ES2279157T3

ES2279157T3 - Extracto con actividad antitumoral y antivenenosa.

Info

Publication number: ES2279157T3
Application number: ES03757940T
Authority: ES
Inventors: Francis Darro; Jean-Claude Braekman; Pierre Guissou; Odile Germaine Nacoulma; Mohamed El Yazidi; Janique Dewelle; Rob Van Ginkel; Marc Van Damme; Robert Kiss
Original assignee: Unibioscreen SA; Universite Libre de Bruxelles ULB
Current assignee: Unibioscreen SA; Universite Libre de Bruxelles ULB
Priority date: 2002-10-09
Filing date: 2003-10-09
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2023-10-09
Also published as: WO2004032948A1; AU2002342808A1; MXPA05003634A; ATE349221T1; DK1549329T3; AU2003273973A1; CN100522184C; WO2004032947A1; HK1082663A1; PT1549329E; CA2501240A1; CN1711099A; DE60310742T2; JP4944380B2; US20060057237A1; DE60310742D1; EP1549329B1; EP1549329A1; ZA200502790B; AU2003273973B2

Abstract

Uso de una composición que comprende un extracto de Calotropis procera, y al menos un compuesto terapéutico seleccionado del grupo que comprende un agente anticancerígeno, un anticuerpo citotóxico o un fragmento del mismo, una hormona citotóxica o un fragmento de la misma y un péptido citotóxico o un fragmento del mismo; para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

Description

Extracto con actividad antitumoral y antivenenosa.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo médico. La invención se refiere en un primer aspecto a extractos de la planta Calotropis procera, que tienen una actividad farmacológica, en particular una actividad antitumoral y/o actividad antivenenosa y a compuestos activos aislados de los mismos. En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a métodos para obtener dichos extractos. La invención se refiere además en un tercer aspecto a una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer que comprende una cantidad eficaz de dichos extractos o un compuesto activo de los mismos. En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere al uso de los extractos o de un compuesto activo de los mismos como un medicamento, y al uso de dichos extractos o de un compuesto activo de los mismos en la preparación de un medicamento para el tratamiento contra el cáncer.

Antecedentes de la invención

El cáncer se desarrolla en un tejido dado cuando alguna mutación genómica perturba la cinética del ciclo celular al aumentar la proliferación celular o disminuir la muerte celular, o ambas. Esta perturbación lleva a un crecimiento no restringido de una población celular genómicamente transformada. Algunas células de esta población celular transformadas pueden cambiar al fenotipo angiogénico, haciéndoles posible reclutar células endoteliales a partir de tejido sano y llevar al crecimiento sostenido del tejido tumoral neoplásico en desarrollo. Posteriormente, algunas células migran del tejido tumoral neoplásico y colonizan tejido nuevo, usando vasos sanguíneos o linfáticos como rutas principales de migración. Este proceso también se conoce como el proceso metastásico.

En la práctica, la mayoría de los agentes usados actualmente en hospitales para tratar a pacientes de cáncer son fármacos, que más o menos tienen como objetivo directamente la cinética celular, es decir, la proliferación celular, del cáncer que se combatirá. El mecanismo de funcionamiento de estos fármacos contra el cáncer se refiere esencialmente a la ruptura del desarrollo de células malignas al actuar sobre la cinética de la célula. Estos fármacos incluyen agentes alquilantes, agentes intercalantes, antimetabolitos, etc., la mayoría de los cuales tienen como objetivo a ADN o enzimas que regulan los procesos de duplicación y alargamiento del ADN. Estos fármacos atacan al ADN.

Una desventaja principal de estos fármacos supone que los fármacos no funcionan de una manera selectiva, es decir, no seleccionan entre células normales y neoplásicas. Se usan según el hecho de que el ADN de células que proliferan rápidamente, es decir, células de cáncer, es más sensible a este tipo de agentes que el ADN de las que proliferan menos rápidamente, es decir, células normales. Sin embargo, los tumores que crecen rápidamente no siempre son tumores que muestran altos niveles de proliferación celular. Los tumores que crecen rápidamente también pueden incluir tumores que muestran bajos niveles de muerte celular en comparación con la población celular normales que se derivan de estas células tumorales. Para estos tipos de tumores que crecen rápidamente, los fármacos mencionados no son
eficaces.

Además, la gran mayoría de los fármacos usados en el tratamiento normal del cáncer usando el enfoque de cinética de células tienen la desventaja de ser tóxicos o incluso altamente tóxicos, es decir, incluyen muchos efectos secundarios perjudiciales en las células, tejidos y órganos sanos, y esto limita su uso clínico a un número de administraciones por paciente relativamente bajo. Además, varios de estos compuestos deben combinarse en un régimen poliquimioterápico con el fin de tener cualquier efecto observable contra el cáncer. A modo de evidencia, estas combinaciones de fármacos contra el cáncer aumentan dañinamente la toxicidad del tratamiento y también limitan el número de administraciones que pueden aplicarse.

Se han propuesto algunos fármacos contra el cáncer de orígenes naturales, tales como por ejemplo compuestos antitubulina, usando un enfoque terapéutico diferente al enfoque de la cinética de las células. Estos fármacos intentan prevenir la migración de células cancerosas que escapan de la masa del tumor e invaden primero el tejido adyacente estableciendo de esta manera metástasis. Sin embargo, los compuestos de este tipo conocidos hasta el momento también muestran efectos secundarios tóxicos grandes, lo que limita su uso durante largos periodos de trata-
miento.

Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad urgente en la técnica por encontrar fármacos contra el cáncer mejorados, que superen al menos algunas de las desventajas mencionadas anteriormente. En consecuencia, un objetivo general de la invención es proporcionar fármacos contra el cáncer mejorados. En particular, la invención pretende proporcionar un fármaco contra el cáncer mejorado, que muestra efectos secundarios mínimos.

Sumario de la invención

Una realización de la presente invención es un extracto de la planta Calotropis procera, caracterizado porque dicho extracto tiene una actividad farmacológica, en particular una actividad antivenenosa. En un primer aspecto, por tanto, la presente invención se refiere al uso de una composición que comprende un extracto de Calotropis procera según la reivindicación 1.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de extracción para obtener un extracto que tiene componentes biológicamente activos según la reivindicación 12. Todavía en otro aspecto, la invención se refiere a un extracto activo según la reivindicación 13.

Una realización de la presente invención es un extracto tal como se describió anteriormente obtenido usando un procedimiento de extracción que comprende las etapas de:

a) extraer el material de partida de dicha planta de Calotropis procera, seleccionándose dicho material de partida de entre frutos, partes subterráneas, partes aéreas y sus mezclas, en un alcohol alifático, disolviendo el material de partida en dicho alcohol, obteniendo de esta manera una suspensión del material en dicho alcohol, agitar dicha suspensión y filtrar dicha suspensión mediante vidrio fritado obteniendo de esta manera un primer filtrado y una primera parte sólida;

b) extraer dicha primera parte sólida en un alcohol alifático obteniendo de esta manera un segundo filtrado y una segunda parte sólida;

c) combinar dicho primer y segundo filtrados obteniendo de esta manera un filtrado combinado, y evaporar el filtrado combinado a vacío obteniendo así el extracto.

Otra realización de la presente invención es un extracto tal como se describió anteriormente, obtenido usando un procedimiento de una extracción que comprende las etapas de:

a) moler el material de partida de hojas, tallos, cortezas y raíces de Calotropis procera para dar un polvo fino de la planta,

b) extraer el polvo de la etapa a) con diclorometano durante al menos 6, 12, 18 o preferiblemente 24 horas usando un extractor Soxhlet,

c) decantar el diclorometano de la etapa b), y evaporar el filtrado, tras la filtración, para obtener una goma.

Otra realización de la presente invención es un extracto tal como se describió anteriormente obtenido usando un procedimiento de extracción que comprende las etapas de:

b) extraer el polvo de la etapa a) con diclorometano durante al menos 6, 12, 18 o preferiblemente 24 horas usando un extractor,

c) decantar el diclorometano de la etapa b) y evaporar el filtrado, tras la filtración, para obtener una goma,

d) extraer el residuo de la etapa c) con metanol durante al menos 6, 12, 18 o preferiblemente 24 horas usando un extractor Soxhlet,

e) decantar el metanol de la etapa d), evaporar el filtrado, tras la filtración, para obtener una goma,

f) someter la goma de la etapa e) a cromatografía en columna usando gel de sílice ultrarrápido y diclorometano-metanol como solvente, y

g) recoger una primera fracción y evaporar la fracción para obtener una goma que tiene los componentes biológicamente activos.

c) decantar el diclorometano de la etapa b), y evaporar el filtrado, tras la filtración, para obtener una goma,

f) someter la goma de la etapa e) a cromatografía en columna usando gel de sílice ultrarrápido y diclorometano-metanol como solvente,

g) recoger una primera fracción, que tiene componentes biológicamente activos,

h) aplicar la fracción concentrada de la etapa g) a cromatografía en columna usando gel de sílice ultrarrápido y hexano-acetona como solvente para dar dos fracciones, y

i) lavar la columna tras la etapa h) con metanol para dar una tercera fracción, que tiene los componentes biológicamente activos.

Otra realización de la presente invención es una composición que comprende:

- un extracto de Calotropis procera tal como se describió anteriormente y

- al menos un compuesto terapéutico y/o un tratamiento físico que ejerce efectos secundarios relevantes y perjudiciales en células, tejidos u órganos relacionados, normales y no cancerosos.

Otra realización de la presente invención es un producto que contiene

- un extracto de Calotropis procera, tal como se describió anteriormente y

- al menos un compuesto terapéutico y/o un tratamiento físico que ejerce efectos secundarios perjudiciales y relevantes en células, tejidos u órganos relacionados, normales y no cancerosos como una preparación combinada para su administración simultánea, separada o secuencial a un sujeto.

Otra realización de la presente invención es una composición tal como se describió anteriormente o un producto tal como se describió anteriormente, en los que uno de los extractos comprende al menos dos compuestos activos seleccionados del grupo que comprende asclepina, calactina, vorusharina, calotropina, calotropagenina, uzarigenina, calotoxina, usharina, usharidina y 2'oxo-vorusharina.

Otra realización de la presente invención es una composición tal como se describió anteriormente, o un producto tal como se describió anteriormente, en los que uno de los extractos comprende al menos uno de los compuestos que están representados en la tabla 1.

Otra realización de la presente invención es una composición tal como se describió anteriormente o un producto tal como se describió anteriormente, en los que la razón de peso de extracto:compuesto terapéutico está en el intervalo de 0,001:1 a 1000:1.

Otra realización de la presente invención es una composición tal como se describió anteriormente, o un producto tal como se describió anteriormente, para usarse como un medicamento.

Otra realización de la presente invención es una composición tal como se describió anteriormente, o un producto tal como se describió anteriormente, para usarse como un medicamento para el tratamiento contra el cáncer.

Otra realización de la presente invención es una composición o producto tal como se describió anteriormente, en los que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, linfoma, sarcoma, cáncer pancreático, melanoma, cáncer colorrectal, glioma, cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer de piel, cáncer de hueso, cáncer ovárico, cáncer del SNC, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata, cáncer de hígado y cánceres hematológicos.

Otra realización de la presente invención es una composición tal como se describió anteriormente, o un producto tal como se describió anteriormente, que comprende además uno o más compuestos terapéuticos adicionales.

Otra realización de la presente invención es una composición tal como se describió anteriormente, o un producto tal como se describió anteriormente, en los que dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s) es(son) un agente(s) contra el cáncer.

Otra realización de la presente invención es una composición tal como se describió anteriormente, o un producto tal como se describió anteriormente, en los que el compuesto terapéutico se selecciona del grupo que comprende adriamicina, alqueran, ara-c, bleomicina, biCNU (carmustina), busulfán, CCNU (lomustina), camptotecina, carboplatino, cisplatino, ciclofosfamida, citoxan, daunorrubicina, DTIC (dacarbacina), 5-FU (fluorouracilo), fludarabina, gemcitabina (gemzar), herceptina, hexametilmelamina, hidrea, idarrubicina, ifosfamida, irinotecano (camptosar, CPT-11), leustatina, metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, muforan, navelbina, mostaza nitrogenada, oxaliplatino, rituxan, STI-571 (imatinib), estreptozocina, taxol, taxotere, topotecano (hicamtina), velban, vincristina, VP-16 (etopósido), xeloda (capecitabina) o zevelina.

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Otra realización de la presente invención es una composición tal como se describió anteriormente, o un producto tal como se describió anteriormente, en los que el compuesto terapéutico se selecciona del grupo que comprende adriamicina, vincristina, camptotecina y oxaliplatino.

Otra realización de la presente invención es una composición tal como se describió anteriormente, o un producto tal como se describió anteriormente, en los que el(los) compuesto(s) terapéutico(s) es(son) un anticuerpo(s) citotóxico(s)
o un fragmento del(de los) mismo(s).

Otra realización de la presente invención es una composición tal como se describió anteriormente, o un producto tal como se describió anteriormente, en los que el(los) compuesto(s) terapéutico(s) es(son) un péptido(s) citotóxico(s) o un fragmento del(de los) mismo(s).

