CN111184740B - 佐太在制备增强紫杉醇抗癌活性的药物中的应用 - Google Patents

佐太在制备增强紫杉醇抗癌活性的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及佐太在制备增强紫杉醇抗癌活性的药物中的应用，属于药物制备技术领域。佐太联合紫杉醇给药能够显著增加紫杉醇进入3种不同癌细胞内部；显著促进不同时间段HN4癌细胞的凋亡率，对紫杉醇具有明显的增效作用；佐太联合紫杉醇小鼠体内给药能够显著促进药物起效，抑制HN4实体瘤的生长。

Description

佐太在制备增强紫杉醇抗癌活性的药物中的应用
技术领域
本发明涉及药物制备技术领域，具体涉及佐太在制备增强紫杉醇抗癌活性的药物中的应用。
背景技术
含无机汞类药物在传统中医药、藏医药和印度传统医药中都有很悠久的用药历史。中药中主要以朱砂为主，印度传统医药中以Bhasma为代表，在藏医药中则以佐太为最典型代表，它们中的主要成份都含有硫化汞。这些含汞类药物的药用历史最早可以追溯到公元3世纪，且都是以辅佐剂的形式出现在各大民族医药的组方中，并被各民族广泛使用而且在临床上沿用至今。佐太作为藏医药的核心制剂，在藏药中的使用率非常高，其中临床最常用的复方药物包括‘七十味珍珠丸’、‘仁青常觉’等。含佐太类制剂在治疗中风、麻痹病、高血压、神经系统疾病、心血管障碍、肝胆胃肠疾病和肿瘤等方面往往能够发挥独特的功效。佐太的安全性评价和研究已证实在正常的药用剂量情况下，对机体的毒性甚微。
紫杉醇是一种二萜生物碱类化合物，是目前已发现的临床效果最显著的天然抗癌药物，已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分头颈癌和肺癌的治疗。对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤等也都具有一定疗效其新颖复杂的化学结构、广泛而显著的生物活性、全新独特的作用机制受到了科研工作者、医务工作者和患者的极大青睐。目前针对紫杉醇新剂型的研究仍受到广泛关注，如何提高药效，降低不良反应仍是研究的热点。如紫杉醇脂质体、白蛋白包裹紫杉醇纳米粒等新剂型，极大地改善了紫杉醇的疗效。但如何高效简便的提升药物临床使用效果仍然需要不断创新研究。
发明内容
本发明的目的在于提供佐太在制备增强紫杉醇抗癌活性的药物中的应用。佐太联合紫杉醇给药能够促进紫杉醇更高效的进入细胞内部，显著提升药物作用效果，该药物组合简便易行，效果显著；具体能够显著增加紫杉醇进入癌细胞内部；促进癌细胞的凋亡率，对紫杉醇具有明显的增效作用。
本发明提供了佐太在制备增强紫杉醇抗癌活性的药物中的应用。
本发明还提供了佐太在制备促进紫杉醇在癌细胞中富集的药物中的应用。
本发明还提供了佐太在制备增强紫杉醇促进癌细胞凋亡的药物中的应用。
本发明还提供了佐太在制备增加紫杉醇对肿瘤组织的抑制作用的药物中的应用。
优选的是，所述应用中，佐太与紫杉醇使用的质量比为(1～1000)：(100～40000)。
优选的是，所述药物的剂型包括注射剂、粉针剂、颗粒剂或胶囊。
优选的是，所述药物还包括药学上可接受的辅料：注射剂包括羟甲基纤维素钠；粉针剂包括葡萄糖、乳糖和/或甘露醇；胶囊包括淀粉、乳糖、硬脂酸镁、微粉硅胶和/或聚山梨酯80；颗粒剂包括淀粉、乳糖、糊精和/或羟丙基甲基纤维素。
本发明提供了佐太在制备增强紫杉醇抗癌活性的药物中的应用。试验结果表明，佐太联合紫杉醇给药能够显著增加紫杉醇进入在3种不同癌细胞内部；显著促进不同时间段HN4癌细胞的凋亡率，对紫杉醇具有明显的增效作用；佐太联合紫杉醇小鼠体内给药能够显著促进药物起效，抑制HN4实体瘤的生长。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的佐太联合紫杉醇给药后不同时间对药物进入HN4细胞内部的促进作用结果图；
图2为本发明实施例1提供的佐太联合紫杉醇给药后不同时间对药物进入K562细胞内部的促进作用结果图；
图3为本发明实施例1提供的佐太联合紫杉醇给药后不同时间对药物进入HpG-2细胞内部的促进作用结果图；
图4为本发明实施例1提供的佐太联合紫杉醇给药48h增加药物促HN4细胞凋亡效果结果图；
