DE2518509B2

DE2518509B2 - Pharmazeutisches Mittel für Antitumoraktivität, enthaltend Abrin

Info

Publication number: DE2518509B2
Application number: DE2518509A
Authority: DE
Inventors: Jung- Yaw Taiwan Lin; Ta-Cheng Taipei Tung
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1974-04-30
Filing date: 1975-04-25
Publication date: 1980-06-04
Also published as: DE2518509A1; US4062949A; FR2269351A1; NL7505108A; FR2269351B1; DE2518509C3; GB1493059A

Description

Die Erfindung betrifft ein pharmazeutisches Mittel, das Abrin und Nucleinsäure enthält und parenteral oder topisch an krebserkrankte Patienten verabreicht werden kann.

Gemäß J. Formosan M ed. Assoc, 70, Nr. 10, Seiten 569—579 (1971), ist Abrin für die Behandlung von menschlichem Krebs wirksam. Bei der Verarbeitung von Abrin treten jedoch gewisse Nachteile auf. Abrin ist eine stark toxische Verbindung mit einer LD50 von 0,02 mg/kg Körpergewicht (bei Mäusen, intraperitoneal). Wegen der starken Toxizität sind die Verabreichungen an Patienten auf topische Anwendung in Form einer halbfesten Präparation, Intratumorinjektion, intraperitonealer Verabreichung, retroperitonealer Verabreichung und intraartereale Infusion beschränkt Eine intravenöse Verabreichung von Abrin kann nicht durchgeführt werden, da dadurch der Tod des Patienten verursacht werden kann.

Bei intraperetonealer oder intratumoraler Verabreichung von Abrin treten außerdem Nebenwirkungen, wie Müdigkeit, Benommenheit, Fieber sowie Eiweißausscheidungen im Harn oftmals ein. v>

Bei dem Mangei an wirksamen Arzneimitteln mit Antitumorwirkung besteht ein Bedürfnis, Abrin bei der Bekämpfung von menschlichen Tumoren einzusetzen und dessen Anwendbarkeit zu verbessern. Insbesondere besteht ein Bedürfnis, Abrin auch intravenös zu applizieren.

Es wurde nun gefunden, daß ein pharmazeutisches Mittel mit Antitumoraktivität welches Abrin enthält, in Kombination mit Nucleinsäure, wobei das Verhältnis von Nucleinsäure zu Abrin in dem Mittel 0,3 oder höher, 4^r> ausgedrückt durch das Gewicht, ist, eine verminderte Toxizität aufweist und auch intravenös verabreicht werden kann.

Abrin ist ein toxisches Protein (Toxalbumin) mit einem Molekulargewicht von ungefähr 65 000, das in ^r>o Samen der Paternostererbse, Abrus precatorius, in tropischen und subtropischen Zonen vorkommt.

Abrin kann aus Abrus precatorius in hochreiner Form gemäß einem in The Journal of Formosan Medical Association, 68,518—521 (1969), beschriebenen Verfahren gewonnen werden. Die Einzelheiten dieses Verfahrens sind die folgenden:

100 g Abrus precatoris-Kerne werden in 500 ml 5%iger Essigsäure bei einer Temperatur von 4° C über Nacht eingeweicht und dann in einem Mischer <>o homogenisiert Die homogene Mischung wird in 250-ml-FIaschen 20 Minuten bei 5000G zentrifugiert und der Rückstand wird verworfen. Zu der überstehenden Lösung fügt man festes Ammoniumsulfat langsam unter Rühren bis zur 45%igen Sättigung hinzu. μ

Der Niederschlag, in dem sehr wenig toxisches Protein festgestellt wird, wird abfiltriert. Zu der überstehenden Lösung fügt man festes Ammoniumsulfat bis zur 100%igen Sättigung. Der entstehende Niederschlag wird in destilliertem Wasser gelöst und weiter gereinigt, indem man das toxische Protein in einem Wasserbad bei 6O⁰C während 30 Minuten erwärmt Der entstehende Niederschlag des Proteins wird abzentrifugiert und die überstehende Lösung wird gegenüber destilliertem Wasser bei 4° C während 24 h dialysiert, wobei aas destillierte Wasser mehrere Male gewechselt wird.