Otra realización de la presente invención es una composición tal como se describió anteriormente, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable o un producto tal como se describió anteriormente, en los que la composición y/o el(los) compuesto(s) terapéutico(s) comprende(n) además un vehículo farmacéuticamente
aceptable.

Otra realización de la presente invención es un uso de un extracto de Calotropis procera tal como se describió anteriormente, en la preparación de un medicamento para aliviar los efectos secundarios de uno o más compuestos terapéuticos.

Otra realización de la presente invención es un uso de un extracto de Calotropis procera tal como se describió anteriormente en la preparación de un medicamento para aumentar la dosis administrada a un individuo de uno o más compuestos terapéuticos.

Otra realización de la presente invención es un uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s) tiene(n) actividad contra el cáncer.

Otra realización de la presente invención es un uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s) se selecciona(n) del grupo que comprende adriamicina, alqueran, ara-c, bleomicina, biCNU, busulfán, CCNU, carboplatino, cisplatino, ciclofosfamida, citoxan, daunorrubicina, DTIC, 5-FU, fludarabina, gemcitabina (gemzar), herceptina, hexametilmelamina, hidrea, idarrubicina, ifosfamida, irinotecano (camptosar, CPT-11), leustatina, metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, muforan, navelbina, mostaza nitrogenada, oxaliplatino, rituxan, STI-571, estreptozocina, taxol, taxotere, topotecano (hicamtina), velban, vincristina, VP-16, xeloda (capecitabina) o zevelina.

Otra realización de la presente invención es un uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s) se selecciona(n) del grupo que comprende adriamicina, vincristina, camptotecina y oxaliplatino.

Otra realización de la presente invención es un uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s) es(son) un anticuerpo(s) citotóxico(s) o un fragmento del mismo.

Otra realización de la presente invención es un uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s) es(son) una hormona(s) citotóxica(s) o un fragmento de la misma.

Otra realización de la presente invención es un uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s) es(son) un péptido(s) citotóxico(s) o un fragmento del mismo.

Otra realización de la presente invención es un uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que dicho extracto comprende al menos dos compuestos activos seleccionados de asclepina, calactina, vorusharina, calotropina, calotropagenina, uzarigenina, calotoxina, usharina y usharidina.

Otra realización de la presente invención es un uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que dicho extracto contiene además al menos uno de los compuestos que están representados en la tabla 1.

Otra realización de la presente invención es un uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que dicho extracto se administra antes de dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s).

Otra realización de la presente invención es un uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que dicho extracto se administra tras dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s).

Otra realización de la presente invención es un uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que dicho extracto se administra al mismo tiempo que dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s).

Otra realización de la presente invención es un uso de un extracto tal como se describió anteriormente, en el que la razón de peso de extracto:compuesto terapéutico está en el intervalo de 0,001:1 a 1000:1.

Otra realización de la presente invención es un procedimiento de extracción para obtener un extracto que tiene componentes biológicamente activos que comprende las etapas de:

a) extraer el material de partida de la planta de Calotropis procera, seleccionándose dicho material de partida de entre frutos, partes aéreas, partes subterráneas y sus mezclas, en un alcohol alifático, disolviendo dicho material de partida en dicho alcohol obteniendo de esta manera una suspensión de dicho material en dicho alcohol, agitar dicha suspensión y filtrar dicha suspensión mediante vidrio fritado obteniendo de esta manera un primer filtrado y una parte sólida;

c) combinar dicho primer y segundo filtrado obteniendo de esta manera un filtrado combinado y

d) evaporar el filtrado combinado a vacío obteniendo de esta manera dicho extracto.

Otra realización de la presente invención es un procedimiento de extracción para obtener varios extractos que tienen componentes biológicamente activos presentes sustancialmente en las hojas, tallos, corteza y raíces de Calotropis procera, que comprende las siguientes etapas:

a) moler el material de partida de hojas, tallo, cortezas y raíces de Calotropis procera para dar un polvo fino de la planta,

b) extraer el polvo de la etapa a) con diclorometano durante al menos 6, 12, 18 o preferiblemente 24 horas usando un extractor Soxhlet, y

Otra realización de la presente invención es un procedimiento de extracción tal como se describió anteriormente que comprende además las etapas de:

d) extraer el residuo de la etapa c) con metanol durante al menos 6, 12, 18 o preferiblemente 24 horas usando un extractor Soxhlet

g) recoger una primera fracción que tiene los componentes biológicamente activos y evaporar el eluyente para obtener dicho extracto.

Otra realización de la presente invención es un procedimiento de extracción tal como se describió anteriormente, que comprende además las etapas de:

h) aplicar fracción de la etapa g) a cromatografía en columna usando gel de sílice ultrarrápido y hexano-acetona para dar dos fracciones,

Otra realización de la presente invención es un procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que la etapa b) se lleva a cabo a una temperatura de trabajo de entre 20 y 80ºC.

Otra realización de la presente invención es un procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que la etapa b) se repite entre una y cinco veces.

Otra realización de la presente invención es un procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que la duración de la etapa b) es de entre 4 horas y 48 horas.

Otra realización de la presente invención es un procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que la fase sólida de la etapa d) es gel de sílice.

Otra realización de la presente invención es un procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que el eluyente de la etapa d) es un eluyente binario, siendo la razón entre los componentes del eluyente de entre 100:0 a 0:100.

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Otra realización de la presente invención es un procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que los componentes del eluyente binario comprenden un solvente alcohólico y un solvente no polar.

Otra realización de la presente invención es un procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que la etapa e) se lleva a cabo a una temperatura de trabajo de entre 20 y 50ºC.

Otra realización de la presente invención es un procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que la fase sólida de la etapa f) es gel de sílice.

Otra realización de la presente invención es un procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que el eluyente de la etapa f) es un eluyente binario, siendo la razón entre los dos componentes del eluyente de entre 100:0 a 0:100.

Otra realización de la presente invención es un procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que los componentes del eluyente binario son no polares y un solvente más polar.

Otra realización de la presente invención es un procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que la razón entre los dos componentes de eluyente, no polar:polar es de entre 50:50 y 100:0.

Otra realización de la presente invención es un procedimiento tal como se describió anteriormente, en el que el solvente de la etapa h) es metanol.

Otra realización de la presente invención es un extracto activo aislado del procedimiento tal como se describió anteriormente.

Otra realización de la presente invención es un uso de un extracto activo tal como se describió anteriormente como un medicamento.

Otra realización de la presente invención es un uso de un extracto activo tal como se describió anteriormente, en la preparación de un medicamento para el tratamiento contra el cáncer.

Otra realización de la presente invención es el uso de una composición según la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento para tratar el cáncer, en el que dicho cáncer se selecciona del grupo que comprende cáncer de mama, linfoma, sarcoma, cáncer pancreático, melanoma, cáncer colorrectal, glioma, cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer de piel, cáncer de hueso, cáncer ovárico, cáncer del SNC, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata, cáncer de hígado y cánceres hematológicos.

La presente invención se refiere además a un kit según la reivindicación 14. Otra realización de la presente invención es un kit que comprende un recipiente en el que está presente un extracto de Calotropis procera tal como se describió anteriormente, y un recipiente en el que está presente un compuesto terapéutico.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a extractos de la planta Calotropis procera. En una primera realización la invención se refiere a extractos de la planta Calotropis procera, que tienen una actividad farmacológica, en particular una actividad antitumoral y/o una actividad antivenenosa. Sorprendentemente, al menos uno de los extractos según la invención combina un efecto antitumoral con una actividad antivenenosa.

Según la presente invención el término "actividad antitumoral", se refiere a los efectos antitumorales in vitro, así como in vivo ejercidos por al menos uno de los extractos o compuestos aislados de los mismos. Los efectos antitumorales incluyen esencialmente, pero no se limitan a, una disminución espectacular del crecimiento celular y un efecto pro-apoptótico. Y lo que es más importante, los extractos según la invención muestran actividad antitumoral sobre un gran número de tipos de cánceres, tales como cáncer de mama, cánceres de melanoma o linfoma, entre otros.

Otra característica de los extractos según la invención abarca su actividad antivenenosa. El término "actividad antivenenosa" se refiere a la capacidad de los extractos según la invención o de los compuestos aislados de los mismos, para atenuar o revertir los efectos de los compuestos o tratamientos terapéuticos. Un "compuesto terapéutico", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto que ejerce un efecto perjudicial relevante, y tóxico en células, tejidos u otros órganos relacionados y normales, es decir, no cancerosos. Por tanto, el término compuesto terapéutico también puede incluir un compuesto, fármaco, tratamiento físico o medicamento, usado para tratar una enfermedad particular, que ejerza efectos secundarios tóxicos perjudiciales. Estos efectos secundarios se conocen por el experto e incluyen, pero no se limitan a, cansancio, náuseas, vómitos, úlceras, úlceras bucales, piel reseca, piel sensible, caída del cabello, recuento reducido de glóbulos rojos y blancos. Tales compuestos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, agentes de quimioterapia, radiación, anticuerpos y hormonas.

Los compuestos terapéuticos útiles según la invención incluyen los usados en la quimioterapia o que son citotóxicos. Incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de adriamicina, alqueran, ara-c, bleomicina, biCNU, busulfán, CCNU, carboplatino, cisplatino, ciclofosfamida, citoxan, daunorrubicina, DTIC, 5-FU, fludarabina, gemcitabina (gemzar), herceptina, hexametilmelamina, hidrea, idarrubicina, ifosfamida, irinotecano (camptosar, CPT-11), leustatina, metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, muforan, navelbina, mostaza nitrogenada, oxaliplatino, rituxan, STI-571, estreptozocina, taxol, taxotere, topotecano (hicamtina), velban, vincristina, VP-16, xeloda (capecitabina) o zevelina.

Otro aspecto de la invención es un agente terapéutico que comprende uno o más agentes contra el cáncer que se derivan de un extracto de la presente invención. Los compuestos anticancerígenos posibles según la invención son cualquiera extraídos de Calotropis procera tales como asclepina, calactina, voruscharina, calotropina, calotropagenina, uzarigenina, calotoxina, uscharina y uscharidina.

En otra realización de la invención, los compuestos anticancerígenos son cualquiera extraídos de Calotropis procera tal como 2''oxo-voruscharina, y derivados de los mismos tal como se muestra en la tabla 2.

Otro aspecto de la invención es un agente terapéutico que es un extracto de la invención. Dicho extracto puede ser idéntico a un extracto que tenga una actividad antivenenosa. Alternativamente, dicho extracto puede ser idéntico a un extracto que tenga una actividad antivenenosa, con excepción de la ausencia de uno o más compuestos activos de cualquier extracto. Alternativamente, dicho extracto puede ser idéntico a un extracto que tenga una actividad antivenenosa, con excepción de la presencia de uno o más compuestos activos adicionales en cualquier extracto. Alternativamente, dicho extracto puede ser idéntico a un extracto que tenga una actividad antivenenosa, con excepción de la diferencia en la concentración de uno o más compuestos activos en cualquier extracto.

Otro aspecto de la invención es que el compuesto terapéutico es un anticuerpo, o un fragmento del mismo. Dicho anticuerpo demuestra actividad citotóxica. Ejemplos de anticuerpos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, HerceptinR, Prostascint, Rituximab y Trastuzumab.

Otro aspecto de la invención es que el compuesto terapéutico es una hormona, o un fragmento de la misma. Dicha hormona demuestra actividad citotóxica. Ejemplos de hormonas terapéuticas incluyen, pero no se limitan a, buserelina, fluoximesterona, flutamida, formestan, noretandrolona, noretisterona, prednisolona, prednisona y tamoxifeno.

Otro aspecto de la invención es que el compuesto terapéutico es un péptido, o un fragmento del mismo. Dicho péptido demuestra actividad citotóxica.

Por fragmento en referencia a un anticuerpo, hormona o péptido se quiere decir un péptido que comprende una parte del anticuerpo, hormona o péptido que puede reconocer el objetivo del anticuerpo, hormona o péptido completo. El fragmento también puede reconocer el objetivo del anticuerpo, hormona o péptido completo. La parte puede comprender sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos, que no cambien sustancialmente el reconocimiento del objetivo por la parte. El número de sustituciones, deleciones o inserciones puede ser menor que 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400 ó 500.

Otro aspecto de la invención es que la actividad intravenosa de los extractos permite la administración de una dosis más alta del compuesto terapéutico. Al administrar una dosis más alta de compuesto terapéutico, el cáncer puede tratarse en forma más rápida y eficaz. Un individuo que reciba una dosis más alta, en combinación con un extracto de la invención, se beneficiaría de efectos secundarios reducidos del compuesto terapéutico.

Otro aspecto de la invención es que la actividad antivenenosa de los extractos permite la administración de una combinación de compuestos terapéuticos. Una terapia de combinación seleccionaría aspectos diferentes de cáncer simultáneamente, llevando así a un tratamiento más eficaz y eficiente. Al administrar la combinación según la invención, el paciente padecería menos efectos secundarios y se beneficiaría de la eficacia de la terapia de combinación.