图5为本发明实施例1提供的佐太联合紫杉醇给药72h增加药物促HN4细胞凋亡效果结果图；
图6为本发明实施例1提供的佐太对紫杉醇抑制小鼠HN4实体瘤增长的增效作用结果图。
具体实施方式
本发明提供了佐太在制备增强紫杉醇抗癌活性的药物中的应用。本发明对所述佐太的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售佐太来源即可。佐太联合紫杉醇给药能够显著增加紫杉醇进入在3种不同癌细胞内部；显著促进不同时间段HN4癌细胞的凋亡率，对紫杉醇具有明显的增效作用；佐太联合紫杉醇小鼠体内给药能够显著促进药物起效，抑制HN4实体瘤的生长。
本发明还提供了佐太在制备促进紫杉醇在癌细胞中富集的药物中的应用。本发明还提供了佐太在制备增强紫杉醇促进癌细胞凋亡的药物中的应用。通过后续具体实施例验证，本发明紫杉醇联合佐太给药，观察HN4、K562和HpG-2细胞的胞内药物浓度变化及促凋亡影响情况，结果显示，佐太能够促进紫杉醇在不同癌细胞内的富集；且能够增强子紫杉醇的促凋亡效果。
本发明还提供了佐太在制备增加紫杉醇对肿瘤组织的抑制作用的药物中的应用。通过后续具体实施例验证，紫杉醇联合佐太给药对HN4和K562裸鼠肿瘤模型的肿瘤组织的抑制实验，证明佐太联合紫杉醇共同给药能够增加紫杉醇对肿瘤组织的抑制作用。
在本发明中，所述应用中，佐太与紫杉醇使用的质量比为(1～1000)：(100～40000)，更优选为1：100。
在本发明中，所述药物的剂型优选包括注射剂、粉针剂、颗粒剂或胶囊。
在本发明中，所述药物还包括药学上可接受的辅料，优选的，注射剂包括羟甲基纤维素钠；粉针剂包括葡萄糖、乳糖和/或甘露醇；胶囊包括淀粉、乳糖、硬脂酸镁、微粉硅胶和/或聚山梨酯80；颗粒剂包括淀粉、乳糖、糊精和/或羟丙基甲基纤维素。
在本发明中，当本发明所述药物和紫杉醇联合体外给药时，所述药物中佐太的有效给药浓度优选为1ng/ml～1000ng/ml；紫杉醇优选为0.1μg/ml～40.0μg/ml，上述浓度的药物和紫杉醇组合的比例优选为1：100～1：2。本发明所述药物和紫杉醇优选体外同时给药或提前24小时给予本发明药物。
在本发明中，当本发明所述药物和紫杉醇联合体内给药时，所述药物中佐太的有效给药量优选为：10ng/kg体重～200μg/kg体重，本发明所述药物优选每隔2～7天给药一次。本发明所述药物的注射方式优选包括腹腔注射、灌胃或静脉给予。在本发明中，紫杉醇的给药量优选为1mg/kg～5mg/kg体重，紫杉醇按照临床给药方法给药。
下面结合具体实施例对本发明所述的佐太在制备增强紫杉醇抗癌活性的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1.佐太促进紫杉醇进入细胞
1.1给药方法
分组与给药：K562白血病细胞、HN4口腔鳞癌上皮细胞及HpG2肝癌细胞三种细胞分别分为紫杉醇单独24h、48h和72h给药组和紫杉醇联合佐太24h、48h和72h给药组。
1.2样品采集：取对数生长期的K562白血病细胞、HN4口腔鳞癌上皮细胞及HpG2肝癌细胞，并调整细胞密度为2×106细胞/mL分别接种于培养皿中，置于5％CO2、37℃的培养箱培养，直至细胞长至70％～80％。三种细胞分别使用浓度为10μg/ml紫杉醇处理和浓度为5ng/ml的佐太联合紫杉醇处理，于24h、48h、72h后PBS洗3次，分别收取细胞。
1.3样品处理
将紫杉醇药物处理和佐太联合紫杉醇处理24h、48h、72h后的细胞使用低温离心机1000r/min离心5min，吸弃上清，剩余沉淀即为所收取细胞，加入50uL细胞裂解液，充分裂解后加入1ml甲醇溶解，HPLC检测。
1.4样品分析
色谱条件：流动相为65％甲醇等度30min；流速为1mL/min；柱温为30℃；检测波长为227nm；进样量为10μL。
