CN117752660A - 蝙蝠葛碱在制备预防或治疗非小细胞肺癌的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蝙蝠葛碱在制备预防或治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。本发明创造性地发现蝙蝠葛碱具有优异的防治非小细胞肺癌的作用，为制备新的预防或治疗非小细胞肺癌的药物提供了一个嵌入点，同时开发了蝙蝠葛碱的新药物用途，为蝙蝠葛碱的开发与利用提供了新的策略。本发明还创造性地将蝙蝠葛碱联合奥希替尼或其可药用盐作为预防或治疗非小细胞肺癌的药物，不仅可以增加非小细胞肺癌对奥希替尼的敏感性，降低奥希替尼的用药剂量，提高用药安全性，还具有比单一使用奥希替尼或蝙蝠葛碱更显著地抑制非小细胞肺癌的效果，达到协同促进的效果。本发明为非小细胞肺癌的改善或治疗提供了有效的药物联用策略。

Description

蝙蝠葛碱在制备预防或治疗非小细胞肺癌的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及蝙蝠葛碱的药用新用途，具体涉及蝙蝠葛碱在制备预防或治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。

背景技术

肺癌是常见的癌症之一，约占全球癌症总死亡人数的19％。在肺癌总发病率中，非小细胞肺癌占比最高，约占85％。目前化学疗法结合外科手术和放射疗法已被用于肺癌症治疗，但其副作用大，如肾毒性和神经毒性对患者的存活不利。因此，迫切需要开发有较小毒副作用的治疗策略。

天然产物是抗肿瘤药物的重要来源。防己科植物蝙蝠葛(Menispermum dauricumDC.)，亦名北豆根，是我国传统中药，始载于《中国药植志》，主产于东北、华北、陕西等地。北豆根性味苦寒，有小毒，归肺、胃、大肠经，具有清热解毒、祛风止痛之功效。现在临床主要用于咽喉肿痛、肠炎痢疾、风湿麻痹等症，在医药研究方面有着巨大的潜力。蝙蝠葛碱(Dauricine，分子式为C38H44N2O6)是北豆根的藤茎中经过提取分离而得的多种生物碱之一，在化学结构上被归类为尾-尾单氧桥连接的双苄基四氢异喹啉类生物碱。蝙蝠葛碱具有较高的脂溶性，易透过血脑屏障。蝙蝠葛碱常用于抗炎和抗心律失常的治疗，尚无蝙蝠葛碱用于治疗非小细胞肺癌中的报道。

AZD-9291(奥希替尼)是高效选择性EGFR突变体抑制剂，是一种针对非小细胞晚期肺癌药物、治疗晚期非小细胞肺癌患者的口服药物。虽然AZD9291(奥希替尼)在非小细胞肺癌中取得了显著的疗效，然而，AZD9291(奥希替尼)靶向治疗长期使用后，几乎所有患者都会产生耐药性。因此，改善或解决奥希替尼的耐药性问题也是本领域亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供蝙蝠葛碱的药用新用途，具体涉及蝙蝠葛碱在制备预防或治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供蝙蝠葛碱在制备预防或治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。

本发明创造性地发现蝙蝠葛碱具有优异的防治非小细胞肺癌的作用，其能通过升高非小细胞肺癌细胞内ROS水平和下调GPX4和SLC7A11水平等来抑制非小细胞肺癌细胞的增殖，同时，在非小细胞肺癌小鼠模型中显示出良好的防治作用，可显著降低小鼠肿瘤的体积。本发明为研究非小细胞肺癌的治疗策略提供了理论依据，为制备新的预防或治疗非小细胞肺癌的药物提供了一个嵌入点。同时，本发明开发了蝙蝠葛碱的新药物用途，为蝙蝠葛碱的开发与利用提供了新的策略。

在本发明中，所述非小细胞肺癌包括耐药型非小细胞肺癌或非耐药型非小细胞肺癌。

本发明研究发现蝙蝠葛碱不仅能防治普通非小细胞肺癌，对耐药型非小细胞肺癌例如耐奥希替尼型非小细胞肺癌也有很好的防治效果。

优选地，所述耐药型非小细胞肺癌包括耐奥希替尼型非小细胞肺癌。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