En otra realización, la presente invención se refiere a los compuestos activos, aislados de los extractos. Los términos "compuestos activos" o "componentes activos" de los extractos, se utilizan en el presente documento como sinónimos, y se refieren a los compuestos presentes en los extractos, que muestran una actividad que es similar a al menos una de las actividades definidas anteriormente de los extractos.

En todavía realización, la presente invención se refiere a métodos para obtener los extractos de la planta Calotropis procera.

Debido al hecho de que al menos uno de los extractos según la invención ejerce una actividad antitumoral, los extractos según la invención son particularmente útiles para el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer. Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden uno de los extractos descritos anteriormente o al menos a un compuesto activo de los mismos.

Además, ya que los extractos según la invención ejercen también una actividad antivenenosa, también es particularmente adecuado que se combinen con otros compuestos terapéuticos, tales como otros medicamentos, que muestren efectos secundarios tóxicos. Por lo tanto, en otra realización, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende uno de los extractos descritos anteriormente o al menos un compuesto activo de los mismos, y un segundo compuesto, que ejerce una actividad farmacológica que tiene efectos secundarios tóxicos.

Además, la presente invención se refiere a uno de los extractos y/o al menos a un compuesto activo de los mismos como un medicamento. La presente invención se refiere además al uso de uno de los extractos o al menos un compuesto activo de los mismos en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades, en particular
cáncer.

Otros objetos y ventajas de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada tomada en conjunto con las figuras adjuntas.

Figuras

La figura 1 describe el crecimiento global de tipos diferentes de tumores como una función de la concentración de un extracto según la invención.

Las figuras 2 a 11 muestran efectos in vitro de un extracto según la invención en diferentes tipos de líneas celulares cancerosas humanas, que son líneas celulares de cáncer de mama en la figura 2, líneas celulares de cáncer de sarcoma en la figura 3, líneas celulares de cáncer pancreático en la figura 4, líneas celulares de cáncer de melanoma en la figura 5, líneas celulares de cáncer de colon en la figura 6, líneas celulares de cáncer de glioma en la figura 7, líneas celulares de cáncer pulmonar en la figura 8, líneas celulares de cáncer de vejiga en la figura 9, líneas celulares de cáncer de próstata en la figura 10 y líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello en la figura 11.

Las figuras 12 a 16 representan efectos in vitro de un extracto según la invención en la cinética del ciclo celular de células que corresponden a cinco líneas celulares humanas diferentes, HCT-15 (figura 12), RPMI (figura 13), A172 (figura 14), J82 (figura 15) y Hs683 (figura 16). La parte superior de las figuras muestra el crecimiento celular completo, como el porcentaje de células cancerosas vivas para controlar células a diferentes dosis del extracto. Las partes medias e inferiores de las figuras muestran el efecto de la cinética del ciclo celular del extracto a diferentes concentraciones tras 24 horas y 72 horas respectivamente. El significado estadístico se evaluó con la prueba t de Student en el que *: p < 0,05, **: p < 0,01: ***: p < 0,001.

Las figuras 17 a 20 representan los efectos inductores de apoptosis e inductores de necrosis in vitro de un extracto según la invención en células que corresponden a cuatro líneas celulares humanas diferentes, HCT-15 (figura 17), A172 (figura 18), J82 (figura 19) y Hs683 (figura 20). La parte superior de las figuras muestra los efectos inductores de apoptosis e inductores de necrosis del extracto a diferentes dosis tras 24 horas, la parte inferior de las figuras tras 72 horas.

La figura 21 representa los efectos de un extracto según la invención en un modelo de cáncer de linfoma in vivo. El extracto mencionado se administró mediante inyección peritoneal a dosis de 2,5 mg/kg; 5 mg/kg y 10 mg/kg de extracto en ratones portadores de tumor de linfoma P388. La figura 21A representa los efectos de un extracto en el peso de ratones control (no tratados) y en ratones tratados. La figura 21B representa los efectos del extracto en el crecimiento tumoral en ratones control y en ratones tratados.

La figura 22 representa los efectos de un extracto según la invención en un modelo de cáncer de linfoma in vivo. Dicho extracto se administró mediante inyección intraperitoneal a dosis de 0,63 mg/kg; 1,25 mg/kg y 2,5 mg/kg de extracto en ratones portadores de tumor de linfoma P388. La figura 22A representa los efectos del extracto en el peso de ratones control y ratones tratados. La figura 22B representa los efectos de dicho extracto en el crecimiento tumoral en ratones control y ratones tratados.

La figura 23 representa los efectos de un extracto según la invención en un modelo de cáncer de melanoma in vivo. Dicho extracto se administró mediante inyección intraperitoneal a dosis de 2,5 mg/kg: 1,25 mg/kg y 0,63 mg/kg de extracto en ratones portadores de melanoma B16. La figura 23A representa los efectos del extracto en el peso de ratones control (no tratados) y ratones tratados. La figura 23B representa los efectos del extracto en el crecimiento tumoral en ratones control y en ratones tratados.

La figura 24 representa los efectos de un extracto según la invención en un modelo de cáncer de melanoma in vivo. El extracto se administró vía oral a dosis de 0,36 mg/kg;1,25 mg/kg y 2,5 mg/kg de extracto en ratones portadores de melanoma B16. La figura 24A representa los efectos en el peso de ratones control y ratones tratados. La figura 24B representa los efectos del extracto en el crecimiento de tumor en ratones control y en ratones
tratados.

La figura 25 representa los efectos de un extracto según la invención en un modelo de cáncer de mama in vivo. El extracto se administró mediante inyección intraperitoneal a dosis de 2,5 mg/kg; 5 mg/kg y 10 mg/kg de extracto en ratones portadores de cáncer de mama MXT-HI. La figura 25A representa los efectos del extracto en el peso de ratones control (no tratados) y ratones tratados. La figura 25B representa los efectos del extracto en el crecimiento tumoral en ratones control y ratones tratados.

La figura 26 representa el ajuste general estadístico para los ratones portadores de cáncer de mama MXT-HI de los grupos de prueba (es decir, inyección intraperitoneal de los ratones a dosis de extracto de 2,5 mg/kg; 5 mg/kg y 10 mg/kg) y el grupo de control, con respecto a la supervivencia (análisis estadístico de Kaplan-Meier).

La figura 27 representa los efectos de un extracto según la invención a dosis de 5 mg/kg y 1,25 mg/kg en la cantidad de glóbulos blancos, glóbulos rojos, hemoglobina y concentración de hematocrito en el día tres tras la inyección peritoneal en ratones en comparación con ratones control (en la figura la dosis de extracto "blanco" es de 1,25 mg/kg).

Las figuras 28 a 35 ilustran los efectos antivenenosos de extractos según la invención cuando se combinan con compuestos antitumorales adriamicina o vincristina o camptotecina u oxaliplatino.

Propiedades del extracto

La planta Calotropis procera, que pertenece a la familia de las Asclepiadaceae, es una planta que crece en África y Asia. Esta planta se usa en la medicina tradicional y también se ha estudiado con respecto a un número considerable de usos tales como un antipirético, antimalárico, antidiarreico, analgésico, antiinflamatorio gástrico, protector de mucosas y como un insecticida, antitusivo, antibacteriano, en curación de heridas y relajante muscular. Se sabe que los tallos, flores y hojas de Calotropis procera contienen ciertos compuestos conocidos como cardenólidos. Recientemente, se ha atribuido la actividad cardiotóxica a estos cardenólidos, y se les utiliza en tratamientos de seres humanos para tratar insuficiencias cardíacas.

Inesperadamente, la presente invención se refiere a al menos un extracto según la invención de la planta Calotropis procera que muestra otro tipo de actividad, en particular una "actividad antitumoral". Además, se demostró que al menos un extracto según la invención muestra efectos antitumorales in vitro así como in vivo. Dicho extracto según la invención induce una reducción espectacular en el crecimiento celular y muestra una actividad pro-apoptótica. Estas propiedades se ilustran adicionalmente en los ejemplos 3 y 4. Además, los inventores han demostrado in vivo que al menos uno de los extractos según la invención es altamente activo contra varios tipos de cánceres. Tal como se muestra en los ejemplos descritos más adelante, el extracto según la invención es altamente activo contra varios tipos de cánceres. Como se muestra en los ejemplos descritos más adelante, el extracto según la invención ejerce efectos antitumorales significativos en varios modelos de tumor probados, lo cual representa un amplio grupo de tipos de tumores histológicos, incluyendo cáncer de mama, linfomas, melanomas. Estos modelos son clínicamente relevantes toda vez que imitan etapas clínicas específicas de cánceres humanos.

Sorprendentemente, el extracto según la invención es altamente activo a dosis relativamente bajas. Dicho extracto puede ejercer una actividad antitumoral a bajas dosis en el intervalo de 0,4 a 2,2 mg/kg y preferiblemente en el intervalo de 0,5 a 2 mg/kg. La alta actividad antitumoral a bajas dosis indica que los extractos son altamente activos. Sorprendentemente, como también quedará claro cuando se lean los ejemplos más adelante, el extracto según la invención muestra efectos antitumorales significativamente más altos cuando se somete a ensayo a dosis crónicamente bajas, es decir, 0,6 mg/kg a 1,25 mg/kg, que a dosis altas, es decir a dosis de 5 mg/kg a 10 mg/kg. El índice de Dosis Tolerada Máxima (MTD) del extracto según la invención, en referencia a la cantidad máxima del extracto, que se puede administrar en forma de dosis única a animales sanos, es de 20 mg/kg de extracto. Este valor indica que el extracto según la invención tiene un amplio intervalo terapéutico.

Los términos "toxicidad" o "efectos tóxicos" se refieren al (a los) efecto(s) perjudicial(es) que un compuesto puede tener en células, tejidos u órganos sanos. Otra propiedad importante de un extracto según la invención incluye su bajo nivel de toxicidad. Se demostró que el extracto mencionado no induce cambios hematológicos in vivo, no induce pérdida de peso o muestra efectos secundarios menores en diferentes tipos de órganos y tejidos. De hecho, el nivel de toxicidad del extracto según la invención es sorprendentemente bajo. El extracto según la invención combina las características esenciales de una buena actividad antitumoral, de bajo nivel de toxicidad y una inducción mínima de efectos secundarios perjudiciales.

Además, los extractos de la planta Calotropis procera según la invención muestran también una "actividad antivenenosa". Tal como se mencionó anteriormente, el término "actividad antivenenosa", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de los extractos según la invención para atenuar o revertir los efectos secundarios perjudiciales de compuestos. Sorprendentemente, los inventores han demostrado que la combinación de un extracto según la invención con otros compuestos terapéuticos, que tienen efectos secundarios perjudiciales, permite que los efectos secundarios indeseables del compuesto terapéutico sean reducidos. Por ejemplo, el ejemplo 8 ilustra que la combinación de un extracto según la invención con compuestos contra el cáncer bien conocidos, tales como vincristina o adriamicina, camptotecina u oxaliplatino, hace posible la reducción de algunos efectos producidos por la toxicidad a células normales inducidos por estos compuestos contra el cáncer.

La actividad antivenenosa es evidente cuando al menos uno de los extractos según la invención se administra antes del compuesto terapéutico, es decir, se administran secuencialmente. Es un aspecto de la invención administrar un extracto previo a cualquier momento antes de que el compuesto terapéutico se administre. Un aspecto adicional de la invención es administrar un extracto no más de 336, 312, 288, 264, 240, 216, 192, 168, 144, 120, 96, 72, 48, 24, 20, 16, 12, 8, 4, 2, 1, ó 0,5 horas antes de que se administre el compuesto terapéutico.

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La actividad antivenenosa también es evidente cuando al menos uno de los extractos según la invención se administra al mismo tiempo que el compuesto terapéutico, es decir, como una composición, mediante administración simultánea o separada.

La actividad antivenenosa también es evidente cuando al menos uno de los extractos según la invención se administra tras el compuesto terapéutico es decir, se administra secuencialmente. Es un aspecto de la invención administrar un extracto en cualquier momento una vez que el compuesto terapéutico se haya administrado. Es un aspecto más de la invención administrar el extracto a menos de 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264, 288, 312 ó 366 horas una vez que el compuesto terapéutico se haya administrado.

En administración secuencial, los extractos pueden administrarse una vez, o cualquier número de veces y en varias dosis antes y/o tras la administración del compuesto terapéutico. La administración secuencial se puede combinar con administración simultánea o secuencial.

Composición del extracto

Los extractos según la invención comprenden uno o varios compuestos activos, es decir, compuestos presentes en un extracto según la invención, que muestran una actividad similar a al menos una de las actividades definidas anteriormente en un extracto según la invención. Las actividades principales de al menos uno de los extractos son actividad antitumoral y una actividad antivenenosa. Tal como entenderá el experto en la técnica, un compuesto activo presente en los extractos puede ejercer sólo una de estas propiedades, o incluso ambas de estas propiedades.

En otra realización, al menos uno de los extractos según la invención comprende al menos dos de los compuestos activos seleccionados del grupo que comprende asclepina, calactina, voruscharina, calotropina, calotropagenina, uzarigenina, calotoxina, uscharina y uscharidina, 2''oxovoruscharina.

