas concentraciones tras 72 horas. Se obtuvo un
incremento de 2,5 veces en el porcentaje de células apoptóticas
Hs683 tras 24 horas de tratamiento con el extracto A a 0,025
\mug/ml (figura 20). Tras 72 horas de tratamiento, el porcentaje
de células apoptóticas aumentó de una manera dependiente de la
concentración.
En conclusión, el extracto A induce
principalmente un incremento en el porcentaje de células
apoptóticas. Se obtuvo un efecto de la ruta de necrosis bajo
ciertas condiciones.
En el presente ejemplo, se determinó el índice
MTD para el extracto A según la invención. La Dosis Tolerada
Máxima (MTD) de un fármaco dado se define como la cantidad máxima de
un fármaco que puede administrarse en forma precisa, es decir, en
una sola dosis intraperitoneal, intravenosa, subcutánea o vía oral,
a animales sanos, es decir, animales no injertados con tumores.
Las condiciones experimentales para determinar
el índice MTD del extracto A fueron las siguientes. Se registraron
los tiempos de supervivencia de ratones, que no están injertados con
un tumor, hasta 14 días tras la inyección. Se usaron seis dosis
diferentes del extracto A para la determinación del índice MTD. La
dosis más alta administrada a ratones portadores de tumores fue de
160 mg/kg. Otras dosis comprendían 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40
mg/kg y 80 mg/kg. Cada grupo experimental estaba compuesto de dos
ratones para la determinación del índice MTD. La siguiente tabla 4
muestra los datos obtenidos para el índice MTD usando el extracto
A.
Según la definición dada anteriormente, el
índice MTD para el extracto A es de 20 mg/kg para una sola
administración en ratones. De esta manera, el Índice de Dosis
Tolerada Máxima (MTD) del extracto A, en referencia a la cantidad
máxima del extracto A, que se puede administrar en una dosis única a
animales sanos, es de 20 mg/kg de extracto. Este valor indica que
el extracto A tiene una amplio intervalo terapéutico.
Este ejemplo ilustra los efectos in vivo
del extracto A según la invención en tres modelos de cáncer
diferentes.
Los efectos in vivo del extracto A se
estudiaron en ratones infectados con diferentes tipos de tumores,
incluyendo un cáncer de linfoma, un cáncer de melanoma y un cáncer
de mama. Los efectos in vivo se evaluaron con tres tipos de
parámetros:
- la toxicidad cumulativa, que se evalúa
registrando los pesos de los ratones portadores de tumores durante
el tratamiento
- el efecto antitumoral real ejercido a
nivel del crecimiento tumoral, que se evalúa midiendo el tamaño del
tumor tres veces a la semana por medio de un calibre. El crecimiento
de tumor real se expresa como un área (mm^{2}) al multiplicar los
dos diámetros perpendiculares más grandes
- el aumento de la supervivencia para los
ratones tratados, que se calcula por medio del índice T/C. Este
índice es la razón entre el tiempo de supervivencia medio del grupo
de ratones tratados (T) y el del grupo control (C). Se considera
que el extracto es activo si el valor T/C es superior al 130% (P
< 0,05), muy activo para un valor superior al 150% (P < 0,01)
y tóxico para un valor inferior al 70%.
El extracto A se evaluó en el modelo de cáncer
de linfoma P388 agresivo. En un primer experimento, se compararon
tres dosis de 10 mg/kg, 5 mg/kg y 2,5 mg/kg con el control. Los
ratones se inocularon por vía subcutánea con 10^{6} de P388 en el
día D0 y se trataron nueve veces durante las tres semanas siguientes
en los días D5, D7, D9, D12, D14, D16, D19, D21 y D23 tras el
injerto. Cada grupo experimental contenía nueve ratones.
Las figuras 21A ilustran que el extracto A no
tuvo influencia en el peso corporal de los ratones. La figura 21B
muestra que el extracto A indujo significativamente una disminución
en el crecimiento de linfoma P388. Los valores del índice T/C para
el programa de administración de 7 x 10 mg/kg dieron un índice T/C
del 111%, los valores de índice T/C para el programa de 6 x 5 mg/kg
dieron un índice T/C del 100% y los valores del índice T/C para el
programa de 8 x 2,5 mg/kg dieron un índice T/C de 121%. En
conclusión, estos resultados indicaron que la administración del
extracto A redujo el crecimiento del cáncer de linfoma P388 pero no
prolongó significativamente la supervivencia de los ratones de
linfoma P388 a las concentraciones probadas.