优选地，所述药学上可接受的辅料包括载体、稀释剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述药物的剂型为药剂学上可接受的任意一种剂型。

优选地，所述剂型选自混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、栓剂、灌肠剂、气雾剂、喷雾剂、贴剂或滴剂中的任意一种。

上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

优选地，所述药物中还含有奥希替尼或其可药用盐。

第二方面，本发明提供一种预防或治疗非小细胞肺癌的联合用药物组合物，所述联合用药物组合物包括蝙蝠葛碱，以及奥希替尼或其可药用盐。

本发明所涉及的联合用药物组合物创造性地将蝙蝠葛碱联合奥希替尼或其可药用盐作为预防或治疗非小细胞肺癌的药物，不仅可以降低奥希替尼的用药剂量，提高用药安全性，还具有比单一使用奥希替尼或蝙蝠葛碱更显著地抑制非小细胞肺癌的效果，达到协同促进的效果。本发明首先通过非小细胞肺癌细胞株，证明其能够显著抑制非小细胞肺癌细胞增殖；然后发现其能够升高非小细胞肺癌细胞内ROS水平和下调GPX4和SLC7A11水平。本发明为非小细胞肺癌的改善或治疗提供了有效的药物联用策略，具有十分显著的意义。

在本发明中，所述联合用药物组合物为单一的复方制剂或两种单独的制剂的组合。

优选地，所述联合用药物组合物为两种单独的制剂的组合，两种单独的制剂同时施用或依次施用。

所述联合用药物组合物可以为单一的复方制剂形式，也可以为两种单独的制剂的组合；当为两种单独的制剂的组合时，其用药方式可以为同时施用，也可以为交叉施用或依次施用。

优选地，所述制剂的剂型为药剂学上可接受的任意一种剂型。

优选地，本发明所述联合用药物组合物可单独给药也可以与辅料搭配做成适当的剂型进行给药，所述联合用药物组合物还包括药学上可接受的辅料。

优选地，所述药学上可接受的辅料包括载体、稀释剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。

在发明中，所述非小细胞肺癌包括耐药型非小细胞肺癌或非耐药型非小细胞肺癌。

本发明研究发现该联合用药物组合物不仅能防治普通非小细胞肺癌，对耐药型非小细胞肺癌例如耐奥希替尼型非小细胞肺癌也有很好的防治效果。

优选地，所述耐药型非小细胞肺癌包括耐奥希替尼型非小细胞肺癌。

第三方面，本发明提供蝙蝠葛碱或第二方面所述的联合用药物组合物在制备非小细胞肺癌细胞的增殖抑制剂中的应用。

根据本发明的研究结果，所述联合用药物组合物具有显著地抑制非小细胞肺癌细胞增殖的作用，因此，该结果表明所述联合用药物组合物可以作为一种体外实验用试剂用于科研领域，例如研究非小细胞肺癌细胞生长和代谢机制或行为，筛选治疗非小细胞肺癌的药物等。本发明所要求保护的增殖抑制剂并不是用于消除病因或病灶，即是一种以非治疗为目的地在制备滤泡非小细胞肺癌细胞的增殖抑制剂中的应用。

在发明中，所述非小细胞肺癌包括耐药型非小细胞肺癌或非耐药型非小细胞肺癌。

优选地，所述耐药型非小细胞肺癌包括耐奥希替尼型非小细胞肺癌。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明创造性地发现蝙蝠葛碱具有优异的防治非小细胞肺癌的作用，其能通过升高非小细胞肺癌细胞内ROS水平和下调GPX4和SLC7A11水平等来抑制非小细胞肺癌细胞的增殖，同时，在非小细胞肺癌小鼠模型中显示出良好的防治作用，可显著降低小鼠肿瘤的体积。本发明为研究非小细胞肺癌的治疗策略提供了理论依据，为制备新的预防或治疗非小细胞肺癌的药物提供了一个嵌入点。同时，本发明开发了蝙蝠葛碱的新药物用途，为蝙蝠葛碱的开发与利用提供了新的策略。