Tal como se entenderá, los extractos según la invención pueden contener además uno o más compuestos activos, que no pertenecen al grupo de los cardenólidos, y otros compuestos. En otra realización, los extractos contienen al menos uno de los compuestos representados en la tabla 1.

TABLA 1 Algunos de los compuestos contenidos en al menos uno de los extractos según la invención

1

En otra realización, la presente invención se refiere a un compuesto activo aislado de los extractos según la invención.

En otra realización de la invención, un compuesto activo del extracto es 2''oxo-voruscharina. En un aspecto de la invención es la actividad contra el cáncer y/o antivenenosa de dicho compuesto (compuesto A) y los derivados (compuestos B a H) del mismo como se muestra en la tabla 2.

TABLA 2 Estructura química de 2''oxo-voruscharina (compuesto A) y derivados de la misma (compuestos B a H)

2

Métodos de extracción

Según otra realización, un extracto según la invención puede obtenerse mediante una extracción alcohólica, en particular mediante una extracción con metanol.

En otra realización, la presente invención se refiere a un método para obtener un extracto según la invención, que comprende las etapas de:

a) extraer el material de partida de la planta Calotropis procera, seleccionándose dicho material de partida de entre frutos, partes aéreas, partes subterráneas y sus mezclas, en un alcohol alifático, disolviendo dicho material de partida en dicho alcohol obteniendo de esta manera una de dicho material en dicho alcohol, agitar dicha suspensión y filtrar la suspensión mediante vidrio fritado obteniendo así un primer filtrado y una primera parte sólida;

c) combinar el primero y segundo filtrados obteniendo de esta manera un filtrado combinado y

d) evaporar el filtrado combinado a vacío obteniendo de esta manera un residuo aceitoso.

En una realización preferida, el material de partida de la planta Calotropis procera se selecciona de partes subterráneas, en particular de las raíces.

En otra realización, el alcohol alifático usado para extraer el material de partida según la invención es metanol. Todavía en otra realización, el residuo obtenido en el procedimiento de extracción se recoge en un solvente, en particular en un solvente farmacéuticamente aceptable.

En otra realización, la presente invención se refiere a extractos para obtener un material según la invención, que comprende las etapas de:

a) moler el material de partida de hojas, tallos, cortezas y raíces de Calotropis procera para dar un polvo fino de la planta;

b) extraer el polvo de la planta a) con diclorometano durante al menos 6, 12, 18 o preferiblemente 24 horas usando un extractor Soxhlet;

c) decantar el diclorometano de la etapa b), y evaporar el filtrado, tras la filtración, para dar una goma;

d) extraer el residuo de la etapa c) con metanol durante al menos 6, 12, 18 o preferiblemente 24 horas usando un extractor Soxhlet;

e) decantar el metanol de la etapa d), evaporar el filtrado, tras la filtración, para formar una goma;

f) someter la goma de la etapa e) a cromatografía en columna usando gel de sílice ultrarrápido y diclorometano-metanol como solvente;

g) recoger una primera fracción;

h) aplicar la fracción concentrada de la etapa g) a cromatografía en columna usando gel de sílice ultrarrápido y hexano:acetona como solvente para dar dos fracciones;

i) lavar la columna tras la etapa h) con metanol para dar una tercera fracción.

Los extractos según la presente invención incluyen los obtenidos de la etapa c), etapa g) y etapa i).

Un aspecto de la invención es que las extracciones se llevan a cabo de una manera compatible con conservar la integridad de los compuestos biológicamente activos contenidos en el extracto. Estas precauciones se conocen por el experto en la técnica.

Aplicabilidad de los extractos

Gracias a las interesantes propiedades de al menos uno de los extractos descritos en el presente documento, en particular su actividad antitumoral, su actividad antivenenosa, su bajo nivel de toxicidad y/o su alta actividad a bajas dosis, el(los) extracto(s) según la invención o los compuestos activos de los mismos son particularmente adecuados para usarse como un medicamento para el tratamiento de enfermedades, y en particular para tratar cáncer.

En otra realización, la invención se refiere al uso de un extracto según la invención, o un compuesto activo del mismo, como un medicamento.

En todavía otra realización, la invención se refiere también al uso de al menos un extracto según la invención, o un compuesto activo del mismo, en la preparación de un medicamento para el tratamiento contra el cáncer. En particular, dicho extracto según la invención, o un compuesto activo del mismo, se usa para la preparación de un medicamento en el tratamiento de un cáncer. Ejemplos de cánceres que pueden tratarse según la invención incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, linfoma, sarcoma, cáncer pancreático, melanoma, cáncer colorrectal, glioma, cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer de piel, cáncer de hueso, cáncer ovárico, cáncer del SNC, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata, cáncer de hígado y cáncer hematológico.

Tal como se mencionó anteriormente, los extractos según la invención comprenden también una actividad antivenenosa. Los inventores han demostrado que una combinación de un extracto según la invención o compuestos activos del mismo con un segundo compuesto que tiene efectos secundarios perjudiciales, hace posible una reducción de la actividad tóxica de este segundo compuesto, sin reducir su actividad terapéutica. Por lo tanto, los extractos de Calotropis procera según la invención también se pueden combinar en un medicamento con otros compuestos, en particular con otros compuestos contra el cáncer.

Composiciones farmacéuticas que comprenden el extracto

En otra realización, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento contra el cáncer, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un extracto de Calotropis procera según la invención o un compuesto activo del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otra realización, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento contra el cáncer que comprende:

- una cantidad terapéuticamente eficaz de un extracto de Calotropis procera según la invención o un compuesto activo del mismo,

- una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto terapéutico y

- un vehículo farmacéuticamente aceptable.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" tal como se usa en el presente documento, significa la cantidad de al menos un extracto o compuesto activo o agente farmacéutico que provoca la respuesta biológica medicinal en un tejido, sistema, animal o humano que se busca por un investigador, veterinario, doctor médico u otro clínico, que incluye el alivio de los síntomas de la enfermedad que se está tratando.

La composición farmacéutica se puede preparar de una manera conocida por un experto en la técnica. Para este fin, un extracto según la invención y/o cualquier compuesto activo del mismo, uno o más vehículos farmacéuticos sólidos o líquidos y, si se desea, en combinación con otros compuestos farmacéuticamente activos, se llevan a una forma de administración o forma de dosis adecuada que después se puede usar como un producto farmacéutico en medicina humana o medicina veterinaria.

Las formas particulares de la composición farmacéutica pueden ser, por ejemplo, disoluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, comprimidos, cápsulas, pulverizadores nasales, liposomas o micro-depósitos, especialmente composiciones en forma ingerible por vía oral o inyectable estéril, por ejemplo, suspensiones o supositorios acuosos u oleaginosos inyectables y estériles. La forma preferida de composición contemplada es la forma sólida seca, que incluye cápsulas, gránulos, comprimidos, píldoras, bolos y polvos. El vehículo sólido puede comprender uno o más vehículos, por ejemplo, lactosa, cargas, agentes disgregantes, aglutinantes, por ejemplo, celulosa, carboximetilcelulosa o almidón o agentes anti-adherencia, es decir, estearato de magnesio, para evitar que los comprimidos se adhieran al equipo de preparación de comprimidos. Los comprimidos, píldoras y bolos pueden formarse con el fin de que se disgreguen rápidamente o para proporcionar una lenta liberación del principio activo.

Además, gracias a su actividad antivenenosa, los extractos según la invención o compuestos activos de los mismos, también son particularmente adecuados para combinarse con otros compuestos terapéuticos con los que ejercen una actividad farmacológica que tienen efectos secundarios tóxicos, tales como otros medicamentos, que muestran efectos secundarios tóxicos.

El "compuesto terapéutico, que ejerce una actividad farmacológica que tiene efectos secundarios tóxicos" puede incluir cualquier compuesto que se usa para el tratamiento de alguna enfermedad pero que induce efectos tóxicos no deseados. Preferiblemente, estos compuestos son compuestos que se usan en el tratamiento contra el cáncer. Por ejemplo, un extracto según la invención o compuestos activos del mismo se puede combinar con uno o más de otros compuestos que tengan un efecto antitumoral. Ya que dos o más compuestos que tienen un efecto antitumoral se combinan, se puede obtener una actividad antitumoral mejorada. Además, estas combinaciones también hacen posible reducir los efectos secundarios tóxicos, que se inducen por uno o varios de los compuestos antitumorales.

Una combinación de un extracto según la invención o compuestos activos del mismo con otro compuesto terapéutico puede incluir un uso separado del extracto o compuesto activo del mismo y el otro compuesto terapéutico. En particular, la combinación puede incluir el uso de un extracto según la invención o compuestos activos del mismo antes (pretratamiento), al mismo tiempo o después (postratamiento) del uso de otro compuesto terapéutico.

Alternativamente, una combinación de un extracto o compuestos activos del mismo con otro compuesto terapéutico también puede incluir una mezcla de ambos elementos. Por lo tanto, en una realización preferida, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un primer componente, siendo dicho primer componente un extracto descrito anteriormente o al menos un compuesto activo del mismo, y un segundo componente, comprendiendo dicho segundo componente un compuesto terapéutico, que ejerce una actividad farmacológica que tiene efectos secundarios tóxicos.

Producto

Un aspecto de la invención es un producto que contiene un extracto de Calotropis procera y un compuesto terapéutico para su administración simultánea, separada o secuencial a un sujeto. Un aspecto de la invención es que el producto puede usarse según la invención.

Por administración simultánea se quiere decir que los dos componentes se administran a un sujeto al mismo tiempo. Por ejemplo, como una mezcla de los dos componentes. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, una disolución administrada por vía intravenosa, un comprimido, líquido, crema tópica, etc., en el que cada preparación comprende ambos componentes.

Por administración separada se quiere decir que los dos componentes se administran a un sujeto al mismo tiempo o sustancialmente al mismo tiempo, pero los componentes están presentes en el producto como preparaciones separadas y no mezcladas. Por ejemplo, los dos componentes pueden estar presentes en el producto como comprimidos individuales. Los comprimidos pueden administrarse al sujeto al tragar ambos comprimidos al mismo tiempo, o un comprimido directamente tras el otro.

Por administración secuencial se quiere decir que los dos componentes se administran a un sujeto secuencialmente y los componentes están presentes en el producto como preparaciones separadas no mezcladas. Existe un intervalo de tiempo entre dosis. Por ejemplo, un componente podría administrarse hasta 336, 312, 288, 264, 240, 216, 192, 168, 144, 120, 96, 72, 48, 24, 20, 16, 12, 8, 4, 2, 1 ó 0,5 horas tras el otro componente.

En la administración secuencial, el extracto puede administrarse una vez, o cualquier número de veces y en varias dosis antes y/o tras la administración del compuesto terapéutico. La administración secuencial puede combinarse con administración simultánea o secuencial.

Kit

Otro aspecto de la presente invención es un kit que comprende un recipiente en el que está presente un extracto de Calotropis procera, y un recipiente en que está presente un compuesto terapéutico. Un extracto según la invención y un compuesto terapéutico según la invención se describieron anteriormente.

Al mencionar un kit que comprende un recipiente en el que está presente un extracto de Calotropis procera, y un recipiente en el que está presente un compuesto terapéutico, se debe entender que el kit puede contener una sola dosis, o una pluralidad de dosis, reflejadas en dos recipientes individuales, dos recipientes individuales que pueden contener cada uno, una pluralidad de dosis o una pluralidad de recipientes individuales que pueden contener cada uno, una sola dosis. Se debe entender que el kit puede comprender más de un kit terapéutico, cada compuesto terapéutico en un recipiente separado, o una mezcla de compuestos terapéuticos en un solo recipiente.

Los recipientes pueden ser cualquiera conocido en la técnica de la medicina. Pueden ser viales, paquetes de blister, jeringas, botellas resellables, botellas con medios de suministro, aspiradores, botellas de goteo, parches, aplicadores, supositorios.

Los recipientes separados hacen posible extraer el compuesto terapéutico que se administrará simultáneamente, por separado o secuencialmente.

Usos

Gracias a las propiedades antitumorales favorables de al menos uno de los extractos según la presente invención, dichos extractos son particularmente útiles en el tratamiento de individuos que padecen cáncer. Gracias a su bajo nivel de toxicidad y a sus efectos secundarios mínimos, el uso de uno de los extractos en una composición farmacéutica para el tratamiento contra el cáncer incluirá efectos secundarios mínimos. Como consecuencia, el extracto según la invención se puede usar durante un periodo de tiempo más largo en el tratamiento contra el cáncer.

En particular, en una realización preferida, la invención se refiere al uso de una composición según la reivindicación 1 para preparar un medicamento para tratar cáncer, en el que el cáncer se selecciona del grupo que comprende, pero sin limitarse a, cáncer de mama, linfoma, sarcoma, cáncer pancreático, melanoma, cáncer colorrectal, glioma, cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer de piel, cáncer de hueso, cáncer ovárico, cáncer del SNC, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata, cáncer hepático y cáncer hematológico.