En un segundo conjunto de experimentos, el
número de administraciones se aumentó de nueve a dieciséis,
acompañado por una disminución concomitante en la dosis por
administración única. Las dosis administradas por vía subcutánea
fueron de 2,5 mg/kg, 1,25 mg/kg y 0,63 mg/kg. El extracto A se
administró diariamente, cinco días a la semana, durante cinco
semanas consecutivas (5 x 5 = 25).
La figura 22B muestra que estas dosis de
extracto A activo de 0,63 mg/kg y 1,25 mg/kg tuvieron efectos
tóxicos insignificantes toda vez que los ratones portadores de
linfoma P388 no perdieron peso durante el tratamiento. La figura
22A muestra que el extracto A disminuyó marcadamente el crecimiento
de linfoma P388 a dosis de 0,63 mg/kg y 1,25 mg/kg. Además, los
valores de índice T/C para el programa de administración de 15 x 2,5
mg/kg dieron un índice T/C del 137%, los valores del índice T/C
para el programa de 15 x 1,25 mg/kg dieron un índice T/C del 137% y
los valores de índice T/C para el programa de 13 x 0,63 mg/kg dieron
un índice T/C de 116%. Por tanto, las 15 administraciones de 2,5
mg/kg de extracto A y las 15 administraciones de 1,25 mg/kg de
extracto A aumentaron significativamente la supervivencia de estos
ratones portadores de linfoma P388 en un 37%. En consecuencia, los
tratamientos a dosis de 2,5 mg/kg y 1,25 mg/kg con el extracto A
prolongaron la supervivencia de ratones portadores de linfoma
P388.
En conclusión, el extracto A según la invención
ejerce efectos antitumorales significativos en el modelo de cáncer
de linfoma P388 agresivo sin alguna pérdida del peso corporal en los
animales involucrados. Asimismo, inesperadamente, el extracto A
según la invención ejerce actividad antitumoral más alta cuando se
somete a ensayo crónicamente a bajas dosis, es decir, alrededor de
1,25 a 0,63 mg/kg, que a altas dosis, es decir, alrededor de 10
mg/kg a 5 mg/kg.
El extracto A se evaluó en el modelo de cáncer
de melanoma B16 agresivo. El extracto A fue se administró por vía
subcutánea a ratones a dosis de 2,5 mg/kg, 1,25 mg/kg y 0,63 mg/kg.
El extracto A se administró diariamente, cinco días a la semana,
durante cinco semanas consecutivas.
La figura 23A muestra que las dosis
administradas tuvieron efectos tóxicos insignificantes toda vez que
los ratones portadores de melanoma B16 no perdieron peso corporal
durante el tratamiento. La figura 23B muestra que las
administraciones del extracto A suministradas a 2,5 ó 1,25 mg/kg
redujeron significativamente el crecimiento de melanoma B16.
Además, los valores del índice T/C para el programa de
administración de 20 x 2,5 mg/kg dieron un índice T/C del 117%, los
valores de índice T/C para el programa de administración de 10 x
1,25 mg/kg dieron un índice T/C del 117% y los valores de índice
T/C para el programa de 25 X 0,63 mg/kg dieron un índice T/C del
140%. De esta manera, el extracto A disminuyó el crecimiento del
melanoma B16 y prolongó significativamente la supervivencia de los
ratones portadores del melanoma B16, específicamente cuando el
extracto A se administró 25 veces a 0,63 mg/kg cuando se alcanza el
nivel de significación.
En un segundo conjunto de experimentos, el
extracto A se administró por vía oral (per os).