Während der Dialyse tritt ein gewisser Niederschlag an Protein auf, der dann durch Zentrifugieren entfernt wird. Die überstehende Lösung wird chromatografisch gereinigt

Die Fraktionen mit dem Proteinpeak werden gesammelt und auf ungefähr 20 mg Protein/ml durch Verdampfung konzentriert Zur Umkristallisation werden die Kristalle in destilliertem Wasser gelöst, indem man einige Tropfen 0,1 η-Essigsäure zugibt Man dialysiert dann gegenüber destilliertem Wasser, und nachdem das destillierte Wasser mehrere Male gewechselt wurde, werden die gebildeten Kristalle abfiltriert Man erhält so 120 mg reines Abrin als feine, stäbchenförmige Kristalle.

Bei der Scheibengelelektrophorese zeigt das Produkt eine einzige Bande. Das Absorptionsvermögen (280 nm) des Produktes in einer 1-cm-Zelle beträgt 12,4. Das Verhältnis der optischen Absorption bei 280 und 260 nm beträgt 1,95. Man stellt fest, daß das Produkt frei von Protease-Aktivität und Blutagglutination verursachender Aktivität ist

Die Nucleinsäure, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfaßt sowohl RNA (Ribonucleinsäure) als auch DNA (Deoxy-rebonucleinsäure).

Eine geeignete RNA kann beispielsweise aus Bäckerhefe, Brauereihefe, Torulahefe, Escherichia coli oder Rinderleber gewonnen werden. DNA kann beispielsweise aus Kalbsthymusdrüsen, Lachssperma, Heringssperma oder Clostridium perfringens gewonnen werden.

In dem erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel ist das Verhältnis Nucleinsäure zu Abrin 0,3 oder höher, ausgedrückt durch das Gewicht Es beträgt vorzugsweise 10 bis 50.

Verschiedene pharmazeutische Präparationen können entsprechend bekannten Verfahren mit Vorteil hergestellt werden, die Abrin und Nucleinsäure zusammen mit üblichen flüssigen, festen und/oder halbfesten Trägern enthalten. Geeignete Präparationen, die Abrin und Nucleinsäure enthalten, umfassen injizierbare Lösungen, injizierbare, feste Präparationen für die jeweilige Verdünnung und halbfeste Präparationen für die topische Anwendung, beispielsweise in Salben. Solche Präparationen können weiter andere pharmazeutisch aktive Materialien wie Lokalanaesthetica, Mittel, um die Diffusion der aktiven Bestandteile in das krebskrauke Gewebe zu beschleunigen und/oder andere Antitumormittel enthalten.

Die semifesten Präparationen, beispielsweise Salben, können unter Verwendung bekannter Salbengrundstoffe wie beispielsweise weißem Vaselin, flüssigem Vaselin, Lanolin, pflanzlichen ölen, Wachsen, Polyäthylenglykolen usw. oder Mischungen davon formuliert verden. Um die Diffusion der Präparation in das Gewebe zu verstärken, können solche Präpaiationen zusätzlich geeignete Mengen an Hyaluronidase enthalten.

Im Falle von injizierbaren Präparationen können diese mit geeigneten Verdünnungsmitteln, wie Kochsalzlösung, hergestellt werden. Bei der Herstellung einer

wäßrigen injizierbaren Präparation und bei der Auflösiijigsstufe, bevor die injizierbare feste Präparation fOr die jeweilige Verdünnung verwendet wird, ist es erforderlich, daß der pH-Wert auf ungefähr 7 oder höher eingestellt wird, da Abrin mit Nucleinsäure in einem wäßrigen Medium, das einen pH-Wert unter ungefähr 6 besitzt, einen Niederschlag bUdet

Injizierbare erfindungsgemäße Präparationen können intratumoraL d.h. in den Tumor, intraperitoneal, retroperitoneal oder intraarteriell verabreicht werden, wie es im Falle der Verabreichung von Abrin per se üblich ist Die Präparationen können ebenfalls intravenös verabreicht werden, da sie, wie oben erwähnt, eine relativ niedrige Toxizität aufweisen. Halbfeste Präparationen können direkt auf die verletzten Stellen bei Gebärmutterhalskrebs, zystischem Krebs u.a. aufgebrachtwerden.