Para estos fines, la composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía oral, por vía parenteral, es decir, incluyendo inyecciones subcutánea, intravenosa, intramuscular, inyección intraesternal o técnicas de infusión, por pulverización de inhalación o por vía rectal, en formulaciones unitarias de dosis que contengan vehículos, adyuvantes y excipientes farmacéuticamente aceptables y no tóxicos convencionales.

Según la presente invención, dicha composición farmacéutica puede administrarse por separado en diferentes momentos durante el curso del tratamiento o concurrentemente en formas de combinación individuales o divididas. Por tanto, la presente invención debe entenderse que abarca todos estos regímenes de tratamiento simultáneo o alternante y el término "administración" se debe interpretar en consecuencia.

Esencialmente, los modos primarios de tratamiento contra el cáncer de tumor sólido comprenden cirugía, radioterapia y quimioterapia, por separado y en combinación. Los extractos según la invención son adecuados para su uso en combinación con estas técnicas médicas. Los extractos según la invención pueden ser útiles para aumentar la sensibilidad de células tumorales a la radiación en radioterapia y también para potenciar o aumentar el daño a tumores por agentes quimioterápicos. Los extractos según la invención también pueden ser útiles para sensibilizar células tumorales resistentes a fármacos múltiples. Los extractos según la invención son compuestos terapéuticos útiles para su administración junto con otros compuestos terapéuticos que dañen el ADN, para potenciar su efecto.

Se entenderá que la composición farmacéutica según la invención puede administrarse a los seres humanos en niveles de dosis específicos y a la frecuencia de dosificación específica que puede variarse para cualquier paciente particular y que dependerá de una variedad de factores incluyendo la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, modo y tiempo de administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos, la gravedad del estado particular del paciente que se someta al tratamiento.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la presente invención. Estos ejemplos no se deben considerar como limitantes del alcance de la invención. Un primer ejemplo ilustra la extracción de extractos según la invención de la planta Calotropis procera. Los ejemplos 2 a 4 se refieren a la caracterización antitumoral in vitro de un extracto según la invención. Los ejemplos 5 a 7 describen la caracterización antitumoral in vivo de un extracto según la invención. El ejemplo 8 ilustra los efectos antivenenosos de los extractos según la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Procedimiento de extracción de extractos según la invención de la planta Calotropis procera

Un extracto (extracto A) según la invención se aisló de las raíces de planta Calotropis procera (familia Asclepiadiaceae) mediante metanol. Este extracto se denomina además el extracto A (para adaptar). Alrededor de 10 gramos de planta se pusieron en un matraz Erlenmeyer con 150 ml de metanol. La suspensión se agitó magnéticamente durante 12 horas y luego se agitó sobre una frita de vidrio. El sólido restante se extrajo una segunda vez con metanol durante dos horas. Ambos filtrados se combinaron y se evaporaron a vacío mediante el uso de un evaporador giratorio. El residuo constituía el extracto metanólico y se denomina más adelante en el presente documento extracto A.

El análisis del extracto A reveló la presencia de varios tipos de compuestos. Un grupo particular de compuestos identificado en dicho extracto A comprende cardenólidos tales como asclepina, calactina, vorusharina, calotropina, calotropagenina, uzarigenina, usharina y usharidina. Además, algunos otros compuestos, presentes en el extracto A comprenden, pero no se limitan a, 3-O-ACETILCALOTROPINA, ALFA-AMIRINA, BENZOATO DE ALFA-AMIRINA, ALFA-CALOTROPEOL, ALFA-LACTUCEROL, ACETATO DE ALFA-LACTUCERILO, ISOVALERATO DE ALFA-LACTUCERILO, ARABINOSA, BENZOILISOLINOLONA, BENZOILLINEOLONA, BETA-AMIRINA, BENZOATO DE BETA-AMIRINA, BETA-CALOTROPEOL, BETA-SITOSTEROL, CAUTCHOUC, COROGLAUCOGENINA; COROTOXIGENINA; D-GLUCOSAMINA, FRUGOSIDA, GIGANTEOL, GIGANTINA, GLUCOSA, HISTAMINA, ISOGIGANTEOL, ISOLACTUCEROL, ISOLINEOLONA, LAURANO LINEOLONA, ACIDO LINOLEICO, ACIDO LINOLENICO, ALCOHOL MELISILICO, MUDARINA, ACIDO OLEICO, ACIDO PALMITICO, PROCEROSIDA, PSEUDOCALOTROPAGENINA, RAMNOSA ESTIGMAESTEROL, SIRIOGENINA TARAXASTEROL, BENZOATO DE TARAXASTEROL y TRIPSINA.

Otros extractos según la invención, se aislaron mediante un método que comprende las etapas de:

b) extraer el polvo de la etapa a) con diclorometano durante 24 horas usando un extractor Soxhlet,

c) decantar el diclorometano de la etapa b) y evaporar el filtrado (tras la filtración) para formar una goma,

d) extraer el residuo de la etapa c) con metanol durante 24 horas usando un extractor Soxhlet,

e) decantar el metanol de la etapa c), evaporar el filtrado (tras la filtración) para formar una goma,

g) recoger una primera fracción,

h) aplicar la fracción concentrada de la etapa g) a cromatografía en columna usando gel de sílice ultrarrápido y hexano-acetona como solvente para dar dos fracciones,

El extracto aislado en la etapa c) se denomina más adelante en el presente documento extracto B. El extracto aislado en la etapa g) se denomina más adelante en el presente documento extracto C. El extracto aislado en la etapa i) se denomina más adelante en el presente documento extracto D.

Ejemplo 2 Efecto de un extracto según la invención en el crecimiento de células global de una línea celular

Este ejemplo ilustra las actividades antitumorales del extracto A según la invención en diferentes tipos de cáncer.

Para caracterizar las actividades in vitro del extracto A, se llevaron a cabo pruebas MTT. La prueba MTT, que es una prueba bien conocida en la técnica, es una técnica indirecta que rápidamente mide, es decir, en el plazo de 5 días, el efecto de un producto dado en el crecimiento global de una línea celular. Esta prueba mide el número de células vivas metabólicamente activas que pueden transformar el producto MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio), que tiene un color amarillento, en el producto azul formazán mediante la reducción mitocondrial llevada a cabo solamente por células vivas. La cantidad de formazán obtenido al final del experimento se mide con un espectrofotómetro y es directamente proporcional al número de células vivas.

Cuarenta y ocho líneas celulares de cáncer humano, descritas en la tabla 2, se probaron en presencia del extracto A. Estas líneas celulares cubrieron diez tipos histológicos, siendo de cáncer pancreático, sarcoma, cáncer de mama, melanoma, cáncer de colon, glioma, cáncer pulmonar, cáncer de vejiga, cáncer de próstata y cáncer de cabeza y cuello. Se dejó que las células crecieran en micropocillos de placas 96 pocillos de fondo plano con 100 \mul de suspensión celular por pocillo y entre 3.000 y 5.000 células/pocillo dependiendo del tipo de célula. Cada línea celular se sembró en su propio medio de cultivo de células, tal como se indica en la tabla 2.

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TABLA 2 Línea celular de cáncer humano y medio de cultivo de células correspondiente usado para los experimentos MTT

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Tras un periodo de incubación de 24 horas a 37ºC el medio de cultivo se reemplazó con 100 \mul de medio reciente en el que se disolvió el extracto A a las diferentes concentraciones de 0,01 \mug/ml, 0,05 \mug/ml, 0,1 \mug/ml, 0,5 \mug/ml, 1 \mug/ml, 5 \mug/ml, 10 \mug/ml, 50 \mug/ml y 100 \mug/ml. Cada condición experimental se llevó a cabo en sextuplicado.

Tras 72 horas de incubación a 37ºC con el fármaco, es decir, condiciones experimentales o sin el fármaco, es decir control, el medio se reemplazó por 100 \mul de MTT a la concentración de 1 mg/ml disuelto en RPMI. Los micropocillos se incubaron después durante tres horas a 37ºC y se centrifugaron a 400 g durante 10 minutos. Se eliminó el MTT y los cristales de formación formados se disolvieron en 100 \mul de DMSO. Los micropocillos se agitaron durante 5 minutos y se leyeron sobre un espectrofotómetro a 2 longitudes de onda a 570 nm que corresponde a la longitud de onda de absorbancia de formazán máxima, y a 630 nm, que es la longitud de onda del ruido de fondo.

Para cada condición experimental, se calculó la DO promedio asociada con el error estándar de la media (SEM) para cada condición, es decir, 6 pocillos. El porcentaje de células vivas restantes se calculó en comparación con el control. Los resultados de estos experimentos se representan 1 a 11.

La figura 1 representa los resultados globales para diez tipos histológicos. Tal como se indica, el extracto A ejerció un efecto antitumoral de todos los tipos histológicos probados. Las líneas celulares tumorales humanas derivadas de la vejiga presentaron una sensibilidad del extracto A que fue más débil que los nueve tipos histológicos restantes. Se determinó la concentración a la que el extracto vegetal mató el 50% de la población celular, el llamado valor de CI_{50}. El valor de CI_{50} comprendía entre 0,5 \mug/ml y 1 \mug/ml para las líneas celulares emitidas de las líneas celulares de mama y páncreas. Un efecto antitumoral más importante con un valor de CI_{50} de 0,5-0,1 \mug/ml se obtuvo para líneas celulares de cáncer de sarcoma, melanoma, pulmón, cabeza y cuello y colorrectal. Las células de cáncer de próstata PC3 mostraron una sensibilidad marcada, con un valor de CI_{50} en el intervalo de 0,01 a 0,05 \mug/ml.

Tal como se ilustra en la figura 1, el valor de CI_{50} promedio de las 5 líneas celulares de cáncer de mama varía entre 0,5 y 1 \mug/ml. El crecimiento global de las cinco líneas celulares de cáncer de mama individuales T-47D, MDA-MB-231, ZR-75-1, MCF-7 y Hs578T, se ilustra adicionalmente en la figura 2. Las líneas celulares T-47D, MDA-MB-231, ZR-75-1 y Hs578T mostraron sensibilidades similares al extracto A, mientras que las células MCF-7 tuvieron su crecimiento global reducido más rápidamente que los restantes cuatro modelos de cáncer de mama.

Tal como se ilustra en la figura 1, el valor de CI_{50} promedio de las 7 líneas celulares de cáncer de sarcoma (véase la tabla 2) osciló entre 0,5 y 0,1 \mug/ml. El crecimiento global de las líneas celulares individuales se ilustra adicionalmente en la figura 3. El extracto A indujo el efecto antitumoral más importante en la línea celular A204. De hecho, el valor de CI_{50} pareció ser de entre 0,1 y 0,05 \mug/ml. La línea celular Hs729 se consideró la menos sensible de las 7 líneas celulares de sarcoma. No obstante mostró valores de CI_{50} para el extracto A que oscilaban entre 1 y 5 \mug/ml.

Tal como se ilustra en la figura 1, el valor de CI_{50} promedio de las siete líneas celulares de cáncer pancreático (véase la tabla 2) osciló entre 0,5 y 0,1 \mug/ml. Crecimientos globales similares fueron observados para 6 de las 7 líneas celulares de cáncer pancreático (figura 4). De estas 7 líneas celulares, Panc-1 pareció ser la más sensible al extracto A y Hs766T la menor. Los valores de CI_{50} de estas 2 líneas variaron entre 0,1 y 0,5 \mug/ml, y entre 1 y 5 \mug/ml, respectivamente.

Tal como se ilustra en la figura 1, el valor de CI_{50} promedio de las 5 líneas celulares de cáncer de melanoma (véase la tabla 2) osciló entre 0,5 y 0,1 \mug/ml. El extracto según la invención redujo el crecimiento global de todas las líneas celulares de melanoma en más del 60% a concentraciones iguales a o más altas que 5 \mug/ml (figura 5). Malme-3M y G-361 fueron las más sensibles de las 5 líneas celulares de melanoma. Mostraron un crecimiento global similar, oscilando el valor de CI_{50} entre 0,1 y 0,5 \mug/ml.

Tal como se ilustra en la figura 1, el valor de CI_{50} promedio de las 7 líneas celulares de cáncer de colon (véase la tabla 2) osciló entre 0,5 y 0,1 \mug/ml. De las diferentes líneas celulares de cáncer colorrectal probadas (figura 6), la línea LoVo tuvo un valor de CI_{50} de alrededor de 0,1 \mug/ml y se consideró que era la línea colorrectal más sensible. La línea celular tumoral SW948 se consideró que era la menos sensible, oscilando el valor de CI_{50} entre 0,5 y 1 \mug/ml.

Tal como se ilustra en la figura 1, el valor de CI_{50} de las 7 líneas celulares de cáncer de glioma humano (véase la tabla 2) osciló entre 0,5 y 0,1 \mug/ml. Hs683 fue la línea celular más sensible al extracto (figura 7). Su valor de CI_{50} fue de casi 0,05 \mug/ml. En contraposición, el crecimiento de las células A172 no resultó afectado por el extracto A a concentraciones de desde 0,01 hasta 10 \mug/ml. El valor de CI_{50} osciló entre 10 y 50 \mug/ml.