同时，还创造性地将蝙蝠葛碱联合奥希替尼或其可药用盐作为预防或治疗非小细胞肺癌的药物，不仅可以增加非小细胞肺癌对奥希替尼的敏感性，降低奥希替尼的用药剂量，提高用药安全性，还具有比单一使用奥希替尼或蝙蝠葛碱更显著地抑制非小细胞肺癌的效果，达到协同促进的效果。本发明为非小细胞肺癌的改善或治疗提供了有效的药物联用策略，具有十分显著的意义。

附图说明

图1是奥希替尼对非耐药型肺癌细胞系PC9与耐药型肺癌细胞系PC9-OR的增殖抑制结果图；

图2A是奥希替尼单药组、蝙蝠葛碱与奥希替尼联用组的细胞增殖水平结果图；

图2B是蝙蝠葛碱单药组的细胞增殖水平结果图；

图3是空白对照组、联合用药物组合物组、联合用药物组合物+抑制剂组、抑制剂组的细胞增殖水平结果图；

图4是空白对照组、蝙蝠葛碱单药组、奥希替尼单药组、蝙蝠葛碱与奥希替尼联用组的ROS水平结果图；

图5是空白对照组、蝙蝠葛碱单药组、奥希替尼单药组、蝙蝠葛碱与奥希替尼联用组的western blot结果图；

图6是对照组、蝙蝠葛碱单药组、奥希替尼单药组、蝙蝠葛碱与奥希替尼联用组小鼠的体重变化情况图；

图7是对照组、蝙蝠葛碱单药组、奥希替尼单药组、蝙蝠葛碱与奥希替尼联用组小鼠的肿瘤体积变化情况图；

图8是对照组、蝙蝠葛碱单药组、奥希替尼单药组、蝙蝠葛碱与奥希替尼联用组小鼠的肿瘤解剖外观图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

本实施例构建一种奥希替尼耐药非小细胞肺癌细胞系，操作如下：

(1)运用CCK8检测奥希替尼对肺癌细胞系PC9的IC50值，为1nM；

(2)在培养基(10％胎牛血清的RPMI 1640)中使用10％ IC50浓度的奥希替尼进行低浓度诱导，待细胞汇合至80％；

(3)使用20％ IC50浓度的奥希替尼继续诱导，根据细胞的状态与汇合度更换奥希替尼浓度，依次增加浓度进行持续诱导，以细胞系奥希替尼IC50增加两个数量级为耐药标准(PC9-OR)。

奥希替尼(OSI)对非耐药型肺癌细胞系PC9与耐药型肺癌细胞系PC9-OR的增殖抑制结果(CCK8法)以及IC50值结果如图1所示，奥希替尼对非耐药型肺癌细胞系PC9的IC50值为1nM，奥希替尼对耐药型肺癌细胞系PC9-OR的IC50值为3573nM。

实施例2

本实施例采用CCK8法验证单独蝙蝠葛碱、单独奥希替尼、联合用药物组合物对非耐药型肺癌细胞系PC9与耐药型肺癌细胞系PC9-OR的增殖的抑制作用，操作如下：

(1)以每孔3000个非耐药型肺癌细胞系PC9与耐药型肺癌细胞系PC9-OR分别接种于96孔板，设置蝙蝠葛碱单药组(DAC)、奥希替尼单药组(OSI)、蝙蝠葛碱与奥希替尼联用组(DAC+OSI)；

(2)蝙蝠葛碱单药组的浓度分别为0μM、0.5μM、1μM、2μM、4μM、8μM、16μM、32μM、64μM、128μM；奥希替尼单药组的浓度分别为0nM、0.32768nM、1.6385nM，8.192nM、40.96nM、204.8nM、1024nM、5120nM、25600nM、128000nM；蝙蝠葛碱与奥希替尼联用组的浓度是固定蝙蝠葛碱的浓度为20μM，将奥希替尼浓度为0nM、0.32768nM、1.6385nM、8.192nM、40.96nM、204.8nM、1024nM、5120nM、25600nM、128000nM。