Die Dosis der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparationen kann variiert werden und hängt von den Verabreichungsverfahren und der Art und der Stärke des Tumors ab. Empfehlbare Dosen von injizierbaren Präparationen liegen im Bereich von ungefähr 0,5 bis ungefähr 30 μg/Tag, angegeben als Abrin, im Falle der intratumoralen Verabreichung, bei ungefähr 50 bis ungefähr 6(X^g/Tag im Falle der intraperitonealen, retroperitonealen und intra-arterealen Verabreichung und bei ungefähr 5 bis ungefähr 40 μΕ/Tag im Falle der intravenösen Verabreichung.

Toxizitätstest

30

Es wurde eine injizierbare Präparation verwendet, die Abrin und Ribonucleinsäure in einem Verhältnis von 1:40, ausgedrückt durch das Gewicht, enthält und die entsprechend dem folgenden Beispiel 1 hergestellt wird. Die entsprechenden Injektionen wurden durchgeführt an der Vene des Vorderbeins eines Hundes, der Randohrvene von Kaninchen und der Oberschenkelvene von Ratten, um die LD₅₀-WeHe zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tnbelle 1 aufgeführt.

40

Tabelle I Tier Dosis (μι/Η als Abrin) Dosis

einer Abrin-Uivonuclcin- ([ig/kg)

säure enthaltenden als Abrin

Präparation allein

Hund

Kaninchen

Ratte

18 16 14

7,5
7,5
7,5

Wurde die gleiche injizierbare Präparation einem Hund allmählich intravenös im Verlauf von 12 Stunden verabreicht, so betrug der LD»-Wert 3(^g/kg als Abrin.

Aus den Werten der obigen Tabelle I ist erkennbar, daß die Toxizität des erfindungsgemäßen Mittels, das Abrin und Ribonucleinsäure enthält, ungefähr die Hälfte oder weniger beträgt, verglichen mit der von Abrin allein.

Der Grund, weshalb die Toxizität des erfindungsgemäßen Mittels, das Abrin und Nucleinsäure enthält, so stark erniedrigt wird, verglichen mit Abrin per se, kann folgendermaßen erklärt werden: Die aktiven Stellen des Abrins werden durch Nucleinsäure maskiert bzw. geschützt, und dadurch wird die toxische Aktivität des Abrins gegenüber tierischen Zellen stark vermindert.

Man nimmt an, daß nach der Verabreichung des erfindungsgemäßen Mittels Abrin allmählich aus dem Komplex freigesetzt wird und seine Antitumoraktivität entfaltet

Pharmakologischer Versuch

Die pharmakologische Wirkung des Mittels, das Abrin und Nucleinsäure (1:40) enthält, wird entsprechend dem Verfahren bestimmt, wie es von E. N. Sassenrath (Ann. N. Y. Acad. ScL, 76, 1958) beschrieben wird. Die Tiere einer jeden Gruppe, die 7 bis 10 Mäuse umfaßt (durchschnittliches Körpergewicht ca. 20 ± 1 g). werden mit 1 χ 10⁷ Tumorzellen intraperitoneal transplantiert, und eine Lösung, die Abrin und Ribonucleinsäure (1:40) in 0,9%igem wäßrigem NaCl enthält, wurde intraperitoneal den Mäusen in verschiedenen Dosisgehalten ein Mal am Tag während 5 Tagen verabreicht, beginnend 24 Stunden nach der Transplantation der Tumorzellen. Die Menge an Ascites, die sich akkumulierte, wurde bestimmt, wobei man geeichte Zylinder verwendete, und das gepackte Zellvolumen wurde in einer Kapillarröhre in einer Blutzentrifuge bestimmt Das gesamte gepackte Zellvolumen (TPCV) wurde durch Mukiplikation dieser beiden Werte berechnet Die Antitumoraktivität wurde ausgedrückt als Prozentgehalt des durchschnittlichen gesamten gepackten Zellvolumens der behandelten Gruppe (T) zu den der Vergleichsgruppe (C) am 7. Tag nach der Transplantation. Das Verhältnis der täglichen Dosis des Mittels, das Abrin und Ribonucleinsäure enthält, zu dem Prozentgehalt des Tumorwachstums (T/C%) ist in Tabelle 11 angegeben.