图1为佐太联合紫杉醇给药后不同时间对药物进入HN4细胞内部的促进作用结果图，其中，A：不同时间HN4细胞内药物浓度峰面积，B：不同时间佐太对HN4胞内药物的增量；图2为佐太联合紫杉醇给药后不同时间对药物进入K562细胞内部的促进作用结果图，其中，A：不同时间K562细胞内药物浓度峰面积，B：不同时间佐太对K562胞内药物的增量；图3为佐太联合紫杉醇给药后不同时间对药物进入HpG-2细胞内部的促进作用结果图，其中，A：不同时间HpG-2细胞内药物浓度峰面积，B：不同时间佐太对HpG-2胞内药物的增量。结果显示，佐太联合紫杉醇给药能够显著增加紫杉醇进入在3种不同癌细胞内部。对HN4、K562和HpG-2三种细胞在给药24、48和72h的胞内药物浓度增量分别为27.37±4.31％、147.25±38.89％、5.17±3.19％；34.33±6.44％、150.43±49.53％、-9.88±25.26％；42.00±23.71％、26.01±5.07％、25.21±16.16(Mean±SD)％。
2.促进紫杉醇增效研究
2.1MTT检测
取对数生长期的HN4口腔鳞癌上皮细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，以每孔为5×103个细胞接种于96孔培养板中，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。培养24h后弃上清，设PBS孔作为空白组，不加药孔为对照组，实验组每孔加入不同浓度的紫杉醇(处理48小时给药浓度为10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml；处理72小时给药浓度为0.5μg/ml，1μg/ml，1.5μg/ml)或联合5ng/ml佐太处理，每组设置6个平行孔。分别温育48、72h后，吸弃上清，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，放入CO2培养箱中继续培养4h后，吸弃上清，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，在恒温37.5℃，300rmp的摇床上慢摇10min，使用酶标仪分别测定波长为490nm和570nm处的吸光度值，以空白孔调零。根据细胞活力计算公式:细胞活力(％)＝(实验组OD值/对照组OD值)×100％，取平均值，计算各实验组平均细胞存活率。
2.2促进紫杉醇抑制小鼠实体瘤
4-6周龄雌性BALB/c无胸腺裸鼠SPF级动物房饲养，12小时光照。1-2×106HN4或HN6细胞右侧腹下皮下注射进行肿瘤移植。移植瘤两周后待肿瘤组织较明显，直径大约在2mm时，小鼠随机分为四组，每组10只小鼠。荷瘤小鼠腹腔注射给药，分别设置阳性对照药组，紫杉醇给药组和紫杉醇+佐太联合给药组，紫杉醇给药剂量为15mg/kg体重，佐太给药剂量为50μg/kg体重，每隔1天给药1次，同时测定肿瘤体积(体积＝(宽度)2×长度/2)。
图4为佐太联合紫杉醇给药48h增加药物促HN4细胞凋亡效果结果图；图5为佐太联合紫杉醇给药72h增加药物促HN4细胞凋亡效果结果图。结果显示，佐太联合紫杉醇给药能够显著促进不同时间段HN4癌细胞的凋亡率，佐太对紫杉醇具有明显的增效作用。佐太联合紫杉醇给药48h不同给药浓度对凋亡率的增加值分别为21.92±7.03％，6.96±8.49％，7.25±2.72％。佐太联合紫杉醇给药72h不同给药浓度对凋亡率的增加值分别为18.94±4.99％，11.22±3.14％，0.02±6.60％。
佐太对紫杉醇抑制小鼠HN4实体瘤增长的增效作用结果如图6所示，佐太联合紫杉醇小鼠体内给药能够显著促进药物起效，抑制HN4实体瘤的生长。
实施例2
1.佐太促进紫杉醇进入细胞
1.1给药方法
分组与给药：K562白血病细胞、HN4口腔鳞癌上皮细胞及HpG2肝癌细胞三种细胞分别分为紫杉醇单独24h、48h和72h给药组和紫杉醇联合佐太24h、48h和72h给药组。
1.2样品采集：取对数生长期的K562白血病细胞、HN4口腔鳞癌上皮细胞及HpG2肝癌细胞，并调整细胞密度为2×106细胞/mL分别接种于培养皿中，置于5％CO2、37℃的培养箱培养，直至细胞长至70％～80％。三种细胞分别使用浓度为40μg/ml紫杉醇处理和浓度为1ng/ml的佐太联合紫杉醇处理，于24h、48h、72h后PBS洗3次，分别收取细胞。
1.3样品处理