将对应体积的药物与上述96孔细胞培养板中的细胞轻微振荡混匀后，在细胞培养箱(Thermo)中培养48h后用CCK8试剂盒(MCE，上海)检测细胞增殖水平。

各组的细胞增殖水平结果如图2A和图2B所示，由图可知，与奥希替尼单药相比，蝙蝠葛碱与奥希替尼联用能够在提高抑制水平的基础上降低奥希替尼的使用量，即能够同时保证低的药物毒副作用和优异的抗肺癌的治疗效果。

实施例3

本实施例探究将联合用药物组合物与不同抑制剂(Fer-1、DFO、Z-VAD-FMK、Necro)联用对耐药型肺癌细胞系PC9-OR的增殖的抑制作用，操作如下：

(1)以每孔3000个细胞的耐药型肺癌细胞系PC9-OR接种于96孔板，设置空白对照组、联合用药物组合物组、联合用药物组合物+抑制剂组、抑制剂组；

(2)空白对照组不加入任何药物或抑制剂；联合用药物组合物组加入40μM的蝙蝠葛碱和6μM的奥希替尼；抑制剂组分别加入浓度依次为20μM、100μM、20μM、6μM的Fer-1、DFO、Z-VAD-FMK、Necro；联合用药物组合物+抑制剂组分别加入40μM的蝙蝠葛碱和6μM的奥希替尼和上述浓度的抑制剂。

将对应体积的药物或抑制剂与上述96孔细胞培养板中的细胞轻微振荡混匀后，在细胞培养箱(Thermo)中培养24h后用CCK8试剂盒(MCE，上海)检测细胞增殖水平。

各组的细胞增殖水平结果如图3所示，由图可知，其他死亡方式的抑制剂，如坏死性凋亡抑制剂Necro、凋亡抑制剂Z-VAD-FMK都不能逆转蝙蝠葛碱联合奥希替尼引起的耐药细胞死亡作用；相反使用铁死亡抑制剂Fer-1、铁螯合剂DFO处理耐药细胞时，细胞死亡减少，蝙蝠葛碱联合奥希替尼的抗肿瘤作用被明显抑制。说明蝙蝠葛碱联合奥希替尼主要通过铁死亡诱导耐药细胞死亡。

实施例4

本实施例探究单独蝙蝠葛碱、单独奥希替尼、联合用药物组合物对耐药型肺癌细胞系PC9-OR的ROS水平的影响，操作如下：

(1)取数量为2×10⁵对数生长期的耐药型肺癌细胞系PC9-OR接种于6孔板，设置空白对照组、蝙蝠葛碱单药组(DAC)、奥希替尼单药组(OSI)、蝙蝠葛碱与奥希替尼联用组(DAC+OSI)，处理48h；

(2)弃培养基，PBS清洗两次，弃PBS，DCFH-DA探针用无血清培养基稀释至10μM，37℃、避光孵育20min；

(3)避光收集细胞，弃含染液的无血清培养基，PBS润洗3次，胰蛋白酶消化，以1000r/min的转速离心3min收集细胞沉淀，无血清培养基重悬细胞备用；

(4)使用流式细胞仪检测活细胞中的ROS水平。

各组的结果如图4所示，由图可知，蝙蝠葛碱联合奥希替尼组明显升高细胞的ROS水平，说明联用组诱导了更多的脂质过氧化。

实施例5

本实施例探究单独蝙蝠葛碱、单独奥希替尼、联合用药物组合物对耐药型肺癌细胞系PC9-OR中GPX4和SLC7A11表达水平的影响，操作如下：

(1)取数量为2×10⁵对数生长期的耐药型肺癌细胞系PC9-OR接种于6孔板，设置空白对照组、蝙蝠葛碱单药组(DAC)、奥希替尼单药组(OSI)、蝙蝠葛碱与奥希替尼联用组(DAC+OSI),处理48h；