Tal como se ilustra en la figura 1, el valor de CI_{50} promedio de las 2 líneas de cáncer pulmonar de células no pequeñas humano (NSCLC) osciló entre 0,1 y 0,5 \mug/ml. La figura 8 muestra que ambas líneas fueron sensibles al extracto A.

Tal como se ilustra en la figura 1, el valor de CI_{50} promedio de las 2 líneas celulares de cáncer de vejiga humano (véase la tabla 2) osciló entre 50 y 100 \mug/ml. Las 2 líneas mostraron diferencias marcadas en lo que se refiere a la sensibilidad al extracto A (figura 9). De hecho, a 5 \mug/ml de extracto A se redujo el crecimiento global de la línea celular T24 en más del 80% mientras que el crecimiento global de la línea celular J82 sólo disminuyó en un 32% a 100 \mug/ml. La línea celular J82 pareció muy débilmente sensible al extracto A.

El crecimiento global de una línea celular de cáncer de próstata (la línea celular PC3) se evaluó mediante el ensayo MTT cuando las células se estaban tratando con el extracto A. El extracto A indujo una inhibición de crecimiento global de aproximadamente el 90% a entre 100 \mug/ml y 0,5 \mug/ml. El valor de CI_{50} fue de alrededor de 0,1 \mug/ml (figura 10).

Tal como se ilustra en la figura 1, el valor de CI_{50} promedio de las 5 líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello osciló entre 0,1 y 0,5 \mug/ml. Se observaron crecimientos completos similares para cuatro de las cinco líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello (figura 11). De estas 5 líneas celulares, SCC9 pareció ser menos sensible. No obstante mostró valores de CI_{50} para el extracto A de alrededor de 5 \mug/ml.

En resumen, los extractos A según la invención ejercen un efecto antitumoral espectacular en cuarenta y seis de las cuarenta y ocho líneas celulares de cáncer humano sometidas a ensayo en los experimentos descritos anteriormente. Estos efectos antitumorales corresponden a disminuciones marcadas en el crecimiento global de estos modelos de cáncer humano que representan un grupo muy amplio de tipos histológicos.

Ejemplo 3 Efecto de un extracto según la invención en la cinética de células

Este ejemplo ilustra el efecto cistostático del extracto A según la invención. Según los experimentos llevados a cabo por medio del ensayo colorimétrico MTT descrito en el ejemplo 2, está claro que el extracto A disminuye espectacularmente el crecimiento global de la mayoría de las cuarenta y ocho líneas celulares de cáncer humano sometidas al ensayo MTT. En los siguientes ejemplos se investigó si ese extracto inducía la disminución en el crecimiento global y corresponde ya sea a las modificaciones que se producen a los niveles de la cinética del ciclo celular (ejemplo 3), o a la inducción de la apoptosis (véase ejemplo 4), o a ambas.

El ciclo celular está dividido en general en varias fases que comprenden una fase G0/G1, S y G2/M. Las modificaciones que tienen lugar en torno a las proteínas que controlan la proliferación celular y/o muerte celular pueden constituir un objetivo de los compuestos activos, presentes en el extracto A. Las modificaciones a la cinética del ciclo celular pueden investigarse por medio de citometría de flujo usando diferentes fluoróforos, por ejemplo yoduro de propidio, acridina naranja y bromuro de etidio, etc. La citometría de flujo hace posible que cada célula cancerosa (que corre a varios miles) se localice en el ciclo celular.

Los cambios en el patrón de histograma de ADN se utilizan por tanto para caracterizar el mecanismo de acción de varios compuestos terapéuticos. Los datos que resultan del análisis de citometría de flujo se procesan gráfica o matemáticamente para derivar así en cálculos significativos de los compartimientos G1, S y G2/M. La mayor parte del procesamiento matemático se basa en ciertos modelos y suposiciones.

Las líneas celulares se sembraron en matraces (25 cm^{2} de área) que contenían 7 ml de medio de cultivo. Tras 48 horas de incubación a 37ºC, el medio de cultivo de las células se reemplazó por medio reciente en el que el extracto A se había disuelto a concentraciones que matan el 50%, (CI_{50}), el 30% (=CI_{30}) y el 10% (CI_{10}) de la población celular. Tras 24 horas o 72 horas de tratamiento, las células se recogieron en suspensión, se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4ºC y se permeabilizaron con etanol al 70% (a 4ºC) durante la noche a -20ºC. Las células se lavaron entonces con PBS y se incubaron con disolución de yoduro de propidio (80 \mug/ml) durante 30 minutos a 37ºC y posteriormente se mantuvieron a 4ºC durante la noche. Se añadió ribonucleasa A (3% v/v) para inducir la ruptura del ADN de doble cadena. El retrato del ciclo celular se estableció para cada muestra. Un programa de software específico incorporado en el citómetro de flujo se usó para definir en forma precisa el porcentaje de células en las diferentes fases del ciclo celular. Cada fase del ciclo celular se notificó en lo que se refiere a la superficie pico y se calculó como un porcentaje. La superficie del ciclo celular completo fue del 100%. Cada experimento se llevó a cabo tres veces. Se calculó el porcentaje promedio de cada fase diferente y el error estándar de la media relacionada. Cada fase del ciclo celular de una condición dada se comparó con la misma fase del ciclo celular de células control, es decir, células no tratadas.

El extracto A es altamente eficaz contra líneas celulares tumorales humanas. Las concentraciones usadas en los experimentos de citrometría de flujo se seleccionaron según los resultados de MTT (ejemplo 2). Se probaron las cinco líneas celulares de cáncer humano Hs683 (glioma), J82 (vejiga), A172 (glioma), RPMI (cabeza y cuello) y HCT-15 (colon) y se determinaron las dosis que mataron al 10, 30 y 50 por ciento de las células (tabla 3) para investigar así si el extracto A promovía una acumulación en una de las fases del ciclo celular cuando los cultivos se trataron durante 24 ó 72 horas con concentraciones cada vez más altas de extracto A.

TABLA 3 Dosis del extracto A según la invención que matan al 10, 30 y 50% de las células en cinco líneas celulares

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Los análisis del ciclo de células HCT-15 (figura 12) mostraron que la distribución de la población celular fue similar al control tras 24 horas del tratamiento independientemente de las concentraciones sometidas a prueba. Por otro lado, una población S importante apareció en las células tratadas con 0,25 \mug/ml de extracto durante 72 horas. La fracción S representó el 21% de las células en control y alcanzó el 59% tras el tratamiento con el extracto A a 0,25 \mug/ml. El incremento en la fracción S estuvo acompañado por una pérdida de las células en la fase G0/G1. La población G0/G1 sufrió una marcada disminución del 71% al 29%.

Los análisis del ciclo celular RPMI (figura 13) mostraron que la distribución de la población celular tratada con el extracto A a 0,05 \mug/ml fue similar al control tras 24 horas de tratamiento. Se observó un débil aumento en la fase S a 0,1 y 0,25 \mug/ml. Por el contrario, se produjo un gran aumento en la población S cuando la línea celular RPMI se incubó durante 72 horas con el extracto A a las tres concentraciones probadas. Hubo aproximadamente un 71%, 69% y 62% de células en la fase S cuando el extracto A se sometió a ensayo a 0,05 \mug/ml, 0,1 \mug/ml y 0,25 \mug/ml, respectivamente. De manera concomitante, el porcentaje de células en la fase G0/G1 disminuyó marcadamente y la fase G2/M aumentó ligeramente, alcanzando el 29% de la población celular.

La línea celular A172 se trató con el extracto A a 10 y 25 \mug/ml, lo que corresponde a la CI_{10} y a la CI_{50}. Los resultados (figura 14) mostraron que cualesquiera que sean las concentraciones probadas, el extracto A induce un aumento en la fase G0/G1 tras 24 horas de tratamiento. El treinta y nueve por ciento de las células estuvieron en la fase G0/G1 en el control mientras que las células tratadas con el extracto A alcanzaron el 60%. En forma concomitante con acumulación en la fase G0/G1, se observó una ligera acumulación en la fase G2/M a la concentración más alta probada. El efecto observado tras 24 horas de tratamiento desapareció tras 72 horas. De hecho, no se observó cambio significativo alguno en las diferentes fases del ciclo celular.

La línea celular J82 es apenas sensible al extracto (véase el ensayo MTT). Las concentraciones seleccionadas para la citrometría de flujo correspondieron a aproximadamente CI_{10} e CI_{30} (figura 15). Tras 24 horas de tratamiento se obtuvo una ligera acumulación en la fase G0/G1 cualquiera que fuera la concentración probada. Por otro lado, el 30 y el 47%, respectivamente, de la población celular estuvo en la fase S, cuando las células se trataron durante 72 horas con el extracto A a 50 y 100 \mug/ml mientras que la condición de control alcanzaba solamente el 18%. A 100 \mug/ml, también se pudo observar una acumulación en la fase G2/M.

Tras 24 horas de tratamiento con el extracto A a 0,05 \mug/ml, las células Hs683 se habían acumulado en la fase G0/G1 y habían logrado el 70% en comparación con el control (58%) (figura 16). Se observó concomitantemente una disminución en el porcentaje de células en la fase S. De la misma manera, a ambas concentraciones, la mayoría de las células estuvieron en la fase G0/G1 tras 72 horas de tratamiento. De hecho, más del 60% de las células estuvieron en esta fase, mientras que las células en esta fase en el control representaron el 46% de la población
celular.

En conclusión, el extracto A induce principalmente una acumulación en la fase G0/G1 y bajo estas circunstancias esto indica que el extracto A tiene un efecto citostático.

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Ejemplo 4 Efecto pro-apoptótico de un extracto según la invención

Este ejemplo ilustra el efecto pro-apoptótico del extracto A según la invención.

La muerte celular puede producirse de dos formas diferentes, ya sea accidentalmente o programada genéticamente. La muerte celular accidental, también denominada necrosis, se produce esencialmente como resultado de, por ejemplo, una agresión física o biológica. La apoptosis se refiere a la forma de muerte celular que es muerte celular genéticamente programada y que se produce bajo condiciones fisiológicas normales. Tras la inducción de la apoptosis, se induce una cascada de acontecimientos en la célula, que comprende la activación de receptores de muerte celular, la activación de una serie de proteasas citosólicas, la formación de cuerpos apoptóticos y la fragmentación del ADN.

El efecto del extracto A en la ruta de la apoptosis se investigó en las cuatro líneas celulares de cáncer humano: Hs683 (glioma), J82 (vejiga), A172 (glioma) y HCT-15 (colon).

Las células se sembraron en matraces (25 cm^{2} de área) que contenían 7 ml de medio de cultivo. Tras una incubación de 48 horas a 37ºC, el medio de cultivo de células se reemplazó por medio reciente en el que el extracto A según la invención estaba disuelto a diferentes concentraciones que mataron al 50% y al 30% de la población celular. Tras 24 ó 72 horas de tratamiento las células se recogieron en suspensión y se contaron. Se centrifugaron 250.000 células durante 10 minutos a 1.700 rpm a 4ºC. El sedimento se lavó con PBS a 4ºC y se incubó con anexina V-FITC y disolución de yoduro de propidio durante 15 minutos a 4ºC en la oscuridad. Para cada muestra, se recogieron los datos de aproximadamente 10.000 células en una escala logarítmica. El software incorporado en el citómetro de flujo se usó para definir en forma precisa el porcentaje de células en la ruta apoptótica y/o necrótica, y las células normales. Cada experimento se llevó a cabo dos veces. Se calculó la media de porcentaje de la ruta apoptótica y la necrótica y el error estándar de la media relacionada. Cada condición se comparó con el control, siendo las células no
tratadas.

Se observó un incremento de cuatro veces de células HCT-15 apoptóticas cuando las células se trataron por el extracto A a 0,25 \mug/ml durante 24 horas en comparación con las células control (figura 17). La línea celular A172 pareció acoplarse en una ruta de apoptosis y necrosis cuando las células se trataron durante 24 horas por el extracto A a 25 \mug/ml (figura 18). Esta tendencia se mantuvo tras 72 horas de tratamiento. El tratamiento con el extracto A indujo la apoptosis de las células J82 de una manera dependiente de concentración, lo cual es particularmente claro 72 horas tras el tratamiento (figura 19). También se observó un aumento en el porcentaje de células necróticas a ambas concentraciones tras 72 horas. Se obtuvo un incremento de 2,5 veces en el porcentaje de células apoptóticas Hs683 tras 24 horas de tratamiento con el extracto A a 0,025 \mug/ml (figura 20). Tras 72 horas de tratamiento, el porcentaje de células apoptóticas aumentó de una manera dependiente de la concentración.

En conclusión, el extracto A induce principalmente un incremento en el porcentaje de células apoptóticas. Se obtuvo un efecto de la ruta de necrosis bajo ciertas condiciones.

Ejemplo 5 Dosis tolerada máxima de un extracto según la invención

En el presente ejemplo, se determinó el índice MTD para el extracto A según la invención. La Dosis Tolerada Máxima (MTD) de un fármaco dado se define como la cantidad máxima de un fármaco que puede administrarse en forma precisa, es decir, en una sola dosis intraperitoneal, intravenosa, subcutánea o vía oral, a animales sanos, es decir, animales no injertados con tumores.