将紫杉醇药物处理和佐太联合紫杉醇处理24h、48h、72h后的细胞使用低温离心机1000r/min离心5min，吸弃上清，剩余沉淀即为所收取细胞，加入50uL细胞裂解液，充分裂解后加入1ml甲醇溶解，HPLC检测。
1.4样品分析
色谱条件：流动相为65％甲醇等度30min；流速为1mL/min；柱温为30℃；检测波长为227nm；进样量为10μL。
佐太对HN4、K562和HpG-2三种细胞在给药24、48和72h的胞内药物浓度增量分别为20.67±2.31％、87.76±18.18％、5.57±2.41％；24.73±2.32％、110.75±12.95％、10.76±5.55％；28.90±13.92％、36.78±4.68％、10.61±6.34(Mean±SD)％。
2.促进紫杉醇增效研究
2.1MTT检测
取对数生长期的HN4口腔鳞癌上皮细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，以每孔为5×103个细胞接种于96孔培养板中，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。培养24h后弃上清，设PBS孔作为空白组，不加药孔为对照组，实验组每孔加入不同浓度的紫杉醇(处理48小时给药浓度为5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml；处理72小时给药浓度为0.25μg/ml，0.5μg/ml，1.0μg/ml)或联合1ng/ml佐太处理，每组设置6个平行孔。分别温育48、72h后，吸弃上清，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，放入CO2培养箱中继续培养4h后，吸弃上清，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，在恒温37.5℃，300rmp的摇床上慢摇10min，使用酶标仪分别测定波长为490nm和570nm处的吸光度值，以空白孔调零。根据细胞活力计算公式:细胞活力(％)＝(实验组OD值/对照组OD值)×100％，取平均值，计算各实验组平均细胞存活率。
佐太联合紫杉醇给药48h不同给药浓度对凋亡率的增加值分别为12.53±6.32％，18.19±8.11％，8.35±5.23％。佐太联合紫杉醇给药72h不同给药浓度对凋亡率的增加值分别为10.58±2.56％，21.44±6.56％，14.27±6.48％。
2.2促进紫杉醇抑制小鼠实体瘤
4-6周龄雌性BALB/c无胸腺裸鼠SPF级动物房饲养，12小时光照。1-2×106HN4或HN6细胞右侧腹下皮下注射进行肿瘤移植。移植瘤两周后待肿瘤组织较明显，直径大约在2mm时，小鼠随机分为四组，每组10只小鼠。荷瘤小鼠腹腔注射给药，分别设置阳性对照药组，紫杉醇给药组和紫杉醇+佐太联合给药组，紫杉醇给药剂量为5mg/kg体重，佐太给药剂量为1mg/kg体重，每隔3天给药1次，同时测定肿瘤体积(体积＝(宽度)2×长度/2)。
佐太联合紫杉醇小鼠体内给药能够显著促进药物起效，抑制HN4实体瘤的生长，作用效果优于单组紫杉醇给药组。
实施例3
1.佐太促进紫杉醇进入细胞
1.1给药方法
分组与给药：K562白血病细胞、HN4口腔鳞癌上皮细胞及HpG2肝癌细胞三种细胞分别分为紫杉醇单独24h、48h和72h给药组和紫杉醇联合佐太24h、48h和72h给药组。
1.2样品采集：取对数生长期的K562白血病细胞、HN4口腔鳞癌上皮细胞及HpG2肝癌细胞，并调整细胞密度为2×106细胞/mL分别接种于培养皿中，置于5％CO2、37℃的培养箱培养，直至细胞长至70％-80％。三种细胞分别使用浓度为40μg/ml紫杉醇处理和浓度为100ng/ml的佐太联合紫杉醇处理，于24h、48h、72h后PBS洗3次，分别收取细胞。
1.3样品处理
将紫杉醇药物处理和佐太联合紫杉醇处理24h、48h、72h后的细胞使用低温离心机1000r/min离心5min，吸弃上清，剩余沉淀即为所收取细胞，加入50uL细胞裂解液，充分裂解后加入1ml甲醇溶解，HPLC检测。