La figura 24A muestra que las dosis
administradas tuvieron efectos tóxicos insignificantes toda vez que
los ratones portadores de melanoma B16 no perdieron peso corporal
durante el tratamiento. La figura 24B muestra que las
administraciones del extracto A vía oral a 2,5 ó 1,25 mg/kg
disminuyeron significativamente el crecimiento del melanoma B16
hasta 25 días tras el injerto. Además, los valores del índice T/C
para el programa de administración de 19 x 2,5 mg/kg dieron un
índice T/C del 114%, los valores de índice T/C para el programa de
15 x 1,25 mg/kg dieron un índice T/C del 100% y los valores de
índice T/C para el programa de 16 x 0,63 mg/kg dieron un índice T/C
del 104%. De esta manera, el extracto A indujo una reducción en el
crecimiento del tumor de melanoma B16 y prolongó ligeramente la
supervivencia de los ratones de melanoma B16 a 2,5 mg/kg.
En conclusión, los dos conjuntos de experimentos
proporcionan evidencia de que el extracto A según la invención
ejerce efectos antitumorales significativos en el modelo de melanoma
B16 independientemente del modo de administración.
El extracto A se evaluó en el modelo de cáncer
de mama MXT-HI, es decir, una variante de cáncer de
mama insensible a hormonas. El modelo MXT-HI
corresponde a un carcinoma no diferenciado con procesos metastásicos
espectaculares hacia el hígado. Corresponde por lo tanto a las
etapas clínicas tardías de cáncer de mama humano. El
MXT-HI representa un modelo de tumor biológico muy
agresivo.
El cáncer de mama MXT-HI se
induce en ratones al inyectar subcutáneamente fragmentos de tumor
MXT en los costados de ratones B6D2F1. Sin tratamiento, los ratones
inoculados mueren entre la cuarta y la séptima semana tras la
inoculación. El extracto A se sometió a ensayo a 10 mg/kg, 5 mg/kg y
2,5 mg/kg con nueve administraciones, es decir, tres veces a la
semana durante tres semanas consecutivas.
La figura 25A indica que los diferentes
programas de tratamiento con el extracto A usados en los presentes
experimentos no indujeron esencialmente ningún efecto secundario
tóxico principal toda vez que los ratones portadores de tumor
MXT-HI no perdieron peso significativo. La figura
25B muestra que las nueve administraciones de 2,5 mg/kg redujeron
significativamente el crecimiento de tumor MXT-HI.
Los valores de índice T/C para el programa de administración de 9 x
10 mg/kg dieron un índice T/C del 103%, los valores de índice T/C
para el programa de 9 x 5 mg/kg dieron un índice T/C del 103% y los
valores de índice T/C para el programa 9 x 2,5 mg/kg dieron un
índice T/C del 119%. De esta manera, a la dosis de 2,5 mg/kg, el
extracto A prolongó la supervivencia de los ratones portadores de
MXT-HI.
En la figura 26 se muestra el número de ratones
portadores de cáncer de mama MXT-HI que murieron
durante el experimento en los grupos control (no tratados) y de
prueba (tratados con el extracto). Se usó un análisis estadístico
de Kaplan-Meier y representa la velocidad de muerte
de los nueve ratones en cada grupo. El valor estadístico destaca el
ajuste general de prueba en comparación con el ajuste general del
grupo de control con respecto a supervivencia.
En conclusión, los experimentos descritos
anteriormente proporcionan evidencia de que el extracto A ejerce
efectos antitumorales significativos en el tumor de cáncer de mama
MXT-HI.
El extracto A según la invención tiene un efecto
antitumoral significativo en los modelos de cáncer probados. Estos
modelos representan un amplio panel de tipos de tumor histológico,
incluyendo carcinomas, linfomas y melanomas. Estos modelos son
clínicamente relevantes porque imitan etapas clínicas específicas de
cánceres humanos. Aparte de esto, también son biológicamente
agresivos e invasivos porque dos de ellos experimentan metástasis
espectacularmente hasta el hígado.
Aunque tiene un efecto antitumoral muy
significativo, el extracto A según la invención muestra efectos
tóxicos insignificantes ya que los ratones que llevan tumor no
perdieron peso corporal durante los tratamientos. El extracto
semipurificado puede por lo tanto incluir un "antídoto" además
del compuesto antitumoral responsable de todas las actividades
antitumorales notificadas en el presente documento.