Las condiciones experimentales para determinar el índice MTD del extracto A fueron las siguientes. Se registraron los tiempos de supervivencia de ratones, que no están injertados con un tumor, hasta 14 días tras la inyección. Se usaron seis dosis diferentes del extracto A para la determinación del índice MTD. La dosis más alta administrada a ratones portadores de tumores fue de 160 mg/kg. Otras dosis comprendían 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg y 80 mg/kg. Cada grupo experimental estaba compuesto de dos ratones para la determinación del índice MTD. La siguiente tabla 4 muestra los datos obtenidos para el índice MTD usando el extracto A.

TABLA 4 Determinación del índice MTD para el extracto A según la invención

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Según la definición dada anteriormente, el índice MTD para el extracto A es de 20 mg/kg para una sola administración en ratones. De esta manera, el Índice de Dosis Tolerada Máxima (MTD) del extracto A, en referencia a la cantidad máxima del extracto A, que se puede administrar en una dosis única a animales sanos, es de 20 mg/kg de extracto. Este valor indica que el extracto A tiene una amplio intervalo terapéutico.

Ejemplo 6 Efectos in vivo de un extracto según la invención evaluado en tres modelos de cáncer

Este ejemplo ilustra los efectos in vivo del extracto A según la invención en tres modelos de cáncer diferentes.

Los efectos in vivo del extracto A se estudiaron en ratones infectados con diferentes tipos de tumores, incluyendo un cáncer de linfoma, un cáncer de melanoma y un cáncer de mama. Los efectos in vivo se evaluaron con tres tipos de parámetros:

- la toxicidad cumulativa, que se evalúa registrando los pesos de los ratones portadores de tumores durante el tratamiento

- el efecto antitumoral real ejercido a nivel del crecimiento tumoral, que se evalúa midiendo el tamaño del tumor tres veces a la semana por medio de un calibre. El crecimiento de tumor real se expresa como un área (mm^{2}) al multiplicar los dos diámetros perpendiculares más grandes

- el aumento de la supervivencia para los ratones tratados, que se calcula por medio del índice T/C. Este índice es la razón entre el tiempo de supervivencia medio del grupo de ratones tratados (T) y el del grupo control (C). Se considera que el extracto es activo si el valor T/C es superior al 130% (P < 0,05), muy activo para un valor superior al 150% (P < 0,01) y tóxico para un valor inferior al 70%.

Efectos in vivo del extracto A en un modelo de cáncer de linfoma

El extracto A se evaluó en el modelo de cáncer de linfoma P388 agresivo. En un primer experimento, se compararon tres dosis de 10 mg/kg, 5 mg/kg y 2,5 mg/kg con el control. Los ratones se inocularon por vía subcutánea con 10^{6} de P388 en el día D0 y se trataron nueve veces durante las tres semanas siguientes en los días D5, D7, D9, D12, D14, D16, D19, D21 y D23 tras el injerto. Cada grupo experimental contenía nueve ratones.

Las figuras 21A ilustran que el extracto A no tuvo influencia en el peso corporal de los ratones. La figura 21B muestra que el extracto A indujo significativamente una disminución en el crecimiento de linfoma P388. Los valores del índice T/C para el programa de administración de 7 x 10 mg/kg dieron un índice T/C del 111%, los valores de índice T/C para el programa de 6 x 5 mg/kg dieron un índice T/C del 100% y los valores del índice T/C para el programa de 8 x 2,5 mg/kg dieron un índice T/C de 121%. En conclusión, estos resultados indicaron que la administración del extracto A redujo el crecimiento del cáncer de linfoma P388 pero no prolongó significativamente la supervivencia de los ratones de linfoma P388 a las concentraciones probadas.

En un segundo conjunto de experimentos, el número de administraciones se aumentó de nueve a dieciséis, acompañado por una disminución concomitante en la dosis por administración única. Las dosis administradas por vía subcutánea fueron de 2,5 mg/kg, 1,25 mg/kg y 0,63 mg/kg. El extracto A se administró diariamente, cinco días a la semana, durante cinco semanas consecutivas (5 x 5 = 25).

La figura 22B muestra que estas dosis de extracto A activo de 0,63 mg/kg y 1,25 mg/kg tuvieron efectos tóxicos insignificantes toda vez que los ratones portadores de linfoma P388 no perdieron peso durante el tratamiento. La figura 22A muestra que el extracto A disminuyó marcadamente el crecimiento de linfoma P388 a dosis de 0,63 mg/kg y 1,25 mg/kg. Además, los valores de índice T/C para el programa de administración de 15 x 2,5 mg/kg dieron un índice T/C del 137%, los valores del índice T/C para el programa de 15 x 1,25 mg/kg dieron un índice T/C del 137% y los valores de índice T/C para el programa de 13 x 0,63 mg/kg dieron un índice T/C de 116%. Por tanto, las 15 administraciones de 2,5 mg/kg de extracto A y las 15 administraciones de 1,25 mg/kg de extracto A aumentaron significativamente la supervivencia de estos ratones portadores de linfoma P388 en un 37%. En consecuencia, los tratamientos a dosis de 2,5 mg/kg y 1,25 mg/kg con el extracto A prolongaron la supervivencia de ratones portadores de linfoma P388.

En conclusión, el extracto A según la invención ejerce efectos antitumorales significativos en el modelo de cáncer de linfoma P388 agresivo sin alguna pérdida del peso corporal en los animales involucrados. Asimismo, inesperadamente, el extracto A según la invención ejerce actividad antitumoral más alta cuando se somete a ensayo crónicamente a bajas dosis, es decir, alrededor de 1,25 a 0,63 mg/kg, que a altas dosis, es decir, alrededor de 10 mg/kg a 5 mg/kg.

Efectos in vivo del extracto A en un modelo de cáncer de melanoma

El extracto A se evaluó en el modelo de cáncer de melanoma B16 agresivo. El extracto A fue se administró por vía subcutánea a ratones a dosis de 2,5 mg/kg, 1,25 mg/kg y 0,63 mg/kg. El extracto A se administró diariamente, cinco días a la semana, durante cinco semanas consecutivas.

La figura 23A muestra que las dosis administradas tuvieron efectos tóxicos insignificantes toda vez que los ratones portadores de melanoma B16 no perdieron peso corporal durante el tratamiento. La figura 23B muestra que las administraciones del extracto A suministradas a 2,5 ó 1,25 mg/kg redujeron significativamente el crecimiento de melanoma B16. Además, los valores del índice T/C para el programa de administración de 20 x 2,5 mg/kg dieron un índice T/C del 117%, los valores de índice T/C para el programa de administración de 10 x 1,25 mg/kg dieron un índice T/C del 117% y los valores de índice T/C para el programa de 25 X 0,63 mg/kg dieron un índice T/C del 140%. De esta manera, el extracto A disminuyó el crecimiento del melanoma B16 y prolongó significativamente la supervivencia de los ratones portadores del melanoma B16, específicamente cuando el extracto A se administró 25 veces a 0,63 mg/kg cuando se alcanza el nivel de significación.

En un segundo conjunto de experimentos, el extracto A se administró por vía oral (per os).

La figura 24A muestra que las dosis administradas tuvieron efectos tóxicos insignificantes toda vez que los ratones portadores de melanoma B16 no perdieron peso corporal durante el tratamiento. La figura 24B muestra que las administraciones del extracto A vía oral a 2,5 ó 1,25 mg/kg disminuyeron significativamente el crecimiento del melanoma B16 hasta 25 días tras el injerto. Además, los valores del índice T/C para el programa de administración de 19 x 2,5 mg/kg dieron un índice T/C del 114%, los valores de índice T/C para el programa de 15 x 1,25 mg/kg dieron un índice T/C del 100% y los valores de índice T/C para el programa de 16 x 0,63 mg/kg dieron un índice T/C del 104%. De esta manera, el extracto A indujo una reducción en el crecimiento del tumor de melanoma B16 y prolongó ligeramente la supervivencia de los ratones de melanoma B16 a 2,5 mg/kg.

En conclusión, los dos conjuntos de experimentos proporcionan evidencia de que el extracto A según la invención ejerce efectos antitumorales significativos en el modelo de melanoma B16 independientemente del modo de administración.

Efectos in vivo del extracto A en un modelo de cáncer de mama

El extracto A se evaluó en el modelo de cáncer de mama MXT-HI, es decir, una variante de cáncer de mama insensible a hormonas. El modelo MXT-HI corresponde a un carcinoma no diferenciado con procesos metastásicos espectaculares hacia el hígado. Corresponde por lo tanto a las etapas clínicas tardías de cáncer de mama humano. El MXT-HI representa un modelo de tumor biológico muy agresivo.

El cáncer de mama MXT-HI se induce en ratones al inyectar subcutáneamente fragmentos de tumor MXT en los costados de ratones B6D2F1. Sin tratamiento, los ratones inoculados mueren entre la cuarta y la séptima semana tras la inoculación. El extracto A se sometió a ensayo a 10 mg/kg, 5 mg/kg y 2,5 mg/kg con nueve administraciones, es decir, tres veces a la semana durante tres semanas consecutivas.

La figura 25A indica que los diferentes programas de tratamiento con el extracto A usados en los presentes experimentos no indujeron esencialmente ningún efecto secundario tóxico principal toda vez que los ratones portadores de tumor MXT-HI no perdieron peso significativo. La figura 25B muestra que las nueve administraciones de 2,5 mg/kg redujeron significativamente el crecimiento de tumor MXT-HI. Los valores de índice T/C para el programa de administración de 9 x 10 mg/kg dieron un índice T/C del 103%, los valores de índice T/C para el programa de 9 x 5 mg/kg dieron un índice T/C del 103% y los valores de índice T/C para el programa 9 x 2,5 mg/kg dieron un índice T/C del 119%. De esta manera, a la dosis de 2,5 mg/kg, el extracto A prolongó la supervivencia de los ratones portadores de MXT-HI.

En la figura 26 se muestra el número de ratones portadores de cáncer de mama MXT-HI que murieron durante el experimento en los grupos control (no tratados) y de prueba (tratados con el extracto). Se usó un análisis estadístico de Kaplan-Meier y representa la velocidad de muerte de los nueve ratones en cada grupo. El valor estadístico destaca el ajuste general de prueba en comparación con el ajuste general del grupo de control con respecto a supervivencia.

En conclusión, los experimentos descritos anteriormente proporcionan evidencia de que el extracto A ejerce efectos antitumorales significativos en el tumor de cáncer de mama MXT-HI.

Conclusiones sobre el ejemplo 6

El extracto A según la invención tiene un efecto antitumoral significativo en los modelos de cáncer probados. Estos modelos representan un amplio panel de tipos de tumor histológico, incluyendo carcinomas, linfomas y melanomas. Estos modelos son clínicamente relevantes porque imitan etapas clínicas específicas de cánceres humanos. Aparte de esto, también son biológicamente agresivos e invasivos porque dos de ellos experimentan metástasis espectacularmente hasta el hígado.

Aunque tiene un efecto antitumoral muy significativo, el extracto A según la invención muestra efectos tóxicos insignificantes ya que los ratones que llevan tumor no perdieron peso corporal durante los tratamientos. El extracto semipurificado puede por lo tanto incluir un "antídoto" además del compuesto antitumoral responsable de todas las actividades antitumorales notificadas en el presente documento.

Sorprendentemente, el extracto A induce actividades antitumorales significativamente más altas cuando se somete a ensayo crónicamente a dosis bajas, es decir, alrededor de 1,25 a 0,63 mg/kg, que a dosis altas, es decir, alrededor de 10 mg/kg a 5 mg/kg.

Ejemplo 7 Efectos toxicológicos in vivo de un extracto según la invención

Este ejemplo ilustra los efectos toxicológicos del extracto A según la invención, en particular la hematotoxicidad in vivo y la toxicidad general.

Hematotoxicidad

Se evalúa la hematotoxicidad al establecer perfiles hematológicos para cada especie animal. Se prestó particular atención a los números de plaquetas, glóbulos rojos y leucocitos de la sangre. Se evaluó el efecto del extracto A a dos dosis, es decir, 5 mg/kg y 1,25 mg/kg, mediante la administración intraperitoneal a ratones. El programa de administración fue de cinco administraciones a la semana durante cinco semanas consecutivas dando como resultado un número de inyecciones total de veinticinco. Se sacrificaron los animales tres días tras la última inyección. Hubo diez ratones por grupo.

En comparación con el control (figura 27), no se observaron cambios estadísticamente significativos con respecto a los parámetros hematológicos detrás el tratamiento con el extracto A. No se observaron cambios significativos en el volumen celular medio de glóbulos rojos, la hemoglobina corpuscular media, la concentración de hemoglobina corpuscular media ni las plaquetas tras los tratamientos.