1.4样品分析
色谱条件：流动相为65％甲醇等度30min；流速为1mL/min；柱温为30℃；检测波长为227nm；进样量为10μL。
对HN4、K562和HpG-2三种细胞在给药24、48和72h的胞内药物浓度增量分别为36.59±8.76％、99.65±28.06％、16.17±5.55％；30.70±9.21％、103.53±29.78％、9.08±8.86％；39.00±12.05％、36.44±8.81％、20.22±7.76(Mean±SD)％。
2.促进紫杉醇增效研究
2.1MTT检测
取对数生长期的HN4口腔鳞癌上皮细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，以每孔为5×103个细胞接种于96孔培养板中，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。培养24h后弃上清，设PBS孔作为空白组，不加药孔为对照组，实验组每孔加入不同浓度的紫杉醇(处理48小时给药浓度为2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml；处理72小时给药浓度为1.0μg/ml，1.5μg/ml，3.0μg/ml)或联合1ng/ml佐太处理，每组设置6个平行孔。分别温育48、72h后，吸弃上清，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，放入CO2培养箱中继续培养4h后，吸弃上清，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，在恒温37.5℃，300rmp的摇床上慢摇10min，使用酶标仪分别测定波长为490nm和570nm处的吸光度值，以空白孔调零。根据细胞活力计算公式:细胞活力(％)＝(实验组OD值/对照组OD值)×100％，取平均值，计算各实验组平均细胞存活率。
佐太联合紫杉醇给药48h不同给药浓度对凋亡率的增加值分别为8.73±5.74％，15.79±4.36％，10.23±6.76％。佐太联合紫杉醇给药72h不同给药浓度对凋亡率的增加值分别为9.08±4.58％，17.23±4.98％，16.46±7.38％。
2.2促进紫杉醇抑制小鼠实体瘤
4～6周龄雌性BALB/c无胸腺裸鼠SPF级动物房饲养，12小时光照。1～2×106HN4或HN6细胞右侧腹下皮下注射进行肿瘤移植。移植瘤两周后待肿瘤组织较明显，直径大约在2mm时，小鼠随机分为四组，每组10只小鼠。荷瘤小鼠腹腔注射给药，分别设置阳性对照药组，紫杉醇给药组和紫杉醇+佐太联合给药组，紫杉醇给药剂量20mg/kg体重，佐太给药剂量为0.5μg/kg体重，每隔2天给药1次，同时测定肿瘤体积(体积＝(宽度)2×长度/2)。
佐太联合紫杉醇小鼠体内给药能够显著促进药物起效，抑制HN4实体瘤的生长，作用效果优于单组紫杉醇给药组。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.佐太在制备增强紫杉醇抗癌活性的药物中的应用。
2.佐太在制备促进紫杉醇在癌细胞中富集的药物中的应用。
3.佐太在制备增强紫杉醇促进癌细胞凋亡的药物中的应用。
4.佐太在制备增加紫杉醇对肿瘤组织的抑制作用的药物中的应用。
5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述应用中，佐太与紫杉醇使用的质量比为(1～1000)：(100～40000)。
6.根据权利要求1～4任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂、粉针剂、颗粒剂或胶囊。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料：注射剂包括羟甲基纤维素钠；粉针剂包括葡萄糖、乳糖和/或甘露醇；胶囊包括淀粉、乳糖、硬脂酸镁、微粉硅胶和/或聚山梨酯80；颗粒剂包括淀粉、乳糖、糊精和/或羟丙基甲基纤维素。
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