Tabelle II

Tägliche Dosis ^g/kg als Abrin) eines Abrin und Ribonucleinsäure enthaltenden Mittels

Prozentgehalt un Tumorwachstum (T/C %)

45 2,50 1,25 0,63 0,31

1,9

1,4

11,6

90,2

Die maximale inhibierende Wirkung (T/C %= 1,4)

wird bei fünf aufeinanderfolgenden Verabreichungen des Mittels in einer Menge von 1,25 μg (als Abrin) erhalten und der ED₉₀-Wert (T/C%-10) wird als ungefähr 0,63 μg/kg geschätzt

Klinischer Versuch

Injizierbare Lösungen von Abrin-Ribonucleinsäure (1:40, ausgedrückt durch das Gewicht), die entsprechend dem im folgenden Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt werden, werden in einer Menge äquivalent zu 2 bis 300 μg/Tag, als Abrin, entsprechend dem Zustand des Patienten und der Art der Verabreichung verabreicht Bei der intravenösen Injektion wird eine Menge äquivalent zu 25 μg, als Abrin, mit 5%iger Glucoselösung verdünnt und die verdünnte Lösung wird durch intravenöses Tropfen verabreicht. Gegebenen-

falls werden gleichzeitig andere Antikrebsmittel wie

Mitomycin, 5-Fluoruracil oder Endoxan mit verabreicht. Zur Bewertung der therapeutischen Wirkung der

erfindungsgemäßen Arzneimittel werden der allgemei-

ne Zustand des Patienten wie auch makroskopische und mikroskopische Beobachtungen verwendet Im Fall von metastatischem Blasenkrebs wird eine cystoskopische Prüfung periodisch durchgeführt, um die erfindungsgemäßen Mittel zu bewerten.

Weiterhin wurden Blutroutineuntersuchungen, Nieren- und Leberfunktionsprüfungen, Röntgenaufnahmen und in einigen Fällen, sofern erforderlich, Leberabtastungen und Serumproteinelektrophoreseprüfungen periodisch durchgeführt Urinuntersuchungen, Leucocytenzählungen und Plättchenzählungen wurden häufiger durchgeführt, insbesondere erfolgte die letztere Untersuchung jeden Tag. Bei der Bewertung der Wirkung der erfindungsgemäßen Mittel erschien die Kamofsky-Klassifizierung nicht geeignet, da keine Null-Fälle aufgenommen sind und fast alle Fälle als 1 klassifiziert werden konnten. Daher erfolgte die folgende Klassifizierung:

»schlecht« bedeutet die Fälle, bei denen weder ein makroskopisches noch ein mikroskopisches Ansprechen beobachtet wurde; »mäßig« bedeutet die Fälle, bei denen eine gewisse Verbesserung beobachtet wurde (z.B. ein Schrumpfen des Tumors, ein Nachlassen der neuralgischen Schmerzen oder eine Verbesserung in anderen klinischen Symptomen), wobei jedoch aktiver Krebs noch festgestellt wurde;

ίο »gut« bedeutet die Fälle, bei denen sowohl das klinische als auch das pathologische Ansprechen recht günstig ist, aber nicht vollständig; »ausgezeichnet« bedeutet die Fälle, bei denen der Tumor vollständig verschwindet sowohl klinisch als auch pathologisch.

Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen III bis VIII zusammengefaßt

Tabelle III

(1) Primärer Gebärmutterhalskrebs; 12 Personen

Dauer der Ansprechen
Beobachtung

(Monate) schlecht mJiig

gut

Folgezustand
ausgezeichnet lebend tot

unbekannt

12 24

Tabelle IV

(2) Wiederauftreten von Gebärmutterhalskrebs; 17 Personen

Dauer der Ansprechen
Beobachtung

(Monate) schlecht

Folgezustand

mäßig

gut ausgezeichnet lebend

tot

12 24

4 1

Tabelle V

(3) Valvar- und Harnröhrenkrebs (primär, wiederauftretend oder Metastasen); 5 Personen

Dauer der	Ansprechen	mäßig	gut	Folgezustand	tot
Beobachtung					1
(Monate)	schlecht	1	1	ausgezeichnet lebend	1
6	1		1
12			1	1
24			1
36			1

7 8

Tabelle VI

(4) Sarkome mit ausgedehnter perinealer Ausdehnung; 3 Personen

Dauer der Ansprechen Folgezustand

Beobachtung

(Monate) schlecht maßig gut ausgezeichnet lebend tot

12 1 1

24 1 1

36 1 1

Tabelle VII

(5) Eierstockkrebs (primär und metastatisch); 5 Personen

Dauer der Ansprechen Folgezustand

Beobachtung

(Monate) schlecht mäßig gut ausgezeichnet lebend tot

6 2 12 1

12 1 1

36 1 1

Tabelle VIII

(6) Lebertumor (primär und metastatisch); 3 Personen

Dauer der Ansprechen Folgezustand

Beobachtung

(Monate) schlecht mäßig gut ausgezeichnet lebend tot

6 11

12 1

Herstellungsbeispiele

Beispiel 1 Beispiel 2

Lösung »A« wird hergestellt, indem man 10 mg 10 mg der Lösung A des vorhergehenden Beispiels

kristallines Abrin in 1 ml 0,01 η-Essigsäure löst, dazu und 7,5 ml der Lösung B von Beispiel 1 werdei 0,01 M mit Phosphat gepufferte physiologische Salzlö- miteinander vermischt Physiologische Kochsalzlösung sung (pH 4) bis zu einem Gesamtvolumen von 40 ml 50 wird zu der Mischung bis zu einem Gesamtvolumen voi zugibt und die Lösung durch ein Mikroporenfilter 20 ml zugegeben. Jeweils 0,4 ml der entstehende! filtriert Lösung werden in Ampullen gefüllt, die ihrerseit

Lösung »B« wird hergestellt indem man 100 mg versiegelt werden. Man erhält injizierbare Ampuller gereinigte Hefe RNA in 10 ml einer O₁OlM mit die 50 μ§ Abrin und 1,5 mg Ribonucleinsäure (Verhältni Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung 55 Abrin zu Ribonukleinsäure = 1:30) enthalten.
(pH 7,4) löst und die Lösung durch ein Mikroporenfilter
filtriert .

Äquivalente Volumen der Lösung »A« und der Beispiel 3

Lösung »B« werden miteinander vermischt Jeweils 10 ml der Lösung A und 0,75 ml der Lösung B, wöbe

0,4 ml der entstehenden Lösung werden in Ampullen 60 diese Lösungen wie im Beispiel 1 beschrieben herge gefüllt, die ihrerseits versiegelt werden. Die entspre- stellt wurden, werden miteinander vermischt Physiolo chenden Ampullen enthalten 50 μ§ Abrin und 2 mg gische Kochsalzlösung wird zu der Mischung bis zi RNA (Verhältnis von Abrin zu Ribonucleinsäure = einem Gesamtvolumen von 20 ml zugegeben. Jeweil 1:40). 0,4 ml der entstehenden Lösung werden in Ampullei

Das gesamte obige Verfahren wird bei einer 65 abgefüllt die verschmolzen werdea Man erhäl Temperatur von 4° C unter Sterilisationsbedingungen injizierbare Ampullen, die jeweils 50 μg Abrin um durchgeführt Die entstehenden Ampullen werden bei 0,15 mg Ribonucleinsäure enthalten (Verhältnis Abrir einer Temperatur von 4° C gehalten. zu Ribonucleinsäure =1:3).

Beispiel 4

Die Lösung »C« wird hergestellt, indem man 12,5 mg gereinigten Kalbsthymus DNA in 10 ml einer 0,01 m mit Phosphat gepufferten physiologischen Kochsalzlösung (pH 7,4) löst und die Lösung durch ein Milliporefilter filtriert.