Sorprendentemente, el extracto A induce
actividades antitumorales significativamente más altas cuando se
somete a ensayo crónicamente a dosis bajas, es decir, alrededor de
1,25 a 0,63 mg/kg, que a dosis altas, es decir, alrededor de 10
mg/kg a 5 mg/kg.
Este ejemplo ilustra los efectos toxicológicos
del extracto A según la invención, en particular la hematotoxicidad
in vivo y la toxicidad general.
Se evalúa la hematotoxicidad al establecer
perfiles hematológicos para cada especie animal. Se prestó
particular atención a los números de plaquetas, glóbulos rojos y
leucocitos de la sangre. Se evaluó el efecto del extracto A a dos
dosis, es decir, 5 mg/kg y 1,25 mg/kg, mediante la administración
intraperitoneal a ratones. El programa de administración fue de
cinco administraciones a la semana durante cinco semanas
consecutivas dando como resultado un número de inyecciones total de
veinticinco. Se sacrificaron los animales tres días tras la última
inyección. Hubo diez ratones por grupo.
En comparación con el control (figura 27), no se
observaron cambios estadísticamente significativos con respecto a
los parámetros hematológicos detrás el tratamiento con el extracto
A. No se observaron cambios significativos en el volumen celular
medio de glóbulos rojos, la hemoglobina corpuscular media, la
concentración de hemoglobina corpuscular media ni las plaquetas
tras los tratamientos.
Se sometió a prueba la toxicidad general del
extracto A histológicamente en ratones por medio de análisis
histopatológicos convencionales de cortes histológicos teñidos con
hematoxicilina-eosina obtenidos de diferentes tipos
de órganos y tejidos. Se evaluó el efecto del extracto A a de 5
mg/kg y a 1,25 mg/kg mediante administración intraperitoneal. El
programa de administración fue de cinco administraciones a la semana
durante cinco semanas consecutivas dando como resultado un número
total de inyecciones de veinticinco. Se sacrificaron los animales
tres días tras la última inyección. Se recogieron el cerebro, el
corazón, el hígado, el páncreas, el estómago, los intestinos y los
ovarios. Hubo diez ratones por grupo.
El examen de los órganos recolectados mostró que
el grupo de control (no tratado) no mostró ninguna modificación
particular en los órganos. Igualmente, en los ratones tratados el
cerebro, el corazón, el hígado, el páncreas, el estómago, los
intestinos y los ovarios no se vieron afectados por los tratamientos
con el extracto A a dosis de 5 mg/kg o 1,25 mg/kg, indicando que el
extracto A no tiene un efecto tóxico general.
Este ejemplo ilustra el efecto antivenenoso de
los extractos según la invención. Se inyectó a ratones hembra de 4
a 5 semanas de edad de dos a cuatro veces la dosis máxima tolerable
de dos fármacos antitumorales bien conocidos y clínicamente usados:
(MTDx4) para adriamicina y (MTDx2) para vincristina. A los ratones
se les administró una única inyección intraperitoneal con 40 mg/kg
de peso corporal de adriamicina o una única inyección
intraperitoneal de 20 mg/kg de peso corporal de vincristina en el
día 0. El lote 1 en la figura 28 muestra la curva de supervivencia
de los ratones a los que se inyectó o bien MTDx2 de vincristina o
bien MTDx4 de adriamicina.
Se inyectó el extracto A según la invención por
vía intraperitoneal a una dosis de 10 mg/kg de peso corporal antes
de la inyección de los fármacos antitumorales. Se aplicaron los
siguientes programas diferentes.
- Se inyectó el extracto A el mismo día (es
decir, el día 0), pero 4 horas antes de la inyección de compuesto
terapéutico adriamicina o vincristina. Los resultados de este
tratamiento se representan por el lote 2 en la figura
28.
28.
- Se inyectó el extracto A una vez al día
durante ocho días antes del día de inyectar el compuesto terapéutico
adriamicina o vincristina. Los resultados de este tratamiento se
representan por el lote 3, en la figura 28.