Toxicidad general

Se sometió a prueba la toxicidad general del extracto A histológicamente en ratones por medio de análisis histopatológicos convencionales de cortes histológicos teñidos con hematoxicilina-eosina obtenidos de diferentes tipos de órganos y tejidos. Se evaluó el efecto del extracto A a de 5 mg/kg y a 1,25 mg/kg mediante administración intraperitoneal. El programa de administración fue de cinco administraciones a la semana durante cinco semanas consecutivas dando como resultado un número total de inyecciones de veinticinco. Se sacrificaron los animales tres días tras la última inyección. Se recogieron el cerebro, el corazón, el hígado, el páncreas, el estómago, los intestinos y los ovarios. Hubo diez ratones por grupo.

El examen de los órganos recolectados mostró que el grupo de control (no tratado) no mostró ninguna modificación particular en los órganos. Igualmente, en los ratones tratados el cerebro, el corazón, el hígado, el páncreas, el estómago, los intestinos y los ovarios no se vieron afectados por los tratamientos con el extracto A a dosis de 5 mg/kg o 1,25 mg/kg, indicando que el extracto A no tiene un efecto tóxico general.

Ejemplo 8 Efectos antivenenosos de los extractos según la invención

Este ejemplo ilustra el efecto antivenenoso de los extractos según la invención. Se inyectó a ratones hembra de 4 a 5 semanas de edad de dos a cuatro veces la dosis máxima tolerable de dos fármacos antitumorales bien conocidos y clínicamente usados: (MTDx4) para adriamicina y (MTDx2) para vincristina. A los ratones se les administró una única inyección intraperitoneal con 40 mg/kg de peso corporal de adriamicina o una única inyección intraperitoneal de 20 mg/kg de peso corporal de vincristina en el día 0. El lote 1 en la figura 28 muestra la curva de supervivencia de los ratones a los que se inyectó o bien MTDx2 de vincristina o bien MTDx4 de adriamicina.

Se inyectó el extracto A según la invención por vía intraperitoneal a una dosis de 10 mg/kg de peso corporal antes de la inyección de los fármacos antitumorales. Se aplicaron los siguientes programas diferentes.

- Se inyectó el extracto A el mismo día (es decir, el día 0), pero 4 horas antes de la inyección de compuesto terapéutico adriamicina o vincristina. Los resultados de este tratamiento se representan por el lote 2 en la figura
28.

- Se inyectó el extracto A una vez al día durante ocho días antes del día de inyectar el compuesto terapéutico adriamicina o vincristina. Los resultados de este tratamiento se representan por el lote 3, en la figura 28.

- Se inyectó el extracto A una vez al día durante ocho días antes del día de inyectar el compuesto terapéutico adriamicina o vincristina y después una vez al día durante siete días tras inyectar los fármacos antitumorales. Los resultados de este tratamiento se representan por el lote 4 en la figura 28.

Tal como puede observarse en la figura 28, todos los programas en los que el extracto A se usa en combinación con un compuesto terapéutico prolongan significativamente la supervivencia de los ratones en comparación con la inyección de los compuestos terapéuticos como únicos agentes.

Un segundo ejemplo ilustra el efecto antivenenoso del extracto A con otro programa de administración. Se administró a los ratones una única inyección intraperitoneal con 20 mg/kg de peso corporal de vincristina en el día 0. El lote 1 en la figura 29 muestra la curva de supervivencia de los ratones a los que se inyectó vincristina.

Se inyectó el extracto A por vía intraperitoneal a una dosis de 10 mg/kg de peso corporal antes de, o al mismo tiempo que, la inyección del fármaco antitumoral. Se aplicaron los siguientes programas diferentes.

- Se inyectó el extracto A el mismo día (es decir en el día 0), pero 6 horas antes de la inyección del compuesto terapéutico vincristina. Los resultados de este tratamiento se representan por el lote 2, en la figura 29.

- Se inyectó el extracto A en el mismo día (es decir en el día 0), pero 4 horas antes de la inyección del compuesto terapéutico vincristina. Los resultados de este tratamiento se representan por el lote 3 en la figura 29.

- Se inyectó el extracto A en el mismo día (es decir en el día 0), pero 2 horas antes de la inyección del compuesto terapéutico vincristina. Los resultados de este tratamiento se representan por el lote 4 en la figura 29.

- Se inyectó el extracto A en el mismo día (es decir en el día 0), y en el mismo tiempo que la inyección del compuesto terapéutico vincristina. Los resultados de este tratamiento se representan por el lote 5 en la figura 29.

El parámetro, que se aplicó para determinar el efecto protector, es decir, antivenenoso, del extracto A, sobre los efectos tóxicos inducidos por los fármacos antitumorales consistió en la "prolongación de la supervivencia". El análisis estadístico se llevó a cabo por medio de la estadística de Kaplan-Meier. El nivel de significación fue de p<0,05.

Tal como puede observarse en la figura 29, el programa en el que se inyectó el extracto A 4 horas antes de la inyección de vincristina (lote 3) prolonga significativamente la supervivencia de ratones en comparación con la inyección del compuesto terapéutico como único agente.

Por tanto, puede concluirse que el extracto A permite proteger significativamente ratones de los efectos tóxicos de una dosis mortal de un compuesto antitumoral frecuentemente usado tal como adriamicina o vincristina. El extracto A según la invención tiene por tanto un efecto antivenenoso, mediante el cual permite reducir los efectos tóxicos de un compuesto antitumoral bien conocido.

Un tercer ejemplo ilustra el efecto antivenenoso del extracto B. Se inyectó a ratones hembra de 4 a 5 semanas de edad cuatro compuestos antitumorales bien conocidos y clínicamente usados: adriamicina, vincristina, oxaliplatino y camptotecina. Se administró a los ratones una única inyección intraperitoneal de 20 mg/kg de peso corporal de adriamicina o una única inyección intraperitoneal de 20 mg/kg de peso corporal de vincristina o una única inyección intraperitoneal de 40 mg/kg de peso corporal de oxaliplatino o una única inyección intraperitoneal de 20 mg/kg de peso corporal de camptotecina en el día 0.

El lote 1 en la figura 30, figura 31, figura 32 y figura 33 muestra la curva de supervivencia de los ratones a los que se inyectó o bien adriamicina o bien vincristina o bien oxaliplatino o bien camptotecina.

El lote 2 en las figuras 30 a 33 muestra el "punto de supervivencia" de los ratones a los que se inyectó el extracto B a 10 mg/kg.

El lote 3 en las figuras 30 a 33 muestra la curva de supervivencia de los ratones a los que se inyectó por vía intraperitoneal el extracto B a 10 mg/kg de peso corporal en el mismo día (es decir, en el día 0) pero 4 horas antes de la inyección del compuesto terapéutico.

Tal como puede observarse en las figuras 30 a 33, el extracto B usado en combinación con el compuesto terapéutico prolonga significativamente la supervivencia de los ratones en comparación con la inyección del compuesto terapéutico como único agente. El extracto B no mostró propiedades citotóxicas. De hecho, ningún ratón murió cuando se le inyectó el extracto B como único agente. El análisis estadístico se llevó a cabo por medio de la estadística de Kaplan-Meier. El nivel de significación fue de p<0,05 para cada combinación del extracto B y compuesto terapéutico.

Por tanto, puede concluirse que el extracto B proporciona protección significativa a ratones de los efectos tóxicos de una dosis mortal de fármacos antitumorales frecuentemente usados. El extracto B tiene por tanto un efecto antivenenoso, que permite la reducción de los efectos tóxicos de fármacos antitumorales bien conocidos. La actividad antivenenosa se conservó tanto en el extracto B como en el extracto A.

Un cuarto ejemplo ilustra el efecto antivenenoso del extracto C. Se usó el extracto C en combinación con adriamicina a 20 mg/kg de peso corporal.

El lote 1 en la figura 34 muestra la curva de supervivencia de los ratones a los que se inyectaron 20 mg/kg de peso corporal de adriamicina.

El lote 2 en la figura 34 muestra la curva de supervivencia de los ratones a los que se inyectó el extracto C a 10 mg/kg el mismo día (es decir, el día 0) pero 4 horas antes de la inyección del compuesto terapéutico.

Tal como puede observarse en la figura 34, la inyección del extracto C indujo una prolongación de supervivencia de los ratones significativa en comparación con la inyección del compuesto terapéutico como un único agente. Por tanto, puede concluirse que el extracto C muestra propiedades antivenenosas al igual que el extracto B anterior.

Un quinto ejemplo ilustra el efecto venenoso del extracto D. Se inyectó adriamicina a ratones hembra de 4 a 5 semanas de edad. Se administró a los ratones a una única inyección intraperitoneal de 20 mg/kg de peso corporal de adriamicina en el día 0 (lote 1 en la figura 35). El lote 2 en la figura 35 muestra la curva de supervivencia de los ratones a los que se inyectó el extracto D por vía intraperitoneal a una dosis de 5 mg/kg de peso corporal el mismo día (es decir, el día 0) pero 4 horas antes de la inyección del compuesto terapéutico adriamicina.

Tal como puede observarse en la figura 35, la inyección del extracto D indujo una prolongación de supervivencia de los ratones significativa en comparación con la inyección del compuesto terapéutico como el único agente. Por tanto, puede concluirse que el extracto D muestra propiedades antivenenosas al igual que el extracto C anterior.

En conclusión, estos experimentos ilustran que los extractos purificados según la invención prolongan significativamente la supervivencia de ratones en comparación con los ratones inyectados con el compuesto terapéutico como el único agente. El extracto D, el extracto más purificado, mostró propiedades antivenenosas sobre los efectos tóxicos inducidos por los fármacos antitumorales.

Claims

1. Uso de una composición que comprende un extracto de Calotropis procera, y al menos un compuesto terapéutico seleccionado del grupo que comprende un agente anticancerígeno, un anticuerpo citotóxico o un fragmento del mismo, una hormona citotóxica o un fragmento de la misma y un péptido citotóxico o un fragmento del mismo; para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

2. Uso de una composición según la reivindicación 1, en el que dicho extracto se obtiene usando un procedimiento de extracción, que comprende las etapas de:

a) extraer el material de partida de la planta Calotropis procera, seleccionándose dicho material de partida de entre frutos, partes aéreas, partes subterráneas y sus mezclas, en un alcohol alifático, disolviendo dicho material de partida en dicho alcohol obteniendo de esta manera una suspensión de dicho material en dicho alcohol, agitar dicha suspensión y filtrar dicha suspensión mediante vidrio fritado obteniendo de esta manera un primer filtrado y una primera parte sólida;

c) combinar dicho primer y segundo filtrados obteniendo de esta manera un filtrado combinado, y evaporar el filtrado combinado a vacío obteniendo de esta manera dicho extracto.

3. Uso de una composición según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho extracto comprende al menos dos compuestos activos seleccionados del grupo que comprende asclepina, calactina, vorusharina, calotropina, calotropagenina, uzarigenina, calotoxina, usharina, usharidina y 2''oxo-vorusharina.

4. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la razón de peso de extracto:compuesto terapéutico está en el intervalo de 0,001 : 1 a 1000 : 1.

5. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho cáncer se selecciona del grupo que comprende cáncer de mama, linfoma, sarcoma, cáncer pancreático, melanoma, cáncer colorrectal, glioma, cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer de piel, cáncer de hueso, cáncer ovárico, cáncer del SNC, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata, cáncer de hígado y cánceres hematológicos.

6. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s) es(son) un agente contra el cáncer.

7. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho compuesto terapéutico se selecciona del grupo que comprende adriamicina, alqueran, ara-c, bleomicina, carmustina, busulfan, lomustina, camptotecina, carboplatino, cisplatino, ciclofosfamida, citoxan, daunorrubicina, dacarbacina, fluorouracilo, fludarabina, gemcitabina (gemzar), herceptina, hexametilmelamina, hidrea, idarrubicina, ifosfamida, irinotecano (camptosar, CPT-11), leustatina, metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, muforan, navelbina, mostaza nitrogenada, oxaliplatino, rituxan, imatinib, estreptozocina, taxol, taxotere, topotecano (hicamtina), velban, vincristina, etopóxido, xeloda (capecitabina) o zevelina.

8. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s) es(son) un anticuerpo citotóxico o un fragmento del mismo.

9. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s) es(son) una hormona citotóxica o un fragmento de la misma.

10. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s) es(son) un péptido citotóxico o un fragmento del mismo.

11. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho extracto se administra antes, después o al mismo tiempo que dicho(s) compuesto(s) terapéutico(s).

12. Un procedimiento de extracción para obtener un extracto que tiene componentes biológicamente activos que comprende las etapas de:

a) extraer el material de partida de la planta Calotropis procera, seleccionándose dicho material de partida de entre frutos, partes aéreas, partes subterráneas y sus mezclas, en un alcohol alifático, disolviendo dicho material de partida en dicho alcohol obteniendo de esta manera una suspensión de dicho material en dicho alcohol, agitar dicha suspensión; y filtrar dicha suspensión mediante vidrio fritado obteniendo de esta manera un primer filtrado y una primera parte sólida;

c) combinar dicho primer y segundo filtrados obteniendo de esta manera un filtrado combinado, y

13. Extracto activo aislado a partir del procedimiento según la reivindicación 12.

14. Un kit que comprende un recipiente en el que está presente un extracto de Calotropis procera según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y un recipiente en el que está presente un compuesto terapéutico según la

\hbox{reivindicación 1.}