Die Lösung C wird mit der Lösung A, die entsprechend Beispiel 1 hergestellt wurde, in einem Verhältnis von äquivalenten Volumen vermischt. Jeweils 0,4 ml der entstehenden Lösung werden in Ampullen gegeben, die ihrerseits abgeschmolzen werden. Man erhält injizierbare Ampullen, die jeweils 50 μg Abrin und 250 μg DNA enthalten (Verhältnis Abrin zu Deoxyribonucleinsäure — 1:5).

Beispiel 5

10 mg der Lösung A, hergestellt wie im Beispiel 1 beschrieben, und 0,5 ml der Lösung C, hergestellt wie im Beispiel 4 beschrieben, werden miteinander vermischt. Zu der entstehenden Mischung gibt man physiologische Kochsalzlösung bis zu einem Gesamtvolumen von 20 ml. Jeweils 0,4 ml der entstehenden Lösung werden in Ampullen gefüllt, die abgeschmolzen werden. Man erhält so injizierbare Ampullen, die 50 μg Abrin und 15 μg Deoxyribonucleinsäure enthalten (Verhältnis Abrin zu Deoxyribonucleinsäure = 1:0,3).

Beispiel 6

Die Lösung »D« wird hergestellt, indem man 10 mg kristallines Abrin in 10 ml 0,01 η-Essigsäure löst. Zu der Lösung D gibt man nacheinander 20 ml gereinigtes Wasser und 10 ml 0,01 η-Ammoniaklösung. Die Mischung wird dann durch ein Mikroporenfilter filtriert, wobei man die Lösung D erhält. 3ί

Die Lösung »E« wird hergestellt, indem man 100 mg gereinigte Hefe RNA (die Probe, wie sie im Beispiel 1 verwendet wurde) und 100 mg Alanin in 10 ml gereinigtem Wasser löst und die Lösung durch ein Mikroporenfilter filtriert.

Äquivalente Mengen der Lösung D und der Lösung E werden miteinander vermischt. Je 0,4 ml der entstehenden Lösung werden in Fläschchen gefüllt, die nach bekannten Verfahren gefriergetrocknet werden und dann im Vakuum verschlossen werden. Die Produkte werden bei ihrer Anwendung in physiologischer Kochsalzlösung, 5%iger Glucoselösung oder gereinigtem Wasser gelöst.

Beispiel 7

100 mg kristallines Abrin und 300 mg Hefe Ribonucleinsäure werden in einer kleinen Menge von 0,01 η-Essigsäure gelöst. Zu der Lösung fügt man Phosphatpuffer mit einem pH-Wert vor. 4 bis zu einem Gesamtvolumen von 10 ml. Zu der Mischung fügt man 2000 Einheiten Hyaluronidase, welches zuvor in 4 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst wurde. Zu der entstehenden Lösung gibt man 10 ml Polyäthylenglykol 300 und dann werden die Bestandteile miteinander vermischt. Die Mischung wird weiter mit 150 g eines Trägers vermischt, welcher aus weißem Vaselin und flüssigem Vaselin besteht, und die entstehende Mischung wild vermischt, bis sie homogen ist. Man erhält so eine Salbe, die Abrin und Ribonucleinsäure in einem Verhältnis von 1:3 enthält.

Die entstehende Salbe wird üblicherweise in einer Menge von ungefähr 1 bis 10 g verwendet, abhängig von der Größe des Tumors oder der Krebsgeschwulst bzw. des Kraters.

Der technische Fortschritt bei dem erfindungsgemäßen Arzneimittel ergibt sich dadurch, daß Abrin durch die verminderte Toxizität besser bei der Tumorbekämpfung angewendet werden kann. Die klinischen Versuche zeigen, daß sogar intravenöse Injektionen durchgeführt werden können, die mit Abrin allein bisher den Tod der Patienten verursachten.

Claims

Patentanspruch:

Pharmazeutisches Mittel mit Antitumoraktivität, enthaltend Abrin, dadurch gelcennzeichnet, daß es außerdem Nucleinsäure enthält, wobei das Verhältnis von Nucleinsäure zu Abrin in dem Mittel 03 oder höher, ausgedrückt durch das Gewicht, ist

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