- Se inyectó el extracto A una vez al día
durante ocho días antes del día de inyectar el compuesto terapéutico
adriamicina o vincristina y después una vez al día durante siete
días tras inyectar los fármacos antitumorales. Los resultados de
este tratamiento se representan por el lote 4 en la figura 28.
Tal como puede observarse en la figura 28, todos
los programas en los que el extracto A se usa en combinación con un
compuesto terapéutico prolongan significativamente la supervivencia
de los ratones en comparación con la inyección de los compuestos
terapéuticos como únicos agentes.
Un segundo ejemplo ilustra el efecto
antivenenoso del extracto A con otro programa de administración. Se
administró a los ratones una única inyección intraperitoneal con 20
mg/kg de peso corporal de vincristina en el día 0. El lote 1 en la
figura 29 muestra la curva de supervivencia de los ratones a los que
se inyectó vincristina.
Se inyectó el extracto A por vía intraperitoneal
a una dosis de 10 mg/kg de peso corporal antes de, o al mismo
tiempo que, la inyección del fármaco antitumoral. Se aplicaron los
siguientes programas diferentes.
- Se inyectó el extracto A el mismo día (es
decir en el día 0), pero 6 horas antes de la inyección del compuesto
terapéutico vincristina. Los resultados de este tratamiento se
representan por el lote 2, en la figura 29.
- Se inyectó el extracto A en el mismo día (es
decir en el día 0), pero 4 horas antes de la inyección del
compuesto terapéutico vincristina. Los resultados de este
tratamiento se representan por el lote 3 en la figura 29.
- Se inyectó el extracto A en el mismo día (es
decir en el día 0), pero 2 horas antes de la inyección del
compuesto terapéutico vincristina. Los resultados de este
tratamiento se representan por el lote 4 en la figura 29.
- Se inyectó el extracto A en el mismo día (es
decir en el día 0), y en el mismo tiempo que la inyección del
compuesto terapéutico vincristina. Los resultados de este
tratamiento se representan por el lote 5 en la figura 29.
El parámetro, que se aplicó para determinar el
efecto protector, es decir, antivenenoso, del extracto A, sobre los
efectos tóxicos inducidos por los fármacos antitumorales consistió
en la "prolongación de la supervivencia". El análisis
estadístico se llevó a cabo por medio de la estadística de
Kaplan-Meier. El nivel de significación fue de
p<0,05.
Tal como puede observarse en la figura 29, el
programa en el que se inyectó el extracto A 4 horas antes de la
inyección de vincristina (lote 3) prolonga significativamente la
supervivencia de ratones en comparación con la inyección del
compuesto terapéutico como único agente.
Por tanto, puede concluirse que el extracto A
permite proteger significativamente ratones de los efectos tóxicos
de una dosis mortal de un compuesto antitumoral frecuentemente usado
tal como adriamicina o vincristina. El extracto A según la
invención tiene por tanto un efecto antivenenoso, mediante el cual
permite reducir los efectos tóxicos de un compuesto antitumoral
bien conocido.
Un tercer ejemplo ilustra el efecto antivenenoso
del extracto B. Se inyectó a ratones hembra de 4 a 5 semanas de
edad cuatro compuestos antitumorales bien conocidos y clínicamente
usados: adriamicina, vincristina, oxaliplatino y camptotecina. Se
administró a los ratones una única inyección intraperitoneal de 20
mg/kg de peso corporal de adriamicina o una única inyección
intraperitoneal de 20 mg/kg de peso corporal de vincristina o una
única inyección intraperitoneal de 40 mg/kg de peso corporal de
oxaliplatino o una única inyección intraperitoneal de 20 mg/kg de
peso corporal de camptotecina en el día 0.
El lote 1 en la figura 30, figura 31, figura 32
y figura 33 muestra la curva de supervivencia de los ratones a los
que se inyectó o bien adriamicina o bien vincristina o bien
oxaliplatino o bien camptotecina.
El lote 2 en las figuras 30 a 33 muestra el
"punto de supervivencia" de los ratones a los que se inyectó el
extracto B a 10 mg/kg.