(2)收样：弃去培养基，加入PBS清洗，吸净PBS；加入预冷的裂解液，用细胞刮板沿着底面仔细将细胞碎片轻轻刮下，转移至预冷的离心管中；

(3)煮样：上样缓冲液(2×Loading Buffer)稀释蛋白样品，充分混合后于100℃金属浴中煮沸10min，放置室温后，分装被备用；

(4)进行蛋白印迹实验。

各组的结果如图5所示，由图可知，蝙蝠葛碱联合奥希替尼组明显下调GPX4及SLC7A11水平，说明联用组导致了铁死亡的发生。

实施例6

本实施例探究单独蝙蝠葛碱、单独奥希替尼、联合用药物组合物对非小细胞肺癌成瘤进程的影响，操作如下：

(1)设置对照组、蝙蝠葛碱单药组(DAC)、奥希替尼单药组(OSI)、蝙蝠葛碱与奥希替尼联用组(DAC+OSI)，其中蝙蝠葛碱用玉米油溶液配成悬浊液使用，奥希替尼用玉米油溶液配成悬浊液使用。

(2)构建非小细胞肺癌小鼠模型：

取处于对数生长期的PC9-OR细胞，PBS润洗，胰酶消化，预冷的PBS重悬细胞沉淀两次，调整细胞浓度为2×10⁷cells/mL，置于冰上备用；

裸鼠环境适应性饲养一周后，0.1mL/只皮下接种于裸鼠右前肢腋下，当肿瘤大小达到约100mm3/只时，将小鼠随机分组：溶剂对照组、奥希替尼OSI组、蝙蝠葛碱DAC组、蝙蝠葛碱联合奥希替尼组。

(3)在小鼠肿瘤大小达到约100mm³/只时开始给药，蝙蝠葛碱剂量为10mg/kg/天，奥希替尼剂量为5mg/kg/天，连续给药7天，通过测量皮下肿瘤大小检测小鼠成瘤进展，并且每天记录各组小鼠的体重。其中Nudemouse(无胸腺)小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司。

各组小鼠的体重变化情况如图6所示，肿瘤体积变化情况如图7所示，肿瘤解剖外观如图8所示。由图可知，单独蝙蝠葛碱或单独奥希替尼均有抑制非小细胞肺癌成瘤进程的作用，且蝙蝠葛碱与奥希替尼的联合组效果更好，表明蝙蝠葛碱与奥希替尼在防治非小细胞肺癌的效果上具有协同增效作用，蝙蝠葛碱能够降低奥希替尼的用药量。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.蝙蝠葛碱在制备预防或治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述非小细胞肺癌包括耐药型非小细胞肺癌或非耐药型非小细胞肺癌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述耐药型非小细胞肺癌包括耐奥希替尼型非小细胞肺癌。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料；

优选地，所述药学上可接受的辅料包括载体、稀释剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述药物的剂型为药剂学上可接受的任意一种剂型；

优选地，所述药物中还含有奥希替尼或其可药用盐。

5.一种预防或治疗非小细胞肺癌的联合用药物组合物，其特征在于，所述联合用药物组合物包括蝙蝠葛碱，以及奥希替尼或其可药用盐。

6.根据权利要求5所述的联合用药物组合物，其特征在于，所述联合用药物组合物为单一的复方制剂或两种单独的制剂的组合；

优选地，所述联合用药物组合物为两种单独的制剂的组合，两种单独的制剂同时施用或依次施用；

优选地，所述制剂的剂型为药剂学上可接受的任意一种剂型。

7.根据权利要求5或6所述的联合用药物组合物，其特征在于，所述联合用药物组合物还包括药学上可接受的辅料；

优选地，所述药学上可接受的辅料包括载体、稀释剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的联合用药物组合物，其特征在于，所述非小细胞肺癌包括耐药型非小细胞肺癌或非耐药型非小细胞肺癌；

优选地，所述耐药型非小细胞肺癌包括耐奥希替尼型非小细胞肺癌。

9.蝙蝠葛碱或权利要求5-8中任一项所述的联合用药物组合物在制备非小细胞肺癌细胞的增殖抑制剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述非小细胞肺癌包括耐药型非小细胞肺癌或非耐药型非小细胞肺癌；

优选地，所述耐药型非小细胞肺癌包括耐奥希替尼型非小细胞肺癌。