El lote 3 en las figuras 30 a 33 muestra la
curva de supervivencia de los ratones a los que se inyectó por vía
intraperitoneal el extracto B a 10 mg/kg de peso corporal en el
mismo día (es decir, en el día 0) pero 4 horas antes de la
inyección del compuesto terapéutico.
Tal como puede observarse en las figuras 30 a
33, el extracto B usado en combinación con el compuesto terapéutico
prolonga significativamente la supervivencia de los ratones en
comparación con la inyección del compuesto terapéutico como único
agente. El extracto B no mostró propiedades citotóxicas. De hecho,
ningún ratón murió cuando se le inyectó el extracto B como único
agente. El análisis estadístico se llevó a cabo por medio de la
estadística de Kaplan-Meier. El nivel de
significación fue de p<0,05 para cada combinación del extracto B
y compuesto terapéutico.
Por tanto, puede concluirse que el extracto B
proporciona protección significativa a ratones de los efectos
tóxicos de una dosis mortal de fármacos antitumorales frecuentemente
usados. El extracto B tiene por tanto un efecto antivenenoso, que
permite la reducción de los efectos tóxicos de fármacos
antitumorales bien conocidos. La actividad antivenenosa se conservó
tanto en el extracto B como en el extracto A.
Un cuarto ejemplo ilustra el efecto antivenenoso
del extracto C. Se usó el extracto C en combinación con adriamicina
a 20 mg/kg de peso corporal.
El lote 1 en la figura 34 muestra la curva de
supervivencia de los ratones a los que se inyectaron 20 mg/kg de
peso corporal de adriamicina.
El lote 2 en la figura 34 muestra la curva de
supervivencia de los ratones a los que se inyectó el extracto C a
10 mg/kg el mismo día (es decir, el día 0) pero 4 horas antes de la
inyección del compuesto terapéutico.
Tal como puede observarse en la figura 34, la
inyección del extracto C indujo una prolongación de supervivencia
de los ratones significativa en comparación con la inyección del
compuesto terapéutico como un único agente. Por tanto, puede
concluirse que el extracto C muestra propiedades antivenenosas al
igual que el extracto B anterior.
Un quinto ejemplo ilustra el efecto venenoso del
extracto D. Se inyectó adriamicina a ratones hembra de 4 a 5
semanas de edad. Se administró a los ratones a una única inyección
intraperitoneal de 20 mg/kg de peso corporal de adriamicina en el
día 0 (lote 1 en la figura 35). El lote 2 en la figura 35 muestra la
curva de supervivencia de los ratones a los que se inyectó el
extracto D por vía intraperitoneal a una dosis de 5 mg/kg de peso
corporal el mismo día (es decir, el día 0) pero 4 horas antes de la
inyección del compuesto terapéutico adriamicina.
Tal como puede observarse en la figura 35, la
inyección del extracto D indujo una prolongación de supervivencia
de los ratones significativa en comparación con la inyección del
compuesto terapéutico como el único agente. Por tanto, puede
concluirse que el extracto D muestra propiedades antivenenosas al
igual que el extracto C anterior.
En conclusión, estos experimentos ilustran que
los extractos purificados según la invención prolongan
significativamente la supervivencia de ratones en comparación con
los ratones inyectados con el compuesto terapéutico como el único
agente. El extracto D, el extracto más purificado, mostró
propiedades antivenenosas sobre los efectos tóxicos inducidos por
los fármacos antitumorales.
Claims (14)
1. Uso de una composición que comprende un
extracto de Calotropis procera, y al menos un compuesto
terapéutico seleccionado del grupo que comprende un agente
anticancerígeno, un anticuerpo citotóxico o un fragmento del mismo,
una hormona citotóxica o un fragmento de la misma y un péptido
citotóxico o un fragmento del mismo; para la preparación de un
medicamento para el tratamiento del cáncer.
2. Uso de una composición según la
reivindicación 1, en el que dicho extracto se obtiene usando un
procedimiento de extracción, que comprende las etapas de:
a) extraer el material de partida de la planta
Calotropis procera, seleccionándose dicho material de
partida de entre frutos, partes aéreas, partes subterráneas y sus
mezclas, en un alcohol alifático, disolviendo dicho material de
partida en dicho alcohol obteniendo de esta manera una suspensión de
dicho material en dicho alcohol, agitar dicha suspensión y filtrar
dicha suspensión mediante vidrio fritado obteniendo de esta manera
un primer filtrado y una primera parte sólida;
b) extraer dicha primera parte sólida en un
alcohol alifático obteniendo de esta manera un segundo filtrado y
una segunda parte sólida;
c) combinar dicho primer y segundo filtrados
obteniendo de esta manera un filtrado combinado, y evaporar el
filtrado combinado a vacío obteniendo de esta manera dicho
extracto.
3. Uso de una composición según la
reivindicación 1 ó 2, en el que dicho extracto comprende al menos
dos compuestos activos seleccionados del grupo que comprende
asclepina, calactina, vorusharina, calotropina, calotropagenina,
uzarigenina, calotoxina, usharina, usharidina y
2''oxo-vorusharina.
4. Uso de una composición según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que la razón de peso de
extracto:compuesto terapéutico está en el intervalo de 0,001 : 1 a
1000 : 1.
5. Uso de una composición según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho cáncer se selecciona
del grupo que comprende cáncer de mama, linfoma, sarcoma, cáncer
pancreático, melanoma, cáncer colorrectal, glioma, cáncer pulmonar
de células no pequeñas, cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer
de piel, cáncer de hueso, cáncer ovárico, cáncer del SNC, cáncer
renal, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de
próstata, cáncer de hígado y cánceres hematológicos.
6. Uso de una composición según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho(s)
compuesto(s) terapéutico(s) es(son) un agente
contra el cáncer.
7. Uso de una composición según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho compuesto terapéutico
se selecciona del grupo que comprende adriamicina, alqueran,
ara-c, bleomicina, carmustina, busulfan, lomustina,
camptotecina, carboplatino, cisplatino, ciclofosfamida, citoxan,
daunorrubicina, dacarbacina, fluorouracilo, fludarabina,
gemcitabina (gemzar), herceptina, hexametilmelamina, hidrea,
idarrubicina, ifosfamida, irinotecano (camptosar,
CPT-11), leustatina, metotrexato, mitramicina,
mitomicina, mitoxantrona, muforan, navelbina, mostaza nitrogenada,
oxaliplatino, rituxan, imatinib, estreptozocina, taxol, taxotere,
topotecano (hicamtina), velban, vincristina, etopóxido, xeloda
(capecitabina) o zevelina.
8. Uso de una composición según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho(s)
compuesto(s) terapéutico(s) es(son) un
anticuerpo citotóxico o un fragmento del mismo.
9. Uso de una composición según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho(s)
compuesto(s) terapéutico(s) es(son) una
hormona citotóxica o un fragmento de la misma.
10. Uso de una composición según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho(s)
compuesto(s) terapéutico(s) es(son) un péptido
citotóxico o un fragmento del mismo.
11. Uso de una composición según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho extracto se administra
antes, después o al mismo tiempo que dicho(s)
compuesto(s) terapéutico(s).
12. Un procedimiento de extracción para obtener
un extracto que tiene componentes biológicamente activos que
comprende las etapas de:
a) extraer el material de partida de la planta
Calotropis procera, seleccionándose dicho material de
partida de entre frutos, partes aéreas, partes subterráneas y sus
mezclas, en un alcohol alifático, disolviendo dicho material de
partida en dicho alcohol obteniendo de esta manera una suspensión de
dicho material en dicho alcohol, agitar dicha suspensión; y filtrar
dicha suspensión mediante vidrio fritado obteniendo de esta manera
un primer filtrado y una primera parte sólida;
b) extraer dicha primera parte sólida en un
alcohol alifático obteniendo de esta manera un segundo filtrado y
una segunda parte sólida;
c) combinar dicho primer y segundo filtrados
obteniendo de esta manera un filtrado combinado, y
d) evaporar el filtrado combinado a vacío
obteniendo de esta manera dicho extracto.
13. Extracto activo aislado a partir del
procedimiento según la reivindicación 12.
14. Un kit que comprende un recipiente en el que
está presente un extracto de Calotropis procera según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y un recipiente en el que
está presente un compuesto terapéutico según la
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